CN102286448B

CN102286448B - 一种肝素黄杆菌肝素酶i、iii的制备方法

Info

Publication number: CN102286448B
Application number: CN 201110241260
Authority: CN
Inventors: 马小来; 史绍鹏; 李锂
Original assignee: SHENZHEN HEPALINK PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Shenzhen Hepalink Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2011-08-22
Filing date: 2011-08-22
Publication date: 2013-02-27
Anticipated expiration: 2031-08-22
Also published as: CN102286448A

Abstract

本发明提供肝素黄杆菌肝素酶I、II、III的制备方法，以肝素黄杆菌为原料，将肝素黄杆菌接到种子培养基中培养、再接到发酵培养基、离心收集沉淀、沉淀超声破碎、离心得到肝素黄杆菌肝素酶I、II、III的粗酶液，先将粗酶液通过一次SP-Sepharose FF层析分离为酶II和酶I、III，再将酶I、III再次过SP-Sepharose FF分离为肝素酶I和肝素酶III；将得到的酶I和酶III分别各再过SP-Sepharose FF两次，纯化得到高纯度的肝素酶I和III；将得到的酶II分别过HEP-Sepharose 4B、HA-Ultrogel、SP-Sepharose FF，得到高纯度的肝素酶II。

Description

一种肝素黄杆菌肝素酶I、III的制备方法

技术领域

本发明涉及一种肝素酶I、II、III的制备方法，尤其涉及一种由氯化钙全程保护之下、并含肝素缓冲液洗脱的特殊层析分离技术制备肝素酶I、II、III的方法。

背景技术

肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后，又陆续在一些微生物和动物组织中发现存在肝素酶。肝素酶的应用十分广泛，如：清除血液中残存肝素、防止凝血、生产低分子肝素、研究肝素的结构。目前有学术论文报道的肝素酶大约有10多种，得到较为细致研究的只有来自肝素黄杆菌的3种酶，分别是肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III。肝素酶I、II、III分别是分子量大约43、78、66kd的单体蛋白质，其等电点均在9.0左右，应用和研究非常广泛。

肝素酶的纯化工作有许多研究报道，但因肝素酶是一种很容易失活的酶，已报道的纯化工艺中大都存在活性损失很大、收率低等缺点。Yang等人（J Biol Chem, 1985, 260 (3): 1849-1857）用羟基磷灰石吸附/洗脱处理、QAE-葡聚糖柱层析、等电聚焦、凝胶过滤等四步纯化，制得纯肝素酶I，活性收率大约1%；Daniel等人（J Bio Chem, 1992,267(34): 24347-24355）用羟基磷灰石吸附/洗脱处理、QAE-葡聚糖凝胶层析、羟基磷灰石HPLC、Mono-S FPLC、GPC-HPLC等五步纯化，最终获得纯的肝素酶I，活性回收率10.8%；马小来等人（食品与药品，2005，32（5）：446-450）使用羟基磷灰石吸附/解吸、DEAE－Sepharose柱层析、CM－Cellose柱层析等三步纯化法，纯化得到肝素酶I，活性收率13.4%；Xiaolai Ma等人（J Chrom B,2006,843(2):209-215）通过硫酸铵沉淀、octyl-sepharose 柱层析、CM-650柱层析、SP-650 柱层析、sephadex G-100柱层析等五步纯化法获得纯化的肝素酶I，收率达到17.8%，为所见的肝素酶I最高纯化收率。

马小来等在2009年5月提交的“一种肝素黄杆菌肝素酶I制备方法”（专利申请号200910039360.1）中，建立了一种全新的纯化制备工艺，使肝素酶I在纯化过程中始终处于氯化钙的保护之下，从而获得高达30%的纯酶活性收率，制备的肝素酶I比活高达223IU/mg，与已有最高技术相比，比活增加了两倍多，纯化收率增加将近一倍。

本发明给出一种同时制备纯化出肝素酶I、II、III的方法，在氯化钙保护之下、并含肝素缓冲液洗脱的多步层析分离技术，最终制备肝素酶I、II、III的方法。方法高效、可重复，所得酶纯度极高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种肝素酶I、II、III的制备方法，该方法可同时纯化出3种酶，制备的肝素酶I、III比活高达417和235IU/mg，肝素酶II比活为15.3IU/mg。与已报道方法相比，酶I、III比活增加两倍，酶II比活接近最高报道。

本发明包括下述步骤：

(1) 肝素酶的粗酶液的发酵制备：

将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中，23℃，150rpm，培养1天。然后按5%接种量接入发酵培养基，23℃，150rpm，培养2-3天。菌液10000rpm，4℃离心15-30分钟，收集沉淀，悬浮在100ml、50mM Tris-HCl^①缓冲液中，冰浴超声1小时（150W，5s,5s）。4℃，10000rpm,离心30min, 向其中滴加0.5g/ml的鱼精蛋白8ml，搅拌，4℃，10000rpm,离心30min，上清即为粗酶液。

(2) 粗酶的SP柱分离：

将步骤(1)所得粗酶液上一根用10-50mM的Tris-HCl^②平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，然后以缓冲液中氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，分别收集洗脱液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的洗脱液，两种酶呈两个活性峰I和 II；

将活性峰II（靠后的那个）洗脱液透析后上一根用50mM Tris-HCl^①缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.2M洗脱，分别收集洗脱液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的洗脱液，呈两种酶呈两个活性峰III和 IV；

(3) 肝素酶I的纯化：

步骤（2）活性峰III洗脱液透析后上一根用Tris-HCl^③缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl^③缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris-HCl^②缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性的组分，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶I。

(4) 肝素酶III的纯化：

步骤（2）活性峰IV洗脱液透析后上一根用Tris-HCl^④缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl^④缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris-HCl^②缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液中具有硫酸乙酰肝素酶活性的组分以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶III。

(5) 肝素酶II的纯化：

步骤（2）活性峰I洗脱液透析后上一根用10mM Tris-HCl^⑤缓冲液平衡过的HEP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl^⑤缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.1M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；然后上一根用50mM磷酸-磷酸钠缓冲液平衡过的HA柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以缓冲液中含氯化钠线形梯度0-1.5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；然后上一根用Tris-HCl^②缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl^②缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶II。

其中，步骤(1)所述的种子培养基的组成为：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，酵母粉 0.5%，NaCl为0.5% ,pH7.0。

步骤(1)所述的发酵培养基组成（g/L）为：肝素8, K₂HPO₄ 2.5,NaH₂PO₄ 2.5, NH₄Cl 2.0, MgCl₂ 0.5, 组氨酸 0.5, 甲硫氨酸 0.5, 微量元素（NaMoO₃,CuCl₂, FeCl₂, CoCl₂, MnCl₂, CaCl₂，1×10^-4M）。

步骤(1)、(2)、(3)、(4)所述Tris-HCl^①②缓冲液含10mM CaCl₂、pH6.5-8.0, 优选pH范围为7.0-7.5。

步骤(3) 、(4)所述Tris-HCl^③④缓冲液含氯化钠5-75mM、含肝素0.01-0.5%，氯化钠含量的优选范围为25-45 mM，肝素含量的优选范围为0.1-0.2%，肝素的种类优选为高纯度肝素。

本发明还包括以下内容：

(6)肝素酶活性测定：在5ml石英比色皿中加入在30℃预热过的2.5ml肝素浓度为1mg/ml的Tris-HCl^①(50mM, 含CaCl₂ 10mM, pH7.0)缓冲液，移取5-20μl酶液，摇匀后在232nm测定吸光值，读取每分钟的变化量。根据摩尔消光系数计算单位时间产生的双键的摩尔数，并由此计算酶液的单位活性（IU/ml）。

(7)硫酸乙酰肝素酶活性测定：在1ml石英比色皿中加入在30℃预热过的0.5ml硫酸乙酰肝素浓度为1mg/ml的Tris-HCl^①(50mM, 含CaCl₂ 10mM, pH7.0)缓冲液，移取5-20μl酶液，摇匀后在232nm测定吸光值，读取每分钟的变化量。根据摩尔消光系数计算单位时间产生的双键的摩尔数，并由此计算酶液的单位活性（IU/ml）。

(8)蛋白质测定：向5ml考马斯亮蓝溶液中加蛋白0.1ml，摇匀，测定A595，根据标准曲线换算蛋白浓度

本发明所述制备方法中，所有肝素酶I、III纯化步骤都保证了保护剂CaCl₂的存在，极大地保持了肝素酶I、III的稳定。肝素酶I经过纯化最终得到比活高达416.67IU/ml的酶，整个过程活性收率为35%，提纯了73.88倍，从1L发酵液的菌体中得到50IU的肝素酶I纯酶。肝素酶III纯化最终得到比活235IU/ml（硫酸类肝素底物）的酶，整个过程活性收率为4%，提纯了34.36倍，从1L发酵液的菌体中得到7.52IU的肝素酶III酶。肝素酶II纯化最终得到比活15.33IU/ml（肝素底物）的酶，整个过程活性收率为22%，提纯了2.72倍。从1L发酵液的菌体中得到2.76IU的肝素酶II较纯酶。

与已报道方法相比，酶I、III比活提高两倍多，酶II比活接近最高报道。酶I、III纯化工艺活性收率也远高于已有报道的最高值。本发明所述制备方法，还具有工艺简单、结果易重复的特点，可放大后用于工业大规模制备高纯度肝素酶I、II、III。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1：

a、将肝素黄杆菌接到50ml种子培养基中，23℃，150rpm，培养1天；

b、按5%接种量接入发酵培养基，23℃，150rpm，培养2-3天，4℃，10000rpm,离心15-30分钟，收集沉淀；

c、沉淀悬浮在100ml、25mM 的Tris-HCl^①缓冲溶液中，冰浴超声1小时，4℃，10000rpm,离心30min,滴加0.5g/ml的鱼精蛋白8ml，搅拌，4℃，10000rpm,离心30min，取上清液；

d、上一根用Tris-HCl^①缓冲液平衡过的SP柱，以同样的缓冲液平衡3个柱体积，以Tris-HCl^①缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性，呈两个活性峰I、II分布的若干管；

e、活性峰II洗脱液透析后上一根用50mM Tris-HCl^②缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.2M洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的组分，呈两个活性峰III、IV分布的若干管；

f、活性峰III洗脱液透析后上一根用Tris-HCl^③缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl^③缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mMTris-HCl^②缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性的组分，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶I。

g、活性峰IV洗脱液透析后上一根用Tris-HCl^④缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl^④缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mMTris-HCl^②缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液中具有硫酸乙酰肝素酶活性的组分以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶III。

h、活性峰I洗脱液透析后上一根用10mM Tris-HCl^⑤缓冲液平衡过的HEP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl^⑤缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.1M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；然后上一根用50mM磷酸-磷酸钠缓冲液平衡过的HA柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以缓冲液中含氯化钠线形梯度0-1.5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；然后上一根用Tris-HCl^②缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl^②缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶II。

其中，所述的肝素黄杆菌肝素酶I、II、III的制备方法，其特征在于：步骤a中所述种子培养基的组成为牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、酵母粉0.5%、NaCl为0.5% 、pH7.0。

步骤b中所述发酵培养基组成为肝素8, K₂HPO₄ 2.5, NaH₂PO₄ 2.5, NH₄Cl 2.0, MgCl₂ 0.5, 组氨酸 0.5, 甲硫氨酸 0.5,微量元素NaMoO₃、CuCl₂、 FeCl₂、 CoCl₂、 MnCl₂、 CaCl₂共1×10^-4M，单位为g/L。

所述Tris-HCl^①②缓冲液含10mM CaCl₂、pH6.5-8.0。

所述Tris-HCl^③缓冲液含氯化钠5-75mM、含肝素0.01-0.5%，肝素的种类为高纯度肝素。

所述Tris-HCl^④缓冲液含氯化钠5-75mM、含肝素0.1-0.5%，肝素的种类为高纯度肝素。

Claims

1.一种肝素黄杆菌肝素酶I、III的制备方法，所述方法步骤如下：

(1) 肝素酶的粗酶液的发酵制备：

将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中，23℃，150rpm，培养1天，然后按5%接种量接入发酵培养基，23℃，150rpm，培养2-3天，菌液10000rpm，4℃离心15-30分钟，收集沉淀，悬浮在100ml、50mM Tris-HCl^①缓冲液中，冰浴超声1小时；4℃，10000rpm,离心30min, 向其中滴加0.5g/ml的鱼精蛋白8ml，搅拌，4℃，10000rpm,离心30min，上清即为粗酶液；

(2) 粗酶的SP柱分离：

将活性峰II洗脱液透析后上一根用50mM Tris-HCl^①缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.2M洗脱，分别收集洗脱液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的洗脱液，呈两种酶呈两个活性峰III和 IV；

(3) 肝素酶I的纯化：

步骤（2）活性峰III洗脱液透析后上一根用Tris-HCl^③缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl^③缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris-HCl^②缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性的组分，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶I；

(4) 肝素酶III的纯化：

步骤（2）活性峰IV洗脱液透析后上一根用Tris-HCl^④缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl^④缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris-HCl^②缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液中具有硫酸乙酰肝素酶活性的组分以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶III；

其中，所述Tris-HCl^①缓冲液含10mM CaCl₂、pH6.5-8.0；

其中，所述Tris-HCl^②缓冲液含10mM CaCl₂、pH6.5-8.0；

其中，所述Tris-HCl^③缓冲液含氯化钠5-75mM、含肝素0.01-0.5%，肝素的种类为高纯度肝素；

其中，所述Tris-HCl^④缓冲液含氯化钠5-75mM、含肝素0.1-0.5%，肝素的种类为高纯度肝素；

肝素酶I、III纯化步骤都有保护剂CaCl₂的存在。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述种子培养基的组成为牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、酵母粉 0.5%、NaCl为0.5% 、pH7.0。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述发酵培养基组成为肝素 8g/L, K₂HPO₄ 2.5g/L, NaH₂PO₄ 2.5g/L, NH₄Cl 2.0g/L, MgCl₂ 0.5g/L, 组氨酸 0.5g/L, 甲硫氨酸 0.5g/L, 微量元素NaMoO₃、CuCl₂、 FeCl₂、 CoCl₂、 MnCl₂、CaCl₂中每个均为1×10^-4M。