CN110628845B - 蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析 - Google Patents
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本发明提供一种蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析方法。所述方法为先用微量的胰蛋白酶酶解蛤蟆油，再通过DEAE阴离子交换色谱柱除去蛋白等杂质，并经透析、冻干、浓缩得到蛤蟆油糖胺聚糖（OR‑GAG）。糖胺聚糖由重复的二糖单元构成，通过肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ特异性酶解OR‑GAG，再利用分子排阻色谱法，得到硫酸乙酰肝素二糖/肝素二糖（HS/HP二糖）。HS/HP二糖经2‑氨基吖啶酮（AMAC）荧光标记后，利用反相色谱柱C18柱进行质谱分析，得到蛤蟆油中各二糖组分的结构与摩尔百分比。最后，建立HS/HP区域结构模型。
Description
技术领域
本发明是关于蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析，属于天然产物制备纯化领域。
背景技术
蛤蟆油为雌蛙输卵管干制品，呈不规则块状，以白色和黄白色为佳。蛤蟆油中约有50%粗蛋白、30%无氮浸出物、10%灰分、5%脂肪以及2%水分。清朝时期，蛤蟆油便已作为“八珍之首”的上等贡品敬献宫廷，其营养成分不亚于人参、燕窝等补品。蛤蟆油素有“补肾益精，养阴润肺”之功效，现代医学又发现，其具有增强机体免疫力、提高抗氧化能力、降血脂、抗癌辅助作用等。其中，降血脂之功效或与其含有硫酸乙酰肝素与肝素有关。
硫酸乙酰肝素（HS）和肝素（HP）为糖胺聚糖（GAG）的一大分支，是由重复的二糖单元构成的聚阴离子线性长链。其中的二糖单元是由己糖醛酸（HexA）与葡萄糖胺（GlcN）以1-4糖苷键连接而成，HexA有两种结构，分别为葡萄糖醛酸（GlcA）和艾杜糖醛酸（IdoA）。二糖单元通常会有不同程度的硫酸化和乙酰化修饰，主要的修饰位点有HexA的C2位O硫酸化，GlcN的N位硫酸化和N位乙酰化，C6位O硫酸化，一些稀有结构会出现C3位O硫酸化。不同程度的硫酸化修饰影响HS/HP的生物功能，目前发现，HS/HP在细胞发育、血管生成、血液凝固、细胞黏附以及肿瘤代谢方面发挥着重要的作用。
由于国内外未见报道有关蛤蟆油中HS/HP的提取与结构分析， 本发明开创性的建立了一种提取蛤蟆油中HS/HP的方法，并首次对蛤蟆油中的HS/HP进行结构解析，为深入研究蛤蟆油中HS/HP的结构及其功效提供了原创性的提取途径和结构分析手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析方法。该方法以蛤蟆油为原料，经蛋白酶酶解、离心、DEAE分段洗脱提取得到糖胺聚糖（GAG）。然后，利用透析和冻干的方法除去盐和水，得到纯净的GAG。再分别用肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ特异性酶解HS/HP至二糖单元，并通过分子排阻色谱柱S75柱对HS/HP二糖进行纯化，纯化后的二糖利用高温挥发除去流动相中的NH4HCO3，再用荧光物质AMAC（2-氨基吖啶酮）标记，利用ODS色谱柱对HS/HP二糖单元进行质谱结构分析，并根据HS/HP二糖组分的摩尔百分比建立HS/HP区域结构模型。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析方法，包括以下步骤：
（1）蛋白酶酶解蛤蟆油：粉末状蛤蟆油充分浸泡后用胰蛋白酶酶解，酶解后离心取上清液。
（2）提取蛤蟆油中的糖胺聚糖：利用DEAE纤维素树脂的阴离子交换作用，置换出蛤蟆油上清液中的糖胺聚糖；透析除去蛤蟆油糖胺聚糖中大量的盐，冻干除去水分。
（3）酶解糖胺聚糖获取二糖组分：用肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ特异性酶解蛤蟆油糖胺聚糖得到蛤蟆油硫酸乙酰肝素/肝素HS/HP二糖。
（4）分子排阻色谱纯化二糖组分：利用液相分子排阻色谱柱S75柱纯化HS/HP二糖。
（5）LC-MS法分析蛤蟆油中HS/HP二糖组分的结构：液相纯化后的二糖经AMAC（2-氨基吖啶酮）和NaBH3CN衍生化处理后，通过质谱分析得到二糖结构及其组分含量，并建立HS/HP区域结构模型。
蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析方法，包括以下具体步骤：
(1) 蛋白酶酶解蛤蟆油：研磨成粉末状的蛤蟆油在充分浸泡后，加入胰蛋白酶酶解，酶解后的蛤蟆油离心取上清液。
(2) 提取蛤蟆油中的糖胺聚糖：将DEAE柱水洗平衡至稳定状态，加入上清液，再加入平衡液除去蛋白质杂质，然后再用不同高盐浓度洗脱液将糖胺聚糖分段洗脱出来。最后将每管收集到的样品进行紫外检测；利用透析将糖胺聚糖中大量的盐除去，随后利用冻干除去水分。
(3) 酶解糖胺聚糖获取二糖组分：利用肝素酶Ⅰ 、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ将糖胺聚糖酶解至HS/HP二糖单元，再用沸水灭活，离心取上清液。
(4) 分子排阻色谱纯化二糖组分： 取步骤(3)中的上清液，通过分子排阻色谱法利用S75柱对样品进行分离、纯化，从而获得纯净的HS/HP二糖组分。
(5) LC-MS法分析蛤蟆油中HS/HP二糖组分的结构：用AMAC（2-氨基吖啶酮）和氰基硼氢化钠对蛤蟆油中HS/HP二糖进行荧光标记，标记后的HS/HP和CS/DS二糖用MS方法进行分析；根据建立好的标准曲线，得到蛤蟆油中HS/HP的组分含量，并建立HS/HP区域结构模型。
进一步的，步骤（1）蛋白酶酶解蛤蟆油具体为：用研钵将蛤蟆油研磨至粉末状，取100-200 mg浸泡在10-50 mL超纯水中，常温放置24-48 h使其充分溶胀；取100 μL 10-30 μg/μL的胰蛋白酶溶液（酶缓冲液为0.2 M NaCl，10-50 mM磷酸缓冲液），分次加入到蛤蟆油样品中，反应温度36-40℃，反应时长24-48 h。酶解结束，10000 rpm离心10-20 min取上清液。
进一步的，步骤（2）提取蛤蟆油中的糖胺聚糖具体为：用足量的超纯水洗去DEAE树脂中的乙醇，取5-20 mL装柱，用十倍柱体积的0.2 M NaCl，10-50 mM磷酸平衡缓冲液平衡DEAE柱，上样，再加入平衡缓冲液除去蛋白杂质，随后利用分段洗脱的方法提取蛤蟆油中的糖胺聚糖，分段洗脱的不同高盐浓度洗脱液分别为0.5 M NaCl，10-50 mM磷酸缓冲液；1.0M NaCl，10-50 mM磷酸缓冲液，以3 mL/管收集各馏分，并进行紫外检测，波长为212 nm；DEAE收集到的馏分用1000-5000 Da的透析膜透析除去洗脱液中的NaCl，每两小时换一次去离子水，透析2-4天，冻干2-4天除去水，得到纯净的蛤蟆油糖胺聚糖(OR-GAG)。
进一步的，步骤（3）酶解糖胺聚糖获取二糖组分具体为：将步骤（2）提取获得的蛤蟆油糖胺聚糖OR-GAG取0.5-1.0 μg，然后加入肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ酶液，各10 μL，酶的浓度均为0.1-1.0 mIU/μL；将蛤蟆油糖胺聚糖OR-GAG特异性酶解至HS/HP二糖单元，酶解温度为36-40℃，酶解时长24-48 h，酶解结束后，10000 rpm离心取上清液。
进一步的，步骤（4）分子排阻色谱纯化二糖组分具体为：取步骤（3）中的上清液，以≤200 μL的上样体积过分子排阻色谱柱，HS/HP二糖经S75柱分离纯化，流动相为0.1-0.3 MNH4HCO3，流速0.4 mL/min，HS/HP二糖在38-44 min出峰并进行收集；流动相中的NH4HCO3通过55-65℃挥发除去。
进一步的，步骤（5）LC-MS法分析蛤蟆油中HS/HP二糖组分的结构具体为：步骤（4）纯化后的蛤蟆油HS/HP二糖经AMAC（2-氨基吖啶酮）荧光标记后，以上样量<20 μL过ODS柱，流动相A相为20-80 mM 醋酸铵，pH=5-7，流动相B相为100%甲醇，流速为0.3 mL/ min，CDL为100-200℃，Heat Block为100-200℃，N2流速为1.5 mL/min,检测电压为1.6-1.8 kV。利用标准曲线分析二糖组分，并建立HS/HP区域模型。
本发明的优点在于：本发明以蛤蟆油为原料，经蛋白酶酶解、离心、DEAE分段洗脱提取得到糖胺聚糖（GAG），利用透析和冻干的方法除去盐和水，得到纯净的GAG。再分别用肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ特异性酶解HS/HP至二糖单元，并通过分子排阻色谱柱S75柱对HS/HP二糖进行纯化，纯化后的二糖利用高温挥发除去流动相中的NH4HCO3，再用荧光物质AMAC（2-氨基吖啶酮）标记，利用ODS色谱柱对HS/HP二糖单元进行质谱结构分析，并根据HS/HP二糖组分的摩尔百分比建立HS/HP区域结构模型。首次对蛤蟆油中的HS/HP进行结构解析，为深入研究蛤蟆油中HS/HP的结构及其功效提供了原创性的提取途径和结构分析手段。
附图说明
图1蛤蟆油经DEAE柱分段洗脱所获得组分的紫外图：H1所对应的的洗脱液浓度为0.5 M NaCl，H2所对应的的洗脱液浓度为1.0 M NaCl。较粗线代表UV值，较细线代表NaCl的浓度。
图2 S75柱-HPLC法分离与纯化HS/HP二糖组分：HPLC-H1图为H1样品经肝素酶酶解后过S75柱所得到的的色谱图，HPLC-H2图为H2样品经肝素酶酶解后过S75柱所得到的的色谱图，图中的短线表示HS/HP二糖收集时间范围。
图3 HS/HP二糖化学式。
图4 ODS-MS法建立HS/HP二糖标准曲线。
图5蛤蟆油中HS/HP二糖的EIC图：A为8个标准二糖各100 ng的EIC图，B为H1中所含二糖的EIC图，C为H2中所含二糖的EIC图。1为2S6SNS，2为6SNS，3为2SNS，4为NS，5为2S6SNAc，6为6SNAc，7为2SNAc，8为NAc。
图6 蛤蟆油HS/HP区域结构模型图：图中1为高度硫酸化的S区，2为过渡区NA/NS区，3为无硫酸化的NA区。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析方法，包括以下具体步骤：
1.蛤蟆油酶解
取0.1 g蛤蟆油充分研磨成粉末状，溶于20 mL水中，常温浸泡24 h。蛤蟆油在24 h浸泡后充分溶胀，此时加入100 μL 10-30 μg/μL的胰蛋白酶溶液（酶缓冲液为0.2 M NaCl，10-50 mM磷酸缓冲液）在37℃水浴中反应48 h。充分酶解后的蛤蟆油样品以10000 rpm转速离心取上清液。
蛤蟆油中糖胺聚糖的提取
取10 mL DEAE纤维素用超纯水水洗除去乙醇保存液，装柱，再用10倍柱体积的平衡液平衡DEAE柱，将酶解好的蛤蟆油取10 mL上样，待样品与DEAE柱充分结合后用平衡液洗脱出蛋白质等电荷密度较低的杂质，随后再用不同盐浓度的洗脱液提取糖胺聚糖，最后将收集到的样品进行紫外检测，波长为212 nm。其中，平衡液为：0.2 M NaCl,10 mM NaH2PO4/Na2HPO4(pH=7.5)；DEAE分段洗脱所用到的洗脱液分别为：0.5 M NaCl，10 mM NaH2PO4/Na2HPO4(pH=7.5)，收集样品H1；1.0 M NaCl，10 mM NaH2PO4/Na2HPO4(pH=7.5)，收集样品H2。紫外图见图1。
DEAE提取糖胺聚糖的具体参数如下：
DEAE柱柱体积：10 mL
上样量: 10 mL
收集：3 mL/管
流动相：不同盐浓度的磷酸缓冲溶液
柱温：室温
检测器：UV检测器
检测波长：212 nm
3.HS/HP二糖的制备与分离
将过完DEAE柱所收集的馏分按不同盐浓度分为两个部分，分别为样品H1和样品H2。H1和H2分别代表盐浓度为0.5 M、1.0 M的洗脱液所洗脱出的组分。将H1和H2先用分子量为3000 Da的透析膜透析三天、每2 h换一次水，随着换水次数的增多，组分中NaCl的含量逐渐减少，最后被完全除去。透析过后的组分进行冻干与浓缩。
浓缩干的H1和H2分别用肝素酶酶解（其中H1为0.275 g蛤蟆油过DEAE柱用0.5 M盐浓度洗脱液洗脱所收集到的组分。H2为0.275g蛤蟆油过DEAE柱用1.0 M盐浓度洗脱液洗脱所收集到的组分），H1和H2分别取0.7 μg、0.8 μg，然后H1和H2分别用肝素酶酶解，所用肝素酶为酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ各10μL，酶浓度均为0.2 mIU/μL，酶反应液为0.1 M NaAc，0.1 mM Ca(Ac)2，pH=7.0（醋酸调pH）。反应温度37℃，反应时长24 h。待反应结束后，用100℃沸水灭活5 min，常温下静置一段时间后，10000 rpm离心10 min取上清液，离心后的沉淀中再加入超纯水100 μL，振荡均匀后，再以10000 r离心10 min取上清液，将两次上清液合并后过液相S75柱。H1和H2上样量为50 mg/200 μL。
S75-HPLC方法具体参数如下：
色谱柱：Superdex™ 75 10/300 GL(10 × 300–310 mm)
流速：0.4 mL/min
上样量：200 μL
流动相：0.2 M NH4HCO3
柱温：室温
检测器：UV检测器
检测波长：232 nm
收集时间：38-44 min；
通过上述方法分离HS/HP二糖，得到的液相图见图2。如图2所示，HPLC-H1图为H1样品经肝素酶酶解后过S75柱所得到的的色谱图，选择保留时间在38-44 min的组分进行收集，得到纯化后的二糖。HPLC-H2图为H2样品经肝素酶酶解后过S75柱所得到的的色谱图，选择保留时间在38-44 min的组分进行收集，得到纯化后的二糖。
实施例 2
1. ODS-MS法建立HS/HP二糖标准曲线
取浓度均为0.1 μg/uL的8种标准二糖各20 μL，均匀混合后浓缩至无水状态。然后，加入5 μL 0.1 M AMAC（AMAC为2-氨基吖啶酮，溶解于乙酸：二甲亚砜=3:17的溶液中），室温下涡旋振荡20 min。随后，加入5 μL 1.0 M 氰基硼氢化钠（NaBH3CN溶解于超纯水中），水浴45℃，反应4 h。整个反应过程中样品需用锡纸包裹达到避光的目的。待反应结束后，用50%二甲亚砜将样品浓度稀释至100ng/10μL、70ng/10μL、60ng/10μL、30ng/10μL以及20ng/10μL进行质谱分析，以样品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线。8种标准二糖的结构见图3、m/z值见表一。
表一 8种HS/HP标准二糖结构与m/z值
ODS-MS方法具体参数如下：
色谱柱：ODS-2 HYPERSIL(4.6×250 mm，5 μm)
流速：0.3 mL/min
上样量：10 ul
流动相： A相为40 mM 醋酸铵，pH=5.6；B相为100%甲醇
柱温：45℃
CDL和Heat Block温度：150℃
Nebulizing Gas：1.5 mL/min
检测电压：1.8 kV
线性梯度：0~70 min(15%B~60%B)，70~75 min(60%B~100%B)
通过上述方法得到的标准曲线见图4。
分析蛤蟆油HS/HP二糖结构
经液相S75柱纯化后的H1和H2组分，55℃挥发碳酸氢铵3天。然后，浓缩至无水状态并进行衍生化处理，先加入5 μL 0.1 M AMAC在室温下涡旋振荡20 min，再加入5 μL 1.0 M氰基硼氢化钠于45℃水浴中反应4 h。整个反应需注意避光。待反应结束后，用50%二甲亚砜将样品浓度稀释至20 μL，最后用ODS-MS方法分析蛤蟆油中HS/HP二糖结构，得到的质谱图见图5，组分含量见表二。如图5所示，图5中A为8个标准二糖各100 ng的EIC图，B为H1中所含二糖的EIC图，C为H2中所含二糖的EIC图。1为2S6SNS，2为6SNS，3为2SNS，4为NS，5为2S6SNAc，6为6SNAc，7为2SNAc，8为NAc。由表二可知，蛤蟆油中HS/HP二糖组分摩尔百分和含量。HS/HP二糖摩尔百分比最高的为NAc，最低的为6SNS。H1样品中HS/HP二糖总含量为2558.2 ng/g，H2样品中HS/HP二糖总含量为2918.3 ng/g。
表二 蛤蟆油中HS/HP二糖组分摩尔百分和含量
3. 模拟蛤蟆油中HS/HP区域结构模型
在HS长链中各二糖组分有序排列在三种类型的区域结构中，分别为高度硫酸化的S区，过渡的NA/NS区以及无硫酸化的NA区，基于蛤蟆油H1、H2中二糖组分的摩尔百分百，模拟HS/HP区域结构模型。HS/HP区域结构模型见图6。如图6中所示，蛤蟆油无硫酸化的NA区占比最大，其次为过渡区NA/NS区，占比最小为高度硫酸化的S区。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (5)
1.蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
蛋白酶酶解蛤蟆油：粉末状蛤蟆油充分浸泡后用胰蛋白酶酶解，酶解后离心取上清液；
提取蛤蟆油中的糖胺聚糖：利用DEAE纤维素树脂的阴离子交换作用，置换出蛤蟆油上清液中的糖胺聚糖；透析除去蛤蟆油糖胺聚糖中大量的盐，冻干除去水分；
酶解糖胺聚糖获取二糖组分：用肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ特异性酶解蛤蟆油糖胺聚糖得到蛤蟆油硫酸乙酰肝素/肝素HS/HP二糖；
分子排阻色谱纯化二糖组分：利用液相分子排阻色谱柱S75柱纯化HS/HP二糖；
LC-MS法分析蛤蟆油中HS/HP二糖组分的结构：液相纯化后得到的二糖经2-氨基吖啶酮和氰基硼氢化钠衍生化处理后，通过质谱分析得到二糖结构及其组分含量，并建立HS/HP区域结构模型；
包括以下具体步骤：
(1) 蛋白酶酶解蛤蟆油：研磨成粉末状的蛤蟆油在充分浸泡后，加入胰蛋白酶酶解，酶解后的蛤蟆油离心取上清液；
(2) 提取蛤蟆油中的糖胺聚糖：将DEAE柱水洗平衡至稳定状态，加入上清液，再加入平衡液除去蛋白质杂质，然后再用不同高盐浓度洗脱液将糖胺聚糖分段洗脱出来；最后将每管收集到的样品进行紫外检测；利用透析将糖胺聚糖中大量的盐除去，随后利用冻干除去大部分的水；
(3) 酶解糖胺聚糖获取二糖组分：利用肝素酶Ⅰ 、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ将糖胺聚糖酶解至HS/HP二糖单元，再用沸水灭活，离心取上清液；
(4) 分子排阻色谱纯化二糖组分： 取步骤(3)中的上清液，通过分子排阻色谱法利用S75柱对样品进行分离、纯化，从而获得纯净的HS/HP二糖组分；
(5) LC-MS法分析蛤蟆油中HS/HP二糖组分的结构：用2-氨基吖啶酮AMAC和氰基硼氢化钠对蛤蟆油中HS/HP二糖进行荧光标记，标记后的HS/HP和CS/DS二糖用MS方法进行分析；根据建立好的标准曲线，得到蛤蟆油中HS/HP的组分含量，并建立HS/HP区域结构模型；
步骤（1）蛋白酶酶解蛤蟆油具体为：用研钵将蛤蟆油研磨至粉末状，取100-200 mg浸泡在10-50 mL超纯水中，常温放置24-48 h使其充分溶胀；取100 μL 10-30 μg/μL的胰蛋白酶溶液，加入到蛤蟆油样品中，反应温度36-40℃，反应时长24-48 h，酶解结束，10000 rpm离心10-20 min取上清液。
2.根据权利要求1所述的蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析方法，其特征在于，步骤（2）提取蛤蟆油中的糖胺聚糖具体为：用足量的超纯水洗去DEAE树脂中的乙醇，取5-20 mL装柱，用十倍柱体积的0.2 M NaCl，10-50 mM磷酸平衡缓冲液平衡DEAE柱，上样，再加入平衡缓冲液除去蛋白杂质，随后利用分段洗脱的方法提取蛤蟆油中的糖胺聚糖，分段洗脱的高盐浓度洗脱液分别为0.5 M NaCl，10-50 mM磷酸缓冲液；1.0 M NaCl，10-50 mM磷酸缓冲液，以3 mL/管收集各馏分，并进行紫外检测，波长为212 nm；DEAE收集到的馏分用1000-5000 Da的透析膜透析除去洗脱液中的NaCl，每两小时换一次去离子水，透析2-4天，冻干2-4天除去水，得到纯净的蛤蟆油糖胺聚糖OR-GAG。
3.根据权利要求1所述的蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析方法，其特征在于，步骤（3）酶解糖胺聚糖获取二糖组分具体为：取步骤（2）提取获得的蛤蟆油糖胺聚糖OR-GAG取0.5-1.0 μg， 然后加入肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ酶液，各10 μL，酶的浓度均为0.1-1.0 mIU/μL；将蛤蟆油糖胺聚糖OR-GAG特异性酶解至HS/HP二糖单元，酶解温度为36-40℃，酶解时长24-48 h，酶解结束后，10000 rpm离心取上清液。
4.根据权利要求1所述的蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析方法，其特征在于，步骤（4）分子排阻色谱纯化二糖组分具体为：取步骤（3）中的上清液，以≤200 μL的上样体积过分子排阻色谱柱，HS/HP二糖经S75柱分离纯化，流动相为0.1-0.3 M NH4HCO3，流速0.4 mL/min，HS/HP二糖在38-44 min出峰并进行收集；流动相中的NH4HCO3通过55-65℃挥发除去。
5.根据权利要求1所述的蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析方法，其特征在于，步骤（5）LC-MS法分析蛤蟆油中HS/HP二糖组分的结构具体为：步骤（4）纯化后的蛤蟆油HS/HP二糖经2-氨基吖啶酮荧光标记后，以上样量<20 μL过ODS柱，流动相A相为20-80 mM醋酸铵，pH=5-7，流动相B相为100%甲醇，流速为0.3 mL/ min，CDL为100-200℃，Heat Block为100-200℃，N2流速为1.5 mL/min,检测电压为1.6-1.8 kV；利用标准曲线分析二糖组分，并建立HS/HP区域模型。
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