CN105368811A - 果胶裂解酶及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种果胶裂解酶及其编码基因和应用，其解决了现有果胶裂解酶活性不高、热稳定性差的技术问题，公开了果胶裂解酶的氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列，同时，公开了编码基因的制备方法及果胶裂解酶在苎麻脱胶中的应用。本发明可广泛用于果胶裂解酶的制备领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶及其编码基因和应用，具体说是一种果胶裂解酶及其编码基因和应用。
背景技术
果胶是一类天然高分子化合物，它是植物细胞间质的重要成分，其主要由半乳糖醛酸与它的甲酯缩合而成，在植物细胞组织中起粘合作用。果胶其主链由半乳糖醛酸以α-1,4-糖苷键连接而成；支链组成则因来源不同而有区别，包括L-鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和木糖等。
果胶酶(Pectinases)是指分解果胶质的一类酶的总称。由于果胶质的化学结构非常复杂，能够催化其分解的果胶酶也是种类繁多。果胶酶按其作用的pH值可分为:酸性果胶酶、中性果胶酶和碱性果胶酶。按其作用底物及其作用方式不同，可分为果胶酯酶(pectinesterases)、果胶解聚酶(depolymerizingenzyme)和原果胶酶(protopectinase)等。果胶裂解酶(pectatelyase,简称Pel,EC4.2.2.2)是果胶解聚酶的一种，可通过反式消去作用以随机方式切割果胶酸或果胶的α-1,4-糖苷键，生成C4-C5不饱和寡聚半乳糖醛酸。这一类酶，尤其是碱性果胶裂解酶，作为一种重要的清洁生产用酶备受关注，其主要运用于纸浆漂白和纺织品的生物精炼等行业。酶解精炼方法能从根本上解决传统工艺存在的环境和能源等问题，在质量与环保方面具有传统工艺无法比拟的优势。其中一个重要应用方向是麻类脱胶。麻类纤维是非常优良的纺织品原料，但是这些纤维中除了含有纤维素外还含有20％-30％的果胶质。脱胶就是从从植物纤维中除去有黏性的非纤维物质。碱性果胶酶脱胶应用上有许多显著优点，包括不破坏植物纤维、不污染环境、节约能源等。
为了提高碱性果胶酶对苎麻的脱胶效果，有必要提高酶蛋白的热活性及热稳定性。当酶蛋白的高级结构及蛋白结构与功能的关系尚不明确的情况下，筛选随机突变文库获得相关突变体，也有助于增加对该酶及其相近酶蛋白催化机理、稳定性等方面的认识。
发明内容
本发明就是为了解决现有果胶裂解酶活性不高、热稳定性差的技术问题，提供一种活性较高、热稳定性好的果胶裂解酶及其编码基因和应用。
为此，本发明提供一种果胶裂解酶，果胶裂解酶的氨基酸序列如序列表的序列4所示。
本发明同时提供果胶裂解酶的编码基因，其编码基因的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
本发明还提供果胶裂解酶编码基因的制备方法，其包括如下步骤：(1)提取短小芽胞杆菌(Bacilluspumilu)ATCC7061的基因组DNA并以其为模板，以5’-atggctagcatgttgaagaaaaaag-3’和5’-gtgctcgagtacctttccaacaccagc-3’为引物进行PCR扩增；(2)将上述步骤(1)获得的PCR产物用NheI和XhoI双酶切，酶切产物与经相同酶切的pET28a载体用T4连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得重组菌，提取重组菌的质粒测序验证，测序分析，该PCR产物的基因命名bppel，将其插入pET28a载体的NheI和XhoI酶切位点间得到的质粒，将该质粒命名为pET28a-pel；(3)在bppel基因的基础上，首先选择位点Arg228，设计简并引物进行定点饱和突变文库构建，即，以简并引物5’-cacaacaacNNSttcgaaaacctg-3’和5’-caggttttcgaaSNNgttgttgtg-3’，以pET28a-pel质粒为模板，用PyrobestDNA聚合酶扩增全质粒，引入饱和突变位点；随后以DpnI酶，酶切处理PCR扩增产物，去除质粒模板，所得产物转化BL21(DE3)感受态细胞，即为饱和突变文库；筛选重组菌，获得突变体Pel-M1；(4)构建随机突变文库；改变PCR扩增体系中的dNTP的比率及锰离子、镁离子的浓度，提高TaqDNA聚合酶的错配率，在基因序列中引入突变，即，以pET28a-pel-M1突变体质粒为模板，以5’-atggctagcatgttgaagaaaaaag-3’和5’-gtgctcgagtacctttccaacaccagc-3’为引物进行PCR扩增，得到突变的PCR产物；将上述突变的PCR产物经NheI和XhoI双酶切，酶切产物分别与经相同酶切的pET28a载体连接，连接产物分别转化BL21(DE3)的感受态细胞中，得到突变文库；筛选重组菌，提取质粒测序，该质粒中的PCR产物的基因具有序列表3所示的核苷酸，该基因命名为pel-M2，该基因编码的蛋白命名为Pel-M2，该蛋白的氨基酸序列如序列表4所示。
本发明还提供了果胶裂解酶在苎麻脱胶中的应用。
本发明可显著提高果胶裂解酶的热稳定性和脱胶活性，具体参照如下的实施例2和附图1-4所示。
附图说明
图1为苎麻示意图；
图2缓冲液处理对照组示意图；
图3为野生型酶脱胶示意图；
图4为突变体酶脱胶示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1果胶裂解酶野生型及突变体及其编码基因的获得
1、提取短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus)ATCC7061,购自中国科学院微生物研究所菌保藏中心，菌种保藏号为CGMCCNo.1.3533)的基因组DNA并以其为模板，以5’-atggctagcatgttgaagaaaaaag-3’(forward)and5’-gtgctcgagtacctttccaacaccagc-3’(reverse)为引物进行PCR扩增。PCR扩增条件如下：先95℃预变性4min，然后95℃45s，55℃30s，72℃1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
回收上述PCR反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得1023p的条带。
2、含有果胶裂解酶野生型编码基因的重组菌的获得
将上述1获得的PCR产物用NheI和XhoI双酶切，酶切产物与经相同酶切的pET28a载体(购自Promega公司)用T4连接酶(购自宝生物公司)4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得重组菌。提取重组菌的质粒测序验证，测序分析，该PCR产物的基因命名bppel，将其插入pET28a载体的NheI和XhoI酶切位点间得到的质粒，将该质粒命名为pET28a-pel。
3、含有果胶裂解酶突变体编码基因的重组菌的获得
在bppel基因的基础上，首先选择位点Arg228，设计简并引物进行定点饱和突变文库构建。具体方法为，以简并引物5’-cacaacaacNNSttcgaaaacctg-3’和5’-caggttttcgaaSNNgttgttgtg-3’，以pET28a-pel质粒为模板，用PyrobestDNA聚合酶(宝生物公司)扩增全质粒，引入饱和突变位点。PCR扩增条件如下：先95℃预变性4min，然后95℃1min，55℃1min，72℃7min，共20个循环；最后72℃延伸20min。
随后以DpnI酶(纽英伦生物技术公司)，37℃酶切过夜酶切处理PCR扩增产物，去除质粒模板。所得产物即可电转人BL21(DE3)感受态细胞，即为饱和突变文库。筛选重组菌，筛选方法为在无菌操作间用无菌牙签将包含着突变体的单菌落克隆挑入已分装有800ulLB培养基(胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L,酵母提取物5g/L,添加抗生素卡那霉素至50μg/mL，诱导剂IPTG至终浓度0.,1mM)30℃摇床培养24h后，离心、弃置上清液，收集菌体，冻融法细胞破壁，并加入溶菌酶(10mg/ml,Tris-HCl缓冲液，pH8.0)在37℃反应1h，离心，上清液即为破壁后的粗酶液。以粗酶液和果胶裂解酶底物聚半乳糖醛酸底物反应(条件为60℃，0.5％多聚半乳糖醛酸溶于100mM甘氨酸/氢氧化钠缓冲液(0.5mM氯化钙,pH10.0))，以二硝基水杨酸法(DNS法)检测反应产物半乳糖醛酸含量，体现果胶裂解酶催化活性。约筛选100克隆，即获得突变体Pel-M1。
利用易错PCR的方法，构建随机突变文库。主要是通过改变PCR扩增体系中的dNTP的比率及锰离子、镁离子的浓度，提高TaqDNA聚合酶的错配率，从而在基因序列中引入突变。在本研究中，共进行一轮突变文库构建，条件为：0.2mMdATP和dGTP,1.0mMdCTP和dTTP,5.5mMMgCl2,75μMMnCl2。以pET28a-pel-M1突变体质粒为模板，以5’-atggctagcatgttgaagaaaaaag-3’(forward)and5’-gtgctcgagtacctttccaacaccagc-3’(reverse)为引物进行PCR扩增，得到突变的PCR产物。将上述突变的PCR产物分别NheI和XhoI双酶切，酶切产物分别与经相同酶切的pET28a载体连接，连接产物分别转化BL21(DE3)的感受态细胞中，得到突变文库。筛选重组菌，筛选方法为在无菌操作间用无菌牙签将包含着突变体的单菌落克隆挑入已分装有800ulLB培养基(胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L,酵母提取物5g/L,添加抗生素卡那霉素至50μg/mL，诱导剂IPTG至终浓度0.1mM)30℃摇床培养24h后，离心、弃置上清液，收集菌体，冻融法细胞破壁，并加入溶菌酶(10mg/ml,Tris-HCl缓冲液，pH8.0)在37℃反应1h，离心，上清液即为破壁后的粗酶液。以粗酶液和果胶裂解酶底物聚半乳糖醛酸底物反应(条件为60℃，0.5％多聚半乳糖醛酸溶于100mM甘氨酸/氢氧化钠缓冲液(0.5mM氯化钙,pH10.0))，以二硝基水杨酸法(DNS法)检测反应产物半乳糖醛酸含量，体现果胶裂解酶催化活性。
对于生成半乳糖醛酸较多的重组菌，提取质粒送去测序，结果该质粒中的PCR产物的基因具有序列表所示的核苷酸，该基因命名为pel-M2，该基因编码的蛋白命名为Pel-M2，该蛋白的氨基酸序列列在序列表中。
将上述Pel-M2的氨基酸和核苷酸序列与野生型果胶裂解酶Pel-M2的氨基酸和核苷酸序列相比：
突变体pel-M2的核酸序列为将野生型果胶裂解酶bppel的核酸序列，发生如下突变：T436A,G619A，T682C及G684T。
Pel-M2的氨基酸序列为将野生型果胶裂解酶BpPel的氨基酸序列，自N‘末端起第146位丝氨酸突变为半胱氨酸，第207位苏氨酸突变为丙氨酸，第228位精氨酸突变为色氨酸。
将含有pel-M2的质粒命名为pET28a-pel-M2，该质粒为将序列表中的序列插入pET28a的NheI和XhoI双酶切位点间得到的载体，将含有该质粒的重组菌命名为BL21(DE3)/pET28a-pel-M2。
采用同样的方法将质粒pET28a-pel转入BL21(DE3)的感受态细胞中，得到重组菌BL21(DE3)/pET28a-pel。
实施例2果胶裂解酶活性测定
一、果胶裂解酶野生型、突变体重组蛋白的获得
1、诱导表达
将上述获得的BL21(DE3)/pET28a-pel或pET28a-pel-M3的单菌落接种至含有卡那霉素(终浓度为50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集发酵液，将发酵液按照1％(体积百分含量)的接种量转接至100ml新鲜的LB液体培养基中，37℃培养至OD600达到0.6，再在培养基中加入无菌的IPTG，使IPTG在培养基中的终浓度为1mM在30℃进行诱导发酵。12h后结束发酵，将发酵液4000g离心10min收集菌体。
将菌体重悬于50ml浓度为50mM的结合缓冲液(Tris-盐酸，pH8,300mMNaCl，10mM咪唑)，超声破壁(200W,工作3s暂停3s，工作100次)，离心(15,700g,4℃,30min)去除细胞碎片，收集上清液。
2、纯化
将上述的上清液经0.22μm滤膜过滤后，用纯化的条件为：
漂洗缓冲液：50mMpH8Tris-HCl，300mMNaCl，20mM咪唑；
洗脱缓冲液：50mMpH8Tris-HCl，300mMNaCl，250mM咪唑。
收集流出液，经透析处理(透析液为100mM甘氨酸/氢氧化钠缓冲液(0.5mM氯化钙,pH10.0),透析袋的截留分子量8000-14000)后，得到纯化酶液(突变体)。
用酶活测试及SDS-PAGE等方法验证，确认纯化组分的纯度；以Bradford蛋白浓度测定法测试纯化蛋白浓度。
采用同样的方法将重组菌BL21(DE3)/pET28a-pel进行诱导表达、纯化，得到纯化酶液(野生)。
二、果胶裂解酶活性检测
将10μl上述得到的纯化酶液(突变或野生型)、140μl多聚半乳糖醛酸(0.5％，溶于100mM甘氨酸/氢氧化钠缓冲液(0.5mM氯化钙,pH10.0)，在60℃反应10min，以DNS法检测产物，对照以半乳糖醛酸为标准品绘制的标准曲线，计算所获得的半乳糖醛酸含量。以纯化酶液(野生)为对照。一个酶活单位定义为标准反应条件下，1min可生成1μmol半乳糖醛酸所需酶蛋白量。
纯化酶液(野生)比活力为130.9±2.1U/mg；
纯化酶液(突变)比活力为438.7±15.3U/mg。
上述结果表明，突变体生成半乳糖醛酸的能力为野生型的3.4倍。
三、果胶裂解酶热稳定性检测
纯化所得重组蛋白(突变体)(蛋白浓度均为0.04mg/ml)在50℃下温育不同时间，取出酶蛋白，以上一部分所提到的酶活测定方法测定残余酶活力，以此评定酶蛋白的热稳定性。实验结果显示，50℃温育，野生型蛋白在温育2.7min后失去50％活性(以不经过温育处理的野生型蛋白，用上一部分所述测活方法测定酶活，记为100％)，在温育10min时已完全失活；而突变体在温育800.3min后，仍保持50％的活性(以不经过温育处理的突变体蛋白，用上一部分所述测活方法测定酶活，记为100％)。因此，突变体Pel-M2较野生型BpPel在热稳定特性上有显著的提高。
实施例3果胶裂解酶BpPel及其突变体Pel-M3在苎麻脱胶中的应用
苎麻脱胶的实验方法
1g的苎麻与10mg纯化后果胶裂解酶(野生型或突变体)混合，反应体系为20ml100mM甘氨酸/氢氧化钠缓冲液(0.3mM氯化钙，pH10.0)。50℃温育4h。随后，处理过的苎麻经水洗后再105℃烘干至恒重。比较酶处理前后苎麻干重的差值，即减重率。
经上述方法，用纯化后的野生型BpPel及突变体Pel-M3分别处理后，苎麻减重率分别为17.6％(BpPel)及23.2％(Pel-M3)。
Claims (4)
1.一种果胶裂解酶，其特征是所述果胶裂解酶的氨基酸序列如序列表的序列4所示。
2.如权利要求1所述的果胶裂解酶的编码基因，其特征是所述编码基因的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
3.如权利要求2所述的果胶裂解酶编码基因的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)提取短小芽胞杆菌(Bacilluspumilu)ATCC7061的基因组DNA并以其为模板，以5’-atggctagcatgttgaagaaaaaag-3’和5’-gtgctcgagtacctttccaacaccagc-3’为引物进行PCR扩增；
(2)将上述步骤(1)获得的PCR产物用NheI和XhoI双酶切，酶切产物与经相同酶切的pET28a载体用T4连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得重组菌，提取重组菌的质粒测序验证，测序分析，该PCR产物的基因命名bppel，将其插入pET28a载体的NheI和XhoI酶切位点间得到的质粒，将该质粒命名为pET28a-pel；
(3)在bppel基因的基础上，首先选择位点Arg228，设计简并引物进行定点饱和突变文库构建，即，以简并引物5’-cacaacaacNNSttcgaaaacctg-3’和5’-caggttttcgaaSNNgttgttgtg-3’，以pET28a-pel质粒为模板，用PyrobestDNA聚合酶扩增全质粒，引入饱和突变位点；随后以DpnI酶，酶切处理PCR扩增产物，去除质粒模板，所得产物转化BL21(DE3)感受态细胞，即为饱和突变文库；筛选重组菌，获得突变体Pel-M1；
(4)构建随机突变文库；改变PCR扩增体系中的dNTP的比率及锰离子、镁离子的浓度，提高TaqDNA聚合酶的错配率，在基因序列中引入突变，即，以pET28a-pel-M1突变体质粒为模板，以5’-atggctagcatgttgaagaaaaaag-3’和5’-gtgctcgagtacctttccaacaccagc-3’为引物进行PCR扩增，得到突变的PCR产物；将上述突变的PCR产物经NheI和XhoI双酶切，酶切产物分别与经相同酶切的pET28a载体连接，连接产物分别转化BL21(DE3)的感受态细胞中，得到突变文库；筛选重组菌，提取质粒测序，该质粒中的PCR产物的基因具有序列表3所示的核苷酸，该基因命名为pel-M2，该基因编码的蛋白命名为Pel-M2，该蛋白的氨基酸序列如序列表4所示。
4.如权利要求1所述的果胶裂解酶在苎麻脱胶中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |