CN104817646B - 薄树芝中的多糖及其提取方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了薄树芝中的多糖及其提取方法和用途，该方法为以薄树芝菌丝粉为原料，通过水提醇沉提取和碱提的结合、Sevag法脱蛋白、DEAE纤维素柱层析、Sephadex 柱层析等获得多糖纯品，结构分析显示此法得到的薄树芝多糖有杂多糖和均多糖，分子量范围1000‑200000Da。该提取方法在比较温和的条件下进行，完好的保存了多糖的组分，所得多糖结构明确，质量可控。该薄树芝多糖在免疫增强、抗肿瘤方面具有显著效果，同时，本发明得到的多糖纯品，在抗氧化实验中显示其具有DPPH·和OH·自由基清除活性，这些可为将来在食品、化妆品、保健品、医药等领域应用中提供依据。
Description
技术领域
本发明属于医药及保健食品技术领域，具体涉及植物粗多糖、纯多糖及其制备方法和用途。
背景技术
薄树芝（Ganoderma Capense （Lloyd）Teng）为灵芝亚属真菌薄树芝的菌丝体，又称薄盖灵芝、薄芝，是多孔菌科灵芝属真菌。性微甘、寒，能清热、消炎，主治肝炎、肿瘤等，广泛分布于中国、日本、韩国等亚洲国家。
据报道，薄树芝的化学成分有嘌呤、嘧啶、D-甘露醇、凝集素、生物碱，麦角甾醇、麦角甾醇棕榈酸酯、麦角甾-7,22-二烯-(3)酮、麦角甾-7、22-二烯-3β-醇、5α-豆甾烷-(3,6)二酮、β-谷甾醇等甾体化合物，菜豆皂苷元-B，以及花生酸、硬脂酸、廿二碳烷酸、廿三碳烷酸、廿四碳烷酸等饱和脂肪酸，蛋白质、氨基酸、多糖、脂肪酸及丰富的矿质元素等。其中，主要活性物质是薄树芝中的多糖、糖肽类成分。研究表明，薄树芝提取物具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、调节心血管系统、护肝解毒、镇静、降血糖等方面的活性。作为主要活性成分的薄树芝多糖具有潜在的开发应用价值。但是由于其环境要求高，自然资源破坏严重等因素，使得薄树芝资源越来越稀缺。据报道，从真菌薄树芝中分离的菌种并经现代生物工程技术深层发酵所得的干燥粉末中，多糖含量比野生薄树芝大大提高，而作为主要活性成分的薄树芝多糖具有潜在的开发应用价值，所以提取、分离、纯化薄树芝多糖就显得尤为重要，总多糖含量及纯度较高的薄树芝多糖可为其药理和制剂提供原料。
目前，国内外对薄树芝的研究则主要集中为对薄芝糖肽的药理活性，对薄树芝多糖的研究还不够深入，同时关于薄树芝发酵产物多糖的研究也鲜有报道。为了进一步开发薄树芝这一宝贵资源，发掘新药源，本发明以经过深层发酵的薄树芝菌粉为原料，采用水提醇沉法得到粗多糖，对提取的粗多糖进行脱蛋白，然后利用离子交换层析和凝胶分子筛柱层析方法纯化薄树芝多糖，首次制备出五种薄树芝多糖纯品，并且对五种组分多糖的理化性质、分子量、单糖组成等进行了系统的分析鉴定，并成功得出了五个组分的重复单元结构。本发明得到的多糖样品在免疫增强、抗肿瘤方面具有显著效果，同时，在抗氧化实验中显示其具有DPPH·和OH·自由基清除活性，这些可为将来在食品、化妆品、保健品、医药等领域应用中提供依据。
发明内容
本发明的目的在于提供薄树芝多糖的提取方法。
本发明的另一目的在于提供新发现的薄树芝多糖。
本发明所采取的技术方案是：
一种薄树芝多糖GCP-1，该多糖GCP-1是由葡萄糖单糖组成的葡聚糖，多糖的主链由→4)-α-D-Glc-(1→和→4,6)-α-D-Glc-(1→组成，支链由α-D-Glc-(1→组成，GCP-1的结构为：
，其中n为12～20。
一种薄树芝多糖GCP-2，该多糖GCP-2是由葡萄糖单糖组成的葡聚糖，多糖的主链由→4)-α-D-Glc-(1→和→4,6)-α-D-Glc-(1→组成，支链由α-D-Glc-(1→组成，GCP-2的结构为：
，其中n为4～7。
一种薄树芝多糖GCP-4，该多糖GCP-4是由葡萄糖单糖组成的葡聚糖，多糖的主链由→4)-α-D-Glc-(1→和→4,6)-α-D-Glc-(1→组成，支链由α-D-Glc-(1→组成，GCP-4的结构为：
，其中n为2～5。
一种薄树芝多糖GCP-3，该多糖GCP-3是由β-L-吡喃构型的阿拉伯糖和β-D-吡喃构型的木糖组成的杂多糖，且以1→4健型作为连接方式，GCP-3的结构为：，其中n为120～130。
一种薄树芝多糖GCP-5，该多糖GCP-5是由阿拉伯糖和木糖以1:1比例组成的杂多糖，其主链由→3，4)-β-D-Xyl-(1→组成，支链由β-D-Xyl-(1→、→3)-β-L-Ara-(1→和→4)-β-L-Ara-(1→组成，GCP-5的结构为：
，其中n为122～132。
薄树芝中多糖的提取方法，该方法包括以下操作步骤：
1）脱脂：将薄树芝菌粉脱脂，晾干；
2）水提：将脱脂后的薄树芝菌粉进行水提，分别收集提取液和残渣；
3）分级醇沉：将提取液浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为a%，静置，收集沉淀，即得粗多糖Pa；将上清液再次浓缩，加入乙醇使乙醇体积浓度为b%，静置，收集沉淀，即得粗多糖Pb；将上清液再次浓缩，加入乙醇使乙醇体积浓度为b%，静置，收集沉淀，即得粗多糖Pc；其中10≤a＜b＜c＜100；
4）碱提：将水提后的残渣浸泡于0.1～1M NaOH溶液中，静置1～4h，上清液用0.1～1M HCl进行中和使上清液的pH为6～8，离心取上清，浓缩上清，加入乙醇使乙醇体积浓度为50～90%，静置，收集沉淀，即得碱提粗多糖PB；
5）纯化：对上述粗多糖Pa、Pb、Pc、PB进行纯化，即得薄树芝多糖。
进一步的，步骤1）中所述脱脂选用2～8倍体积的石油醚对薄树芝菌粉进行脱脂；
进一步的，步骤2）中所述水提的具体操作为用5～15倍体积的60~100℃热水对薄树芝菌粉进行提取，提取时间1～4h。
进一步的，步骤3）中所有所述浓缩为40～70℃真空浓缩，所有所述静置的时间为10～28h。
进一步的，将步骤5）中纯化后的多糖Pa、Pb、Pc、PB分别进行离子交换柱层析，用0～1.5M NaCl进行梯度洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集有效部分，浓缩，冷冻干燥；然后，分别用水进行溶解，离心，取上清液进行分子筛凝胶柱层析，用水进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收集有效部分，浓缩，冷冻干燥后获得五种多糖纯品，分别命名为GCP-1、GCP-2、GCP-3、GCP-4和GCP-5，其中GCP-1来自多糖Pb中，GCP-2来自多糖Pc中，GCP-3、CPP-4、GCP-5来自于多糖PB中。
薄树芝多糖，该多糖的提取方法为上述所述的方法。
本发明的有益效果是：
1.与传统水煮法提取多糖相比，本发明采用水提醇沉法和碱提法的结合，乙醇浓度由低到高进行分级醇沉，对薄树芝多糖进行初步分离，同时高浓度乙醇能将极性大、水溶性好的多糖与极性小、水溶性差的多糖分离，使所提取的多糖组合物含有更多种类的多糖成分。且本制备工艺简单且可以大规模生产。
2.本发明中通过柱层析法对薄树芝粗多糖进行分离纯化，效果显著，首次制备出五种薄树芝多糖纯品。
3.本发明对制备出的五种多糖结构进行了鉴定，明确了各多糖组分的理化性质及结构，并进一步研究各组分的药理活性，能使薄树芝多糖尽快转化为医药和保健食品，造福于社会。
4.本发明提取方法在比较温和的条件下进行，完好的保存了多糖的组分，所得多糖结构明确，质量可控。该薄树芝多糖在免疫增强、抗肿瘤方面具有显著效果，同时，本发明得到的多糖纯品，在抗氧化实验中显示其具有DPPH·和OH·自由基清除活性，这些可为将来在食品、化妆品、保健品、医药等领域应用中提供依据。
附图说明
图1为GCP-5的HPGPC色谱图；
图2为GCP-5的红外图谱图；
图3为GCP-5的13C NMR图谱；
图4为GCP-5的1H NMR图谱；
图5为GCP-5的HMQC图谱；
图6为GCP-5的HMBC图谱；
图7 为GCP-5对DPPH·的清除作用。
具体实施方式
薄树芝中多糖的提取方法，该方法包括以下操作步骤：
1）脱脂：将薄树芝菌粉脱脂，晾干；
2）水提：将脱脂后的薄树芝菌粉进行水提，分别收集提取液和残渣；
3）分级醇沉：将提取液浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为a%，静置，收集沉淀，即得粗多糖Pa；将上清液再次浓缩，加入乙醇使乙醇体积浓度为b%，静置，收集沉淀，即得粗多糖Pb；将上清液再次浓缩，加入乙醇使乙醇体积浓度为b%，静置，收集沉淀，即得粗多糖Pc；其中10≤a＜b＜c＜100；更优选的10≤a＜b＜c＜100，且10≤a＜60，60＜b＜80，80＜c＜100；
4）碱提：将水提后的残渣浸泡于0.1～1M NaOH溶液中，静置1～4h，上清液用0.1～1M HCl进行中和，使上清液的pH为6～8，离心取上清，浓缩上清，加入乙醇使乙醇体积浓度为50～90%，静置，收集沉淀，即得碱提粗多糖PB；
5）纯化：对上述粗多糖Pa、Pb、Pc、PB进行纯化，即得薄树芝多糖。
优选的，步骤1）中所述脱脂选用2～8倍体积的石油醚对薄树芝菌粉进行脱脂。
优选的，步骤2）中所述水提的具体操作为用5～15倍体积的60~100℃热水对薄树芝菌粉进行提取，提取时间1～4h。
优选的，步骤3）中所有所述浓缩为40～70℃真空浓缩，所有所述醇沉静置的时间为10～28h。
优选的，步骤4）中NaOH溶液用量体积为残渣体积的10～20倍。
优选的，步骤5）中所述纯化具体操作为利用Sevag法分别对粗多糖Pa、Pb、Pc、PB除蛋白，除蛋白后再经透析袋进行透析、冻干。
优选的，上述透析袋的截留分子量为3000 Da。
优选的，将步骤5）中纯化后的多糖Pa、Pb、Pc、PB分别进行以下层析纯化：
1）离子交换柱层析：纯化后的多糖Pa、Pb、Pc、PB分别进行离子交换柱层析，用0～1.5M NaCl进行梯度洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集有效部分，然后浓缩、冷冻干燥；
2）分子筛凝胶柱层析：将上一步冷冻干燥的多糖再分别用水进行溶解，离心，取上清液分别进行分子筛凝胶柱层析，用水进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收集有效部分，浓缩、冷冻干燥后获得五种多糖纯品，分别命名为GCP-1、GCP-2、GCP-3、GCP-4和GCP-5，其中GCP-1来自粗多糖Pb中，GCP-2来自粗多糖Pc中，GCP-3、CPP-4、GCP-5来自粗多糖PB中。
优选的，上述离子交换柱为DEAE 离子交换柱。
优选的，上述分子筛凝胶层析选用Sephadex 分子筛色谱柱或DEAE SepharoseCL-6B色谱柱。
优选的，上述GCP-5来自粗多糖PB离子交换柱层析过程中0.1M NaCl洗脱液中，GCP-3、GCP-4 来自0.05M NaCl洗脱液中。
更优选的，GCP-4 来自分子筛凝胶柱层析过程中第二个峰的洗脱液中。
更优选的，GCP-3来自分子筛凝胶柱层析过程中第一个峰的洗脱液中。
优选的，上述GCP-2来自多糖Pc离子交换柱层析过程中0.05M NaCl洗脱液中。
优选的，上述GCP-1来自多糖Pb离子交换柱层析过程中0～0.075 mol/L NaCl梯度洗脱条件下的第二个峰的洗脱液中。
优选的，上述薄树芝多糖GCP-1是由葡萄糖单糖组成的葡聚糖，多糖的主链由→4)-α-D-Glc-(1→和→4,6)-α-D-Glc-(1→组成，支链由α-D-Glc-(1→组成，GCP-1的结构为：
，其中n为12～20，优选的，GCP-1的平均分子量为7918Da，更优选的n为16。
优选的，上述薄树芝多糖GCP-2是由葡萄糖单糖组成的葡聚糖，多糖的主链由→4)-α-D-Glc-(1→和→4,6)-α-D-Glc-(1→组成，支链由α-D-Glc-(1→组成，GCP-2的结构为：
，其中n为4～7，优选的，GCP-2平均分子量为6970Da，更优选的n为5。
优选的，上述薄树芝多糖GCP-4是由葡萄糖单糖组成的葡聚糖，多糖的主链由→4)-α-D-Glc-(1→和→4,6)-α-D-Glc-(1→组成，支链由α-D-Glc-(1→组成，GCP-4的结构为：
，其中n为2～5，优选的，GCP-4平均分子量为2847Da，更优选的n为3。
优选的，上述薄树芝多糖GCP-3是由β-L-吡喃构型的阿拉伯糖和β-D-吡喃构型的木糖组成的杂多糖，且以1→4健型作为连接方式，GCP-3的结构为：，其中n为120～130；优选的，GCP-3平均分子量为52243Da；更优选的n为126。
优选的，上述薄树芝多糖GCP-5是由阿拉伯糖和木糖以1:1比例组成的杂多糖，其主链由→3，4)-β-D-Xyl-(1→组成，支链由β-D-Xyl-(1→、→3)-β-L-Ara-(1→和→4)-β-L-Ara-(1→组成，GCP-5的结构为：
，其中n为122～132，优选的，GCP-5平均分子量为102817Da，更优选的n为127。
薄树芝多糖，该多糖的提取方法为上述所述的薄树芝中多糖的提取方法。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1 薄树芝中多糖的提取方法
1）脱脂：将3.8kg的薄树芝菌粉用5倍体积量的石油醚脱脂后，晾干；
2）水提：将脱脂后的薄树芝菌粉，用10倍体积量热水（60~100℃）提取，提取时间2h，收集提取液，残渣晾干。
3）分级醇沉：提取液于60℃真空浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为40%，室温静置24h后，离心，收集沉淀，称重981.16g，为粗多糖Pa；收集上清液于60℃真空浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为70%，室温静置24h后，离心，收集沉淀，称重158.35g，为粗多糖Pb，重复按上述同样的操作（除了乙醇体积浓度为90%，其他操作均同上），得180.73g粗多糖Pc。
4）碱提：将水提后残渣浸没于15倍体积量的0.3M NaOH溶液中，室温放置2h，上清液用0.5M HCl进行中和，使其PH=6~8，取上清液进行离心（5000r/min，10min），取上清液，60℃真空浓缩，然后加入乙醇使乙醇体积浓度为70%，静置24h后离心，收集沉淀，称重为93.87g，此为碱提粗多糖PB。
5）纯化：利用Sevag法对分别对各组分粗多糖Pa、Pb、Pc和PB进行除蛋白，除蛋白后粗多糖用透析袋（截留分子量为3000 Da）进行透析、冻干，即得薄树芝多糖。
实施例2 薄树芝多糖GCP-5的提取方法
1）脱脂：将3.8kg的薄树芝菌粉用5倍体积量的石油醚脱脂后，晾干；
2）水提：将脱脂后的薄树芝菌粉，用10倍体积量热水（60~100℃）提取，提取时间2h，收集提取液，残渣晾干。
3）碱提：将水提后残渣浸没于15倍体积量的0.3M NaOH溶液中，室温放置2h，上清液用0.5M HCl进行中和，使其PH=6~8，取上清液进行离心（5000r/min，10min），取上清液，60℃真空浓缩，然后加入乙醇使乙醇体积浓度为70%，静置24h后离心，收集沉淀，称重为93.87g，此为碱提粗多糖PB。
4）纯化：利用Sevag法对粗多糖PB进行除蛋白，除蛋白后粗多糖用透析袋（截留分子量为3000 Da）进行透析、冻干，即得薄树芝多糖PB。
5）离子交换柱层析：取100mg上述纯化后的多糖PB，溶于6mL的去离子水中，上样于DEAE-Cellulose 52柱，在不同盐浓度的洗脱液条件下出现三个峰，其中峰一为0.05M NaCl洗脱部分，峰二为0.1M NaCl洗脱部分，峰三为0.25M NaCl洗脱部分（洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集有效部分），分别将所得洗脱液浓缩、冷冻干燥后，分别得到峰一多糖、峰二多糖、峰三多糖这三种多糖；
6）分子筛凝胶层析：将上述冻干后的峰二多糖样品，用水进行溶解，离心，取上清液，上DEAE Sepharose CL-6B柱，用0.15M NaCl进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，出现一个单一对称峰，收集主峰，浓缩，离心后取上清液上Sephadex G75凝胶柱，用水进行洗脱，出现一个单一对称峰，收集主峰，浓缩，冷冻干燥后得薄树芝多糖GCP-5。
纯度及分子量检测：将上述获得的多糖GCP-5配成2%浓度（W/V）的水溶液，HPGPC法测得保留时间，根据标准曲线计算得分子量。
结果如图1所示，经离子交换和凝胶过滤法分离纯化后得到的组分GCP-5呈单一对称峰，说明GCP-5为均一多糖，测得平均分子量为102817Da。
实施例3薄树芝多糖GCP-4的提取方法
GCP-4的提取方法同实施例2中GCP-5的提取方法，除了步骤6）中进行分子筛凝胶层析时选用的是步骤5）中的峰一多糖样品，以及在Sephadex G75凝胶柱纯化过程中，用水进行洗脱，出现两个峰，收集峰二洗脱液，浓缩、冷冻干燥后得薄树芝多糖GCP-4。其他均同实施例2。
实施例4薄树芝多糖GCP-3的提取方法
GCP-3的提取方法同实施例3中GCP-4的提取方法，除了步骤6）中进行SephadexG75凝胶柱洗脱时，收集的是峰一洗脱液；将峰一洗脱液，浓缩、冷冻干燥后得到薄树芝多糖GCP-3。其他均同实施例3。
实施例5薄树芝多糖GCP-2的提取方法
1）脱脂：将3.8kg的薄树芝菌粉用5倍体积量的石油醚脱脂后，晾干；
2）水提：将脱脂后的薄树芝菌粉，用10倍体积量热水（60~100℃）提取，提取时间2h，收集提取液，残渣晾干。
3）分级醇沉：提取液于60℃真空浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为40%，室温静置24h后，离心，收集沉淀，称重981.16g，为粗多糖Pa；收集上清液于60℃真空浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为70%，室温静置24h后，离心，收集沉淀，称重158.35g，为粗多糖Pb，重复按上述同样的操作（除了乙醇体积浓度为90%，其他操作均同上），得180.73g粗多糖Pc。
4）纯化：利用Sevag法对分别对各组分粗多糖Pc进行除蛋白，除蛋白后粗多糖用透析袋（截留分子量为3000 Da）进行透析、冻干，即得薄树芝多糖Pc。
5）离子交换柱层析：取100mg上述纯化后的多糖Pc，溶于6mL的去离子水中，上样于DEAE-Cellulose 52柱，在不同盐浓度的洗脱液条件下出现二个峰，其中峰一为0.05M NaCl洗脱部分，峰二为0.15M NaCl洗脱部分（洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集有效部分），分别将所得洗脱液浓缩、冷冻干燥后，得到峰一多糖、峰二多糖这二种多糖。
6）分子筛凝胶层析：将上一步冻干后的峰一多糖样品，用水进行溶解，离心，取上清液，上DEAE Sepharose CL-6B柱，用0.15M NaCl进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，出现一个单一对称峰，收集主峰，浓缩，离心后取上清液上Sephadex G75凝胶柱，用水进行洗脱，出现一个单一对称峰，收集主峰，浓缩，冷冻干燥后得薄树芝多糖GCP-2。
实施例6薄树芝多糖GCP-1的提取方法
1）脱脂：将3.8kg的薄树芝菌粉用5倍体积量的石油醚脱脂后，晾干；
2）水提：将脱脂后的薄树芝菌粉，用10倍体积量热水（60~100℃）提取，提取时间2h，收集提取液，残渣晾干。
3）分级醇沉：提取液于60℃真空浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为40%，室温静置24h后，离心，收集沉淀，称重981.16g，为粗多糖Pa；收集上清液于60℃真空浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为70%，室温静置24h后，离心，收集沉淀，称重158.35g，为粗多糖Pb，重复按上述同样的操作（除了乙醇体积浓度为90%，其他操作均同上），得180.73g粗多糖Pc。
4）纯化：利用Sevag法对分别对各组分粗多糖Pb进行除蛋白，除蛋白后粗多糖用透析袋（截留分子量为3000 Da）进行透析、冻干，即得薄树芝多糖Pb。
5）离子交换柱层析：取100mg上述纯化后的多糖Pb，溶于6mL的去离子水中，上样于DEAE-Cellulose 52柱，在0-0.075 mol/L NaCl梯度洗脱条件下出现了三个峰，（洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集有效部分），将峰二洗脱液进行收集，浓缩，冷冻干燥。
6）分子筛凝胶层析：将上一步述冻干后的峰二多糖样品，用水进行溶解，离心，取上清液，上DEAE Sepharose CL-6B柱，用0.25M NaCl进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，出现一个单一对称峰，收集主峰，浓缩，离心后取上清液上Sephadex G75凝胶柱，用水进行洗脱，出现一个单一对称峰，收集主峰，浓缩，冷冻干燥后得薄树芝多糖GCP-1。
下面以上述实施例中提取的GCP-1、GCP-2、GCP-3、GCP-4和GCP-5作进一步的结构分析及效果检测。
一、薄树芝多糖的结构分析
（1）气相色谱分析单糖组成
由完全酸水解产物GC图谱可知，GCP-5单糖组成为阿拉伯糖和木糖，其摩尔比为1.05:1。
（2）多糖的部分酸水解分析
多糖的部分酸水解分析结果显示GCP-5主链部位由木糖组成；支链部位由阿拉伯糖和木糖共同组成，摩尔比为1.15:1。
（3）多糖的过碘酸氧化-Smith降解反应：
GCP-5 经高碘酸氧化后经检测，阿拉伯糖和木糖的摩尔比从原来的1.05:1 变成1:1.927，部分阿拉伯糖和木糖被氧化，说明GCP-5中存在1→，1→2或1→4键型；Smith降解后检测有大量的阿拉伯糖和木糖存在，说明GCP-5 中仍存在大部分键型不被氧化，如1→3；1→2, 3；1→2, 4；1→3, 4；1→2, 3, 4 键型。同时，有大量的甘油产生，进一步说明GCP-5中可被氧化的单糖主要为1→2或1→4键型。
（4）红外光谱检测
GCP-5的红外光谱检测结果如图2所示，从中可以看出，GCP-5含有多糖的特征吸收峰为：3400.14 cm-1 为O-H伸缩振动，2932.20cm-1为C-H 伸缩振动，1635.14cm-1为羰基吸收峰。899.62cm-1处有吸收峰，说明 GCP-5为β型糖残基。
（5）多糖的核磁共振分析
将均一多糖GCP-5样品置于核磁管中，用D2O溶解后测谱，所得结果如图3～6所示。
根据上述图3～6的核磁图谱可知各个碳和氢的归属，如下表1所示。
表1 GCP-5 核磁共振分析结果
经上述完全酸水解、部分酸水解、甲基化分析、高碘酸反应、Smith降解分析、红外光谱检测及核磁分析，结果显示GCP-5是一种由阿拉伯糖和木糖以 1:1 比例组成的杂多糖，从部分酸水解说明其主链结构由木糖组成，而支链由木糖和阿拉伯糖组成，它们含有 1→3,4；1→4；1→3和1→键型，同时被氧化的单糖是以1→4键型为结构，由此得出 GCP-5 的结构为:
，其中n为122～132，平均分子量为102817Da。
同理，分别对多糖GCP-1、GCP-2、GCP-3和GCP-4的结构进行上述同样的分析（完全酸水解、部分酸水解、甲基化分析、高碘酸反应、Smith降解分析、红外光谱检测及核磁分析），并分别获得以下信息：
1）多糖GCP-1：是由葡萄糖单糖组成的葡聚糖，多糖的主链由→4)-α-D-Glc-(1→和→4,6)-α-D-Glc-(1→组成，支链由α-D-Glc-(1→组成，GCP-1的结构为：
，其中n为12～20，平均分子量为7918Da。
2）多糖GCP-2：是由葡萄糖单糖组成的葡聚糖，多糖的主链由→4)-α-D-Glc-(1→和→4,6)-α-D-Glc-(1→组成，支链由α-D-Glc-(1→组成，GCP-2的结构为：
，其中n为4～7，平均分子量为6970Da。
3）多糖GCP-3是由β-L-吡喃构型的阿拉伯糖和β-D-吡喃构型的木糖组成的杂多糖，且以1→4健型作为连接方式，GCP-3的结构为：，其中n为120～130，平均分子量为52243Da。
4）多糖GCP-4是由葡萄糖单糖组成的葡聚糖，多糖的主链由→4)-α-D-Glc-(1→和→4,6)-α-D-Glc-(1→组成，支链由α-D-Glc-(1→组成，GCP-4的结构为：
，其中n为2～5，平均分子量为2847Da。
5）多糖GCP-5是由阿拉伯糖和木糖以1:1比例组成的杂多糖，其主链由→3，4)-β-D-Xyl-(1→组成，支链由β-D-Xyl-(1→、→3)-β-D-Ara-(1→和→4)-β-D-Ara-(1→组成，GCP-5的结构为：
，其中n为122～132，平均分子量为102817Da。
二、薄树芝多糖抗氧化活性的检测
（1）薄树芝多糖对DPPH·清除能力的检测
取不同浓度的GCP-5多糖样品溶液0.5mL，加入2mL 0.1mmol/L DPPH·溶液和1.5mL水，立即混匀，静置30 min后，于517nm波长处测定吸光值A2；样品溶液0.5mL，乙醇2mL与水l.5mL的混合液吸光度A1；DPPH·溶液2mL与l.5mL水混合液的吸光度A0。每个样品做三组平行，以维生素C为阳性对照，清除DPPH·的活性按公式计算: 清除率%=[l-(A2-A1)/A0]×100%，式中：A2为2mL DPPH·溶液 + 0.5mL多糖溶液 + 1.5mL水的吸光度；A1为2mL乙醇 +0.5mL多糖样品溶液 + 1.5mL水的吸光度；A0为2mL DPPH·溶液 + 2mL水的吸光度。
结果：多糖GCP-5对DPPH·清除能力的检测结果见图7，当 GCP-5浓度为20 mg/mL时，其清除率为62.5%，呈现一定的DPPH·清除活性。
（2）薄树芝多糖对OH·清除能力测定：
实验利用邻二氮菲-金属铁离子-H2O2体系，采用Fenton法测定其抗氧化性。
1、准确吸取不同浓度的GCP-5多糖溶液1.0mL于试管中，加入2.0mL磷酸缓冲溶液，邻二氮菲1.0mL，FeSO41.0mL，加入过氧化氢1.0mL启动反应，37℃反应60 min，在536nm处测定其吸光度A3（样品）。
2、准确加入2.0mL磷酸缓冲溶液，邻二氮菲1.0mL，FeSO4 1.0mL，蒸馏水1.0mL，加入过氧化氢1.0mL启动反应，37℃ 反应60 min，测得吸光度A4（损伤组）。
3、准确加入2.0mL磷酸缓冲溶液，邻二氮菲1.0mL，FeSO4 1.0mL，蒸馏水2.0mL，37℃ 反应60min，测得吸光度A5(未损伤组)。
每个样品做三组平行，以维生素C为阳性对照，按以下公式计算样品对OH·的清除率: 清除率=(A3-A4)/(A5-A4)×100%，式中：A3为样品组吸光度；A4为空白组吸光度；A5为标准对照组吸光度。
结果显示，GCP-5在20 mg/mL浓度时，计算得其OH·清除率为10.9%。
另外，本发明对GCP-3和GCP-4也进行了与GCP-5类似的对DPPH·和OH·自由基清除能力的测定，结果显示，GCP-3、GCP-4和GCP-5具有DPPH·和OH·自由基清除能力，其清除率与浓度之间存在量效关系。当多糖样品浓度为20 mg/mL时，其对DPPH·自由基清除率如下表2所示：
表2本发明多糖的抗氧化活性检测
以上所述的仅是本发明的一些实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。对于本领域的普通技术人员来说，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、代替、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种薄树芝多糖GCP-1，其特征在于：该多糖GCP-1是由葡萄糖单糖组成的葡聚糖，多糖的主链由→4)-α-D-Glc-(1→和→4,6)-α-D-Glc-(1→组成，支链由α-D-Glc-(1→组成，GCP-1的结构为：
，其中n为12～20。
2.一种薄树芝多糖GCP-2，其特征在于：该多糖GCP-2是由葡萄糖单糖组成的葡聚糖，多糖的主链由→4)-α-D-Glc-(1→和→4,6)-α-D-Glc-(1→组成，支链由α-D-Glc-(1→组成，GCP-2的结构为：
，其中n为4～7。
3.一种薄树芝多糖GCP-4，其特征在于：该多糖GCP-4是由葡萄糖单糖组成的葡聚糖，多糖的主链由→4)-α-D-Glc-(1→和→4,6)-α-D-Glc-(1→组成，支链由α-D-Glc-(1→组成，GCP-4的结构为：
，其中n为2～5。
4.一种薄树芝多糖GCP-3，其特征在于：该多糖GCP-3是由β-L-吡喃构型的阿拉伯糖和β-D-吡喃构型的木糖组成的杂多糖，且以1→4键 型作为连接方式，GCP-3的结构为：，其中n为120～130。
5.一种薄树芝多糖GCP-5，其特征在于：该多糖GCP-5是由阿拉伯糖和木糖以1:1比例组成的杂多糖，其主链由→3，4)-β-D-Xyl-(1→组成，支链由β-D-Xyl-(1→、→3)-β-L-Ara-(1→和→4)-β-L-Ara-(1→组成，GCP-5的结构为：
，其中n为122～132。
6.薄树芝中多糖的提取方法，其特征在于：该方法包括以下操作步骤：
1）脱脂：将薄树芝菌粉脱脂，晾干；
2）水提：将脱脂后的薄树芝菌粉进行水提，分别收集提取液和残渣；
3）分级醇沉：将提取液浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为a%，静置，收集沉淀，即得粗多糖Pa；将上清液再次浓缩，加入乙醇使乙醇体积浓度为b%，静置，收集沉淀，即得粗多糖Pb；将上清液再次浓缩，加入乙醇使乙醇体积浓度为c%，静置，收集沉淀，即得粗多糖Pc；其中10≤a＜b＜c＜100；
4）碱提：将水提后的残渣浸泡于0.1～1M NaOH溶液中，静置1～4h，上清液用0.1～1MHCl进行中和使上清液的pH为6～8，离心取上清，浓缩上清，加入乙醇使乙醇体积浓度为50～90%，静置，收集沉淀，即得碱提粗多糖PB；
5）纯化：对上述粗多糖Pa、Pb、Pc、PB进行纯化，即得薄树芝多糖；
步骤1）中所述脱脂选用2～8倍体积的石油醚对薄树芝菌粉进行脱脂；
步骤2）中所述水提的具体操作为用5～15倍体积的60~100℃热水对薄树芝菌粉进行提取，提取时间1～4h；
步骤3）中所有所述浓缩为40～70℃真空浓缩，所有所述静置的时间为10～28h；
步骤4）中NaOH溶液用量体积为残渣体积的10～20倍。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：将步骤5）中纯化后的多糖Pa、Pb、Pc、PB分别进行离子交换柱层析，用0～1.5M NaCl进行梯度洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集有效部分，浓缩，冷冻干燥；然后，分别用水进行溶解，离心，取上清液进行分子筛凝胶柱层析，用水进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收集有效部分，浓缩，冷冻干燥后获得五种多糖纯品，分别命名为GCP-1、GCP-2、GCP-3、GCP-4和GCP-5，其中GCP-1来自多糖Pb中，GCP-2来自多糖Pc中，GCP-3、CPP-4、GCP-5来自于多糖PB中。
8.薄树芝多糖，其特征在于：该多糖的提取方法为权利要求6～7中任一所述的方法。
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