CN1228449C - 灵芝菌丝体抗肿瘤水溶性杂多糖及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具有抗肿瘤活性的灵芝菌丝体水溶性多糖的制备方法。用葡萄糖为主要成分配制成培养基，由灵芝菌种深层发酵培养出灵芝菌丝体。分别用磷酸盐缓冲液在不同温度下从菌丝体中提取出两种水溶性杂多糖-蛋白质复合物和一种葡聚糖。其中两种杂多糖-蛋白质复合物主要由D-葡萄糖、甘露糖、半乳糖组成，结合蛋白含量分别为13.5%和20.1%，其重均分子量分别为62.8×104和81.8×104，而水溶性葡聚糖的分子量604.7×104。两种杂多糖-蛋白质复合物对植入小鼠体内的Sarcoma 180肿瘤的生长具有更为明显的抑制作用，而且无毒副作用。体外活性实验表明，该类多糖在较高剂量下对Sarcoma 180肿瘤细胞的增殖有显著的抑制效果。
Description
技术领域 本发明涉及具有抗肿瘤活性的灵芝菌丝体水溶性杂多糖及其制备方法和用途。它属于高分子化学领域，也属于分子生物学领域。
背景技术 恶性肿瘤已成为人类死亡率最高的疾病，世界各国都在花费巨资对肿瘤的治疗进行研究。针对癌症患者免疫力低的现象，人们积极寻找一种既具有抗肿瘤效果又能提高机体免疫功能的药物。80年代以来的研究表明，多糖对多种危害人类健康的疾病，如免疫紊乱、癌症、糖尿病、高血压、肝炎、肺炎等都具有显著的疗效。多糖类化合物是一种免疫调节剂，它能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬功能，诱导产生肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞素，从而提高人体的免疫机能，而且对正常细胞没有毒副作用(Intern.J.Orient.Med，17，57，1992)。Sone等人(Agric.Biol.Chem.，49，2461，1985)和Mizuno等人(Nipon Nogeikagaku Kaishi，42，2641，1985)分别报道了从灵芝子实体和菌丝体中提取的多糖具有明显的抗肿瘤活性。近年有关灵芝药物和保健品的报道很多，但灵芝菌丝体多糖的一、二级结构并不完全清楚，此外由于野生灵芝子实体资源有限，而人工栽培生长周期长，同时灵芝孢子的破壁技术有待突破，使得灵芝子实体和灵芝孢子活性多糖的推广应用受到限制。而采用生物工程技术培养灵芝菌丝体，并从中分离出多糖可克服这些缺点。
发明内容 本发明所要解决的问题是提供一种灵芝菌丝体抗肿瘤水溶性杂多糖及其制备方法和用途，所得水溶性杂多糖具有明显抗肿瘤活性，而且其制备方法简单易行、生产周期短、成本较低廉。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
灵芝菌丝体抗肿瘤水溶性杂多糖，由下法制得：采用华中农业大学应用真菌研究所提供的灵芝菌种(Ganoderma tsugae)在含葡萄糖的液体培养基中深层发酵培养出灵芝菌丝体，将灵芝菌丝体依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪；然后室温浸泡在磷酸盐缓冲液中，离心，收集提取液；提取液浓缩后，用20％～30％(重量百分比)H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后透析、冷冻干燥得水溶性杂多糖-蛋白质(GM1)纯品。上述离心后所得菌丝体残渣用20～50℃的磷酸盐缓冲液浸泡提取，离心，收集提取液；提取液浓缩后，用20％～30％(重量百分比)H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后透析、冷冻干燥得水溶性杂多糖-蛋白质(GM2)纯品。上述离心后所得菌丝体残渣用50～100℃的磷酸盐缓冲液浸泡提取，离心，收集提取液；提取液浓缩后，用20％～30％(重量百分比)H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后透析、冷冻干燥得水溶性葡聚糖(GM3)纯品。
上述两种水溶性杂多糖-蛋白质复合物主要由α-D-葡萄糖、甘露糖、半乳糖和不同含量的蛋白质组成，结合蛋白含量分别为13.5％和20.1％，其重均分子量分别为62.8×104和81.8×104，而水溶性葡聚糖的重均分子量604.7×104。
上述培养基的基本组成为D-葡萄糖(10～20％)，蛋白胨(0.6～1.2％)，酵母膏(0.5～1.5％)，KH2PO4(0.03～0.07％)，K2HPO4(0.03～0.07％)，MgSO4(0.03～0.07％)：以上百分比均为重量百分比。
上述培养条件为25～30℃摇床培养10～15天，摇床转速为150～220rpm。所得菌丝体为浅黄色，且有一种淡香味。过滤出菌丝体并冷冻干燥的灵芝菌丝体粉末。产率为每升培养液5～8克干菌丝体。
上述灵芝菌丝体索氏提取去除脂肪时间在4～8小时，其在磷酸盐缓冲液中的室温下的提取时间在8～12小时，20～50℃下的提取时间为2～4小时，50～100℃下的提取时间为0.5～1.5小时；透析时间在5～10天。
上述水溶性多糖可用作抗肿瘤药物或提高机体免疫功能的保健品。
上述水溶性多糖用红外、核磁共振、气相色谱、蛋白质分析仪、粘度计及光散射仪确定了其化学组成和二级结构。
本发明的灵芝菌丝体水溶性杂多糖为结构清楚的新的物质，它们具有明显抗肿瘤活性。由于弄清了其化学组成和二级结构，加之无任何毒副作用，这种水溶性灵芝菌丝体杂多糖可成为理想的和有开发前景的抗肿瘤药物或提高机体免疫功能的保健品。利用生物工程发酵技术培养灵芝菌丝体，并从中分离出具有抗肿瘤活性的多糖。因此具有广阔的应用前景和潜在的经济效益。本发明的水溶性杂多糖制备方法简单易行、成本低廉、生产周期短、易于工业化生产。
具体实施方式
以下结合具体的实例对本发明的技术方案作进一步说明：
实施例
灵芝菌种为华中农业大学应用真菌研究所提供的灵芝菌种(Ganoderma tsugae；公众可随时购买)。首先在斜面培养基中培养菌种。培养用的试管以及棉塞先在121℃消毒灭菌30分钟(空消)，再装入培养基在121℃消毒灭菌30分钟，斜放冷却使其凝固成斜面。然后在无菌室接种。斜面培养在恒温28℃下进行，为期7天。液体培养基配方如下：15％的D-葡萄糖、1％的蛋白胨、1％的酵母膏、0.05％的KH2PO4、0.05％的K2HPO4、0.05％的MgSO4，均为重量百分比。培养用的摇瓶(150mL)和棉塞事先在121℃消毒灭菌30分钟，装入液体培养基后再在121℃消毒灭菌30分钟。冷却后在无菌室接种。静置一天后将摇瓶置于摇床上，于28±1℃条件下震荡培养12天。所得菌丝体为浅黄色，且有一种淡香味。过滤出菌丝体并冷冻干燥的灵芝菌丝体粉末。产率为每升培养液5.6克干菌丝体。
将灵芝菌丝体粉末(100克)依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取各8小时。然后室温用0.2M磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)水溶液提取三次，每次12小时，离心，合并收集上清液(GM1)。所得残渣用0.2M磷酸盐缓冲液于20～50℃提取三次，每次4小时，离心，合并收集上清液(GM2)。所得残渣用0.2M磷酸盐缓冲液于50～100℃提取三次，每次1小时，离心，合并收集上清液(GM3)。提取液浓缩后，均用30％H2O2脱色至浅黄色，用Sevag法除去游离的蛋白质，反复进行9次以上直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后分别用清水和二次蒸馏水透析5天和3天，浓缩，最后冷冻干燥得白色粉状多糖纯品GM1、GM2和GM3分别为1.3克、0.5克和0.7克。
这些多糖的单糖组成、结合蛋白质含量、分子量及产率列于附表1。经华中科技大学同济医学院对植入Sarcoma 180肿瘤的小鼠进行体内腹腔注射实验的生物活性结果列于附表2。显然，灵芝菌丝体水溶性多糖均具有明显的抗肿瘤效果。同时给药期间小鼠体重均有增加，由此表明该多糖样品无毒副作用，特别是分子量不超过1×106的两种水溶性灵芝菌丝体杂多糖-蛋白质复合物具有更高的抗肿瘤活性。该多糖可用于制备抗肿瘤药物和提高机体免疫功能的保健品，具有极大的推广和应用前景。
附表1.灵芝菌丝体水溶性杂多糖单糖组成、蛋白质含量、产率和分子量
| 样品 | 产率(％) | 蛋白质(％) | Mw×10-4(gmol-1) | 单糖组成(％) | ||||||
| 鼠李糖 | 岩藻糖 | 木糖 | 甘露糖 | 半乳糖 | 葡萄糖 | 葡萄糖氨 | ||||
| GM1GM2GM3 | 1.30.50.7 | 13.5420.11- | 62.881.8604.7 | --- | 6.76.20.6 | 0.4nd0.5 | 26.14.81.9 | 48.334.35.2 | 10.146.886.5 | 8.57.95.2 |
-：未检测到；
附表2.灵芝菌丝体水溶性杂多糖小鼠体内抗S180肿瘤活性
| 样品 | 剂量(mg/kg×days) | 抑制率(％) | 体重增加率(％) |
| GM1GM2GM3 | 16×1032×1016×1032×105×1016×1032×10 | 54.0657.3073.0368.5443.0755.0651.46 | 27.521.84.74.933.323.311.5 |
Claims (9)
1.一种灵芝菌丝体抗肿瘤水溶性杂多糖，由下法制得：采用灵芝菌种(Ganoderma tsugae)在含葡萄糖的液体培养基中深层发酵培养出灵芝菌丝体，将灵芝菌丝体依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪；然后室温浸泡在磷酸盐缓冲液中，离心，收集提取液；提取液浓缩后，用H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质，然后透析、冷冻干燥得多糖纯品；所述培养基的基本组成为10～20％的D-葡萄糖、0.6～1.2％的蛋白胨、0.5～1.5％的酵母膏、0.03～0.07％的KH2PO4、0.03～0.07％的K2HPO4、0.03～0.07％的MgSO4，以上百分比为重量百分比。
2.一种灵芝菌丝体抗肿瘤水溶性杂多糖，由下法制得：采用灵芝菌种(Ganoderma tsugae)在含葡萄糖的液体培养基中深层发酵培养出灵芝菌丝体，将灵芝菌丝体依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪；经磷酸盐缓冲液室温提取后所得的菌丝体残渣用20～50℃的磷酸盐缓冲液浸泡提取，离心，收集提取液；提取液浓缩后，用H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质，然后透析、冷冻干燥得多糖纯品；所述培养基的基本组成为10～20％的D-葡萄糖、0.6～1.2％的蛋白胨、0.5～1.5％的酵母膏、0.03～0.07％的KH2PO4、0.03～0.07％的K2HPO4、0.03～0.07％的MgSO4，以上百分比为重量百分比。
3.一种灵芝菌丝体抗肿瘤水溶性杂多糖，由下法制得：采用灵芝菌种(Ganoderma tsugae)在含葡萄糖的液体培养基中深层发酵培养出灵芝菌丝体，将灵芝菌丝体用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪；经磷酸盐缓冲液室温和20～50℃依次提取后的菌丝体残渣用50～100℃的磷酸盐缓冲液浸泡提取，离心，收集提取液；提取液浓缩后，用H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质，然后透析、冷冻干燥得多糖纯品；所述培养基的基本组成为10～20％的D-葡萄糖、0.6～1.2％的蛋白胨、0.5～1.5％的酵母膏、0.03～0.07％的的KH2PO4、0.03～0.07％的K2HPO4、0.03～0.07％的MgSO4，以上百分比为重量百分比。
4.权利要求1所述水溶性杂多糖的制备方法，其特征在于：采用灵芝菌种(Ganoderma tsugae)在含葡萄糖的液体培养基中深层发酵培养出灵芝菌丝体，将灵芝菌丝体依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪；然后室温浸泡在磷酸盐缓冲液中，离心，收集提取液；提取液浓缩后，用20wt％～30wt％的H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后透析、冷冻干燥得多糖纯品；所述培养基的基本组成为10～20％的D-葡萄糖、0.6～1.2％的蛋白胨、0.5～1.5％的酵母膏、0.03～0.07％的KH2PO4、0.03～0.07％的K2HPO4、0.03～0.07％的MgSO4，以上百分比为重量百分比。
5.权利要求2所述水溶性杂多糖的制备方法，其特征在于：采用灵芝菌种(Ganoderma tsugae)在含葡萄糖的液体培养基中深层发酵培养出灵芝菌丝体，将灵芝菌丝体依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪；经磷酸盐缓冲液室温提取后的菌丝体残渣用20～50℃的磷酸盐缓冲液浸泡提取，离心，收集提取液；提取液浓缩后，用20wt％～30wt％的H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后透析、冷冻干燥得多糖纯品；所述培养基的基本组成为10～20％的D-葡萄糖、0.6～1.2％的蛋白胨、0.5～1.5％的酵母膏、0.03～0.07％的KH2PO4、0.03～0.07％的K2HPO4、0.03～0.07％的MgSO4，以上百分比为重量百分比。
6.权利要求3所述水溶性杂多糖的制备方法，其特征在于：采用灵芝菌种(Ganoderma tsugae)在含葡萄糖的液体培养基中深层发酵培养出灵芝菌丝体，将灵芝菌丝体依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪；经磷酸盐缓冲液室温和20～50℃提取离心后所得菌丝体残渣用50～100℃的磷酸盐缓冲液浸泡提取，离心，收集提取液；提取液浓缩后，用20wt％～30wt％的H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后透析、冷冻干燥得多糖纯品；所述培养基的基本组成为10～20％的D-葡萄糖、0.6～1.2％的蛋白胨、0.5～1.5％的酵母膏、0.03～0.07％的KH2PO4、0.03～0.07％的K2HPO4、0.03～0.07％的MgSO4，以上百分比为重量百分比。
7.权利要求1所述的水溶性杂多糖在制备抗肿瘤药物或提高机体免疫功能的保健品中的应用。
8.权利要求2所述的水溶性杂多糖在制备抗肿瘤药物或提高机体免疫功能的保健品中的应用。
9.权利要求3所述的水溶性杂多糖在制备抗肿瘤药物或提高机体免疫功能的保健品中的应用。
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