CN106754875A - 基因饱和突变库及其构建方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及基因饱和突变库及其构建方法、应用。该长序列DNA中连续多点饱和突变库构建方法适用于高通量蛋白质功能筛选，以含有表达目的蛋白的基因的环状双螺旋DNA质粒为模板，采用一对序列完全反向互补的正向和反向突变引物，通过聚合酶链式反应，仅需一步反应即可实现在长序列DNA中连续排列的多个碱基的饱和突变，具有简单、快速、突变成功率高的特点，可实现在氨基酸水平上对蛋白质功能位点的快速筛选定位和高效突变改造。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及基因饱和突变库及其构建方法、应用。
背景技术
蛋白质改造和筛选技术在天然基因的异源表达、疫苗、抗体等蛋白类药物的优化、人工合成细胞工厂乃至人造生命体等方面应用广泛，对人类健康和社会发展具有重大意义。在蛋白质功能研究和工程改造中，首先要确定影响蛋白质功能的关键氨基酸位点，通过对这些位点进行多轮突变和筛选，获得所需功能和活性的工程蛋白质。通常的策略是先采用多轮易错PCR对目的基因进行随机突变，初步筛选出一些可疑位点。随后，采用定点突变或多点突变方法围绕可疑位点展开进一步探查。
然而，虽然易错PCR可以随机地向目的基因中一次性引入多个碱基突变，但它的这种随机性也限制了这种方法的突变效率，比如多轮突变中某些位点被重复突变，而某些区域的序列始终没有被突变，各轮的突变碱基个数也不尽相同，导致在有限的实验次数中几乎无法实现对目的基因序列的全面探查。另一方面，目前所采用的各种定点突变方法通常单轮实验只能实现1-3个相邻碱基突变，多点突变则要求各个突变位点之间的间隔需在几十到几百个碱基对以上，并且通常也需要多个PCR反应串联才能实现最终的突变目的。这些方法对指定序列中连续排列的多个碱基突变效率低、步骤繁琐，并且对长序列DNA的兼容性差。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种适用于高通量蛋白质功能筛选的长序列DNA中连续多点饱和突变库构建方法。本发明提供的连续多点饱和突变库构建方法仅需一步反应即可实现在长序列DNA中连续排列的多个碱基的饱和突变，具有简单、快速、突变成功率高的特点，可实现在氨基酸水平上对蛋白质功能位点的快速筛选定位和高效突变改造。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基因饱和突变库的构建方法，以含有表达目的蛋白的基因的环状双螺旋DNA质粒为模板，采用一对序列完全反向互补的正向突变引物和反向突变引物，通过聚合酶链式反应构建获得基因饱和突变库；
所述正向突变引物和所述反向突变引物的序列中分别含有9个以上连续排列的兼并碱基。
在本发明的一些具体实施方案中，所述含有表达目的蛋白的基因的环状双螺旋质粒的长度不小于8kb。
在本发明的一些具体实施方案中，所述聚合酶链式反应的循环数不高于18。
在本发明的一些具体实施方案中，获得所述基因饱和突变库后还包括经DpnI酶消化除去模板后，直接转化到宿主菌进行培养基平板筛选的步骤。
在本发明的一些具体实施方案中，所述正向突变引物由三部分序列组成：5’-模板序列、兼并碱基序列和3’-模板序列，其中所述兼并碱基序列是以兼并碱基代替了目的基因中待突变的序列，5’-模板序列是目的基因中待突变序列5’端上游的序列，3’-模板序列是目的基因中待突变序列3’端下游的序列；
所述反向突变引物的序列为所述正向突变引物的反向互补序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述5’-模板序列和所述3’-模板序列的Tm值相差不高于5℃，所述5’-模板序列和所述3’-模板序列的长度均不低于所述兼并碱基序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述正向突变引物和所述反向突变引物的序列如SEQ ID No.7～SEQ ID No.112所示。
在本发明的一些具体实施方案中，所述聚合酶链式反应的体系为：所述环状双螺旋DNA质粒20～100ng、所述正向突变引物100～200nM、所述反向突变引物100～200nM、Q5高保真聚合酶1U、1×Q5反应缓冲液。
在本发明的一些具体实施方案中，所述聚合酶链式反应的条件为：98℃预变性1～2.5min、以如下条件进行10～18个循环：98℃0.5～1min、退火0.5～2min、72℃延伸15s/kb，最后以72℃再进行2～5min延伸。
本发明还提供了所述的构建方法获得的基因饱和突变库。
本发明还提供了所述的基因饱和突变库在蛋白质功能位点的快速筛选定位和/或高效突变改造中的应用。
本发明提供了一种适用于高通量蛋白质功能筛选的长序列DNA中连续多点饱和突变库构建方法，以含有表达目的蛋白的基因的环状双螺旋DNA质粒为模板，采用一对序列完全反向互补的正向和反向突变引物，通过聚合酶链式反应，仅需一步反应即可实现在长序列DNA中连续排列的多个碱基的饱和突变，具有简单、快速、突变成功率高的特点，可实现在氨基酸水平上对蛋白质功能位点的快速筛选定位和高效突变改造。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明提供的长序列DNA饱和突变库构建方法全过程的示意图；
图2示实施例1和2中用于构建饱和突变库的模板质粒图谱；其中，图2(A)示EBPA质粒图谱；图2(B)示EBPP质粒图谱；
图3示实施例1和2中目的基因突变区域分组示意图；
图4示实施例3中突变库测序峰图；
图5示实施例4中突变基因库转化到表达宿主中的进行筛选的培养平板。
具体实施方式
本发明公开了一种适用于高通量蛋白质功能筛选的长序列DNA中连续多点饱和突变库构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的长序列DNA中连续多位点饱和突变库构建方法包括以下步骤：
(1)构建含有目的基因的环状双螺旋DNA质粒；
(2)确定待突变的基因位点或区域，设计和合成构建基因筛选库所需的突变引物；
(3)采用聚合酶链式反应进行突变基因库的合成；
(4)所获得的突变基因库经DpnI酶消化除去模板后，直接转化到宿主菌进行培养基平板筛选。
优选的，所述的环状双螺旋DNA质粒的长度大于等于10kb。
所述的突变引物包括正向突变引物和反向突变引物。正向突变引物由5’-模板序列、兼并碱基序列和3’-模板序列这三部分序列组成，其中兼并碱基序列是以兼并碱基代替了目的基因中待突变的序列，5’-模板序列是目的基因中待突变序列5’端上游的一段序列，3’-模板序列是目的基因中待突变序列3’端下游的一段序列。反向突变引物的序列为正向突变引物的反向互补序列。
优选的，5’-模板序列和3’-模板序列的Tm值相差不高于5℃；
优选的，5’-模板序列和3’-模板序列的长度均不低于兼并碱基序列。
所述的聚合酶链式反应中，反应体系由质粒模板、正向引物、反向引物、高保真DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲液及去离子水组成。
优选的，质粒模板的用量为20-100ng；
优选的，正向引物和反向引物在反应体系中的终浓度为100-200nM；
优选的，高保真DNA聚合酶具备长链DNA扩增能力；
优选的，高保真DNA聚合酶为Phusion高保真聚合酶或高保真聚合酶；
所述的聚合酶反应由以下步骤组成：预变性，循环反应(变性、退火、延伸)，再次延伸。
优选的，预变性的温度为98℃，时间为1-2.5min；
优选的，循环反应的循环数为10-18个循环；
优选的，变性温度为98℃，时间为0.5-1min；
优选的，退火温度为正向突变引物中5’端模板序列与3’端模板序列两者的Tm值中较低的数值减去2-5℃，退火时间为0.5-2min；
优选的，延伸温度为72℃，延伸时间以15s/kb计算而得；
优选的，再次延伸的温度为72℃，时间为2-5min。
优选的，所构建的突变基因库中加入10-20U DpnI酶消化模板，消化时间为0.5～2hr。
优选的，所述培养基平板上可以含有目的蛋白的功能底物或指示剂，以便于快速筛选。
具体的，本发明公开了一种适用于高通量蛋白质功能筛选的长序列DNA中连续多点饱和突变库构建方法，该方法全过程的示意图见图1。以含有表达目的蛋白的基因的环状双螺旋DNA质粒为模板，采用一对序列完全反向互补的正向和反向突变引物，通过聚合酶链式反应实现目的基因饱和突变库的构建。正向突变引物由5’-模板序列、兼并碱基序列和3’-模板序列这三部分序列组成，其中兼并碱基序列是以兼并碱基代替了目的基因中待突变的序列，5’-模板序列是目的基因中待突变序列5’端上游的一段序列，3’-模板序列是目的基因中待突变序列3’端下游的一段序列。反向突变引物的序列为正向突变引物的反向互补序列。在聚合酶链式反应中，反应体系由20-100ng质粒模板、100-200nM正向引物、100-200nM反向引物、高保真聚合酶、聚合酶反应缓冲液及去离子水组成。反应条件为：98℃预变性1-2.5min、随后以以下条件进行10-18个循环：98℃0.5-1min、退火0.5-2min、72℃延伸15s/kb，最后以72℃再进行2-5min延伸。所获得的突变基因库经DpnI酶消化除去模板后，直接转化到宿主菌进行培养基平板筛选。
本发明提供的基因饱和突变库及其构建方法、应用中所用原料均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：
天然活性PR因结合了反式视黄醛而能够吸收一定波长范围内的绿光，使含有它的菌体带有不同程度的红或橙色。将PR基因(750bp，序列如SEQ ID No.6所示)与视黄醛合成相关的5个基因——crtE(909bp，序列如SEQ ID No.1所示)、crtB(930bp，序列如SEQ IDNo.2所示)、crtI(1479bp，序列如SEQ ID No.3所示)、crtY(1149bp，序列如SEQ ID No.4所示)(Genbank:90087)及β-diox(1701bp，序列如SEQ ID No.5所示，Genbank:AF271298)全部构建到pACYCDuet-1载体(4008bp，购自Merck公司)中，获得总长度为10.804kb的重组质粒EBPA(谱图如图2(A)所示)。如图3所示，将目的基因PR的DNA序列以每12bp为一组，分成62组，以EBPA重组质粒为模板，设计饱和突变引物(见表1)，对PR序列中编号为10、11、14、25、26、29、30、33、46、49、50、57、58的序列(共13组)进行饱和突变库的构建。反应体系为EBPA质粒50ng、正向突变引物125nM、反向引物125nM、Q5高保真聚合酶(购自美国NEB公司)1U、1×Q5反应缓冲液，反应体系总体积为50μl。突变反应先于98℃预变性1min后，进行18个循环反应，每个循环包括：98℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸4min，最后在于72℃延伸5min。在所得的突变产物中加入10U DpnI酶(购自美国NEB公司)于37℃下反应2hr以消化质粒模板。取10μl消化产物加入到100μl Trans-T1感受态细胞(购自全式金公司)中，于冰上放置30min后，42℃热激30s，冰上放置2min后，加入1mL LB培养基，于37℃下，200rpm摇动1hr。将菌液涂布于含34μg/mL氯霉素的LB平板上，于37℃下过夜倒置培养。对照组采用FastMultiSite Mutagenesis System(购自全式金公司)和QuickChange Multi Site-DirectedMutagenesis Kit(购自美国Agilent公司)，按各试剂盒说明书设计突变引物并进行操作。
实施例2
PR基因(750bp)与视黄醛合成相关的5个基因——crtE(909bp)、crtB(930bp)、crtI(1479bp)、crtY(1149bp)(Genbank:90087)及β-diox(1701bp，Genbank:AF271298)全部构建到pETDuet-1载体(5420bp，购自Merck将公司)中，获得总长度为12.188kb的重组质粒EBPP(图谱如图2(B)所示)。以EBPP重组质粒为模板，对图3中PR序列中编号为6、7、8、9、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、27、28、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、48、51、52、53、54、55、56的序列(共40组)设计饱和突变引物，进行饱和突变库的构建。
突变引物序列如表1所示：
表1
反应体系为EBPP质粒80ng、正向突变引物150nM、反向引物150nM、Q5高保真聚合酶(购自美国NEB公司)1U、1×Q5反应缓冲液，反应体系总体积为50μl。
突变反应先于98℃预变性1min后，进行18个循环反应，每个循环包括：98℃变性50s，60℃退火50s，72℃延伸5min，最后在于72℃延伸5min。
在所得的突变产物中加入20U DpnI酶(购自美国NEB公司)于37℃下反应2hr以消化质粒模板。取10μl消化产物加入到100μl Trans-T1感受态细胞(购自全式金公司)中，于冰上放置30min后，42℃热激30s，冰上放置2min后，加入1mL LB培养基，与37℃下，200rpm摇动1hr。将菌液涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，于37℃下过夜倒置培养。对照组采用Fast MultiSite Mutagenesis System(购自全式金公司)和QuickChange MultiSite-Directed Mutagenesis Kit(购自美国Agilent公司)，按各试剂盒说明书设计突变引物并进行操作。
实施例3
实施例1应用本发明制备的编号为26、29、57和58及实施例2中应用本发明制备的编号为9、15、19、24、27、45、48和55的各组过夜培养的平板上克隆数均超过500个，各随机挑取20个克隆进行测序，突变成功率见表2，其中，“有效测序样品数量”是指送测的20个样品中测序反应成功的样品总数，“突变体数量”是指在测序反应成功的样品中所获得的不同突变序列的总数，如多个样品具有相同突变序列则只记为1种序列，则EBPA的平均突变率为76.6％，EBPP的平均突变率为85.8％。由于对照组过夜培养的平板上长出的克隆数均少于50个，对于连续引入12个兼并碱基的突变库来说，所获得的样本量充分指示该方法是失败的，因此没有对所得克隆进行进一步测序分析。
实施例1和实施例2应用本发明制备的所有平板上的克隆用涂布棒刮下收集到15ml离心管中，并提取质粒进行测序，以评估突变库有效性，测序峰图如图4所示。
由各组峰图可见，突变区域突变碱基的数量与突变引物中兼并碱基的数量一致，突变区与非突变区对比明显，每个位点处的四种碱基的比例趋于接近。由于“原生序列优势效应”的存在，即如突变引物中其兼并碱基与原生序列一致，则该引物PCR扩增效率优于其他引物，因此突变产物中与原生序列一致的产物相比其他产物要偏多一点，这种现象在基于其他原理的饱和突变方法中也普遍存在，不影响对突变库有效性的确认。
这些实验结果显示本发明提供的这种长序列DNA饱和突变库的构建方法能够有效地实现8kb以上的长序列中目的基因的连续多点突变，具有高度的可行性和可靠性。
表2单克隆测序结果
| 编号 | 突变体数量 | 有效测序样品数量 | 突变成功率 |
| 26 | 14 | 16 | 87.5％ |
| 29 | 12 | 20 | 60％ |
| 57 | 16 | 20 | 80％ |
| 58 | 15 | 19 | 78.9％ |
| 9 | 20 | 20 | 100％ |
| 15 | 16 | 20 | 100％ |
| 19 | 20 | 20 | 100％ |
| 24 | 16 | 20 | 80％ |
| 27 | 16 | 20 | 80％ |
| 45 | 14 | 20 | 70％ |
| 48 | 20 | 20 | 100％ |
| 55 | 10 | 18 | 55.6％ |
实施例4
实施例1和实施例2中的DpnI消化产物各取10μl通过电击转化的方法导入到100μlBL21(DE3)GOLD感受态细胞中，加入1mL LB培养基，与37℃下，200rpm摇动1hr。将菌液涂布于含相应抗生素的LB平板上，于37℃下过夜倒置培养。
过夜培养的平板上，因各个克隆中含有的PR基因突变体序列不同而使菌体带有不同程度的黄色，由碱基突变而导致蛋白质功能发生明显变化的克隆甚至呈现出白色。选取实施例2中编号为45的培养平板(如图5所示)经Colony Doc-It菌落分析系统(购自美国UVP公司)分析，呈现白色的克隆数为259，平板上克隆总数为589，白色克隆占比44％。实施例3中随机挑取的单克隆测序结果45号的突变成功率为70％，由于并非所有碱基突变都会引起蛋白功能改变从而导致菌体颜色变化，所以基因突变率高于颜色变化克隆的在总克隆数中的比例是正常的。通过颜色的多样性差异，据此可以再一次证实本发明的可行性和可靠性。
根据菌落颜色的差异可以从平板上快速筛选出在PR基因中与其功能相关的关键位点产生突变的基因变异体，对这些变异体进行测序和数据分析，可以直接获得准确的位点序列信息，便于进一步功能研究和蛋白改造。在饱和突变库的筛选中，研究人员可根据研究条件和筛选需求扩大筛选规模，以获得处于理想置信区间内的突变库容量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 基因饱和突变库及其构建方法、应用
<130> MP1620486
<160> 112
<170> PatentIn version 3.3
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caggcgtttt ctttccactc gctgttggtg ggcggcaatc ccttcgccac ctcatccatt 600
tatacgttga tacacgcgct ggagcgtgag tggggcgtct ggtttccgcg tggcggcacc 660
ggcgcattag ttcaggggat gataaagctg tttcaggatc tgggtggcga agtcgtgtta 720
aacgccagag tcagccatat ggaaacgaca ggaaacaaga ttgaagccgt gcatttagag 780
gacggtcgca ggttcctgac gcaagccgtc gcgtcaaatg cagatgtggt tcatacctat 840
cgcgacctgt taagccagca ccctgccgcg gttaagcagt ccaacaaact gcagactaag 900
cgcatgagta actctctgtt tgtgctctat tttggtttga atcaccatca tgatcagctc 960
gcgcatcaca cggtttgttt cggcccgcgt taccgcgagc tgattgacga aatttttaat 1020
catgatggcc tcgcagagga cttctcactt tatctgcacg cgccctgtgt cacggattcg 1080
tcactggcgc ctgaaggttg cggcagttac tatgtgttgg cgccggtgcc gcatttaggc 1140
accgcgaacc tcgactggac ggttgagggg ccaaaactac gcgaccgtat ttttgcgtac 1200
cttgagcagc attacatgcc tggcttacgg agtcagctgg tcacgcaccg gatgtttacg 1260
ccgtttgatt ttcgcgacca gcttaatgcc tatcatggct cagccttttc tgtggagccc 1320
gttcttaccc agagcgcctg gtttcggccg cataaccgcg ataaaaccat tactaatctc 1380
tacctggtcg gcgcaggcac gcatcccggc gcaggcattc ctggcgtcat cggctcggca 1440
aaagcgacag caggtttgat gctggaggat ctgatatga 1479
<210> 4
<211> 1149
<212> DNA
<213> crtY
<400> 4
atgcaaccgc attatgatct gattctcgtg ggggctggac tcgcgaatgg ccttatcgcc 60
ctgcgtcttc agcagcagca acctgatatg cgtattttgc ttatcgacgc cgcaccccag 120
gcgggcggga atcatacgtg gtcatttcac cacgatgatt tgactgagag ccaacatcgt 180
tggatagctc cgctggtggt tcatcactgg cccgactatc aggtacgctt tcccacacgc 240
cgtcgtaagc tgaacagcgg ctacttttgt attacttctc agcgtttcgc tgaggtttta 300
cagcgacagt ttggcccgca cttgtggatg gataccgcgg tcgcagaggt taatgcggaa 360
tctgttcggt tgaaaaaggg tcaggttatc ggtgcccgcg cggtgattga cgggcggggt 420
tatgcggcaa attcagcact gagcgtgggc ttccaggcgt ttattggcca ggaatggcga 480
ttgagccacc cgcatggttt atcgtctccc attatcatgg atgccacggt cgatcagcaa 540
aatggttatc gcttcgtgta cagcctgccg ctctcgccga ccagattgtt aattgaagac 600
acgcactata ttgataatgc gacattagat cctgaatgcg cgcggcaaaa tatttgcgac 660
tatgccgcgc aacagggttg gcagcttcag acactgctgc gagaagaaca gggcgcctta 720
cccattactc tgtcgggcaa tgccgacgca ttctggcagc agcgccccct ggcctgtagt 780
ggattacgtg ccggtctgtt ccatcctacc accggctatt cactgccgct ggcggttgcc 840
gtggccgacc gcctgagtgc acttgatgtc tttacgtcgg cctcaattca ccatgccatt 900
acgcattttg cccgcgagcg ctggcagcag cagggctttt tccgcatgct gaatcgcatg 960
ctgtttttag ccggacccgc cgattcacgc tggcgggtta tgcagcgttt ttatggttta 1020
cctgaagatt taattgcccg tttttatgcg ggaaaactca cgctgaccga tcggctacgt 1080
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catcgttaa 1149
<210> 5
<211> 1701
<212> DNA
<213> -diox
<400> 5
atggagataa tatttggcca gaataagaaa gaacagctgg agccagttca ggccaaagtg 60
acaggcagca ttccagcatg gctgcagggg accctgctcc gaaacgggcc cgggatgcac 120
acagtgggag agagcaagta caaccattgg tttgatggcc tggcccttct ccacagtttt 180
tccatcagag atggggaggt cttctacagg agcaaatacc tgcagagtga cacctacatc 240
gccaacattg aggccaacag aatcgtggtg tctgagttcg gaaccatggc ctacccggac 300
ccctgcaaaa acatcttttc caaagctttc tcctacttgt ctcacaccat ccccgacttc 360
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accaactaca tcaggaaaat cgacccccag accctagaga ccttggagaa ggttgattac 480
cggaagtatg tggcggtaaa cctggctacc tcgcaccctc attatgacga ggctgggaat 540
gtccttaaca tgggcacatc cgtcgtggac aaagggagga caaaatacgt gatatttaag 600
atccctgcca cagtgccaga cagcaagaag aaagggaaga gtcccgtgaa gcacgcggaa 660
gttttctgct ccatttcctc ccgctcgctg ctctctccca gctactacca cagctttggt 720
gtcacggaga actatgtggt gtttctggag cagcctttta agttggatat cctcaagatg 780
gccaccgcat acatgagggg agtgagctgg gcttcctgta tgtcattcga cagggaggac 840
aagacataca ttcatatcat cgaccagagg accaggaagc ctgtgcctac caagttctac 900
acagatccca tggtggtctt ccatcatgtc aatgcctacg aggaggacgg ctgtgtgctg 960
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aacaaggact tcgaggagaa gtccaggctg acctcagtgc ctaccctcag gaggtttgct 1080
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acaactgcaa cagccctgaa ggagaaagac ggccatgtct attgccagcc cgaggtcctc 1200
tacgaaggcc tagagctccc tcggataaat tatgcttaca acgggaagcc atatcgctac 1260
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ctcacaaagt cctccttaaa gtggtctgag gagagctgct ggccagcaga gcctctgttt 1380
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gctcgcgcct ctgttgatgc ggacatgcac ctggaccttc atggtttatt tatcccagat 1560
gcagactgga atgcagtgaa gcagactcca gctgaaacgc aagaggttga aaactcagat 1620
catcccacag atccgacagc accagaactg agccacagtg aaaatgactt cacagcgggt 1680
catggtggct caagtcttta a 1701
<210> 6
<211> 750
<212> DNA
<213> PR
<400> 6
atgaaattat tactgatatt aggtagtgtt attgcacttc ctacatttgc tgcaggtggt 60
ggtgaccttg atgctagtga ttacactggt gtttcttttt ggttagttac tgctgcttta 120
ttagcatcta ctgtattttt ctttgttgaa agagatagag tttctgcaaa atggaaaaca 180
tcattaactg tatctggtct tgttactggt attgctttct ggcattacat gtacatgaga 240
ggggtatgga ttgaaactgg tgattcgcca actgtattta gatacattga ttggttacta 300
acagttcctc tattaatatg tgaattctac ttaattcttg ctgctgcaac taatgttgct 360
ggatcattat ttaagaaatt actagttggt tctcttgtta tgcttgtgtt tggttacatg 420
ggtgaagcag gaatcatggc tgcatggcct gcattcatta ttgggtgttt agcttgggta 480
tacatgattt atgaattatg ggctggagaa ggaaaatctg catgtaatac tgcaagtcct 540
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cctgtaggtt atttcacagg ttacctgatg ggtgacggtg gatcagctct taacttaaac 660
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<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(27)
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<400> 7
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<210> 8
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
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t;
<400> 8
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<210> 9
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(29)
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t;n(26)=g or t;n(27)=a,c,g or t;n(27)=a,c,g or t;n(29)=g or t;
<400> 9
gtggtgacct tgatgctnnn nnnnnnnnng gtgtttcttt ttggttagtt ac 52
<210> 10
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(35)
<223> n(24)=a or c;n(25)=a,c,g or t;n(26)=a,c,g or t;n(27)=a or
c;n(28)=a,c,g or t;n(29)=a,c,g or t;n(30)=a or c;n(31)=a,c,g or
t;n(32)=a,c,g or t;n(33)=a or c;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a,c,g or
t;
<400> 10
gtaactaacc aaaaagaaac accnnnnnnn nnnnnagcat caaggtcacc ac 52
<210> 11
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(35)
<223> n(24)=a,c,g or t;n(25)=a,c,g or t;n(26)=g or t;n(27)=a,c,g or
t;n(28)=a,c,g or t;n(29)=g or t;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a,c,g or
t;n(32)=g or t;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a,c,g or t;n(35)=g or t;
<400> 11
accttgatgc tagtgattac actnnnnnnn nnnnntggtt agttactgct gctttattag 60
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(37)
<223> n(26)=a or c;n(27)=a,c,g or t;n(28)=a,c,g or t;n(29)=a or
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t;
<400> 12
ctaataaagc agcagtaact aaccannnnn nnnnnnnagt gtaatcacta gcatcaaggt 60
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
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<400> 13
agtgattaca ctggtgtttc ttttnnnnnn nnnnnngctg ctttattagc atctactgta 60
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
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t;
<400> 14
tacagtagat gctaataaag cagcnnnnnn nnnnnnaaaa gaaacaccag tgtaatcact 60
<210> 15
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
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<400> 15
ggtgtttctt tttggttagt tactnnnnnn nnnnnngcat ctactgtatt tttctttgtt 60
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<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
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t;
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<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(35)
<223> n(24)=a,c,g or t;n(25)=a,c,g or t;n(26)=g or t;n(27)=a,c,g or
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<400> 17
ggttagttac tgctgcttta ttannnnnnn nnnnnttttt ctttgttgaa agagatagag 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(37)
<223> n(26)=a or c;n(27)=a,c,g or t;n(28)=a,c,g or t;n(29)=a or
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t;
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ctctatctct ttcaacaaag aaaaannnnn nnnnnnntaa taaagcagca gtaactaacc 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
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gctgctttat tagcatctac tgtannnnnn nnnnnngaaa gagatagagt ttctgcaaaa 60
<210> 20
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
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t;
<400> 20
ttttgcagaa actctatctc tttcnnnnnn nnnnnntaca gtagatgcta ataaagcagc 60
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
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<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
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t;
<400> 22
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<210> 23
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
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<210> 24
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
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t;
<400> 24
gatacagtta atgatgtttt ccannnnnnn nnnnntctat ctctttcaac aaagaaaaat 60
<210> 25
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
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<400> 25
gaaagagata gagtttctgc aaaannnnnn nnnnnnttaa ctgtatctgg tcttgttact 60
<210> 26
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
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t;
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<210> 27
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
<223> n(25)=a,c,g or t;n(26)=a,c,g or t;n(27)=g or t;n(28)=a,c,g or
t;n(29)=a,c,g or t;n(30)=g or t;n(31)=a,c,g or t;n(32)=a,c,g or
t;n(33)=g or t;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a,c,g or t;n(36)=g or t;
<400> 27
gtttctgcaa aatggaaaac atcannnnnn nnnnnnggtc ttgttactgg tattgctttc 60
<210> 28
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
<223> n(25)=a or c;n(26)=a,c,g or t;n(27)=a,c,g or t;n(28)=a or
c;n(29)=a,c,g or t;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a or c;n(32)=a,c,g or
t;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a or c;n(35)=a,c,g or t;n(36)=a,c,g or
t;
<400> 28
gaaagcaata ccagtaacaa gaccnnnnnn nnnnnntgat gttttccatt ttgcagaaac 60
<210> 29
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<223> n(16)=a,c,g or t;n(17)=a,c,g or t;n(18)=g or t;n(19)=a,c,g or
t;n(20)=a,c,g or t;n(21)=g or t;n(22)=a,c,g or t;n(23)=a,c,g or
t;n(24)=g or t;n(25)=a,c,g or t;n(26)=a,c,g or t;n(27)=g or t;
<220>
<221> misc_feature
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t;n(24)=g or t;n(25)=a,c,g or t;n(26)=a,c,g or t;n(27)=g or t;
<400> 29
aatggaaaac atcattaact gtatctnnnn nnnnnnnngg tattgctttc tggcattaca 60
<210> 30
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(34)
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t;
<400> 30
tgtaatgcca gaaagcaata ccnnnnnnnn nnnnagatac agttaatgat gttttccatt 60
<210> 31
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(37)
<223> n(26)=a,c,g or t;n(27)=a,c,g or t;n(28)=g or t;n(29)=a,c,g or
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t;n(34)=g or t;n(35)=a,c,g or t;n(36)=a,c,g or t;n(37)=g or t;
<400> 31
attaactgta tctggtcttg ttactnnnnn nnnnnnntgg cattacatgt acatgagagg 60
<210> 32
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(35)
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c;n(28)=a,c,g or t;n(29)=a,c,g or t;n(30)=a or c;n(31)=a,c,g or
t;n(32)=a,c,g or t;n(33)=a or c;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a,c,g or
t;
<400> 32
cctctcatgt acatgtaatg ccannnnnnn nnnnnagtaa caagaccaga tacagttaat 60
<210> 33
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
<223> n(25)=a,c,g or t;n(26)=a,c,g or t;n(27)=g or t;n(28)=a,c,g or
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t;n(33)=g or t;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a,c,g or t;n(36)=g or t;
<400> 33
ggtcttgtta ctggtattgc tttcnnnnnn nnnnnntaca tgagaggggt atggattgaa 60
<210> 34
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<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
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t;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a or c;n(35)=a,c,g or t;n(36)=a,c,g or
t;
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ttcaatccat acccctctca tgtannnnnn nnnnnngaaa gcaataccag taacaagacc 60
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
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t;n(33)=g or t;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a,c,g or t;n(36)=g or t;
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ggtattgctt tctggcatta catgnnnnnn nnnnnngtat ggattgaaac tggtgattcg 60
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
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t;
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cgaatcacca gtttcaatcc atacnnnnnn nnnnnncatg taatgccaga aagcaatacc 60
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<212> DNA
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<222> (25)..(36)
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t;n(33)=g or t;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a,c,g or t;n(36)=g or t;
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tggcattaca tgtacatgag agggnnnnnn nnnnnnactg gtgattcgcc aactgtattt 60
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<212> DNA
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t;
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<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
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t;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a or c;n(35)=a,c,g or t;n(36)=a,c,g or
t;
<400> 38
aaatacagtt ggcgaatcac cagtnnnnnn nnnnnnccct ctcatgtaca tgtaatgcca 60
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<212> DNA
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<212> DNA
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<221> misc_feature
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t;
<400> 40
ccaatcaatg tatctaaata cagttggnnn nnnnnnnnnt tcaatccata cccctctcat 60
<210> 41
<211> 60
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
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tatggattga aactggtgat tcgnnnnnnn nnnnnagata cattgattgg ttactaacag 60
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<212> DNA
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<221> misc_feature
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t;
<400> 42
ctgttagtaa ccaatcaatg tatctnnnnn nnnnnnncga atcaccagtt tcaatccata 60
<210> 43
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
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ctggtgattc gccaactgta tttnnnnnnn nnnnntggtt actaacagtt cctctattaa 60
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<212> DNA
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<221> misc_feature
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t;
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ttaatagagg aactgttagt aaccannnnn nnnnnnnaaa tacagttggc gaatcaccag 60
<210> 45
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
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t;n(33)=g or t;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a,c,g or t;n(36)=g or t;
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ccaactgtat ttagatacat tgatnnnnnn nnnnnngttc ctctattaat atgtgaattc 60
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<212> DNA
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<221> misc_feature
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t;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a or c;n(35)=a,c,g or t;n(36)=a,c,g or
t;
<400> 46
gaattcacat attaatagag gaacnnnnnn nnnnnnatca atgtatctaa atacagttgg 60
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
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gatacattga ttggttacta acannnnnnn nnnnnatatg tgaattctac ttaattcttg 60
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t;
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caagaattaa gtagaattca catatnnnnn nnnnnnntgt tagtaaccaa tcaatgtatc 60
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<212> DNA
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attggttact aacagttcct ctattannnn nnnnnnnnta cttaattctt gctgctgcaa 60
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<212> DNA
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<221> misc_feature
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t;
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ttgcagcagc aagaattaag tannnnnnnn nnnntaatag aggaactgtt agtaaccaat 60
<210> 51
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<212> DNA
<213> 人工序列;
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<222> (30)..(41)
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<400> 51
taacagttcc tctattaata tgtgaattcn nnnnnnnnnn ngctgctgca actaatgttg 60
<210> 52
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(31)
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t;n(28)=a,c,g or t;n(29)=a or c;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a,c,g or
t;
<400> 52
caacattagt tgcagcagcn nnnnnnnnnn ngaattcaca tattaataga ggaactgtta 60
<210> 53
<211> 60
<212> DNA
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<222> (28)..(39)
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t;n(36)=g or t;n(37)=a,c,g or t;n(38)=a,c,g or t;n(39)=g or t;
<400> 53
ttaatatgtg aattctactt aattcttnnn nnnnnnnnna atgttgctgg atcattattt 60
<210> 54
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(33)
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t;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a or c;n(32)=a,c,g or t;n(33)=a,c,g or
t;
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aaataatgat ccagcaacat tnnnnnnnnn nnnaagaatt aagtagaatt cacatattaa 60
<210> 55
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<212> DNA
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taattcttgc tgctgcaact nnnnnnnnnn nntcattatt taagaaatta ctagttggtt 60
<210> 56
<211> 60
<212> DNA
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<222> (29)..(40)
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t;
<400> 56
aaccaactag taatttctta aataatgann nnnnnnnnnn agttgcagca gcaagaatta 60
<210> 57
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(32)
<223> n(21)=a,c,g or t;n(22)=a,c,g or t;n(23)=g or t;n(24)=a,c,g or
t;n(25)=a,c,g or t;n(26)=g or t;n(27)=a,c,g or t;n(28)=a,c,g or
t;n(29)=g or t;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a,c,g or t;n(32)=g or t;
<400> 57
ctgcaactaa tgttgctgga nnnnnnnnnn nnaaattact agttggttct cttgttatgc 60
<210> 58
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(40)
<223> n(29)=a or c;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a,c,g or t;n(32)=a or
c;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a or c;n(36)=a,c,g or
t;n(37)=a,c,g or t;n(38)=a or c;n(39)=a,c,g or t;n(40)=a,c,g or
t;
<400> 58
gcataacaag agaaccaact agtaatttnn nnnnnnnnnn tccagcaaca ttagttgcag 60
<210> 59
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(39)
<223> n(28)=a,c,g or t;n(29)=a,c,g or t;n(30)=g or t;n(31)=a,c,g or
t;n(32)=a,c,g or t;n(33)=g or t;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a,c,g or
t;n(36)=g or t;n(37)=a,c,g or t;n(38)=a,c,g or t;n(39)=g or t;
<400> 59
actaatgttg ctggatcatt atttaagnnn nnnnnnnnng gttctcttgt tatgcttgtg 60
<210> 60
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(33)
<223> n(22)=a or c;n(23)=a,c,g or t;n(24)=a,c,g or t;n(25)=a or
c;n(26)=a,c,g or t;n(27)=a,c,g or t;n(28)=a or c;n(29)=a,c,g or
t;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a or c;n(32)=a,c,g or t;n(33)=a,c,g or
t;
<400> 60
cacaagcata acaagagaac cnnnnnnnnn nnncttaaat aatgatccag caacattagt 60
<210> 61
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(40)
<223> n(29)=a,c,g or t;n(30)=a,c,g or t;n(31)=g or t;n(32)=a,c,g or
t;n(33)=a,c,g or t;n(34)=g or t;n(35)=a,c,g or t;n(36)=a,c,g or
t;n(37)=g or t;n(38)=a,c,g or t;n(39)=a,c,g or t;n(40)=g or t;
<400> 61
tggatcatta tttaagaaat tactagttnn nnnnnnnnnn atgcttgtgt ttggttacat 60
<210> 62
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(32)
<223> n(21)=a or c;n(22)=a,c,g or t;n(23)=a,c,g or t;n(24)=a or
c;n(25)=a,c,g or t;n(26)=a,c,g or t;n(27)=a or c;n(28)=a,c,g or
t;n(29)=a,c,g or t;n(30)=a or c;n(31)=a,c,g or t;n(32)=a,c,g or
t;
<400> 62
atgtaaccaa acacaagcat nnnnnnnnnn nnaactagta atttcttaaa taatgatcca 60
<210> 63
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(40)
<223> n(29)=a,c,g or t;n(30)=a,c,g or t;n(31)=g or t;n(32)=a,c,g or
t;n(33)=a,c,g or t;n(34)=g or t;n(35)=a,c,g or t;n(36)=a,c,g or
t;n(37)=g or t;n(38)=a,c,g or t;n(39)=a,c,g or t;n(40)=g or t;
<400> 63
taagaaatta ctagttggtt ctcttgttnn nnnnnnnnnn ggttacatgg gtgaagcagg 60
<210> 64
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(32)
<223> n(21)=a or c;n(22)=a,c,g or t;n(23)=a,c,g or t;n(24)=a or
c;n(25)=a,c,g or t;n(26)=a,c,g or t;n(27)=a or c;n(28)=a,c,g or
t;n(29)=a,c,g or t;n(30)=a or c;n(31)=a,c,g or t;n(30)=a,c,g or
t;
<400> 64
cctgcttcac ccatgtaacc nnnnnnnnnn nnaacaagag aaccaactag taatttctta 60
<210> 65
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(35)
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t;n(28)=a,c,g or t;n(29)=g or t;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a,c,g or
t;n(32)=g or t;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a,c,g or t;n(35)=g or t;
<400> 65
gttctcttgt tatgcttgtg tttnnnnnnn nnnnngaagc aggaatcatg gct 53
<210> 66
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(30)
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t;n(27)=a,c,g or t;n(28)=a or c;n(29)=a,c,g or t;n(30)=a,c,g or
t;
<400> 66
agccatgatt cctgcttcnn nnnnnnnnnn aaacacaagc ataacaagag aac 53
<210> 67
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(30)
<223> n(19)=a,c,g or t;n(20)=a,c,g or t;n(21)=g or t;n(22)=a,c,g or
t;n(23)=a,c,g or t;n(24)=g or t;n(25)=a,c,g or t;n(26)=a,c,g or
t;n(27)=g or t;n(28)=a,c,g or t;n(29)=a,c,g or t;n(30)=g or t;
<400> 67
gtgtttggtt acatgggtnn nnnnnnnnnn atggctgcat ggc 43
<210> 68
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(25)
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t;n(22)=a,c,g or t;n(23)=a or c;n(24)=a,c,g or t;n(25)=a,c,g or
t;
<400> 68
gccatgcagc catnnnnnnn nnnnnaccca tgtaaccaaa cac 43
<210> 69
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
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<400> 69
ggttacatgg gtgaagcagg aatcnnnnnn nnnnnncctg cattcattat tgggtgttta 60
<210> 70
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
<223> n(25)=a or c;n(26)=a,c,g or t;n(27)=a,c,g or t;n(28)=a or
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t;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a or c;n(35)=a,c,g or t;n(36)=a,c,g or
t;
<400> 70
taaacaccca ataatgaatg caggnnnnnn nnnnnngatt cctgcttcac ccatgtaacc 60
<210> 71
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(29)
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<400> 71
gaatcatggc tgcatggnnn nnnnnnnnna ttgggtgttt agcttggg 48
<210> 72
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(31)
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t;n(28)=a,c,g or t;n(29)=a or c;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a,c,g or
t;
<400> 72
cccaagctaa acacccaatn nnnnnnnnnn nccatgcagc catgattc 48
<210> 73
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(32)
<223> n(21)=a,c,g or t;n(22)=a,c,g or t;n(23)=g or t;n(24)=a,c,g or
t;n(25)=a,c,g or t;n(26)=g or t;n(27)=a,c,g or t;n(28)=a,c,g or
t;n(29)=g or t;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a,c,g or t;n(32)=g or t;
<400> 73
ctgcatggcc tgcattcatt nnnnnnnnnn nngcttgggt atacatgatt tatgaattat 60
<210> 74
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(40)
<223> n(29)=a or c;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a,c,g or t;n(32)=a or
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t;n(37)=a,c,g or t;n(38)=a or c;n(39)=a,c,g or t;n(40)=a,c,g or
t;
<400> 74
ataattcata aatcatgtat acccaagcnn nnnnnnnnnn aatgaatgca ggccatgcag 60
<210> 75
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
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t;n(33)=g or t;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a,c,g or t;n(36)=g or t;
<400> 75
cctgcattca ttattgggtg tttannnnnn nnnnnnatga tttatgaatt atgggctgga 60
<210> 76
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
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t;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a or c;n(35)=a,c,g or t;n(36)=a,c,g or
t;
<400> 76
tccagcccat aattcataaa tcatnnnnnn nnnnnntaaa cacccaataa tgaatgcagg 60
<210> 77
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
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t;n(33)=g or t;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a,c,g or t;n(36)=g or t;
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attgggtgtt tagcttgggt atacnnnnnn nnnnnnttat gggctggaga aggaaaatct 60
<210> 78
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
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t;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a or c;n(35)=a,c,g or t;n(36)=a,c,g or
t;
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agattttcct tctccagccc ataannnnnn nnnnnngtat acccaagcta aacacccaat 60
<210> 79
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
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t;n(33)=g or t;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a,c,g or t;n(36)=g or t;
<400> 79
gcttgggtat acatgattta tgaannnnnn nnnnnngaag gaaaatctgc atgtaatact 60
<210> 80
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
<223> n(25)=a or c;n(26)=a,c,g or t;n(27)=a,c,g or t;n(28)=a or
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t;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a or c;n(35)=a,c,g or t;n(36)=a,c,g or
t;
<400> 80
agtattacat gcagattttc cttcnnnnnn nnnnnnttca taaatcatgt atacccaagc 60
<210> 81
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(37)
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t;n(34)=g or t;n(35)=a,c,g or t;n(36)=a,c,g or t;n(37)=g or t;
<400> 81
catgatttat gaattatggg ctggannnnn nnnnnnngca tgtaatactg caagtcctgc 60
<210> 82
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(35)
<223> n(24)=a or c;n(25)=a,c,g or t;n(26)=a,c,g or t;n(27)=a or
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t;n(32)=a,c,g or t;n(33)=a or c;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a,c,g or
t;
<400> 82
gcaggacttg cagtattaca tgcnnnnnnn nnnnntccag cccataattc ataaatcatg 60
<210> 83
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(31)
<223> n(20)=a,c,g or t;n(21)=a,c,g or t;n(22)=g or t;n(23)=a,c,g or
t;n(24)=a,c,g or t;n(25)=g or t;n(26)=a,c,g or t;n(27)=a,c,g or
t;n(28)=g or t;n(29)=a,c,g or t;n(30)=a,c,g or t;n(31)=g or t;
<400> 83
ggctggagaa ggaaaatctn nnnnnnnnnn ngcaagtcct gctgtg 46
<210> 84
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(27)
<223> n(16)=a or c;n(17)=a,c,g or t;n(18)=a,c,g or t;n(19)=a or
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t;n(24)=a,c,g or t;n(25)=a or c;n(26)=a,c,g or t;n(27)=a,c,g or
t;
<400> 84
cacagcagga cttgcnnnnn nnnnnnnaga ttttccttct ccagcc 46
<210> 85
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(37)
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t;n(30)=a,c,g or t;n(31)=g or t;n(32)=a,c,g or t;n(33)=a,c,g or
t;n(34)=g or t;n(35)=a,c,g or t;n(36)=a,c,g or t;n(37)=g or t;
<400> 85
agaaggaaaa tctgcatgta atactnnnnn nnnnnnngtg caatcagctt acaacacaat 60
<210> 86
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(35)
<223> n(24)=a or c;n(25)=a,c,g or t;n(26)=a,c,g or t;n(27)=a or
c;n(28)=a,c,g or t;n(29)=a,c,g or t;n(30)=a or c;n(31)=a,c,g or
t;n(32)=a,c,g or t;n(33)=a or c;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a,c,g or
t;
<400> 86
attgtgttgt aagctgattg cacnnnnnnn nnnnnagtat tacatgcaga ttttccttct 60
<210> 87
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(33)
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t;n(30)=g or t;n(31)=a,c,g or t;n(32)=a,c,g or t;n(33)=g or t;
<400> 87
tgtaatactg caagtcctgc tnnnnnnnnn nnntacaaca caatgatgta tattatcatc 60
<210> 88
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(39)
<223> n(28)=a or c;n(29)=a,c,g or t;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a or
c;n(32)=a,c,g or t;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a or c;n(35)=a,c,g or
t;n(36)=a,c,g or t;n(37)=a or c;n(38)=a,c,g or t;n(39)=a,c,g or
t;
<400> 88
gatgataata tacatcattg tgttgtannn nnnnnnnnna gcaggacttg cagtattaca 60
<210> 89
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(33)
<223> n(22)=a,c,g or t;n(23)=a,c,g or t;n(24)=g or t;n(25)=a,c,g or
t;n(26)=a,c,g or t;n(27)=g or t;n(28)=a,c,g or t;n(29)=a,c,g or
t;n(30)=g or t;n(31)=a,c,g or t;n(32)=a,c,g or t;n(33)=g or t;
<400> 89
agtcctgctg tgcaatcagc tnnnnnnnnn nnnatgtata ttatcatctt tggttgggcg 60
<210> 90
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(39)
<223> n(28)=a or c;n(29)=a,c,g or t;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a or
c;n(32)=a,c,g or t;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a or c;n(35)=a,c,g or
t;n(36)=a,c,g or t;n(37)=a or c;n(38)=a,c,g or t;n(39)=a,c,g or
t;
<400> 90
cgcccaacca aagatgataa tatacatnnn nnnnnnnnna gctgattgca cagcaggact 60
<210> 91
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
<223> n(25)=a,c,g or t;n(26)=a,c,g or t;n(27)=g or t;n(28)=a,c,g or
t;n(29)=a,c,g or t;n(30)=g or t;n(31)=a,c,g or t;n(32)=a,c,g or
t;n(33)=g or t;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a,c,g or t;n(36)=g or t;
<400> 91
gtgcaatcag cttacaacac aatgnnnnnn nnnnnnatct ttggttgggc gatttatcct 60
<210> 92
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
<223> n(25)=a or c;n(26)=a,c,g or t;n(27)=a,c,g or t;n(28)=a or
c;n(29)=a,c,g or t;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a or c;n(32)=a,c,g or
t;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a or c;n(35)=a,c,g or t;n(36)=a,c,g or
t;
<400> 92
aggataaatc gcccaaccaa agatnnnnnn nnnnnncatt gtgttgtaag ctgattgcac 60
<210> 93
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(38)
<223> n(27)=a,c,g or t;n(28)=a,c,g or t;n(29)=g or t;n(30)=a,c,g or
t;n(31)=a,c,g or t;n(32)=g or t;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a,c,g or
t;n(35)=g or t;n(36)=a,c,g or t;n(37)=a,c,g or t;n(38)=g or t;
<400> 93
cttacaacac aatgatgtat attatcnnnn nnnnnnnngc gatttatcct gtaggttatt 60
<210> 94
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(34)
<223> n(23)=a or c;n(24)=a,c,g or t;n(25)=a,c,g or t;n(26)=a or
c;n(27)=a,c,g or t;n(28)=a,c,g or t;n(29)=a or c;n(30)=a,c,g or
t;n(31)=a,c,g or t;n(32)=a or c;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a,c,g or
t;
<400> 94
aataacctac aggataaatc gcnnnnnnnn nnnngataat atacatcatt gtgttgtaag 60
<210> 95
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(37)
<223> n(26)=a,c,g or t;n(27)=a,c,g or t;n(28)=g or t;n(29)=a,c,g or
t;n(30)=a,c,g or t;n(31)=g or t;n(32)=a,c,g or t;n(33)=a,c,g or
t;n(34)=g or t;n(35)=a,c,g or t;n(36)=a,c,g or t;n(37)=g or t;
<400> 95
gatgtatatt atcatctttg gttggnnnnn nnnnnnngta ggttatttca caggttacct 60
<210> 96
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(35)
<223> n(24)=a or c;n(25)=a,c,g or t;n(26)=a,c,g or t;n(27)=a or
c;n(28)=a,c,g or t;n(29)=a,c,g or t;n(30)=a or c;n(30)=a,c,g or
t;n(32)=a,c,g or t;n(33)=a or c;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a,c,g or
t;
<400> 96
aggtaacctg tgaaataacc tacnnnnnnn nnnnnccaac caaagatgat aatatacatc 60
<210> 97
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(30)
<223> n(19)=a,c,g or t;n(20)=a,c,g or t;n(21)=g or t;n(22)=a,c,g or
t;n(23)=a,c,g or t;n(24)=g or t;n(25)=a,c,g or t;n(26)=a,c,g or
t;n(27)=g or t;n(28)=a,c,g or t;n(29)=a,c,g or t;n(30)=g or t;
<400> 97
ggttgggcga tttatcctnn nnnnnnnnnn acaggttacc tgatgggt 48
<210> 98
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(30)
<223> n(19)=a or c;n(20)=a,c,g or t;n(21)=a,c,g or t;n(22)=a or
c;n(23)=a,c,g or t;n(24)=a,c,g or t;n(25)=a or c;n(26)=a,c,g or
t;n(27)=a,c,g or t;n(28)=a or c;n(29)=a,c,g or t;n(30)=a,c,g or
t;
<400> 98
acccatcagg taacctgtnn nnnnnnnnnn aggataaatc gcccaacc 48
<210> 99
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
<223> n(25)=a,c,g or t;n(26)=a,c,g or t;n(27)=g or t;n(28)=a,c,g or
t;n(29)=a,c,g or t;n(30)=g or t;n(31)=a,c,g or t;n(32)=a,c,g or
t;n(33)=g or t;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a,c,g or t;n(36)=g or t;
<400> 99
gcgatttatc ctgtaggtta tttcnnnnnn nnnnnnatgg gtgacggtgg a 51
<210> 100
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(27)
<223> n(16)=a or c;n(17)=a,c,g or t;n(18)=a,c,g or t;n(19)=a or
c;n(20)=a,c,g or t;n(21)=a,c,g or t;n(22)=a or c;n(23)=a,c,g or
t;n(24)=a,c,g or t;n(25)=a or c;n(26)=a,c,g or t;n(27)=a,c,g or
t;
<400> 100
tccaccgtca cccatnnnnn nnnnnnngaa ataacctaca ggataaatcg c 51
<210> 101
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
<223> n(25)=a,c,g or t;n(26)=a,c,g or t;n(27)=g or t;n(28)=a,c,g or
t;n(29)=a,c,g or t;n(30)=g or t;n(31)=a,c,g or t;n(32)=a,c,g or
t;n(33)=g or t;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a,c,g or t;n(36)=g or t;
<400> 101
gtaggttatt tcacaggtta cctgnnnnnn nnnnnnggat cagctcttaa cttaaacctt 60
<210> 102
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
<223> n(25)=a or c;n(26)=a,c,g or t;n(27)=a,c,g or t;n(28)=a or
c;n(29)=a,c,g or t;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a or c;n(32)=a,c,g or
t;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a or c;n(35)=a,c,g or t;n(36)=a,c,g or
t;
<400> 102
aaggtttaag ttaagagctg atccnnnnnn nnnnnncagg taacctgtga aataacctac 60
<210> 103
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(32)
<223> n(21)=a,c,g or t;n(22)=a,c,g or t;n(23)=g or t;n(24)=a,c,g or
t;n(25)=a,c,g or t;n(26)=g or t;n(27)=a,c,g or t;n(28)=a,c,g or
t;n(29)=g or t;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a,c,g or t;n(32)=g or t;
<400> 103
gttacctgat gggtgacggt nnnnnnnnnn nnaacttaaa ccttatctat aaccttgctg 60
<210> 104
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(40)
<223> n(29)=a or c;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a,c,g or t;n(32)=a or
c;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a or c;n(36)=a,c,g or
t;n(37)=a,c,g or t;n(38)=a or c;n(39)=a,c,g or t;n(40)=a,c,g or
t;
<400> 104
cagcaaggtt atagataagg tttaagttnn nnnnnnnnnn accgtcaccc atcaggtaac 60
<210> 105
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(32)
<223> n(21)=a,c,g or t;n(22)=a,c,g or t;n(23)=g or t;n(24)=a,c,g or
t;n(25)=a,c,g or t;n(26)=g or t;n(27)=a,c,g or t;n(28)=a,c,g or
t;n(29)=g or t;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a,c,g or t;n(32)=g or t;
<400> 105
gtgacggtgg atcagctctt nnnnnnnnnn nnatctataa ccttgctgac tttgttaaca 60
<210> 106
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(40)
<223> n(29)=a or c;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a,c,g or t;n(32)=a or
c;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a or c;n(36)=a,c,g or
t;n(37)=a,c,g or t;n(38)=a or c;n(39)=a,c,g or t;n(40)=a,c,g or
t;
<400> 106
tgttaacaaa gtcagcaagg ttatagatnn nnnnnnnnnn aagagctgat ccaccgtcac 60
<210> 107
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
<223> n(25)=a,c,g or t;n(26)=a,c,g or t;n(27)=g or t;n(28)=a,c,g or
t;n(29)=a,c,g or t;n(30)=g or t;n(31)=a,c,g or t;n(32)=a,c,g or
t;n(33)=g or t;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a,c,g or t;n(36)=g or t;
<400> 107
ggatcagctc ttaacttaaa ccttnnnnnn nnnnnngctg actttgttaa caagattcta 60
<210> 108
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
<223> n(25)=a or c;n(26)=a,c,g or t;n(27)=a,c,g or t;n(28)=a or
c;n(29)=a,c,g or t;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a or c;n(32)=a,c,g or
t;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a or c;n(35)=a,c,g or t;n(36)=a,c,g or
t;
<400> 108
tagaatcttg ttaacaaagt cagcnnnnnn nnnnnnaagg tttaagttaa gagctgatcc 60
<210> 109
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
<223> n(25)=a,c,g or t;n(26)=a,c,g or t;n(27)=g or t;n(28)=a,c,g or
t;n(29)=a,c,g or t;n(30)=g or t;n(31)=a,c,g or t;n(32)=a,c,g or
t;n(33)=g or t;n(34)=a,c,g or t;n(35)=a,c,g or t;n(36)=g or t;
<400> 109
aacttaaacc ttatctataa ccttnnnnnn nnnnnnaaca agattctatt tggtttaatt 60
<210> 110
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
<223> n(25)=a or c;n(26)=a,c,g or t;n(27)=a,c,g or t;n(28)=a or
c;n(29)=a,c,g or t;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a or c;n(32)=a,c,g or
t;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a or c;n(35)=a,c,g or t;n(36)=a,c,g or
t;
<400> 110
aattaaacca aatagaatct tgttnnnnnn nnnnnnaagg ttatagataa ggtttaagtt 60
<210> 111
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(28)
<223> n(17)=a,c,g or t;n(18)=a,c,g or t;n(19)=g or t;n(20)=a,c,g or
t;n(21)=a,c,g or t;n(22)=g or t;n(23)=a,c,g or t;n(24)=a,c,g or
t;n(25)=g or t;n(26)=a,c,g or t;n(27)=a,c,g or t;n(28)=g or t;
<400> 111
ccttgctgac tttgttnnnn nnnnnnnntt tggtttaatt atatggaatg tt 52
<210> 112
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列;
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(36)
<223> n(25)=a or c;n(26)=a,c,g or t;n(27)=a,c,g or t;n(28)=a or
c;n(29)=a,c,g or t;n(30)=a,c,g or t;n(31)=a or c;n(32)=a,c,g or
t;n(33)=a,c,g or t;n(34)=a or c;n(35)=a,c,g or t;n(36)=a,c,g or
t;
<400> 112
aacattccat ataattaaac caaannnnnn nnnnnnaaca aagtcagcaa gg 52
Claims (11)
1.一种基因饱和突变库的构建方法，其特征在于，以含有表达目的蛋白的基因的环状双螺旋DNA质粒为模板，采用一对序列完全反向互补的正向突变引物和反向突变引物，通过聚合酶链式反应构建获得基因饱和突变库；
所述正向突变引物和所述反向突变引物的序列中分别含有9个以上连续排列的兼并碱基。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述含有表达目的蛋白的基因的环状双螺旋质粒的长度不小于8kb。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述聚合酶链式反应的循环数不高于18。
4.根据权利要求1至3任一项所述的构建方法，其特征在于，获得所述基因饱和突变库后还包括经DpnI酶消化除去模板后，直接转化到宿主菌进行培养基平板筛选的步骤。
5.根据权利要求1至4任一项所述的构建方法，其特征在于，所述正向突变引物由三部分序列组成：5’-模板序列、兼并碱基序列和3’-模板序列，其中所述兼并碱基序列是以兼并碱基代替了目的基因中待突变的序列，5’-模板序列是目的基因中待突变序列5’端上游的序列，3’-模板序列是目的基因中待突变序列3’端下游的序列；
所述反向突变引物的序列为所述正向突变引物的反向互补序列。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述5’-模板序列和所述3’-模板序列的Tm值相差不高于5℃，所述5’-模板序列和所述3’-模板序列的长度均不低于所述兼并碱基序列。
7.根据权利要求1至6任一项所述的构建方法，其特征在于，所述正向突变引物和所述反向突变引物的序列如SEQ ID No.7～SEQ ID No.112所示。
8.根据权利要求1至7任一项所述的构建方法，其特征在于，所述聚合酶链式反应的体系为：所述环状双螺旋DNA质粒20～100ng、所述正向突变引物100～200nM、所述反向突变引物100～200nM、Q5高保真聚合酶1U、1×Q5反应缓冲液。
9.根据权利要求1至8任一项所述的构建方法，其特征在于，所述聚合酶链式反应的条件为：98℃预变性1～2.5min、以如下条件进行10～18个循环：98℃0.5～1min、退火0.5～2min、72℃延伸15s/kb，最后以72℃再进行2～5min延伸。
10.根据权利要求1至9任一项所述的构建方法获得的基因饱和突变库。
11.根据权利要求10所述的基因饱和突变库在蛋白质功能位点的快速筛选定位和/或高效突变改造中的应用。
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