KR20080025795A

KR20080025795A - 항균 활성을 갖는 락토바실루스 파라플란타룸 ｋｎｕｃ25 및 그 배양액

Info

Publication number: KR20080025795A
Application number: KR1020060090398A
Authority: KR
Inventors: 김사열; 한태원; 설경조; 박유미; 이수진; 김마리; 정규식
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2006-09-19
Filing date: 2006-09-19
Publication date: 2008-03-24

Abstract

공장에서 대량 생산되는 김치의 숙성과정 중에 생성되는 식품 오염균인 대장균군(coliform bacteria)에 항균 활성을 갖는 신규 유산균으로서 락토바실루스 파라플란타룸(Lactobacillus paraplantarum)을 분리동정하였다. 이것은 김치 숙성중에 생기는 다양한 대장균군에 대해서뿐 아니라 병원성 대장균군에 대해서도 항균 활성을 보였으므로 천연 항균제로 사용될 수 있으며, 나아가 대량 생산되는 식품 첨가물 및 의약품으로 사용하더라도 안정성 문제가 없다.

락토바실러스 파라플란타룸, 유산균, 콜리폼 박테리아

Description

항균 활성을 갖는 락토바실루스 파라플란타룸 ＫＮＵＣ25 및 그 배양액{Lactobacillus paraplantarum KNUC25 derived from Kimchi having anti-bacterial activity and Culture Fluids thereof}

도 1은 배추김치를 갈아만든 액즙과 김치 국물에서 분리해낸 유산균 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25 균주에서 16S rRNA 염기 서열 분석을 이용한 부분 동정 결과이다.

도 2는 본 발명에 의한 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25 균주의 주사전자 현미경(x15000) 사진이다.

도 3은 공장 김치로부터 분리된 대장균군(coliform bacteria)에 대한 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 항균 활성을 보여주는 사진으로서, (a)는 pH 4.5인 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC 25의 농축상등액（x30), (b)는 니신(Nisin) - negative control, 10 ㎎ of nisin (2.5% powder, Sigma, Germany)/1 ㎖ of 0.02 M HCl, (c)는 pH 7.0인 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC 25의 농축상등액(x30), (d)는 1% Lactic acid(pH 2.0)의 사진이다.

도 4는 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 농축상등액 처리전후의 대장균군의 주사전자 현미경 사진으로서 (a)처리전 배율은 x18000, (b)처리후 배율은 20000 배율이다.

도 5는 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 농축상등액 처리후 대장균군의 viable cell test를 도시한 그래프로서, control은 coliform bacteria; LA는 1% lactic acid; 25 (pH 4.5)는 pH 조정하지 않은 L. paraplantarum KNUC25 농축 상등액; 25 (pH 7.0)는 pH 조정한 L. paraplantarum KNUC25 농축 상등액을 나타낸다.

도 6은 공장 김치에 신규한 김치 유산균 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 배양액 처리시와 미처리시 각각에 대한 김치내 대장균군의 수적 변화를 대비한 그래프로서 (a)는 5℃, (b)는 10℃이고, Treatment는 L. paraplantarum KNUC25 배양액 처리 후 대장균군을, 그리고 control은 대장균군을 나타낸다.

도 7은 인체병원성 대장균군과 식중독균에 대한 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 항균 활성을 도시한 사진으로서, (a)는 인체병원성 대장균군, (b)는 식중독균을 나타낸 사진으로서, K45는 pH 4.5의 L. paraplantarum KNUC25 농축 상등액; N은 니신, negative control (10 ㎎ of nisin (2.5% powder, Sigma, Germany)/1 ㎖ of 0.02 M HCl); K70은 pH 7.0의 L. paraplantarum KNUC25 농축 상등액: LA는 1% lactic acid (pH 2.0)을 나타낸다.

도 8은 인체병원성 대장균군으로서 K. pneumoniae ATCC13883에 대하여 pH 4.5와 pH 7.0 조건하에 형태 변화를 도시한 사진(a-c, x15000), 및 식중독균으로서 S. enteritidis ATCC13076에 대하여 pH 4.5와 pH 7.0 조건하에 형태 변화를 도시한 사진(d-f)으로서, 병원성 대장균군에 대하여 (a)는 L. paraplantarum KNUC25 농축 상등액의 처리전, (b)는 pH 4.5의 농축 상등액 처리후, (c)는 pH 7.0의 농축 상등액 처리후 사진이고, 식중독균에 대하여 (d)는 L. paraplantarum KNUC25 농축 상등액의 처리전(x12000), (e-f)는 pH 4.5의 농축 상등액 처리후 사진(각각 x10000 및 x7000)이다.

도 9는 인체병원성 대장균군의 viable cell test 결과를 도시한 그래프로서, (a)는 병원성 대장균군 K. pneumoniae ATCC13883의 결과, 그리고 (b)는 병원성 대장균군 E. cloacae ATCC13047의 결과이며, 각 그래프내 표기중 control은 병원성 대장균군을, LA(pH 2.0)는 1% lactic acid를, 25 (pH 4.5)는 pH 를 조정하지 않은 L. paraplantarum KNUC25 농축 상등액을, 그리고 25 (pH 7.0)은 pH 조정한 L. paraplantarum KNUC25 농축 상등액을 의미한다.

본 발명은 항균 활성을 갖는 락토바실루스 파라플란타룸 (Lactobacillus paraplantarum) KNUC25 및 그 배양액에 관한 것이다.

김치는 삼국시대 이전부터 형성된 농경문화 속에서 사계절 기후에 따라 채소를 저장하기 위한 방법의 일환으로 발전된 김치 유산균에 의한 발효식품이다. 유산균은 영양분의 소화흡수의 증대, 면역증진작용, 병원균의 생육저해 등 여러 유익한 생리 활성을 나타내는 것으로 널리 알려져 있다. 최근 국민소득 증대, 식생활 패턴의 변화, 사회적 다변화 및 국제적 교류의 증가 등으로 우리의 전통식품에 대한 관심이 고조되고 김치는 우리나라를 대표하는 국제적인 식품으로 자리매김하게 되었다. 이에 따라 김치의 영양이 과학적으로 재평가되고 있으며, 특히 김치 유산균의 항균, 항암 활성에 대한 많은 연구가 이루어지고 있다.

과거에는 김치를 각 가정에서 제조하여 먹었으나, 근래에는 공장 또는 소규모 가게에서 생산되는 김치가 다양한 유통망을 통해 공급, 판매되고 있어 시판 김치의 소비량도 늘어가고 있는 추세이다.

그에 따라 김치의 위생적인 면에 대한 조사가 요구되어 공장에서 제조되어 시판되는 김치를 점검해 본 결과, 분변 오염의 지표가 되는 대장균(Escherichia coli)과 콜리폼 박테리아(coliform bacteria), 식품 위생상 위해가 되는 살모넬라 (Salmonella), 포도상구균 (Staphylococcus) 속의 세균 등에 오염되어 있다는 사실이 밝혀졌다.

따라서, 공장에서 대량생산, 유통되는 김치의 숙성 과정에서 생성되는 상기 식품 유해균의 오염으로부터 벗어나 식품의 위생 안전성이 확보에 대한 문제 해결책이 시급히 요구되는 실정이다. 이러한 문제를 해결하기 위해 유산균이 생산하는 박테리오신에 대한 연구가 활발히 이루어져 왔다.

박테리오신은 천연 항생물질로서, 대표적인 유산균의 박테리오신으로 니신(nisin)이 가장 광범위하게 사용되고 있으나 그람 양성균에 활성이 있고 콜리폼 박테리아와 같은 그람 음성균이나 진핵 미생물에는 항균력이 제한적인 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 공장에서 대량생산되는 김치의 숙성과정 중에 생성되는 식품 오염균인 대장균군으로 부터 공장 김치의 위생 안전성을 확보하기 위해 다양한 김치 유산균을 대상으로 연구한 결과, 항균 활성을 갖는 신규 유산균을 분리ㆍ동정할 수 있었다.

따라서 본 발명의 목적은 항균 활성을 갖는 신규한 김치 유래 유산균인 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25 또는 그 배양액을 제공하려는데 있다.

본 발명에 의하면, 신규 유산균인 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25 및 그 배양액이 제공된다.

이에, 본 발명은 항균 활성을 갖는 신규 유산균인 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 분리 및 동정, 식품 오염균인 대장균군의 분리 및 동정, 나아가 본 발명에 따른 신규 유산균의 대장균군에 대한 항균 활성 테스트로 구성된다.

우선, 대구 지역 가정에서 담근 배추김치를 갈아 만든 액즙과 김치 국물에서 유산균을 분리하고, 분리된 유산균을 분자생물학적 동정방법인 16S rDNA 염기서열 분석을 이용하여 동정한 결과, 도 1에서 보듯이, 락토바실루스 파라플란타룸과 99.2%의 상동성을 확인하였다.

이에, 신규 유산균을 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25로 명명하고 2006년 6월 9일부로 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국과학기술연구소 생명공학연구소 내 유전자원센타에 기탁하여 기탁번호 KCTC 10958BP를 부여받았다.

한편, 공장 김치로부터 대장균군을 분리하기 위해 콜리폼 박테리아 감별배지인 페트리 건조 필름(3M, USA)을 사용하고 분리된 대장균군을 16S rDNA 염기서열 분석을 이용하여 동정한 결과, 99%의 상동성을 보여 엔테로박터(Enterobacter), 클렙시엘라(Klebsiella) 속으로 동정되었다.

이와같이, 분리된 대장균군에 대한 신규 유산균의 항균 활성을 알아보기 위해 spot-on-the-lawn 테스트를 수행하였다. LB 한천 배지에 대장균군의 배양액을 도말하고, 그 위에 본 발명에 따른 신규한 유산균인 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25 배양액의 농축상등액을 취해 접종하였다.

이를 배양하면서 대장균군의 억제 구역 (inhibition zone) 형성을 관찰하였다. 이로써 김치 유산균 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 항균 활성에 의해 대장균군의 초기 생육이 저해되는 것을 알 수 있었다.

또한, 분리된 대장균군이 신규 유산균인 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 항균 활성에 의해 형태적으로 어떠한 변화가 일어나는지 알아보기 위하여 대장균군 배양액에 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 농축상등액을 처리한 후 주사전자현미경 사진을 찍었다.

그 결과 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 농축상등액에 의해 대장균군의 세포가 터지거나 뒤틀린 형태로 변하는 것을 관찰할 수 있었다.

부가하여, 신규 김치 유산균의 대장균군에 대한 항균 활성을 확인하는 일환으로, 김치에서 분리한 대장균군뿐 아니라 type strain으로 병원성 대장균군인 Klebsiella pneumoniae ATCC13883, Enterobacter cloacae ATCC13047, Enterobacter aerogenes ATCC29751에 대한 항균 활성 실험도 상기된 방법과 같은 방법으로 수행하였다.

그 결과, 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25가 이들 3종의 병원성 대장균군에 대해서도 항균 활성을 나타내었다.

이에, 본 발명자들은 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25를 실제 공장 김치 제조 과정에 처리시에도 상술한 대장균군의 생육억제와 같은 변화가 발생하는지 알아보기 위해 공장 김치 제조 과정 중에 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25 배양액을 처리하였다.

그 결과 김치가 숙성되기 전 초기 과정에서 급격히 증가하는 대장균군 양이 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

이를 보다 명확히 하고자, 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 농축상등액을 처리한 대장균군의 viable cell test를 수행하여, 시간에 따른 변화를 관찰하였다. pH를 조정하지 않은 pH 4.5인 김치 유산균의 농축상등액을 처리한 경우가 pH를 조정한 pH 7.0인 김치 유산균의 농축상등액을 처리한 경우에 비해 오랜 시간동안 대장균군의 생육을 저해하였다.

pH를 7.0으로 조정한 김치 유산균 상등액의 경우에서 그의 항균 활성이 다소 감소하는 것을 관찰할 수 있었으나, 여전히 대장균군의 초기 생장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

이때 pH 7.0인 농축상등액에서 항균 활성이 감소한 것은 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 항균 활성에 적합한 최적 pH가 아닌 환경이기 때문으로 사료된다.

<실시예>

상술한 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명을 한정하려는 것은 아니다.

-실시예 1- 유산균의 분리 및 동정

대구 지역의 가정에서 담근 배추김치를 채취하여 갈아 만든 액즙과 김치 국물을 0.85% 염수 용액으로 희석하여 0.5% CaCO₃가 첨가된 MRS 한천배지에 도말하여 25℃에서 배양하였다. 균락색이 우유빛이고 CaCO₃가 젖산에 녹아 그 주위가 투명한 것을 선택하여 MRS 한천 배지에 여러 차례에 걸친 획선 접종을 통해 순수 분리하고 KNUC25라고 명명하였다.

분리된 KNUC25의 게놈 DNA를 추출하여 16S rRNA 유전자 부분을 포함하는 DNA 단편을 PCR을 통해 증폭하여 염기서열을 분석하고 NCBI의 데이터베이스와 비교한 결과, 락토바실루스 파라플란타룸과 99.2%의 상동성을 보였다(도 1 참조).

이에, 상기 미생물을 락토바실루스 파라프란타룸 KNUC25로 명명하고 2006년 6월 9일부로 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국과학기술연구소 생명공학연구소 내 유전자원센타에 기탁하여 기탁번호 KCTC 10958BP를 부여받았다.

-실시예 2- 대장균군의 분리

대장균군이라 함은 그람 음성 무아포간균으로 락토오스를 분해하여 가스를 생산하는 모든 호기성 또는 통성 혐기성균을 말한다. 공장 김치로부터 대장균군을 분리하기 위해서 대장균군 감별배지인 페트리 건조 필름(3M, USA)을 사용하였다. 그 조성은 효모 추출물(9.6 g), 젤라틴의 췌액 소화물(20.9 g), bile 염 No.3(1.6 g), 동물 조직의 위액 소화물(1.6 g), 락토오스(21.4 g), 염화나트륨(5.3 g), crystal violet(2 mg), neutral red(0.1 g), guar gum(cold water soluble gellin agent, 65.7 g), 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(0.11 g)로 증류수 1,000 ml에 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균하여 건조필름을 제조하였다.

공장 김치 제조 후 김치를 무균적으로 처리된 검사시료 1 ml와 각 단계 희석액 1 ml를 페트리 건조 필름배지에 접종한 후 잘 흡수시키고, 35±1℃에서 24±2시간 배양한 후 생성된 붉은 집락 중 주위에 기포를 형성한 집락을 LB (Luria-Bertani) 배지에 순수 분리하였다.

LB 배지에 순수 분리된 대장균군을 분자생물학적 동정 방법인 16S rDNA 염기서열 분석을 통해 부분 동정하였다. 분리된 대장균군으로부터 게놈 DNA를 추출하여 16S rRNA 유전자 부분을 포함하는 DNA 단편을 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭하였다. 이를 위하여 GF1 (5'-taacacatgcaagtcgaacg-3')과 GR1 (5'-ggtgtgacgggcggtgtgtacaag-3')을 primer로 제작하여 사용하였다. 게놈 DNA 30 ng을 주형으로 하고 PCR premix (Bioneer, Korea)를 이용해 PCR 증폭을 수행하였다. PCR 증폭의 수행조건은 denaturation (94℃, 30초), annealing (60℃, 30초), elongation (72℃, 45초) 단계를 35회 반복한 후 incubation(72℃, 15분)하였다.

PCR에 의하여 증폭된 DNA 단편을 전기영동한 다음 DNA PrepMate^TM(Bioneer, Korea)를 이용하여 겔 상에서 회수하여 염기서열을 분석하고, NCBI의 데이터베이스와 비교 결과, 99% 이상의 상동성을 보이며 엔테로박터(Enterobacter), 클렙시엘라(Klebsiella) 속 등으로 부분 동정되었다.

16S rDNA 염기서열 분석을 통한 대장균군의 부분 동정

균 주	Homologous microorganism (% identity)
2	Enterobacter intermedius (99%)
3-1	Enterobacter intermedius (99%)
3-2	Klebsiella terrigena (99%)
4	Enterobacter intermedius (99%)
5	Enterobacter cloacae (99%)
6	Enterobacter intermedius (99%)
7	Enterobacter intermedius (99%)
8	Enterobacter intermedius (99%)
9	Klebsiella ornithinolytica (99%)
10	Klebsiella oxytoca (99%)
11	Enterobacter intermedius (99%)
12	Enterobacter amnigenus (99%)
13	Hafnia alvei (99%)
14	Enterobacter intermedius (99%)
15	Enterobacter intermedius (99%)
16	Klebsiella ornithinolytica (99%)
17	Klebsiella ornithinolytica (99%)

상기 표에서 보듯이, 대장균군의 동정은 상기 유산균의 동정 방법과 같은 방법으로 수행되었다. 그 결과, 99%의 상동성을 보이며 엔테로박터, 클렙시엘라 속으로 동정되었다.

-실시예 3- 대장균군에 대한 신규 김치 유산균의 항균 활성

(1) Spot-on-the-lawn test

김치로부터 분리된 젖산균 Lactobacillus paraplantarum KNUC25 균주를 250 ml MRS 액체 배지에 접종하고 25℃에서 600 nm에서의 흡광도(OD₆₀₀)가 약 1.0이 될 때까지 정치 배양하였다.

배양액을 4℃에서 10,000 rmp으로 30분간 원심분리 하여 상등액을 취하고, 이 상등액을 기공 사이즈 0.22 ㎛ 필터(Millipore, USA)를 이용해 여과하여 무균 상태의 상등액을 얻었다. 여과된 상등액을 동결건조한 후 -70℃에 보관하여 사용하였다.

L. paraplantarum KNUC25의 항균 활성을 알아보기 위해 동결 건조된 L. paraplantarum KNUC25의 상등액을 30배로 농축하여 사용하였다. 상등액의 pH가 4.5이므로 pH에 의한 항균 활성을 배제시키기 위해 최종 pH를 7.0으로 조정한 상등액의 항균 활성 실험도 수행하였다. 공장에서 김치가 제조되어 제품으로 출고될 때의 젖산 함량이 전체의 약 1%를 차지한다고 하여 모든 실험에서 1% 젖산을 positive control로 사용하였다.

김치에서 분리된 대장균군 균주를 5 ml LB 배지에 접종하고 30℃에서 진탕배양하여 OD₆₀₀값이 0.3~0.4일 때 대장균군 균주의 cell을 원심분리 하여 모아서 100 ㎕의 cell pellet을 LB 한천 배지에 도말하였다.

도말된 배지 위에 멸균된 filter paper disc를 사방으로 올리고 그 위에 동결 건조된 L. paraplantarum KNUC25의 상등액을 30배 농축하여 10 ㎕씩 떨어뜨리고 30℃에서 배양하며 대장균군의 생육 억제 구역(growth-inhibition zone)을 관찰하였다. 그 결과를 도 3에 정리하였다.

도 3에서 보듯이, pH 4.5의 L. paraplantarum KNUC25의 농축 상등액과 pH 7.0의 농축 상등액, 1% lactic acid 모두 대장균군의 생장을 억제하여 filter paper disc 주변에 투명환이 생성되었다. 이는 L. paraplantarum KNUC25의 농축 상등액의 항균 활성이 젖산에 의해서만 나타나는 것이 아니며, 그와 다른 항균 활성을 나타내는 물질이 존재한다는 것을 의미한다.

일반적으로 그람 양성 세균에 대해 넓은 항균 활성 스펙트럼을 나타내는 니신은 김치에서 분리된 대장균군의 생육 억제에 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다.

(2) Lactobacillus paraplantarum KNUC25 균주의 항균 활성에 의한 대장균군의 형태적 변화

실시예 2에서 분리된 대장균군, 콜리폼 박테리아에 L. paraplantarum KNUC25의 상등액을 처리했을 때 대장균군에 형태적으로 어떠한 변화가 일어나는지 알아보기 위하여 주사전자현미경(SEM, Scanning electron microscope)을 이용하여 관찰을 수행하였다.

김치에서 분리된 대장균군 균주를 5 ml LB 배지에 접종하고 30℃에서 진탕배양하였다. OD₆₀₀값이 0.3~0.4일 때 대장균군의 배양액에 30배 농축된 L. paraplantarum KNUC25의 상등액을 처리하고 15분간 더 진탕배양한 후, 4℃에서 8,000 rpm으로 10분간 원심분리 하여 대장균군의 cell을 모았다.

대장균군의 cell을 전처리 과정을 거쳐 고정(fixation)시킨 후 주사전자현미경을 통해 김치 젖산균 L. paraplantarum KNUC25의 항균 활성에 의한 대장균군의 형태적인 변화를 관찰하였다. 그 결과를 도 4에 도시하였다.

그 결과, 도 4a에서 정상의 간균 형태를 보이던 대장균군의 세포 모양이 도 4b에서 보듯이, L. paraplantarum KNUC25의 농축 상등액의 처리 후 뒤틀리거나 구멍이 나고 터져버리는 등의 비정상적인 변형된 모양을 가지는 것으로 나타났다.

(3) 대장균군의 viable cell test

Lactobacillus paraplantarum KNUC25의 농축 상등액을 처리한 대장균군의 viable cell test를 수행하여, 시간에 따른 변화를 관찰하였다.

대장균군을 5 ml LB 액체 배지에 접종하고, OD₆₀₀값이 0.3~0.4에 도달하면 그 배양액을 96 well plate에 100 ㎕씩 분주하였다. 분주된 대장균군의 배양액에 L. paraplantarum KNUC25의 농축 상등액(pH 4.5와 pH 7.0)과 1% lactic acid (pH 2.0)를 10 ㎕씩 처리한다. 이를 37℃에서 배양하면서 멀티스캐너를 이용하여 30분마다 대장균군의 흡광도를 측정하여 대장균군의 생육 패턴을 관찰하였다.

그 결과, 도 5에서 보듯이, LA, 25 (pH 4.5), 25 (pH 7.0) 모두에서 대조군에 비해 생육이 저해되었다. 25 (pH 4.5)를 처리한 경우 대장균군이 거의 자라지 못하며, 25 (pH 7.0)을 처리한 경우 pH 4.5에 비해 다소 항균 활성이 감소하나 대조군에 비해서는 여전히 초기 생육을 억제하였다.

한편, pH 7.0의 농축 상등액에서 항균 활성이 감소한 것은 항균 물질의 항균 활성에 적합한 최적 pH가 아닌 환경이기 때문으로 사료된다.

(4) Lactobacillus paraplantarum KNUC25 배양액의 공장 김치에의 적용

L. paraplantarum KNUC25의 배양액을 실제 공장 김치 제조 과정에서 처리하였을 때도 앞서 실험한 바와 같이 대장균군의 생육억제와 같은 변화가 발생하는지 알아보기 위해 공장 김치 제조 과정 중에 L. paraplantarum KNUC25 배양액을 처리하였다. L. paraplantarum KNUC25 균주를 MRS 배지에 10⁸ cell/ml 배양하여 시료 김치에 2%(w/w) 첨가한 후 포장하여 5℃, 10℃ 항온기에 저장하면서 실험을 수행하였다. 그 결과 김치가 숙성되기 전 초기 과정에서 급격히 증가하는 대장균군의 양이 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

그 결과 도 6에서 보듯이, 5℃(도 6a)와 10℃(도 6b) 모두에서 L. paraplantarum KNUC25 배양액을 처리하기 전보다 김치 내의 대장균군의 양이 감소하였다. 특히, 5℃에서 김치가 숙성되기 전 초기 과정에서 급격히 증가하는 대장균군의 양이 L. paraplantarum KNUC25 배양액 처리 후 현저하게 줄어들었다.

-실시예 4- 병원성 대장균군에 대한 신규 김치 유산균의 항균 활성

상기에 설명한 것과 같은 방법으로 인체 병원성 대장균인 Enterobacter cloacae ATCC13047, Klebsiella pneumoniae ATCC13883를 비롯해 식중독균인 Salmonella enteritidis ATCC13076 등에 대한 항균 활성 테스트, 주사전자현미경 관찰 및 viable cell test를 수행하였다.

(1) Spot - on - the - lawn test

병원성 대장균군과 살모넬라를 5 ml LB 배지에 접종하고 37℃에서 진탕배양하여 OD₆₀₀값이 0.3~0.4일 때 각 배양액을 원심분리 하여 cell을 모아서 100 ㎕의 cell pellet을 LB 한천 배지에 도말하였다. 도말된 배지 위에 멸균된 filter paper disc를 사방으로 올리고 그 위에 동결 건조된 L. paraplantarum KNUC25의 상등액을 30배 농축하여 10 ㎕씩 떨어뜨리고 30℃에서 배양하며 대장균군의 생육 억제 구역(growth-inhibition zone)을 관찰하였다.

본 실험에서도 이전의 실험에서와 마찬가지로 pH를 조정하지 않은 L. paraplantarum KNUC25의 농축 상등액(pH 4.5)과 pH를 조정한 농축 상등액(pH 7.0)에 대한 항균 활성 실험을 모두 수행하였으며 1% lactic acid를 positive control로 이용하였다.

도 7(a)에서 보듯이, pH 4.5의 농축 상등액과 pH 7.0의 농축 상등액, 1% lactic acid 모두에서 병원성 대장균군의 생장을 억제하여 filter paper disc 주변에 투명환이 생성되었다. pH 4.5의 농축 상등액을 처리한 disc 주변에서는 뚜렷한 투명환을 관찰할 수 있었으나, pH 7.0 이나 1% lactic acid를 처리한 disc 주변에서는 매우 약한 투명환이 관찰되었다. 대장균군이 자라기 시작하는 초기에는 pH 7.0의 농축 상등액과 1% lactic acid를 처리한 곳에서도 투명환이 쉽게 관찰되었으나 초기 생장기가 지나고 대장균군의 생장이 빨라지자 투명환이 작아지는 것을 관찰할 수 있었다.

pH 4.5의 농축 상등액을 처리한 경우에는 24시간 이상이 지난 후에도 투명환이 뚜렷이 관찰되었다.

한편, 도 7(b)에서 보듯이, L. paraplantarum KNUC25의 농축 상등액(pH 4.5과 pH 7.0)이 식중독균인 살모넬라의 생육도 저해하는 것을 본 실험을 통해 알 수 있었다.

인체병원성 대장균군과 식중독균을 5 ml LB 배지에 접종하고 37℃에서 진탕배양 하였다. OD₆₀₀값이 0.3~0.4일 때 대장균군의 배양액에 30배 농축된 L. paraplantarum KNUC25의 상등액을 처리하고 15분간 더 진탕배양한 후, 4℃에서 8,000 rpm으로 10분간 원심분리 하여 각 배양액의 cell을 모았다. 병원성 대장균군과 식중독균의 cell을 전처리 과정을 거쳐 고정(fixation)시킨 후 주사전자현미경을 통해 형태적인 변화를 관찰하였다.

그 결과, 도 8에서 보듯이, 정상의 간균 형태를 보이던 병원성 대장균군과 식중독균의 세포 모양도 앞에서 실험한 대장균군들과 마찬가지로 L. paraplantarum KNUC25의 농축 상등액의 처리 후 뒤틀리거나 구멍이 나고 터지고 뭉치는 등의 비정상적인 변형된 형태를 나타냈다.

(3) 인체병원성 대장균군의 viable cell test

인체병원성 대장균군을 5 ml LB 액체 배지에 접종하고, OD₆₀₀값이 0.3~0.4에 도달하면 그 배양액을 96 well plate에 100 ㎕씩 분주한다. 분주된 대장균군의 배양액에 L. paraplantarum KNUC25의 농축상등액(pH 4.5와 pH 7.0)과 1% lactic acid (pH 2.0)를 10 ㎕씩 처리한다. 이를 37℃에서 배양하면서 멀티스캐너를 이용하여 30분마다 대장균군의 흡광도를 측정하여 인체병원성 대장균군의 생육 패턴을 관찰하였다.

그 결과 도 9에서 보듯이, pH 4.5의 농축 상등액을 처리한 경우가 pH 7.0의 김치 유산균의 농축 상등액을 처리한 경우에 비해 오랜 시간동안 대장균군의 생육을 저해하였다. pH 7.0의 농축 상등액의 경우에서 그의 항균 활성이 다소 감소하였으나, 여전히 대장균군의 초기 생장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 pH 7.0의 농축 상등액에서 항균 활성이 감소한 것은 항균 물질의 항균 활성에 적합한 최적 pH가 아닌 환경이기 때문으로 사료된다.

본 발명에 의해 제공되는 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25 균주의 배양액은 천연 항균제로서 사용될 수 있을 것이며, 그로 인해 대량생산되는 공장 김치의 식품 안정성을 확보할 수 있을 것이며, 이는 공장 김치에만 적용되는 것이 아니라 기타의 대량 생산되는 식품에도 식품 첨가물로서 적용될 수 있을 것이다.

또한, 본 발명에 따른 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25의 배양액은 대장균군에 대하여도 항균 활성을 나타내었으므로, 의약품으로의 개발도 가능할 것이다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Primer for Classification of Coliform bacteria in Kimchi <130> DP20060203 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GF1 <400> 1 taacacatgc aagtcgaacg 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GR1 <400> 2 ggtgtgacgg gcggtgtgta caag 24

Claims

대장균군(coliform bacteria)에 항균 활성을 가지는 신규한 김치 유산균 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25 (Lactobacillus paraplantarum KNUC25) 균주의 배양액
인체병원성 대장균군에 항균 활성을 가지는 신규한 김치 유산균 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25 균주의 배양액
식중독균에 항균 활성을 가지는 신규한 김치 유산균 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25 균주의 배양액
제1항 내지 제3항에 있어서, 상기 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC 25 균주는 기탁번호 KCTC 10958BP 를 갖는 것을 특징으로 하는 균주의 배양액
제1항 내지 제3항중 어느 한항의 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25 균주의 배양액을 유효성분으로 하는 식품
제1항 내지 제3항중 어느 한항의 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25 균주의 배양액을 유효성분으로 하는 식품 첨가물
제1항 내지 제3항중 어느 한항의 락토바실루스 파라플란타룸 KNUC25 균주의 배양액을 유효성분으로 하는 의약 조성물