CN106011162A - 大肠杆菌细胞内原位进化目标蛋白质的新方法 - Google Patents

大肠杆菌细胞内原位进化目标蛋白质的新方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种在大肠杆菌细胞内原位进化蛋白质的新方法。首先制备目标蛋白质分子中特定氨基酸位点的寡核苷酸饱和突变单链库，或制备目标蛋白质分子的同源双链或单链DNA突变库；将上述突变库转化含有目标基因或已经整合目标基因的大肠杆菌，通过λ‑Red同源重组技术，建立含目标基因突变库的大肠杆菌菌群；再次将DNA突变库转化上述得到的大肠杆菌，形成更大库容量的大肠杆菌突变库；循环操作上述过程3‑30次，构建含有目标基因突变的大肠杆菌基因组突变库；最后通过高效筛选或高通量筛选获得多种目标蛋白质突变体。这一技术可应用于微生物单个基因原位进化或多个目标基因的同时原位进化，提高酶催化活性，并应用于提高微生物代谢产物的产率。

Description

大肠杆菌细胞内原位进化目标蛋白质的新方法
发明领域
本发明涉及一种在大肠杆菌细胞内原位进化蛋白质的新方法，属于生物技术领域。
背景技术
定向进化技术是一种在实验室中模拟达尔文进化,进化出在自然界并不存在的或是具有更优性质的蛋白质，并可以通过改变酶的催化效率改变代谢流，扩展或构建新的代谢途径，弱化或消除不必要或有害的代谢途径，从而达到提高某种代谢产物产率或降解有害物质的目的。定向进化技术主要有两个步骤：首先利用现代分子生物学方法构建基因的突变文库，然后耦合筛选方法对文库进行筛选。突变文库的构建可以提供足够的多样性以供筛选，是定向进化的关键步骤。按照DNA突变发生的场所，构建突变文库的技术可以分为体外突变和体内突变。
体外突变技术主要有易错PCR(error prone PCR)，DNA改组(DNA shuffling)，交错延伸过程(Staggered extension process,StEP)，定点饱和突变技术(Site directedsaturation mutagenesis,SDSM)，迭代饱和突变(Iterative saturation mutagenesis，ISM)等。易错PCR(error prone PCR)是通过改变聚合酶链式反应条件而随机引入点突变的；DNA改组(DNA shuffling)是一种DNA分子的体外重组技术，通过将一组序列相关的DNA序列用DNase I随机切割成小片段，随后进行PCR重聚实现基因重排得到突变文库，再筛选出有预期性状的基因，这种方法可以实现与亲本序列有70％同源性序列的重组；而交错延伸过程(Staggered extension process,StEP)是一种简化了的DNA改组技术。定点饱和突变技术(Site directed saturation mutagenesis,SDSM)是将目的蛋白靶位点的氨基酸用分别其他19种氨基酸替代，分析靶位点改造后蛋白的活性；迭代饱和突变(Iterativesaturation mutagenesis，ISM)是一种反复的饱和突变方法，通过选择结构已知蛋白的几个重要区域的1-2个或3个位点同时进行反复饱和突变后获得突变体文库，并进行筛选以获得功能提高的突变体。以上这些体外突变技术虽然突变的效率比较高，但是必须将突变的基因通过酶切连接到相应的载体上转化到生物体内，突变基因被转录翻译为对应的蛋白表现出一定表型，才可以耦合相应的筛选技术对突变文库进行筛选。酶切连接转化的步骤操作繁琐、过程复杂，不能、连续进化，不能自发进化，需要人工干预。
体内突变技术有物理化学诱变，PACE(噬菌体辅助持续进化,MAGE(多位点自动化基因组编辑)。物理、化学诱变是利用物理、化学等因素处理生物体，以诱发遗传物质的突变，从而引起形态特征的变异。这一传统的诱变方法的突变效率低而且没有目标性。最近，哈佛大学David R Liu实验室开发了一种基于噬菌体生长的连续进化系统，通过在大肠杆菌体内表达易突变的DNA聚合酶产生突变，并结合M13噬菌体建立了筛选体系实现了定向进化的自动化。但是PACE技术的突变效率比较低只有10-5，对一个1kb的基因随机的3个位点实现饱和突变几乎没有可能，另外PACE技术只可以对一个基因进行进化。
George Church实验室发明了MAGE(多重自动基因组改造技术)。它同时针对基因组的不同区域设计一系列的单链寡核苷酸简并引物，利用λ-Red同源重组系统将这些简并引物整合到基因组上，实现单个细胞基因组多个位点的改造或细胞群体间基因组改造的多样性。他们针对该技术的周期性和可扩展性设计了可以实现该过程的自动化操作装置。利用该技术定向改造大肠杆菌中番茄红素合成过程中的20个基因的RBS区，设计不同的简并引物，使他们定向进化到认为可以提高表达量的经典的SD序列(TAAGGAGGT)模式，最终筛选得到高产菌株，并对这些高产菌株的基因序列分析得出参与番茄红素合成起始以及末端的基因的RBS序列趋于相似。MAGE技术虽然在体内实现了对代谢通路中多基因RBS序列的突变文库的构建，但是并没有实现对代谢途径中单个或多个目标蛋白质的结构基因进行原位定向进化。但在大肠杆菌细胞内，一个目标基因所编码的酶蛋白在微生物代谢网络中所起到的代谢调控作用，往往取决于该基因的体内表达水平和编码蛋白质的酶活性。已报道，有很多方法被发明如何调控目标基因的表达，但还没有出现在大肠杆菌细胞内进行原位同源重组进化酶蛋白基因的方法。
发明内容
本发明涉及一种在大肠杆菌细胞内原位进化蛋白质的新方法，并应用于一种或多种酶催化性能的提高，从而提高微生物特定目标代谢产物的产率。
在本发明中，包括构建一个包含一个或多个突变位点的核酸库，包括体外合成的寡核苷酸单链库或制备的单链DNA库或双链DNA库，通过λ-Red同源重组技术，利用所述核酸库对大肠杆菌胞内载体上或基因组上的结构基因进行原位重组，达到进化酶分子结构提高酶催化效率的目的。寡核苷酸可以以化学合成的方式获取；单链核苷酸的获取方式包括但不限于T7逆转录法，核酸外切酶法，变性高效液相色谱法，磁珠捕获法，不对称PCR，两步PCR法等；双链核苷酸可以通过PCR法合成获得。
寡核苷酸和单链核苷酸可以在其5’端的1至4位碱基处进行修饰；双链核苷酸在其中一条链的5’端的1至4位碱基处进行修饰，以避免在转化入细胞后被核酸酶所降解。修饰的方式包括但不限于5’端溴尿嘧啶修饰，5’端氯尿嘧啶修饰，5’端碘代尿嘧啶修饰，磷酸酯修饰，硫代磷酸修饰等。
寡核苷酸、单链核苷酸和双链核苷酸可以通过转化或者转染的方式进入细胞内。这里提到的转化和转染指的是一些成熟地把外源核苷酸导入目标细胞的技术，包括但不限于磷酸钙法，氯化钙法，脂质体转染，电穿孔法，光穿孔法等。转染介质包括但不限于水，氯化钙，脂质体等。
在转化或转染之前，大肠杆菌细胞在30℃培养至一定浓度，并于42℃进行诱导。在细胞基因组上的λ-Red同源重组系统在pL启动子控制下，并受到cI857阻遏蛋白的调控。在30℃时pL启动子受阻遏不表达，42℃时诱导表达λ-Red同源重组所需的三个蛋白。经过15min诱导之后的细胞放于4℃保存，防止诱导的蛋白降解。
培养基需要置换成转染介质，去除其中的离子。此过程可以采用的方式包括但不限于离心法，膜过滤法等。
在转化或转染过程中，加入核酸库的同时，引入抗性回复核苷酸片段，可以在抗性平板上进行筛选，并提高抗性基因附近位置的重组效率。合适的抗性基因包括但不限于氨苄抗性基因，四环素抗性基因，卡那霉素抗性基因，新霉素抗性基因，氯霉素抗性基因等。
合适的筛选标记可以被应运于平板筛选，流式细胞仪筛选，微流控等。筛选标记包括但不限于各种酶，辅助基团，荧光标记，发光标记，生物发光基团等。荧光标记包括但不限于黄色荧光蛋白，绿色荧光蛋白，青色荧光蛋白，罗丹明等。生物发光基团包括但不限于萤光素酶，发光蛋白质等。一些能产生视觉信号的酶包括但不限于半乳糖苷酶，磷酸酶，过氧化物酶，胆碱酯酶等。
本发明为了在体内实现较高的突变率并对基因组上的一个或多个基因进行突变，提供了一种体内突变方法，通过反复λ-Red同源重组的策略对大肠杆菌的整个基因组进行突变，尤其是对结构基因的修饰，达到对功能蛋白所对应基因的原位进化目的。此方法可以对基因组上单一基因进行进化，也可以同时对多个基因进行修饰，并耦合筛选，寻找出多个突变蛋白协同作用所达到的最佳效果。
本发明所提供的在大肠杆菌细胞内原位进化蛋白质的新方法是一种有效得获得所需生物分子或生物物质的方法，比以往的方法更加简便、高效。
本发明所提供的在大肠杆菌细胞内原位进化蛋白质的新方法，可以通过大肠杆菌胞内目标基因关键氨基酸的原位饱和突变，提高吡咯喹啉依赖型葡萄糖脱氢酶的热稳定性和催化特异性。
本发明所提供的在大肠杆菌细胞内原位进化蛋白质的新方法，所述方法可应用于体内原位重组突变番茄红素合成关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因，提高其表达蛋白的可溶性水平和催化效率。通过筛选得到的5个1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)突变体。其中，突变体DXSa(S217P，L226H)，DXSb(K214E，K227E，G512H)，DXSc(E230G)和DXSd(Y115H，E182A，L226R，F435S)的可溶表达相对于野生型DXS蛋白都提高了2倍以上。DXS突变体(DXSa，DXSb，DXSd和DXSe(I170T K213E，N249S))的比酶活都得到了明显提高，从而提高了含相应突变基因的大肠杆菌生物合成番茄红素水平2-5倍。
本发明所提供的在大肠杆菌细胞内原位进化蛋白质的新方法，所述方法可采用同时突变多个番茄红素关键酶基因从而提高大肠杆菌合成番茄红素的生产水平。
本发明还提供了大肠杆菌菌株EcLYCb，保存编号为CCTCC M 2015692的大肠杆菌菌株，该菌株的可溶性表达水平和酶催化效率都得到明显提高。
本发明还提供了大肠杆菌菌株EcLYC246，保存编号为CCTCC M 2015692，提高了大肠杆菌合成番茄红素的生产水平。
附图说明
图1：本发明流程与传统DNA重排技术对比示意图。其中，DNA Shuffling Method：DNA重排技术；DNase I Digestion：DNase I酶切；cycles of denaturation，annealing，extension：多次变性，连接，延伸；Cloning，Transformation：克隆，转化；Gene：基因；Error-Prone PCR：易错PCR；Asymmetric PCR：不对称PCR；Synthetic Oligos：合成寡聚核苷酸；cycles of Recombination：多次重组；Genome：基因组；E.coli：大肠杆菌。
图2：野生型及GDH突变体在55℃的热稳定性分析图。
图3：野生型及DXS突变蛋白的可溶表达情况对比图。其中，Comparation ofSoluble DXS Expression：可溶DXS蛋白表达情况对比；Marker：蛋白分子量标准大小。
图4：野生型及DXS突变蛋白的比酶活对比图。其中，Retention time：保留时间；Specific enzyme activity：比酶活。
图5：野生型及含dxs突变体的大肠杆菌菌株产番茄红素能力对比图；其中，Lycopene Production：番茄红素产量。
图6：野生型及含dxs突变体的大肠杆菌菌株产番茄红素能力对比图；其中，Lycopene Production：番茄红素产量。
图7：野生型及含多个基因突变的大肠杆菌菌株产番茄红素能力对比图；其中，Lycopene Production：番茄红素产量。
图8：野生型及含多个基因突变的大肠杆菌菌株产番茄红素能力对比图；其中，Lycopene Production：番茄红素产量。
具体实施方式
本发明的操作流程如图1所示，并通过以下五个例子更好得阐述，分别为提高吡咯喹啉依赖型葡萄糖脱氢酶热稳定性和催化特异性，提高1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶的可溶表达和催化活性，以及提高大肠杆菌中番茄红素合成途径的多个关键酶的催化活性。
实施例1，大肠杆菌体内原位进化吡咯喹啉依赖型葡萄糖脱氢酶
大肠杆菌EcNR2(Harris H.Wang等.2009Nature.460:894-890)在温度条件诱导下可以表达λ-Red重组所需蛋白，表现出对80-100nt寡核苷酸的高重组效率。
把吡咯喹啉依赖型葡萄糖脱氢酶基因(gdh)通过λ-Red同源重组插入到上述菌株基因组上，命名为EcGDH。设计两条90nt含兼并碱基的寡核苷酸分别对应gdh基因的两个活性位点：热稳定性(S231，SEQ ID NO.1)和催化特异性(N452，SEQ ID NO.2)，构成一个寡核苷酸突变库，并用该突变库在基因组上进行点饱和突变。同时合成一条用于恢复原本基因组上被沉默的氯霉素抗性基因的90nt寡核苷酸(SEQ ID NO.3)。
在50mL LB培养基的摇瓶中接入从平板上挑取的大肠杆菌EcGDH单菌落，并加入25μL卡那霉素，30℃下摇床过夜培养；
转接1％的菌液至2mL LB培养基的试管中，置于30℃下摇床培养2.5-3h至OD达到0.7左右；
将试管置于42℃水浴中振荡培养15min，诱导λ-Red重组蛋白充分表达；
将试管置于冰上5min；
取1mL菌液移入1.5mL预冷离心管中，4℃下以13000r/min离心30s，弃去上清液，加入预冷的无菌水1ml重悬洗涤，弃去上清液，并用预冷的无菌水1ml重悬洗涤2次；
去除上清液，并用100μL预冷无菌水重悬菌体，加入寡核苷酸突变库和抗性回复寡核苷酸；
将上述混合物转移到2mm电转杯中，在电容25μF，电压2.5kV，电阻200Ω条件下进行电击；
迅速将准备好的1ml SOC培养基加入到电击杯中，轻轻吹打使细胞悬浮。将电击杯中的混合液转移到装有1ml培养基的试管中，放入30℃摇床培养，使细胞复苏；
当细胞复苏到OD达到0.7左右时，重复上述步骤，进行第二轮转化。该转化过程一共进行3-5轮；
最后一轮电转后，复苏12h。在氯霉素抗生素平板上进行筛选，通过与一系列底物的显色反应来筛选热稳定性提高或催化特异性提高的突变子。野生型EcGDH及GDH突变体(EcGDHa，EcGDHb，EcGDHc，EcGDHd，EcGDHe，EcGDHf)的催化特异性对比如表1所示，其在55℃的热稳定性分析如图2所示。
表1：各种GDH突变体的氨基酸突变及催化特性总结
从表中可以看出，大肠杆菌菌株EcGDHa，EcGDHb，EcGDHc，EcGDHd中的GDH突变体的底物特异性得到了提高。相对于野生型大肠杆菌中的GDH，其对于乳糖和麦芽糖的相对活性降低了28％至42％。大肠杆菌菌株EcGDHb和EcGDHf中的GDH突变体的热稳定相对于野生型GDH分别提高了1.69和1.6倍。
实施例2用双链核苷酸在大肠杆菌体内原位进化1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶
双链核苷酸在大肠杆菌中通过λ-Red同源重组的效率比较低，只有0.01％。研究发现，大肠杆菌EcNR2(Harris H.Wang等.(2009)Nature.460:894-890)在温度条件诱导下可以表达λ-Red重组所需蛋白，通过与抗性回复片段共同转化可以显著提高重组效率。
1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(dxs)是大肠杆菌中异戊二烯合成途径中一个关键酶，以3-磷酸-甘油醛和丙酮酸为底物合成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。在大肠杆菌EcNR2中引入外源基因crtE，crtB，crtI，使得该大肠杆菌可以产番茄红素，命名为EcLYC。由于番茄红素具有可见的红色，可以根据菌落红色的深浅，高通量的筛选番茄红素产量提高的菌株。
体外制备带突变的双链dxs基因：
根据NCBI上的CCD工具分析结果发现，DXS蛋白有三个保守区域，所以制备了3条带突变的双链核苷酸；
分别用5’端4个碱基硫代修饰的上引物dxs-1-for(SEQ ID NO.4),dxs-2-for(SEQID NO.5),dxs-3-for(SEQ ID NO.6)和下引物dxs-1-rev(SEQ ID NO.7),dxs-2-rev(SEQID NO.8),dxs-3-rev(SEQ ID NO.9)，在添加Mn2+的条件下，94℃45s，54℃50s，72℃1min循环30次做易错PCR，割胶纯化回收得到的含有突变的双链突变库。
在50mL LB培养基的摇瓶中接入从平板上挑取的大肠杆菌EcLYC单菌落，并加入25μL卡那霉素，30℃下摇床过夜培养；
转接1％的菌液至2mL LB培养基的试管中，置于30℃下摇床培养2.5-3h至OD达到0.7左右；
将试管置于42℃水浴中振荡培养15min，诱导λ-Red重组蛋白充分表达；
将试管置于冰上5min；
取1mL菌液移入1.5mL预冷离心管中，4℃下以13000r/min离心30s，弃去上清液，加入预冷的无菌水1ml重悬洗涤，弃去上清液，并用预冷的无菌水1ml重悬洗涤2次；
去除上清液，并用100μL预冷无菌水重悬菌体，加入带突变的双链突变库和抗性回复寡核苷酸；
将上述混合物转移到2mm电转杯中，在电容25μF，电压2.5kV，电阻200Ω条件下进行电击；
迅速将准备好的1ml SOC培养基加入到电击杯中，轻轻吹打使细胞悬浮。将电击杯中的混合液转移到装有1ml培养基的试管中，放入30℃摇床培养，使细胞复苏；
当细胞复苏到OD达到0.7左右时，重复上述步骤，进行第二轮转化。该转化过程一共进行8轮；
最后一轮电转后，复苏12h。在平板上筛选出红色较深的菌落。DXS蛋白的氨基酸突变情况如表2所示，其可溶性表达情况如图3所示，其比酶活情况如图4所示，以及影响产番茄红素能力对比如图5所示(其中EcLYCb已申请专利菌种保存，菌种保藏号为CCTCC M2015691)。
表2DXS突变蛋白的氨基酸突变情况
从图3中可以看出，DXS突变体DXSa(SEQ ID NO.10)，DXSb(SEQ ID NO.11)，DXSc(SEQ ID NO.12)和DXSd(SEQ ID NO.13)的可溶表达相对于野生型DXS蛋白(SEQ ID NO.14)都提高了2倍以上。可溶表达的提高使得其在胞内的有效蛋白量得到提高。通过体外酶反应可知，DXS突变体DXSa，DXSb，DXSd和DXSe(SEQ ID NO.15)的比酶活都提到了提高，并最终使得各株大肠杆菌的番茄红素积累量相对于野生型菌株提高了4倍以上。其中，EcLYCb已申请专利菌种保存，菌种保藏号为CCTCC M 2015691，此株大肠杆菌中的DXS蛋白突变体可溶表达量高，比酶活高，且番茄红素的积累量是野生型大肠杆菌菌株的5倍以上。
实施例3用单链核苷酸在大肠杆菌体内原位进化1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶
大肠杆菌EcNR2(Harris H.Wang等.(2009)Nature.460:894-890)在温度条件诱导下可以表达λ-Red重组所需蛋白，对5’端4个碱基硫代修饰的长单链也有较高的重组效率，因为在重组过程中少了把双链变单链的步骤。
1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(dxs)是大肠杆菌中异戊二烯合成途径中一个关键酶，以3-磷酸-甘油醛和丙酮酸为底物合成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。在大肠杆菌EcNR2中引入外源基因crtE，crtB，crtI，使得该大肠杆菌可以产番茄红素，作为一种筛选标志物，命名为EcLYC。
体外制备带突变的5’端4个碱基硫代修饰的dxs基因长单链：
用5’端4个碱基硫代修饰的上引物dxs-for(SEQ ID NO.16)和5’端磷酸化的下引物dxs-rev(SEQ ID NO.17)两个引物以dxs基因为模板，在添加Mn2+的条件下，94℃45s，54℃50s，72℃2min循环30次做易错PCR，割胶纯化回收得到的双链；
以上述含有突变的双链为模板，在PCR体系中只添加5’端4个碱基硫代修饰的上引物dxs-for(SEQ ID NO.16)，94℃30s，53℃30s，72℃4min循环15次，制备得到dxs单链；
用Lambda EXO外切酶处理上述得到的PCR产物，把其中的dxs双链酶切成单链；
乙醇沉淀得到5’端4个碱基硫代修饰的dxs单链突变库。
在50mL LB培养基的摇瓶中接入从平板上挑取的大肠杆菌EcLYC单菌落，并加入25μL卡那霉素，30℃下摇床过夜培养；
转接1％的菌液至2mL LB培养基的试管中，置于30℃下摇床培养2.5-3h至OD达到0.7左右；
将试管置于42℃水浴中振荡培养15min，诱导λ-Red重组蛋白充分表达；
将试管置于冰上5min；
取1mL菌液移入1.5mL预冷离心管中，4℃下以13000r/min离心30s，弃去上清液，加入预冷的无菌水1ml重悬洗涤，弃去上清液，并用预冷的无菌水1ml重悬洗涤2次；
去除上清液，并用100μL预冷无菌水重悬菌体，加入5’端4个碱基硫代修饰的dxs单链突变库和抗性回复寡核苷酸；
将上述混合物转移到2mm电转杯中，在电容25μF，电压2.5kV，电阻200Ω条件下进行电击；
迅速将准备好的1ml SOC培养基加入到电击杯中，轻轻吹打使细胞悬浮。将电击杯中的混合液转移到装有1ml培养基的试管中，放入30℃摇床培养，使细胞复苏；
当细胞复苏到OD达到0.7左右时，重复上述步骤，进行第二轮转化。该转化过程一共进行4-6轮；
最后一轮电转后，复苏12h。在平板上筛选出红色较深的菌落。野生型EcLYC及含DXS突变体的大肠杆菌菌株(EcLYC-a，EcLYC-b，EcLYC-c，EcLYC-d，EcLYC-e)产番茄红素能力对比如图6所示。
从图中可以看出，各株含有DXS突变体的大肠杆菌菌株的番茄红素积累量相对于野生型菌株都得到了提高，其中EcLYC-d提高了1倍以上。
实施例4大肠杆菌胞内原位同时进化多个番茄红素合成关键基因
引入外源基因crtE，crtB，crtI的大肠杆菌EcNR2能够合成番茄红素(EcLYC)，该合成过程主要依赖大肠杆菌中的异戊二烯合成途径，同时对ATP和NADPH都有需求。在此过程中，存在多个关键酶可以提升异戊二烯代谢流，并提高NADPH的供应量，如dxs，dxr，idi，ispA，talB等。
采用两步PCR和易错PCR获得上述基因同源带突变的单链核苷酸，以dxs基因为例，说明体外制备带突变的5’端4个碱基硫代修饰的dxs基因长单链的过程。
用5’端4个碱基硫代修饰的上引物dxs-for(SEQ ID NO.16)和5’端磷酸化的下引物dxs-rev(SEQ ID NO.17)两个引物以dxs基因为模板，在添加Mn2+的条件下，94℃45s，54℃50s，72℃2min循环30次做易错PCR，割胶纯化回收得到的双链；
以上述易错双链为模板，在PCR体系中只添加5’端4个碱基硫代修饰的上引物dxs-for(SEQ ID NO.16)，94℃30s，53℃30s，72℃4min循环15次，制备得到dxs单链；
用Lambda EXO外切酶处理上述得到的PCR产物，把其中的dxs双链酶切成单链；
乙醇沉淀得到带突变的5’端4个碱基硫代修饰的dxs单链。
重复上述方法，获得dxs，dxr，idi，ispA，talB和rpos带突变的5’端4个碱基硫代修饰的单链。
这些单链混合在一起成为一个单链DNA突变库。
在50mL LB培养基的摇瓶中接入从平板上挑取的大肠杆菌EcLYC单菌落，并加入25μL卡那霉素，30℃下摇床过夜培养；
转接1％的菌液至2mL LB培养基的试管中，置于30℃下摇床培养2.5-3h至OD达到0.7左右；
将试管置于42℃水浴中振荡培养15min，诱导λ-Red重组蛋白充分表达；
将试管置于冰上5min；
取1mL菌液移入1.5mL预冷离心管中，4℃下以13000r/min离心30s，弃去上清液，加入预冷的无菌水1ml重悬洗涤，弃去上清液，并用预冷的无菌水1ml重悬洗涤2次；
去除上清液，并用100μL预冷无菌水重悬菌体，加入单链DNA突变库和抗性回复寡核苷酸；
将上述混合物转移到2mm电转杯中，在电容25μF，电压2.5kV，电阻200Ω条件下进行电击；
迅速将准备好的1ml SOC培养基加入到电击杯中，轻轻吹打使细胞悬浮。将电击杯中的混合液转移到装有1ml培养基的试管中，放入30℃摇床培养，使细胞复苏；
当细胞复苏到OD达到0.7左右时，重复上述步骤，进行第二轮转化。该转化过程一共进行10-15轮；
最后一轮电转后，复苏12h。在平板上筛选红色较红的菌落。野生型(EcLYC)及含多个基因突变的大肠杆菌菌株(EcLYC-1，EcLYC-2，EcLYC-3，EcLYC-4，EcLYC-5)产番茄红素能力对比如图7所示。
从图中可以看出，各株含有DXS突变体的大肠杆菌菌株的番茄红素积累量相对于野生型菌株都得到了提高，其中EcLYC-5是原来的1.5倍以上。
实施例5基因组多位点进化大肠杆菌番茄红素代谢相关基因
引入外源基因crtE，crtB，crtI的大肠杆菌EcNR2能够合成番茄红素(EcLYC)，其积累量受到多方面的影响：1、大肠杆菌中番茄红素的积累依赖前体物质IPP的积累，其通过异戊二烯途径合成。过量表达该途径上的多个基因(dxs，dxr，ispD，ispE，ispG，ispH，idi，ispA)都会提高前体物质IPP的积累；2、鸟枪法研究发现多个功能未明确的基因也会影响番茄红素的积累(appY，rpoS，crl，elbA，elbB，yjiD，purH，rnlA，yggT，ycgZ，ymgA，ariR)；3、敲除异戊二烯的一些旁路代谢途径基因(ytjC，fdhF，aceE，gdhA)可以提高番茄红素的产量；4、大肠杆菌体内的能量供应也会影响番茄红素的积累(sucAB，talB，sdhABCD)。
对从上述基因中挑选的二十个基因(dxs，dxr，idi，ispA，appY，rpoS，crl，elbA，elbB，yjiD，purH，rnlA，yggT，sucA，sucB，talB，sdhA，sdhB，sdhC，sdhD)在基因组上进行原位进化，并同时用合成的含两个无义突变的寡核苷酸对四个基因(ytjC，fdhF，aceE，gdhA)进行沉默。
采用两步PCR和易错PCR获得上述基因同源带突变的单链核苷酸，以dxs基因为例，说明体外制备带突变的5’端4个碱基硫代修饰的dxs基因长单链的过程。
用5’端4个碱基硫代修饰的上引物dxs-for(SEQ ID NO.16)和5’端磷酸化的下引物dxs-rev(SEQ ID NO.17)两个引物以dxs基因为模板，在添加Mn2+的条件下，94℃45s，54℃50s，72℃2min循环30次做易错PCR，割胶纯化回收得到的双链；
以上述易错双链为模板，在PCR体系中只添加5’端4个碱基硫代修饰的上引物dxs-for(SEQ ID NO.10)，94℃30s，53℃30s，72℃4min循环15次，制备得到dxs单链；
用Lambda EXO外切酶处理上述得到的PCR产物，把其中的dxs双链酶切成单链；
乙醇沉淀得到带突变的5’端4个碱基硫代修饰的dxs单链。
重复上述方法，获得dxs，dxr，idi，ispA，appY，rpoS，crl，elbA，elbB，yjiD，purH，rnlA，yggT，sucA，sucB，talB，sdhA，sdhB，sdhC和sdhD带突变的5’端4个碱基硫代修饰的单链。
这些单链混合在一起成为一个单链DNA突变库。
把上述单链核苷酸库与合成的带无义突变的寡核苷酸混合在一起，用于对基因的重组。
在50mL LB培养基的摇瓶中接入从平板上挑取的大肠杆菌EcLYC单菌落，并加入25μL卡那霉素，30℃下摇床过夜培养；
转接1％的菌液至2mL LB培养基的试管中，置于30℃下摇床培养2.5-3h至OD达到0.7左右；
将试管置于42℃水浴中振荡培养15min，诱导λ-Red重组蛋白充分表达；
将试管置于冰上5min；
取1mL菌液移入1.5mL预冷离心管中，4℃下以13000r/min离心30s，弃去上清液，加入预冷的无菌水1ml重悬洗涤，弃去上清液，并用预冷的无菌水1ml重悬洗涤2次；
去除上清液，并用100μL预冷无菌水重悬菌体，加入单链NDA突变库和抗性回复寡核苷酸；
将上述混合物转移到2mm电转杯中，在电容25μF，电压2.5kV，电阻200Ω条件下进行电击；
迅速将准备好的1ml SOC培养基加入到电击杯中，轻轻吹打使细胞悬浮。将电击杯中的混合液转移到装有1ml培养基的试管中，放入30℃摇床培养，使细胞复苏；
当细胞复苏到OD达到0.7左右时，重复上述步骤，进行第二轮转化。该转化过程一共进行10-15轮；
最后一轮电转后，复苏12h。在平板上筛选红色较红的菌落。野生型(EcLYC)及含多个基因突变的大肠杆菌菌株(EcLYC20，EcLYC45，EcLYC60，EcLYC139，EcLYC246)产番茄红素能力对比如图8所示(其中EcLYC246已申请专利菌种保存，菌种保藏号为CCTCC M2015692)。
从图中可以看出，各株含有DXS突变体的大肠杆菌菌株的番茄红素积累量相对于野生型菌株都得到了提高。其中，EcLYC246已申请专利菌种保存，菌种保藏号为CCTCC M2015692，此株大肠杆菌中产番茄红素相关基因经过突变使其番茄红素的积累量是野生型大肠杆菌菌株的4倍以上。
文中序列
SEQ ID NO.1 热稳定性饱和突变寡核苷酸
5’-*T*C*A*CACCTATATGGGTAAAGTACTACGCTTAAATCTTGATGGANNNATTCCAAAGGATAATCCAAGTTTTAACGGGGTGGTTAGCCATA-3’(*为硫代修饰，下同)
SEQ ID NO.2 催化特异性饱和突变寡核苷酸
5’-
TCCAGATGGGAATGTCTTATATGTATTAACTGATACTGCCGGANNNGTCCAAAAAGATGATGGCTCAGTAACAAATACATTAGAAAACC-3’
SEQ ID NO.3 氯霉素抗性基因的90nt寡核苷酸
5’-*G*C*A*TCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGT-3’
SEQ ID NO.4 5’端4个碱基硫代修饰的上引物dxs-1-for
5’-*G*A*G*TTTTGATATTGCCAAATACCCGACCCTGGC-3’
SEQ ID NO.5 5’端4个碱基硫代修饰的上引物dxs-2-for
5’-*T*T*G*CCGAGCTATTCAAAAATCTTTGGCGAC-3’
SEQ ID NO.6 5’端4个碱基硫代修饰的上引物dxs-3-for
5’-*G*G*C*AAAGGCATTGTGAAGCGTCGTG-3’
SEQ ID NO.7 下引物dxs-1-rev
5’-GGTCATGATATGCAGGAACTGCGGG-3’
SEQ ID NO.8 下引物dxs-2-rev
5’-CAGTTCCACGCCGACCGCGTTGCCACGCGGGTA-3’
SEQ ID NO.9 下引物dxs-3-rev
5’-TATGCCAGCCAGGCCTTGATTTTGGC-3’
SEQ ID NO.10 DXSa氨基酸序列
MSFDIAKYPTLALVDSTQELRLLPKESLPKLCDELRRYLLDSVSRSSGHFASGLGTVELTVALHYVYNTPFDQLIWDVGHQAYPHKILTGRRDKIGTIRQKGGLHPFPWRGESEYDVLSVGHSSTSISAGIGIAVAAEKEGKNRRTVCVIGDGAITAGMAFEAMNHAGDIRPDMLVILNDNEMSISENVGALNNHLAQLLSGKLYSSLREGGKKVFPGVPPIKELHKRTEEHIKGMVVPGTLFEELGFNYIGPVDGHDVLGLITTLKNMRDLKGPQFLHIMTKKGRGYEPAEKDPITFHAVPKFDPSSGCLPKSSGGLPSYSKIFGDWLCETAAKDNKLMAITPAMREGSGMVEFSRKFPDRYFDVAIAEQHAVTFAAGLAIGGYKPIVAIYSTFLQRAYDQVLHDVAIQKLPVLFAIDRAGIVGADGQTHQGAFDLSYLRCIPEMVIMTPSDENECRQMLYTGYHYNDGPSAVRYPRGNAVGVELTPLEKLPIGKGIVKRRGEKLAILNFGTLMPEAAKVAESLNATLVDMRFVKPLDEALILEMAASHEALVTVEENAIMGGAGSGVNEVLMAHRKPVPVLNIGLPDFFIPQGTQEEMRAELGLDAAGMEAKIKAWLA*
SEQ ID NO.11 DXSb氨基酸序列
MSFDIAKYPTLALVDSTQELRLLPKESLPKLCDELRRYLLDSVSRSSGHFASGLGTVELTVALHYVYNTPFDQLIWDVGHQAYPHKILTGRRDKIGTIRQKGGLHPFPWRGESEYDVLSVGHSSTSISAGIGIAVAAEKEGKNRRTVCVIGDGAITAGMAFEAMNHAGDIRPDMLVILNDNEMSISENVGALNNHLAQLLSGKLYSSLREGGKEVFSGVPPIKELLERTEEHIKGMVVPGTLFEELGFNYIGPVDGHDVLGLITTLKNMRDLKGPQFLHIMTKKGRGYEPAEKDPITFHAVPKFDPSSGCLPKSSGGLPSYSKIFGDWLCETAAKDNKLMAITPAMREGSGMVEFSRKFPDRYFDVAIAEQHAVTFAAGLAIGGYKPIVAIYSTFLQRAYDQVLHDVAIQKLPVLFAIDRAGIVGADGQTHQGAFDLSYLRCIPEMVIMTPSDENECRQMLYTGYHYNDGPSAVRYPRGNAVGVELTPLEKLPIGKGIVKRRGEKLAILNFHTLMPEAAKVAESLNATLVDMRFVKPLDEALILEMAASHEALVTVEENAIMGGAGSGVNEVLMAHRKPVPVLNIGLPDFFIPQGTQEEMRAELGLDAAGMEAKIKAWLA*
SEQ ID NO.12 DXSc氨基酸序列
MSFDIAKYPTLALVDSTQELRLLPKESLPKLCDELRRYLLDSVSRSSGHFASGLGTVELTVALHYVYNTPFDQLIWDVGHQAYPHKILTGRRDKIGTIRQKGGLHPFPWRGESEYDVLSVGHSSTSISAGIGIAVAAEKEGKNRRTVCVIGDGAITAGMAFEAMNHAGDIRPDMLVILNDNEMSISENVGALNNHLAQLLSGKLYSSLREGGKKVFSGVPPIKELLKRTGEHIKGMVVPGTLFEELGFNYIGPVDGHDVLGLITTLKNMRDLKGPQFLHIMTKKGRGYEPAEKDPITFHAVPKFDPSSGCLPKSSGGLPSYSKIFGDWLCETAAKDNKLMAITPAMREGSGMVEFSRKFPDRYFDVAIAEQHAVTFAAGLAIGGYKPIVAIYSTFLQRAYDQVLHDVAIQKLPVLFAIDRAGIVGADGQTHQGAFDLSYLRCIPEMVIMTPSDENECRQMLYTGYHYNDGPSAVRYPRGNAVGVELTPLEKLPIGKGIVKRRGEKLAILNFGTLMPEAAKVAESLNATLVDMRFVKPLDEALILEMAASHEALVTVEENAIMGGAGSGVNEVLMAHRKPVPVLNIGLPDFFIPQGTQEEMRAELGLDAAGMEAKIKAWLA*
SEQ ID NO.13 DXSd氨基酸序列
MSFDIAKYPTLALVDSTQELRLLPKESLPKLCDELRRYLLDSVSRSSGHFASGLGTVELTVALHYVYNTPFDQLIWDVGHQAYPHKILTGRRDKIGTIRQKGGLHPFPWRGESEYDVLSVGHSSTSISAGIGIAVAAEKEGKNRRTVCVIGDGAITAGMAFEAMNHAGDIRPDMLVILNDNAMSISENVGALNNHLAQLLSGKLYSSLREGGKKVFSGVPPIKELRKRTEEHIKGMVVPGTLFEELGFNYIGPVDGHDVLGLITTLKNMRDLKGPQFLHIMTKKGRGYEPAEKDPITFHAVPKFDPSSGCLPKSSGGLPSYSKIFGDWLCETAAKDNKLMAITPAMREGSGMVEFSRKFPDRYFDVAIAEQHAVTFAAGLAIGGYKPIVAIYSTFLQRAYDQVLHDVAIQKLPVLFAIDRAGIVGADGQTHQGASDLSYLRCIPEMVIMTPSDENECRQMLYTGYHYNDGPSAVRYPRGNAVGVELTPLEKLPIGKGIVKRRGEKLAILNFGTLMPEAAKVAESLNATLVDMRFVKPLDEALILEMAASHEALVTVEENAIMGGAGSGVNEVLMAHRKPVPVLNIGLPDFFIPQGTQEEMRAELGLDAAGMEAKIKAWLA*
SEQ ID NO.14 野生型DXS氨基酸序列
MSFDIAKYPTLALVDSTQELRLLPKESLPKLCDELRRYLLDSVSRSSGHFASGLGTVELTVALHYVYNTPFDQLIWDVGHQAYPHKILTGRRDKIGTIRQKGGLHPFPWRGESEYDVLSVGHSSTSISAGIGIAVAAEKEGKNRRTVCVIGDGAITAGMAFEAMNHAGDIRPDMLVILNDNEMSISENVGALNNHLAQLLSGKLYSSLREGGKKVFSGVPPIKELLKRTEEHIKGMVVPGTLFEELGFNYIGPVDGHDVLGLITTLKNMRDLKGPQFLHIMTKKGRGYEPAEKDPITFHAVPKFDPSSGCLPKSSGGLPSYSKIFGDWLCETAAKDNKLMAITPAMREGSGMVEFSRKFPDRYFDVAIAEQHAVTFAAGLAIGGYKPIVAIYSTFLQRAYDQVLHDVAIQKLPVLFAIDRAGIVGADGQTHQGAFDLSYLRCIPEMVIMTPSDENECRQMLYTGYHYNDGPSAVRYPRGNAVGVELTPLEKLPIGKGIVKRRGEKLAILNFGTLMPEAAKVAESLNATLVDMRFVKPLDEALILEMAASHEALVTVEENAIMGGAGSGVNEVLMAHRKPVPVLNIGLPDFFIPQGTQEEMRAELGLDAAGMEAKIKAWLA*
SEQ ID NO.15 DXSe氨基酸序列
MSFDIAKYPTLALVDSTQELRLLPKESLPKLCDELRRYLLDSVSRSSGHFASGLGTVELTVALHYVYNTPFDQLIWDVGHQAYPHKILTGRRDKIGTIRQKGGLHPFPWRGESEYDVLSVGHSSTSISAGIGIAVAAEKEGKNRRTVCVIGDGAITAGMAFEAMNHAGDTRPDMLVILNDNEMSISENVGALNNHLAQLLSGKLYSSLREGGEKVFSGVPPIKELLKRTEEHIKGMVVPGTLFEELGFSYIGPVDGHDVLGLITTLKNMRDLKGPQFLHIMTKKGRGYEPAEKDPITFHAVPKFDPSSGCLPKSSGGLPSYSKIFGDWLCETAAKDNKLMAITPAMREGSGMVEFSRKFPDRYFDVAIAEQHAVTFAAGLAIGGYKPIVAIYSTFLQRAYDQVLHDVAIQKLPVLFAIDRAGIVGADGQTHQGAFDLSYLRCIPEMVIMTPSDENECRQMLYTGYHYNDGPSAVRYPRGNAVGVELTPLEKLPIGKGIVKRRGEKLAILNFGTLMPEAAKVAESLNATLVDMRFVKPLDEALILEMAASHEALVTVEENAIMGGAGSGVNEVLMAHRKPVPVLNIGLPDFFIPQGTQEEMRAELGLDAAGMEAKIKAWLA*
SEQ ID NO.16 5’端4个碱基硫代修饰的上引物dxs-for
5’-*G*A*G*TTTTGATATTGCCAAATACCCGACCCTGGC-3’
SEQ ID NO.17 5’端磷酸化的下引物dxs-rev
5’-TTATGCCAGCCAGGCCTTGATTTTG-3’(5’端磷酸化)
<110> 浙江大学
<120> 大肠杆菌细胞内原位进化目标蛋白质的新方法
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcacacctat atgggtaaag tactacgctt aaatcttgat ggannnattc caaaggataa 60
tccaagtttt aacggggtgg ttagccata 89
<210> 2
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tccagatggg aatgtcttat atgtattaac tgatactgcc ggannngtcc aaaaagatga 60
tggctcagta acaaatacat tagaaaacc 89
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcatcgtaaa gaacattttg aggcatttca gtcagt 36
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gagttttgat attgccaaat acccgaccct ggc 33
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttgccgagct attcaaaaat ctttggcgac 30
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggcaaaggca ttgtgaagcg tcgtg 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggtcatgata tgcaggaact gcggg 25
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cagttccacg ccgaccgcgt tgccacgcgg gta 33
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tatgccagcc aggccttgat tttggc 26
<210> 10
<211> 620
<212> DXSa氨基酸
<213> 人工序列
<400> 10
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VALHYVYNTP FDQLIWDVGH QAYPHKILTG RRDKIGTIRQ KGGLHPFPWR GESEYDVLSV 120
GHSSTSISAG IGIAVAAEKE GKNRRTVCVI GDGAITAGMA FEAMNHAGDI RPDMLVILND 180
NEMSISENVG ALNNHLAQLL SGKLYSSLRE GGKKVFPGVP PIKELHKRTE EHIKGMVVPG 240
TLFEELGFNY IGPVDGHDVL GLITTLKNMR DLKGPQFLHI MTKKGRGYEP AEKDPITFHA 300
VPKFDPSSGC LPKSSGGLPS YSKIFGDWLC ETAAKDNKLM AITPAMREGS GMVEFSRKFP 360
DRYFDVAIAE QHAVTFAAGL AIGGYKPIVA IYSTFLQRAY DQVLHDVAIQ KLPVLFAIDR 420
AGIVGADGQT HQGAFDLSYL RCIPEMVIMT PSDENECRQM LYTGYHYNDG PSAVRYPRGN 480
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<210> 11
<211> 620
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<213> 人工序列
<400> 11
MSFDIAKYPT LALVDSTQEL RLLPKESLPK LCDELRRYLL DSVSRSSGHF ASGLGTVELT 60
VALHYVYNTP FDQLIWDVGH QAYPHKILTG RRDKIGTIRQ KGGLHPFPWR GESEYDVLSV 120
GHSSTSISAG IGIAVAAEKE GKNRRTVCVI GDGAITAGMA FEAMNHAGDI RPDMLVILND 180
NEMSISENVG ALNNHLAQLL SGKLYSSLRE GGKEVFSGVP PIKELLERTE EHIKGMVVPG 240
TLFEELGFNY IGPVDGHDVL GLITTLKNMR DLKGPQFLHI MTKKGRGYEP AEKDPITFHA 300
VPKFDPSSGC LPKSSGGLPS YSKIFGDWLC ETAAKDNKLM AITPAMREGS GMVEFSRKFP 360
DRYFDVAIAE QHAVTFAAGL AIGGYKPIVA IYSTFLQRAY DQVLHDVAIQ KLPVLFAIDR 420
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AVGVELTPLE KLPIGKGIVK RRGEKLAILN FHTLMPEAAK VAESLNATLV DMRFVKPLDE 540
ALILEMAASH EALVTVEENA IMGGAGSGVN EVLMAHRKPV PVLNIGLPDF FIPQGTQEEM 600
RAELGLDAAG MEAKIKAWLA 620
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<211> 620
<212> DXSc氨基酸
<213> 人工序列
<400> 12
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vpkfdpssgc lpkssgglps yskifgdwlc etaakdnklm aitpamregs gmvefsrkfp 360
dryfdvaiae qhavtfaagl aiggykpiva iystflqray dqvlhdvaiq klpvlfaidr 420
agivgadgqt hqgasdlsyl rcipemvimt psdenecrqm lytgyhyndg psavryprgn 480
avgveltple klpigkgivk rrgeklailn fgtlmpeaak vaeslnatlv dmrfvkplde 540
alilemaash ealvtveena imggagsgvn evlmahrkpv pvlniglpdf fipqgtqeem 600
raelgldaag meakikawla 620
<210> 14
<211> 620
<212> 野生型DXS氨基酸
<213> 人工序列
<400> 14
MSFDIAKYPT LALVDSTQEL RLLPKESLPK LCDELRRYLL DSVSRSSGHF ASGLGTVELT 60
VALHYVYNTP FDQLIWDVGH QAYPHKILTG RRDKIGTIRQ KGGLHPFPWR GESEYDVLSV 120
GHSSTSISAG IGIAVAAEKE GKNRRTVCVI GDGAITAGMA FEAMNHAGDI RPDMLVILND 180
NEMSISENVG ALNNHLAQLL SGKLYSSLRE GGKKVFSGVP PIKELLKRTE EHIKGMVVPG 240
TLFEELGFNY IGPVDGHDVL GLITTLKNMR DLKGPQFLHI MTKKGRGYEP AEKDPITFHA 300
VPKFDPSSGC LPKSSGGLPS YSKIFGDWLC ETAAKDNKLM AITPAMREGS GMVEFSRKFP 360
DRYFDVAIAE QHAVTFAAGL AIGGYKPIVA IYSTFLQRAY DQVLHDVAIQ KLPVLFAIDR 420
AGIVGADGQT HQGAFDLSYL RCIPEMVIMT PSDENECRQM LYTGYHYNDG PSAVRYPRGN 480
AVGVELTPLE KLPIGKGIVK RRGEKLAILN FGTLMPEAAK VAESLNATLV DMRFVKPLDE 540
ALILEMAASH EALVTVEENA IMGGAGSGVN EVLMAHRKPV PVLNIGLPDF FIPQGTQEEM 600
RAELGLDAAG MEAKIKAWLA 620
<210> 15
<211> 620
<212> DXSe氨基酸
<213> 人工序列
<400> 15
MSFDIAKYPT LALVDSTQEL RLLPKESLPK LCDELRRYLL DSVSRSSGHF ASGLGTVELT 60
VALHYVYNTP FDQLIWDVGH QAYPHKILTG RRDKIGTIRQ KGGLHPFPWR GESEYDVLSV 120
GHSSTSISAG IGIAVAAEKE GKNRRTVCVI GDGAITAGMA FEAMNHAGDT RPDMLVILND 180
NEMSISENVG ALNNHLAQLL SGKLYSSLRE GGEKVFSGVP PIKELLKRTE EHIKGMVVPG 240
TLFEELGFSY IGPVDGHDVL GLITTLKNMR DLKGPQFLHI MTKKGRGYEP AEKDPITFHA 300
VPKFDPSSGC LPKSSGGLPS YSKIFGDWLC ETAAKDNKLM AITPAMREGS GMVEFSRKFP 360
DRYFDVAIAE QHAVTFAAGL AIGGYKPIVA IYSTFLQRAY DQVLHDVAIQ KLPVLFAIDR 420
AGIVGADGQT HQGAFDLSYL RCIPEMVIMT PSDENECRQM LYTGYHYNDG PSAVRYPRGN 480
AVGVELTPLE KLPIGKGIVK RRGEKLAILN FGTLMPEAAK VAESLNATLV DMRFVKPLDE 540
ALILEMAASH EALVTVEENA IMGGAGSGVN EVLMAHRKPV PVLNIGLPDF FIPQGTQEEM 600
RAELGLDAAG MEAKIKAWLA 620
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gagttttgat attgccaaat acccgaccct ggc 33
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ttatgccagc caggccttga ttttg 25

Claims (7)

1.一种在大肠杆菌细胞内原位进化蛋白质的新方法，其特征在于所述方法包括构建包含一个或多个突变位点的核酸库，包括体外合成的寡核苷酸单链库或制备的单链DNA库或双链DNA库，通过λ-Red同源重组技术，利用所述核酸库对大肠杆菌胞内载体上或基因组上的一个或多个结构基因进行原位重组，以较高的突变率达到进化酶分子结构提高酶催化效率的目的。
2.如权利要求1所述的一种在大肠杆菌细胞内原位进化蛋白质的新方法，其特征在于所述方法对大肠杆菌基因组上多个基因同时进行重组突变，应用于代谢途径中多个关键酶的进化，从而达到优化代谢途径提高目标产物合成产率的目的。
3.如权利要求1所述的一种在大肠杆菌细胞内原位进化蛋白质的新方法，其特征在于所述方法通过大肠杆菌胞内目标基因关键氨基酸的原位饱和突变，提高吡咯喹啉依赖型葡萄糖脱氢酶的热稳定性和催化特异性。
4.如权利要求1所述的一种在大肠杆菌细胞内原位进化蛋白质的新方法，其特征在于所述方法应用于体内原位重组突变番茄红素合成关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因，提高其表达蛋白的可溶性水平和催化效率。
5.如权利要求1所述的一种在大肠杆菌细胞内原位进化蛋白质的新方法，其特征在于所述方法同时突变多个番茄红素关键酶基因从而提高大肠杆菌合成番茄红素的生产水平。
6.大肠杆菌菌株EcLYCb，保存编号为CCTCC M 2015691。
7.大肠杆菌菌株EcLYC246，保存编号为CCTCC M 2015692。
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