KR100413335B1 - 항균 펩타이드 물질을 생산하는 유산균 락토코커스 락티스bh5(케이씨씨엠 10275) - Google Patents

Abstract

(1) 청구범위에 기재된 발명이 속하는 기술분야

항균 펩타이드 물질을 생산하는 유산균 락토코커스 락티스 BH5(KCCM-10275)에 관한 것이다.

(2) 발명이 해결하려고 하는 기술적 과제

본 발명은 대부분의 유산균과 식품 부패 미생물 및 병원성 미생물에 대해 넓고 강한 항균 활성을 가지는 항균 펩타이드 물질인 박테리오신을 생산하는 유산균 락토코커스 락티스 BH5(KCCM-10275)를 제공하는데 그 목적이 있다.

(3) 발명의 해결방법의 요지

본 발명은 항균력을 가지는 균주를 선발하여 대부분의 유산균과 여러 종류의 식품 부패 세균 및 병원성 세균에 대하여 저해효과를 가지는 미생물을 개발하는 것으로서, 김치에서 분리한 유산균으로부터 항균력을 가지는 미생물을 선별하였으며, 생화학적, 형태학적 실험과 당발효 실험을 통해 동정한 결과 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)인 것으로 동정되었다. 본 균주는 항균활성이 범위가 넓고 강한 박테리오신을 생산하며, 본 균이 생산하는 박테리오신을 분리, 정제하여 특성을 조사하였다. 본 박테리오신은 대부분의 유산균과 여러 종류의 식품 부패 미생물 및 병원성 미생물, 헬리코박터 파이로리, 여드름 원인균에 대하여 저해 효과가 있으며, 열과 pH에 안정한 항균 펩타이드 물질인 박테리오신을 생산하는 것을 특징으로 한다.

(4) 발명의 중요한 용도

본 발명에 의한 균주는 대부분의 유산균과 식품 부패 미생물 및 병원성 미생물, 헬리코박터 파이로리, 여드름 원인균 등에 대하여 넓은 저해 효과를 가지며, 산과 열에 안정한 박테리오신의 특성을 지니고 있어 식품첨가물이나 건강보조식품, 화장품 및 약품의 원료로 사용되어 보존성 연장 및 항균효과를 나타내므로 제품의 품질이나 가격 경쟁력에서 비교우위를 점할 수 있다.

Description

항균 펩타이드 물질을 생산하는 유산균 락토코커스 락티스 BH5(케이씨씨엠10275){Lactococcus lactis BH5(KCCM-10275) which is produced antimicrobial peptide}

본 발명은 식품첨가물이나 화장품 및 약품의 원료로 사용되어 보존성 연장 및 항균 효과 기대할 수 있는 항균력이 우수한 항균 펩타이드 물질인 박테리오신(bacteriocin)을 생산하는 락토코커스 락티스 미생물에 관한 것이다.

유산균(lactic acid bacteria)은 탄수화물을 혐기적으로 이용하여 젖산을 생산하는 미생물로 자연계에 널리 분포하는 미생물이다. 이 미생물은 중성 및 알칼리성에서 잘 생육하는 부패성 미생물의 생육을 억제하여 동서양을 막론하고 식품의 보존 수단으로 이용되어 왔으며, 특히 우유, 유제품, 육제품, 침채류 및 각종 젓갈류의 가공에 이용되어 왔다. 유산균은 이들의 대사산물인 여러 종류의 유기산에 의해 pH를 감소시키면서 식품의 보존성을 증진시키는데, 젖산 및 초산과 같은 유기산은 대부분의 미생물에 대하여 살균작용(bactericidal)이 있기 때문이다. 또한 유기산 외에 과산화수소 및 이들이 생산하는 박테리오신이 보존성에 관여한다.

박테리오신이란 물질은 세균이 생산하는 단백질 또는 단백질계열의 항균물질로 일반적으로 항균 물질 생산 균주 자신과 계통 ·혈통학적으로 유사한 균종으로 제한된 좁은 항균 범위를 나타내며 자신의 유전자로부터 직접 생합성 된다는 점에서 일반 항생 물질과 구분이 되는 천연의 항균성 단백질이다. 박테리오신은 각종 발효 식품 중에 흔히 존재하고 일상 식생활을 통해 섭취하고 있는 유산균에 의해 생산이 되며, 기존의 항생제와는 달리 단백질로 이루어져 있기 때문에 인체에 섭취되는 즉시 소화기관의 단백질 가수분해 효소에 의해 분해됨으로써 인체에 무독성이고 잔류성이 없다는 측면에서 식품의 새로운 생물보존제 또는 발효식품의 생물제어제로 그 효용이 크게 기대되고 있다. 유산균이 생산하는 가장 널리 알려진 박테리오신인 나이신(nisin)은 광범위한 항균 범위 때문에 오래 전부터 상용이 허용되어 왔으며, 미국에서도 1988년 식품의약안전본부(FDA)가 그라스(GRAS, generally recognized as safe) 식품 첨가물로 인정하게 되었다.

김치, 장류 등 전통적으로 자연의 미생물을 이용한 발효식품이 풍부한 우리나라에서는 이들 식품이 주요 기초식품을 이루고 있으므로 박테리오신에 대한 과학적, 산업적 응용기술의 개발은 중요하다.

따라서 본 발명은 식품의 천연 보존제 및 건강보조식품, 화장품이나 약품의 원료로 사용이 가능한 항균 범위가 넓고 항균력이 강한 박테리오신을 생산하는 유산균을 제공하는데 그 목적이 있다.

보다 상세히 설명하자면, 본 발명의 목적은 한국 고유의 전통 식품인 김치에서 항균력이 뛰어난 미생물을 분리 ·선발하였으며 항균 범위가 넓은 박테리오신 생산 균주 락토코커스 락티스 BH5(KCCM- 10275, Journal of Food Protection, Vol. 63, No, 12, 2000, p. 1707-1712에 게재) 미생물을 제공하는 것이다. 본 박테리오신 생산균인 락토코커스 락티스 BH5(KCCM-10275)는 기 논문에서 밝혔듯이, 기존 공지의 박테리오신인 우유제품에서 분리한 나이신 생산 균주와 비교하여 한국 전통 식품인 김치에서 분리하였으며 항균활성 범위가 우월하고 항균력도 강하며 증식 기간과 박테리오신 생산 시간이 짧고, 동일 지시균에 대하여도 동일하게 비교 우위의 항균활성을 가지는 것을 알 수 있다.

제 1도는 락토코커스 락티스 BH5(KCCM-10275) 균주의 전자 현미경 사진이다.

제 2도는 본 균주 락토코커스 락티스 BH5(KCCM-10275)를 MRS 액체배지에서 배양하면서 시간별로 균체 증식과 박테리오신 활성을 나타내는 그림이다.

제 3도는 본 균주 락토코커스 락티스 BH5(KCCm-10275)와 나이신 생산 표준균 락토코커스 락티스 서브스피시즈 락티스 ATCC 11454의 균체 증식 및 박테리오신 활성을 비교한 그림이다.

제 4도는 정제된 박테리오신의 에스디에스 폴리아크릴마아이드 겔 전기영동 사진(A)과 정제된 박테리오신에 의한 마이크로코커스 플레이브스의 생육저해(B)를 나타낸 사진이다.

1. 저분자량 표준 단백질

2. 정제된 박테리오신

다음의 실시예로서 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

[실시예1]

[유산균의 분리 및 항균물질 생산 균주의 탐색]

전통 발효식품으로부터 채취한 시료를 멸균된 생리 식염수로 희석한 뒤, BCP 선택 배지와 MRS 한천 배지에 각각 도말한 후 30℃에서 48시간 동안 배양하여 산을 생산하는 균주를 중심으로 선별하였다. 형성된 군락은 미리 만들어진 MRS 한천 배지에 멸균 이쑤시개로 이식하여 30℃에서 군락이 형성될때까지 배양한 후 지시균이 함유된 연한천 배지를 중층하고 지시균을 적정배양 조건에서 배양한 뒤, 생육 저지대를 형성한 균주를 1차 적으로 선별하였다. 1차 선발된 균주들은 액체 배지에서의 활성 여부를 관찰하여 2차 선발하였다. 1차 선발 균주들을 MRS 액체 배지에 접종하여 하룻밤 정치 배양한 후 원심 분리하여 균체는 제거하고 상징액만을 취하여 0.22㎛ 여과막(membrane filter)으로 잔존 균체를 완전히 제거한 후 미리 페트리 접시에 부어 놓은 MRS 한천 배지 위에 지시균이 함유된 연한천 배지 5ml를 중층하여 건조시킨 후 배양 상징액 5㎕를 떨어뜨려 lawn이 형성되도록 배양하여 저해환을 검토한 결과 총 2균주를 선별하였고 그 중에서 저해환이 가장 큰 유산균 BH5를 최종 선발하였다.

[실시예 2]

[선발된 균주의 동정]

선발된 균주인 유산균 BH5에 대해 형태적, 생리적, 생화학적 실험을 통하여 동정을 실시하였다. BH5에 대한 형태적, 생리적, 생화학적 실험을 한 결과는 표 1과 같았으며, 균주의 형태를 관찰하기 위해서 전자현미경을 이용하였으며, 결과 도 1과 같다. 표 1과 도 1에서 나타난 결과로 미루어보아 선발된 본 균주는 유산구균으로 간주되었다.

유산구균으로 간주된 이 선발균주에 대하여 API 50CHL 킷트(API bioMerieux, France)를 이용해 49종의 당발효 시험을 실시한 결과는 다음의 표 2와 같다. 표 2의 결과를 토대로 미생물을 동정한 결과 신뢰도 99%로 BH5(KCCM-10275) 균주는 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis)로 동정되었다.

[항균활성의 측정]

박테리오신의 항균활성 측정은 spot-on-lawn 방법을 사용하여 수행하였다.

박테리오신 생산균주의 배양액을 4℃, 8,000×g 에서 20분간 원심 분리하여 상징액을 취하고 0.22㎛ 여과막(membrane filter)로 잔존 균주를 완전히 제

거한 후 앞서 기술한 바와 같이 미리 부어 놓은 고체 배지에 점적한 후 배양 상징액이 완전히 확산되도록 상온에서 약 30분 정도 건조시켰다. 항균활성의 정량적인 측정을 위해서는 상징액을 100mM 인산완충용액(pH 7.0)을 이용하여 순차적으로 2배씩 희석하여 고체배지에 점적한 후 항균활성을 측정하였고, 활성 단위(activity unit, AU)는 1ml 당 항균활성을 나타내는 최대 희석 배수의 역수로 나타내었다.

[실시예 3]

[박테리오신의 생산]

본 발명의 균주인 락토코커스 락티스 BH5(KCCM-10275)가 생산하는 박테리오신의 생산성을 알아보기 위한 최적 배양 조건을 조사하였다. 여러 종류의 합성 배지, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH를 각기 달리하여 본 균주를 배양하였으며 균체량과 박테리오신 활성을 측정하였다.

배지로는 MRS 배지에서 균체 증식과 박테리오신 활성이 가장 높게 나타났다. 본 발명 균주를 MRS 액체 배지에 접종하여 pH를 6.0으로 조절하면서 30℃에서 배양한 결과는 도 2와 같았다. 균체 증식은 배양 5시간이 지나면서부터 정지기에 들어가는 것으로 나타났다. 박테리오신 생산은 접종 후 균체생육과 함께 생산되었으며, 배양 5시간만에 최대 생산량을 나타내었으며 1시간 동안 유지되다가 시간이 지나면서 차츰 감소하는 경향을 나타내었다.

[실시예 4]

[항균범위의 측정]

본 발명의 균주인 BH5(KCCM-10275)가 생산하는 박테리오신의 항균범위는 대부분의 젖산균, 여러 종류의 비병원성균과 식품유래 병원성균 및 부패균, 효모와 곰팡이에 대하여 spot-on-lawn 방법으로 실시하였다.

본 박테리오신은 대부분의 젖산균, 스테필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus), 스테필로코커스 에피데미디스(Staphylococcus epidermidis), 클로스트리듐 플프리젠스(Clostridium perfringens), 몇 종의 바실러스(Bacillus), 마이크로코커스 플레이브스(Micrococcus flavus),

리스테리아 모노사이토제네시스(Listeria monocytogenes), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 에셰리시아 콜라이(Escherichia coli), 헬리코박터 파이로리(Helicobater pylori), 슈도모나스 플루오레센스(Psedomonas fluorescens) 등의 균주에 대해 항균 활성을 보였으며, 공지의 박테리오신인 나이신 생산균인 락토코커스 락티스 서브시피시즈 락티스 ATCC 11454 보다 더 넓은 항균활성 범위를 나타냄을 알 수 있었다(표 3).

또한 여드름 원인균인 프로피오니박테리움에 대한 항균 활성을 확인하였으며 사람 여드름 부위에서 직접 채취하여 확인한 프로피오니박테리움 서브스피시즈 P1, P4, P6 그리고 P9에 대한 항균 역가를 검증하기 위하여 박테리오신의 최소억제농도(MIC)를 측정하였다. 그 결과는 표 4와 같았으며,P4의 생장은 균주 BH5(KCCM-10275)의 배양액을 1/2농도 이상으로 첨가시켰을 때 저해되었으나 P1,P6, 그리고 P9의 생장은 배양액 1/16농도에서도 생장 저해효과를 나타내었다. 따라서 락토코커스 락티스 BH5(KCCM-10275)가 생산하

는 박테리오신이 여드름 원인균의 생장을 저해시키는 물질임을 확인 할 수 있었다.

[실시예 5]

[BH5 균주와 나이신 생산 균주의 활성 비교]

나이신 생산 대표 균주인 락토코커스 락티스 서브스피시즈 락티스 ATCC 11454로부터 생산되는 나이신과 락토코커스 락티스 BH5(KCCM-10275)에서 생산되는 박테리오신의 활성을 비교하였다. 도 3에 나타난 것과 같이, 락토코커스 락티스 BH5(KCCM-10275)에서 생산된 박테리오신의 항균 활성을 마이크로코커스 플레이브스를 지시균으로 사용하여 측정했을 때, 최적 배양 조건에서 배양된 나이신 생산 표준 균주인 락토코커스 락티스 서브스피시즈 락티스 ATCC 11454의 나이신 항균 활성 보다 2배 높게 관찰되었으며 생육 속도와 박테리오신 생산 속도도 더 빠른 것으로 나타났다.

[실시예 6]

[박테리오신의 분해효소 처리 및 열처리에 대한 영향]

본 발명의 균주인 락토코커스 락티스 BH5(KCCM-10275)의 부분 정제액을 가지고 실험을 수행하였다.

락토코커스 락티스 BH5(KCCM-10275)의 부분 정제액 제조는 5L 발효조를 이용하여 MRS 액체 배지 3L에 1%가 되게 접종하고 30℃에서 6시간 배양한 후 8,000×g 에서 20분간 원심 분리하여 균체를 제거하여 상징액에 황산암모늄을 4℃에서 75% 포화농도로 첨가한 후 1시간 동안 방치하여 12,000×g 에서 20분간 원심 분리하여 침전물만 회수한 다음 100mM 인산완충용액(pH7.0)에 현탁한 후 투석을 실시하였다. 투석은 molecular weight cutoff이 1000Da인 투석막을 사용하여 12시간마다 새로운 인산완충용액으로 2회 교환하였으며 이를 부분 정제액으로 70℃에 보존하면서 실험에 사용하였다. 이렇게 제조된 박테리오신 부분 정제액에 단백질 가수분해 효소인 protease X IV, protease IX, pepsin,α-chymotrypsin, proteinase K, 당분해효소인α-amylase 및 지방분해효소인 lipase를 최종농도 1 mg/ml이 되게 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후 잔존 활성을 측정한 결과 표 5에 나타낸 바와 같이 protease X IV에 의하여 활성이 모두 소실되었으며α-chymotrypsin에 의하여 부분적으로 활성이 소실되었다. Protease IX, pepsin,α-chymotrypsin, proteinase K,α-amylase, lipase에 의해서는 활성에 변화가 없었다.

부분 정제된 박테리오신 용액을 열처리하여 잔존 활성을 측정한 결과는 표6와 같았다. 90℃에서 30분간 열처리하였을 때까지는 활성의 변화가 없었으며, 100℃에서 30분간 열처리하였을 때 활성이 부분적으로 소실됨을 알 수 있었다. 121℃에서 15분간 열처리하였을 때 활성이 모두 소실되었다. 이상의 결과로 미루어 볼때 본 박테리오신은 열에 대하여 안정한 것으로 판단되었다.

[실시예 7]

[박테리오신의 pH 에 따른 안정성]

부분 정제된 박테리오신을 pH 2.0에서 11.0까지 완충용액과 1:1로 혼합하여 4℃에서 4시간 방치하여 pH가 고르게 한 후 잔존하는 활성을 측정하였다.

표 7에 나타나는 바와 같이 pH 9.0이하의 범위에서는 활성이 그대로 유지되었으나 pH 10.0에서는 부분적으로 활성이 소실되었으며, pH 11.0에서는 항균활성이 완전히 소실되었다. 따라서 본 박테리오신은 pH가 낮은 조건에서 안정성이 증가하는 것으로 나타났다.

[실시예 8]

[박테리오신의 정제]

황산암모늄 침전법으로 단백질 분획을 수집한 후 50mM 인산 완충액(pH 6.0)에 용해한 다음 에탄올을 20%가 되도록 첨가시켜 원심분리로 침전물을 회수한 후 동일 완충 용액에 용해한 뒤 에탄올을 증발시켜 박테리오신을 농축하였다. 양이온 교환수지인 CM-Sepharose fast flow 칼럼에 충진하여 10mM 인산 완충액으로 평형화시킨 후 부분 정제된 박테리오신 농축액을 칼럼에 적하 하였다. 동일 완충액으로 비흡착 단백질 부분을 씻어낸 다음 흡착단백질

분획을 1.0M 염화나트륨이 함유된 동일 완충액으로 용출시켜 단일 peak의 활성 분획을 모으고 이를 막의 분자량이 10 kDa인 Ultrafiltration으로 통과 시켜 최종 정제 실험을 수행하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이 순수한 박테리오신을 얻을 수 있었으며, 정제된 박테리오신을 이용하여 에스디에스 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 수행하여 활성을 측정한 결과, 단일 band와 일치하는 부위에서 투명환이 생겼으며, 따라서 락토코커스 락티스 BH5(KCCM-10275)에서 생산되는 박테리오신의 분자량이 대략 3.0-3.5kDa임을 알 수 있었다.

[실시예 8]

[박테리오신 생산에 따른 영양원의 효과]

본 발명의 균주인 락토코커스 락티스 BH5(KCCM-10275)가 생산하는 박테리오신의 최적 생산 배지 조성을 확립하고자 다양한 탄소원 질소원을 달리 첨가하여 본 균주를 배양한 후 균체량과 박테리오신 활성을 측정하였다.

먼저 탄소원의 영향을 조사하기 위하여 MRS 액체 배지에 각각의 탄소원을

2%가 되게 첨가하여 본 균주 BH5(KCCM-10275)를 배양하였다. 탄소원으로 글루코스(glucose)를 첨가했을 때 균체 증식 및 박테리오신 활성이 최대로 나타났다(표 8). 반면 말토스(maltose), 만노스(mannose), 자일로스(xylose)와 슈크로스(sucrose)를 첨가한 경우에는 균체는 증가되었으나, 박테리오신 활성은 만노스(mannose)를 첨가한 경우에만 증가하였다. 다음 질소원을 1%가 되게 첨가하여 배양한 후 균체 증식과 박테리오신 생산을 관찰하였다.

그 결과 비프 추출물(beef extract), 펩톤(peptone), 소이톤(soytone), 트립톤(tryptone), 효모추출물(yeast extract)를 첨가한 경우에 균체 증식 및 박테리오신 생산이 크게 증가되었으며, 그 중 소이톤(soytone)과 트립톤(tryptone)을 첨가하였을 때 박테리오신 생산이 최대로 나타났다(표 9).

한국의 전통발효 식품인 김치에서 분리, 동정한 락토코커스 락티스 BH5(KCCM-10275)는 대부분의 유산균과 식품 부패 미생물 및 병원성 미생물, 헬리코박터 파이로리, 여드름 원인균 등에 대해 넓은 항균 범위를 가지고 열과 pH에 안정한 박테리오신을 생산하는 것으로 나타났다.

이 미생물을 식품첨가물이나 건강보조식품, 화장품 및 약품의 원료로 사용함으로써 보존성 연장 및 항균 효과를 나타낼 수 있으므로 제품의 품질이나 가격 경쟁력에서 비교우위를 점할 수 있다.

Claims (1)

1. 전통 발효식품인 김치에서 분리한 락토바실러스, 류코노스탁, 피디오코커스를 포함하는 대부분의 유산균종과 바실러스 쎄레우스, 스타필로코커스 오레우스, 리스테리아 모노사이토제네스와 같은 병원성 미생물, 헬리코박터 파이로리, 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 등에 대하여 폭 넓은 항균 활성을 가지는 항균 펩타이드 물질인 분자량 3.0-3.5 kDa의 박테리오신을 생산하는 것을 특징으로 하는 락토코커스 락티스 BH5(KCCM-10275) 균주.