KR101417365B1

KR101417365B1 - 신균주인 리시니바실러스 ｙ-4ｂ 균주 및 이를 포함하는 항균 조성물

Info

Publication number: KR101417365B1
Application number: KR1020120115044A
Authority: KR
Inventors: 김정섭; 문은성
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2012-10-16
Filing date: 2012-10-16
Publication date: 2014-07-10
Also published as: KR20140048745A

Abstract

본 발명은 신규 미생물 균주에서 분리한 항생 단백질 및 그 생산조건에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항균활성을 갖는 리시니바실러스(Lysinibacillus sp .) 균주에서 항균 활성을 갖는 항생단백질을 생산하는 방법 및 그 생산 조건에 관한 것이다. 본 발명의 방법으로 제조된 항생 단백질은 그람 양성균에 대한 항균활성이 있어 이를 유효성분으로 하여 항균성 제제 또는 백신을 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 리시니바실러스(Lysinibacillus sp .) Y-4B KCTC 12284BP 균주는 썩은 감귤에서 분리하여 썩은 감귤 및 감귤 부산물을 활용하여 항생 단백질을 생산할 수가 있기에 감귤 부산물 처리를 효과적으로 할 수 있다.

Description

신균주인 리시니바실러스 Ｙ-4Ｂ 균주 및 이를 포함하는 항균 조성물{Novel strain Lysinibacillus sp. Y-4B and antimicrobial composition comprising the same}

본 발명은 항균활성을 갖는 신균주인 리시니바실러스(Lysinibacillus sp.) Y-4B 균주 및 이를 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다.

감귤은 운향과 감귤나무아과 감귤속, 금감속, 탱자나무속의 과일을 총칭하는 것으로 흔히 비타민이 풍부하여 피로회복 및 피부 미용에 효과가 있다고 알려져 있으며 겨울 철 대표 과일로 남녀노소 좋아하는 과일이다. 다만 과육이 많고 껍질이 얇아 수확 후 부패가 빨리 진행되는 단점이 있다.

한편, 미생물에 대한 항균력을 가진 물질은 1929년 플레밍에 의해 페니실린이 발견된 이후 많은 발전이 되고 있다. 이후로 많은 종류의 항생 물질이 발견 되었고, 그에 대한 많은 연구가 이루어지고 있다. 미생물들은 각각 다른 종류의 항생제에 대한 반응을 보이고 어떤 항생제에 대해서는 내성을 지니기도 한다. 항생제는 주로 세포내 물질들에 결합하여 세포막 생성저해(페니실린, 세팔로스포린)나, 단백질 합성을 저해(아미노글리코사이드, 테트라사이클린, 클로람페니콜 등)하는 등의 기작에 의해 균에 대한 항균력을 갖는다. 항생제에 대한 내성의 원인은 여러 기작이 있지만 그중 하나는 이들 항생물질이 균의 세포막을 통과하지 못하면 내성을 갖게 된다. 세포막을 통과하기 위해서는 세포막에 존재하는 단백질들에 의해 물질이 유입된다. 하지만 요즘 연구 되고 있는 리포펩타이드류는 소수성과 친수성을 모두 갖고 있기 때문에 세포막의 단백질을 통해서 세포내로 들어가 작용하는 것이 아니라 세포막의 인지질 이중막(lipid bilayer)을 파괴하기 때문에 지금까지 연구되어 온 항생물질보다 유용하게 이용할 수 있는 것으로 보인다.

또한, 병원균으로부터 자유로워지기 위해서는 병원균에 대한 항균물질이 필요하다. 항균물질은 세포막 형성을 저해하거나 유전자 발현을 저해하는 등 여러 기작으로 미생물에 대한 항균력을 갖는다. 우리가 알고 있는 항균물질은 1929년에 플레밍에 의해 발견된 페니실린(penecillin) 이후로, 세팔로스포린(cephalosporin), 아미노글리코사이드(aminoglycoside), 테트라사이클린(tetracycline) 등 여러 종류가 발견되었다. 이 항균물질의 남용으로 인하여 많은 병원성 균들이 저항성을 갖기 때문에 새로운 항균물질의 지속적인 개발이 필요한 실정이다.

한국공개특허 제2012-0023480호 한국공개특허 제2012-0063587호

본 발명의 목적은 항균 활성을 갖는 리시니바실러스(Lysinibacillus sp.) 균주를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 균주를 배양하는 단계를 포함하는 상기 균주로부터 항균 활성을 갖는 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

나아가 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 방법으로 수득한 리시니바실러스(Lysinibacillus sp .) 균주로부터 분리된 항균 활성을 갖는 단백질을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항균 활성을 갖는 리시니바실러스(Lysinibacillus sp .) 균주를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 리시니바실러스 Y-4B KCTC 12284BP 균주일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 썩은 감귤에서 분리된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 유해균주인 Lysinibacillus sphaericus, Pichiascaptomyzae 또는 Staphylococcus aureus subsp . aureus에 대해 항균활성을 가지는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 균주를 배양하는 단계를 포함하는 상기 균주로부터 항균 활성을 갖는 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배양은 상기 균주를 YPD 브로스 배지를 이용하여 24℃에서 7일 ~ 10일 동안 배양하는 것일 수 있다.

나아가 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 수득한 리시니바실러스(Lysinibacillus sp.) 균주로부터 분리된 항균 활성을 갖는 단백질을 제공한다.

본 발명은 신규한 리시니바실러스(Lysinibacillus sp .) Y-4B 균주 및 상기 균주로부터 생산된 항생 단백질에 관한 것으로서, 본 발명의 항생 단백질은 그람 양성균에 대한 항균활성이 있어 이를 유효성분으로 하여 항균성 제제 또는 백신을 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 리시니바실러스(Lysinibacillus sp .) Y-4B 균주는 썩은 감귤에서 분리하여 썩은 감귤 및 감귤 부산물을 활용하여 항생 단백질을 생산할 수가 있기에 감귤 부산물 처리를 효과적으로 할 수 있다.

도 1은 본 발명의 썩은 감귤의 곰팡이를 배양하여 항균성이 있는 미생물을 분리한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 신균주인 리시니바실러스(Lysinibacillus sp .) Y-4B의 분자계통분석 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 신균주인 리시니바실러스(Lysinibacillus sp .) Y-4B에서 분리된 단백질의 최적 배양 온도(24℃, 30℃) 및 배양시간(4일, 7일)을 알아보기 위하여 온도 및 배지의 조건을 달리하여 실험한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 신균주인 리시니바실러스(Lysinibacillus sp .) Y-4B에서 분리된 물질이 무엇인지를 알아보기 위하여 트립신/ EDTA를 처리하였을 때와 하지 않았을 때의 효과를 알아본 결과이다.
도 5는 배양시간에 따른 전체 단백질의 농도와 항균활성을 나타내는 투명원의 크기를 상관적으로 나타낸 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 신균주인 리시니바실러스(Lysinibacillus sp .) Y-4B에서 분리된 단백질의 최적 생산 조건을 알아보기 위하여 배양일 후 1, 4, 7, 10일 째의 배양 효능을 측정한 결과이다.

본 발명은 신규한 리시니바실러스(Lysinibacillus sp .) Y-4B 균주 및 상기 균주로부터 생산된 항생 단백질을 제공한다는 데 그 특징이 있다.

일반적으로 식품 보존 및 안전성 확보를 위하여 합성 보존료 사용, 방사선 조사, 냉동, 항균포장 등 다양한 방법이 이용되고 있다. 그 중 합성 보존료를 사용하는 방법이 가장 널리 이용되고 있지만 인체 유해 가능성이 제시되어 사용이 기피되고 있다. 최근 사회가 발달함에 따라 가공, 편의식품에 대한 사회적 관심이 증대되고 있으며 전반적으로 유기농, 무방부제 제품이 선호되고 있기 때문에 합성 항균제 보다는 천연항균제에 대한 소비자 요구도가 높아지고 있다.

또한, 항균작용을 하는 저분자 항균 펩타이드는 그 생합성 기작에 따라 ribosomal peptide antibiotics와 nonribosomal peptide antibiotics의 두 종류로 구분이 되는데 90% 이상이 nonribosomal peptide antibiotics로 multienzyme complex에 의해 생합성이 된다고 알려져 있다.

한편, 최근 항생제 과다 사용은 항생제 내성 균주의 출현, 항생제의 식용 가축물에 잔류되어 궁극적으로 인간에게 흡수, 축적 되는 문제점을 초래한다.

이에 본 발명에서는 제주산 감귤의 부산물을 처리하는 방법을 개발하던 도중에 곰팡이가 자란 감귤즙에 항균 활성이 있는 것을 확인하고 썩은 감귤즙에서 항균 활성이 있는 균주를 분리 및 동정하고, 16S rRNA의 염기서열을 분석하여 계통학적 분류를 조사한 결과, 동일한 염기서열을 갖는 균주는 존재하지 않았으며, 계통학적으로 리시니바실러스 (Lysinibacillus sp .)에 속하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 동정한 신규한 균주를 2012년 10월 8일일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁하여 기탁번호 KCTC 12284BP를 부여받았고 이를 “리시니바실러스(Lysinibacillus sp .)Y-4B”로 명명하였다.

본 발명에서 분리 및 동정한 상기 리시니바실러스(Lysinibacillus sp .) 균주는 그람 양성 및 그람 음성 미생물에서 항균활성이 뛰어난 특징이 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 상기 신균주가 가지는 항균활성을 분석하기 위해 paper disc(CLSI standard method에 따름) 방법을 이용하여 다양한 미생물에 대한 항균능력을 확인한 결과, 신균주 리시니바실러스(Lysinibacillus sp .) Y-4B는 유해균주인 Lysinibacillus sphaericus , Pichiascaptomyzae 또는 Staphylococcus aureus subsp . aureus에 대해 높은 항균 활성을 보이는 것으로 나타났다(표 2 참조).

따라서 본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 동정한 리시니바실러스 Y-4B 균주가 항균활성을 갖는다는 사실을 확인함에 따라 상기 신균주가 항균활성 물질을 생산할 수 있다고 생각하여 본 발명의 신균주의 배양조건을 달리하여 가장 높은 항균활성을 나타내는 배양 조건을 분석하였다.

본 발명의 일실시예에 따르면, LB broth(SIGMA-AKDRICH, L3022) 및 YPD broth (SIGMA-AKDRICH, Y1375)를 각각 이용하여 배양하였고, 최적의 온도를 검색하기 위하여 24℃와 30℃의 조건에서 각각 실험을 진행하였으며, 배양시간에 따른 조건도 각각 4일 및 7일로 하여 균주를 배양한 후 항균활성을 측정한 결과, 본 발명의 신균주는 YPD broth를 이용하여 24℃에서 7일 이상 배양한 경우, 균주 배양액이 가장 우수한 항균활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었으며, 배양 상층액에 항균활성을 가질 것으로 예측되는 물질이 생기는 것을 알 수 있었다(도 3 참조).

또한 본 발명자들은 본 발명의 신균주가 생산하는 항균활성 물질이 어떠한 특징을 가지는 물질인지 확인하기 위해 침전물이 존재하는 균주의 배양 상층액을 열처리(100℃, 121℃)한 후 항균활성을 분석한 결과 2가지 온도 모두에서 그 활성이 상실된 것을 확인하였고, 트립신/ EDTA 용액을 균주 배양 상층액에 처리한 결과 트립신/ EDTA 용액을 처리하지 않은 경우 정상적인 항균활성을 보였으나 트립신/ EDTA 용액을 처리한 배양액에서 항균활성이 사라진 것으로 나타나 본 발명의 신균주는 항균 활성을 갖는 특정 단백질을 생산할 수 있다는 점을 알 수 있었다.

본 발명의 일실시예에서 배양시간에 따른 생산량(농도), 배양시간에 따른 단백질 정량(bradford assay), 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 및 항균활성 실험을 진행한 결과 배양시간이 지남에 따라 전체 단백질의 농도가 증가했고 이것은 항균활성의 증가로 이어짐을 알 수 있었다(도 5 참조). 뿐만 아니라 본 발명의 균주 배양 상층액에 트립신/ EDTA 용액을 처리한 뒤에도 항균 활성을 가지는 단백질이 존재하고 있는 것을 볼 수 있었는데 실제 실험 결과에서 배양시간이 길어질수록 항생단백질의 생산량이 증가한다는 것을 알 수 있었다(도 6 참조).

따라서 본 발명은 신균주 리시니바실러스(Lysinibacillus sp .)Y-4B ,상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.

본 발명은 리시니바실러스 (Lysinibacillus sp .)Y-4B 균주를 YPD 브로스 배지에서 24℃에서 7일 ~ 10일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 리시니바실러스 (Lysinibacillus sp .)Y-4B 균주를 특징으로 하는 항균 활성을 갖는 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

상기의 방법으로 수득한 항균 활성을 갖는 단백질은 그람 양성균에 대하여 항균 활성을 갖는다. 여기서 “그람 양성균”이란 포도상구균, 연쇄상구균, 폐렴균, 나병균, 디프테리아균, 파상풍균, 탄저균, 방선균등 그람염색법에 의해 자주색으로 변하는 세균을 말하며 색소나 약제에 대한 감수성이 높고, 대사작용에는 아미노산과 비타민을 필요로 한다. 균체외 독소를 방출하는데 이 독소의 독작용은 균종에는 강력하지만 가열하게 되면 쉽게 파괴된다. 이 독소는 생체 내에서 항원성이 높고, 생성된 항체는 독소와 결합하여 그 독성을 중화시키는 특이성을 가지고 있으며 그 밖에 외독소에 포르말린을 작용시키게 되면 독성은 없어지고 항체만 남게 되므로 면역원으로 이용할 수가 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

신균주인 리시니바실러스 ( Lysinibacillus sp . ) Y-4B의 분리

<1-1> 균주의 분리

본 발명자들은 항균능력을 갖는 새로운 항생제를 발굴하기 위해 썩은 감귤의 곰팡이를 YPD agar(SIGMA-AKDRICH, Y1500)에서 연속적인 획선배양 방법을 이용하여 단일 집락이 형태상으로 순계의 집락을 이룰 때까지 배양시켰다. 여기에서 배양된 단일 집락은 다시 YPD broth (SIGMA-AKDRICH, Y1375)를 이용하여 배양한 후, 배양액으로부터 항균 활성을 갖는 미생물을 분리하였는데, 그 결과, 8개의 미생물 집락을 분리할 수가 있었으며, 8개의 미생물 집락을 대상으로 paper disc(CLSI standard method에 따름) 방법을 이용하여 항균 활성을 조사한 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 특정 균주가 우수한 항균활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었다(도 1 참조).

<1-2> 선별된 균주의 동정

a. 형태학적 동정

상기 실시예 <1-1>에서 항균활성이 우수한 균주를 동정하기 위해 먼저 현미경을 통해 균주의 형태학적 모양을 관찰하였다.

관찰 결과, 동정된 균주의 세포는 편성 호기성의 세포 크기가 0.9-1.1 x 3.0-5.0 mm이며, 단일집락의 모양은 둥글고 그 색은 반투명 회색의 구형을 이루는형태를 띄는 것으로 관찰되었다(결과 미도시).

b. 분자생물학적 동정

형태학적 특징 이외에 분자생물학적 특징을 조사하기 위해 상기 형태학적 분석을 수행한 균주를 대상으로, DNeasy plant mini kit(QIAGEN, 69104)를 이용하여 DNA를 추출하였으며, 이렇게 얻어진 염색체 DNA는 미생물 동정을 위하여 16s rRNA gene을 27F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)와 1492R(TACGGYTACCTTGTTACGACTT) 프라이머로 일반적인 조건 하에서 중합효소 연쇄반응을 이용하여 증폭하였다. 증폭된 DNA는 아가로즈 겔 전기영동을 이용하여 그 길이를 확인 후 27F, 337F, 518F, 785F, 518R, 800R, 1492R 염기서열 분석 프라이머를 이용하여 16s rRNA gene의 전체 염기서열 분석을 하였다.

또한, 진화계통상 본 발명의 신 균주가 어디에 속하는지 확인하기 위하여 nucleotide BLAST(NCBI, NIH, USA) 프로그램을 이용하여 염기서열의 상동성을 비교하였다.

그 결과, 본 발명의 신균주는 Lysinibacillus macroides strain 608(DQ350821) 및 Lysinibacillus fusiformis isolate LLP(DQ333300)와 상동성이 각각 96.2%와 96.8%로 나타났으며, 이후 이러한 결과를 토대로 보다 정확한 분류를 확인하기 위하여 EzTaxon-e(Chunlab, SNU, Korea)를 사용하여 최종적인 분자동정을 하였으며, 그 결과는 하기 표 1에 기재된 바와 같다.

표 1의 상동성을 토대로 MEGA5를 이용하여 분자계통 분석을 진행한 결과, 본 발명에서 동정한 균주는 도 2와 같이 리시니바실러스 속에 속하는 균주인 것으로 나타났으며, 본 발명자들은 상기 동정한 균주의 염기서열을 분석하였고, 그 염기서열을 서열번호 1에 나타내었으며, 이러한 염기서열을 갖는 균주는 기존에 존재하지 않는 신규한 균주임을 확인함으로써, 2012년 10월 8일일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁하여 기탁번호 KCTC 12284BP를 부여받았다. 또한, 본 발명자들은 상기 본 발명에서 분리 및 동정한 신균주를 “리시니바실러스 Y-4B"로 명명하였다.

< 실시예 2>

본 발명에서 동정한 신균주인 리시니바실러스 Y-4B의 항균활성 분석

상기 실시예 1에서 분리 및 동정한 신균주인 리시니바실러스 Y-4B의 항균활성을 분석하기 위해, paper disc(CLSI standard method에 따름) 방법을 이용하였다. 보다 상세하게 상기 항균활성 실험은 신균주인 리시니바실러스 Y-4B 균주가 다른 유해 균주에 대한 항균력 테스트를 통해 수행하였는데, 본 발명의 균주를 YPD broth(SIGMA-AKDRICH, Y1375)에서 배양한 후, 배양액을 LB agar(1.5%, w/v)에 1.5x10⁸CFU로 되게 희석하여 평판배양하고 그 위에 종이원판을 올려놓고 그 종이원판에 배양액(유해 균주의 배양액과 본 발명의 균주가 배양된 배양액) 및 항생제인 엠피실린(Ampicillin) 과 카나마이신(Kanamycin)을 첨가하여 항균 활성을 분석하였다.

그 결과, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 신균주인 리시니바실러스 Y-4B는 Lysinibacillus sphaericus 에 대해 가장 우수한 항균 활성을 보이는 것으로 나타났으며, 이 외에도 Pichiascaptomyzae 및 Staphylococcus aureus subsp . aureus에 대해서도 항균활성을 보이는 것으로 나타났다. 특히 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)은 미국 1973~1987년 통계에 의하면 돼지고기 96건, 베이커리 26건, 쇠고기 22건, 칠면조 20건, 닭고기 14건, 달걀 9건 등에서 구토(82%), 구역질(74%), 위경련(64%), 설사(68%), 두통, 근육경련 등의 식중독을 일으키고 사망에 이르게 하는 주요 식중독균으로 본 발명에서 Y-4B 균주가 생산하는 항생단백질은 황색포도상구균을 안전하고 효과적으로 제어할 수 있음과 식품보존제로 이용가능성을 보여준다.

< 실시예 3>

본 발명의 신균주로부터 항균활성 물질의 분리 및 생산 조건 확립

<3-1> 본 발명의 신균주가 우수한 항균활성을 가질 수 있는 배양조건 확립

상기 실시예 2를 통해 본 발명에서 분리 및 동정한 리시니바실러스 Y-4B 균주가 항균활성을 갖는다는 사실을 확인함에 따라 본 발명자들은 상기 신균주가 항균활성 물질을 생산할 수 있다고 착안하였고, 먼저 본 발명의 신균주의 배양조건을 달리하여 가장 높은 항균활성을 나타내는 배양 조건을 분석하였다. 이를 위해 균주를 배양하는 온도 및 배지의 조건을 달리하여 배양하였는데, LB broth(SIGMA-AKDRICH, L3022) 및 YPD broth (SIGMA-AKDRICH, Y1375)를 각각 이용하여 배양하였고, 최적의 온도를 검색하기 위하여 24℃와 30℃의 조건에서 각각 실험을 진행하였으며, 배양시간에 따른 조건도 각각 4일 및 7일로 하였고 이러한 조건 하에서 균주를 배양한 후 미세여과를 통하여 침전물 여부를 체크하고 항균활성을 측정하였다. 이때 항균활성은 유해 균주로 Lysinibacillus sphaericus 와 Enterobacter aerogenes를 각각 사용하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 신균주는 YPD broth를 이용하여 24℃에서 7일 이상 배양한 경우, 균주 배양액이 가장 우수한 항균활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었으며, 배양 상층액에 항균활성을 가질 것으로 예측되는 물질이 생기는 것을 알 수 있었다.

<3-2> 본 발명의 신균주로부터 항균활성을 가지는 물질의 분리

앞서 수행한 실험을 통해 본 발명자들은 본 발명의 신균주가 생산하는 항균활성 물질이 어떠한 특정을 가지는 물질인지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 우선, 침전물이 존재하는 균주의 배양 상층액을 열처리(100℃, 121℃)한 후 항균활성을 분석하였더니 2가지 온도 모두에서 그 활성이 상실된 것을 확인하였다.

이 결과를 통해 본 발명자들은 항균활성 물질이 고온에서는 그 활성이 파괴되거나 상실될 수 있는 화학물질 또는 단백질이라는 것을 예상할 수 있었으며, 이 물질이 화학물질 또는 단백질 중 어느 것인지 확인하기 위하여, 트립신/ EDTA 용액을 균주 배양 상층액에 처리하였다.

이러한 이유는 단백질 분해효소인 트립신의 경우, 단백질의 라이신과 아르기닌을 특이적으로 절단하는 특징이 있어, 트립신 처리 시 그 활성이 감소되거나 사라지게 된다면, 본 발명의 항균활성 물질은 단백질이라는 것을 알 수 있기 때문이다.

이러한 점을 토대로 실험을 수행한 결과, 본 발명의 신균주 배양 상층액에 트립신을 처리하지 않았을 경우, 정상적인 항균활성을 보였으나, 트립신/ EDTA 용액을 처리한 배양액에서는 항균활성이 사라진 것으로 나타났다(도 4 참조). 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 신균주가 항균 활성을 가지는 특정 단백질을 생산할 수 있다는 점을 알 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 본 발명의 신균주에서 생산된 항균활성을 가지는 단백질의 최적 생산 조건을 알아보기 위하여 배양시간에 따른 생산량(농도), 배양시간에 다른 단백질 정량(bradford assay), 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 및 항균활성 실험을 진행하였다.

그 결과, 배양시간이 지남에 따라 전체 단백질의 농도는 증가한 것으로 나타났고, 이것은 항균활성의 증가로 이어진 것을 확인할 수 있었다(도 5 참조).

뿐만 아니라, 본 발명의 균주 배양 상층액에 트립신/ EDTA 용액을 처리한 뒤에도 항균 활성을 가지는 단백질이 고농도로 존재하고 있어 이 단백질이 전부 분해되지 않고 일부가 남아 있어서 항균 효과를 나타내는 것을 알 수 있었는데, 실제 실험결과에서 배양시간이 길어질수록 트립신/ EDTA 용액을 처리했음에도 불구하고 부분적으로 항균활성이 나타나는 것을 보아 항생단백질은 본 발명의 신균주의 배양시간이 지남에 따라 점차 생산량이 증가한다는 것을 알 수 있었다(도 6 참조).

따라서, 이상과 같은 실험 결과를 통해 본 발명자들은 썩은 감귤에서 분리해 낸 본 발명의 Y-4B 균주가 리시니바실러스 에 속하는 신균주이며, 항균활성을 갖는 단백질을 생산하는 활성이 있고, 최대의 항균활성을 가질 수 있기 위해서는 YPD broth 배지를 이용하여 24℃의 온도에서 7일 이상 배양하는 것이 가장 효과적이라는 사실을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC12284BP

20121008

<110> Cheju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel strain Lysinibacillus sp. Y-4B and antimicrobial composition comprising the same <130> PN1208-436 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1526 <212> DNA <213> Lysinibacillus sp. Y-4B <400> 1 agtttgatcm tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcga 60 acagaaaagg agcttgctcc tttgacgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggcaa 120 cctaccctat agtttgggat aactccggga aaccggggct aataccgaat aatctctttt 180 gcttcatggt aagagactga aagacggttt tcgctgtcgc tataggatgg gcccgcggcg 240 cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300 ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360 gaatcttcca caatgggcga aagcctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggtttt 420 cggatcgtaa aactctgttg taagggaaga acaagtacag tagtaactgg ctgtaccttg 480 acggtacctt attagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540 tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg caggcggtcc tttaagtctg 600 atgtgaaagc ccacggctca accgtggagg gtcattggaa actgggggac ttgagtgcag 660 aagaggaaag tggaattcca agtgtagcgg tgaaatgcgt agagatttgg aggaacacca 720 gtggcgaagg cgactttctg gtctgtaact gacgctgagg cgcgaaagcg tggggagcaa 780 acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt 840 ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggtcgca 900 agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960 tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatccc gttgaccact gtagagatat 1020 agtttcccct tcgggggcaa cggtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt 1080 gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc catcatttag 1140 ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat 1200 catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacgatac aaacggttgc 1260 caactcgcga gagggagcta atccgataaa gtcgttctca gttcggattg taggctgcaa 1320 ctcgcctaca tgaagccgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg 1380 ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg 1440 tgaggtaacc ttttggagcc agccgccgaa ggtgggatag atgattgggg tgaagtcgta 1500 acaaggtagc cgtaaagggc gaattc 1526

Claims

리시니바실러스 스파에리쿠스(Lysinibacillus sphaericus), 피치아스캅토마이재(Pichiascaptomyzae) 또는 스타필로코커스 아우루스(Staphylococcus aureus subsp.aureus)에 항균 활성을 갖는 리시니바실러스 속(Lysinibacillus sp.) Y-4B KCTC 12284BP 균주.
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제1항에 있어서,
상기 균주는 썩은 감귤에서 분리된 것을 특징으로 하는 균주.
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제1항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물.
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제1항의 균주를 YPD 브로스 배지를 이용하여 24℃에서 7일 ~ 10일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
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