CN110951762A - 一种利用dITP进行基因随机突变的方法 - Google Patents

一种利用dITP进行基因随机突变的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110951762A
CN110951762A CN201911357756.0A CN201911357756A CN110951762A CN 110951762 A CN110951762 A CN 110951762A CN 201911357756 A CN201911357756 A CN 201911357756A CN 110951762 A CN110951762 A CN 110951762A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ditp
gene
mutation
random mutation
target gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911357756.0A
Other languages
English (en)
Inventor
袁慧
田文齐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suhou Bolaiheng Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Suhou Bolaiheng Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suhou Bolaiheng Biotechnology Co ltd filed Critical Suhou Bolaiheng Biotechnology Co ltd
Priority to CN201911357756.0A priority Critical patent/CN110951762A/zh
Publication of CN110951762A publication Critical patent/CN110951762A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用dITP进行基因随机突变的方法，在Taq DNA聚合酶的PCR体系中加入dITP，得到PCR扩增产物；dITP与4种碱基都能够配对，因此在目标基因中引入了大量的突变碱基。将扩增的PCR产物克隆到目的载体，获得目标基因的全位点随机突变文库。本发明的基因突变文库的突变覆盖度高，突变丰度可调，是一种构建基因随机突变文库的良好方法，可用于目标基因定向进化突变筛选。

Description

一种利用dITP进行基因随机突变的方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种利用dITP进行基因随机突变的方法。
背景技术
基因突变对于获得特定性能的蛋白质和功能基因至关重要。经典的基因突变技术有随机突变、定点突变等。定点突变虽然能够在特定位点引入特定碱基突变，但一次只能引入一种突变碱基，若进行饱和突变需要合成多条突变引物，导致工作量和成本大大增加。常规随机突变技术主要通过改变Taq DNA聚合酶的PCR体系来实现，例如增加镁离子浓度等。改变PCR体系的缓冲液组成引入的随机突变数量有限，很难保证绝大多数位点都被突变，不能够为后期从随机突变文库中获得目的突变体提供足量的突变体。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种利用dITP进行PCR，大幅增高目标基因随机突变丰度的方法，为从突变文库筛选获得性能改善的突变体提供足量的随机突变体，提高了筛选效率，可用于各种基因的随机突变法功能进化。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种利用dITP进行基因随机突变的方法，包括步骤为：(1)PCR反应中添加一定比例的dITP进行PCR扩增，得到含随机突变碱基的目标基因扩增产物；(2)对步骤(1)得到的扩增产物用限制性核酸内切酶加DNA连接酶法/或DNA重组法等非连接酶依赖性基因克隆技术，将目标基因的随机突变片段克隆到特定载体；(3)将步骤(2)得到的重组载体转化大肠杆菌，经37度培养大肠杆菌，抽提质粒等操作获得目标基因的随机突变文库，即插入了随机突变的目标基因的质粒文库。
在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中所述目标基因的扩增中采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有扩增目标基因的正向引物、扩增目标基因的反向引物、目标核酸模板分子、低忠实性DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸、dITP。
在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中所述dITP与正常dNTP的相对比例可调。
在本发明一个较佳实施例中，步骤(2)中所述随机突变基因克隆到载体的克隆方法可以是经典的限制性内切酶与DNA连接酶的常规克隆方法，也可是各种不依赖于DNA连接酶的克隆方法。
在本发明一个较佳实施例中，步骤(3)还包括对含随机突变目标基因的完整重组质粒载体挑取一定数目单克隆，测序鉴定目标基因在单一克隆中的突变丰度。
本发明的有益效果是：
(1)所述利用dITP进行PCR随机引入突变的方法不需要合成多条引物，利用dI与4种正常碱基配对原则，能够实现基因各个位点的随机突变；
(2)所述利用dITP进行基因随机突变的方法，能够通过改变添加的dITP与正常dNTP的比例，来无极调控随机突变丰度；
(3)所述利用dITP进行基因随机突变的方法能够克服现有随机技术中随机突变丰度低的缺陷，能够应用于构建基因高丰度随机突变文库，增加从突变文库中获得目标突变体的概率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1是本发明的利用dITP进行基因随机突变的方法一较佳实施例的流程图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：枯草芽孢杆菌单链DNA结合蛋白SSB的随机突变文库构建
请参阅图1，提供一种利用dITP进行Thermus thermophilis mutS(TthmutS)基因随机突变的方法，包括步骤为：
(1)设计合成用于扩增目标基因TthmutS的引物
引物-F：5’CCCCCCGGATCCatgggggggt atggcggagt。
引物-R：5’CCCCCCGAATTCtcaccccttc atgctaccca。
正向引物下划线为BamHI，反向引物下划线为EcoRI限制性酶切位点。
(2)采用聚合酶链式反应PCR扩增目标基因TthmutS的随机突变的DNA片段。将扩增目标基因的正向引物与反向引物、Thermus thermophilus基因组DNA或含野生型TthmutS的质粒载体DNA、低忠实性Taq DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)、dITP加入PCR反应缓冲液，进行PCR反应。PCR反应体系(50微升)组成如下：正向引物(0.2μM)、反向引物(0.2μM)、野生型质粒模板分子(5纳克)、Taq DNA聚合酶(2.5个单位)、4种脱氧核苷三磷酸(0.2mM)，dITP(0.02mM)。PCR条件为95度5分钟；(95度0.5分钟，52度0.5分钟，72度3分钟)×30循环；72度×3分钟；16度3分钟。
(3)TthmutS随机突变DNA片段的克隆。在100微升限制性内切酶反应体系中，加入100U的限制性内切酶BamHI与EcoRI，10微克PCR产物，在37度消化2小时，PCR产物纯化试剂盒回收限制性内切酶处理的TthmutS随机突变基因的DNA。在100微升DNA连接酶反应体系中，加入8微克BamHI/EcoRI消化的TthmutS随机突变DNA片段，3微克BamHI/EcoRI消化的pUC18质粒。在20度反应2小时。将随机突变的TthmutS基因片段插入pUC18质粒。
(4)含随机突变的TthmutS目标基因的重组质粒转化大肠杆菌。含随机突变的TthmutS目标基因的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，在固体培养基上37度培养过夜。
(5)随机突变质粒文库的制备与突变的测序鉴定。挑取5-10个单菌落，培养后抽提含质粒，测序鉴定TthmutS基因单一克隆的突变含量。将所有克隆收集培养，抽提质粒，获得TthmutS基因的质粒型突变文库。
本发明利用dITP在PCR扩增的过程中与4种碱基均能配对的特性，PCR扩增目标基因，在PCR产物中引入随机突变，并将突变后的目标基因DNA片段引入载体中，转化大肠杆菌后，抽提含随机突变基因的质粒载体，构建目标基因的质粒型突变文库。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (5)

1.一种利用dIITP进行基因随机突变的方法，其特征在于，包括步骤为：(1)PCR反应中添加一定比例的dITP进行PCR扩增，得到含随机突变碱基的目标基因扩增产物；(2)对步骤(1)得到的扩增产物用限制性核酸内切酶加DNA连接酶法/或DNA重组法等非连接酶依赖性基因克隆技术，将目标基因的随机突变片段克隆到特定载体；(3)将步骤(2)得到的重组载体转化大肠杆菌，经37度培养大肠杆菌，抽提质粒等操作获得目标基因的随机突变文库，即插入了随机突变的目标基因的质粒文库。
2.根据权利要求1所述的利用dITP进行基因随机突变的方法，其特征在于，步骤(1)中所述扩增中采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有扩增目标基因的正向引物、扩增目标基因的反向引物、目标核酸模板分子、Taq DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸，次黄嘌呤核苷三磷酸dITP。
3.根据权利要求1所述的利用dITP进行基因随机突变的方法，其特征在于，步骤(1)中所述次黄嘌呤核苷三磷酸dITP与正常dNTP的相对比例可调。
4.根据权利要求1所述的利用dITP进行基因随机突变的方法，其特征在于，步骤(2)中所述基因克隆方法可以是经典的限制性内切酶与DNA连接酶的常规克隆方法，也可是各种不依赖于DNA连接酶的克隆方法。
5.根据权利要求1所述的利用dITP进行基因随机突变的方法，其特征在于，步骤(3)还包括对含随机突变目标基因的完整重组质粒载体的抽提与挑取单克隆测序鉴定突变程度。
CN201911357756.0A 2019-12-25 2019-12-25 一种利用dITP进行基因随机突变的方法 Pending CN110951762A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911357756.0A CN110951762A (zh) 2019-12-25 2019-12-25 一种利用dITP进行基因随机突变的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911357756.0A CN110951762A (zh) 2019-12-25 2019-12-25 一种利用dITP进行基因随机突变的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110951762A true CN110951762A (zh) 2020-04-03

Family

ID=69984099

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911357756.0A Pending CN110951762A (zh) 2019-12-25 2019-12-25 一种利用dITP进行基因随机突变的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110951762A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101532043A (zh) * 2009-04-22 2009-09-16 四川大学 一种新型的基因突变重组方法及其应用
CN106754875A (zh) * 2016-12-12 2017-05-31 中国科学院天津工业生物技术研究所 基因饱和突变库及其构建方法、应用
CN109266644A (zh) * 2018-10-21 2019-01-25 苏州博睐恒生物科技有限公司 一种利用dI引物进行基因定点饱和突变的方法
CN109266670A (zh) * 2018-10-21 2019-01-25 苏州博睐恒生物科技有限公司 利用dI碱基进行基因克隆与点突变的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101532043A (zh) * 2009-04-22 2009-09-16 四川大学 一种新型的基因突变重组方法及其应用
CN106754875A (zh) * 2016-12-12 2017-05-31 中国科学院天津工业生物技术研究所 基因饱和突变库及其构建方法、应用
CN109266644A (zh) * 2018-10-21 2019-01-25 苏州博睐恒生物科技有限公司 一种利用dI引物进行基因定点饱和突变的方法
CN109266670A (zh) * 2018-10-21 2019-01-25 苏州博睐恒生物科技有限公司 利用dI碱基进行基因克隆与点突变的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOHAN H.SPEE等: "Efficient random mutagenesis method with adjustable mutation frequency bu use of PCR and dITP", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *
OSCAR P. KUIPERS: "Random Mutagenesis by Using Mixtures of dNTP and dITP in PCR", 《METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY》 *
TAKASHI KOYANAGI等: "A Rapid,Simple,and Effective Method of Constructing a Randomly Mutagenized Plasmid Library Free from Ligation", 《BIOSCIENCE,BIOTECHNOLOGY,AND BIOCHEMISTRY》 *
王未未等: "通过原位易错PCR一步构建基因突变文库", 《微生物学通报》 *
赵和: "生物技术在基因诱变中的应用", 《河北农业科学》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11639511B2 (en) CRISPR enabled multiplexed genome engineering
KR20140004053A (ko) 핵산분자의 제조방법
US20210277385A1 (en) Method for editing dna in cell-free system
EP3591051A1 (en) Method for replicating or amplifying circular dna
CN108424907B (zh) 一种高通量dna多位点精确碱基突变方法
US9834762B2 (en) Modified polymerases for replication of threose nucleic acids
CN114901820A (zh) 构建基因突变文库的方法
JP2022515085A (ja) 一本鎖ｄｎａの合成方法
CN110951762A (zh) 一种利用dITP进行基因随机突变的方法
US20020119535A1 (en) Method for recombining polynucleotides
US7771974B2 (en) Degenerate oligonucleotide gene shuffling
WO2022061748A1 (zh) 广谱识别PAM序列的FnCpf1突变体及其应用
US20060199185A1 (en) Plasmid having a function of t-vector and expression vector, and expression of the target gene using the same
KR101155368B1 (ko) 나노아케움 이퀴탄스 플러스 ＤＮＡ 중합효소, 이의제조방법　및 데옥시유티피 (ｄＵＴＰ)와 우라실-ＤＮＡ글리코실라제 (ＵＤＧ)를 이용한 중합효소 연쇄 반응(ＰＣＲ) 방법
Palis et al. A simple and efficient method for in vitro site-directed mutagenesis
AU2022232600A1 (en) Analyzing expression of protein-coding variants in cells
Slupphaug et al. Genomic Uracil—Valuable Tool in Molecular Biology but Inherent Problem in Sequencing of Ancient DNA
CN117487830A (zh) 一种用于多片段快速高效组装构建质粒的方法
CN117015602A (zh) 分析细胞中蛋白质编码变体的表达
US20050153338A1 (en) Method for obtaining circular mutated or chimeric polynucleotides
CN110241117A (zh) 一种双碱基突变的高活性sgRNA骨架、sgRNA骨架载体及其应用
KR20090036452A (ko) 인버스 ｐｃｒ을 이용한 부위-지정 돌연변이 유발방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200403

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication