CN114540215B - 一种枯草芽孢杆菌brs-1及其应用 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌brs-1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌BRS‑1及其应用。本发明从土壤中分离鉴定得到一株枯草芽孢杆菌，将其命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BRS‑1。本发明经过试验验证，该枯草芽孢杆菌BRS‑1可以起到水解淀粉和制备抗生素的作用，同时还可以抑制多种微生物的生长，尤其是抑制真菌的生长，具有广泛的抗菌谱。本发明提供的枯草芽孢杆菌BRS‑1可以促进动物生长、提高鸡的产蛋量，还能有效抑制草莓病害，以及提高植物产量，在农业生产领域具有重要意义。

Description

一种枯草芽孢杆菌BRS-1及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌BRS-1 及其应用。
背景技术
化学农药的施用会严重的污染水体和土壤，破坏生态系统，甚至 会引起人和动植物急性或慢性中毒。化肥的大量施用会引起土壤退化， 农作物品质下降。因此，人们对于有能力防治植物病害、促进植物生 长的制剂和材料的需求与日俱增。希望新制剂能解决病害对现有农药 的抗性的问题，或能扩大对病害的防治范围，或使现有的化学农药不 再使用或减少使用。生物来源的制剂由于无毒无害，且在其环境中不 会永久残留而备受青睐。
再者，抗生素在维持动物和人类健康方面的应用，尤其是在家禽， 鱼类及贝类等养殖中的应用受到越来越多的关注。这致使抗生素的高 效替代品成为一种需求。使用益生菌或其产生的活性物质将是一种潜 在替代方案。
枯草芽孢杆菌是一种益生菌，有良好的热稳定性和化学稳定性， 有可能被开发为新的饲料添加剂和生物农药或生物肥料，对于实现农 业生产系统的可持续发展有着重要的意义。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种枯草芽 孢杆菌BRS-1及其应用。
本发明从土壤中筛选并鉴定得到一株枯草芽孢杆菌，命名为枯草 芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BRS-1，并将其提交保藏，具体的保藏信 息如下：
保藏编号：CGMCC No.23476，分类命名为：枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 邮编为100101，保藏日期：2021年9月24日。
本发明进一步提供包括所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BRS-1的菌剂。
所述菌剂可以是多种形式的菌剂，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BRS-1发酵液、将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BRS-1发 酵液添加于饲料中、将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BRS-1发酵液 制备成菌粉等。
本发明进一步提供所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BRS-1 的菌剂或所述菌剂在淀粉水解中的应用。
本发明进一步提供所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BRS-1 的菌剂或所述菌剂在制备抗生素中的应用。
本发明进一步提供所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BRS-1 的菌剂或所述菌剂在所述抗生素包括丰原素和/或表面活性素；
所述丰原素包括：C14 Fengycin A、*C15 Fengycin A、C15 Fengycin A、*C16Fengycin A、C16 Fengycin A、C17 FengycinA、C18 Fengycin A、*C15 Fengycin B、C15Fengycin B、*C16 Fengycin B、 C16Fengycin B、C19 Fengycin B或C20 Fengycin B中的一种或多种；* 是指C链含有一个双键。
所述表面活性素包括：C12 Surfactin A、C13 Surfactin A、C14 Surfactin A、C15 Surfactin A、C16 Surfactin A、C17 Surfactin A、C13 Surfactin B、C14SurfactinB、C15 Surfactin B或C16 Surfactin B中的一 种或多种。
本发明进一步提供所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BRS-1 的菌剂或所述菌剂在抑制微生物中的应用；
所述微生物包括：绿色木霉、曲弗里弯孢霉、苹果斑点落叶病菌、 棉花链格孢、白菜环斑病菌、苹果轮纹病菌、苹果腐烂病菌、油菜核 盘菌、可可毛色二孢、烟草赤星菌、稻瘟菌3-2、烟草黑胫菌、赤霉 菌、番茄灰霉、灰霉菌、瓜棒孢霉菌、木贼镰孢菌、苹果炭疽菌、橄榄小孢拟盘多毛孢、尖孢镰刀菌、轮枝镰刀菌中的一种或多种。
本发明进一步提供所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BRS-1 的菌剂或所述菌剂在促进动物生长中的应用。
所述动物包括禽、反刍动物、脯乳动物或水产鱼类中的一种或多 种，例如鸡、鸭、鸽子、猪、牛、羊、鱼、虾、海参或中的一种或多 种。
本发明进一步提供所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BRS-1 的菌剂或所述菌剂在提高鸡的产蛋量中的应用。
本发明进一步提供所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BRS-1 的菌剂或所述菌剂在降低草莓白粉病或根腐病的发病率中的应用。
本发明进一步提供所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BRS-1 的菌剂或所述菌剂在提高植物产量中的应用。
本发明具备如下有益效果：
本发明从土壤中分离鉴定得到一株枯草芽孢杆菌，将其命名为枯 草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BRS-1。该枯草芽孢杆菌BRS-1具有水 解淀粉、生产抗生素、抑制微生物的作用。此外，还能够促进动物生 长，提高植物产量，以及抑制草莓病菌病害，在农业生产领域具有重 要意义。
附图说明
图1为本发明实施例2提供的枯草芽孢杆菌BRS-1淀粉水解示意 图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1-枯草芽孢杆菌BRS-1发酵液具有广谱的抗真菌活性， 这表明BRS-1具有开发成更高效的生物农药的潜力。
本发明从土壤中筛选并鉴定得到一株枯草芽孢杆菌，命名为枯草 芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BRS-1，并将其提交保藏，具体的保藏信 息如下：
保藏编号：CGMCC No.23476，分类命名为：枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 邮编为100101，保藏日期：2021年9月24日。
为了评估BRS-1在Endo-KNO3培养基中培养48h后的发酵液对 真菌生长的抑制效应，进行平板对峙实验。
甘油管保存的枯草芽孢杆菌BRS-1在LB固体培养基划板，37℃ 培养过夜，次日挑取单菌落于100mL/250mL LB液体培养基中， 37℃，200rpm培养12h，按2％的接种量接种于100mL/250mL Endo-KNO3培养基中，35℃，200rpm培养48h，取发酵液 10,000-11,000rpm离心10min取上清，将上清液在超净台用0.22μm 的无菌过滤器过滤四遍。
在PDA固体培养基平皿底部标上中心点，然后接种直径为0.6 cm的受试病原菌菌饼，在中心点垂直的四个方向3cm处分别用打 孔器打出4个孔洞，在孔洞中加入100μL的BRS-1菌株无菌发酵上 清液，以不加BRS-1菌株无菌发酵上清液的作为对照。待对照组的病原菌长到培养皿的3/4时，计算菌株BRS-1发酵液上清抑菌率。 每个处理设置3个重复。
抑菌率(％)＝(对照组菌落的平均直径-处理组菌落的平均直径)/ 对照组菌落的平均直径×100％。
菌株BRS-1发酵液上清对21种丝状真菌有很好的抑菌效果(表 1)，如Botryospuaeria dothidea,Fusahum graminearum,Curvularia trifolii,Fusariumoxysporum,Valsa mali,Glomerella cingulat, Phytophthora parasiticavar.nicotanae,Alternaria mali rob,Alternaria alternata,Fusarium equiseti,Lasiodiplodia theobromae,Sclerotinia sclerotiorum,Alternaria gossypina,Corynespora cassiicola, phyllosticta brassicea,Magnaporthe grisea 3-2,Botrytis cinerea Pers, Trichoderma viride,Pestalotiopsis microspore,Botrytiscinerea, Fusarium verticillioides。
表1枯草芽孢杆菌BRS-1培养液上清抗菌活性物质抑菌谱
枯草芽孢杆菌BRS-1对农杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等 细菌无抑制效果，对黄曲霉、黑曲霉等真菌没有抑菌效果。
结果表明，枯草芽孢杆菌BRS-1可以用作生物控制剂或土壤修 复剂以抑制各种病原菌。
实施例2枯草芽孢杆菌BRS-1活菌能产生淀粉水解酶水解淀 粉，说明BRS-1具有作为生产淀粉酶的潜力。
为了证明枯草芽孢杆菌BRS-1能产生淀粉水解酶水解淀粉的功 能，本发明进行了枯草芽孢杆菌BRS-1点接淀粉琼脂平板实验。
培养基配制：蛋白胨：5g，NaCl：5g，可溶性淀粉5g，琼脂： 20g，蒸馏水定容至1000mL，PH：7.2，121℃灭菌20min后倒平 板。
BRS-1在LB培养基中培养12h后，点接于淀粉琼脂平板，于 37℃培养箱中培养48h。然后将碘试剂直接滴浸于培养基表面。
立即检视结果(如图1所示)，BRS-1菌落周围出现无色透明 圈，淀粉琼脂平板培养基边缘呈深蓝色，说明BRS-1菌落周围的淀 粉被淀粉水解酶水解了，形成透明圈。
因此，BRS-1可以成为生产淀粉酶的菌株。
实施例3枯草芽孢杆菌BRS-1抗菌脂肽的成分鉴定。
为了鉴定出枯草芽孢杆菌BRS-1抗菌脂肽的分子结构，本发明 利用超高效液相-飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)方法对枯草 芽孢杆菌BRS-1抗菌脂肽进行定性分析。
枯草芽孢杆菌BRS-1抗菌脂肽按下述方法制备：
采用超高效液相-飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)方法鉴 定枯草芽孢杆菌BRS-1发酵液中脂肽分子的结构，液相参数如下： 流动相A为0.1％HPLC级甲酸水溶液，流动相B为HPLC级甲醇； 洗脱梯度：0.1min，70％B；0.1min-2.0min，70％B；2.0min-8.0min，70％-100％B；8.0min-10min，100％B；10.1min，70％B，10.1min-13 min 70％B；流速为0.3mL/min，色谱柱采用Waters BEH C18(50mm ×2.1mm，1.7μm particle)；质谱方法：采用正离子模式分析，MS tune 参数：脱气速度500L/h，脱气温度500℃，锥孔气流50L/h，源温度为120℃，毛细管电压和锥孔电压分别为3.0KV和30V。数据收 集时间为0.5sec，质荷比范围为100m/z～1,200m/z。碰撞电压设定 为25V，并根据实际情况微调。
根据二级质谱中碎片离子所产生的特征离子峰分析，枯草芽孢 杆菌BRS-1发酵液中脂肽分子的结构主要是Fengycin和Surfactin。 其中共鉴定枯草芽孢杆菌BRS-1抗菌脂肽中Fengycin家族成员13 种(表2)。其中包括C14-C18 Fengycin A和C15-C20 FengycinB， 鉴定出的C14-C18 Fengycin A和文献报道一样，鉴定出的C19 Fengycin B和C20Fengycin B为首次报道，可能具有新的功能。共 鉴定Surfactin家族成员10种(表3)。其中包括C12-C17 Surfactin A和C13-C16 Surfactin B，根据文献报道Surfactin一般含有13-15 个碳原子(Pecci et al.,2010)，本研究中C16 Surfactin A、C17 Surfactin A和C16Surfactin B第一次报道，可能具有特殊活性。
Fengycin和Surfactin的鉴定结果列于表2和表3。
表2Fengycin分子鉴定结果
表3Surfactin分子鉴定结果
实施例4枯草芽孢杆菌BRS-1发酵液可以作为饲料添加剂以 改善白羽肉鸡的生长。
长期使用抗生素作为饲料添加剂会导致动物产生抗药性、药物 残留和环境污染。而抗生素的滥用会直接导致了细菌出现耐药性， 这是问题已经日益引起关注，因此发现和开发出一款替代传统抗生 素的新药已成为必要。本发明利用0.8％枯草芽孢杆菌BRS-1的发酵 液作为白羽肉鸡日常饮用水，研究枯草芽孢杆菌BRS-1对白羽肉鸡 的促生作用，具体如下：
从第1天到38天，将稀释到0.8％枯草芽孢杆菌BRS-1发酵液 (菌株枯草芽孢杆菌BRS-1发酵液于LB液体培养基中28℃培养、 200rpm条件下培养36h，30亿CFU/ml)作为白羽肉鸡日常饮用水， 并用基础饲料饲养白羽肉鸡作为试验组；
食用基础饲料并饮用无任何添加剂的水的白羽肉鸡作为阴性对 照(CK)。
食用基础饲料+枯草芽胞杆菌2g/20kg(市售产品，2000亿/g， 最终添加量200亿/Kg饲料)的白羽肉鸡作为阳性对照1。
食用基础饲料+枯草芽胞杆菌1g/kg(市售产品，2000亿/g，最 终添加量2000亿/Kg饲料)的白羽肉鸡作为阳性对照2。
将稀释到0.8％枯草芽孢杆菌HF1发酵液(菌株HF1发酵液于 Endo-KNO3液体培养基中28℃培养、200rpm条件下培养36h,30亿 CFU/ml。枯草芽孢杆菌HF1为已有专利记载的优良专利菌株，保藏 号为CGMCC No.11487，专利号为ZL201680061786.5)作为白羽肉 鸡日常饮用水，并用基础饲料饲养白羽肉鸡作为阳性对照3。
每组5栏，每栏10只，公母各半。饲养38天后各称其体重进 行比较，结果见表4。
表4枯草芽孢杆菌BRS-1饲养白羽肉鸡后其体重结果
**试验组与阴性对照及阳性对照1、2和3相比差异都显著
当在第38天试验结束时，试验组白羽肉鸡的平均体重为2148.40 ±68.05g，阴性对照(CK)的平均体重为1886.40±129.4g；阳性对照 1的平均体重为1940.2±110.9g；阳性对照2的平均体重为1910.6± 141.2g；阳性对照3的平均体重为2040.8±122.3g。
试验组与阴性对照(CK)、阳性对照1、阳性对照2和阳性对照3 相比，白羽肉鸡的体重增长率分别为14.3±7.6％、11.0±5.9％、13.0 ±8.7％和5.6±6.1％。
在另外独立的试验中，菌株BRS-1发酵液按照0.2％-1％(体积 /重量)添加到肉鸡饲料中，都能够显著促进肉鸡的生长。
本发明还证明了当用添加有干燥形式的枯草芽孢杆菌BRS-1培 养物的固体(稻壳或轻质碳酸钙)饲养白羽肉鸡时，也表现出了显 著提高白羽肉鸡体重的结果。
因此，枯草芽孢杆菌BRS-1可以作为饲料添加剂以改善白羽肉 鸡的生长。
实施例5枯草芽孢杆菌BRS-1显著促进反刍动物肉牛的生长
本发明利用枯草芽孢杆菌BRS-1(轻质碳酸钙为载体，300亿 CFU/g)的发酵液喷干产物为饲料添加剂，研究枯草芽孢杆菌BRS-1 对安格斯肉牛的促生作用。
实验动物为安格斯肉牛，实验共分2组，每组6头，共12头， 每头用耳标标记。
第一组阴性对照组，饲喂常规饲料和精料。
第二组为实验组，在饲喂常规饲料和精料的基础上添加枯草芽 孢杆菌BRS-1(轻质碳酸钙为载体，300亿CFU/g)，添加比例为 精料的0.252％。
精料补充料为自制的产品，含玉米和豆粕，总粗蛋白16％(参 考河北定兴县粤兴饲料有限公司的育肥牛精料补充料，产品503)。 以上各组精料和草料的比例是1:6。实验共进行40天。实验前空腹 测体重，试验后再空腹测体重，试验结果见表5。
表5枯草芽孢杆菌BRS-1作为饲料添加剂饲养安格斯肉牛增重结果
注：*，P＜0.05，差异显著。**，P＜0.01，差异极显著。
在饲养40天后，试验组的安格斯肉牛平均增长了38.83±13.91kg， 增重百分比为16.58％；阴性对照组的安格斯肉牛平均增长了 24.75±4kg，增重百分比8.96％。试验组的平均体重比阴性对照组多 增加14.08公斤，且试验组的增重百分比也显著高于阴性对照组。 另外，其他观察结果表明实验过程中使用枯草芽孢杆菌BRS-1的肉 牛活跃度高、毛色发亮、粪便成型。
本发明还经过试验验证，菌株BRS-1菌粉按照0.1％-1％(体积 /重量)添加到肉牛精料补充料中，都能够显著促进肉牛的生长。
因此可以得出结论，枯草芽孢杆菌BRS-1可以显著地促进安格 斯肉牛生长，且能改善肉牛的健康状况，包括活跃度、毛色亮、粪 便。
实施例6枯草芽孢杆菌BRS-1促进鲤鱼体重增加，降低料肉比。
枯草芽孢杆菌作为抗生素添加剂的替代品备受关注，其应用也 从以前的畜牧业逐渐应用到养殖业中来。本发明利用枯草芽孢杆菌 BRS-1的发酵液为饲料添加剂，研究枯草芽孢杆菌BRS-1对鲤鱼的 促生作用，具体流程如下：
选择15日龄，体重10-20克鲤鱼1,000尾。随机共分2组，分 别是阴性对照组、试验组。每个组500条。每组独立使用一个鱼池。 每个鱼池使用前进行规范消杀，鱼池水质相同。
对照组饲喂常规饲料(肇东市双强饲料厂鱼种1号饲料)。
实验组饲喂常规饲料，另加枯草芽孢杆菌BRS-1发酵液(30亿 CFU/ml)，按照0.4％(体积/重量)添加到鱼饲料中。
饲料制粒方法，用枯草芽孢杆菌发酵液加少许水浸透鱼食之后 阴凉处晾干，收集在透气的编织袋中。以0.4％添加量为例：吸取0.8 mL样品培养液加入到50mL蒸馏水中，充分混匀；然后将其加入 到200g鱼饲料中，拌匀(此过程中又加入少量适量的水)，保证无 明显的积水存在及无明显鱼饲料颗粒破碎。最后将其均匀地摊开在 干净的朔料盒中，放在阴凉处(阴面，无阳光照射)，通风晾干(3-4 天，此过程中鱼饲料进行了5-6次重新混匀，以使其充分晾干)。 整个试验周期68天，每个组喂鱼食均为38公斤。整个实验周期， 未发现因病死亡的情况。整个实验过程未使用任何药物。实验前空 腹测体重。在第69天再进行空腹称重，分别统计每个鱼池鲤鱼的数 量和体重，试验结果见表6。
表6枯草芽孢杆菌BRS-1饲喂鲤鱼后体重结果
在喂养68天后，试验组平均每条鲤鱼增重77.55g，阴性对照组 平均每条鲤鱼增重72.87g。试验组与阴性对照相比体重增加6.42％， 料肉比降低3.33％。
鲤鱼喂养实验结束后，随机挑选实验组和对照组各3条鱼，解 剖，取小肠用生理盐水洗净后，用4％福尔马林固定。将固定的小肠， 常规实验程序进行石蜡切片并用HE染色，在显微镜下观察小肠绒 毛长度。绒毛长度统计结果见表7。
表7枯草芽孢杆菌BRS-1饲喂鲤鱼后绒毛长度统计结果
注：**，P＜0.01，差异极显著
在显微镜下观察阴性对照组鲤鱼绒毛的平均长度为
297.99±26.14μm，试验组鲤鱼绒毛的平均长度为668.67±51.58μm， 试验组比阴性对照增加124.39％。
本发明还经过试验验证，菌株BRS-1发酵液按照0.2％-1％(体 积/重量)添加到鱼饲料中，都能够显著促进鲤鱼的生长。
因此可以得出结论，枯草芽孢杆菌BRS-1(0.4％)有促进鲤鱼 生长的作用，且可显著促进鲤鱼绒毛的生长，增加小肠对营养的吸 收。
实施例7枯草芽孢杆菌BRS-1作为饲料添加剂促进蛋鸡的产 蛋量
本发明利用枯草芽孢杆菌BRS-1作为饲料添加剂饲养海兰褐蛋 鸡，研究其对蛋鸡产蛋量的影响，具体流程如下：
选用120只402日龄海兰褐蛋鸡作为试验对象，分为实验组和 阴性对照组，每组60只鸡。阴性对照组用常规饲料，实验组在常规 饲料中添加枯草芽孢杆菌BRS-1饲料添加剂(320亿CFU/g)，添 加剂量为160g/吨饲料。饲料用量均为120克/只/天。实验周期28 天。实验开始前一周对照组产蛋个数360枚，蛋重量22.96公斤； 实验组342枚，蛋重量22.58公斤。实验过程中每周记录周产蛋数 和蛋重，粪便和生长状态。4周后统计分析结果，结果见表8。
表8枯草芽孢杆菌BRS-1饲养海兰褐蛋鸡后的产蛋数和蛋重结果
试验第一周结束后，阴性对照组总产蛋数为367枚，总蛋重为 23.41kg；试验组总产蛋数为349枚，总蛋重为23.05kg。试验第二 周结束后，阴性对照组总产蛋数为409枚，总蛋重为25.41kg；试验 组总产蛋数为400枚，总蛋重为26.10kg。试验第三周结束后，阴性 对照组总产蛋数为357枚，总蛋重为22.50kg；试验组总产蛋数为 366枚，总蛋重为23.34kg。试验第四周结束后，阴性对照组总产蛋 数为456枚，总蛋重为28.82kg；试验组总产蛋数为484枚，总蛋重 为30.63kg。阴性对照四周总计产蛋1589枚，总蛋重为100.13kg。 试验组四周总计产蛋1599枚，总蛋重为103.12kg。
实验结果表明：实验结束时实验组与对照组比较产蛋总数增加 10枚，蛋总重增加2.99公斤。实验结束后，实验组最后一周的产蛋 数为484枚，蛋重30.63公斤，比实验之前342枚，22.58公斤，分 别提高了41.52％和35.65％。而对照组最后一周的产蛋数为456枚，蛋重28.82公斤，比实验之前360枚，22.96公斤，分别提高了26.67％ 和25.52％，产蛋数和蛋重的增重百分比，实验组均高于对照组。在 实验过程中，每组蛋鸡数量相同，每组均为60只，饲喂时两组饲料 用量相同，均为120克/只/天。在整个试验周期两组饲料用量201 公斤，实验组料蛋比1.949，对照组2.003。料蛋比，实验组小于对 照组。在实验进行到第三周时，两组蛋鸡均发生了腹泻，影响了生 产性能，实验组产蛋数366枚，蛋重23.34公斤，比第二周400枚， 26.1公斤分别下降了8.50％和10.57％。而对照组产蛋数357枚，蛋 重22.5公斤，比第二周409枚，25.4公斤分别下降了12.71％和11.42％。 产蛋数和蛋重降低百分比对照组高于实验组。在实验进行到第5天 两组粪便外观出现差异，实验组粪便发干成型，对照组粪便比实验 组稍稀且不完全成型。第三周两组均发生腹泻，从粪便外观来看对 照组更严重，从病程来看，实验组时间短，3天就恢复正常，对照 组需要6天。
本发明同时实验证明，枯草芽孢杆菌BRS-1饲料添加剂添加量 160g/吨，260g/吨，360g/吨，均能显著促进蛋鸡200-420天蛋鸡的 产蛋总重量。
因此可以得出结论，枯草芽孢杆菌BRS-1作为饲料添加剂能促 进蛋鸡的产蛋量。
实施例8-枯草芽孢杆菌BRS-1菌液显著降低草莓白粉病发病 率
草莓白粉病是由羽衣草单囊壳侵染所引起的、发生在草莓上的 一种病害。主要危害叶片、叶柄、花器、果实、果柄。是草莓生产 中的主要病害，会严重影响草莓的产量、品质和经济效益。本发明 利用枯草芽孢杆菌BRS-1的发酵液(Endo-KNO3培养基，35℃,200 rpm，培养48小时，菌含量为3×109/ml，发酵液用水稀释300倍) 去防治草莓白粉病，研究枯草芽孢杆菌BRS-1对草莓白粉病的防治 效果，具体流程如下：
叶部白粉病的防治方法：同一个大棚内，选取发病程度基本一 致的300片草莓叶片，并对叶片做标记；试验随机分成6组，2个 处理，即以水为阴性对照，300倍枯草芽孢杆菌BRS-1稀释菌液为 试验组。将水和枯草芽孢杆菌BRS-1稀释后的菌液均匀地喷于草莓 叶片的正和背面。处理5天后，统计防治效率。在处理之前，统计 病情指数。
叶片分级标准如下：
0级，无病斑；
1级，病斑面积占整个叶面积的5％以下；
3级，病斑面积占整个叶面积的6％～15％；
5级，病斑面积占整个叶面积的16％～25％；
7级，病斑面积占整个叶面积的26％～50％；
9级，病斑面积占整个叶面积的50％以上。
果实白粉病的防治方法：同一个大棚内，选取发病程度基本一 致的300个草莓果，并逐一做标记；试验随机分成6组，2个处理， 即以水为阴性对照，300倍枯草芽孢杆菌BRS-1稀释菌液为试验组。 将水和枯草芽孢杆菌BRS-1稀释后的菌液均匀地喷于草莓叶片的正和背面。处理5天后，统计防治效率。在处理之前，统计病情指数。
果实分级标准：
0级，无病斑；
1级，病斑面积占果实面积的15％以下；
3级，病斑面积占果实面积的16％～30％；
5级，病斑面积占果实面积的31％～50％；
7级，病斑面积占果实面积的50％以上。
草莓叶片或果实白粉病的病情指数的计算公式如下：
病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级 值)×100
枯草芽孢杆菌BRS-1发酵液对草莓叶片或果实白粉病的防治效 果按Henderson-Tilton公式计算：
式中CK0、CK1分别为对照区施药前和施药后的病情指数，Pt0、 Pt1分别为处理区施药前和施药后的病情指数。
处理5天后，草莓叶部白粉病防治效果：阴性对照防治时的病 情指数为0.80±0.03，防治后的病情指数为0.88±0.06；试验组防治 时的病情指数为0.82±0.01，防治后的病情指数为0.08±0.01，试验 组与阴性对照相比，枯草芽孢杆菌BRS-1发酵液对草莓叶片白粉病 的防治效率为89.12±2.98％。草莓果实白粉病防治效果：阴性对照防 治时的病情指数为0.64±0.03，防治后的病情指数为0.85±0.02；试 验组防治时的病情指数为0.65±0.04，防治后的病情指数为0.07± 0.01，试验组与阴性对照相比，枯草芽孢杆菌BRS-1发酵液对草莓 果实白粉病的防治效率为91.63±0.98％。
枯草芽孢杆菌BRS-1发酵液对草莓白粉病防治效果列于表9。
表9枯草芽孢杆菌BRS-1发酵液对草莓白粉病防治结果
注：**，P＜0.01，差异极显著
本发明还通过实验验证中，枯草芽孢杆菌BRS-1发酵液稀释 50-350倍，对防治草莓白粉病都具有显著的效果。
因此可以得出结论，枯草芽孢杆菌BRS-1发酵液对草莓白粉病 有很强的防治效率，具有开发成生物农药的潜力。
实施例9枯草芽孢杆菌BRS-1发酵液对草莓根腐病的防治
草莓根腐病主要是由镰刀菌、炭疽菌、腐霉菌等多种病原菌引 起。其田间症状主要表型为：初发病时，从细小侧根或新生根开始 出现浅褐色病斑，后变深至暗褐色；随着病害发生加重，全部根系 迅速坏死变褐。同时，由于根系受损，植株吸收水份及养份的能力差，长势弱，直至全株死亡。由于复种指数的提高，保护地中草莓 根腐病发生猖獗，严重影响了草莓产量及种植户的收益。
本发明利用枯草芽孢杆菌BRS-1的发酵液(Endo-KNO3培养基， 35℃,200rpm，培养48小时，菌含量为3×109/ml)去防治草莓根 腐病，研究枯草芽孢杆菌BRS-1对草莓根腐病的防治效果。
草莓种植：草莓种植采用大垄双行种植。首先将大棚内土地旋 耕均匀，起垄(垄台高30cm～40cm，上宽50cm～60cm，下宽70 cm～80cm，垄沟宽20cm)，覆膜后移栽。每垄种植两行(株距 15cm～18cm，行距25cm～35cm)，共计100棵草莓苗左右。选 用长势一致草莓苗进行移栽处理。
草莓根腐防治处理：施用剂量为按照1亩地每次用1.5升BRS-1 发酵液(菌量3×109cfu，稀释200-300倍使用)；分别在移栽后 15天、30天及开花前施用3次；每次都是通过滴灌系统施用。以水 为阴性对照。以10垄为一个小区，随机设计6个小区，每个处理重 复3次。
数据收集：移栽时记录每个小区的草莓苗数量；在生长季，间 隔2周调查草莓根腐病发病情况，并对发病植株进行标记；生长季 结束时，统计每个小区中草莓发生根腐病总株数；计算枯草芽孢杆 菌BRS-1对草莓根腐病的防治效率。其相关计算公式如下：
试验结果列于表10：
表10枯草芽孢杆菌BRS-1发酵液对草莓根腐病的防治结果
注：**P＜0.01，差异极显著。
结果表明，阴性对照区的草莓数量分别为1032、1021和1048 棵，发病数量分别为149、156和163，发病率分别为14.43％、15.28％、 15.55％；试验组的草莓数量分别1025、1020和1055棵，发病数量 分别为65、62和56，发病率分别为6.34％、6.08％、5.31％。试验组与阴性对照相比，阴性对照组的发病率是试验组发病率的2-3倍， 且枯草芽孢杆菌BRS-1发酵液对草莓根腐的防治效率达到了 62.83±2.36％。
本发明还通过实验验证，BRS-1发酵液(菌量3×109cfu)，稀 释100-300倍使用，都对草莓根腐病具有显著的防效。
因此可以得出结论，枯草芽孢杆菌BRS-1发酵液对草莓根腐具 有显著的防治效果。
实施例10枯草芽孢杆菌BRS-1菌粉能增加花生产量
花生是一种常见的经济作物和油、食、饲兼用作物，其营养非 常丰富，同时还有较高的药用价值。提高花生的产量具有重要的意 义。因此，本发明利用枯草芽孢杆菌BRS-1菌粉处理花生种子，研 究其对花生产量的影响，具体流程如下：
利用200g枯草芽孢杆菌BRS-1粉剂(BRS-1菌剂，以加益粉 为载体，喷干，cfu＝600亿/g)与500mL常规种衣剂混匀后，与17.5 kg花生种子混匀，之后在阴凉处晾干，作为试验组。
未加菌剂的种衣剂，与17.5kg花生种子混匀，之后在阴凉出晾 干，作为阴性对照组。
每个小区为0.9米×250米，每个处理，三个重复。按照株距16 厘米、行距30厘米进行播种，起垄种植(宽0.9米)。田间管理按 照当地耕作方式进行。待花生成熟后，选取3米垄长作为一个计量 单位，每个小区随机选取5个单位的平均产量作为小区产量。
等花生成熟后，对花生进行产量统计，结果见表11。
表11枯草芽孢杆菌BRS-1菌粉增加花生产量结果
注：**P＜0.01，差异极显著。
阴性对照重复一鲜果产量总重为3.55±0.56，重复二鲜果产量 总重为3.40±0.65，重复三鲜果产量总重为3.00±0.78，平均总重为 3.32±0.66。试验组重复一鲜果产量总重为4.50±0.86，重复二鲜果 产量总重为4.55±0.98，重复三鲜果产量总重为4.55±0.96，平均总 重为4.54±0.93。
从产量来看，花生经枯草芽孢杆菌BRS-1菌粉包衣后，小区(0.9 米×3.0米)的鲜果产量为4.54±0.93kg，比对照(3.32±0.66kg) 提高为36.80±2.79％。由此可知，菌剂包衣对花生有显著的增产效 果。
本发明还通过实验验证，菌株BRS-1菌粉100-400g，对花生种 子包衣，都能够显著增加花生的产量。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了 详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这 对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BRS-1，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BRS-1的保藏编号为CGMCC No.23476。
2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BRS-1。
3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BRS-1或权利要求2所述的菌剂在淀粉水解中的应用。
4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BRS-1或权利要求2所述的菌剂在制备抗生素中的应用；
所述抗生素为丰原素和/或表面活性素；
所述丰原素为：C14 Fengycin A、*C15 Fengycin A、C15 Fengycin A、*C16 FengycinA、C16 Fengycin A、C17 FengycinA、C18 Fengycin A、*C15 Fengycin B、C15 FengycinB、*C16 Fengycin B、C16Fengycin B、C19 Fengycin B或C20 Fengycin B中的一种或多种；
所述表面活性素为：C12 Surfactin A、C13 Surfactin A、C14 Surfactin A、C15Surfactin A、C16 Surfactin A、C17 Surfactin A、C13 Surfactin B、C14 SurfactinB、C15 Surfactin B或C16 Surfactin B中的一种或多种。
5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BRS-1或权利要求2所述的菌剂在抑制微生物中的应用；
所述微生物包括：绿色木霉、曲弗里弯孢霉、苹果斑点落叶病菌、棉花链格孢、白菜环斑病菌、苹果轮纹病菌、苹果腐烂病菌、油菜核盘菌、可可毛色二孢、烟草赤星菌、稻瘟菌3-2、烟草黑胫菌、赤霉菌、番茄灰霉、灰霉菌、瓜棒孢霉菌、木贼镰孢菌、苹果炭疽菌、橄榄小孢拟盘多毛孢、尖孢镰刀菌、轮枝镰刀菌中的一种或多种。
6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BRS-1或权利要求2所述的菌剂在促进动物生长中的应用。
7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BRS-1或权利要求2所述的菌剂在提高鸡的产蛋量中的应用。
8.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BRS-1或权利要求2所述的菌剂在降低草莓白粉病或根腐病的发病率中的应用。
9.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BRS-1或权利要求2所述的菌剂在提高植物产量中的应用。
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