CN101402951B - 一种灵芝细胞固定化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种灵芝细胞固定化方法，其具体步骤为：(1)制备固定化细胞载体：取人造海绵、玉米芯或丝瓜瓤，洗净，121℃灭菌45～60min，无菌保存备用；(下述步骤在无菌条件下进行)(2)灵芝细胞斜面培养：接种灵芝细胞到斜面培养基上，25～28℃，培养7～9天，形成种子菌；(3)种子菌扩大培养：收集种子菌，接种到装250～350ml培养液的500ml三角瓶、或装1100～1400ml培养液的2000ml三角瓶，25～28℃下，以100～130r/min摇瓶培养8～10天，形成菌液；(4)用衡重法测定细胞干质量达到0.7～1.0mg/ml；(5)按培养液体积：载体干质量为8～10ml∶1～1.5mg，加入备用载体；(6)以100～130r/min摇瓶培养8～12小时，细胞被固定。
Description
技术领域
本发明涉及微生物细胞固定方法，具体地，涉及一种灵芝细胞固定化方法。
背景技术
灵芝(Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Krast.)属于担子菌纲、多孔菌科、灵芝属高等真菌。中华传统医学认为，灵芝味甘、性温、无毒、可补心、肝、肺、脾、肾五胀之气，具滋补强壮、固本扶正之功效。现代医学研究也表明，灵芝的药理成分非常丰富，其中有效成份包括多糖类(即：灵芝多糖)、三萜类(主要为灵芝酸类)、灵芝多肽、16种氨基酸(其中含有七种人体必需氨基酸)、蛋白质、甾类、甘露醇、香豆精苷、生物碱、有机酸(主含延胡索酸)，以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn、等。灵芝对人体具有双向调节作用，所治病种，涉及心脑血管、消化、神经、内分泌、呼吸、运动等各个系统，尤其对肿瘤、肝脏病变、失眠以及衰老的防治作用十分显著。其主要有效成份为灵芝多糖、灵芝酸具有抗癌和抗艾滋病等疗效(Russell R，Paterson M.(2006)Ganoderma-A therapeutic fungal biofactory.PHytochemistry67:1985-2001；Kun-Chieh Cheng，Hsuan-Cheng Huang，Jenn-Han Chen，et al.(2007)Ganoderma lucidum polysaccharides in human monocytic leukemia cells：from geneexpression to network construction.BMC Genomics.8：411.；El-MekkawyS，Meselhy MR，Nakamura N，Tezuka Y，Hattori M，Kakiuchi N，ShimotohnoK，Kawahata T，Otake T.(1998)Anti-HIV 1 and anti-HIV-1-protease substances fromGanoderma lucidum.PHytochemistry49：1651-1657)。
在灵芝多糖、灵芝酸的药用价值被广泛揭示的同时，灵芝产量和质量成为限制其应用的瓶颈。目前灵芝的主要来源一是采集野生灵芝，二是人工栽培。野生灵芝数量稀少，采集困难，价格高昂，难以广泛应用。人工栽培灵芝的生长期很短，先天不足，菌种抗病毒能力差，农药的大量使用，基料的变化等，使目前的人工栽培灵芝往往是有其形而无其实。
目前也发展了利用发酵方法产生灵芝多糖和灵芝酸等有效成份的方法，主要采用液体深层发酵。如公开号为CN1264743A(发明名称：液体发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝酸的工艺)、CN1375557A(发明名称：生物反应器中灵芝细胞两阶段培养生产灵芝酸的方法)、授权公告号为CN1141392C(发明名称：中间补料发酵生产灵芝多糖和灵芝酸的方法)、公开号为101235393A(发明名称：促进灵芝酸和灵芝多糖生物合成的发酵方法)等专利文献公开了一系列通过液体深层发酵产生灵芝多糖和灵芝酸的方法。但液体深层发酵是采用游离细胞生产灵芝糖和灵芝酸，细胞密度低，产物含量和产量低，这正是灵芝多糖和灵芝酸生产行业的瓶颈。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种灵芝细胞固定化方法，与游离细胞发酵相比，提高了细胞密度，增加了产物含量和产量，增强细胞耐受毒害能力，易于分离细胞和产物，可反复利用，发酵周期长。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种灵芝细胞固定化方法，包括以下步骤：
(1)固定化细胞载体的制备：取人造海绵或玉米芯或丝瓜瓤，洗净，在121℃灭菌45～60min，保存备用；
(2)灵芝细胞斜面的培养：无菌条件下，将灵芝细胞接种到斜面培养基上，在25～28℃培养7～9天，形成种子菌；
(3)种子菌扩大培养：在无菌条件下，收集种子菌，接种到装无菌培养液250～350ml的500ml三角瓶中或装无菌培养液1100～1400m的2000ml三角瓶中，在25～28℃下以100～130r/min摇瓶培养8～10天，形成菌液；
(4)用衡重法测定细胞干质量达到0.7～1.0mg/ml；
(5)按培养液体积与载体干质量的比例为8～10ml∶1～1.5mg，在无菌条件下向菌液中加入备用载体；
(6)以100～130r/min摇瓶培养8～12小时，细胞被固定。
本发明灵芝细胞固定化方法中，按衡重法测定细胞固定化效率为70～85％。
本发明灵芝细胞固定化方法中，所述灵芝选用紫芝(Ganoderma Sinense)YTZ9k1CGMCC No.0742。
本发明灵芝细胞固定化方法中，所述斜面培养基为马铃薯培养基。
本发明灵芝细胞固定化方法中，所述灵芝细胞斜面菌种的培养基为：马铃薯150～250g、琼脂18～22g、蛋白胨0.1～0.3g、葡萄糖15～25g、磷酸二氢钾0.2～0.4g、硫酸镁0.1～0.2g、维生素B10.06～0.1g，加水至1000ml，自然pH，灭菌。
本发明灵芝细胞固定化方法中，所述种子菌的液体培养基为：黄豆30～60g、玉米8～12g、蔗糖8～12g、硫酸镁0.3～0.5g、蛋白胨3～5g、葡萄糖8～12g、磷酸二氢钾1.2～1.6g、氯化钙0.1～0.3g，先将黄豆和玉米匀浆后配料，加水定容至1000ml，自然pH，灭菌。
本发明为工业化高效发酵生产灵芝多糖提供了一种新的方法。本发明采用人造海绵，玉米芯或丝瓜瓤作为细胞固定化的载体，原料来源丰富，易于加工，价格低廉，绿色环保，固定化工艺简单，固定化效率高，按衡重法测定细胞固定化效率，并按下式计算：
可得灵芝细胞固定化效率可达70～85％，细胞固定后，发酵液中多糖含量可达10-13％，比游离细胞发酵后的发酵液中多糖含量提高了3-4倍。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明有关细节做进一步的说明。
实施例1
(1)人造海绵固定化细胞载体的制备：取孔径0.75mm的人造海绵，洗净，切成0.3cm3，121℃灭菌50min，保存备用。
(2)灵芝细胞斜面培养：无菌条件下，将紫芝(Ganoderma Sinense)YTZ9k1 CGMCCNo.0742细胞接种到斜面培养基上，25～28℃，培养8天，形成种子菌备用。其中，斜面培养基中含有马铃薯200g/L、琼脂20g/L、蛋白胨0.2g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.15g/L、维生素B10.08g/L。
(3)种子菌扩大培养：无菌条件下，收集种子菌，接种到装无菌培养液300ml的500ml三角瓶，25～28℃下，以100～130r/min摇瓶培养8～10天，形成菌液。其中，种子菌的培养液含有黄豆45g/L、玉米10g/L、蔗糖10g/L、硫酸镁0.4g/L、蛋白胨4g/L、葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾1.4g/L、氯化钙0.2g/L。
(4)用衡重法测定细胞干质量达到1.0mg/ml，则可计算得到固定前细胞干质量为300mg。
(5)按培养液体积与载体干质量的比例为9ml∶1.2mg，在无菌条件下加入干质量为40mg备用载体。
(6)在100～130r/min摇瓶培养12小时，细胞被固定，测得固定后载体干质量为295mg。
按衡重法测定细胞固定化效率，并按下式计算：
取部分步骤(5)中的菌液，记为样品I，和部分步骤(6)中的固定化菌液，记为样品II，使样品I和样品II中的细胞干质量相同，在相同条件下发酵后，用硫酸-苯酚法分别测定发酵液中灵芝多糖的含量，测得样品I的多糖含量为3％，样品II的多糖含量为12％。由此可见，细胞固定后，发酵液中多糖产量提高了4倍。
实施例2
(1)玉米芯固定化细胞载体的制备：取成熟玉米棒，除去玉米粒，取玉米芯两端各切去0.5～1cm左右，洗净，121℃灭菌50min，保存备用。
(2)灵芝细胞斜面培养：无菌条件下，将紫芝(Ganoderma Sinense)YTZ9k1 CGMCCNo.0742细胞接种到斜面培养基上，25～28℃，培养8天，形成种子菌备用。其中，斜面培养基中含有马铃薯200g/L、琼脂20g/L、蛋白胨0.2g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.15g/L、维生素B10.08g/L。
(3)种子菌扩大培养：无菌条件下，收集种子菌，接种到装无菌培养液1200ml的2000ml三角瓶25～28℃下，以100～130r/min摇瓶培养8～10天，形成菌液。其中，种子菌的培养液含有黄豆45g/L、玉米10g/L、蔗糖10g/L、硫酸镁0.4g/L、蛋白胨4g/L、葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾1.4g/L、氯化钙0.2g/L。
(4)用衡重法测定细胞干质量达到0.9mg/ml，则可计算得到固定前细胞干质量为1080mg。
(5)按培养液体积与载体干质量的比例为8ml∶1.5mg，在无菌条件下加入干质量为225mg备用载体。
(6)在100～130r/min摇瓶培养10小时，细胞被固定，测得固定后载体干质量为1089mg。
按衡重法测定细胞固定化效率，并按下式计算：
取部分步骤(5)中的菌液，记为样品III，和部分步骤(6)中的固定化菌液，记为样品IV，使样品III和样品IV中的细胞干质量相同，在相同条件下发酵后，用硫酸-苯酚法分别测定发酵液中灵芝多糖的含量，测得样品III的多糖含量为3％，样品IV的多糖含量为10％。由此可见，细胞固定后，发酵液中多糖产量提高了3.3倍。
实施例3
(1)丝瓜海绵体固定化细胞载体的制备：将成熟丝瓜晒干后除去外皮部分，得到丝瓜海绵体，切成0.3cm3，洗净，121℃灭菌50min，保存备用。
(2)灵芝细胞斜面培养：无菌条件下，将紫芝(Ganoderma Sinense)YTZ9k1 CGMCCNo.0742细胞接种到斜面培养基上，25～28℃，培养8天，形成种子菌备用。其中，斜面培养基中含有马铃薯200g/L、琼脂20g/L、蛋白胨0.2g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.15g/L、维生素B10.08g/L。
(3)种子菌扩大培养：无菌条件下，收集种子菌，接种到装无菌培养液1200ml的2000ml三角瓶(扩大培养)25～28℃下，以100～130r/min摇瓶培养8～10天，形成菌液。其中，种子菌的培养液含有黄豆45g/L、玉米10g/L、蔗糖10g/L、硫酸镁0.4g/L、蛋白胨4g/L、葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾1.4g/L、氯化钙0.2g/L。
(4)用衡重法测定细胞干质量达到0.7mg/ml，则可计算得到固定前细胞干质量为840mg。
(5)按培养液体积与载体干质量的比例为10ml∶1mg，在无菌条件下加入干质量为120mg备用载体。
(6)在100～130r/min摇瓶培养8小时，细胞被固定，测定固定后载体干质量为708mg。
按衡重法测定细胞固定化效率，并按下式计算：
取部分步骤(5)中的菌液，记为样品V，和部分步骤(6)中的固定化菌液，记为样品VI，使样品V和样品VI中的细胞干质量相同，在相同条件下发酵后，用硫酸-苯酚法分别测定发酵液中灵芝多糖的含量，测得样品V的多糖含量为2.8％，样品VI的多糖含量为10.5％。由此可见，细胞固定后，发酵液中多糖产量提高了3.75倍。
Claims (6)
1.一种灵芝细胞固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)固定化细胞载体的制备：取人造海绵或丝瓜瓤，洗净，在121℃灭菌45～60min，保存备用；
(2)灵芝细胞斜面的培养：无菌条件下，将灵芝细胞接种到斜面培养基上，在25～28℃培养7～9天，形成种子菌；
(3)种子菌扩大培养：在无菌条件下，收集种子菌，接种到装无菌培养液250～350ml的500ml三角瓶中或装无菌培养液1100～1400ml的2000ml三角瓶中，在25～28℃下以100～130r/min摇瓶培养8～10天，形成菌液；
(4)用恒重法测定细胞干质量达到0.7～1.0mg/ml；
(5)按培养液体积与载体干质量的比例为8～10ml∶1～1.5mg，在无菌条件下向菌液中加入备用载体；
(6)以100～130r/min摇瓶培养8～12小时，细胞被固定；
其中，所述灵芝选用紫芝(Ganoderma Sinense)YTZ9k1 CGMCC No.0742。
2.如权利要求1所述的灵芝细胞固定化方法，其特征在于：所述海绵孔径为0.6～0.9mm，切成0.3cm3。
3.如权利要求1所述的灵芝细胞固定化方法，其特征在于：所述丝瓜瓤为成熟丝瓜去皮，晒干后得到的丝瓜海绵体。
4.如权利要求1所述的灵芝细胞固定化方法，其特征在于：所述灵芝细胞斜面的培养基为马铃薯培养基。
5.如权利要求1所述的灵芝细胞固定化方法，其特征在于：所述灵芝细胞斜面的培养基为：马铃薯150～250g、琼脂18～22g、蛋白胨0.1～0.3g、葡萄糖15～25g、磷酸二氢钾0.2～0.4g、硫酸镁0.1～0.2g、维生素B10.06～0.1g，加水至1000ml，自然pH，灭菌。
6.如权利要求1所述的灵芝细胞固定化方法，其特征在于：所述种子菌的液体培养基为：黄豆30～60g、玉米8～12g、蔗糖8～12g、硫酸镁0.3～0.5g、蛋白胨3～5g、葡萄糖8～12g、磷酸二氢钾1.2～1.6g、氯化钙0.1～0.3g，先将黄豆和玉米匀浆后配料，加水定容至1000ml，自然pH，灭菌。
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