CN101143896A - 一种枯草芽孢杆菌抗菌肽fengycin同系物及其制备方法 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌抗菌肽fengycin同系物及其制备方法 Download PDF

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陆兆新
别小妹
吕凤霞
王煜
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本发明涉及一种枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌肽fengycin同系物及其制备方法，属于微生物发酵和生物分离领域。专用于新型抗菌肽fengycin同系物的微生物发酵和分离鉴定。新型抗菌肽fengycin同系物的微生物发酵和分离鉴定方法包括枯草芽孢杆菌fmbJ的发酵，抗菌肽fengycin同系物酸沉淀分离和甲醇抽提，抗菌肽fengycin同系物高效液相色谱分析，ESI－MS/CID分析测定抗菌肽fengycin同系物其分子量并进行结构鉴定，抗菌肽fengycin同系物对8种革兰氏阴性菌、4种革兰氏阳性菌和6种霉菌具有显著的抑菌作用。

Description

一种枯草芽孢杆菌抗菌肽fengycin同系物及其制备方法
一、技术领域
本发明为一种枯草芽孢杆菌fmbJ新型抗菌肽fengycin同系物及其发酵制备，属于微生物发酵和生物分离领域，本发明涉及新型抗菌肽fengycinC的微生物发酵和分离鉴定。
二、技术背景
食品在加工、储运、包装、销售和消费等各个环节均易受微生物的污染，如何防止食品的腐败变质是保障食品安全的关键技术问题。
长期以来，在食品工业中都习惯于使用化学合成品作为食品的防腐剂，如苯甲酸及其盐类、山梨酸及其盐类和对羟基苯甲酸酯类等，这些防腐剂在食品加工中的添加量都比较大，容易超标使用而对人体产生毒副作用。随着社会经济的快速发展，人民生活水平的不断提高，人们对食品防腐剂安全性日益关注。
目前我国食品添加剂标准(GB2760)允许使用的32种防腐剂中以化学防腐剂为主，天然防腐剂仅乳链菌肽(Nisin)和纳他霉素(Natamycin)两种，所占比例很少。而且Nisin和纳他霉素抑菌谱较窄，在食品中的应用受到一定限制。因此研究开发高效安全无毒的天然食品防腐剂(Natural Antiseptics)已成为当今国际食品添加剂发展的主要方向。
在天然防腐剂中，有一大类属于肽类防腐剂，由于其安全无毒害，而受到人们广泛关注，其中微生物抗菌肽发酵周期短、生产成本低、抑菌效果好，因此成为防腐剂的研究热点领域。
枯草芽孢杆菌在生长代谢过程中能够产生多种抗菌物质，其中以抗菌肽类为主，一类是核糖体合成的羊毛硫抗生素(bacteriocin)，已经鉴定的有：subtilosin、subtilin和sublancin等；另一类为非核糖体合成脂肽类(lipopeptides)，已经鉴定的有：surfactin、iturin和fengycin。由于枯草芽孢杆菌抗菌肽抑菌谱广、抗菌效果强，因此在农业、医学和食品轻工等领域具有广阔的应用前景。
三、发明内容
技术问题
本发明目的之一在于提供一种新型枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌肽fengycin同系物。
本发明目的之二在于提供新型抗菌肽fengycin同系物的微生物发酵和分离鉴定方法
技术方案
一种枯草芽孢杆菌抗菌肽fengycin同系物，其特征在于：
该抗菌肽fengycin同系物，来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ，经过ESI-MS鉴定其分子量为m/z1496.8和m/z1510.7，两者的分子量相差14D，恰好为脂肪酸链长度-CH2的分子量，符合一般脂肽类同系物的规律。m/z1496.8和m/z1510.7与fengycinB的同系物m/z1491.0和m/z1505.0恰好相差5D，根据前面分析得知，脂肪酸结构与fengycinBm/z1491.0和m/z1505.0的同系物相同，仅仅是氨基酸分子量上分别相差5D。新型抗菌肽fengycin同系物的微生物发酵和分离鉴定方法：
1、枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌肽fengycin同系物的发酵
将枯草芽孢杆菌fmbJ接种于试管斜面营养琼脂培养基上，37℃培养24h，将菌种活化。将试管斜面枯草芽孢杆菌fmbJ菌种接种于装有种子培养基(营养琼脂培养基去除琼脂)的三角瓶中，37℃、130～150rpm/min下培养12～15h，至对数生长期，制成浓度为108～109CFU/L的种子液。将枯草芽孢杆菌fmbJ种子液以5％浓度接种于Landy发酵培养基中，在30～33℃和180rpm/min下培养33～35h，得抗菌物质发酵液。
2、枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌肽fengycin同系物的分离
①发酵液在11.000g下离心15min除去菌体，用HCl将上清夜调节pH至2，然后轻微搅动或静止过夜，离心收集沉淀，加入甲醇抽提几次，获得抗菌提取物。
②枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌物质高效液相色谱分析(HPLC)
将枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌物质采用RP-C18柱(4.6mmφ×250mm，)进行HPLC分离纯化获得枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌肽fengycin同系物。高效液相色谱仪为美国AGILENT1100series，配备DVD检测器。洗脱液为水和乙氰(含3.8mmol三氟乙酸)，流速为0.5ml/min，梯度洗脱。检测波长分别为230nm。三氟乙酸和乙氰为MERK公司产品。surfactin标准样品(美国SIGMA公司)也在相同条件下进行HPLC层析。
3、枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌肽fengycin同系物的鉴定
枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌物质提取液利用电喷雾电离/诱导碰撞解离质谱(Electrosprayionization mass spectrometry/collision-induced dissociation，ESI-MS/CID)测定其分子量和鉴定其结构。ESI-MS/CID采用配备了电喷雾离子源的LCQDECA XP PLUS ThermoFinnigan液质联用(LS-MS)设备(Thermo Corporation，USA)。采用MS柱(2.6mmφ×250mm，2μm)进行分析，HPLC条件中流动相成分和比例与枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌肽fengycin同系物的分离步骤相同，流速为2ul/min。电喷雾源操作电压为4.5KV，操作温度为300℃，操作压力为20abr。
有益效果
本发明首次提供了一种新型枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌肽fengycin同系物及其微生物发酵制备方法，抗菌肽fengycin同系物对8种革兰氏阴性菌、4种革兰氏阳性菌和6种霉菌具有显著的抑菌作用。
本发明使用安全，方法简便，成本低。本发明枯草芽孢杆菌fmbJ菌株属于国际上公认的食品安全菌种，为1989年美国FDA发布的42种安全有效的有益菌种之一，同时为我国农业部1996年公布的允许使用的12种益生菌之一。枯草芽孢杆菌抗菌肽fengycin同系物属于微生物天然食品防腐剂，对食品和人类健康安全性高，无毒副作用，不会导致对环境的污染，可用于绿色食品和天然食品的生产与出口，该抗菌产物替代化学防腐剂广泛用于食品工业，将提高食品的安全性和商品价值。
四、附图说明
图1枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌物肽fengycin同系物的ESI-MS图
图2 fengycin同系物m/z1496.0作为前导子的CID图谱
图3 fengycin同系物m/z1510.0作为前导子的CID图谱
图4 fengycinB和fengycin同系物的分子结构
五、具体实施方式
(一)本发明新型抗菌肽fengycinC的微生物发酵和分离鉴定方法如下：
1、枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌肽fengycin同系物的发酵
将枯草芽孢杆菌fmbJ接种于试管斜面营养琼脂培养基上，37℃培养24h，将菌种活化。将试管斜面枯草芽孢杆菌fmbJ菌种接种于装有种子培养基(营养琼脂培养基去除琼脂)的三角瓶中，37℃、130～150rpm/min下培养12～15h，至对数生长期，制成浓度为108～109CFU/L的种子液。将枯草芽孢杆菌fmbJ种子液以5％浓度接种于Landy发酵培养基中，在30～33℃和180rpm/min下培养33～35h，得抗菌物质发酵液。
2、草芽孢杆菌fmbJ抗菌肽fengycin同系物的分离
①发酵液在11.000g下离心15min除去菌体，用HCl将上清夜调节pH至2，然后轻微搅动或静止过夜，离心收集沉淀，加入甲醇抽提几次，获得抗菌提取物。
②枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌物质高效液相色谱分析(HPLC)
将枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌物质采用RP-C18柱(4.6mmφ×250mm，)进行HPLC分离纯化获得枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌肽fengycin同系物。高效液相色谱仪为美国AGILENT1100series，配备DVD检测器。洗脱液为水和乙睛(含3.8mmol三氟乙酸)，流速为0.5ml/min，梯度洗脱。检测波长分别为230nm。三氟乙酸和乙睛为MERK公司产品。surfactin标准样品(美国SIGMA公司)也在相同条件下进行HPLC层析。
3、枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌肽fengycin同系物的鉴定
枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌物质提取液利用电喷雾电离/诱导碰撞解离质谱(Electrosprayionization mass spectrometry/collision-induced dissociation，ESI-MS/CID)测定其分子量和鉴定其结构。ESI-MS/CID采用配备了电喷雾离子源的LCQDECA XP PLUS ThermoFinnigan液质联用(LS-MS)设备(Thermo Corporation，USA)。采用MS柱(2.6mmφ×250mm，2μm)进行分析，HPLC条件中流动相成分和比例与枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌肽fengycin同系物的分离步骤相同，流速为2ul/min。电喷雾源操作电压为4.5KV，操作温度为300℃，操作压力为20abr。
(二)枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌肽fengycin同系物分子量和结构鉴定
图1为枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌物质fengycin同系物的ESI-MS图，从图1-a中可以获得一组已知的脂肽化合物fengycin同系物：m/z1421.6、m/z1435.6、m/z1449.9和m/z1463.7，与已知fengycin同系物一起出现的还有m/z1496.8和m/z1510.7两种物质，两者的分子量相差14Da，恰好为脂肪酸链长度-CH2的分子量，符合一般脂肽类同系物的规律。为了进一步鉴定这组物质，选择m/z1496.8和m/z1510.7为前导子进行CID分析(图2和图3)
首先m/z1496.0和m/z1510.0的分子量恰好比已知的脂肽化合物fengycinB(图4)的两个同系物m/z1491.0和m/z1505.0(图1-b)多5Da。从图2中可以获得[M+H]+为m/z1113.2和m/z999.3的片断，从图3中同样获得[M+H]+为m/z1112.5和m/z999.3的片断，这两个片断的分子量分别比fengycinB的两个特征性片断m/z1108和m/z994的分子量多5Da，而fengycinB的两个特征性片断m/z1108和m/z994分别代表其氨基酸组成，所以判断m/z1496.0和m/z1510.0两种物质在氨基酸分子量上比fengycinB多5Da，脂肪酸组成与fengycinB(图4)同系物m/z1491.0和m/z1505.0相同。
根据以往文献，分子量为m/z1496.8和m/z1510.7的脂肽从未见报道，通过以上推理可以判断m/z1496.8和m/z1510.7的两种物质结构与fengycinB相似，属于新型fengycin同系物。
(三)枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌肽fengycin同系物的抑菌试验
1抑菌试验指示菌
1)细菌指示菌：抑菌实验所采用的指示菌细菌为食品中15个重要的致病菌和腐败菌：大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)(AS1.487)、大肠埃希氏杆菌O157H7、(Escherichia coli)(CMCC(B)882364)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(AS1.1802)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(CMCC(B)50013)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)(CMCC(B)50071)、宋内氏志贺菌(Shigella sonnei)(CMCC(B)51334)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)(Serotype 2a，CMCC(B)51302)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)(CMCC(B)52206)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)(AS1.1846)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)(54004)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(AS1.2465)、藤黄微球菌(Micrococcus aureus)(AS1.191)、副溶血性弧菌(Vibrioparachaemolyticus)(CMCC(B)89001)、溶血链球菌(Streptococcus sanguis)(CMCC(B)32214)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)(IFFI10207)。单核细胞增生李斯特菌购自卫生部食品监督所，其他菌种均购自自中科院微生物研究所菌种保藏中心。溶血链球菌保藏在血平板斜面培养基上，其他菌种保藏在营养琼脂培养基上，其中嗜热脂肪芽孢杆菌在于54℃下保湿培养，其他菌种在37℃下培养。
2)真菌指示菌：抑菌实验所采用的指示菌真菌为食品中6个重要腐败霉菌：匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)(AS3.2336)，扩展青霉(Penicillium expansum)(AS3.4042)和点青霉(Penicillium meleagrinum)(AS3.4356)购自中科院微生物研究所菌种保藏中心；黑曲霉(Aspergillus niger)、黑根霉(Rhizopusnigricans)和总状毛霉(Mucor racemosus)均为公知公用，见参考文献：Food Sci Technol.Int.2006，12(3)：189-194(SCI/EI)，该菌株由本实验室鉴定保藏，如果有需要可对外提供。以上霉菌保藏在PDA斜面培养基上于8-30℃下培养。
2抗菌肽的抑菌实验
1)细菌抑菌实验方法：将培养到对数期的各细菌用无菌生理盐水稀释到105CFU/L，取0.1ml均匀涂于9cm培养皿表面，晾干后，在平板不同位置等距离放置高温灭菌的牛津杯(5mmφ×10mm)，再将抗菌物质提取物加于牛津杯(200μl)，37℃下培养15～18小时，记录抑菌圈直径大小。溶血链球菌和单核细胞增生李斯特菌采用血平板培养基，于37℃下培养；其他细菌采用营养琼脂培养基，其中荧光假单胞菌在28～30℃下培养，嗜热脂肪芽孢杆菌于54℃下保湿培养，其他菌在37℃下培养。抑菌实验重复三次，抑菌圈直径取平均值。
2)真菌抑菌实验方法：方法同细菌。将斜面培养的各霉菌孢子用无菌生理盐水洗下制成孢子悬液，再稀释至105个/L。同样吸取0.1ml涂平板，晾干后在平板不同位置等距离放置高温灭菌的牛津杯，再将200μl抗菌提取物加于牛津杯中，于30℃下培养3-5天，记录抑菌圈直径大小。实验重复三次。
研究结果表明：在上述实验的15种细菌中，枯草芽孢杆菌抗菌肽对全部8种革兰氏阴性菌(Escherichia coli，Escherichia coli O157H7，Pseudomonas fluorescens，Salmonellatyphimurium，Salmonella typhi，Shigella sonnei，Shigellaflexneri，Yersinia enterocolitica)、4种革兰氏阳性菌(Listeria monocytogenes，Bacillus cereus，β-Streptococcus hemolytic，Bacillusstearothermophilus)和全部6种霉菌(Rhizopus stolonifer，Penicillium expansum，Penicillium meleagrinum，Aspergillus niger，Rhizopus nigricans，Mucor racemosus)具有显著的抑菌作用(表1)。
由于枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌肽对食品中多种有害细菌和霉菌具有明显抑制作用，表现出高效广谱特性，因此可以开发成为一种新型的天然食品防腐剂，广泛用于鱼、肉、禽、蛋、乳、水果和蔬菜等食品加工和防腐保鲜，有效控制食品中微生物生长，对于减少食品腐烂损失和延长食品保质期具有重要应用价值。
枯草芽孢杆菌菌株属于国际上公认的食品安全菌种，为1989年美国FDA发布的42种安全有效的有益菌种之一，同时为我国农业部1996年公布的允许使用的12种益生菌之一。枯草芽孢杆菌产生的抗菌产物属微生物天然食品防腐剂，对食品和人类健康安全性高，无毒副作用，不会导致对环境的污染，可用于绿色食品和天然食品的生产与出口，该抗菌产物替代化学防腐剂广泛用于食品工业，将提高食品的安全性和商品价值。
表1枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌提取物对食品致病菌和腐败真菌的抑菌效果
微生物 抑菌圈直径(cm)
BacteriaEscherichia coliEscherichia coli O157H7Pseudomonas fluorescensSalmonella typhimuriumSalmonella typhiShigella sonneiShigella flexneriYersinia enterocoliticaListeria monocytogenesBacillus cereusStaphylococcus aureusMicrococcus aureusVibrio parachaemolyticusStreptococcus sanguisBacillus stearothermophilusFungiRhizopus nigricansRhizopus stoloniferAspergillus nigerPenicillium meleagrinumPenicillium expansumMucor racemosus 26.53±0.5323.46±0.2226.34±0.1623.87±0.4422.55±0.6324.42±0.2127.21±0.5728.57±0.4834.66±0.3421.53±0.52NaNaNa22.78±0.7424.21±0.5830.41±0.3524.65±0.7426.26±0.4324.77±0.6225.58±0.4723.59±0.35
a：N代表没有抑菌圈

Claims (2)

1.一种枯草芽孢杆菌抗菌肽fengycin同系物，其特征在于，
该抗菌肽fengycin同系物，来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ，经过ESI-MS鉴定其分子量为m/z1496.8和m/z1510.7，两同系物分子量相差14Da，与已知的fengycinB同系物m/z1491.0和m/z1505.0恰好相差5Da，该fengycin同系物与fengycinB有相似结构特征，其脂肪酸组成与fengycinB的同系物m/z1491.0和m/z1505.0相同，仅仅是氨基酸分子量上分别相差5D。
2.权利要求1所述抗菌肽fengycin同系物的制备方法，包括：
1)抗菌肽fengycin同系物的发酵
将试管斜面枯草芽孢杆菌fmbJ菌种接种于装有种子培养基的三角瓶中，37℃、130～150rpm/min下培养12～15h，至对数生长期，制成浓度为108～109CFU/L的种子液，将枯草芽孢杆菌fmbJ种子液以体积比5％浓度接种于Landy发酵培养基中，在30～33℃和180rpm/min下培养33～35h，得抗菌物质发酵液；
2)枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌肽fengycin同系物的分离
①抗菌物质发酵液在11.000g下离心15min除去菌体，用HCl将上清夜调节pH至2，然后轻微搅动或静止过夜，离心收集沉淀，加入甲醇抽提，获得抗菌提取物；
②枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌肽高效液相色谱分析HPLC
将枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌提取物采用4.6mmφ×250mm RP-C18柱进行HPLC分离纯化获得枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌肽fengycin同系物，洗脱液为水和含3.8mmol三氟乙酸的乙氰，流速为0.5ml/min，梯度洗脱，检测波长为230nm。
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