KR20150140663A - 방향적 진화를 위한 라이브러리의 생산 방법 - Google Patents

방향적 진화를 위한 라이브러리의 생산 방법 Download PDF

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마이클 와이너
마가렛 키스
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악시오엠엑스, 인크.
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Abstract

방향적 진화에 사용될 수 있는 것과 같은 관심 서열의 변이체의 라이브러리를 생성하는 효율적인 방법이 본원에 개시된다. 한 실시양태에서, 방법은 관심 서열의 이중 가닥 DNA (dsDNA) 변이체를 생성하기 위한 증폭 반응, 예를 들어 오류-유발 PCR을 포함하며, 이후에 dsDNA 변이체의 하나의 가닥을 선택적으로 분해하여 단일 가닥 DNA (ssDNA) 변이체를 생산한다. ssDNA 변이체를 ssDNA 중간자, 예를 들어 우라실화 원형 ssDNA 중간자에 혼성화시켜 헤테로듀플렉스 DNA를 형성할 수 있고, 이를 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포 내로 형질전환시켜 변이체의 라이브러리를 생산할 수 있다. 이 방법은 다수의 종래 방법에서 요구되었던 비효율적인 서브클로닝 단계 및 고비용의 프라이머 세트에 대한 필요성을 제거한다.

Description

방향적 진화를 위한 라이브러리의 생산 방법 {METHODS FOR THE PRODUCTION OF LIBRARIES FOR DIRECTED EVOLUTION}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2013년 2월 26일에 출원된 미국 가출원 번호 61/769,517을 우선권 주장하며, 상기 가출원은 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
일반적으로, 본 발명은 개선된 핵산 라이브러리 생산에 관한 것이다.
다양한 유전자 서열의 라이브러리는 특정 기능을 갖는 단백질을 확인하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 다양한 유전자 서열의 라이브러리를 발현시키고, 생성된 단백질을 특정 기능에 대해 시험하고, 잘 작동하는 상기 서열을 단리함으로써 상업적으로 가치있는 기능적 서열을 확인할 수 있다. 이 과정은 방향적 진화로서 언급될 수 있다. 서열은 추가로 다양화 및 선택의 반복적 사이클에 의해 특정한 기능에 대해 최적화될 수 있다. 다양한 서열 풀로부터 선택된 서열은 생물학적, 의학적 또는 산업적 용도에 유용할 수 있다. 예를 들어, 방향적 진화에 의해 확인된 서열은 항체 조작에 사용될 수 있다.
다양한 유전자 서열의 라이브러리를 생성하는 종래 방법은 종종 비효율적이다. 예를 들어, 종래 방법은 비효율적인 라이게이션 단계를 포함하거나 또는 고비용의 프라이머 세트를 요구할 수 있다. 공지된 방법의 속도 및 비용-유효성을 개선하는 것은 라이브러리 생성의 효율을 증가시키고, 다중 기능적 서열의 고처리량 병렬 프로세싱을 가능하게 하고, 새로운 기능적 서열의 확인을 촉진할 것이다.
본 발명은 관심 서열의 변이체의 라이브러리를 생성하는 방법을 포함한다. 방법은 먼저 관심 서열을 포함하는 주형 DNA 분자를 제공하는 단계 및 한 쌍의 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나는 보호될 수 있고, 다른 올리고뉴클레오티드는 비-보호될 수 있고, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 관심 서열의 대향하는 가닥에 혼성화되고 관심 서열에 플랭킹되는 것인 단계를 포함할 수 있다. 후속 단계는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 주형 DNA 분자에 대한 증폭 반응을 수행함으로써 dsDNA 변이체 집단을 생성하는 단계, 이어서 dsDNA 변이체의 보호된 가닥에 비해 비-보호된 가닥을 선택적으로 분해할 수 있는 효소와 함께 dsDNA 변이체 집단을 인큐베이션함으로써 ssDNA 변이체 집단을 생산하는 것을 포함할 수 있다. 다음에, 관심 서열 또는 그의 단편과 실질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있는 ssDNA 중간자에 ssDNA 변이체 집단을 혼성화시킴으로써 헤테로듀플렉스 DNA를 생성할 수 있다. 헤테로듀플렉스 DNA의 생성 후에, 후속 단계는 헤테로듀플렉스 DNA를 세포 내로 형질전환시킴으로써 관심 서열의 변이체의 라이브러리를 생성하는 것을 포함할 수 있다.
주형 DNA 분자는 선형 dsDNA 분자, 원형 dsDNA 분자, 원형 ssDNA 분자, 우라실화 원형 ssDNA 분자 또는 메틸화 원형 ssDNA 분자일 수 있다. 주형 DNA 분자의 서열은 ssDNA 중간자의 서열과 실질적으로 동일할 수 있다.
관심 서열은 100개 초과의 염기쌍, 300개 초과, 500개 초과 또는 700개 초과의 염기쌍일 수 있다. 관심 서열은 100 내지 2000개 염기쌍, 300 내지 1500개 염기쌍 또는 700 내지 1200개 염기쌍일 수 있다.
일부 실시양태에서, 보호된 올리고뉴클레오티드는 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 보호된 올리고뉴클레오티드는 3, 4 또는 5개의 5' 포스포로티오에이트를 포함할 수 있다. 비-보호된 올리고뉴클레오티드는 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 포함하지 않는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 보호된 가닥에 비해 비-보호된 가닥을 선택적으로 분해할 수 있는 효소는 T7 엑소뉴클레아제 또는 람다 엑소뉴클레아제일 수 있다. 다른 실시양태에서, 보호된 올리고뉴클레오티드는 5' 포스페이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드일 수 있고, 비-보호된 올리고뉴클레오티드는 5' 포스페이트를 포함하지 않는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 보호된 가닥에 비해 비-보호된 가닥을 선택적으로 분해할 수 있는 효소는 람다 엑소뉴클레아제일 수 있다.
다양한 실시양태에서, 증폭 반응은 PCR 반응, 오류-유발 PCR 반응, 등온 증폭 반응 또는 롤링 서클 증폭 반응일 수 있다. 일부 실시양태에서, dsDNA 변이체 집단 중 50%의 dsDNA 변이체는 관심 서열과 99.5% 미만의 동일성 또는 관심 서열과 98% 미만의 동일성을 갖는다.
임의의 상기 실시양태는 보호된 가닥에 비해 비-보호된 가닥을 선택적으로 분해할 수 있는 효소와 함께 인큐베이션하기 전에 dsDNA 변이체 집단을 정제하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 상기 실시양태는 ssDNA 중간자에 혼성화시키기 전에 ssDNA 변이체 집단을 정제하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 실시양태에서, ssDNA 중간자는 관심 서열 또는 그의 단편에 대해 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 90% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. ssDNA 중간자는 파지미드이거나 또는 파지미드의 서열과 실질적으로 동일한 서열 단편을 포함하는 벡터일 수 있다.
임의의 상기 실시양태에서, ssDNA 중간자에 ssDNA 변이체 집단을 혼성화시키는 것은 ssDNA 변이체 집단 및 ssDNA 중간자를 변성 온도에서 공동-인큐베이션한 후에 어닐링 온도로 점진적 냉각시키는 것을 포함할 수 있다. 변성 온도는 약 90℃일 수 있다. 어닐링 온도는 약 55℃일 수 있다. 점진적 냉각은 분당 약 -1℃의 속도로 일어난다.
본 발명의 세포는 진핵 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 효모 세포 또는 박테리아 세포일 수 있다.
임의의 상기 실시양태에서, ssDNA 중간자는 변형된 핵염기를 포함할 수 있거나 또는 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티민 이외의 핵염기를 포함할 수 있다. 세포는 ssDNA 중간자를 선택적으로 분해할 수 있다. 일부 특정한 실시양태에서, ssDNA 중간자는 우라실화 ssDNA 중간자일 수 있다. 다른 특정한 실시양태에서, ssDNA 중간자는 메틸화 ssDNA 중간자일 수 있다. 특정 실시양태에서, ssDNA 중간자를 선택적으로 분해할 수 있는 세포는 Ung+ 박테리아 세포 또는 TG1 이. 콜라이(E. coli) 세포일 수 있다. 다른 실시양태에서, ssDNA 중간자를 선택적으로 분해할 수 있는 세포는 Mcr+ 박테리아 세포일 수 있다.
추가 실시양태는 ssDNA 중간자에 혼성화된 ssDNA 변이체를 헤테로듀플렉스 DNA와 DNA 폴리머라제의 인큐베이션에 의해 연장시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 헤테로듀플렉스 DNA와 DNA 폴리머라제의 인큐베이션은 헤테로듀플렉스 DNA와 DNA 폴리머라제 및 DNA 리가제의 인큐베이션을 포함할 수 있다. ssDNA 중간자는 메틸화 ssDNA 중간자일 수 있고, 방법은 헤테로듀플렉스 DNA를 변성시키는 단계 및 변성된 산물을 메틸화 DNA를 선택적으로 분해하는 효소와 함께 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 메틸화 ssDNA 중간자는 메틸화 아데닌 핵염기를 포함할 수 있고, 메틸화 DNA를 선택적으로 분해하는 효소는 DpnI일 수 있다. 일부 실시양태에서, ssDNA 변이체는 메틸화될 수 있고, ssDNA 중간자는 메틸화되지 않을 수 있고, 방법은 헤테로듀플렉스 DNA를 변성시키는 단계 및 변성된 산물을 비-메틸화 DNA를 선택적으로 분해하는 효소와 함께 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 메틸화 ssDNA 변이체는 메틸화 시토신 또는 구아닌 핵염기를 포함하고, 비-메틸화 DNA를 선택적으로 분해하는 상기 효소는 DNA 서열 5'-GATC-3'를 인식하는 제한 효소 또는 Sau3AI일 수 있다.
임의의 상기 실시양태에서, 방법은 헤테로듀플렉스 DNA를 세포 내로 형질전환시키기 전에 정제하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 헤테로듀플렉스 DNA를 세포 내로 형질전환시키는 것은 세포의 2개 이상, 10개 이상, 20개 이상 또는 50개 이상의 분취물의 독립적 형질전환을 포함할 수 있다. 변이체의 라이브러리의 1개 이상의 분취물을 배양하여 배양된 라이브러리를 생성할 수 있다. 분취물을 회복 배지에서 배양할 수 있다. 변이체의 라이브러리의 1개 이상의 분취물을 독립적으로 배양할 수 있거나 또는 단일 배양으로 합할 수 있다. 배양된 라이브러리를 펠릿화하여 펠릿화된 배양된 라이브러리를 생성할 수 있다. 펠릿화된 배양된 라이브러리를 -20℃ 이하의 온도에서 저장할 수 있다. 펠릿화된 배양된 라이브러리를 재현탁시켜 재현탁된 펠릿화된 배양된 라이브러리를 생성할 수 있다. 재현탁된 펠릿화된 배양된 라이브러리를 -20℃ 이하의 온도에서 저장할 수 있다. 배양된 라이브러리의 1개 이상의 분취물을 헬퍼 파지와 함께 인큐베이션하여 파지 디스플레이 라이브러리를 생성할 수 있다. 배양된 라이브러리의 1개 이상의 분취물을 헬퍼 파지와 함께 독립적으로 인큐베이션할 수 있거나 또는 헬퍼 파지와의 인큐베이션을 위해 합할 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 펠릿화하여 펠릿화된 파지 디스플레이 라이브러리를 생성할 수 있다. 펠릿화된 파지 디스플레이 라이브러리를 -20℃ 이하의 온도에서 저장할 수 있다. 펠릿화된 파지 디스플레이 라이브러리를 재현탁시켜 재현탁된 펠릿화된 파지 디스플레이 라이브러리를 생성할 수 있다. 재현탁된 펠릿화된 파지 디스플레이 라이브러리를 -20℃ 이하의 온도에서 저장할 수 있다. 배양된 라이브러리를 희석하거나 또는 연속 희석하여 희석 또는 연속 희석된 배양된 라이브러리를 생성할 수 있다. 희석 또는 연속 희석된 배양된 라이브러리를 배양 플레이트에 플레이팅하여, 배양 플레이트가 세포 성장 또는 분할에 도움이 되는 온도에서 배양될 수 있도록 하였다.
임의의 상기 실시양태에서, 관심 서열은 항체 또는 그의 도메인 또는 단편, 폴리머라제 또는 그의 도메인 또는 단편, 효소 또는 그의 도메인 또는 단편, 단일 쇄 가변 단편 항체 또는 그의 도메인 또는 단편, 키나제 또는 그의 도메인 또는 단편, DNA 결합 단백질 또는 그의 도메인 또는 단편, RNA 결합 단백질 또는 그의 도메인 또는 단편, 전사 인자 또는 그의 도메인 또는 단편, 또는 인간 단백질 또는 그의 도메인 또는 단편을 코딩할 수 있다. 관심 서열 또는 ssDNA 중간자의 서열은 박테리오파지 코트 단백질을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 형질전환된 세포 중 적어도 30%, 적어도 50% 또는 적어도 70%는 관심 서열의 변이체를 포함할 수 있다.
임의의 상기 실시양태에서, 관심 서열을 포함하는 주형 DNA 분자를 제공하는 단계, 한 쌍의 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계, 올리고뉴클레오티드를 사용하여 주형 DNA 분자에 대한 증폭 반응을 수행하는 단계, 및 생성된 dsDNA 변이체 집단을 dsDNA 변이체의 보호된 가닥에 비해 비-보호된 가닥을 선택적으로 분해할 수 있는 효소와 함께 인큐베이션하는 단계를 2개 이상의 상이한 관심 서열 각각으로부터 병행 수행하여 2개 이상의 ssDNA 변이체 집단을 생산할 수 있으며, 상기 올리고뉴클레오티드, 증폭 반응 및 효소는 2개 이상의 상이한 관심 서열 각각에 대한 임의의 또는 모든 단계의 적용에 있어서 상이할 수 있다. ssDNA 변이체 집단을 후속 ssDNA 중간자에의 혼성화 전에 또는 그 동안에 혼합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 상이한 관심 서열 중 적어도 2개를 단일 주형 DNA 분자로부터 증폭시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 2개 이상의 상이한 관심 서열 모두를 단일 주형 DNA 분자로부터 증폭시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 상이한 관심 서열 중 적어도 2개를 상이한 주형 DNA 분자로부터 증폭시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 2개 이상의 상이한 관심 서열 각각을 상이한 주형 DNA 분자로부터 증폭시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 병행 수행한 단계 중 하나 이상을 2개 이상의 상이한 관심 서열 중 적어도 2개에 대해 단일 반응으로 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 병행 수행한 단계 중 하나 이상을 2개 이상의 상이한 관심 서열 모두에 대해 단일 반응으로 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 병행 수행한 단계 중 하나 이상을 2개 이상의 상이한 관심 서열 중 적어도 2개 또는 2개 이상의 상이한 관심 서열 각각에 대해 개별적으로 수행할 수 있다. 특정한 실시양태에서, ssDNA 중간자는 2개 이상의 상이한 관심 서열 각각 또는 그의 단편과 실질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있으며, 상기 혼성화는 2개 이상의 ssDNA 변이체 집단을 ssDNA 중간자에 혼성화시키는 것을 포괄한다. 특정 실시양태에서, 2개 이상의 ssDNA 변이체 집단을 ssDNA 중간자에 동시에 또는 순차적으로 혼성화시킬 수 있다.
오류-유발 PCR에 의해 dsDNA 변이체 집단을 생성하는 방법은 관심 서열을 포함하는 주형 DNA 분자를 제공하는 단계, 한 쌍의 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 관심 서열의 대향하는 가닥에 혼성화되며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나는 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 포함하고 다른 올리고뉴클레오티드는 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 포함하지 않고, 상기 올리고뉴클레오티드는 관심 서열에 플랭킹되는 것인 단계, 및 올리고뉴클레오티드를 사용하여 주형 DNA 분자에 대한 오류-유발 PCR을 수행함으로써 dsDNA 변이체 집단을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
오류-유발 PCR에 의해 ssDNA 변이체 집단을 생성하는 방법은 관심 서열을 포함하는 주형 DNA 분자를 제공하는 단계, 한 쌍의 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 관심 서열의 대향하는 가닥에 혼성화되며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나는 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 포함하고 다른 올리고뉴클레오티드는 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 포함하지 않고, 상기 올리고뉴클레오티드는 관심 서열에 플랭킹되는 것인 단계, 올리고뉴클레오티드를 사용하여 주형 DNA 분자에 대한 오류-유발 PCR을 수행함으로써 dsDNA 변이체 집단을 생성하는 단계, dsDNA 변이체의 포스포로티오에이트 가닥이 아닌 비-포스포로티오에이트 가닥을 가수분해할 수 있는 효소와 함께 dsDNA 변이체 집단을 인큐베이션함으로써 ssDNA 변이체 집단을 생산하는 단계를 포함할 수 있다.
PCR에 의해 dsDNA 분자 집단을 생성하는 방법은 관심 서열을 포함하는 주형 DNA 분자를 제공하는 단계, 한 쌍의 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 관심 서열의 대향하는 가닥에 혼성화되며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나는 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 포함하고 다른 올리고뉴클레오티드는 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 포함하지 않고, 상기 올리고뉴클레오티드는 관심 서열에 플랭킹되는 것인 단계, 올리고뉴클레오티드를 사용하여 주형 DNA 분자에 대한 PCR을 수행함으로써 dsDNA 분자 집단을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
PCR에 의해 ssDNA 분자 집단을 생성하는 방법은 관심 서열을 포함하는 주형 DNA 분자를 제공하는 단계, 한 쌍의 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 관심 서열의 대향하는 가닥에 혼성화되며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나는 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 포함하고 다른 올리고뉴클레오티드는 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 포함하지 않고, 상기 올리고뉴클레오티드는 관심 서열에 플랭킹되는 것인 단계, 올리고뉴클레오티드를 사용하여 주형 DNA 분자에 대한 PCR을 수행함으로써 dsDNA 분자 집단을 생성하는 단계, dsDNA 분자의 포스포로티오에이트 가닥이 아닌 비-포스포로티오에이트 가닥을 가수분해할 수 있는 효소와 함께 dsDNA 분자 집단을 인큐베이션함으로써 ssDNA 분자 집단을 생산하는 단계를 포함할 수 있다.
파지 디스플레이의 방법은 본 발명의 실시양태에 의해 생성된 변이체의 라이브러리를 제공하는 단계, 변이체 라이브러리의 1개 이상의 분취물을 배양하여 배양된 변이체 라이브러리를 생성하는 단계, 배양된 변이체 라이브러리의 1개 이상의 분취물을 헬퍼 파지와 함께 인큐베이션하여 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하며, 여기서 상기 파지 디스플레이 라이브러리의 세포는 관심 서열에 의해 코딩되는 단백질의 변이체를 디스플레이하는 것인 단계, 파지 디스플레이 라이브러리의 세포를 표적 분자에 접촉시키며, 여기서 상기 관심 서열에 의해 코딩되는 단백질의 변이체 중 하나 이상은 표적 분자와 상호작용할 수 있는 것인 단계, 및 파지 디스플레이 라이브러리의 세포 중에서 표적 분자와 상호작용하는 변이체 단백질을 디스플레이하는 세포를 단리하는 단계를 포함할 수 있다. 변이체 단백질은 표적 분자에 결합하거나, 표적 분자를 절단하거나, 표적 분자의 반응을 촉매하거나, 표적 분자 내의 입체형태 변화를 유도하거나, 또는 표적 분자를 변형시킴으로써 표적 분자와 상호작용할 수 있다. 표적 분자는 소분자, 단백질 또는 그의 도메인 또는 단편, 병원체 단백질 또는 그의 도메인 또는 단편, 효소 또는 그의 도메인 또는 단편, 또는 인간 단백질 또는 그의 도메인 또는 단편일 수 있다.
비-재조합 핵산을 선택적으로 분해하는 방법은 제한 부위를 갖는 적어도 하나의 절편을 포함하는 제1 핵산을 제공하는 단계; 제한 부위를 포함하지 않는 적어도 하나의 절편을 포함하는 제2 핵산을 제공하는 단계; 제1 핵산의 절편이 제2 핵산의 절편으로 대체되도록 하는 제1 핵산 및 제2 핵산의 재조합 반응에 제1 핵산 및 제2 핵산을 적용함으로써 제한 부위를 포함하지 않는 재조합 산물을 생성하는 단계; 제한 부위를 절단할 수 있는 제한 효소를 발현하는 세포 내로 반응 산물을 형질전환시키는 단계; 및 세포에 의해 발현된 제한 효소에 의해 절단되도록 하기에 충분한 방식으로 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 세포가 제한 효소에 의해 절단된 제한 부위를 포함하지 않는 재조합 산물을 포함하는지 여부를 결정하는 단계 및/또는 세포로부터 재조합 산물을 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 제한 효소는 Eco29kI일 수 있다. 임의의 이러한 방법에서, 재조합 산물은 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩할 수 있고, 이뮤노글로불린 경쇄 및 이뮤노글로불린 중쇄 중 하나 이상은 제1 핵산의 적어도 일부분 및 제2 핵산의 적어도 일부분에 의해 코딩된다.
비-돌연변이유발 핵산을 선택적으로 분해하는 방법은 제한 부위를 갖는 적어도 하나의 절편을 포함하는 제1 핵산을 제공하는 단계; 제한 부위를 포함하지 않으며 제한 부위를 갖는 제1 핵산의 적어도 하나의 절편에 혼성화될 수 있는 적어도 하나의 절편을 갖는 제2 핵산을 제공하는 단계; 제2 핵산을 제1 핵산에 혼성화시킴으로써 헤테로듀플렉스 DNA를 생성하는 단계; 헤테로듀플렉스 DNA를 해상함으로써 제한 부위를 포함하지 않는 산물을 생성하는 단계; 제한 부위를 절단할 수 있는 제한 효소를 발현하는 세포 내로 반응 산물을 형질전환시키는 단계; 및 세포에 의해 발현된 제한 효소에 의해 절단되도록 하기에 충분한 방식으로 상기 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 세포가 제한 효소에 의해 절단된 제한 부위를 포함하지 않는 산물을 포함하는지 여부를 결정하는 단계 및/또는 세포로부터 산물을 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 제한 효소는 Eco29kI일 수 있다. 임의의 이러한 방법에서, 산물은 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩할 수 있고, 이뮤노글로불린 경쇄 및 이뮤노글로불린 중쇄 중 하나 이상은 제2 핵산의 적어도 일부분 또는 그의 서열에 의해 코딩된다. 임의의 이러한 방법에서, 제1 핵산은 ssDNA 중간자일 수 있고, 제2 핵산은 ssDNA 변이체일 수 있다.
돌연변이유발된 오픈 리딩 프레임으로부터 단백질을 선택적으로 발현시키는 방법은 정지 코돈이 없다면 발현이 가능한 오픈 리딩 프레임의 적어도 하나의 절편에 하나 이상의 정지 코돈을 포함하는 제1 핵산을 제공하는 단계; 정지 코돈을 포함하지 않는 적어도 하나의 절편을 포함하는 제2 핵산을 제공하는 단계; 제1 핵산의 절편이 제2 핵산의 절편으로 대체되도록 하는 제1 핵산 및 제2 핵산의 재조합 반응에 제1 핵산 및 제2 핵산을 적용함으로써 오픈 리딩 프레임에 정지 코돈을 포함하지 않는 재조합 산물을 생성하는 단계; 반응 산물을 세포 내로 형질전환시키는 단계; 및 오픈 리딩 프레임의 발현을 허용하기에 충분한 기간 동안 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 세포가 제1 핵산의 일부분의 서열 및 제2 핵산의 적어도 일부분의 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임으로부터 발현된 단백질 또는 그의 부분을 포함하는지 여부를 결정하는 단계 및/또는 제1 핵산의 일부분의 서열 및 제2 핵산의 적어도 일부분의 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임으로부터 발현된 단백질 또는 그의 단편을 세포로부터 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 임의의 이러한 방법에서, 재조합 산물은 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩할 수 있고, 이뮤노글로불린 경쇄 및 이뮤노글로불린 중쇄 중 하나 이상은 제1 핵산의 적어도 일부분 및 제2 핵산의 적어도 일부분에 의해 코딩된다. 임의의 이러한 방법에서, 재조합 반응은 제1 핵산이 ssDNA 중간자이고 제2 핵산이 ssDNA 변이체인 돌연변이유발 반응일 수 있다.
돌연변이유발된 오픈 리딩 프레임으로부터 단백질을 선택적으로 발현시키는 방법은 정지 코돈이 없다면 발현이 가능한 오픈 리딩 프레임의 적어도 하나의 절편에 하나 이상의 정지 코돈을 포함하는 제1 핵산을 제공하는 단계; 정지 코돈을 포함하지 않으며 정지 코돈 중 하나 이상을 갖는 제1 핵산의 적어도 하나의 절편에 혼성화될 수 있는 적어도 하나의 절편을 포함하는 제2 핵산을 제공하는 단계; 제2 핵산을 제1 핵산에 혼성화시킴으로써 헤테로듀플렉스 DNA를 생성하는 단계; 헤테로듀플렉스 DNA를 해상함으로써 오픈 리딩 프레임에 정지 코돈을 포함하지 않는 산물을 생성하는 단계; 반응 산물을 세포 내로 형질전환시키는 단계; 및 오픈 리딩 프레임의 발현을 허용하기에 충분한 기간 동안 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 세포가 제1 핵산의 일부분의 서열 및 제2 핵산의 적어도 일부분의 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임으로부터 발현된 단백질 또는 그의 부분을 포함하는지 여부를 결정하는 단계 및/또는 제1 핵산의 일부분의 서열 및 제2 핵산의 적어도 일부분의 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임으로부터 발현된 단백질 또는 그의 단편을 세포로부터 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 임의의 이러한 방법에서, 산물은 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩할 수 있고, 이뮤노글로불린 경쇄 및 이뮤노글로불린 중쇄 중 하나 이상은 제2 핵산의 적어도 일부분 또는 그의 서열에 의해 코딩된다. 임의의 이러한 방법에서, 재조합 반응은 제1 핵산이 ssDNA 중간자이고 제2 핵산이 ssDNA 변이체인 돌연변이유발 반응일 수 있다. 조성물이 본 발명의 방법에 의해 생산될 수 있다. 이들은 dsDNA 변이체 집단, ssDNA 변이체 집단, 변이체의 라이브러리, 배양된 라이브러리, 펠릿화된 배양된 라이브러리, 파지 디스플레이 라이브러리, 펠릿화된 파지 디스플레이 라이브러리, 희석된 배양된 라이브러리, 연속 희석된 배양된 라이브러리 및 플레이팅된 연속 희석된 배양된 라이브러리를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "약"은 인용된 값의 +/- 10%를 의미한다.
"실질적으로 동일한"은 참조 핵산 서열과 비교하여 적어도 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 99% 동일성을 갖는 핵산을 의미한다. 서열 동일성은 전형적으로 디폴트 파라미터가 안에 명시된 서열 분석 소프트웨어 (미국 53705 위스콘신주 매디슨 유니버시티 애비뉴 1710 위스콘신 대학교 바이오테크놀로지 센터의 제네틱스 컴퓨터 그룹의 서열 분석 소프트웨어 패키지)를 사용하여 측정된다. 이러한 소프트웨어 프로그램은 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 상동성 정도를 할당함으로써 유사한 서열을 매치한다. 비교 서열의 길이는 일반적으로 적어도 20개 뉴클레오티드 (예를 들어, 60개 뉴클레오티드), 바람직하게는 적어도 90개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 적어도 120개 뉴클레오티드이거나 또는 전장일 것이다. 본원에서 갭은 원래 서열의 핵염기에 동일 또는 유사한 서열의 핵염기 사이에 발견될 수 있는 것으로 이해된다. 갭은 원래 핵산에 동일 또는 유사하지 않은 핵염기를 전혀 포함하지 않을 수 있거나 또는 그러한 핵염기를 하나 이상 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는 2개의 분자가 엄격한 조건하에서 서로 혼성화되는지 여부이다. 엄격한 조건은 서열 의존성이며, 상이한 상황에 따라 다를 것이다. 일반적으로, 엄격한 조건은 한정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 용융점 (Tm)보다 약 5℃ 내지 약 20℃, 통상적으로 약 10℃ 내지 약 15℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 (한정된 이온 강도 및 pH 하에서) 표적 서열의 50%가 매치된 프로브와 혼성화되는 온도이다. 전형적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7에서 약 0.02 몰이고 온도가 적어도 약 60℃인 조건일 것이다. 예를 들어, 표준 서던 혼성화 절차에서, 엄격한 조건은 42℃에서 6x SSC로 초기 세척, 이어서 적어도 약 55℃, 전형적으로 약 60℃ 및 종종 약 65℃의 온도에서 0.2x SSC로 하나 이상의 추가의 세척을 포함할 것이다.
DNA "서열"은 DNA 분자 내의 일련의 핵염기를 의미한다. DNA 분자는 단일 가닥 (ss) 또는 이중 가닥 (ds)일 수 있다. dsDNA 분자의 서열을 언급할 때, 그 용어는 dsDNA 분자의 2개 가닥 중 어느 하나 또는 둘 다의 서열을 언급할 수 있다. ssDNA 분자의 서열을 언급할 때, 그 용어는 ssDNA 분자의 서열, ssDNA 분자에 상보적인 가닥의 서열, 또는 둘 다를 언급할 수 있다.
"관심 서열"은 변이체의 라이브러리를 생성하는데 있어서 출발점으로 사용될 수 있는 DNA 분자 내의 일련의 핵염기를 의미한다.
DNA의 "단편"은 적어도 약 10개의 연속적 핵염기, 예컨대 약 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 또는 4000개 핵염기를 포함하는 서열이다. 단백질의 "단편"은 일련의 적어도 6개 아미노산, 예컨대 약 6, 8, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000개 또는 그 초과의 아미노산을 의미한다.
"관심 서열 변이체"는 관심 서열과 비교하여 하나 이상의 서열 변화를 함유하는, 관심 서열로부터 유래된 서열, 예컨대 증폭 반응을 통해 관심 서열로부터 유래된 서열을 의미한다. 관심 서열 변이체는 상기 관심 서열과 70%-99.9% 동일성, 예컨대 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일성을 가질 수 있다. 변이체는 관심 서열과 실질적으로 동일할 수 있다. 변이체는 단일 가닥 (ss) 또는 이중 가닥 (ds) DNA 분자일 수 있다. dsDNA 변이체는 증폭 반응의 산물일 수 있다. ssDNA 변이체는, 예를 들어 상보적 가닥이 분해되었다면 상보적 가닥으로부터 분리된 dsDNA 변이체의 가닥일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "메가프라이머"는 용어 "ssDNA 변이체"과 상호교환가능하다.
"분해하다"는 효소 또는 화학물질을 사용한 처리에 의해 핵염기를 절단하거나, 제거하거나 또는 대체하는 것에 의해 DNA 분자를 변경하는 것을 의미한다.
"보호된"은 DNA 분자가 동일한 조건 하에서 비-보호된 DNA 분자와 비교하여 보다 서서히 분해된다는 것을 의미한다. 보호된 DNA 분자는 전혀 분해되지 않는 DNA 분자일 수 있다. 보호된 DNA 분자는, 그 DNA 분자의 분해가 비-보호된 DNA 분자의 분해와 비교하여 억제되도록, 변형된 핵염기, 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티민 이외의 핵염기, 또는 포스포디에스테르 결합 이외의 뉴클레오티드간 결합을 포함하는 DNA 분자일 수 있다. 대안적으로, 보호된 DNA 분자는 상기와 같이 변형된 DNA 분자의 분해와 비교하여 DNA 분자의 분해를 증가시킬 수 있는 방식으로 변형되지 않은 DNA 분자일 수 있다.
"선택적 분해"는 제공된 효소가 다른 것보다 더 신속히 일부 DNA 분자를 분해한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 효소는 보호된 가닥에 비해 비-보호된 가닥을 선택적으로 분해할 수 있다. 비-보호된 가닥은, 예를 들어 보호된 가닥이 분해되는 속도보다 적어도 약 20배 더 큰 속도로 선택적으로 분해될 수 있다. 예를 들어, 비-보호된 가닥은 보호된 가닥에 비해 약 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, 90-, 100-, 200-, 300-, 400-, 500-, 600-, 700-, 800-, 900-, 1000-, 2000-, 3000-, 4000-, 5000배 또는 그 초과의 속도로 선택적으로 분해될 수 있다. 일부 경우에서, 효소는 보호된 가닥을 전혀 분해하지 않을 수 있다.
"포스포로티오에이트"는 폴리뉴클레오티드 분자, 예컨대 DNA에서 발견될 수 있는 뉴클레오티드간 결합을 의미한다. 화학적으로, 포스포로티오에이트는 비-가교 산소 중 하나가 산소 원자 대신에 황 원자라는 점에서 포스포디에스테르 결합과 상이하다.
"5' 포스포로티오에이트"는 올리고뉴클레오티드에서, 예를 들어 5' 말단 뉴클레오티드간 결합 위치에 존재하는 포스포로티오에이트를 의미한다. 5' 포스포로티오에이트는 올리고뉴클레오티드의 말단 5' 결합일 수 있거나, 또는 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 5' 말단 결합으로부터 분리될 수 있다. 2개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 갖는 올리고뉴클레오티드에서, 포스포로티오에이트는 5' 말단 뉴클레오티드간 결합 위치를 포함하는 연속적 뉴클레오티드간 결합 위치를 점유할 수 있다. 대안적으로, 포스포로티오에이트는 비연속적 뉴클레오티드간 결합 위치를 점유할 수 있고, 점유된 위치는 5' 말단 뉴클레오티드간 결합 위치를 포함하지 않을 수 있다. 2개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 갖는 올리고뉴클레오티드의 포스포로티오에이트는 연속적, 비연속적, 또는 연속적 및 비연속적 포스포로티오에이트의 혼합물일 수 있다. 2개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 갖는 올리고뉴클레오티드는 2개 이상의 연속적 포스포로티오에이트, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 100개 또는 그 초과의 연속적 포스포로티오에이트를 포함할 수 있거나, 또는 연속적 포스포로티오에이트를 갖지 않을 수 있다. 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 갖는 올리고뉴클레오티드는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 100개 또는 그 초과의 포스포로티오에이트를 포함할 수 있다.
0, 1 또는 2개의 포스포로티오에이트를 갖는 올리고뉴클레오티드는 "비-포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드"이다. 3개 이상의 포스포로티오에이트를 갖는 올리고뉴클레오티드는 "포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드"이다.
한 쌍의 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드가 혼성화될 수 있는 서열이 주형 DNA 분자의 대향하는 가닥에서 발견되어 올리고뉴클레오티드가 이러한 혼성화 서열에 대해 정렬되고 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 서로를 향하며 관심 서열이 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 사이에 속하도록 하는 경우에 주형 DNA 분자 내의 관심 서열에 "플랭킹된다"고 언급될 것이다.
"증폭 반응"은 관심 서열의 카피를 생성하는 임의의 반응을 의미한다. 카피는 관심 서열의 완벽한 카피 또는 관심 서열의 변이체일 수 있다. 증폭 반응의 충실도는 이용된 폴리머라제, 뉴클레오티드, 완충제 및 사이클링 조건과 같은 인자, 뿐만 아니라 다른 인자에 좌우된다. 관련 기술분야에 공지된 증폭 반응은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 및 오류-유발 PCR을 포함한다. 증폭 반응은 2개 이상의 올리고뉴클레오티드, 예컨대 보호된 올리고뉴클레오티드 및 비-보호된 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 및 비-포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행될 수 있다.
본원에 사용된 "보호된 가닥"은 보호된 올리고뉴클레오티드로부터 프라이밍되는 연장에 의해 증폭 반응에서 생산되는 DNA 분자를 의미한다.
본원에 사용된 "비-보호된 가닥"은 비-보호된 올리고뉴클레오티드로부터 프라이밍되는 연장에 의해 증폭 반응에서 생산되는 DNA 분자를 의미한다.
본원에 사용된 "포스포로티오에이트 가닥"은 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 갖는 DNA 분자를 의미한다.
본원에 사용된 "비-포스포로티오에이트 가닥"은 3개 미만의 5' 포스포로티오에이트를 갖는 DNA 분자를 의미한다.
"ssDNA 중간자"는 ssDNA 변이체가 혼성화될 수 있는 ssDNA 분자를 의미한다. ssDNA 중간자는 형질전환을 위한 벡터일 수 있다. 예를 들어, ssDNA 중간자는 파지미드일 수 있다.
"헤테로듀플렉스 DNA"는 ssDNA 중간자에 혼성화된 ssDNA 변이체로 구성된 분자 집단, 또는 세포 내로의 형질전환 전에 연장, 변성 또는 가닥-특이적 소화와 같은 후속 프로세싱 단계를 통해 상기 분자 집단으로부터 유래된 조성물을 의미한다. "헤테로듀플렉스 DNA 분자"는 ssDNA 중간자에 혼성화된 ssDNA 변이체, 또는 세포 내로의 형질전환 전에 연장, 변성 또는 가닥-특이적 소화와 같은 후속 프로세싱 단계를 통해 상기 분자로부터 유래된 산물을 의미한다.
"정제"는 출발 물질로부터 약 20% 내지 100%의 목적 산물, 예컨대 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 목적 산물을 분리하는 것을 의미한다.
도 1은 본 발명의 방법의 예의 다이어그램이다. 관심 재조합 항체 서열을 오류-유발 PCR 조건 하에서 증폭시킨다. 생성된 dsDNA 변이체를 T7 엑소뉴클레아제로 처리하여 dsDNA 분자의 하나의 가닥을 선택적으로 분해함으로써 ssDNA 변이체 또는 메가프라이머를 생성한다. 이러한 ssDNA 변이체 (메가프라이머)를 우라실화 원형 단일 가닥 파지미드에 어닐링하고, 이를 사용하여 DNA 폴리머라제에 의해 시험관내 합성을 프라이밍한다. 라이게이션된 헤테로듀플렉스 산물을, DNA로부터 우라실을 제거할 수 있으며 ssDNA 변이체를 함유하는 새로 합성된 재조합 가닥에 유리하게 DNA를 복구할 수 있는 이. 콜라이 균주로 내로 형질전환시킨다.
도 2는 dsDNA 오류-유발 PCR 산물의 ssDNA 분자로의 전환을 제시하는, SYBR 골드로 염색된 천연 아크릴아미드 겔이다. 제1 레인은 래더를 함유한다. 비처리 dsDNA 오류-유발 PCR 산물은 래더 다음의 처음 5개의 레인에 제시되어 있다. T7 엑소뉴클레아제를 마지막 5개의 레인에서 오류-유발 PCR 산물에 첨가하였다. 오류-유발 PCR 산물은 각 레인 상에 표지된 바와 같이, 비변형 정방향 프라이머 및 비변형되거나 또는 1, 2, 3 또는 4개의 5'-포스포로티오에이트로 변형된 인산화 역방향 프라이머를 사용하여 생성하였다. 이 겔 분석에서 볼 수 있는 바와 같이, 적어도 3개의 5' 포스포로티오에이트는 T7 효소의 엑소뉴클레아제 활성으로부터 가닥을 보호하는데 필요하다.
도 3은 ssDNA의 헤테로듀플렉스 DNA로의 전환을 제시하는 아가로스 겔 전기영동이다. ssDNA 분자를 우라실화 원형 ssDNA 분자에 혼성화하여 헤테로듀플렉스를 형성하였다. 레인 M은 2 로그 DNA 래더 (뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))이다. 레인 1, 2 및 3은 각각 우라실화 원형 ssDNA (pAX143) 단독, 3:1 비의 ssDNA 변이체 대 우라실화 원형 ssDNA 중간자로 형성된 헤테로듀플렉스, 및 10:1 비의 ssDNA 변이체 대 우라실화 원형 ssDNA 중간자로 형성된 헤테로듀플렉스이다. Y-축 표지는 우라실화 원형 ssDNA (pAX143) 단독 (ssDNA) 및 헤테로듀플렉스 DNA (hetDNA)의 밴드를 나타낸다.
도 4는 scFv 구축물을 제시하는 한 쌍의 다이어그램이다. 상부 구축물은 ssDNA 중간자 서열을 나타낸다. 하부 구축물은 주형 DNA 분자를 나타낸다.
도 5는 이뮤노글로불린의 발현을 위해 동일한 세포로 전달될 별개의 벡터 내로 중쇄 및 경쇄 가변 서열을 클로닝하는 것을 제시하는 다이어그램이다.
도 6은 중쇄 서열 및 경쇄 서열이, 예를 들어 비-시스트론 발현을 위해 삽입될 수 있는 벡터를 제시하는 다이어그램이다.
도 7은 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 서열의 돌연변이유발 및 후속적으로 Eco29kI를 갖는 TG1 세포 내로의 형질전환을 제시하는 다이어그램이다.
도 8은 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 도메인의 돌연변이유발을 제시하는 다이어그램이다.
다양한 유전자 서열의 라이브러리로부터 기능적 서열을 단리하는 과정은 방향적 진화로서 언급될 수 있다. 유전자 서열의 크고 다양한 라이브러리를 생산하는 효율적인 방법이 이 과정의 중요한 단계이다. 이러한 라이브러리는 관심 서열 변이체의 집단일 수 있다. 본 발명은 방향적 진화에 사용될 수 있는 것과 같은, 관심 서열의 변이체의 라이브러리를 생성하는 효율적인 방법에 관한 것이다. 하기에 상세히 기재된 바와 같이, 방법은 관심 서열의 이중 가닥 DNA (dsDNA) 변이체를 생성하기 위한 증폭 반응, 예를 들어 오류-유발 PCR을 포함할 수 있으며, 그 후에 dsDNA 변이체의 하나의 가닥을 선택적으로 분해하여 단일 가닥 DNA (ssDNA) 변이체를 생산할 수 있다. ssDNA 변이체를 ssDNA 중간자, 예를 들어 우라실화 원형 ssDNA 중간자에 혼성화시켜 헤테로듀플렉스 DNA를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 헤테로듀플렉스 DNA는 주형으로서 ssDNA 중간자를 사용하여 ssDNA 변이체를 연장시키기 위해 DNA 폴리머라제와 함께 인큐베이션한다. 헤테로듀플렉스 DNA를 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포 내로 형질전환시켜 변이체의 라이브러리를 생산할 수 있다. 이 방법은 다수의 종래 방법에서 요구되었던 비효율적인 서브클로닝 단계 및 고비용의 프라이머 세트에 대한 필요성을 제거한다.
관심 서열
본 방법은 또한 관심 서열의 변이체의 라이브러리에 관한 것이다. 관심 서열은 무작위 서열, 공지된 기능이 없는 서열 또는 단백질을 코딩하는 서열일 수 있다. 관심 서열은 효소 또는 그의 도메인 또는 단편, 키나제 또는 그의 도메인 또는 단편, 전사 인자 또는 그의 도메인 또는 단편, DNA 결합 단백질 또는 그의 도메인 또는 단편, RNA 결합 단백질 또는 그의 도메인 또는 단편, 항체 또는 그의 도메인 또는 단편, 폴리머라제 또는 그의 도메인 또는 단편, 또는 인간 단백질 또는 그의 도메인 또는 단편을 코딩할 수 있다.
증폭 반응
본 방법에서, dsDNA 변이체는 주형 DNA 분자로부터 증폭될 수 있다. 주형 DNA 분자는 관심 서열을 포함하는 분자이다. 주형 DNA 분자는 ssDNA 분자, dsDNA 분자, 원형 ssDNA 분자, 원형 dsDNA 분자, 우라실화 원형 ssDNA 분자 또는 우라실화 원형 dsDNA 분자일 수 있다. 주형 DNA 분자는 PCR 산물, 플라스미드, 파지미드, 파지-패키징된 DNA 분자 또는 단리된 DNA 분자일 수 있다.
본 방법에서, 관심 서열은 한 쌍의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시킬 수 있으며, 이 중 하나의 올리고뉴클레오티드는 보호된 올리고뉴클레오티드이고 다른 것은 비-보호된 올리고뉴클레오티드이다. 관심 서열은 증폭 반응, 예컨대 PCR, 오류-유발 PCR, 등온 증폭 또는 롤링 서클 증폭에 의해 상기 올리고뉴클레오티드 쌍을 사용하여 증폭시킬 수 있다.
다양한 증폭 방법은 앰플리콘의 서열이 주형 관심 서열의 서열과 상이한 서열 변화를 유도할 수 있다. 특정 PCR 방법은 뉴클레오티드 오혼입을 촉진한다. 오류-유발 PCR은 이러한 방법의 예이다. 오류-유발 PCR은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 오류-유발 PCR은 전형적으로, 주형 서열로부터 증폭된 서열 내에 돌연변이가 도입되는 비율을 증가시키는 변형된 형태의 표준 PCR이다. PCR의 돌연변이 비율을 증가시키는 방법은 MgCl2의 농도를 증가시키거나, MnCl2의 농도를 증가시키거나, 아니면 2가 양이온의 이용률을 변경시키거나, PCR 반응에 불균등한 비율의 각각의 뉴클레오티드를 포함시키거나, 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함시키는 것을 포함한다. 오류-유발 PCR의 구체적 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Rasila et al. Analytical Biochemistry, 2009, 388:71-80]은 Taq DNA 폴리머라제 및 돌연변이유발 완충제를 사용하는 오류-유발 PCR을 기재하고, 미국 특허 번호 6803216은 신규 오류-유발 DNA 폴리머라제를 사용하는 PCR 돌연변이유발을 기재한다. 다른 방법이 또한 관련 기술분야에 공지되어 있다.
PCR에서 DNA 폴리머라제의 사용이 항상 특정 정도의 돌연변이를 생성하기 때문에, 표준 PCR 방법이 또한 관심 서열 dsDNA 변이체를 생산하는데 사용될 수 있다. 천연 및 조작 DNA 폴리머라제 둘 다의 고유 오류율은 변한다. 본 발명의 증폭 반응 산물은 관심 서열의 dsDNA 변이체일 수 있다.
올리고뉴클레오티드
본 발명의 증폭 반응은 한 쌍의 올리고뉴클레오티드를 이용할 수 있으며, 여기서 하나의 올리고뉴클레오티드는 보호된 올리고뉴클레오티드이고 다른 것은 비-보호된 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명에 사용된 올리고뉴클레오티드 때문에, 각각의 dsDNA 변이체는 보호된 가닥 및 비-보호된 가닥을 가질 수 있다. 보호된 가닥은 비-보호된 가닥에 비해 선택적으로 분해되어, dsDNA 변이체의 ssDNA 변이체로의 전환을 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 한 예에서, 관심 서열에 플랭킹되는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 및 비-포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 사용하여 주형 DNA 분자로부터 관심 서열을 증폭시킨다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 dsDNA 변이체의 하나의 가닥 내로 (그러나 다른 가닥은 아님) 선택적으로 혼입시키도록 설계된다. 보다 구체적으로, 관심 서열에 상보적인 하나의 올리고뉴클레오티드 (포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드)는 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 갖고, 반면에 관심 서열의 대향하는 가닥에 상보적인 제2 올리고뉴클레오티드 (비-포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드)는 3개 미만의 포스포로티오에이트를 갖는다.
포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 3개 이상의 포스포로티오에이트, 예를 들어 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 100개의 포스포로티오에이트를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 3 내지 100개의 포스포로티오에이트, 보다 바람직하게는 3 내지 20개의 포스포로티오에이트 또는 보다 더 바람직하게는 3 내지 10개의 포스포로티오에이트를 포함한다. 포스포로티오에이트는 연속적일 수 있거나 또는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 전반에 걸쳐 분포될 수 있다. 비-포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 3개 미만의 포스포로티오에이트, 예를 들어 2, 1 또는 0개의 포스포로티오에이트를 포함할 수 있다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 비-포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 길이는 8 내지 200개 염기쌍, 예를 들어 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150 또는 200개 염기쌍일 수 있다.
사용된 올리고뉴클레오티드 때문에, 관심 서열의 각각의 dsDNA 변이체는 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 갖는 가닥 및 3개 미만의 5' 포스포로티오에이트를 갖는 가닥을 포함할 수 있다. 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 갖는 가닥은 3개 미만의 5' 포스포로티오에이트를 갖는 가닥에 비해 분해로부터 보호될 수 있다.
본 발명의 또 다른 예에서, 보호된 올리고뉴클레오티드는 5' 포스페이트를 포함하고, 비-보호된 올리고뉴클레오티드는 5' 포스페이트를 포함하지 않는다. 5' 포스페이트가 결핍되어 있는 비-보호된 가닥은 보호된 가닥보다 더 신속하게 분해되어, ssDNA 변이체의 생산을 위한 수단을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보호된 올리고뉴클레오티드를 제공하는 메카니즘은 비-보호된 올리고뉴클레오티드를 제공하는 상이한 메카니즘과 조합되어 사용될 수 있다.
dsDNA 변이체의 ssDNA 변이체로의 전환
본 발명은 dsDNA 변이체를 ssDNA 변이체로 효율적으로 전환시키기 위해 dsDNA 변이체의 비-보호된 가닥을 선택적으로 분해하는 효소, 화합물 또는 화학물질을 이용한다. 전형적으로, DNA 가수분해는 가닥-특이적이 아니다. 본 발명에서, dsDNA 변이체의 단일 가닥의 선택적 분해가 가능한데 이는 하나의 가닥이 보호된 가닥이고 다른 것이 비-보호된 가닥이기 때문이다.
예를 들어, 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트는 DNA 가닥을 분해로부터 보호할 수 있다. 대조적으로, 0, 1 또는 2개의 포스포로티오에이트를 갖는 가닥은 보호되지 않을 것이다. 보호된 가닥이 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 포함하고 비-보호된 가닥이 3개 미만의 5' 포스포로티오에이트를 포함하는 dsDNA 변이체는 3개 미만의 5' 포스포로티오에이트를 갖는 DNA 가닥을 선택적으로 분해하는 효소에 의해 ssDNA 변이체로 전환될 수 있다.
3개 미만의 5' 포스포로티오에이트를 갖는 가닥을 선택적으로 분해할 수 있는 엑소뉴클레아제의 예는 T7 엑소뉴클레아제 및 람다 엑소뉴클레아제를 포함한다. T7 및 람다 엑소뉴클레아제 둘 다는 5' → 3' 방향으로 이중 가닥 DNA를 가수분해한다. dsDNA 분자의 하나의 가닥이 5' 포스포로티오에이트에 의해 보호되고 대향하는 가닥이 보호되지 않은 경우에, 대향하는 가닥은 T7 또는 람다 엑소뉴클레아제에 의해 선택적으로 분해될 것이다. 보호되지 않은 가닥은 완전히 분해될 수 있다. 선택적 분해는 ssDNA 변이체를 생산한다. 이어서, ssDNA 변이체는 ssDNA 중간자에 혼성화될 수 있다 (예를 들어, 도 1). 또 다른 예에서, 보호된 올리고뉴클레오티드는 5' 포스페이트를 포함하는 뉴클레오티드이고, 반면에 비-보호된 올리고뉴클레오티드는 5' 포스페이트를 포함하지 않는다. 비-보호된 가닥은 보호된 가닥보다 더 신속하게 엑소뉴클레아제에 의해 분해될 수 있다. 람다 엑소뉴클레아제는 5' 포스페이트를 갖는 가닥에 비해 5' 포스페이트가 없는 가닥을 선택적으로 분해할 수 있는 뉴클레아제의 예이다. 보호된 가닥이 5' 포스페이트를 포함하고 비-보호된 가닥이 그를 포함하지 않는 dsDNA 변이체의 처리는 dsDNA 변이체를 ssDNA 변이체로 전환시킬 수 있다.
ssDNA 변이체의 헤테로듀플렉스 DNA 내로의 혼입
관심 서열의 변이체의 라이브러리를 생성하는 것은 세포를 관심 서열의 변이체로 형질전환시키는 것을 요구한다. 이것이 일어나기 위해, ssDNA 변이체는 세포, 예를 들어 이. 콜라이를 성공적으로 형질감염시킬 수 있는 형태로 적응될 수 있다. 본 발명에서, ssDNA 변이체는 ssDNA 중간자에 대한 혼성화에 의해 헤테로듀플렉스 DNA 내로 혼입된다. 일부 실시양태에서, ssDNA 변이체는 혼성화 전에 정제된다. ssDNA 변이체는 ssDNA 변이체가 혼성화될 수 있는 서열을 포함하는 ssDNA 중간자와 함께 인큐베이션된다. 일부 경우에서, 이 서열은 관심 서열과 동일하거나 또는 실질적으로 동일할 것이다. 예를 들어, ssDNA 중간자는 관심 서열에 대해 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함할 수 있다.
ssDNA 중간자는 원형 ssDNA 분자 또는 선형 ssDNA 분자일 수 있다. ssDNA 중간자는 파지미드이거나 또는 파지미드와 동일한 또는 실질적으로 동일한 서열 단편을 포함할 수 있다. ssDNA 중간자는 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술에 의해 파지 디스플레이 목적으로 변형될 수 있으며, 예를 들어 관심 서열의 ssDNA 변이체가 파지 디스플레이에 대해 최적화된 유전자 발현 메카니즘 내로 혼입되도록 변형될 수 있다. ssDNA 중간자는 우라실화 또는 메틸화될 수 있다.
ssDNA 변이체를 ssDNA 중간자에 혼성화시키기 위해, ssDNA 변이체 및 ssDNA 중간자는 혼성화를 허용하는 온도 또는 일련의 온도에서 공동-인큐베이션될 수 있다. 예를 들어, 이들을 변성 온도에서 공동-인큐베이션하고 어닐링 온도로 점진적 냉각시킬 수 있다. 혼성화 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 온도는 약 90℃에서의 변성, 약 55℃에서의 어닐링, 및 분당 약 -1℃로 변성 온도에서 어닐링 온도로의 냉각을 포함할 수 있다.
혼성화된 ssDNA 변이체는, 특정 실시양태에서, DNA 폴리머라제 및 유리 뉴클레오티드의 존재 하에 DNA 연장을 프라이밍할 수 있다. 연장은 DNA 폴리머라제가 활성인 온도에서 연장 반응물의 인큐베이션에 의해 달성될 수 있다. 연장 반응은 임의로 리가제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, ssDNA 중간자는, 예를 들어 우라실화 또는 메틸화되고, 완전한 연장은 ssDNA 중간자의 원래 우라실화 또는 메틸화 가닥과, 혼입된 ssDNA 변이체에 존재하는 변화 또는 차이 및 연장 동안 도입된 임의의 추가의 변화 또는 차이를 제외하고는 ssDNA 중간자와 동일한 서열을 갖는 새로운 비-우라실화 및/또는 비-메틸화 가닥을 포함하는 헤테로듀플렉스 DNA 분자를 생성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 헤테로듀플렉스 DNA는 ssDNA 중간자 가닥을 선택적으로 분해하기 위해, 형질전환 전에 시험관내에서 처리될 수 있다. 이는 헤테로듀플렉스 DNA를 변성시키고, 변성된 헤테로듀플렉스 DNA를 ssDNA 중간자 가닥을 선택적으로 분해할 수 있는 효소, 화합물 또는 화학물질로 처리함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, ssDNA 변이체 가닥이 아닌 ssDNA 중간자 가닥이 변형된 핵염기 또는 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티민 이외의 핵염기를 포함하는 경우에, 특정한 효소는 시험관내에서 ssDNA 중간자를 선택적으로 분해할 수 있다. 한 예에서, ssDNA 중간자 가닥은 메틸화 아데닌 핵염기를 포함하고, 변성된 헤테로듀플렉스 DNA는 메틸화 DNA를 선택적으로 분해하는 효소 DpnI로 처리된다. 대안적으로, ssDNA 변이체 가닥은, ssDNA 중간자 가닥에서 발견되지 않으며 ssDNA 변이체 가닥을 분해로부터 선택적으로 보호하는 변형된 핵염기 또는 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티민 이외의 핵염기를 포함할 수 있다. 한 예에서, ssDNA 중간자 가닥이 아닌 ssDNA 변이체 가닥은 메틸화 핵염기를 포함하고, 변성된 헤테로듀플렉스 DNA는 비-메틸화 DNA를 선택적으로 분해하는 효소 Sau3AI로 처리된다. 한 그룹의 가닥에 존재하는 변형 또는 비정형 염기는 다른 가닥에 완전히 또는 단지 부분적으로 부재할 수 있다.
2개 이상의 ssDNA 변이체 집단으로부터의 ssDNA 변이체의 헤테로듀플렉스 DNA 내로의 혼입
일부 실시양태에서, 단일 관심 서열로부터 유래된 ssDNA 변이체는 ssDNA 중간자에 혼성화될 수 있다. 다른 실시양태에서, 2개 이상의 상이한 관심 서열로부터 유래된 ssDNA 변이체는 ssDNA 중간자에 혼성화될 수 있다. 예를 들어, ssDNA 변이체는 2개 이상의 상이한 관심 서열 각각으로부터 생성된 dsDNA로부터 생성될 수 있다. 임의의 2개의 상이한 관심 서열은 단일 주형 DNA 서열에서 또는 상이한 주형 DNA 서열에서 발견될 수 있다. 이에 따라, dsDNA 변이체의 임의의 2개 이상의 상이한 집단은 단일 주형 DNA 분자로부터 또는 2개 이상의 상이한 주형 DNA 분자로부터 증폭될 수 있다.
보호된 올리고뉴클레오티드 및 비-보호된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단일 쌍의 올리고뉴클레오티드는 2개 이상의 관심 서열을 증폭시킬 수 있다. 대안적으로, 각각의 쌍이 1개 이상의 관심 서열을 증폭시킬 수 있는 2개 이상의 상이한 쌍의 올리고뉴클레오티드는 2개 이상의 관심 서열을 증폭시키는데 사용될 수 있다. 주어진 쌍의 올리고뉴클레오티드의 보호된 올리고뉴클레오티드가 비-보호된 올리고뉴클레오티드에 비해 분해로부터 선택적으로 보호되는 메카니즘은 임의의 두 쌍의 올리고뉴클레오티드에 대해 동일할 수 있거나 또는 임의의 두 쌍의 올리고뉴클레오티드에 대해 상이할 수 있다.
임의의 2개의 관심 서열 각각으로부터의 dsDNA 변이체 집단의 생산은 개별적으로 수행되어, 각각의 관심 서열로부터 생성된 ssDNA 변이체가 물리적으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 임의의 2개의 상이한 관심 서열의 증폭은 별개의 반응 챔버에서 수행될 수 있다. 개별적으로 수행된 임의의 두 증폭 반응은 동일한 유형의 증폭 반응, 예를 들어 둘 다 오류-유발 PCR이거나, 또는 상이한 유형의 반응, 예를 들어 한 반응은 오류-유발 PCR일 수 있고 반면에 다른 것은 PCR 또는 등온 증폭일 수 있다. 대안적으로, 임의의 2개의 관심 서열의 증폭은 단일 반응으로 수행될 수 있다. 유사하게, 임의의 2개 집단의 dsDNA 변이체의 ssDNA 변이체로의 전환은 개별적으로 또는 단일 반응으로 수행될 수 있다. dsDNA 변이체의 전환은 적용가능성이 각각의 증폭 반응에서 이용된 올리고노뉴클레오티드에 의해 결정될 수 있는 선택적 분해의 임의의 메카니즘에 의해 달성될 수 있다
2개 이상의 개별적으로 생성된 ssDNA 변이체 집단은 ssDNA 중간자에의 혼성화 전에 또는 그 동안에 조합될 수 있다. ssDNA 중간자는 각각의 관심 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있다. 단일 서열은 1개 초과의 관심 서열과 실질적으로 동일할 수 있다. 대안적으로, 단일 서열은 단지 1개의 관심 서열과 실질적으로 동일할 수 있다. 임의의 2개의 관심 서열은 ssDNA 중간자의 단일 서열, ssDNA 중간자의 중복 서열, 또는 ssDNA 중간자의 비-중복 서열과 실질적으로 동일할 수 있다. ssDNA 중간자는 단일 관심 서열이 혼성화될 수 있는 다수의 중복 또는 비-중복 서열을 포함할 수 있다. ssDNA 변이체 집단의 ssDNA 중간자에의 혼성화는 동시에 또는 순차적으로 일어날 수 있다. 조합된 ssDNA 변이체 집단은 상기 기재된 방법에 의해 ssDNA 중간자에 혼성화될 수 있고, 생성된 헤테로듀플렉스 DNA는 본 발명의 임의의 혼성화-후 단계, 처리 또는 반응에 이용하기에 적절할 수 있다. 기재된 임의의 단계, 반응 또는 처리는 병행으로 일어날 수 있으며, 이는 상이한 ssDNA 집단이 단일 헤테로듀플렉스 DNA 내로 혼입될 수 있는 방식으로 일어남을 의미한다. 병행으로 일어나는 단계, 반응 또는 처리는 동시에 또는 유사한 기간 내에 일어날 수 있거나 또는 일어날 수 없다. 2개 이상의 ssDNA 변이체 집단을 ssDNA 중간자에 혼성화시키는 방법은 2개 이상의 관심 서열, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20개의 관심 서열로부터의 ssDNA 중간자의 생성을 포함할 수 있다.
2개 이상의 ssDNA 변이체 집단을 ssDNA 중간자에 혼성화시키는 방법의 사용 예는 관심 단백질을 코딩하는 서열 내의 다수의 서열 단편을 변형시키는 것일 수 있다. 예를 들어, 항체는 고정된 프레임워크 및 항체 기능을 결정하는 다수의 비-인접 상보성 결정 영역 (CDR)을 가질 수 있다. 각각의 CDR 또는 그의 단편을 코딩하는 서열은 관심 서열일 수 있다. 본 발명의 방법에서 각각의 CDR 관심 서열로부터 ssDNA 변이체를 생성함으로써, 변이가 서열 변화를 바람직한 영역 (CDR)에서만 가지며 다른 영역 (고정된 프레임워크)에서는 갖지 않는 관심 서열의 변이체의 라이브러리가 생성될 수 있다. 관심 서열의 이러한 변이체는 특정한 기능을 갖는 항체를 확인하기 위한 방향적 진화 방법에 사용될 수 있다.
헤테로듀플렉스 DNA 또는 헤테로듀플렉스 DNA 중간자 가닥의 선택적 시험관내 분해에 의해 생산된 ssDNA 변이체 가닥을 사용한 세포의 형질전환
헤테로듀플렉스 DNA 또는 헤테로듀플렉스 DNA 중간자 가닥의 선택적 시험관내 분해에 의해 생산된 ssDNA 변이체 가닥을 사용한 세포의 형질전환은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 예는 전기천공, 화학적 변환 및 열 쇼크 형질전환을 포함한다. 세포는 선택된 형질전환 방법에 대한 적격성을 최적화하도록 처리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 헤테로듀플렉스 DNA는 형질전환 전에 정제될 수 있다. 형질전환은 1 내지 50개 또는 그 초과의 분취물의 형질전환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 분취물이 형질전환될 수 있다. 형질전환체는 관심 서열의 변이체의 라이브러리이다. 형질전환체는 회복 배지에서 배양될 수 있다. 개별 분취물은 회복 배지에서 합해지거나 또는 개별적으로 배양될 수 있다. 회수 후에, 배양된 형질전환체는 펠릿화될 수 있다. 펠릿화된 형질전환체는 -20℃ 이하의 온도에서 저장될 수 있다. 대안적으로, 펠릿화된 형질전환체는 재현탁될 수 있다. 재현탁된 라이브러리는 헬퍼 파지와 함께 인큐베이션되어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성할 수 있다. 대안적으로 재현탁된 라이브러리의 일부 또는 모든 분취물은 -20℃ 이하의 온도에서 저장될 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리는 펠릿화될 수 있다. 펠릿화된 파지 디스플레이 라이브러리는 -20℃ 이하의 온도에서 저장될 수 있다. 대안적으로, 펠릿화된 파지 디스플레이 라이브러리는 재현탁될 수 있다. 재현탁된 펠릿화된 파지 디스플레이 라이브러리는 -20℃ 이하의 온도에서 저장될 수 있다. 배양된 변이체 라이브러리, 재현탁된 변이체 라이브러리, 파지 디스플레이 라이브러리 또는 재현탁된 파지 디스플레이 라이브러리는 임의로 희석되고 배양 플레이트 상에 플레이팅될 수 있다.
본 발명의 세포는 진핵생물, 예컨대 포유동물, 곤충 또는 효모의 세포, 또는 박테리아, 예컨대 이. 콜라이 또는 비. 서브틸리스(B. subtilis)의 세포일 수 있다. 우라실화 ssDNA 중간자를 이용하는 실시양태는 우라실화 DNA, 예컨대 Ung+ 이. 콜라이를 선택적으로 분해할 수 있는 세포를 형질전환시킬 수 있다. 메틸화 ssDNA 중간자를 이용하는 실시양태는 메틸화 DNA, 예컨대 Mcr+ 박테리아를 선택적으로 분해할 수 있는 세포를 형질전환시킬 수 있다.
미스매치 뉴클레오티드의 해상
헤테로듀플렉스 DNA 또는 헤테로듀플렉스 DNA 중간자 가닥의 선택적 시험관내 분해에 의해 생산된 ssDNA 변이체 가닥은 해상될 수 있으며, 이는 헤테로듀플렉스 DNA 또는 ssDNA 변이체 가닥이 시험관내 또는 생체내 과정에 의해 변형되어 미스매치 뉴클레오티드가 소수이거나 또는 전혀 없는 이중 가닥 벡터를 생성할 수 있음을 의미한다. 해상된 벡터에는, 관심 서열과 비교하여 있다면 하나 이상의 변화 또는 차이가 존재하는 하나 이상의 ssDNA 변이체의 서열이 혼입될 수 있다. 일부 경우에서, 해상된 벡터는, 하나 이상의 ssDNA 변이체가 혼성화되는 헤테로듀플렉스 DNA의 중간자 가닥의 하나 이상의 미스매치된 뉴클레오티드가 변형되어 중간자 가닥의 미스매치 뉴클레오티드가 혼성화된 ssDNA 변이체 가닥에 상보적인 뉴클레오티드로 대체 (즉, 복구)되도록 하는 시험관내 또는 생체내 반응에 의해 형성된다. 복구는 또한, ssDNA 변이체 가닥의 하나 이상의 미스매치된 뉴클레오티드가 변형되어 ssDNA 변이체 가닥의 미스매치 뉴클레오티드가 상기 변이체 가닥이 혼성화되는 중간자 가닥의 절편에 상보적인 뉴클레오티드로 대체되도록 하게 일어날 수 있다.
헤테로듀플렉스 DNA의 중간자 가닥은 ssDNA 변이체 가닥의 서열을 보존하는 (선호하는) 방식으로 복구를 용이하게 하는 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, ssDNA 변이체 가닥은 ssDNA 변이체 가닥의 서열을 선호하는 방식으로 복구를 용이하게 하는 변형을 포함할 수 있다. 특정한 경우에서, 중간자 가닥은 우라실화된다. 더욱 더 특정한 경우에서, DNA는 ung+ 박테리아 세포, 예컨대 ung+ 이. 콜라이 세포 내로 형질전환된다.
다른 경우에서, 헤테로듀플렉스 DNA 중간자 가닥의 선택적 시험관내 분해에 의해 생산된 ssDNA 변이체 가닥은 생체내에서 해상된다. 이러한 해상은, 예를 들어 ssDNA 변이체 가닥에 상보적인 새로운 DNA 가닥의 생성에 의해 일어날 수 있다.
비-재조합 벡터의 생체내 분해
본 발명은 본 발명의 하나 이상 또는 모든 실시양태와 함께 또는 그와 독립적으로 사용하기 위한, 비-재조합 벡터를 분해하는 방법을 포함한다. 비-재조합 벡터의 분해를 포함하는 실시양태에서, 수용자 벡터는 제거되거나, 대체되거나 또는 다르게는 변형될 하나 이상의 절편 내에 하나 이상의 제한 부위를 포함한다. 하나 이상의 절편이, 예를 들어 클로닝에 의해 제거되거나, 대체되거나 또는 다르게는 변형된 후에, 세포-발현된 제한 효소는 중간자 가닥을 선택적으로 분해할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제한 부위 또는 부위들은 SacII 부위이고, 제한 효소는 Eco29kI이다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함된 문헌 [Pertzev et al. Nucleic Acids Res. 1992 April 25; 20(8): 1991]에 기재됨). Eco29kI는 SacII 제한 부위 (CCGCGG)를 절단할 수 있는 SacII 이소스키조머이고, 이는 박테리아 세포, 예를 들어 이. 콜라이에서 발현될 수 있다. SacII 제한 부위의 한 이점은 그것이 A 또는 T 뉴클레오티드를 포함하지 않으므로 본 발명의 다양한 실시양태와 조합하여 dut 및 ung 전략을 최적으로 사용하게 한다는 것이다. 세포는, 예를 들어 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 또는 보다 구체적으로는, 예컨대 TG1 세포일 수 있다. 그 결과, 생성된 벡터가 제한 부위를 포함하지 않도록 각각의 하나 이상의 절편이 변형되거나, 대체되거나 또는 제거되지 않은 벡터는 제한 효소 또는 효소들을 발현하는 세포 내에서 분해될 것이다.
특정한 실시양태에서, 비-재조합 벡터 또는 벡터 가닥의 생체내 분해는 scFv 가변 영역 및 IgG 불변 영역이 이뮤노글로불린의 형태로 배열되도록 하는 이뮤노글로불린의 재조합을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. scFv는 경쇄 가변 도메인, 링커, 중쇄 가변 도메인 및 Gp3 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 IgG 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 핵산은 제한 부위 및 적어도 IgG 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는 절편을 포함한다. IgG 중쇄는 제한 부위를 포함하는 절편을 포함할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 핵산은 별개의 벡터에 존재할 수 있거나, 단일 벡터에 존재할 수 있거나, 또는 비-시스트론 발현 시스템에 배열될 수 있다. 특정한 실시양태에서, scFv 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인은 IgG 경쇄 불변 도메인을 코딩하는 핵산 및 IgG 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 핵산 내로 각각 클로닝되어, 이러한 클로닝이 각각의 제한 부위를 제거하거나 또는 변형하고, IgG 중쇄를 코딩하는 핵산 및 IgG 경쇄를 코딩하는 핵산을 형성시키도록 한다. 상기에 기재된 바와 같이, 이러한 두 구축물은 별개의 벡터 (예를 들어, 단세포 내에서의 발현을 위한) 또는 단일 벡터 (예를 들어, 별개의 발현을 위한 또는 비-시스트론 배열에)에 존재할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 제한 부위는 SacII 제한 부위이다. 특정한 실시양태에서, 생체내 분해는 Eco29kI에 의한다. 특정한 경우에서, 중간자 가닥은 우라실화된다. 더욱 더 특정한 경우에서, DNA는 ung+ 박테리아 세포, 예컨대 ung+ 이. 콜라이 세포 내로 형질전환된다.
본원에 기재되어 있거나, 본원에 기재된 방법에 생성되거나 또는 생성될 수 있는 벡터는 비-박테리아 세포 유형, 예를 들어 CHO 세포 내로의 전달에 적합할 수 있다. 벡터는 하나 이상의 세포 유형, 예를 들어 포유동물 세포, 곤충 세포 및/또는 박테리아 세포 내 벡터에 존재하는 하나 이상의 단백질의 직접적인 발현에 충분한 서열 정보를 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 벡터는 CHO 세포에서 발현시킬 수 있는 IgG 중쇄 및 IgG 경쇄를 포함할 수 있다 (도 8).
ssDNA 중간자 가닥에 유리하게 해상되거나 또는 ssDNA 변이체가 충분히 혼입되지 않은 벡터의 분해
본 발명의 임의의 다양한 실시양태에서, ssDNA 중간자 가닥에 유리하게 해상되거나 또는 ssDNA 변이체가 충분히 혼입되지 않은 벡터를 선택적으로 분해하는 메카니즘이 제공될 수 있다. 특히, ssDNA 중간자 가닥은 하나 이상의 제한 부위 (예를 들어, 제한 효소에 의해 인식되고 절단될 수 있는 서열)를 포함하는 하나 이상의 절편을 포함할 수 있고, 반면에 ssDNA 중간자 가닥 절편에 혼성화될 수 있는 ssDNA 변이체는 그러한 제한 부위를 포함하지 않는다. 따라서, 일반적으로, 제한 부위가 ssDNA 변이체에 유리하게 복구되는 경우에, 해상된 벡터는 그러한 부위를 절단할 수 있는 제한 효소에 의해 분해되지 않을 것이다. 대조적으로, 제한 부위 중 하나 이상이 ssDNA 중간자에 유리하게 복구되는 경우에, 해상된 벡터는 그러한 부위를 절단할 수 있는 제한 효소에 의해 절단되기 쉬울 것이다.
한 예에서, ssDNA 중간자는 특정한 제한 부위의 단일 카피를 포함하고, 제한 부위는 ssDNA 변이체가 혼성화될 수 있는 영역 내에 위치한다. ssDNA 변이체는 제한 부위를 어떤 배향으로도 포함하지 않는다. 따라서, 제한 부위는, 예를 들어 생체내에서 복구될 수 있는 하나 이상의 미스매치된 뉴클레오티드를 포함한다. 제한 부위 미스매치가 ssDNA 변이체에 유리하게 복구되는 경우에, 생성된 벡터는 특정한 제한 효소에 의해 분해되기 쉽지 않을 것이다. 대안적으로, 제한 부위 미스매치가 ssDNA 중간자에 유리하게 복구되는 경우에, 생성된 벡터는 제한 부위를 포함할 것이고, 특정한 효소에 의해 분해되기 쉬울 것이다. 구체적 예에서, ssDNA 중간자는 우라실화된다.
다양한 실시양태에서, ssDNA 변이체는 제한 부위를 포함하지 않는데, 이는 ssDNA 변이체 생성의 기초가 된 주형 분자에 제한 부위가 존재하지 않았기 때문이다. 다른 실시양태에서, ssDNA 변이체는 제한 부위를 포함하지 않는데, 이는 돌연변이유발 사건에 의해 제한 부위가 파괴되었기 때문이다. 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 다양한 실시양태는 2개 이상의 상이한 관심 서열로부터 유래되며 ssDNA 중간자에 혼성화될 수 있는 ssDNA 변이체를 포함할 수 있다. 이러한 경우에서, 각각의 2개 이상의 ssDNA 변이체가 혼성화될 수 있는 ssDNA 중간자의 절편은 각각 제한 부위를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, ssDNA 변이체가 혼성화될 수 있는 각각의 2개 이상의 절편은 동일한 특정한 제한 부위를 포함한다. 다른 실시양태에서, ssDNA 변이체가 혼성화될 수 있는 2개 이상의 절편은 2개 이상의 상이한 제한 부위를 포함한다.
특정 경우에서, 하나 이상의 ssDNA 변이체가 혼성화될 수 있는 ssDNA 중간자의 하나 이상 절편은 각각 단일 제한 부위를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 ssDNA 변이체가 혼성화될 수 있는 ssDNA 중간자의 절편은 2개 이상의 제한 부위를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 해상된 벡터는 단리되고/거나 정제되고, ssDNA 중간자 가닥에 유리하게 해상되거나 또는 ssDNA 변이체가 충분히 혼입되지 않은 벡터를 시험관내에서 분해하는 하나 이상의 제한 효소로 처리된다.
일부 실시양태에서, ssDNA 중간자 가닥에 유리하게 해상되거나 또는 ssDNA 변이체가 충분히 혼입되지 않은 하나 이상의 벡터는 생체내에서 분해된다. 특히, 해상된 벡터는 제한 효소를 발현하는 세포에 존재할 수 있고, 제한 효소가 분해할 수 있는 하나 이상의 제한 부위를 포함할 수 있다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 해상된 벡터는 제한 효소 Eco29kI를 발현하는 세포에 존재할 수 있다. 세포는, 예를 들어 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 예컨대 TG1 세포일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 비-재조합 벡터의 생체내 분해는 이뮤노글로불린 형태로 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 IgG 불변 영역의 ssDNA 변이체의 재조합을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인은, 예를 들어 scFv 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 IgG 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 핵산은 제한 부위를 포함하는 절편을 포함하고, 적어도 IgG 경쇄 불변 도메인을 코딩하는 핵산은 제한 부위를 포함하는 절편을 포함한다. 중쇄 및 경쇄 핵산은 별개의 벡터에 존재할 수 있거나, 단일 벡터에 존재할 수 있거나, 또는 비-시스트론 발현 시스템에 배열될 수 있다 (예를 들어, 도 5-7 참조). 특정한 실시양태에서, 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인은 IgG 경쇄 불변 도메인을 코딩하는 핵산 및 IgG 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 핵산에 각각 혼성화되어, 이러한 혼성화된 벡터의 해상이 각각의 제한 부위를 제거하거나 또는 변형하도록 한다. 이로써 각각 잠재적으로 하나 이상의 ssDNA 변이체가 혼입되는, IgG 중쇄를 코딩하는 핵산 및 IgG 경쇄를 코딩하는 핵산이 형성된다. 상기 기재된 바와 같이, 이러한 두 구축물은 별개의 벡터 (예를 들어, 단세포 내에서의 발현을 위한) 또는 단일 벡터 (예를 들어, 별개의 발현을 위한 또는 비-시스트론 배열에)에 존재할 수 있다. 구축물은, 예를 들어 박테리아 내로 형질전환될 수 있으며, 그 안에서 해상될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 제한 부위는 SacII 제한 부위이다. 특정한 실시양태에서, 생체내 분해는 Eco29kI에 의한 것이고, 박테리아는 Eco29kI 발현 박테리아이다.
본원에 기재되어 있거나, 본원에 기재된 방법에 생성되거나 또는 생성될 수 있는 벡터는 비-박테리아 세포 유형, 예를 들어 CHO 세포 내로의 전달에 적합할 수 있다. 벡터는 하나 이상의 세포 유형 내 벡터에 존재하는 하나 이상의 단백질의 직접적인 발현에 충분한 서열 정보를 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 벡터는 CHO 세포에서 발현시킬 수 있는 IgG 중쇄 및 IgG 경쇄를 포함할 수 있다 (도 8).
ssDNA 중간자 가닥에 유리하게 해상되거나 또는 ssDNA 변이체가 충분히 혼입되지 않은 벡터를 분해하기 위한 상기 방법 및 조성물은 재조합 핵산, 충분히 재조합된 핵산, 또는 다수의 표적화된 유전자좌 각각에서 재조합된 핵산의 회수율을 10% 이상만큼, 예컨대 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 500% 또는 1000% 또는 그 초과만큼 개선할 수 있다.
관심 서열의 변이체의 라이브러리의 크기 및 특성화
본 발명의 방법은 약 1E+05개 초과, 예컨대 약 1E+05, 1E+06, 1E+07, 1E+08, 1E+09, 1E+10, 1E+11 또는 1E+12개 또는 그 초과의 변이체의 총 변이체 수를 갖는 변이체의 라이브러리를 생산할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 형질전환체 중에서, 재조합 형질전환체의 수는 30% 초과, 예컨대 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%일 수 있다. 재조합체 중에서 돌연변이 비율은 적어도 약 0.75%, 예컨대 약 0.75%, 0.8%, 0.85%, 0.9%, 0.95%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5% 또는 3%일 수 있다. 라이브러리의 크기, 재조합체의 백분율 및 재조합체 중에서 돌연변이 비율은 헤테로듀플렉스 DNA 분자의 수, 시도된 형질전환의 수, 형질전환의 방법, 관심 서열을 증폭시키는 방법 및 다른 인자에 좌우될 것이다.
돌연변이유발의 효율의 결정
본 발명의 방법은 관심 서열의 변이체의 라이브러리를 생산하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 돌연변이유발의 효율을 결정하는 것이 유리하다. 돌연변이유발의 효율을 결정하기 위한 메카니즘은 정량적, 반-정량적 또는 정성적일 수 있다.
돌연변이유발의 효율을 결정하는 한 메카니즘에서, 청색/백색 리포터 스크린이 본 발명의 방법과 함께 사용된다. 청색/백색 리포터 스크린에 사용하기 위한 일부 공지된 구축물은 LacZ 유전자를 포함한다. 이러한 실시양태에서, LacZ의 발현은 구성적이거나, 예를 들어 IPTG에 의한 유도성이거나, 또는 예를 들어 억제를 비롯한 다수의 수단에 의해 조절될 수 있다. LacZ 유전자는 세포의 게놈에, 플라스미드에, 본 발명의 헤테로듀플렉스 DNA 분자에, 또는 본 발명의 해상된 벡터에 존재할 수 있다. LacZ 유전자의 발현은 청색 색소를 생성하는 방식으로 X-gal을 절단할 수 있는 효소인 β-갈락토시다제를 생산한다. 충분한 양의 β-갈락토시다제 및 X-gal을 포함하는 세포는 청색일 것이다. 돌연변이유발은 β-갈락토시다제에 의한 X-gal의 절단을 방해할 수 있다. 이것이 일어날 때, 세포는 백색으로 보일 것이다. 추가로, 백색 콜로니의 백분율은 돌연변이유발의 효율의 지표이다. 백색 콜로니의 높은 백분율은 LacZ의 발현 및/또는 β-갈락토시다제에 의한 X-gal의 절단을 방해하기에 충분한 돌연변이가 자주 일어났음을 나타내고, 반면에 백색 콜로니의 낮은 백분율은 이러한 돌연변이가 자주 일어나지 않았음을 나타낸다.
특정 실시양태에서, 백색 콜로니의 백분율은 돌연변이유발의 특정한 빈도와 실험적으로 또는 이론적으로 상관관계가 있을 수 있으며, 이에 의해 백색 콜로니의 백분율은 돌연변이유발의 효율의 추정치를 제공한다.
특정 실시양태에서, 청색/백색 스크린이 적용된 세포는 실험 세포, 예를 들어 특정한 특성을 갖는 변이체를 확인하기 위해 돌연변이유발된 서열을 포함하는 세포이다. 다른 실시양태에서, 세포는 실험 세포와 병행으로 돌연변이유발된 대조 세포이다.
본 발명의 다양한 다른 실시양태에서, 스크린은 청색 색소화와는 다른 표현형을 확인시켜 준다. 이러한 경우에서, 마커 구축물은 반드시 lacZ 유전자를 포함하는 구축물이 아니라, 오히려 검출가능한 표현형을 나타낼 수 있는 일부 다른 마커 유전자를 포함하는 구축물이다. 예를 들어, 돌연변이유발에 의해 파괴될 수 있는 검출가능한 표현형은, 비제한적으로, 발광, 형광, 항생제 내성, 항생제 감수성, 독소 내성, 독소 감수성, 변경된 성장 속도, 분석물에 대한 변경된 반응, 변경된 세포 구조, 변경된 콜로니 형성, 또는 변경된 영양요구성일 수 있다. 추가의 검출가능한 표현형은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 추가로, 이러한 검출가능한 표현형을 나타낼 수 있는 유전자 또한 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 검출가능한 표현형은 녹색 형광 단백질 (예를 들어, gfp), 적색 형광 단백질 (예를 들어, rfp), 황색 형광 단백질 (예를 들어, yfp), 암피실린 내성 유전자 (amp), 테트라시클린 내성 유전자 (tet), 카나마이신 내성 유전자 (kan), 베타 갈락토시다제 (β-gal), 알라닌 합성 유전자 (예를 들어, argA), 시스테인 합성 유전자 (예를 들어, cysE), 류신 합성 유전자 (예를 들어, lysA), 트레오닌 합성 유전자 (예를 들어, thrC), 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다수의 다른 천연 또는 합성 유전자의 발현으로부터 생성될 수 있다. 대안적으로, 마커 단백질은, 예를 들어 전사 인자의 발현에 의해 검출가능한 표현형을 나타내는 유전자의 발현을 지시하거나 또는 이에 기여하는 기능적 카세트일 수 있다. 이러한 경우에서, 검출가능한 표현형을 나타내는 유전자는 세포에 대해 내인성일 수 있거나 또는 벡터에 의해 코딩된다. 세포의 하위세트가 검정 조건하에서 발생하지 못할 것으로 예상되는 실시양태에서, 허용 조건에의 플레이트 복제 또는 유사한 효과의 또 다른 기술을 사용하여 지시된 표현형을 갖는 세포의 백분율을 결정할 수 있다. 또한, 검출가능한 표현형을 갖는 세포를 선택하거나 또는 단리하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 마커 단백질의 발현으로부터 생성된 표현형을 갖는 하나 이상의 세포를 선택하거나 또는 단리하는 것은 검출가능한 표현형에 따라, 유동 세포측정법, 적절한 항생제 또는 독소의 존재 하에 세포 집단의 배양, 특정한 유기 화합물의 존재 또는 부재 하에 세포 집단의 배양, 또는 현미경검사 기술을 포함할 수 있다. 특정한 검출가능한 표현형을 갖는 세포를 선택 및 단리하는 추가의 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
방향적 진화
본 발명의 변이체의 라이브러리는 파지 디스플레이 또는 방향적 진화의 방법에서 이용될 수 있다. 본 발명의 ssDNA 중간자는 파지 디스플레이에서 사용하기에 적절한 파지미드일 수 있으며, 그 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 관심 서열의 변이체의 라이브러리의 세포를 헬퍼 파지와 인큐베이션하는 것은 관심 서열의 변이체에 의해 코딩된 단백질의 디스플레이를 생성할 수 있다. 단백질 변이체를 디스플레이하는 세포는 단백질 변이체가 상호작용할 수 있는 하나 이상의 표적 분자, 예컨대 하나 이상의 단백질, 분자 또는 화합물과 공동-인큐베이션될 수 있다. 표적 분자(들)는 소분자, 단백질 또는 그의 도메인, 인간 단백질 또는 그의 도메인, 효소, 병원체 단백질 또는 그의 도메인, 항체 또는 그의 도메인, 또는 재조합 단백질일 수 있다. 단백질 변이체는 표적 분자(들)에 결합하거나, 그를 절단하거나 또는 변형할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 서열의 단백질 변이체는 표적 분자(들)에서 입체형태 변화를 유도할 수 있거나 또는 표적 분자(들)의 반응을 촉매할 수 있다. 방향적 진화에 의해 확인된 서열은 다양화 및 선택의 후속 라운드에서 관심 서열로서 사용될 수 있다.
실시예 1: 우라실화 원형 ssDNA의 생산
본 발명에서, 우라실화 원형 ssDNA는 DNA 주형 분자, 우라실화 원형 ssDNA 중간자 또는 둘 다의 역할을 할 수 있다. 우라실화 원형 ssDNA 분자는 파지 또는 파지미드 ssDNA 분자일 수 있다. 우라실화 원형 ssDNA 분자를 생산하는 하나의 방법은 CJ236 이. 콜라이 세포를 이용한다 (유전자형: FΔ(HindIII)::cat (Tra+ Pil+ CamR)/ ung-1 relA1 dut-1 thi-1 spoT1 mcrA; 뉴잉글랜드 바이오랩스). 이 균주의 세포는 기능적 dUTPase 및 우라실-N 글리코실라제가 결핍되어 있다. 먼저, 전기적격 CJ236 세포의 분취물 (25 μl)을 냉각된 0.1mm 갭 큐벳 내로 피펫팅하고, 1 μl의 pAPIII6 플라스미드 DNA를 CJ236 세포에 첨가하였다. 세포를 바이오라드(BioRad) 전기천공기에서 1.6 볼트로 전기천공하였다. 전기천공 직후에, 1 ml의 SOC 배지를 첨가하고, 배지 + 세포를 14 ml 팔콘(Falcon)-브랜드 배양 튜브로 옮겼다. 배양물을 1시간 동안 진탕 (~225 rpm)하면서 37℃에서 인큐베이션하였다. 시간의 종료 시에, 250 μl의 형질전환된 세포를 LB +CAM +AMP 플레이트 상에 직접 스프레딩하였다. 이러한 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
파지를 생산하기 위해, LB 및 암피실린 (60 μg/ml)을 함유하는 1 ml의 성장 배지 및 100 μl의 M13K07 헬퍼 파지 (NEB, 1011 PFU/ml)를 배양 튜브에 첨가하였다. 이어서, 단일 10 μl 피펫 팁을 사용하여 밤새 형질전환시킨 플레이트로부터의 30개 콜로니로 배지를 접종하였다. 배양물을 2시간 동안 37℃에서 200 rpm으로 진탕하고, 그 후에 0.5 μl의 카나마이신 스톡 (최종 농도 30 μg/ml)을 첨가하고, 배양물을 6시간 동안 또는 탁해질 때까지 37℃에서 225 rpm으로 진탕하였다. 배양물을 250 ml 유리 배플형 플라스크에서 암피실린 (60 μg/ml), 카나마이신 (30 μg/ml) 및 우리딘 (0.3 μg/ml)을 함유하는 30 ml의 새로운 2YT 배지 내로 희석하였다. 배양물을 30℃에서 밤새 (대략 18시간) 225 rpm으로 진탕하였다.
밤새 진탕한 후, 30 ml 배양물을 둥근 바닥 원심분리 튜브로 옮기고, 세포를 4℃에서 SS34 로터 또는 동등한 로터를 사용하는 소르발(Sorvall) RC-5B 원심분리기에서 15,000 rpm으로 15분 동안 원심분리하여 펠릿화하였다. 상청액을 0.22 μm 튜브 탑 필터를 사용하여 여과하고, 여과물을 6 ml 20% PEG8000/2.5 M NaCl을 함유하는 새로운 둥근 바닥 튜브로 옮겼다. 각각의 튜브를 파라필름으로 덮고, 수회 역전시켜 혼합한 다음, 얼음 상에서 60분 인큐베이션하였다. 각각의 튜브를 4℃에서 SS34 로터를 사용하는 소르발 RC-5B 원심분리기에서 10K rpm으로 20분 동안 원심분리하였다. 상청액을 경사분리하고, 튜브를 SS34 로터를 사용하는 소르발 RC-5B 원심분리기에서 5K rpm으로 5분 동안 다시 원심분리하였다. 남아있는 액체를 피펫을 사용하여 흡인함으로써, 파지 펠릿을 남겼다. 파지 펠릿을 1x 멸균 PBS 500 μl 내에 재현탁시키고, 1.7 ml 튜브로 옮겼다. 재현탁된 파지를 4℃에서 벤치 탑 마이크로원심분리기에서 전속력 (14K rpm)으로 5분 동안 원심분리하였다.
원심분리된 재현탁된 파지의 상청액을 새로운 1.5 ml 튜브로 옮겼다. 다음에, 7 μl의 완충제 MP (퀴아젠(Qiagen) M13 키트)를 파지 프렙에 첨가하고, 혼합하고, 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 샘플을 퀴아프렙(QIAprep) 스핀 칼럼 (퀴아젠 M13 키트)에 적용하였다. 칼럼을 벤치 탑 마이크로원심분리기에서 8K rpm으로 30초 동안 원심분리하고, 통과액을 폐기하였다. 이어서, 700 μl의 완충제 MLB를 칼럼 (퀴아젠 M13 키트)에 첨가하고, 칼럼을 벤치 탑 마이크로원심분리기에서 8K rpm으로 15초 동안 원심분리하였다. 700 μl의 추가의 완충제 MLB를 칼럼에 첨가하고, 칼럼을 실온에서 1분 이상 동안 인큐베이션한 다음, 벤치 탑 마이크로원심분리에서 8K rpm으로 30초 동안 원심분리하였다. 다음에, 700 μl의 완충제 PE (퀴아젠 M13 키트)를 첨가하고, 칼럼을 벤치 탑 마이크로원심분리기에서 8K rpm으로 15초 동안 원심분리하였다. 이 단계를 반복하였다. 칼럼을 새로운 1.7 ml 튜브로 옮겼다. 100 μl의 완충제 EB (M13 키트)를 칼럼 막에 첨가하고, 칼럼을 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 다음, 벤치 탑 원심분리기에서 8K rpm으로 30초 동안 원심분리하였다. dU-ssDNA를 함유하는 용리액은 1% 아가로스 TAE 겔 상에서 1.0 μl의 용리액을 전개시킴으로써 분석하였다. DNA는 우세한 단일 밴드로서 나타났지만, 보다 낮은 전기영동 이동성의 희미한 밴드를 종종 보였으며, 이는 아마도 dU-ssDNA에서의 2차 구조에 의해 유발된 것이다.
실시예 2: 오류 유발 PCR
본 발명에서, 오류-유발 PCR이 관심 서열 변이체를 생성하는데 이용될 수 있다. 본 실시예에서, 한 PCR 프라이머를 그의 5' 말단에 포스포로티오에이트를 도입하여 변형시킨다. 관심 서열은 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 가지며 관심 서열의 하나의 가닥에 혼성화될 수 있는 올리고뉴클레오티드, 및 3개 미만의 포스포로티오에이트를 가지며 관심 서열의 대향하는 가닥에 혼성화될 수 있는 제2 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시킨다. 오류-유발 PCR을 수행하기 위해, 10 μL의 10x 돌연변이유발 PCR 완충제 [70 mM MgCl2, 500 mM KCl, 100 mM 트리스 (pH 8.3), 0.1% (wt/vol) 젤라틴]를 10 μL의 10x dNTP 혼합물 (2 mM dGTP, 2 mM dATP, 10 mM dCTP, 10 mM dTTP), 관심 DNA를 증폭시키기 위해 설계된 각각 30 pmol의 정방향 및 역방향 프라이머와 합하였다. scFv 유전자에 대해, 본 발명자들은 다음을 사용하였다: (AXL6AS4-PCRR 5'Phos G*T*C*G*ACTGAGGAGACGGTGACC); 및 (AXL6KunkPCRF2 AAGCTTTCCTATGAGCTGACACAGCC), 여기서 별표는 포스포로티오에이트에 의해 연결된 염기쌍의 경계를 정하는 것이다. 반응은 1, 10 또는 20 fmol의 투입 DNA를 이용하였으며 (즉, 각 양에 대해 별개의 반응), 여기서 물을 첨가하여 총 부피 88 μL가 되었다. 이어서, 10 μL의 5 mM MnCl2를 첨가하고, 잘 혼합하였으며; 어떤 침전물도 존재하지 않음을 확인하였다. 2 μL의 Taq DNA 폴리머라제를 첨가하여 최종 부피 100 μL가 되었다. 반응을 바이오라드 T100 써멀 사이클러(Thermal Cycler) 상에서 30 사이클 동안 사이클링하였다 (94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분). PCR이 완료된 후에, 퀴아젠 퀴아퀵(QIAquick) PCR 정제 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 반응 정화를 수행하였다. 산물 크기는 대략 800개 염기쌍이었다.
실시예 3: T7 처리
3개 미만의 포스포로티오에이트를 갖는 가닥을 소화시키기 위해, 퀴아젠 퀴아퀵 PCR 정제 키트를 사용하여 정제된 40 μl의 PCR 산물을 1x NEB 완충제 4 중 10 μl T7 엑소뉴클레아제 (ml당 10,000개 유닛)와 함께 바이오라드 T100 써멀 사이클러 내 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. T7-처리된 산물을 퀴아젠 퀴아퀵 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하고, 반응당 40 μl EB 완충제로 용리시켰다.
이러한 포스포로티오에이트는 5' → 3' 엑소뉴클레아제 T7의 가수분해 작용으로부터 초기 이중 가닥 PCR 산물의 보호를 제공하고 그 동안 대향하는 비-보호된 가닥은 가수분해된다. 본 발명자들은 1개 또는 2개의 포스포로티오에이트가 가수분해를 방지하기에 충분하지 않았지만, 3개 또는 4개의 포스포로티오에이트의 첨가는 상응하는 가닥의 완전한 보호를 가져왔음을 발견하였다.
포스포로티오에이트는 이. 콜라이에서 임의의 불완전하게 라이게이션된 헤테로듀플렉스 산물을 시토졸 엑소뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호하여 편향된 돌연변이 혼입을 방지함으로써 생체내에서 추가의 이익을 제공할 수 있다.
이중 가닥 PCR 산물의 단일 가닥 DNA 변이체로의 전환.
뉴클레오티드 오혼입이 유리한 조건 하에서 800개 염기쌍 scFv 유전자의 증폭으로부터의 PCR 산물을 25℃에서 1시간 동안 T7 또는 람다 엑소뉴클레아제로 또는 그 없이 처리하였다. 처리 후에, 산물을 SYBR-골드로 염색한 천연 아크릴아미드 겔 상에 가시화하였다. ssDNA 산물은 상응하는 dsDNA보다 더 느린 이동성을 제시한다 (도 2). 예상한 대로, T7 엑소뉴클레아제는 어떤 프라이머도 포스포로티오에이트를 함유하지 않은 경우 보호되지 않은 DNA를 완전히 분해한다. 5' 말단 상의 1개 또는 2개의 포스포로티오에이트 잔기는 효소의 가수분해 작용으로부터 충분한 보호를 제공하지 않는다 (도 2). 그러나, 5' 말단 중 하나가 3개 또는 4개의 포스포로티오에이트를 갖는 경우에, PCR 산물은 ssDNA로 완전히 전환된다 (도 2). 람다 엑소뉴클레아제는 또한 dsDNA를 ssDNA로 전환시키지만, 반응은 비-포스포로티오에이트 프라이머가 5' 인산화되는 경우에 보다 효율적이다.
실시예 4: 헤테로듀플렉스 형성
오류-유발 PCR에 이은 T7 소화의 단일 가닥 산물을 DNA 헤테로듀플렉스 내로 혼입시키기 위해, 40 μl의 T7 처리된- 및 정화 반응물을 13 μl의 pAX143 ssDNA, 25 μl 10x TM (0.1 M MgCl2, 0.5 M 트리스, pH 7.5) 완충제, 및 172 μl dH20에 첨가하였다. pAX143은 박테리오파지 M13 gpIII 코트 단백질에 융합된 단일 쇄 가변 단편 항체 (scFv)를 갖는 pAP-III6인 파지미드의 유도체이다. pAX143 내의 scFv는 비-재조합 클론이 비-기능적으로 되도록 각각의 CDR에 정지 코돈 및 Sac II 제한 부위를 함유한다. 합성 올리고뉴클레오티드와의 반응에서, 200 ng의 올리고뉴클레오티드를 20 μg 원형 단일 가닥 주형에 첨가하였다. 어닐링 반응은 바이오라드 T100 써모사이클러에서 90℃에서 2분 동안 인큐베이션한 다음 분당 -1℃로 90℃에서 55℃로 점진적 감소시켜 수행하였다. 이어서, 어닐링된 산물을 10 μl의 10 mM ATP, 10 μl의 100 mM dNTP 혼합물, 15 μl의 100 mM DTT, 0.5 μl (30 U) T4 DNA 리가제 및 3 μl (30 U) T7 DNA 폴리머라제와 합하였다. 혼합물을 5개의 PCR 튜브 내로 동등하게 분취하고, 바이오라드 T100 써모사이클러에서 20℃에서 밤새 (16시간) 인큐베이션하였다.
생성된 DNA를 퀴아젠 퀴아퀵 DNA 정제 키트를 사용하여 탈염 및 정제하였다. 이것은 반응물을 1.0 ml의 완충제 QG (퀴아젠 퀴아퀵 DNA 정제 키트)와 혼합함으로써 달성하였다. 샘플을 각각의 칼럼에 35 μl의 완충제 EB (퀴아젠 퀴아퀵 DNA 정제 키트)를 첨가함으로써 용리시켰다. 2개 칼럼으로부터의 용리액 (최종 70 μl)을 합하고, 2 μl의 산물을 2 μl의 ssDNA와 나란히 아가로스 겔 상에 가시화하였다. 최대 3개의 밴드가 관찰되었다. 상부 (및 종종 가장 우세한) 밴드는 가닥 치환된 DNA에 상응하고, 중간 (보통 희미한) 밴드는 니킹된 DNA (즉, 적절히 연장 및 라이게이션되지 않음)에 상응하고, 하부 밴드는 정확하게 연장 및 라이게이션된 산물을 나타낸다. ssDNA는 정확하게 라이게이션된 밴드보다 더 아래로 전개될 것이다.
오류-유발 PCR 산물의 표준 클로닝을 위해, DNA를 HindIII 및 SalI에 의해 소화시키고, 파지 디스플레이를 위한 pAPIII6 벡터 내로 라이게이션시켰다.
실시예 5: CJ236 균주의 형질전환
CJ236 균주 (유전자형: FΔ(HindIII)::cat (Tra+ Pil+ CamR)/ ung-1 relA1 dut-1 thi-1 spoT1 mcrA)를 뉴잉글랜드 바이오랩스로부터 구입하였다. 이 균주는 기능적 dUTPase 및 우라실-N 글리코실라제가 결핍되어 있고, 우라실화 단일 가닥 DNA 주형을 생성하기 위해 사용된다. 전기적격 CJ236 세포의 분취물 (25 μl)을 냉각된 0.1mm 갭 큐벳 내로 피펫팅하고, 1 μl의 pAPIII6 플라스미드 DNA를 큐벳 내 CJ236 세포에 첨가하였다. 세포를 바이오라드 전기천공기에서 1.6 볼트로 전기천공하였다. 전기천공 직후에, 1 ml의 SOC 배지를 첨가하고, 배지 + 세포를 14 ml 팔콘-브랜드 배양 튜브로 옮겼다. 배양물을 1시간 동안 진탕 (~225 rpm)하면서 37℃에서 인큐베이션하였다. 시간의 종료 시에, 250 μl의 형질전환된 세포를 LB +CAM +AMP 플레이트 상에 직접 스프레딩하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다
실시예 6: 라이브러리 형질전환
TG1 이. 콜라이 균주 (F' [traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]supE thi-1 Δ(lac-proAB) Δ(mcrB-hsdSM)5, (rK-mK-))를 루시젠(Lucigen)으로부터 구입하였다. 형질전환 반응을 위해 0.5 μl 헤테로듀플렉스 DNA 또는 라이게이션 산물을 25 μl의 TG1 전기적격 세포 (루시젠)와 혼합하고, 0.1 cm 갭 큐벳에 첨가하였다. 세포 + DNA를 진펄서(GenePulser) 세트를 사용하여 1.6 kV ("세트 볼트" 상의 r1.60), 200 옴, 25 μF로 전기천공하였다. 전기 천공된 세포를 1 ml의 루시젠 회수물과 혼합하고, 14 ml 팔콘 배양 튜브로 옮긴 다음, 37℃에서 진탕하였다. 1시간 후에, 2 μl의 배양물을 꺼내고, 198 μl의 2YT 배지 내로 10-2로 희석하고, 볼텍싱하여 혼합하였다. 이어서, 깨끗한 피펫을 사용하여, 2 μl의 10-2 희석물을 10-4 희석물을 위해 198 μl의 2YT 배지 내로 추가 희석하였다. 이러한 10-2 연속 희석을 10-14까지 반복하였다. 100 μl의 각각의 희석물을 TYE- AMP-글루코스 플레이트 상에 멸균 스프레더로 플레이팅하고, 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
실시예 7: 쿤켈 돌연변이유발
쿤켈 돌연변이유발의 효율에 대한, 5' 포스포로티오에이트 결합을 갖는 ssDNA 산물의 효과, 및 특히 시험관내 합성된 재조합 가닥에 유리한 우라실화 DNA 가닥의 편향된 복구를 이. 콜라이에서 연구하였다. 5' 말단에 4개의 포스포로티오에이트를 함유하는 합성 올리고뉴클레오티드를 포스포로티오에이트가 결핍되어 있는 동일한 올리고뉴클레오티드와 병행으로 표준 쿤켈 돌연변이유발 반응에 사용하였다. 헤테로듀플렉스 DNA 산물을, DNA 내 우라실의 제거에 요구되는 효소의 야생형 버전을 코딩하며 재조합 비-우라실화 가닥의 증식이 유리한 이. 콜라이 TG1 세포 내로 형질전환시켰다. 재조합체를 비변형 및 변형된 올리고뉴클레오티드 둘 다로부터 각각 44% 및 50%의 비율로 생성하였으며 (표 1), 이는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 쿤켈 돌연변이유발에 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
합성 올리고뉴클레오티드를, 돌연변이된 scFv 유전자에 상응하는 800개 염기쌍 오류-유발 PCR 단편의 T7 엑소뉴클레아제 처리에 의해 생성된 ssDNA 변이체 대신에 사용하였다. 돌연변이된 ssDNA 변이체가 올리고뉴클레오티드보다 20배 더 크기 때문에, 우라실화 원형 단일 가닥 주형에 대한 ssDNA 변이체의 비는 헤테로듀플렉스 산물의 효율적인 생산을 달성하는데 최적화되어야 했다 (도 3). dsDNA 산물의 TG1 세포 내로의 전기천공 후에, 개별 클론을 서열분석에 보내어 재조합체의 수를 결정하였다. 재조합체는 46%의 비율로 생성되었으며, 이는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 관찰된 효율에 필적한다. 완전 재조합체 이외에도, ssDNA 변이체 반응은 또한 ssDNA 변이체 서열의 부분이 혼입된 부분 재조합체를 35%의 빈도로 생산하였다 (재조합체 26개 중 9개; 표 1).
<표 1>
쿤켈 돌연변이유발 반응으로부터의 재조합체의 분석
Figure pct00001
실시예 8: AXM 돌연변이유발을 사용한 다양한 라이브러리의 생성
오류-유발 PCR에 의해 친화도 성숙 라이브러리를 생성하는 통상의 접근법에 본 방법을 비교하기 위해, 상기와 같은 동일한 scFv 유전자를 오류-유발 PCR에 의해 증폭시키고, 표준 기술을 사용하여 파지미드 벡터 내로 서브클로닝하였다. 라이게이션된 산물을 TG1 세포 내로 전기천공한 후에, 형질전환체 수의 추정치를 얻기 위해 연속 희석물을 고체 배지 상에 플레이팅하였다. 개별 클론을 서열분석하여 재조합체의 백분율 및 돌연변이 빈도를 결정하였다.
표준 라이브러리로부터의 형질전환체 중에서, 75%는 재조합체였고, 평균적으로 각각의 재조합 클론은 8개의 돌연변이를 가졌으며, 이는 대략 1%의 점 돌연변이 비율과 동등하다 (표 2). AXM 돌연변이유발 접근법을 사용한 경우 1.5%의 유사한 돌연변이 비율을 관찰하였다 (표 2). 재조합체의 빈도가 AXM 돌연변이유발 라이브러리에 대해서보다 표준 라이브러리에 대해서 약간 더 높았지만, 형질전환체의 전체 수는 AXM 돌연변이유발 접근법을 사용한 경우가 여러 차수 더 높았다 (각각 2.8 x 108 대 1 x 105). 이러한 효율을 기준으로 하여, AXM 돌연변이유발 접근법을 사용한 단일 형질전환으로부터의 전체 라이브러리 다양성은 대략 108개 재조합 클론이었다 (표 2). 표준 접근법을 사용하여 유사한 크기 라이브러리를 달성하기 위해서는 1000회의 형질전환이 요구될 것이다. 이러한 결과는 본 방법이 단일 형질전환으로부터 108개 재조합 클론을 갖는 라이브러리를 효율적으로 생성하게 한다는 것을 제시한다. 종래 오류-유발 PCR 및 서브클로닝 접근법은 동등한 크기의 라이브러리를 생산하기 위해 1000회의 형질전환이 요구되었다.
<표 2>
통상의 접근법 및 AXM 돌연변이유발 접근법을 사용한 라이브러리 다양성의 비교
Figure pct00002
실시예 9: 돌연변이유발의 효율을 결정하는 방법
청색/백색 스크린을 사용하여 돌연변이유발의 효율을 결정하였다. β-갈락토시다제를 발현할 수 있는 lacZ 유전자를 포함하는 p블루스크립트 벡터를 이러한 실험에 사용하였다. 대조 세포를 표준 PCR에 의해 증폭된 LacZ ssDNA 변이체에 혼성화된 p블루스크립트 벡터로 형질전환시켰다. 이러한 형질전환된 세포를 X-gal의 존재 하에 배양하였으며; 이러한 세포 1490개 중 1480개가 청색이었다 (0.01% 백색 콜로니). 오류 유발 PCR에 의해 증폭된 LacZ ssDNA 변이체에 혼성화된 p블루스크립트 벡터로 형질전환된 세포를 별도로 X-gal의 존재 하에 배양하였다. 세포 627개 중 525개가 청색이었다 (19% 백색 콜로니). 별도로, 추가의 세포를 오류 유발 PCR에 의해 증폭된 scFv 주형으로 형질전환시켰다. scFv 주형이 오류 유발 PCR에 의해 증폭되고, 벡터에 혼성화되고, X-gal 상에서 배양된 2개의 샘플 각각에서, 100%의 콜로니가 백색이었다. 이러한 세포에 대한 쿤켈 효율 21%가 결정되었다 (표 3).
<표 3>
돌연변이유발의 효율을 결정하기 위한 청색/백색 스크린
Figure pct00003
실시예 10: 별개의 벡터 상의 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 돌연변이유발
본 발명의 한 예에서, 제1 관심 서열은 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩하고 제2 관심 서열은 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩한다. 각각은 본 발명의 방법에 따라 돌연변이유발되어 dsDNA 변이체를 생산하고, 이는 이어서 ssDNA 변이체로 전환되고, ssDNA 중간자에 혼성화되어 헤테로듀플렉스를 형성한다. 이뮤노글로불린 경쇄 ssDNA 변이체는 제1 ssDNA 중간자에 혼성화될 것이고, 반면에 이뮤노글로불린 중쇄 ssDNA 변이체는 별개의 제2 ssDNA 중간자에 혼성화될 것이다. 혼성화된 ssDNA 변이체는 주형 분자로서 ssDNA 중간자를 사용하여 DNA 연장을 프라이밍할 것이다. 연장 반응은 리가제를 포함할 것이다. 이후에, ssDNA 중간자는 박테리아 내로의 형질전환 전 또는 후에 분해될 것이다. 임의의 또는 모든 단계는 단일 반응 풀에서 또는 예를 들어 이뮤노글로불린 경쇄 변이체에 대한 적어도 하나의 풀 및 이뮤노글로불린 중쇄 변이체에 대한 또 다른 풀을 포함하는 2개 이상의 별개의 반응 풀에서 일어날 수 있다. 박테리아의 단일 풀을 생산된 이뮤노글로불린 경쇄 벡터 및 생산된 이뮤노글로불린 중쇄 벡터로 형질전환시킨다. 형질전환된 세포의 하위세트를 1개 이상의 이뮤노글로불린 경쇄 벡터 및 1개 이상의 이뮤노글로불린 중쇄 벡터 둘 다로 형질전환시킨다. 이러한 경우에, 중쇄 변이체 및 경쇄 변이체는 공동-발현되어, 발현된 중쇄 단백질 및 발현된 경쇄 단백질이 이뮤노글로불린 복합체, 즉 항체를 형성하도록 할 수 있다. 중쇄 변이체 및 경쇄 변이체의 발현은 벡터에 의해 최초로 형질전환된 박테리아 세포 유형에서 일어날 수 있거나 또는 벡터 또는 그로부터 유래된 벡터가 후속 전달되는 상이한 세포 유형에서 일어날 수 있다.
실시예 11: 단일 벡터 상의 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 돌연변이유발
본 발명의 한 예에서, 제1 관심 서열은 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩하고 제2 관심 서열은 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩한다. 이뮤노글로불린 중쇄 및 이뮤노글로불린 경쇄 서열은 단일 벡터 내로 클로닝된다. 각각은 본 발명의 방법에 따라 돌연변이유발되어 dsDNA 변이체를 생산하고, 이는 이어서 ssDNA 변이체로 전환되고, ssDNA 중간자에 혼성화되어 헤테로듀플렉스를 형성하며, 여기서 각각의 ssDNA 중간자는 이뮤노글로불린 중쇄 ssDNA 변이체에 혼성화될 수 있는 하나 이상의 유전자좌 및 이뮤노글로불린 경쇄 ssDNA 변이체에 혼성화될 수 있는 별개이 유전자좌를 가진다. 혼성화된 ssDNA 변이체는 주형 분자로서 ssDNA 중간자를 사용하여 DNA 연장을 프라이밍할 것이다. 연장 반응은 리가제를 포함할 것이다. 이후에, ssDNA 중간자는 박테리아 내로의 형질전환 전 또는 후에 분해될 것이다. 본 발명의 방법에 의해 단일 벡터 내로 클로닝된 중쇄 변이체 및 경쇄 변이체는 공동-발현되어, 발현된 중쇄 단백질 및 발현된 경쇄 단백질이 이뮤노글로불린 복합체, 즉 항체를 형성하도록 할 수 있다. 중쇄 변이체 및 경쇄 변이체의 발현은 벡터에 의해 최초로 형질전환된 박테리아 세포 유형에서 일어날 수 있거나 또는 벡터 또는 그로부터 유래된 벡터가 후속 전달되는 상이한 세포 유형에서 일어날 수 있다.
실시예 12: 해상된 벡터를 위해 선택되는 Eco29kI 제한 부위의 사용
본 발명의 일부 경우에서 다수의 별개의 폴리뉴클레오티드 절편에 상응하는 ssDNA 변이체를 단일의 해상된 벡터 내로 혼입시키는 것이 바람직하다. 본 실시예에서, 본 발명의 방법은, 단일 구축물에서, 단일 쇄 항체의 6개 상보성 결정 영역 각각을 그에 혼성화될 수 있는 ssDNA 변이체의 서열로 대체하는데 사용된다. 단일 쇄 항체는 경쇄 가변 도메인 (VL) 상보성 결정 영역 (CDR) 1 (함께, VL-CDR1), VL-CDR2, VL-CDR3, 링커, 중쇄 가변 도메인 (VH) CDR1 (함께, VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3을 포함한다. 임의의 2개의 인접한 CDR 사이의 거리는, 예를 들어 30 내지 40개 염기쌍일 수 있다.
각각의 CDR에 혼성화될 수 있는 ssDNA 변이체는 각각의 CDR에 상응하는 주형 서열을 기반으로 하여 생성된다. 주형 서열은 SacII 제한 부위 또는 opal 정지 코돈을 포함하지 않는다 (도 4). ssDNA 변이체는, CDR ssDNA 변이체가 혼성화될 수 있는 서열을 가지지만 상응하는 ssDNA 변이체가 혼성화될 수 있는 각각의 CDR의 절편 내에 SacII 제한 부위 및 opal 정지 코돈을 추가로 포함하는 우라실화 ssDNA 중간자에 혼성화된다 (도 4). ssDNA 변이체는 ssDNA 중간자에 혼성화되고 이후에 박테리아로 전달되며, 여기서 미스매치된 뉴클레오티드가 해상된다. 이들 박테리아는 완전한 SacII 제한 부위를 포함하는 벡터를 분해할 수 있는 Eco29kI 제한 효소를 발현한다. 따라서, 중간자 가닥의 6개 CDR 중 어느 하나가 ssDNA 변이체에 혼성화되지 않는 경우, 또는 6개 CDR 중 어느 하나가 상응하는 ssDNA 변이체에 혼성화되지만, SacII 제한 부위에서 혼성화된 ssDNA 변이체 보다 오히려 ssDNA 중간자 가닥에 유리하게 해상되지 않는 경우에, 생성된 벡터는 하나 이상의 SacII 제한 부위를 포함한다. 이러한 벡터는 Eco29kI를 발현하는 박테리아에서 분해된다. 각각의 6개 CDR에서 ssDNA 변이체에 유리하게 해상되지 않은 상기 벡터를 제거함으로써, 모든 6개 CDR에서 변형된 구축물을 확인하는 효율은 증가된다. 유사하게, 임의의 opal 돌연변이의 존재는 해상된 벡터에 의해 코딩되는 단일 쇄 항체 또는 그의 변이체의 발현을 방해한다.
실시예 14: 재조합체의 백분율을 향상시키기 위한 Eco29kI 제한의 사용
본원에 기재된 Eco29kI 제한 방법을 사용하는 경우에 확인된 재조합체의 빈도 증가를 입증하기 위해, 여러 조건을 시험하였다. 제1 조건에서, ssDNA 변이체를 scFv 주형 (scFv1 또는 scFv2)으로부터 생성하였다. ssDNA 변이체는 SacII 제한 부위를 포함하지 않는다. ssDNA 변이체를 ssDNA 변이체가 혼성화될 수 있는 ssDNA 중간자의 절편 내에 SacII 제한 부위를 포함하는 ssDNA 중간자에 혼성화시켰다. Eco29kI를 발현하는 TG1 세포 내로의 형질전환은 미스매치 뉴클레오티드의 해상 및 SacII 제한 부위를 포함하는 벡터의 분해를 일으켰다. 제2 조건에서, scFv 2 주형을 사용하여 ssDNA 변이체를 생성하고, ssDNA 변이체를 SacII 제한 부위를 포함하지 않는 ssDNA 중간자에 혼성화시켰다. 이러한 제2 조건에서, Eco29kI를 발현하는 TG1 세포 내로의 형질전환은 SacII 제한 부위를 포함하는 벡터의 분해를 일으키지 않았다. SacII 제한 부위를 포함하는 벡터의 분해는 재조합을 완료하지 않은 벡터를 선택적으로 분해하기 때문에, 재조합체의 백분율은 증가된다. 이러한 효과는 SacII를 사용한 시험관내 처리와 함께 또는 그 없이, Eco29kI를 발현하지 않는 세포 (TG1 세포)에서 비교된다.
하기 결과는 Eco29kI를 발현하는 TG1 세포에서의 비-재조합 벡터의 제한이 Eco29kI를 발현하지 않는 TG1 세포에서 관찰되는 것보다 더 높은 백분율의 재조합체를 생산한다는 것을 제시한다.
<표 4>
재조합체 백분율
Figure pct00004
다른 실시양태
본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌, 특허 출원 및 특허는 본원에 참조로 포함된다.
본 발명이 구체적 실시양태와 관련하여 기재되었지만, 추가의 변형이 가능한 것으로 이해될 것이다. 따라서, 본 출원은 관련 기술분야에서 공지되어 있거나 통상적으로 실시되는 본 개시내용으로부터의 이탈을 비롯하여, 일반적으로 본 발명의 원리에 따른 본 발명의 임의의 변동, 사용 또는 개조를 포함하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> AXIOMX, Inc. <120> METHODS FOR THE PRODUCTION OF LIBRARIES FOR DIRECTED EVOLUTION <130> 50881-004WO2 <140> PCT/US2014/018672 <141> 2014-02-26 <150> 61/769,517 <151> 2013-02-26 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 gtcgactgag gagacggtga cc 22 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 aagctttcct atgagctgac acagcc 26

Claims (91)

  1. (a) 관심 서열을 포함하는 주형 DNA 분자를 제공하는 단계;
    (b) 한 쌍의 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 관심 서열의 대향하는 가닥에 혼성화되며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나는 보호되고, 다른 올리고뉴클레오티드는 비-보호되고, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 관심 서열에 플랭킹되는 것인 단계;
    (c) 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상기 주형 DNA 분자에 대한 증폭 반응을 수행함으로써 dsDNA 변이체 집단을 생성하는 단계;
    (d) 상기 dsDNA 변이체의 보호된 가닥에 비해 비-보호된 가닥을 선택적으로 분해할 수 있는 효소와 함께 상기 dsDNA 변이체 집단을 인큐베이션함으로써 ssDNA 변이체 집단을 생산하는 단계;
    (e) 상기 관심 서열 또는 그의 단편과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 ssDNA 중간자에 상기 ssDNA 변이체 집단을 혼성화시킴으로써 헤테로듀플렉스 DNA를 생성하는 단계; 및
    (f) 상기 헤테로듀플렉스 DNA를 세포 내로 형질전환시킴으로써 상기 관심 서열의 변이체의 라이브러리를 생성하는 단계
    를 포함하는, 관심 서열의 변이체의 라이브러리를 생성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 주형 DNA 분자가 선형 dsDNA 분자인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 주형 DNA 분자가 원형 dsDNA 분자인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 주형 DNA 분자가 원형 ssDNA 분자인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 주형 DNA 분자가 우라실화 또는 메틸화 원형 ssDNA 분자인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주형 DNA 분자의 서열이 상기 ssDNA 중간자의 서열과 실질적으로 동일한 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 서열이 100개 초과의 염기쌍인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 관심 서열이 300개 초과, 500개 초과 또는 700개 초과의 염기쌍인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 관심 서열이 100 내지 2000개 염기쌍인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 관심 서열이 300 내지 1500개 염기쌍인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 관심 서열이 700 내지 1200개 염기쌍인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보호된 올리고뉴클레오티드가 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드이고, 상기 비-보호된 올리고뉴클레오티드가 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 포함하지 않는 올리고뉴클레오티드인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 보호된 올리고뉴클레오티드가 3, 4 또는 5개의 5' 포스포로티오에이트를 포함하는 것인 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 보호된 가닥에 비해 비-보호된 가닥을 선택적으로 분해할 수 있는 상기 효소가 T7 엑소뉴클레아제인 방법.
  15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 보호된 가닥에 비해 비-보호된 가닥을 선택적으로 분해할 수 있는 상기 효소가 람다 엑소뉴클레아제인 방법.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보호된 올리고뉴클레오티드가 5' 포스페이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드이고, 상기 비-보호된 올리고뉴클레오티드가 5' 포스페이트를 포함하지 않는 올리고뉴클레오티드인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 보호된 가닥에 비해 비-보호된 가닥을 선택적으로 분해할 수 있는 상기 효소가 람다 엑소뉴클레아제인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭 반응이 PCR 반응인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 증폭 반응이 오류-유발 PCR 반응인 방법.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭 반응이 등온 증폭 반응인 방법.
  21. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭 반응이 롤링 서클 증폭 반응인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsDNA 변이체 집단 중 50%의 dsDNA 변이체가 상기 관심 서열과 99.5% 미만의 동일성을 갖는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 dsDNA 변이체 집단 중 50%의 dsDNA 변이체가 상기 관심 서열과 98% 미만의 동일성을 갖는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 보호된 가닥에 비해 비-보호된 가닥을 선택적으로 분해할 수 있는 상기 효소와 인큐베이션하기 전에 상기 dsDNA 변이체 집단을 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 중간자에 혼성화시키기 전에 상기 ssDNA 변이체 집단을 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 중간자가 상기 관심 서열 또는 그의 단편에 대해 적어도 50% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 ssDNA 중간자가 상기 관심 서열 또는 그의 단편에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 ssDNA 중간자가 상기 관심 서열 또는 그의 단편에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 ssDNA 중간자가 상기 관심 서열 또는 그의 단편에 대해 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 중간자가 파지미드이거나 또는 파지미드의 서열과 실질적으로 동일한 서열 단편을 포함하는 벡터인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 중간자에의 상기 ssDNA 변이체 집단의 상기 혼성화가, 상기 ssDNA 변이체 집단 및 상기 ssDNA 중간자를 변성 온도에서 공동-인큐베이션한 후에 어닐링 온도로 점진적 냉각시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 변성화 온도가 약 90℃인 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 어닐링 온도가 약 55℃인 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 점진적 냉각이 분당 약 -1℃의 속도로 일어나는 것인 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 진핵 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 효모 세포 또는 박테리아 세포인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 중간자가 변형된 핵염기를 포함하거나 또는 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티민 이외의 핵염기를 포함하는 것인 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 상기 ssDNA 중간자를 선택적으로 분해할 수 있는 세포인 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 중간자가 우라실화 ssDNA 중간자인 방법.
  39. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 중간자가 메틸화 ssDNA 중간자인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 ssDNA 중간자를 선택적으로 분해할 수 있는 상기 세포가 Ung+ 박테리아 세포인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 세포가 TG1 이. 콜라이(E. coli) 세포인 방법.
  42. 제39항에 있어서, 상기 ssDNA 중간자를 선택적으로 분해할 수 있는 상기 세포가 Mcr+ 박테리아 세포인 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e)가 상기 ssDNA 중간자에 혼성화된 상기 ssDNA 변이체를 상기 헤테로듀플렉스 DNA와 DNA 폴리머라제의 인큐베이션에 의해 연장시키는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 헤테로듀플렉스 DNA와 DNA 폴리머라제의 상기 인큐베이션이 상기 헤테로듀플렉스 DNA와 DNA 폴리머라제 및 DNA 리가제의 인큐베이션을 포함하는 것인 방법.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 ssDNA 중간자가 메틸화 ssDNA 중간자이고, 단계 (e)가 상기 헤테로듀플렉스 DNA를 변성시키는 단계 및 변성된 산물을 메틸화 DNA를 선택적으로 분해하는 효소와 함께 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 메틸화 ssDNA 중간자가 메틸화 아데닌 핵염기를 포함하고, 메틸화 DNA를 선택적으로 분해하는 상기 효소가 DpnI인 방법.
  47. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 ssDNA 변이체가 메틸화되고, 상기 ssDNA 중간자가 메틸화되지 않고, 단계 (e)가 상기 헤테로듀플렉스 DNA를 변성시키는 단계 및 변성된 산물을 비-메틸화 DNA를 선택적으로 분해하는 효소와 함께 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 메틸화 ssDNA 변이체가 메틸화 시토신 또는 구아닌 핵염기를 포함하고, 비-메틸화 DNA를 선택적으로 분해하는 상기 효소가 DNA 서열 5'-GATC-3'를 인식하는 제한 효소인 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤테로듀플렉스 DNA를 상기 세포 내로 형질전환시키기 전에 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤테로듀플렉스 DNA의 상기 세포 내로의 상기 형질전환이 상기 세포의 2개 이상, 10개 이상, 20개 이상 또는 50개 이상의 분취물의 독립적 형질전환을 포함하는 것인 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 서열이 항체 또는 그의 도메인 또는 단편을 코딩하는 것인 방법.
  52. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 서열이 폴리머라제 또는 그의 도메인 또는 단편을 코딩하는 것인 방법.
  53. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 서열이 효소 또는 그의 도메인 또는 단편을 코딩하는 것인 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 1(a) 내지 1(d)를 2개 이상의 상이한 관심 서열 각각으로부터 병행 수행하여 2개 이상의 ssDNA 변이체 집단을 생산하며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드, 상기 증폭 반응 및 상기 효소는 상기 2개 이상의 상이한 관심 서열 각각에 대한 단계 1(a) 내지 1(d) 중 임의의 또는 모든 단계의 적용에 있어서 상이할 수 있고, 상기 ssDNA 변이체 집단을 단계 1(e) 전에 또는 그 동안에 혼합하는 것인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 2개 이상의 상이한 관심 서열 중 적어도 2개를 단일 주형 DNA 분자로부터 증폭시키는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 2개 이상의 상이한 관심 서열 모두를 단일 주형 DNA 분자로부터 증폭시키는 것인 방법.
  57. 제54항에 있어서, 상기 2개 이상의 상이한 관심 서열 중 적어도 2개를 상이한 주형 DNA 분자로부터 증폭시키는 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 2개 이상의 상이한 관심 서열 각각을 상이한 주형 DNA 분자로부터 증폭시키는 것인 방법.
  59. 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 병행 수행한 상기 단계 중 하나 이상을 상기 2개 이상의 상이한 관심 서열 중 적어도 2개에 대해 단일 반응으로 수행하는 것인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 병행 수행한 상기 단계 중 하나 이상을 상기 2개 이상의 상이한 관심 서열 모두에 대해 단일 반응으로 수행하는 것인 방법.
  61. 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 병행 수행한 상기 단계 중 하나 이상을 상기 2개 이상의 상이한 관심 서열 중 적어도 2개에 대해 개별적으로 수행하는 것인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 병행 수행한 상기 단계 중 하나 이상을 상기 2개 이상의 상이한 관심 서열 각각에 대해 개별적으로 수행하는 것인 방법.
  63. 제54항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 중간자가 상기 2개 이상의 상이한 관심 서열 각각 또는 그의 단편과 실질적으로 동일한 서열을 포함하고, 단계 1(e)가 상기 2개 이상의 ssDNA 변이체 집단을 상기 ssDNA 중간자에 혼성화시키는 것을 포괄하는 것인 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 2개 이상의 ssDNA 변이체 집단을 상기 ssDNA 중간자에 동시에 혼성화시키는 것인 방법.
  65. 제63항에 있어서, 상기 2개 이상의 ssDNA 변이체 집단을 상기 ssDNA 중간자에 순차적으로 혼성화시키는 것인 방법.
  66. (a) 관심 서열을 포함하는 주형 DNA 분자를 제공하는 단계;
    (b) 한 쌍의 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 관심 서열의 대향하는 가닥에 혼성화되며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나는 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 포함하고 다른 올리고뉴클레오티드는 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 포함하지 않고, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 관심 서열에 플랭킹되는 것인 단계; 및
    (c) 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상기 주형 DNA 분자에 대한 오류-유발 PCR을 수행함으로써 dsDNA 변이체 집단을 생성하는 단계
    를 포함하는, 오류-유발 PCR에 의해 dsDNA 변이체 집단을 생성하는 방법.
  67. (a) 관심 서열을 포함하는 주형 DNA 분자를 제공하는 단계;
    (b) 한 쌍의 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 관심 서열의 대향하는 가닥에 혼성화되며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나는 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 포함하고 다른 올리고뉴클레오티드는 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 포함하지 않고, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 관심 서열에 플랭킹되는 것인 단계;
    (c) 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상기 주형 DNA 분자에 대한 오류-유발 PCR을 수행함으로써 dsDNA 변이체 집단을 생성하는 단계; 및
    (d) 상기 dsDNA 변이체의 포스포로티오에이트 가닥이 아닌 비-포스포로티오에이트 가닥을 가수분해할 수 있는 효소와 함께 상기 dsDNA 변이체 집단을 인큐베이션함으로써 ssDNA 변이체 집단을 생산하는 단계
    를 포함하는, 오류-유발 PCR에 의해 ssDNA 변이체 집단을 생성하는 방법.
  68. (a) 관심 서열을 포함하는 주형 DNA 분자를 제공하는 단계;
    (b) 한 쌍의 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 관심 서열의 대향하는 가닥에 혼성화되며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나는 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 포함하고 다른 올리고뉴클레오티드는 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 포함하지 않고, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 관심 서열에 플랭킹되는 것인 단계; 및
    (c) 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상기 주형 DNA 분자에 대한 PCR을 수행함으로써 dsDNA 분자 집단을 생성하는 단계
    를 포함하는, PCR에 의해 dsDNA 분자 집단을 생성하는 방법.
  69. (a) 관심 서열을 포함하는 주형 DNA 분자를 제공하는 단계;
    (b) 한 쌍의 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 관심 서열의 대향하는 가닥에 혼성화되며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나는 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 포함하고 다른 올리고뉴클레오티드는 3개 이상의 5' 포스포로티오에이트를 포함하지 않고, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 관심 서열에 플랭킹되는 것인 단계;
    (c) 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상기 주형 DNA 분자에 대한 PCR을 수행함으로써 dsDNA 분자 집단을 생성하는 단계; 및
    (d) 상기 dsDNA 분자의 포스포로티오에이트 가닥이 아닌 비-포스포로티오에이트 가닥을 가수분해할 수 있는 효소와 함께 상기 dsDNA 분자 집단을 인큐베이션함으로써 ssDNA 분자 집단을 생산하는 단계
    를 포함하는, PCR에 의해 ssDNA 분자 집단을 생성하는 방법.
  70. (a) 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항의 변이체의 라이브러리를 제공하는 단계;
    (b) 상기 변이체 라이브러리의 1개 이상의 분취물을 배양하여 배양된 변이체 라이브러리를 생성하는 단계;
    (c) 상기 배양된 변이체 라이브러리의 1개 이상의 분취물을 헬퍼 파지와 함께 인큐베이션하여 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하며, 여기서 상기 파지 디스플레이 라이브러리의 세포는 상기 관심 서열에 의해 코딩되는 단백질의 변이체를 디스플레이하는 것인 단계;
    (d) 상기 파지 디스플레이 라이브러리의 상기 세포를 표적 분자에 접촉시키며, 여기서 상기 관심 서열에 의해 코딩되는 단백질의 상기 변이체 중 하나 이상은 상기 표적 분자와 상호작용할 수 있는 것인 단계; 및
    (e) 상기 파지 디스플레이 라이브러리의 상기 세포 중에서 상기 표적 분자와 상호작용하는 변이체 단백질을 디스플레이하는 세포를 단리하는 단계
    를 포함하는, 파지 디스플레이의 방법.
  71. (a) 제한 부위를 갖는 적어도 하나의 절편을 포함하는 제1 핵산을 제공하는 단계;
    (b) 상기 제한 부위를 포함하지 않는 적어도 하나의 절편을 포함하는 제2 핵산을 제공하는 단계;
    (c) 상기 제1 핵산의 상기 절편이 상기 제2 핵산의 상기 절편으로 대체되도록 하는 상기 제1 핵산 및 상기 제2 핵산의 재조합 반응에 상기 제1 핵산 및 상기 제2 핵산을 적용함으로써 상기 제한 부위를 포함하지 않는 재조합 산물을 생성하는 단계;
    (d) 상기 제한 부위를 절단할 수 있는 제한 효소를 발현하는 세포 내로 상기 반응 산물을 형질전환시키는 단계; 및
    (e) 상기 세포에 의해 발현되는 상기 제한 효소에 의해 절단되도록 하기에 충분한 방식으로 상기 세포를 인큐베이션하는 단계
    를 포함하는, 비-재조합 핵산을 선택적으로 분해하는 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 세포가 상기 제한 효소에 의해 절단되는 제한 부위를 포함하지 않는 재조합 산물을 포함하는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  73. 제71항에 있어서, 상기 세포로부터 상기 재조합 산물을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  74. 제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제한 효소가 Eco29kI인 방법.
  75. 제71항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 산물이 이뮤노글로불린 경쇄 및 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩하며, 상기 이뮤노글로불린 경쇄 및 상기 이뮤노글로불린 중쇄 중 하나 이상이 상기 제1 핵산의 적어도 일부분 및 상기 제2 핵산의 적어도 일부분에 의해 코딩되는 것인 방법.
  76. (a) 제한 부위를 갖는 적어도 하나의 절편을 포함하는 제1 핵산을 제공하는 단계;
    (b) 상기 제한 부위를 포함하지 않으며 상기 제한 부위를 갖는 상기 제1 핵산의 적어도 하나의 절편에 혼성화될 수 있는 적어도 하나의 절편을 갖는 제2 핵산을 제공하는 단계;
    (c) 상기 제2 핵산을 상기 제1 핵산에 혼성화시킴으로써 헤테로듀플렉스 DNA를 생성하는 단계;
    (d) 상기 헤테로듀플렉스 DNA를 해상함으로써 상기 제한 부위를 포함하지 않는 산물을 생성하는 단계;
    (e) 상기 제한 부위를 절단할 수 있는 제한 효소를 발현하는 세포 내로 상기 반응 산물을 형질전환시키는 단계; 및
    (f) 상기 세포에 의해 발현되는 상기 제한 효소에 의해 절단되도록 하기에 충분한 방식으로 상기 세포를 인큐베이션하는 단계
    를 포함하는, 비-돌연변이유발 핵산을 선택적으로 분해하는 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 세포가 상기 제한 효소에 의해 절단되는 제한 부위를 포함하지 않는 산물을 포함하는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  78. 제76항에 있어서, 상기 세포로부터 상기 산물을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  79. 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제한 효소가 Eco29kI인 방법.
  80. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산물이 이뮤노글로불린 경쇄 및 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩하며, 상기 이뮤노글로불린 경쇄 및 상기 이뮤노글로불린 중쇄 중 하나 이상이 상기 제2 핵산의 적어도 일부분 또는 그의 서열에 의해 코딩되는 것인 방법.
  81. 제76항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산이 ssDNA 중간자이고, 상기 제2 핵산이 ssDNA 변이체인 방법.
  82. (a) 정지 코돈이 없다면 발현이 가능한 오픈 리딩 프레임의 적어도 하나의 절편에 하나 이상의 정지 코돈을 포함하는 제1 핵산을 제공하는 단계;
    (b) 정지 코돈을 포함하지 않는 적어도 하나의 절편을 포함하는 제2 핵산을 제공하는 단계;
    (c) 상기 제1 핵산의 상기 절편이 상기 제2 핵산의 상기 절편으로 대체되도록 하는 상기 제1 핵산 및 상기 제2 핵산의 재조합 반응에 상기 제1 핵산 및 상기 제2 핵산을 적용함으로써 상기 오픈 리딩 프레임에 정지 코돈을 포함하지 않는 재조합 산물을 생성하는 단계;
    (d) 상기 반응 산물을 세포 내로 형질전환시키는 단계; 및
    (e) 상기 오픈 리딩 프레임의 발현을 허용하기에 충분한 기간 동안 상기 세포를 인큐베이션하는 단계
    를 포함하는, 돌연변이유발된 오픈 리딩 프레임으로부터 단백질을 선택적으로 발현시키는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 세포가 상기 제1 핵산의 일부분의 서열 및 상기 제2 핵산의 적어도 일부분의 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임으로부터 발현된 단백질 또는 그의 부분을 포함하는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  84. 제82항에 있어서, 상기 제1 핵산의 일부분의 서열 및 상기 제2 핵산의 적어도 일부분의 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임으로부터 발현된 단백질 또는 그의 단편을 상기 세포로부터 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  85. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 산물이 이뮤노글로불린 경쇄 및 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩하며, 상기 이뮤노글로불린 경쇄 및 상기 이뮤노글로불린 중쇄 중 하나 이상이 상기 제1 핵산의 적어도 일부분 및 상기 제2 핵산의 적어도 일부분에 의해 코딩되는 것인 방법.
  86. 제82항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 반응이, 제1 핵산은 ssDNA 중간자이고 제2 핵산은 ssDNA 변이체인 돌연변이유발 반응인 방법.
  87. (a) 정지 코돈이 없다면 발현이 가능한 오픈 리딩 프레임의 적어도 하나의 절편에 하나 이상의 정지 코돈을 포함하는 제1 핵산을 제공하는 단계;
    (b) 정지 코돈을 포함하지 않으며 상기 정지 코돈 중 하나 이상을 갖는 상기 제1 핵산의 적어도 하나의 절편에 혼성화될 수 있는 적어도 하나의 절편을 포함하는 제2 핵산을 제공하는 단계;
    (c) 상기 제2 핵산을 상기 제1 핵산에 혼성화시킴으로써 헤테로듀플렉스 DNA를 생성하는 단계;
    (d) 상기 헤테로듀플렉스 DNA를 해상함으로써 상기 오픈 리딩 프레임에 정지 코돈을 포함하지 않는 산물을 생성하는 단계;
    (e) 상기 반응 산물을 세포 내로 형질전환시키는 단계; 및
    (f) 상기 오픈 리딩 프레임의 발현을 허용하기에 충분한 기간 동안 상기 세포를 인큐베이션하는 단계
    를 포함하는, 돌연변이유발된 오픈 리딩 프레임으로부터 단백질을 선택적으로 발현시키는 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 세포가 상기 제1 핵산의 일부분의 서열 및 상기 제2 핵산의 적어도 일부분의 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임으로부터 발현된 단백질 또는 그의 부분을 포함하는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  89. 제87항에 있어서, 상기 제1 핵산의 일부분의 서열 및 상기 제2 핵산의 적어도 일부분의 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임으로부터 발현된 단백질 또는 그의 단편을 상기 세포로부터 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  90. 제87항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산물이 이뮤노글로불린 경쇄 및 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩하며, 상기 이뮤노글로불린 경쇄 및 상기 이뮤노글로불린 중쇄 중 하나 이상이 상기 제2 핵산의 적어도 일부분 또는 그의 서열에 의해 코딩되는 것인 방법.
  91. 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 반응이, 제1 핵산은 ssDNA 중간자이고 제2 핵산은 ssDNA 변이체인 돌연변이유발 반응인 방법.
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