CN102178701A

CN102178701A - 一种具有抗肿瘤活性多糖组合物的制备方法

Info

Publication number: CN102178701A
Application number: CN 201110104482
Authority: CN
Inventors: 计东风; 李有贵; 钟石; 吕志强; 胡桂燕; 林天宝; 朱燕
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-04-26
Filing date: 2011-04-26
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2031-04-26
Also published as: CN102178701B

Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤活性多糖组合物的制备方法，将人工培养虫草子实体和液体发酵培养桑黄菌丝体烘干、粉碎，加蒸馏水提取、乙醇沉淀离心后，再溶于水，用超滤膜高压过滤得到虫草子实体多糖和桑黄菌丝体多糖，将虫草子实体多糖和桑黄菌丝体多糖配比混合均匀后，通过压片机压片。本发明的优点是：通过复配后，利用两类多糖相互协同作用，可增强其抗肿瘤活性。本发明工艺简单、所建立的提取方法专业性强、重复性好，且使用医用酒精提取，不仅环保，同时产品安全可靠，适宜于工业化生产。

Description

一种具有抗肿瘤活性多糖组合物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有抗肿瘤活性多糖组合物的制备方法，本发明方法制备的产品具有直接抑制肿瘤细胞生长和增殖的作用，亦可提高机体免疫力，可作为一种辅助治疗肿瘤的药品或保健品。

背景技术

自上世纪六十年代，真菌多糖作为抗肿瘤的广谱免疫促进剂引起了人们极大的兴趣。大量药理和临床研究表明，真菌多糖类化合物具有复杂的多方面生物活性与功能，对正常的细胞没有毒副作用，真菌多糖主要通过影响网状内皮系统、巨噬细胞、淋巴细胞、白细胞以及蛋白质的合成、抗体生成及干扰素的诱生作用来提高机体免疫功能，增强抗病能力。多糖作为免疫促进剂，可与细胞毒性抗癌药物如氟尿嘧啶(5-FU)、环磷酰胺(CIX)合用，减轻因化疗所致的免疫功能低下，增强细胞毒抗癌药物的抗肿瘤活性(袁建国，程显好，侯永勤.冬虫夏草多糖组份研究及药理试验[J].山东食品发酵，2004，4：52-55；林新坚，郑永标，陈济琛等.冬虫夏草粗多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α的作用[J].微生物学杂志，2004，24(3)：22-23；Zhang W，Yang J，Chen J，et al.Immunomodulatory and antitumor effects of exopolysaccharide fraction(EPSF)from a cultivated Cordyceps sinensis fungus on tumor-bearing mice.Biotechnol Appl Biochem，2004，15(12)：256-259；Zhou GF，Hua X，Sheng WX.In vivo growth-inhibition of S180 tumor by mixture of 5-Fu and low molecular-carrageenan from Chondrus ocellatus.Pharmacological research.2005，51：153-157)。

国内外很多研究表明，虫草多糖具有抗肿瘤活性，大多数抗肿瘤作用是非直接杀伤癌细胞，即通过刺激人体非特异性防御机能，在癌症病人经放疗、化疗机体免疫力受损的情况下，与放疗、化疗配合治疗可达到治愈疾病的目的(吴庆光，赵珍东，王宗伟.冬虫夏草抗肿瘤作用研究进展[J].中医药导报.2005，11(6)：80-82)。桑黄是寄生于桑树等阔叶树的一种药用真菌，具有独特的抗癌等功效，已引起国内外医药界与保健品行业不少专家的关注。其抑制肿瘤的研究主要集中在桑黄多糖方面，作用机制是通过细胞调节和体液免疫来提高机体的免疫力，进而达到抑制肿瘤细胞生长和转移的目的(沈业寿，郑立军，王正亮.桑黄胞内多糖抗肿瘤效应的实验研究[J].癌变畸变突变，2007，19(4)：305-308)。

由于国内外市场对虫草、桑黄的需求量越来越大，致使国内各产地药农掠夺性采集，子实体孢子无法大量形成，结果造成野生虫草、桑黄资源在我国已难觅踪影，即将枯竭。近年来大量的科研工作者对虫草、桑黄的人工栽培、液体发酵技术等方面开展了广泛的研究，但人工栽培、液体发酵产生的虫草、桑黄子实体和菌丝体多糖抗肿瘤等活性有待进一步研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性多糖组合物的制备方法，通过两类多糖相互协同作用，增强其抗肿瘤活性。体外活性实验表明，本发明产品对人源性结肠癌细胞HT-29、人源性肺癌细胞A549、人源性肝癌细胞HepG2的增殖有显著的抑制作用，且显著高于单一来源多糖的抑制效果，可作为一种辅助治疗肿瘤的药品或保健品。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：一种具有抗肿瘤活性多糖组合物的制备方法，依次包括以下步骤：

A.将人工培养虫草子实体用70℃-90℃烘干，粉碎成20-80目，蒸馏水90℃-100℃提取4-8h，过滤后滤液用浓度70％-80％的乙醇沉淀，8000-12000rpm离心收集沉淀，复溶于水；

B.将步骤A的产物用分子量10000道尔顿的超滤膜高压过滤，得到透明液体用烘干或冷冻干燥后粉碎得到虫草子实体多糖；

C.在步骤A进行的同时，将液体发酵培养桑黄菌丝体用70℃-90℃烘干，粉碎成20-80目，蒸馏水90℃-100℃提取4-8h，过滤后滤液用浓度70％-80％的乙醇沉淀，8000-12000rpm离心收集沉淀，复溶于水；

D.将步骤C的产物用分子量10000道尔顿的超滤膜高压过滤，得到透明液体用烘干或冷冻干燥后粉碎得到桑黄菌丝体多糖；

E.将步骤B中得到的虫草子实体多糖和步骤D中得到的桑黄菌丝体多糖按1∶0.5～1∶3的比例混合均匀后，通过压片机压片。

优选的，步骤A中虫草子实体的烘干温度为80℃，粉碎度为40目，蒸馏水提取温度95℃，提取时间为6h，滤液用于沉淀的乙醇终浓度为75％；能够得到最佳质量的虫草子实体多糖。

优选的，步骤C中桑黄菌丝体的烘干温度为80℃，粉碎度为40目，蒸馏水提取温度95℃，提取时间为6h，滤液用于沉淀的乙醇终浓度为75％；能够得到最佳质量的桑黄菌丝体多糖。

优选的，步骤E中虫草子实体多糖与桑黄菌丝体多糖按1∶1的比例混合均匀；最佳的混个比例，对人源性结肠癌细胞HT-29、人源性肺癌细胞A549、人源性肝癌细胞HepG2生长具有显著抑制作用。

与现有技术相比，本发明的优点是：现有的研究发现人工培养的虫草、桑黄子实体和菌丝体多糖具有一定的抗肿瘤活性，但其抗肿瘤效果尚不理想，本发明通过多种肿瘤细胞抑制实验，筛选出对人源性结肠癌细胞HT-29、人源性肺癌细胞A549、人源性肝癌细胞HepG2生长具有显著抑制作用的多糖，通过复配后，利用两类多糖相互协同作用，可增强其抗肿瘤活性。本发明工艺简单、所建立的提取方法专业性强、重复性好，且使用医用酒精提取，不仅环保，同时产品安全可靠，适宜于工业化生产。

附图说明

图1为不同多糖对人源性结肠癌细胞HT-29增殖的抑制作用对比图；

图2为不同多糖组合对人源性结肠癌细胞HT-29增殖的抑制作用对比图；

图3为不同多糖对人源性肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用对比图；

图4为不同多糖组合对人源性肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用对比图；

图5为不同多糖对人源性肺癌细胞A549增殖的抑制作用对比图；

图6为不同多糖组分对人源性肺癌细胞A549增殖的抑制作用对比图。

具体实施方式

(1)人工培养的虫草子实体：可以到各大中药店购买。

(2)液体发酵培养的桑黄菌丝体：桑黄菌丝体培养方法参考本研究室前期的发明专利“一种高效液体培养桑黄菌丝体的培养基及培养方法(申请号：201010255665.9)”。

具体为：发酵培养基1L，其各组分的浓度(g/L)为：麦芽糖30g，酵母粉20g，MgSO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，柠檬酸三铵1.0g，维生素B₁8mg、维生素B₂ 4mg、维生素B₆ 0.52mg、烟酰胺26mg、泛酸钙2.6mg，桑枝水提物5g。将培养基分装到50mL摇瓶中，装液量为装30mL，培养基灭菌温度：121℃，灭菌时间：30min；

菌丝体培养：将购买的桑黄菌种培养时间5d，接种量15％(V/V)，培养温度27℃，摇瓶装液量60％，往复式摇床转速120rpm，发酵时间为7d。每24h取样，8000rpm离心10min，用蒸馏水洗涤菌丝体3次，-50℃真空冷冻干燥至恒重，即得桑黄菌丝体。

(3)一种具有抗肿瘤活性多糖组合物的制备方法，依次包括以下步骤：

A.将人工培养虫草子实体用80℃烘干，粉碎成40目，蒸馏水95℃提取6h，过滤后滤液用浓度75％的乙醇沉淀，8000-12000rpm离心收集沉淀，复溶于水；

C.在步骤A进行的同时，将液体发酵培养桑黄菌丝体用80℃烘干，粉碎成40目，蒸馏水95℃提取6h，过滤后滤液用浓度75％的乙醇沉淀，8000-12000rpm离心收集沉淀，复溶于水；

E.将步骤B中得到的虫草子实体多糖和步骤D中得到的桑黄菌丝体多糖按1∶1的比例混合均匀后，通过压片机压片。

采用上述工艺生产的原料粉通过压片机压片，每片重0.5克。以下是体外肿瘤细胞抑制实验，利用多种肿瘤细胞，通过多种多糖组合筛选出抗肿瘤活性较强的本发明产品。

1.实验目的

通过MTT法测定人工培养的虫草子实体、虫草菌丝体、桑黄子实体、桑黄菌丝体提取的多糖以及不同多糖组合物对人源性结肠癌细胞HT-29、人源性肺癌细胞A549、人源性肝癌细胞HepG2生长的抑制作用。

2.材料与仪器

2.1仪器设备

细胞培养箱，Forma 3111型，Thermo公司；超净工作台，苏州冯氏实验动物设备有限公司；酶标仪，BIO-RAD 680；离心机Sorvall Legend Mach 1.6R，Thermo公司；蔡氏荧光倒置显微镜；YS2-H光学显微镜，日本NiKon公司；电子天平，酸度计等。

2.2主要试剂

2.2.1RPMI 1640、胰蛋白酶美国GIBCO公司；

2.2.2噻唑蓝(3-(4，5-dimethylthliazol-2-yl)-2，5-dipenyl tetrazolium bromide，MTT)；

2.2.3新生牛血清(无菌、无支原体、无嗜菌体)，杭州四季青生物工程有限公司；

2.2.4台盼蓝(trypan blue)上海化学试剂总厂。

2.3细胞株

2.3.1肿瘤细胞株：人源性结肠癌细胞HT-29、人源性肺癌细胞A549、人源性肝癌细胞HepG2均购于中科院上海细胞生物所；

2.3.2细胞培养与细胞悬液制备：用含10％胎牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基，于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中传代培养。取对数生长期细胞，经0.25％胰蛋白酶消化后，用含10％胎牛血清的PRMI 1640培养液配成单个细胞悬液，以台盼蓝拒染法计数后，将细胞悬液稀释成实验所需的浓度。

2.4受试药物

人工培养的虫草子实体、虫草菌丝体、桑黄子实体、桑黄菌丝体提取的多糖以及不同多糖组合物，褐色片状，批号：100319。配制方法：各样品称取80mg，以5ml非完全培养液超声溶解，调整pH至7.2，针式滤器过滤，制成16mg/ml的母液。临用前取1.2ml该母液，加4.8ml非完全培养液制成3.2mg/ml的高浓度药物稀释液，依次倍比稀释为1.6、0.8、0.4、0.2mg/ml的药物稀释液。

3.实验方法

分别取对数生长期的人源性结肠癌细胞HT-29、人源性肺癌细胞A549、人源性肝癌细胞HepG2，PBS洗两遍之后，0.05％胰蛋白酶消化，以RPMI 1640培养液制成细胞悬液，分别以1×105个/ml细胞浓度接种于96孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2细胞培养箱内孵育24小时，加入不同浓度的供试品稀释液。继续培养48小时，各孔加入MTT溶液，再继续培养2h。酸性DMSO振荡溶解甲臜结晶，以酶

测定OD值，按下列公式计算抑制率(％)。

4.实验结果

由图1可见，人工培养虫草子实体多糖在0.1～0.8mg/ml剂量时对人源性结肠癌细胞HT-29的增殖具有显著的抑制作用，其抑制率为3.83％～49.58％，虫草菌丝体多糖、桑黄子实体多糖和桑黄菌丝体多糖在0.1～0.8mg/ml剂量时对人源性结肠癌细胞HT-29的增殖具有一定的抑制作用，其抑制率分别为：7.46％～28.42％，-4.06％～22.40％和2.01％～18.13％。当不同多糖进行组合时，由图2可知，虫草子实体多糖和桑黄菌丝体多糖(1∶1)组合时可显著提高抑制结肠癌细胞HT-29的增殖，且这种抑制作用显著高于单一多糖，在0.2-1.6mg/ml剂量时，抑制率达17.47％～72.17％。

由图3可见，虫草子实体多糖、虫草菌丝体多糖、桑黄子实体多糖和桑黄菌丝体多糖在0.1～0.8mg/ml剂量时对人源性肝癌细胞HepG2的增殖具有一定的抑制作用，其抑制率分别为：-3.42％～21.07％，5.15％～6.39％，7.03％～9.77％和8.27％～14.87％。由图4可知，当不同多糖进行组合时，可显著提高其抗肝癌细胞HepG2的增殖作用，其中虫草子实体多糖和桑黄菌丝体多糖(1∶1)组合时抑制作用最显著，且显著高于任一单多糖，在0.2-1.6mg/ml剂量时，抑制率为35.01％～43.99％。

由图5可见，虫草子实体多糖和桑黄子实体多糖在0.1～0.8mg/ml剂量时对人源性肺癌细胞A549的增殖具有显著的抑制作用，其抑制率分别为23.47％～41.14％和11.45％～30.21％；虫草菌丝体多糖和桑黄菌丝体多糖在0.1～0.8mg/ml剂量时对肺癌细胞A549的增殖具有一定的抑制作用，其抑制率分别为：8.06％～18.11％和3.91％～14.50％。由图6可知，当不同多糖进行组合时，可显著提高其抗肺癌细胞A549的增殖作用，虫草子实体多糖和桑黄菌丝体多糖(1∶1)组合时这种协同抑制作用增强，在0.2-1.6mg/ml剂量时，抑制率为32.73％～54.40％。

以上所述仅为本发明的具体实施例，但本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims

1.一种具有抗肿瘤活性多糖组合物的制备方法，其特征在于：依次包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种具有抗肿瘤活性多糖组合物的制备方法，其特征在于：步骤A中虫草子实体的烘干温度为80℃，粉碎度为40目，蒸馏水提取温度95℃，提取时间为6h，滤液用于沉淀的乙醇终浓度为75％。

3.如权利要求1所述的一种具有抗肿瘤活性多糖组合物的制备方法，其特征在于：步骤C中桑黄菌丝体的烘干温度为80℃，粉碎度为40目，蒸馏水提取温度95℃，提取时间为6h，滤液用于沉淀的乙醇终浓度为75％。

4.如权利要求1所述的一种具有抗肿瘤活性多糖组合物的制备方法，其特征在于：步骤E中虫草子实体多糖与桑黄菌丝体多糖按1∶1的比例混合均匀。