CN101857645B

CN101857645B - 一种灵芝水溶性中性多糖glp1及其制备方法

Info

Publication number: CN101857645B
Application number: CN201010184061XA
Authority: CN
Inventors: 黄生权; 敖宏
Original assignee: Infinitus China Co Ltd
Current assignee: Infinitus China Co Ltd
Priority date: 2010-05-20
Filing date: 2010-05-20
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2030-05-20
Also published as: CN101857645A

Abstract

本发明公开了一种灵芝水溶性中性多糖GLP1，由葡萄糖残基Glcp和半乳糖残基Galp组成，其摩尔比为34∶1，其峰位分子量为2.5×10⁶Da，所述的GLP1主要由→4)Glcp(1→构成主链，且每10个→4)Glcp(1→在6位有一个支链，所述的支链为→6)Glcp(1→和→4)Galp(1→，所述的支链的摩尔比为6∶1，本发明还公开了上述多糖GLP1的制备方法，本发明方法工艺新颖、简洁，采用本发明方法所制备的灵芝水溶性中性多糖GLP1纯度和活性高。

Description

一种灵芝水溶性中性多糖GLP1及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种多糖，具体涉及一种灵芝水溶性中性多糖GLP1及其制备方法。

背景技术

灵芝(Ganoderma Lucidum)为担子菌门担子菌纲多孔菌科灵芝属的一种药用真菌，又称“灵芝草”、“仙草”、“瑞草”，也叫长生草、灵草、还魂草，在我国有悠久的药用历史。我国古人认为灵芝是一种超自然的神药仙草，东汉时期的《神农本草经》对灵芝的功效有详细的极为肯定的记载，认为灵芝具有扶正固本、滋补强壮、延年益寿等功效。现代药理学与临床实践进一步证实了灵芝能抗衰老、增强肌体免疫力，而且具有广谱的抗病毒、抗肿瘤作用。现代科学研究表明灵芝药理活性与其生物活性成分密切相关。

近年来，对灵芝营养成分的研究逐渐受到人们的重视，研究结果表明，灵芝的营养成分种类繁多，除含有六大营养成分还含有生理活性极高的多糖。赵桂梅等人分离纯化出一种水溶性多糖；罗立新等人分离纯化出一种水溶性多糖，从目前的研究结果可以看出，虽然一些学者已鉴定出一些灵芝多糖的结构，但由于灵芝多糖的多样性以及分离纯化方法的差异性，造成灵芝多糖结构的差异性，所以制备的灵芝多糖也不同。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵芝水溶性中性多糖GLP1及其制备方法，该方法工艺新颖、简洁，采用该方法所制备的灵芝水溶性中性多糖GLP1纯度和活性高。

为达到上述目的，本发明提供的灵芝水溶性中性多糖GLP1，由葡萄糖残基Glcp和半乳糖残基Galp组成，其摩尔比为34∶1，其峰位分子量为2.5×10⁶Da，所述的GLP1主要由→4)Glcp(1→构成主链，且每10个→4)Glcp(1→在6位有一个支链，所述的支链为→6)Glcp(1→和→4)Galp(1→，所述的支链的摩尔比为6∶1，所述的GLP1的结构单元如下：

本发明所述的葡萄糖残基Glcp是GLP1的主要单元，以1→4、1→6、1→4，6和1→连接方式存在，它们的摩尔比30.7∶12.1∶2.8∶1。

本发明所述的半乳糖残基Galp是GLP1的另一单元，以1→4连接方式存在。

本发明提供的上述灵芝水溶性中性多糖GLP1的制备方法，含有下述步骤：

(1)取除杂后灵芝粉，按料液的重量体积比为1∶15～25加入水，先采用微波然后采用超声波辅助提取得提取液；

(2)将步骤(1)所得提取液离心后，取上清液，加入工业酒精，静置过夜，离心，取下层沉淀依次经无水乙醇和丙酮洗涤，冷冻干燥，即为灵芝粗多糖；

(3)将步骤(2)所得灵芝粗多糖过阴离子交换柱，用NaCl水溶液进行线性梯度洗脱，收集流出液中的GLP1组分，上凝胶过滤层析柱，将所得组分真空浓缩，依次经透析、浓缩、冷冻干燥后得灵芝多糖GLP1。

在上述步骤中：

步骤(1)中灵芝粉的除杂过程为：取灵芝粉，用工业酒精在60℃～80℃回流2～3次去杂，每次3～5h，离心后取下层沉淀在50℃～65℃干燥5～8h，得除去部分单糖、低聚糖和脂类化合物的灵芝粉。

上述灵芝粉的原料为赤灵芝子实体，所述的灵芝粉的粒度为≤30目，水分含量为13～15％。

步骤(1)中微波的功率为350～400W，提取时间为10～12min；超声功率为550～600W，温度为50～60℃，超声的时间为60～70min，占空比为5S/5S。

步骤(2)中加入工业酒精至溶液的含醇量为75～85％。

步骤(3)中NaCl水溶液的摩尔浓度为0.1～1.5mol/L。

步骤(3)中透析时的截留分子量＞10000。

如附图1-2所示，上述方法制备的GLP1经HPLC毛细管电泳(CE)和高效液相色谱(HLPC)分离后只得到一个单峰，从而说明其分布均一，不含有其它杂质，证明GLP1是一种水溶性中性多糖灵芝多糖。

本发明的有益效果是：本发明从灵芝中提取并纯化得到单一级纯多糖GLP1，并通过结构鉴定得出其结构单元和基本组成，为灵芝多糖的功能及其资源的深度开发提供参考。

附图说明

图1是GLP1的HLPC洗脱曲线图；

图2是GLP1高效毛细管电泳图谱；

图3是GLP1乙酰化的气相色谱图；

图4是GLP1的红外傅立叶转换光谱图；

图5是GLP1的甲基化碎片GC/MS重构总离子流图；

图6是GLP1的¹H NMR谱图；

图7是GLP1的DEPT-135°NMR谱图；

图8是GLP1的COSY-NMR谱图；

图9是GLP1的HSQC NMR谱图；

图10是GLP1的HMBC谱图。

具体实施方式

第一部分：灵芝水溶性中性多糖GLP1结构分析

(1)GLP1单糖组成

采用糖腈乙酸酯衍生物气相色谱法进行定量测定GLP1糖基组成摩尔比，其气相色谱图如附图3所示。糖基组成分析结果表明，GLP1是由葡萄糖残基Glcp和半乳糖残基Galp组成，其摩尔比为34∶1。

(2)GLP1红外光谱测定

GLP1的红外光谱见附图4，由附图4可推测，所得多糖在3416.25cm^-1处有一宽而强的吸收峰是由于分子内和分子间的O-H伸缩振动的引起，这是-OH伸缩振动峰；在2923.27cm^-1处有一较弱的吸收峰主要归属于C-H(CH、CH₂、CH₃)的伸缩振动，这是-CH伸缩振动吸收峰；在1384.13cm^-1处有一尖而较强的吸收峰是由于C-H的弯曲振动所引起，这是-CH弯曲振动吸收峰；在1077.83cm^-1处有一尖而弱的吸收峰，这是-OH变角振动吸收峰。

(3)甲基化分析

GLP1经甲基化、水解、还原、和乙酰处理后进行GC-MS分析，其甲基化碎片的GC/MS重构总离子流图谱见附图5；根据GLP1的单糖组成，结合标准图谱对GLP1甲基化碎片中摩尔含量较高的峰进行归属，甲基化分析结果见表1。

表1GLP1的甲基化分析(mol.％)

甲基化分析结果表明：

1)GLP1主要是→4)Glcp(1→、→6)Glcp(1→以及→4)Galp(1→组成；

2)Glcp残基是GLP1的主要单元，以1→4、1→6、1→4，6和1→连接方式存在，它们的摩尔比30.7∶12.1∶2.8∶1；

3)Galp残基以1→4连接方式存在。

(4)GLP1¹HNMR分析

如附图6所示，GLP1¹H NMR谱图显示异头碳上氢的化学位移δ为5.53，5.350，5.290，5.185，4.628与4.545ppm，提示该多糖含有五类端基质子；

如附图5所示，GLP1大于δ5.0的质子信号明显小于δ5.0ppm的信号，因此，GLP1主要以β型糖苷键构型存在；

(5)GLP1DEPT谱分析

如附图7所示，GLP1的DEPT谱中可见：异头碳区域的的化学位移值处于103.40ppm，可以判断葡聚糖GLP1的糖残基为吡喃环型，糖苷键的连接方式为β型，这与¹HNMR的推测相一致。

通过对GLP1¹H-NMR、DEPT谱分析，并利用同核二维相关谱COSY(见附图8)、异核多量子二维相干相关谱HMQC(见附图9)、异核多键二维相关谱HMBC(见附图10)分析，GLP1的部分酸水解和甲基化结果，对GLP1糖残基的1H和¹³C NMR的化学位移进行归属，结果见表2和表3。

表2GLP1中糖残基的¹HNMR的化学位移(δ)

表3GLP1中糖残基的¹³C NMR的化学位移(δ)

综合对灵芝水溶性中性多糖GLP1的分子量、红外光谱、紫外光谱以及核磁共振测定及分析结果，推测GLP1具有的特征为：

1)GLP1是由→4)Glcp(1→构成的主链，在→4)Glcp(1→的6位有分支，且每十个→4)Glcp(1→在6位有一个分支点；

2)GLP1是由→6)Glcp(1→和→4)Galp(1→构成核心的支链，它们的摩尔比6∶1。

第二部分：灵芝水溶性中性多糖GLP1的制备方法

实施例1

精确称取5g赤灵芝粉，赤灵芝粉的粒度≤30目，水分含量为13.26％，以水作为溶剂，加水量100mL，先采用微波然后采用超声辅助提取水溶性灵芝多糖的方法，具体过程为：将上述灵芝粉的水溶液置于微波炉中进行微波辅助提取，然后将上述微波辅助提取后的溶液转入超声细胞破碎仪中进行超声辅助提取，其中，微波提取条件为：微波功率350W，提取时间12min；超声波辅助提取条件为：超声功率550W，提取温度50℃，提取时间70min，其中占空比5S/5S。将提取液于4000r/min条件下离心12min，收集上清液，加入工业酒精至溶液的含醇量为80％，静置过夜，离心，取下层沉淀依次经无水乙醇和丙酮洗涤，冷冻干燥，即为灵芝粗多糖；按硫酸苯酚法测定水溶性多糖含量为3.158±0.046％。将灵芝粗多糖过阴离子交换柱DEAE Sepharose Fast Flow(Pharmacia，2.6×20cm)，用摩尔浓度0.1～1.5mol/LNaCL进行线性梯度洗脱，苯酚-硫酸法跟踪检测多糖含量(OD₄₉₀)。分别收集单一组分GLP1、GLP2、GLP3、GLP4和GLP5。GLP1过凝胶过滤层析柱Sephacryl S-500HR，将所收集得到的组分真空浓缩，浓缩液置透析袋内(截留分子量＞10000)，去离子水透析3天，再浓缩并冷冻干燥后，得灵芝多糖GLP1，通过毛细管电泳(CE)和高效液相色谱(HLPC)证明GLP1是一种单一灵芝多糖。

实施例2

以赤灵芝子实体为原料进行粉碎处理，粉碎粒度≤30目，灵芝粉水分含量为13～15％；将上述灵芝粉用体积浓度为95％的工业酒精在70℃回流2次，每次5h，以钝化灵芝的内源性酶并去掉醇溶性成分，离心去除上清液，沉淀在50℃烘箱干燥8h，得到去除掉部分单糖、低聚糖和脂类物质的灵芝粉。

精确称取10g上述赤灵芝，以水作为溶剂，加水量250mL，先采用微波然后超声辅助提取水溶性灵芝多糖的方法，其中，微波提取条件为：微波功率400W，提取时间10min；超声波辅助提取条件为：超声功率550W，提取温度55℃，提取时间65min，其中占空比5S/5S。将提取液于4000r/min条件下离心10min，收集上清液，加入工业酒精至溶液的含醇量为85％，静置过夜，离心，取下层沉淀依次经无水乙醇和丙酮洗涤，冷冻干燥，即为灵芝粗多糖；按硫酸苯酚法测定水溶性多糖含量为3.24±0.13％。将灵芝粗多糖过阴离子交换柱DEAE SepharoseFast Flow(Pharmacia，2.6×20cm)，用摩尔浓度为0.1～1.5mol/LNaCL进行线性梯度洗脱，苯酚-硫酸法跟踪检测多糖含量(OD₄₉₀)。分别收集单一组分GLP1、GLP2、GLP3、GLP4、GLP5、GLP6和GLP7。GLP1过凝胶过滤层析柱SephacrylS-500HR，将所收集得到的组分真空浓缩，浓缩液置透析袋内(截留分子量＞10000)，去离子水透析3天，再浓缩并冷冻干燥后，得灵芝多糖GLP1。通过毛细管电泳(CE)和高效液相色谱(HLPC)证明GLP1是一种单一灵芝多糖。

实施例3

以赤灵芝子实体为原料进行粉碎处理，粉碎粒度≤30目，灵芝粉水分含量为13～15％；将上述灵芝粉用体积浓度为95％的工业酒精在80℃回流2次，每次3h，以钝化灵芝的内源性酶并去掉醇溶性成分，离心去除上清液，沉淀在60℃烘箱干燥5h，得到去除掉部分单糖、低聚糖和脂类物质的灵芝粉。

精确称取20g赤灵芝粉，以水作为溶剂，加水量300mL，先采用微波然后超声辅助提取水溶性灵芝多糖的方法，其中，微波提取条件为：微波功率380W，提取时间11min；超声波辅助提取条件为：超声功率600W，提取温度50℃，提取时间60min，其中占空比5S/5S。将提取液于4000r/min条件下离心15min，收集上清液，加入工业酒精至溶液的含醇量为75％，静置过夜，离心，取下层沉淀依次经无水乙醇和丙酮洗涤，冷冻干燥，即为灵芝粗多糖；按硫酸苯酚法测定水溶性多糖含量为3.28±0.046％。将灵芝粗多糖过阴离子交换柱DEAE SepharoseFast Flow(Pharmacia，2.6×20cm)，用摩尔浓度为0.1～1.5mol/LNaCL进行线性梯度洗脱，苯酚-硫酸法跟踪检测多糖含量(OD₄₉₀)。分别收集单一组分GLP1、GLP2、GLP3、GLP4和GLP5。GLP1过凝胶过滤层析柱Sephacryl S-500HR，将所收集得到的组分真空浓缩，浓缩液置透析袋内(截留分子量＞10000)，去离子水透析3天，再浓缩并冷冻干燥后，得灵芝多糖GLP1，通过毛细管电泳(CE)和高效液相色谱(HLPC)证明GLP1是一种单一灵芝多糖。

Claims

1.一种灵芝水溶性中性多糖GLP1，其特征在于：由葡萄糖残基Glcp和半乳糖残基Galp组成，其摩尔比为34∶1，采用糖腈乙酸酯衍生物气相色谱法获得的灵芝水溶性中性多糖GLP1的峰位分子量为2.5×10⁶Da，所述的GLP1主要由→4)Glcp(1→构成主链，且每10个→4)Glcp(1→在6位有一个支链，所述的支链为→6)Glcp(1→和→4)Galp(1→，所述的支链的摩尔比为6∶1，所述的GLP1的结构单元如下：

2.根据权利要求1所述的灵芝水溶性中性多糖GLP1，其特征在于：所述的葡萄糖残基Glcp是GLP1的主要单元，以1→4、1→6、1→4，6和1→连接方式存在，它们的摩尔比30.7∶12.1∶2.8∶1。

3.根据权利要求1所述的灵芝水溶性中性多糖GLP1，其特征在于：所述的半乳糖残基Galp是GLP1的另一单元，以1→4连接方式存在。

4.权利要求1所述的灵芝水溶性中性多糖GLP1的制备方法，其特征在于：含有下述步骤：

5.根据权利要求4所述的灵芝水溶性中性多糖GLP1的制备方法，其特征在于：步骤(1)中灵芝粉的除杂过程为：取灵芝粉，用工业酒精在60℃～80℃回流2～3次去杂，每次3～5h，离心后取下层沉淀在50℃～65℃干燥5～8h，得除去部分单糖、低聚糖和脂类化合物的灵芝粉。

6.根据权利要求5所述的灵芝水溶性中性多糖GLP1的制备方法，其特征在于：所述的灵芝粉的原料为赤灵芝子实体，所述的灵芝粉的粒度为≤30目，水分含量为13～15％。

7.根据权利要求4所述的灵芝水溶性中性多糖GLP1的制备方法，其特征在于：步骤(1)中微波的功率为350～400W，提取时间为10～12min；超声功率为550～600W，温度为50～60℃，超声的时间为60～70min，占空比为5S/5S。

8.根据权利要求4所述的灵芝水溶性中性多糖GLP1的制备方法，其特征在于：步骤(2)中加入工业酒精至溶液的含醇量为75～85％。

9.根据权利要求4所述的灵芝水溶性中性多糖GLP1的制备方法，其特征在于：步骤(3)中NaCl水溶液的摩尔浓度为0.1～1.5mol/L。

10.根据权利要求4所述的灵芝水溶性中性多糖GLP1的制备方法，其特征在于：步骤(3)中透析时的截留分子量＞10000。