KR20130025453A - 식중독균 길항 효과를 가지는 신규한 항균물질 및 이를 생산하는 바실러스 서브틸리스 비와이08 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식중독 유발 세균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)에 대하여 동시에 탁월한 항균활성을 갖는 신규한 항균물질(UV254-B) 및 이를 생산하는 균주로서 바실러스 서브틸리스 (B. substilis) BY08에 관한 것이다. 구체적으로는 본 발명에 의하면 신규한 항균물질(UV254-B) 및 이를 생산하는 균주로서 바실러스 서브틸리스 (B. substilis) BY08을 이용하여 인체에 무해한 방법으로 식중독 균인 바실러스 세레우스(B. cereus) 과 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes)를 동시에 억제할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 항균물질을 이용하면 장내 다른 유익균에 대해서는 항균활성을 나타내지 않으면서 바실러스 세레우스(B. cereus) 및 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytognens)에 대해서만 특이적으로 항균활성 및 길항효과를 나타내는 것에 관한 것이다.

Description

식중독균 길항 효과를 가지는 신규한 항균물질 및 이를 생산하는 바실러스 서브틸리스 비와이08{New antibacterial material with antagonistic effect against the food borne pathogenic microorganism such as Bacillus cereus and Listeria monocytogenes, and Bacullus substilis BY08}

본 발명은 식중독균 길항 효과를 가지는 신규한 항균물질 및 이를 생산하는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08에 관한 것이다.

대두 발효식품은 특별한 지식 없이도 가정에서 누구나 전래의 보편적인 방법으로 제조 가능한 식품으로, 보다 구체적으로는 삼국시대부터 발달한 한국의 대표적 전통발효식품으로서 대두와 같은 콩으로부터 생활환경 주변에 존재하는 미생물들에 의한 발효과정을 거쳐 숙성되는 대표적인 한국의 발효식품 중 하나이다.

전통방식으로 대두발효식품을 제조할 경우, 생활환경에 산재되어 있는 유해균의 오염문제는 식품안전성에 대한 문제로 아직 남아 있다. 국내 전통장류 내의 여러 오염균 중 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는 장류 주발효균인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 와 같은 속으로, 토양 등 생활환경 주변에 널리 분포하고 있으며, 열처리에 견딜 수 있는 내생포자를 생성하여 일반적인 살균방법으로는 사멸되지 않으며, 독성물질을 생성하여 식중독을 유발할 수 있다. 이에 2006년 식품의약 안전청(KFDA)에서는 장류 식품중에 유해한 오염균으로서 바실러스 세레우스를 추가하고, 검출 범위를 제품당 10,000마리/g이하로 제한하는 법령을 제정 고시하였다.

이에 바실러스 세레우스(B. cereus)를 비롯한 여러 유해균들을 제어 할 목적으로 고농도의 염분을 첨가하거나 합성식품보존제를 사용하여 왔다(Jang 등, 2003). 그러나 웰빙(well being) 트랜드에 맞춰 저염식품이나 무방부제의 식품을 선호하는 추세에 따라, 천연 식품 보존제를 개발하기 위하여 식품 및 의약산업에서의 사용에 있어 안전한 GRAS 미생물로 인정된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)와 같은 속이 생산하는 항균물질(antibacterial material)을 이용하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다.

따라서, 인체에 무해하면서 식중독균 등 식품의 주요 위해 미생물에 대한 새로운 항균물질에 대한 연구의 필요성이 계속 대두되고 있는 실정이다.

그리고, 바실러스 세레우스(B. cereus)에 대한 항균물질로 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)에 의해 생성되는 리포펩타이드 계열의 서펙틴(surfactin), 펜기신(fengycin), 이튜린(iturin) 및 바실로펩틴(bacillopeptins) 등이 알려져 있으나 새로운 항균물질을 찾고자 많은 연구가 진행되어지고 있다.

이에 본 발명자들은, 식중독 유발 세균인 바실러스 세레우스(B. cereus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)에 대하여 동시에 항균 활성을 갖는 신규한 항균물질 및 이를 생산하는 균주를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

구체적으로, 본 발명은 신규한 항균물질 (UV254-B) 및 이를 생산하는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

위와 같은 본 발명에 따른 항균물질(UV254-B)은 서열목록 1을 포함하는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) KCTC 18217P의 배양에 의해 얻어진다.

또한 상기 배양은 최적온도 25 내지 40℃, 최적 pH 7.0 내지 8.0, 배양시간 12시간 내지 48시간인 것을 특징으로 배양하는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 항균물질(UV254-B)의 제조 방법은 서열목록 1을 포함하는 바실러스 서브틸리스 균주 (Bacillus subtilis) KCTC 18217P를 분리하는 단계와 상기 분리하는 단계 후 바실러스 서브틸리스 균주 (Bacillus subtilis) KCTC 18217P를 배양하는 단계 및 상기 배양하는 단계 후 항균물질(UV254-B)을 정제하는 단계를 포함하여 바실러스 서브틸리스 균주(Bacillus subtilis) KCTC 18217P를 이용한 항균물질(UV254-B)의 제조 방법이다.

또한 상기 배양은 최적온도 25 내지 40℃, 최적 pH 7.0 내지 8.0, 배양시간 12시간 내지 48시간인 것을 특징으로 배양하는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) KCTC 18217P 균주는 서열목록 1을 포함하며 항균물질(UV254-B)을 생산하는 균주이다.

또한 상기 항균물질(UV254-B)의 생산은 최적온도 25 내지 40℃, 최적 pH 7.0 내지 8.0, 배양시간 12시간 내지 48시간의 특징으로 배양하여 생산되는 것을 포함한다.

본 발명에 따른 신규한 항균 물질(UV254-B) 및 이를 생산하는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08 균주는 식중독 유발 세균인 바실러스 세레우스(B. cereus), 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes) 에 대하여 동시에 항균 활성을 갖는 신규한 항균 물질 및 균주이다. 또한 본 발명에 따른 신규한 항균 물질(UV254-B) 및 이를 생산하는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08 균주는 장내의 다른 균주에는 영향을 미치지 않으면서 식중독 유발세균인 바실러스 세레우스(B. cereus) 및 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes) 에 대하여만 특이적으로 항균 활성을 보이므로, 장내의 유익한 균주에는 영향을 미치지 않는 신규한 항균물질 및 균주이다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08 과 다른 세균(bacteria)과의 계통발생론적 관계를 나타내는 그림이다.
도 2는 PCR-생성된 증폭 바실러스 세레우스(B. cereus) HblA 분획의 아가로스 겔 전기영동 도면이다(Lane M: molecular size marker; Lane 1: B. subtilis BY08 (A)； B. cereus (KCTC 3624) (B): Lane2: enterotoxin-positive control; Lane3: enterotoxin-negative control).
도 3은 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08 의 배양액의 세포 성장 및 항균활성에 탄소 공급원이 미치는 영향을 살펴본 그래프이다.
도 4는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08 의 배양액의 세포 성장 및 항균활성에 금속 이온이 미치는 영향을 살펴본 그래프이다(A: KCl; B: CaCl2; C: FeSO4; D: MgSO4; E: CuSO4; F: ZnSO4; G: NaCl).
도 5는 UV 254nm하에 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08 로부터 생성된 항균물질의 박막 크로마토그래피 결과를 보여준다.
도 6은 메탄올로 TLC 실리카 겔로부터 용출된 항균물질의 항균활성을 도시한 도면이다
도 7은 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08 로부터 생성된 항균물질의 TLC 크로마토그래피 결과를 보여준다.
도 8은 마이크로 용출법으로 바실러스 세레우스에 대하여 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08 로부터 정제된 항균물질(UV254-B)의 최소 억제 농도 도면이다.
도 9는 254nm에서 HPLC에 의해 스캔된 항균물질(UV254-B)의 크로마토그램이다.
도 10은 ESI-MS detection, positive ion mode, TIC에 의하여 항균물질(UV-254-B)의 풀 스캔으로부터 얻어진 분획 이온 스펙트럼의 크로마토그램이다.
도 11은 15.186 분부터 15.387 분까지 보유 시간에서 분자의 생성 이온 스펙트럼이다.

본 발명자들은 이에 항균 물질 및 균주를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 신규한 항균 물질 및 이를 생산하는 균주를 발견하였다. 구체적으로는 식중독균인 바실러스 세레우스(B. cereus) 및 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)에 대하여 동시에 항균 활성을 갖는 신규한 항균 물질(UV254-B) 및 이를 생산하는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08 균주를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 식중독균인 바실러스 세레우스(B. cereus) 및 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)에 대하여 항균활성이 있는 신규한 항균물질(UV254-B) 및 이를 생산하는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) BY08 균주에 관한 것이다. 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) BY08 는 대한민국 대전광역시 유성구 과학로 125번지 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 2011년 8월 10일자로 기탁하여 2011년 8월 17일자로 수탁번호 KCTC 18217P를 부여 받았으며, 서열목록 1에 따른 염기서열을 포함한다. 또한 본 발명에 따른 상기 신규한 항균물질(UV254-B) 및 이를 생산하는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) BY08은 식중독균인 상기 바실러스 세레우스(B. cereus) 및 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)에 대하여만 특이적으로 항균활성이 있는 반면에, 장내 다른 균주에는 영향을 미치지 않는 신규한 항균 물질 및 이를 생산하는 균주에 관한 발명이다.

또한 본 발명에 따른 상기 항균물질(UV254-B)의 생산량을 증가시키기 위해, 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) BY08의 온도, pH, 배양시간에 관한 배양조건은, 온도 25~40℃, pH 7.0 내지 8.0, 배양시간은12 시간 내지 48 시간 동안 배양할 경우 그 생산량은 최대치가 되어 최대의 항균활성을 나타낸다.

또한 본 발명에 따른 신규한 항균물질(UV254-B)은 특이적으로 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)와 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)에 항균활성을 나타내었다. 이때, 바실러스 세레우스(B. cereus)에 대한 최소억제농도 값은 64 μg/mL 이상이었다.

또한 LC/ESI-MS/MS를 이용하여 항균물질(UV254-B)를 분석한 결과 m/z 1133.6 및 1700.5에서 피크가 관찰되었다. 그리하여 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) BY08 균주로부터 생산된 항균물질(UV254-B)은 기존의 항균물질과는 분자량에서부터 완전히 상이한 바, 본 발명에 따른 항균물질(UV254-B)은 신규한 항균물질로 확인된다.

그러므로 본 발명은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 리스테리아 모노사이토제네스 균주(Listeria monocytogenes)와 같은 식중독균에 대한 길항효과 및 우수한 항균활성 효과를 가지는 신규한 항균물질(UV254-B) 및 이를 생산하는 신규한 균주인 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08을 제공한다.

이하, 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 :

공시균주

항균활성 시험에 이용한 공시균주는 한국 생명공학 연구소(Daegeon, Korea)에서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis KCTC1998), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus KCTC 3624), 바실러스 아밀로리쿠파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens, KCTC 1660), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis KCTC 3559), Salmonellaenteric subsp. enterica (KCTC 2514) 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes KCTC 3710) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus KCTC 1621)를 분양받아 이용하였다.

< 실시예 1> 바실러스 서브틸리스 (B. subtilis ) BY08 균주의 분리 및 동정

균주의 분리

바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08 균주를 분리하기 위하여 1차적으로 멸균식염수 18 mL에 청국장 2g을 가한 후 80℃에서 15분간 중탕하였다. 이 후 상징액을 TSB(tryptic soy broth, Bacto, MD, USA) 고체배지에 도말하고 37℃에서 12시간 배양한 후 세균 형태의 콜로니를 분리하였다. 선별된 균주를 TSB 배지(Bacto Co, MD, USA)에 접종한 후 37℃에서 36시간 동안 진탕배양 한 후 그 배양액을 원심분리(15,000 rpm, 15 min)하여 얻은 상징액을 항균력 시험용 시료로 사용하였다. 측정법은 107~8 CFU/mL 농도의 론 셀(lawn cell) 배지(nutrient agar)상의 웰(well)에 각각의 미생물 배양액 100 μL씩을 주입하고 37℃에서 6시간 배양한 다음 유해미생물의 생육저해를 나타내는 청정 존(clear zone)의 직경 (mm)을 측정하였다.

바실러스 세레우스(B. cereus)에 대한 길항 균주 선별

본 실시예에서는 대두 발효식품의 주요 위해 미생물인 바실러스 세레우스(B. cereus KCTC 3624)을 효과적으로 저지하기 위한 생물학적제어 방법의 개발을 위하여 바실러스 세레우스 (B. cereus KCTC 3624)에 대한 각각의 분리 균주의 항균력을 비교 검증하였다 (하기 표 1 참조).

구체적으로는 일차적으로 바실러스 세레우스(B. cereus)에 대한 항균활성을 보인 균주들을 분리하여, 바실러스 세레우스(B. cereus KCTC 3624) 론 셀(lawn cell) 배지상에서 항균력을 시험하였다. 그 결과 생육저지환의 직경은 각각 8 mm, 11 mm인 것으로서, 분리균주 BY03와 BY08의 배양액을 첨가한 실험구에서 바실러스 세레우스(B. cereus KCTC 3624)에 대한 항균활성이 있음을 확인 하여 이를 분리하였다. 그리고 그 중에서도 특히 항균활성이 더욱 탁월한 BY08균주를 선별하였다.

균주의 동정

Gyrase B 유전자의 포워드 프라이머(5`-CCC AAG CTT AAC TGC ACT GGG AAA TYG THG AYA AYA G-3`) GyrB135와 리버스 프라이머(5`-CGG AAT TCG GAT CCA CRT CGG CRT CBG TCA TRA T-3’)를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction) 반응을 수행하였다.

구체적인 PCR 반응조건은 94℃에 4분간 열변성(denaturation)을 1 사이클(cycle) 반응하고 94℃에 1분 동안 열변성(denaturation)과 58℃에 1 분간 어닐링(annealing)시킨 후 72℃에 1분간 신장(elongation)과정을 30 사이클(cycle) 반응한 후 72℃에서 10 분 동안 파이널 익스텐션(final extension)을 통하여 증폭하였다. 증폭된 DNA 밴드는 Agarose Gel Extraction Kit(MEGA-spinTM, Intron Co, Seongnam, Korea)를 이용하여 정제하고, 코스모진텍 유전자 해석센터(Seoul, korea) 에 염기서열 분석을 의뢰하였다.

염기서열 분석을 통하여 얻은 균주의 염기서열은 Blast Network Service를 이용하여 NCBI 진뱅크 데이터베이스(GenBank database)의 염기서열과 비교하여 계통분류학적 유연관계를 분석하였으며 크러스털W 멀티플 시퀀스 얼리그먼트(ClustalW Multiple Sequence Alignment) 프로그램을 이용하여 유연 관계를 분석하였다. 생화학시험은 API 50CHB kit (Bio Merieux, France)를 이용하여 균주의 당 이용성을 조사하였으며 당 발효성 시험 결과를 애피웹(apiweb , apiweb.biomerieux.com)을 이용하여 분석하였다.

선별된 BY08균주의 gyrB gene 염기서열들과 상동성을 비교한 결과 및 계통분류학적 유연관계를 나타내는 계통구조(phylogenic tree)는 표 2와 도 1에 나타내었다.

표 2에서 보듯이, BY08는 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 아밀로리쿠파시엔스와 98%의 유사성을 나타내었으나, 도 1의 계통분류학적 유연관계를 나타내는 계통구조(phylogenic tree)에서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 가장 유연관계가 높은 것으로 판명되었다.

또한 API 50 CHB 키트를 사용한 생화학 검사 결과를 정리한 하기 표 3에서도 BY08은 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)와 99.8%의 유사율을 나타냈으므로 분리균주 BY08을 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08로 명명하였다.

< 실시예 2> 최적 배지조성

분리 균주의 최적배지 조성을 위한 질소원에 대한 배지조성시험은 기초TSB배지(glucose 0.25%, Na2HPO4 0.5%, NaCl 0.25%)에 트립톤, 효모 추출물, 소이톤(soytone), 펩톤, 쇠고기 추출물, 탈지유 및 대두 추출액 등을 각각 3%씩 첨가하여 30℃, 180 rpm으로 24시간 배양 한 후 상등액을 이용하여 바실러스 세레우스(B. cereus)에 대한 항균활성을 시험하였다.

탄소원에 대한 배지조성시험은 단당류 (글루코오스 및 프럭토오스), 이당류 (락토오스 및 수크로오스), 다당류 (전분), 폴리올 (만니톨 및 글리세롤)등을 각각 2%씩 첨가한 후 질소원에 대한 배지조성 시험과 동일하게 수행하였다. 무기염에 대한 배지조성시험은 KCl, CaCl2, FeSO4, MgSO4, CuSO4, ZnSO4, NaCl 등을 각각 1 mM 농도로 첨가하여 질소원의 영향과 동일한 방법으로 검토하였다.

탄소원 , 질소원과 무기염에 따른 항균활성의 변화

TSB 배지에서 질소원을 제외한 기초TSB배지(glucose 0.25%, Na2HPO4 0.5%, NaCl 0.25%)에서 각각의 질소원을 3.0% 첨가하여 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08의 항균활성에 미치는 질소원의 영향을 조사하였다 (표 4).

그 결과 표 4에서 보듯이, 바실러스 세레우스(B. cereus)에 대한 항균활성은 효모 추출물, 소이톤(soytone) 및 대두 추출물을 첨가한 시험구에서 높게 나타났으며 가장 항균력이 높게 나타난 질소원은 대두 추출물을 첨가한 시험구에서 나타났으며 트립톤, 펩톤, 쇠고기 추출물 및 탈지유를 첨가한 기초TSB 배지 시험구에서는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus KCTC 3624)의 성장을 억제하지 못하였다.

또한, 기초TSB배지 (대두 추출물3.0%, Na2HPO4 0.5%, NaCl 0.25%)에 각각의 탄소원 2.0% 을 첨가하여 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08의 생육 및 항균활성에 미치는 탄소원의 영향을 조사한 도 3에서 보듯이, 균 생육은 용해성 전분, 수크로스, 글루코오스의 순으로 촉진하였으나, 프럭토오스, 락토오스, 만니톨 및 글리세롤을 첨가한 경우에 생육에는 무관한 것으로 나타났다. 또한 글루코오스, 수크로오스 및 글리세롤들을 첨가한 시험구에서 바실러스 세레우스(B. cereus)에 대한 항균활성이 높게 나타났다.

이상의 결과로부터 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08 균주의 항균활성은 탄소원으로 글루코오스를 첨가하면 균의 생육 촉진과 항균활성의 상승효과를 가져오는 것을 확인하였다.

나아가, 무기염의 첨가에 따른 항균활성의 변화를 시험하기 위하여, 기초배지(3% 대두추출물, 2%의 glucose와 1% NaCl 및 1% Na2HPO4)에 각종 무기염을 각각 1 mM 농도로 첨가한 배지를 이용하여 항균활성의 변화를 시험하고 도 4에 결과를 정리하였다.

도 4에서 보듯이, 무기염을 첨가하지 않은 대조구와 KCl, CaCl2, FeSO4, MgSO4, ZnSO4 및 NaCl 무기염들을 첨가한 시험구와 항균력의 변화를 관찰한 결과 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 다만, CuSO4를 첨가한 시험구에서는 항균력을 전혀 갖지 못하였으며, CuSO4를 첨가한 시험구에서 항균력을 상실하게 된 결과는 아마도 1 mM CuSO4를 첨가한 농도에서 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08를 생육하지 못하여 나타난 결과로 추론된다.

< 실시예 3> 항균물질( UV254 -B) 분리

항균물질의 준비

선발된 BY 08 균주를 최적배지에 접종한 후 30℃에서 24시간 동안 180 rpm으로 진탕 배양(VS-245MTi, Vision Scientific, Korea)하였다. 배양액 300 mL을 원심분리(8000 rpm, 15 min)한 후 상징액을 항균물질 추출에 사용하였다. 항균물질의 추출은 Huang 등 (2007)의 방법에 따라 수행하였다. 즉, 6N의 염산을 사용하여 상징액의 pH (2.0)를 조절 한 후 4℃에서 24시간 방치한 다음 원심분리(8,000 rpm, 15 min)하여 생성되는 침전물을 분리하였다. 침전물을 80% 메탄올 10 mL에 용해한 후 6 N의 NaOH으로 pH (7.0)를 조절하여 4℃에서 12시간 방치한 다음 원심분리 (10,000 rpm, 15 min)하여 항균물질을 정제하였다. 상징액은 감압농축한 다음 동결건조 (Model FD5508; ilshin, Netherlands)하여 분말시료를 제조하였다.

TLC 에 의한 항균물질의 정제

항균물질은 TLC 플레이트(실리카 겔 60 F254, Merck Co, Darmstadt, Germany)를 이용하여 정제하였다(도 5). 즉, 90% 메탄올로 추출한 균 배양액을 동결건조 시킨 분말을 100% 메탄올에 용해시킨 용액을 점적한 후 클로로포름/메탄올/물 (13:5:0.9, v/v/v)혼합액으로 전개시킨 후 UV 램프 (77202 Vilber lourmat, Marne La Vallee Cedex1, France)를 사용하여 254 nm의 파장에서 밴드를 관찰하였다. 항균물질을 분리하여 메탄올로 4℃에서 12시간 동안 추출한 다음 (Lee 등, 2010) 다시 원심분리(15,000 rpm, 15 min) 하여 상등액을 질소가스로 건조시킨 후 -20℃ 냉동고에 보관하면서 사용하였다.

항균물질의 분리 정제

상기 항균물질을 이용하여 항균활성을 측정한 결과는 도 6과 같다.

TLC에 나타난 A, B와 C 밴드들의 실리카 겔을 긁은 다음 메탄올로 용출시킨 후 농축시킨 물질을 사용하여 바실러스 세레우스(B. cereus)에 대한 페이퍼-디스크(paper-disc)법으로 항균활성을 측정한 결과 2번 밴드(B)에서 항균효과를 확인 할 수 있었으며(도 6 참조), 254nm에서 발광되었다. 발광된 파장대를 근거로 항균물질을 UV254-B로 명명하였다.

UV 램프로 확인된 항균물질을 정성분석법으로서 닌히드린(ninhydrin)과 요오딘(iodine) 염색법을 이용하여 발색시킨 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7의 레인 A는 닌히드린 시약으로 염색한 결과 약한 적자색으로 발색은 되였으나 선명하지는 않았으며, 레인 B는 요오딘 시약으로 염색한 결과 옅은 황색으로 발색이 되었다. 참고로, 닌히드린의 염색시약은 펩타이드의 아민과 결합하여 적자색으로 발색되며, 요오딘 염색시약은 불포화 지방산에 결합하여 노란색으로 발색되므로, 상기 요오딘에 의하여 옅은 황색으로 염색된 결과는 항균물질(UV254-B)이 불포화 지방산이 함유된 물질로 해석이 가능하며 닌히드린에 의해 약한 적자색으로 발색된 결과는 항균물질(UV254-B)은 펩타이드성 물질 임을 알 수 있다.

또한 항균물질(UV254-B)이 254 nm의 UV 램프에 의해 형광된 결과 등을 종합해 볼 때 항균물질(UV254-B)의 성분은 리포펩티드(lipopeptides)계 물질로 추정된다.

실험예 :

< 실험예 1> 장독소 생성 유무 실험

바실러스 에스피(Bacillus sp.)의 장독소 생성 유·무의 검출은 헤모리신 BL (HblA)유전자를 이용하여 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)과 면역학적 장독소 검출법인 역수동 라텍스 응집반응(reversed passive latex agglutination, RPLA kit, Oxoid) 법으로 확인하였다.

HblA 유전자 동정을 위한 프라이머로서, 포워드 프라이머의 서열은 5’-CGG GCG TTC TAG GGC ATA TTG AG-3’, 리버스 프라이머의 서열은 5’-GCG AGT AGT TTA TTA GGG ATT TTT TTC A-3’)를 사용하였다.

시험세균을 뮬러 힌톤 아가(Mueller-Hinton agar, Difco co, france)에 접종하여 37℃에서 하룻밤 배양한 집락을 증류수 50 μL에 부유시키고 98℃에서 20분간 가열하여 DNA를 추출하였다. DNA추출액 2 μL, 혼합 프라이머 2 μL, PCR 혼합액 (deoxy-nucleotide triphosphate, dNTP; Taq polymerase, 10 x buffer) 4 μL, 8-MOP(methoxypsoralene) 12 μL 즉, 총 20 μL를 혼합하여 반응 혼합액(premix)를 만들었다.

이를 진앰프 PCR 시스템(GeneAmp PCR system 9600, Perkin-Elmer Cetus Corp., Norwalk, CT, USA)으로 HblAl 프라이머 쌍을 사용한 반응은 94℃에서 5분간 예비변성(predenaturation), 94℃로 45초간 열변성, 65℃로 45초간 어닐링, 72℃에서 45초간 익스텐션(extension), 72℃로 5분간 마지막 익스텐션(extension)하는 30 싸이클(cycle)의 PCR을 시행하였다. PCR에 의한 증폭산물 5 μL를 2% 아가로스 겔 (promega, Madision, WI, USA)의 홈에 넣고 20분간 전기영동 하여 밴드의 유·무를 확인하였다(도 2).

장독소 생성 유무를 확인하기 위한 PCR 의 결과

도 2에서 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08및 바실러스 세레우스(B. cereu KCTC 3624)의 HblA 유전자 단편의 PCR 증폭산물을 아가로스 겔에 전기영동 한 후 밴드 유무를 통하여 장독소의 생성 유·무를 확인한 결과, 공시균주 바실러스 세레우스(B. cereus KCTC 3624)는 586 bp에서 밴드가 선명하게 나타난 결과로부터 인체에 유해한 장독소를 생성함을 확인할 수 있었으나, 본 발명의 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08는 인체에 유해한 장독소를 생성하지 않음을 확인되었다.

< 실험예 2> 바실러스 세레우스(B. cereus KCTC 3624)에 대한 항균활성 측정

분리한 바실러스 서브틸리스 (B. subtilis) BY08 균주의 최고의 항균활성을 나타내기 위한 배지 pH 및 배양 시간에 따른 항균활성의 변화 시험은 다음과 같다.

최적 pH의 설정은 50mL 삼각플러스크에 20mL TSB 배지에 넣고 0.1 N HCl과 0.1 N NaOH용액으로 배지의 초기 pH를 5.5~8.5의 범위로 조절하여 121℃에서 15분 동안 살균하였다. 살균된 배지에 선발된 균주의 전배양액을 1%씩 접종하고 30℃, 180rpm에서 24시간 배양한 후 항균활성을 검토하였다. 최적 배양온도는 25~50℃의 온도범위에서 최적 pH의 설정시험과 동일하게 검토하였다. 최적배양 시간 또한 TSB 배지에 접종한 후 30℃, 180 rpm에 60시간 동안 배양하면서 0, 6, 12, 24, 36, 48, 60시간 별로 시료를 채취하여 여러 종류의 유해미생물에 대한 항균활성을 측정하였다.

배양 온도 및 pH 에 따른 항균활성의 변화

바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08의 항균활성의 변화에 미치는 배양온도 및 pH의 영향을 실험한 결과는 표 5에 나타내었다.

표 5에서 보듯이, 배양온도를 25~50℃의 범위로 변화시키면서 배양한 결과 25 내지 40℃에서 바실러스 세레우스(B. cereus KCTC 3624)에 대한 항균활성이 높게 나타났다.

이상의 결과로부터 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08 균주의 배양 온도에 따라 항균물질(UV254-B)의 발현량이 달라지며, 25 내지 40℃에서 다량의 항균물질(UV254-B)이 발현되어 항균활성이 우수함을 알 수 있다. 또한 상기 결과로부터 가장 바람직한 배양 온도는 30℃임을 알 수 있다. 그리하여 최대의 항균물질(UV254-B) 발현을 위한 최적의 배양온도 범위는 25 내지 40℃ 임을 알 수 있었다.

또한 초기 pH를 5.5~8.0 범위로 조절한 후 30℃에서 24시간 배양하면서 초기 pH의 영향을 조사한 결과 배지의 pH에 따라 항균물질(UV254-B)의 생산량이 달라지며, pH가 7.0 내지 8.0인 범위에서 강한 항균활성을 나타내었으며, 가장 바람직하게는 7.5인 시험구에서 가장 강력한 항균활성을 나타내는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과로부터 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08 균주는 pH에 따라 항균활성이 최대치가 되는 항균물질(UV254-B)의 발현량에 차이가 있음을 알 수 있었으며, 최대의 항균물질(UV254-B) 발현을 위한 최적 pH는 7.0 내지 8.0 임을 알 수 있었다.

배양시간에 따른 항균활성

바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08균주 를 TSB배지에 접종한 후 30℃에서 180 rpm로 배양 하면서 배양시간에 따른 항균활성의 변화를 검토한 결과는 도 5와 표 6에 나타내었다. 바실러스 세레우스(B. cereus)에 대한 항균활성은 12~48시간까지 매우 높게 나타났다. 하지만 배양 60 시간째에는 항균활성이 거의 사라진 결과로 나타내었다.

이상의 결과로부터 배양 시간에 따라 항균물질(UV254-B)의 생산에 차이가 남을 알 수 있으며, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08로부터 유래된 항균물질(UV254-B) 생산을 위한 최적의 배양시간은 12~48시간 정도가 적당한 것으로 판단되었다.

< 실험예 3>항균물질에 대한 안정성 실험

pH 조정과 가열처리에 따른 항균물질의 안정성 실험

항균물질(UV254-B)의 pH에 대한 영향을 조사하기 위하여 pH 3.0, pH 5.0, pH 7.0, pH 9.0, pH 11.0로 조절한 완충용액에 용해시켜 37℃에서 2시간 동안 처리한 다음 페이퍼 디스크(paper-disc)법으로 생육저해가 나타나는 청정 존(clear zone)의 직경(mm)을 측정하였다. 또한 항균물질(UV254-B)의 열 안정성은 알아보기 위하여 동결건조된 항균물질을 멸균수에 녹인 후 30, 40, 60, 80, 100℃에서 각각 1시간 동안 열처리한 다음 페이퍼 디스크법으로 항균 활성을 측정하였다.

항균물질(UV254-B)의 pH, 온도에 대한 안정성을 조사한 결과는 표 7에 나타내었다.

TLC 분리 항균물질(UV254-B)의 효소처리에 따른 항균활성 변화 실험

항균물질(UV254-B)을 효소로 처리한 후 항균활성의 변화에 미치는 영향을 파악하기 위하여 항균물질(UV254-B)에 프로테나아제 K(proteinase K), 리파아제(lipase) 및 에스테라제(esterase)를 반응시킨 후 항균활성의 변화를 조사한 결과 또한 표 7에 나타내었다.

표 7에서 보듯이, 항균물질(UV254-B)은 100℃의 고온에서 1시간 동안 가열한 후에 항균활성이 나타나지 않았으나 80℃에서 1시간 동안 가열한 후에도 비교적 강한 항균성을 유지하고 있었다.

또한, 항균물질(UV254-B)은 pH 3 및 5의 산성 측에서는 항균활성이 감소되었지만, pH 7~11까지의 알칼리성 범위에서는 매우 안정된 항균활성을 유지하였으며, 특히 pH 9의 알칼리에서 항균활성이 가장 강하게 나타났다. TLC를 이용한 정제 물질인 항균물질(UV254-B)는 pH 변화에 크게 영향을 받지 않음을 알 수 있었다. 따라서 위를 통과 할 때 위의 산성의 pH에 의해 그 효능을 발휘 할 수 있을 것으로 기대된다.

나아가, 항균물질(UV254-B)을 효소로 처리한 후 항균활성의 변화에 미치는 영향을 파악하기 위하여 항균물질(UV254-B)에 프로테나아제 K(proteinase K), 리파제(lipase) 및 에스테라제(esterase)를 반응시킨 후 항균활성의 변화를 조사한 결과, 항균물질(UV254-B)은 프로테나아제 K와 리파아제로 처리한 후 완전히 항균활성이 소실되었으나 에스테라제로 처리한 후에는 항균활성이 감소되지 않았다.

이러한 결과로부터 항균물질(UV254-B)은 단백질 또는 긴 펩티드 쇄를 갖는 구조의 지방산의 물질로서, 리포펩티드계 물질로 추정된다.

< 실험예 4> 최소 항균활성 농도 실험

바실러스 세레우스(B. cereus)에 대한 최소억제농도(minimum inhibition concentration, MIC)의 측정은 액체배지 미량희석(Broth Microdilution)법 (Bhatta and Kapadnis, 2010)에 준하여 측정하였다. 즉, 96웰 마이크로플레이트의 각 웰에 멸균된 TSB배지(100 μL)를 넣고, 항균물질 (UV254-B) 256 μg/mL (100 μL)을 가하여 단계별로 2배씩 항균물질(UV254-B)를 희석하였다. 1.5×108 cells/mL 농도로(McFarland; 0.5) 미리 배양시킨 바실러스 세레우스(B. cereus KCTC 3624) 배양액을 10배 희석(1.5×107 cells/mL)하여 각 웰에 10 μL씩 접종하여 37℃에서 24시간 동안 생육시킨 후 그 생육의 정도를 판독하였다. 이때 항균활성을 MIC로 나타내었으며, MIC는 바실러스 세레우스(B. cereus KCTC 3624)가 100% 생육되지 않은 시료의 최소농도로 결정하였다. 또한 대조군으로 바실러스 세레우스(B. cereus KCTC 3624) 배양액이 함유되지 않은 그룹과 비교하였다.

항균물질의 최소 항균활성 농도

항균물질(UV254-B)에 대하여 브로드 마이크로디루션(broth microdilution) 법(Baker 등, 1991)을 시행하여 균의 최소저해농도를 시험한 결과는 도 8과 같다. 항균물질(UV254-B)가 바실러스 세레우스(B. cereus) (1.5×105 CFU/mL)에 대한 최소 항균활성 농도 값은 ≥64 μg/mL로 낮은 항균력을 보였다.

< 실험예 5> LC / ESI - MS 분석을 통한 항균물질의 분자량 측정 등 특성 분석 실험

항균물질의 LC / ESI - MS 분석

TLC에서 분리한 항균물질(UV254-B) 분석은 MS/MS 분석조건으로 ESI (electrospray ionization) 이온화방식을 선택하였고 포지티브 이온 모드(positive ion mode)에서 MRM (multiple reaction monitoring)방법을 사용하였다. 이동상으로는 A: 물, 0.1% 포름산과 B: 아세토니트릴, 0.1% 포름산을 사용하였으며, 칼럼은 Capcell Pak C18 (2.0 x 100mm, 5μm, Shiseido, Japan)을 사용하였다.

유속은 0.23 mL/min 였으며, 분석시간 선형 구배로 0분에서 이동상 B가 10%부터 20분까지 100%로 이동상 B를 유지하면서 0.23 mL/min의 유속으로 분석을 실시하였다. 21분에서 25분까지는 선형 구배로 이동상 B가 10%가 되도록 하였다.

분석컬럼의 온도는 40℃로 일정하게 하였다. 분무 가스(Nebulizing gas)와 충돌 가스(collision gas)는 모두 질소가스를 사용하였고 기타 MS/MS 분석 파라미터는 스프레이 전압(spray voltage) 110 V, 이온 스프레이 온도는 300℃로 설정하였다. 스캔 레인지는 m/z 100~1,800 이였다.

LC / ESI - MS / MS 를 이용한 항균물질 분자량 분석

항균물질(UV254-B)의 LC/ESI-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램을 도9, 10 및 11에 나타내었다. 가장 큰 피이크의 유지시간은 약 15분이었으며, LC/ESI-MS/MS법을 이용하여 스캔 하였을 때 15분 대 나오는 피이크의 분자량을 protonated molecular ion/product ion 이온쌍으로 검출할 수 있었다.

즉, m/z 1133.6 및 1700.5에서 피크가 관찰되었으며 (도 11), 이들 결과와 TLC에서의 정색 반응의 결과를 종합해 볼 때 본 연구에서 분리한 항균물질은 비교적 분자량이 큰 시클릭 리포펩티드계의 화합물로서, 기존에 알려진 바실러스 sp에서의 항균물질로 밝혀진 서펙틴(surfactin[1044.6005-1074.5780(m/z)]), 이튜린(ituline[1061.5812, 1075.5810(m/z)]), 펜기신(fengycin[1449.5587-1515.5127(m/z)])계열의 물질과는 완전히 다른 신규한 항균물질 임이 확인되었다.

< 실험예 6> 바실러스 세레우스 (B. cereus ) 및 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes)에 대한 특이적 항균효과 및 길항효과를 나타내는 실험

각종 식품에서 발생되는 병원성 미생물인 바실러스 세레우스(B. cereus), 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes), S. enterica와 S. aureus와 사료의 발효에 사용되는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 바실러스 리체니포미스(B. licheniformis)와 바실러스 아밀로리쿠페이션스(B. amyloliqufaciens)에 대한 항균물질 및 본 발명에 따른 항균물질 (UV254-B)의 항균범위를 조사한 결과를 표 8에 나타내었다.

그 결과 본 발명에 따른 항균물질 (UV254-B)은 그람양성 균주인 바실러스 세레우스(B. cereus)와 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes)에 대하여 항균활성을 나타낸 반면 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 바실러스 리케니포미스(B. licheniformis), 바실러스 아밀로리쿠페이션스(B. amyloliqufaciens), S. enterica와 S. aureus 에 대해서는 항균효과를 나타내지 않았다(Table 9). Bacillus spp.에서 분리한 항균물질들로는 이튜린(iturin), 바실로미신(bacillomycin), 프리파스타틴(plipastatin)와 서펙신(surfactin)들이 발견되었는데 이러한 항균물질들은 Gram 음성균, 양성균 및 균류(fungi) 등에 대하여 비교적 넓은 길항작용을 갖고 있으나 (Shelburne et al., 2007) 특이적으로 바실러스 세레우스(B. cereus) 와 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes) 에 대하여 항균활성을 나타낸 미생물의 분리·동정은 처음으로 밝혀진 결과이다. 본 연구에서 분리하여 얻은 항균물질(UV254-B)는 이러한 바실러스 세레우스(B. cereus) 와 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes) 균주에 특이적으로 높은 항균활성을 갖고 있으며 일반적으로 응용되는 바실러스(Bacillus) 유익균에 대하여 항균활성을 나타내지 않았다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 신규한 항균 물질(UV254-B) 및 이를 생산하는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BY08은 바실러스 세레우스(B. cereus) 및 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes) 에 대하여 특이적으로 항균활성 및 길항효과가 우수함을 알 수 있다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.

한국생명공학연구원 KCTC18217P 20110810

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> New antibacterial material with antagonistic effect against the food borne pathogenic microorganism such as Bacillus cereus and Listeria monocytogenes, and Bacullus substilis BY zero eight <130> 1038271 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1345 <212> DNA <213> Bacillus subtilis BY08 <400> 1 cttgggacag agcctcgccg gttattgtac ggatatcaat atccaaattg agaaagacaa 60 cagcatcacg gtgatagata atggtcgcgg tattccagtc ggtattcatg aaaaaatggg 120 ccgtcctgcg gtagaagtta ttatgacggt gcttcatgct ggaggaaaat ttgacgggag 180 cggttataaa gtgtctggag gactgcacgg tgtaggtgcg tcagtcgtaa acgcgctttc 240 aactgagctt gttgtgacgg tacaccgtga cggtaaaatc caccgtcaaa cctataaacg 300 tggagttccg gtttcagacc ttgaaatcat tggcgaaaca gatcatacag gaacgacgac 360 acattttgtc cctgatcctg agatttttac agaaacaact gtgtatgatt atgatctgct 420 tgctaaccgc gtgcgcgaat tagccttttt gacaaaaggc gtaaacatca cgattgaaga 480 taaacgtgaa ggacaagaac gcaaaaatga gtaccattac gaaggcggaa ttaaaagtta 540 tgtagagtat ttaaaccgtt ctaaagaagt tgtccacgaa gagccaattt acattgaagg 600 tgaaaaggac ggcattacgg ttgaagtggc tttacaatac aatgacagct acacaagcaa 660 catttactca tttacaaata acattaacac gtatgaaggt ggtacccacg aagcgggctt 720 taaaactggt ctgactcgtg ttatcaacga ttacgccaga aaaaaaggac tcataaaaga 780 aaatgatcca aacttaagcg gagatgacgt aagagaaggg ctgaccgcga ttatttcaat 840 caaacaccct gatccgcagt tcgaaggcca aacgaaaaca aaactaggca actcagaggc 900 gcggacgatc acagatacgt tattttctgc ggcgttggaa acatttatgc tggaaaatcc 960 agacgcggct aaaaaaattg tcgataaagg tttaatggcg gcaagagcaa gaatggctgc 1020 gaaaaaagca cgtgaattaa cacgccgcaa gagtgctttg gaaatttcaa accttcctgg 1080 taagttagcg gactgctctt caaaagaccc gagcatctcc gagttgtata tcgtagaggg 1140 tgattctgcc ggaggatctg ctaaacaggg acgcgacaga cattttcaag ccattttgcc 1200 gcttagaggt aaaatcctga acgttgaaaa agcaagactg gataaaatcc tttcaaataa 1260 cgaagttcgc tctatgatta cagcgctcgg cacaggtatc ggggaagatt caacctggag 1320 aaagcccgta ccacaaaggt ttcca 1345

Claims (6)

1. 서열목록 1을 포함하는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) KCTC 18217P의 배양에 의해 얻어진 항균물질(UV254-B).
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 배양은 하기 (a) 내지 (c)의 특징으로 배양되는 것을 포함하는 항균물질.
   (a) 최적온도 25 내지 40℃;
   (b) 최적 pH 7.0 내지 8.0;
   (c) 배양시간 12시간 내지 48시간;
   
3. 서열목록 1을 포함하는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) KCTC 18217P를 분리하는 단계;
   상기 분리하는 단계 후 바실러스 서브틸리스 균주 (Bacillus subtilis) KCTC 18217P를 배양하는 단계; 및
   상기 배양하는 단계 후 항균물질(UV254-B)을 정제하는 단계;
   를 포함하는 바실러스 서브틸리스 균주(Bacillus subtilis) KCTC 18217P를 이용한 항균물질(UV254-B)의 제조 방법.
   
4. 제 3항에 있어서,
   상기 배양은 하기 (a) 내지 (c)의 특징으로 배양하는 것을 포함하는 항균물질(UV254-B)의 제조 방법.
   (a) 최적온도 25 내지 40℃;
   (b) 최적 pH 7.0 내지 8.0;
   (c) 배양시간 12시간 내지 48시간;
   
5. 서열목록 1을 포함하며 항균물질(UV254-B)을 생산하는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) KCTC 18217P 균주.
   
6. 제 5항에 있어서,
   상기 항균물질(UV254-B)의 생산은 하기 (a) 내지 (c)의 특징으로 배양하여 생산되는 것을 포함하는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) KCTC 18217P 균주.
   (a) 최적온도 25 내지 40℃;
   (b) 최적 pH 7.0 내지 8.0;
   (c) 배양시간 12시간 내지 48시간;
   

Images