CN103182068A

CN103182068A - 环脂肽Fengycin在制备抗肿瘤药中的应用

Info

Publication number: CN103182068A
Application number: CN2013100934685A
Authority: CN
Inventors: 陆兆新; 尹鸿萍; 郭传龙; 吕风霞; 别小妹; 吕云斌
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2013-03-22
Filing date: 2013-03-22
Publication date: 2013-07-03

Abstract

本发明属于制药领域，公开了环脂肽Fengycin在制备抗肿瘤药中的应用，本发明提供了环脂肽Fengycin在制备抗肿瘤药中的新运用，特别是在制备治疗肺癌、胃癌、乳腺癌及结肠癌的药物中的应用。环脂肽Fengycin对肿瘤细胞及肿瘤组织具有显著的抑制作用，对肿瘤细胞及肿瘤组织具有较好的选择性，并对与肿瘤凋亡有关的相关蛋白有明显影响。本发明为研制新型抗肿瘤药物提供了依据，具有很好的临床运用前景。

Description

环脂肽Fengycin在制备抗肿瘤药中的应用

技术领域

本发明涉及环脂肽Fengycin的药理活性，特别涉及环脂肽Fengycin在制备抗肿瘤药中的应用。

背景技术

世界上恶性肿瘤的发生率继续呈上升趋势，2000年世界卫生组织统计全球的癌症新发病率例达到1000万例，有600万例癌症死亡。癌症已径成为威胁人类生命健康的主要疾病之一。

目前细胞毒性药物依然是抗肿瘤的基础和主要途径，虽然使用细胞毒性药物能够杀死肿瘤细胞，但往往会对正常的细胞产生伤害，同时也容易诱发肿瘤细胞产生“耐药性”。因此临床治疗肿瘤疾病急需新的药物，是真正能够达到高效低毒目标的药物，并且不易诱发肿瘤细胞产生耐药性。

环脂肽又名脂酰肽，是一类结构新颖的环状肽类化合物，具有抗菌、抗肿瘤、抗炎等广泛的生物活性，近年来受到人们的广泛关注。这些脂肽有一个共同的特点是包含一个脂肪链连接在一个环状的肽链上，所以这种表面活性剂既有亲水性又有亲脂性。

Fengycin就是属于这类环脂肽中一种，它源于淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens fmb-50，CGMCC No.6249)发酵液中，经提取、分离、纯化而得。其结构是C16～C19的β-羟基脂肪酸链和10个氨基酸组成的肽链，10个氨基酸中其中的8个组成一个肽环。由于其结构的特殊性，它具有较好的两性物质的特点，与这类脂肽类物质(如Surfactin)相比，具有溶血性低的优势。目前国内外对于Fengycin的研究，还停留在抗真菌活性上，有关环脂肽Fengycin的抗肿瘤活性尚未见报道。

发明内容：

发明目的

本发明是提供的从淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens fmb-50，CGMCC No.6249)发酵分离纯化得到的一种环脂肽类物质Fengycin在制药领域中新用途，即Fengycin在制备抗肿瘤药中应用。

技术方案

本发明的目的是通过下列措施来实现的：

环脂肽Fengycin在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的肿瘤为肺癌、胃癌、乳腺癌或结肠癌。

所述环脂肽Fengycin，来源于淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens fmb-50，CGMCC No.6249)发酵液，经分离纯化所制的，其结构式如下：

Fengycin结构式

有益效果：

我们实验结果表明，环脂肽Fengycin具有显著的抗肿瘤效果，并且其抗癌作用与一般的化疗抗癌药有所区别，能选择性的杀死肿瘤细胞，而对正常的造血系统和白细胞没有影响，并且作用在肿瘤细胞膜上，不易诱发肿瘤细胞产生“耐药性”，这为寻找新型抗肿瘤药物提供新颖的前景，同时有可能启示新的抗癌机理。具体来说：

1、Fengycin对人肺癌95D及A-549细胞株、大细胞肺癌H460细胞株、人胃癌BGC-823及SGC-7901、人乳腺癌MCF-7细胞株、人结肠癌HCT-116细胞株的体外生长具有显著的抑制作用。对两株正常的人肝细胞L02及人胚肺成纤维细胞HELF体外生长抑制作用较低。

2、Fengycin对肿瘤细胞的抑制作用具有较好的选择性。

3、Fengycin对肿瘤细胞的抑制作用表现在：

(1)对接种的人肺癌、胃癌的裸小鼠肿瘤模型有显著的抑制作用；(2)对肿瘤凋亡相关蛋白有明显影响；(3)对动物肝脏的相关酶类未见影响。

本发明为研制新的抗肿瘤药物提供了可靠的实验依据，对开发低细胞毒性的环脂肽类的抗肿瘤药物具有重要价值。

附图说明

图1Fengycin对肿瘤细胞和正常细胞细胞毒性结果图，其中A是Fengycin对肿瘤细胞细胞毒性；B是Fengycin对正常细胞细胞毒性；C是Fengycin对95D细胞不同时间的IC50。

图2Fengycin对95D周期和相关蛋白的影响结果图，其中A是Fengycin对95D细胞周期的影响；B是Fengycin对95D细胞周期相关蛋白的影响；C是Fengycin对95D细胞凋亡蛋白mRNA的影响；D是Fengycin对95D细胞凋亡相关蛋白的影响；E是Fengycin对95D细胞周期蛋白mRNA的影响。

图3Fengycin对95D移植瘤的抑制作用结果图，其中A是不同剂量组的Fengycin对肿瘤重量的影响；B是不同剂量组的Fengycin对肿瘤的抑制率；C是不同剂量组的Fengycin对荷瘤小鼠体重的影响；D是不同剂量组的Fengycin对荷瘤小鼠脾重的影响。

图4Fengycin对BGC-823细胞不同时间的IC50结果图。

图5Fengycin对BGC-823移植瘤的抑制作用结果图，其中A是不同剂量组的Fengycin对肿瘤重量的影响；B是不同剂量组的Fengycin对肿瘤的抑制率；C是不同剂量组的Fengycin对荷瘤小鼠体重的影响；D是不同剂量组的Fengycin对荷瘤小鼠脾重的影响。

图6Fengycin对BGC-823肿瘤组织蛋白Western blot结果图

图7Fengycin对BGC-823肿瘤组织病理切片结果图(200×)

图8Fengycin纯品的二级质谱分析，其中图8A是质荷比为1450.8的先导子的CID图谱；图8B是质荷比为1464.8的先导子的MS/MS分析；图8C是质荷比为1478.8的先导子的CID图谱；图8D是质荷比为1492.8的先导子的CID图谱；

表1Fengycin对BGC-823移植瘤小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的影响

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不对本发明作任何限制。

具体实施方式

实施例1本发明实施例所用的Fengycin来源于淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens fmb-50，CGMCC No.6249，南京农业大学食品科技学院酶工程实验室保藏)，于32℃，150r/min发酵(发酵培养基：葡萄糖20.0g，L-谷氨酸钠5.0g，MgSO₄0.5g，KCl0.5g，KH₂PO₄1.0g，FeS0₄·7H₂O0.15mg，MnSO₄5.0mg，CuS0₄·5H₂O0.16mg，pH7.0，补水至1L)，经36h后，收集发酵液，用甲醇萃取，萃取液经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇(2/1)洗脱弃去，换用氯仿/甲醇/水(65/25/4)洗脱，并收集洗脱液，反相色谱(RP-HPLC)纯化，冷冻干燥制得。

结构鉴定的波谱数据见图8，其The ESI mass与文献一致：Bie X，Lu Z，Lu F.Identification of fengycin homologues from Bacillus subtilis with ESI-MS/CID.J Microbiol Methods2009；79：272-278。

实施例2环脂肽Fengycin对95D、A-549、H460、SGC-7901、HCT-116、MCF-7和正常细胞L02和HELF细胞毒性研究

实验方法为国际通用的MTT法：根据细胞的生长速率，取对数期的细胞以180μl/孔接种于96孔板，贴壁生长24小时后加药20μl/孔。每个浓度设置三个复孔，并设定相应浓度的PBS溶媒对照及无细胞调零空。细胞在37℃、5％CO₂条件下培养72小时，然后加入20μl，5mg/ml的MTT，于37℃、5％CO₂条件下孵育4小时，吸弃上清，每孔加入150μl DMSO，震荡10分钟，酶标仪570nm波长下检测OD值，计算抑制率。

具体操作为：取对数期的肿瘤细胞(95D、A-549、H460、SGC-7901、HCT-116、 MCF-7，均从中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库购置)和正常细胞L02及HELF(从中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库购置)以180μl/孔接种96孔板，贴壁生长24小时后加药20μl/孔。每个浓度设置三个复孔，并设定相应浓度的PBS溶媒对照及无细胞调零组。细胞在37℃、5％CO₂条件下培养72小时，然后加入20μl，5mg/ml的MTT，于37℃、5％CO₂条件下孵育4小时，吸弃上清，每孔加入150μl DMSO，震荡10分钟，酶标仪570nm波长下检测OD值。并计算细胞存活率。结果显示，当Fengycin浓度为400μg/ml，作用72h时，对95D、A-549、H460、SGC-7901、HCT-116、MCF-7的抑制率分别为：76％、45％、54％、48％、55％、58％，结果见图1A。同样浓度Fengycin作用正常细胞L02和HELF时，抑制率为15％和25％，结果见图1B。尤其对95D细胞作用效果明显，Fengycin作用95D细胞24、48、72h时IC50分别为239.9、177.8、154.9μg/ml。结果见图1C。

实施例3环脂肽Fengycin对95D细胞周期和凋亡相关蛋白的影响

对细胞周期的分析采用PI单染的方法。取对数期95D细胞，调整细胞浓度为5×105/ml，接种于六孔板，培养24h后用200μg/ml Fengycin分别刺激6h、12h、24h。离心收集细胞，PBS洗涤两次，细胞用75％的冷乙醇重悬并置于-20℃过夜。细胞离心并用PBS洗涤两次，用PBS重悬细胞加入20mg/ml的RnaseA于37℃孵育30min，然后细胞加入50mg/ml的PI室温避光孵育30min后于流式细胞仪进行检测。结果显示，Fengycin可导致95D细胞发生G0/G1期阻滞。结果见图2(A)。

取对数期95D细胞接种于六孔板，培养24h后加入200μg/ml Fengycin分别作用6、12、24h，用RIPA强裂解液提取各组细胞总蛋白。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳(浓缩胶80V，分离胶120V)及转膜，转移蛋白至PVDF膜，将PVDF膜浸润在含5％脱脂奶粉的TBST中封闭1h，加入特异性一抗CyclinD1，CDK4，Bcl-2，Bax，cytochrome c，Apaf-1，caspase-3，caspase-9，PARP。4℃过夜，TBST缓冲液洗膜3次，加入HRP标记的二抗(1∶5000)室温孵育1h，TBST缓冲液洗膜3次，最后用ECL显色，X感光片感光后，显影定影。β-actin作为内参蛋白。结果显示，Fengycin刺激95D细胞后，导致周期相关蛋白CyclinD1和CDK4表达下调，导致Bax蛋白表达上调而下调Bcl-2的表达，同时导致细胞质内细胞色素c释放增加，激活Apaf-1、PARP、caspase-9和caspase-3。结果见图2(B，C，D，E)。

实施例4环脂肽Fengycin对95D裸小鼠移植瘤的抑制作用

体外培养95D细胞，调整细胞浓度为1×10⁷/ml，接种于小鼠腋下，0.2ml/只。观察至瘤长到一定体积(80mm³)，将小鼠随机分为5组每组6只。Fengycin组设定三个剂量浓度(40，20，10mg/kg)，同时设定阳性对照组环磷酰胺(20mg/kg)和空白对照组(生理盐水)，腹腔注射给药，连续给药21天。给药结束后，小鼠称重并处死，取瘤组织称重并计算抑瘤率，取脾脏称重。

抑瘤率(％)＝[(W_Control-W_Treated)/W_Control]×100％

W_Control和W_Treated分别表示空白组和给药组的瘤重。

实验结果显示，荷瘤小鼠给予Fengycin后，瘤重与空白组相比有明显的减小，Fengycin剂量为10、20、40mg/kg时抑瘤率分别为30％、44％、67％。小鼠给予Fengycin后体重有所增加，脾指数与空白组相比没有变化，而环磷酰胺组脾指数减小，说明，表明Fengycin能抑制肿瘤生长，并且其毒性低。结果见图3。

实施例5环脂肽Fengycin对BGC-823细胞毒性及IC50研究

取对数期的肿瘤细胞BGC-823以180μl/孔接种于96孔板，贴壁生长24小时后加药20μl/孔。每个浓度设置三个复孔，并设定相应浓度的PBS溶媒对照及无细胞调零组。细胞在37℃、5％CO₂条件下培养24、48、72小时，然后加入20μl，5mg/ml的MTT，于37℃、5％CO₂条件下孵育4小时，吸弃上清，每孔加入150μl DMSO，震荡10分钟，酶标仪570nm波长下检测OD值。并计算细胞存活率。结果显示，Fengycin作用24h、48h、72h时的别IC50分别为281μ g/ml、196μg/ml、151μg/ml。结果见图4。

实施例6环脂肽Fengycin对BGC-823移植瘤的抑制作用实验

体外培养BGC-823细胞，调整细胞浓度为1×10⁷/ml，接种于小鼠腋下，0.2ml/只。观察至瘤长到一定体积(80mm³)，将小鼠随机分为5组每组6只。Fengycin组设定三个剂量浓度(40，20，10mg/kg)，同时设定阳性对照组环磷酰胺(20mg/kg)和空白对照组(生理盐水)，静脉给药，连续给药14天。给药结束后，小鼠称重眼球取血并处死，取瘤组织沉重并计算抑瘤率，并取脾脏称重。

抑瘤率(％)＝[(W_Control-W_Treated)/W_Control]×100％

W_Control和W_Treated分别表示空白组和给药组的瘤重。

瘤组织用10％甲醛固定后进行病理切片分析。肿瘤组织进行蛋白提取并采用Western blot检测凋亡信号通途中的关键蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的活性。血清中的谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)用试剂盒进行检测分析

实验结果显示，荷瘤小鼠给予Fengycin后，瘤重与空白组相比有明显的减小，Fengycin剂量为10、20、40mg/kg时抑瘤率分别为30％、48％、74％。小鼠给予Fengycin后体重有所增加，脾指数与空白组相比没有变化，而环磷酰胺组脾指数相应减小，说明，表明Fengycin能抑制肿瘤生长，并且其毒性较低，结果见图5，

Bcl-2和Bax是凋亡途径中的关键因子，Bcl-2可以抑制由多种细胞毒因素所引起的细胞死亡，而Bax则促进细胞凋亡，实验结果显示，Bax表达量升高，Bcl-2表达量降低。Caspase-3在凋亡途径中起着不可替代的作用，实验结果显示，Caspase-3活性片段(17KD)量升高，说明Caspase激活，最终导致细胞凋亡，结果见图6。肿瘤组织经甲醛固定后进行病理切片HE染色分析，结果显示低剂量Fengycin(10mg/kg)可导致1/3瘤细胞死亡，中剂量(20mg/kg)和高剂量(40mg/kg)时细胞死亡比例可以达到2/3和3/4，结果见图7。相关酶类结果表明，Fengycin作用小鼠后，AST和ALT量没有明显变化，而环磷酰胺组两者的量变化明显，说明，Fengycin体外抗肿瘤活性的发挥不会产生明显的肝毒性，结果见表1。

表1：Fengycin对BGC-823移植瘤小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的影响

实施例7

取Fengycin10g按注射剂常规工艺添加适当辅料制备成注射剂。

实施例8

取Fengycin10g按冻干粉针制剂常规工艺添加辅料制备成冻干粉针制剂。

Claims

1.环脂肽Fengycin在制备抗肿瘤药中的应用。

2.根据权利要求1所述的环脂肽Fengycin在制备抗肿瘤药中的应用，其特征在所述的肿瘤为肺癌、胃癌、乳腺癌或结肠癌。