CN108884450A - Mini-III RNA酶、改变Mini-III RNA酶切割RNA序列的特异性的方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是一种具有氨基酸序列的Mini‑III RNA酶，所述氨基酸序列包含受体部分以及在Mini‑III RNA酶结构中分别形成α4螺旋和α5b‑α6环的结构的可移植的α4螺旋和可移植的α5b‑α6环，其中分别形成α4螺旋和α5b‑α6环的结构的片段在结构上对应于分别由SEQ ID NO：1所示的来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的Mini‑III RNA酶的氨基酸序列片段46‑52和85‑98形成的α4螺旋和α5b‑α6环的相应结构，其中所述Mini‑III RNA酶在dsRNA切割中显示序列特异性，所述dsRNA切割仅依赖于底物的核糖核苷酸序列并且不依赖于底物结构中二级结构的出现，并且不依赖于其它辅助蛋白的存在，并且其中所述Mini‑III RNA酶不是SEQ ID NO:1的来自枯草芽孢杆菌的Mini‑III蛋白，也不是具有D94R突变的SEQ ID NO：1。本发明还涉及获得嵌合Mini‑III RNA酶的方法、Mini‑III RNA酶编码构建体、具有Mini‑III RNA酶编码基因的细胞、Mini‑III RNA酶用于dsRNA切割的用途以及仅依赖于核糖核苷酸序列的dsRNA切割方法。
Description
描述。
技术领域
本发明的目的是新的天然和嵌合Mini-III RNA酶，其氨基酸序列包含受体部分以及在Mini-III RNA酶结构中分别形成α4螺旋和α5b-α6环的结构的可移植的α4螺旋和可移植的α5b-α6环的部分，其中Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示序列特异性，所述dsRNA切割仅依赖于底物的核糖核苷酸序列并且不依赖于底物结构中二级结构的出现，并且不依赖于其它辅助蛋白的存在，并且其中所述Mini-III RNA酶不是SEQ ID NO: 1的来自枯草芽孢杆菌的Mini-III蛋白，也不是具有D94R突变的SEQ ID NO：1。本发明还涉及获得嵌合Mini-III RNA酶的方法、Mini-III RNA酶编码构建体、具有Mini-III RNA酶编码基因的细胞、Mini-III RNA酶用于dsRNA切割的用途以及仅依赖于核糖核苷酸序列的dsRNA切割方法。
背景技术
分子生物学的基本工具之一是具有明确限定的活性的蛋白，例如用在基因工程、诊断学、医学和用于制造和加工各种产品的工业中。这种酶的一个例子是DNA核酸内切酶，也称为限制性内切酶，其识别和切割双链DNA（dsDNA）的特定序列。
核糖核酸酶（RNA酶）是DNA限制性内切酶的相似物，并且它们基于RNA分子的核酸外水解或核酸内水解切割，通过参与多种生化反应在细胞内RNA的加工和降解中起重要作用。核糖核酸外切酶以不依赖于序列的方式从其末端开始降解RNA分子，而核糖核酸内切酶（endoRNases）切割内部的单链或双链RNA分子（分别表示为ssRNA和dsRNA）。尽管许多RNA酶显示出底物特异性，但它们的靶序列通常局限于ssRNA中的一个或几个核苷酸，非常经常的是在整个分子的特定二级和三级结构的环境下。这类酶中的一种是噬菌体蛋白RegB，其从中间切割GGAG序列。为了有效切割，RegB需要额外的决定因素，例如适当的RNA二级结构以及与核糖体蛋白S1的酶相互作用(Lebars, I., et al., J Biol Chem, (2001) 276,13264-13272, 和Saida, F., et al., (2003) Nucleic Acids Res, 31, 2751-2758.)。
已知存在其它序列特异性的核糖核酸酶，但它们由于以下的原因而不适于工程化：除了适合的核苷酸序列之外，还需要由特定ssRNA片段形成的独特结构。已经有改变T1和MC1 RNA酶的底物特异性的尝试(Hoschler, K., et al., J Mol Biol, (1999) 294,1231-1238, Numata, T., et al., Biochemistry, (2003) 42, 5270-5278)。在这两种情况下，产生了特异性从单核苷酸缩小至两个核苷酸的酶的变体(Numata, T., et al.,Biochemistry, (2003) 42, 5270-5278; Czaja, R., et al., Biochemistry, (2004)43, 2854-2862; Struhalla, M., et al., Chembiochem, (2004) 5, 200-205)。然而，对水解的RNA序列的低特异性或无特异性极大地限制了其加工，因此也极大地限制了应用这些酶的可能性。
除蛋白外，锤头状核酶、催化性DNA分子（DNAzyme）和基于肽核酸的人工酶（PNAzyme）也用于切割RNA序列。可以设计所述分子以获得RNA分子的序列特异性切割。锤头状核酶是最初在植物病毒中发现的30个核苷酸的RNA分子(Prody, GA., et al.,Science, (1986) 231, 1577-1580)。它们形成三个茎，其中形成茎I和III的序列与靶序列UH（其中H是除G外的任何核苷酸）侧翼的底物RNA分子的互补序列结合，靶序列UH在中间被切割。锤头状核酶可设计成切割顺式或反式构象的靶序列(Usman, N., et al., Curr. Opin. Struct. Biol. (1996) 4, 527−533)。DNAzyme是使用体外筛选从随机DNA序列中鉴定的催化性DNA分子。迄今为止，许多具有广泛特异性的DNAzyme已被描述。设计的Cu2+依赖性PNAzyme也提供一种RNA分子高度选择性切割的可能性。它们被设计成与RNA互补序列结合并在靶分子中形成四个核苷酸的凸起。如果形成的凸起包含AYRA序列（其中Y = C, U; R= A, G），其可以被PNAzyme切割(Murtola M., et al., J Am Chem Soc (2010) 26,8984-8990)。
具有加工dsRNA的能力的酶属于核糖核酸酶III超家族，其中四个家族已经鉴定：Dicer、Drosha、RNA酶III和Mini-III。分为此类的所有蛋白通过核糖核酸酶III的催化结构域来表征。来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的核糖核酸酶Mini-III具有一个这种类型的结构域，但其没有核糖核酸酶III超家族的其它已知成员典型的dsRNA结合结构域。Mini-III的编码基因存在于革兰氏阴性细菌的基因组和植物质体中。在细菌和质体二者中，Mini-III酶参与23S rRNA成熟的过程。该蛋白的天然底物是23S前-rRNA，其中3'和5'末端被切割。Mini-III在23S前-rRNA的天然底物中切割的序列已确定，并且已发现靠近切割位点，23S前-rRNA片段获得具有未配对单链元件的部分双链和部分不规则的结构。迄今为止进行的研究表明，Mini-III可能具有识别dsRNA螺旋结构中的不规则的倾向(Redko, Y.,et al., Molecular Microbiology, (2008) 68(5), 1096-1106)。Mini-III对23S前-rRNA的活性显著地受L3蛋白的刺激，L3蛋白作用于底物，而不作用于酶构象状态(Redko, Y. etal., Molecular Microbiology, (2009) 71(5), 1145-1154)。已经证明，在植物细胞的质体中，Mini-III通过降解细胞中存在的内含子和非编码RNA分子来调节它们的量(HottoA., et al., Plant Cell, (2015), 27(3), 724-740)。
本发明人的团队有史以来第一次描述了RNA酶对双链RNA（dsRNA）的序列特异性活性，所述活性由Mini-III酶及其突变体D94R显示。报道的结果证实了来自枯草芽孢杆菌的Mini-III RNA酶(BsMiniIII)对长dsRNA分子的序列依赖性切割。在长dsRNA分子（噬菌体Φ6基因组）的有限切割期间被该酶切割的位点的分析导致该酶切割的dsRNA中的序列基序的鉴定。此外，切割位点内的核苷酸残基已经被建立，其影响切割效率并且对于酶识别dsRNA序列是必要的。结构研究接着辅以适当的实验进行的计算机建模也显示出α5b-α6环在蛋白的特异性激活中而不是在结合dsRNA的过程中起关键作用，α5b-α6环是属于Mini-III RNA酶的酶特有的结构元件(Glow D., et al., Nucleic Acids Res, (2015), 43(5), 2864-2873)。
对dsRNA展现出序列特异性的其它RNA酶的鉴定以及改变其特异性的可能性，将使RNA核酸操作技术领域的发展，以及用此类酶的新研究方法和应用和使用此类酶的新技术的开发成为可能。
基于上述前提，本发明的目的，首先，是提供除BsMiniIII之外的具有高序列特异性的dsRNA RNA酶，其识别和切割双链RNA中的特定序列；其次，为了改变底物偏好及其活性，提供基于该核酸内切酶亚家族的酶之间限定结构元件的交换的方法。本发明的目的还在于提供一种确定、分离、获得、选择和制备此类序列特异性dsRNA RNA酶的方法。
在测试一组BsMiniIII同源物的活性和特异性时，本发明人意外地发现，核糖核酸酶Mini-III家族的酶在dsRNA切割过程中具有与BsMiniIII不同的核苷酸偏好。与BsMiniIII的情况一样，这种偏好仅依赖于dsRNA序列，并且不依赖于dsRNA中不规则螺旋的出现和与其它蛋白的配合。出乎意料的是，发明人已经发现，在计算机建模中具有由多肽链片段形成的环(位于dsRNA螺旋的大沟中并与之相互作用)的核糖核酸酶III超家族的酶，显示出允许特异性和限定的dsRNA片段化的活性，具有与dsDNA的限制性内切酶接近的性质。本发明人进行的研究首次提供切割偏好依赖于α5b-α6环序列的证据。此外，模型分析惊人地允许我们找到另外的结构元件--α4螺旋，其与所述环类似，位置足够接近dsRNA序列并影响Mini-III酶的活性和特异性。蛋白之间结构元件的交换意外地使所得嵌合蛋白的特异性和活性二者产生了变化。
发明内容
本发明的目的涉及一组序列特异性Mini-III RNA酶以及在Mini-III RNA酶中负责这些酶的序列偏好的限定结构元件，以及在Mini-III酶之间交换这些元件或其片段的方法。
本发明涉及一种具有氨基酸序列的Mini-III RNA酶，所述氨基酸序列包含受体部分和在Mini-III RNA酶结构中分别形成α4螺旋和α5b-α6环结构的可移植的α4螺旋和/或可移植的α5b-α6环的部分，
其中分别形成α4螺旋和α5b-α6环结构的片段在结构上对应于分别由SEQ ID NO：1中所示的来自枯草芽孢杆菌的Mini-III RNA酶的氨基酸序列片段46-52和85-98形成的α4螺旋和α5b-α6环的相应结构，
其中所述Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，所述dsRNA切割仅依赖于底物的核糖核苷酸序列，并且不依赖于底物结构中二级结构的出现，并且不依赖于其它辅助蛋白的存在，
并且其中Mini-III RNA酶不是SEQ ID NO: 1的来自枯草芽孢杆菌的Mini-III蛋白，也不是具有D94R突变的SEQ ID NO: 1。
在一种优选的Mini-III RNA酶中，氨基酸序列由源自一种微生物的Mini-III RNA酶的受体部分与插入的源自分别来自不同微生物的Mini-III RNA酶的α4螺旋和/或α5b-α6环序列的可移植的α4螺旋和/或可移植的α5b-α6环构成。
在一种优选的Mini-III RNA酶中，氨基酸序列包括
- 源自BsMiniIIIwt (SEQ ID NO: 1)、或Caldicellulosiruptor kristjanssonii的Mini-III CkMiniIIIwt (SEQ ID NO: 2)、或多枝梭菌(Clostridium ramosum)的CrMiniIIIwt (SEQ ID NO: 4)、或热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)的CtMiniIIIwt(SEQ ID NO: 6)、或Faecalibacterium prausnitzii的FpMiniIIIwt(SEQ ID NO: 8)、或具核梭杆菌具核亚种(Fusobacterium nucleatum subsp. Nucleatum)的FnMiniIIIwt(SEQ IDNO: 10)、或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的SeMiniIIIwt(SEQ ID NO:12)、或海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的TmMiniIIIwt(SEQ ID NO: 14)、或现称为Caldanaerobacter subterraneus subsp. Tengcongensis的腾冲热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)的TtMiniIIIwt (SEQ ID NO: 16)的Mini-III RNA酶的受体部分，或与其具有至少80％、优选85％、更优选90％、最优选95％同一性的氨基酸序列；
- 可移植的α4螺旋，其源自具有包括SEQ ID NO: 1的46-52位氨基酸的氨基酸序列的BsMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 2的氨基酸36-42的氨基酸序列的CkMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 4的氨基酸40-46的氨基酸序列的CtMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO:6的56-62位氨基酸的氨基酸序列的CtMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 8的45-51位氨基酸的氨基酸序列的FpMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 10的氨基酸45-51的氨基酸序列的FnMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 12的43-49位氨基酸的氨基酸序列的SeMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 14的氨基酸45-51的氨基酸序列的TmMiniIIIwt、或具有包括SEQ IDNO: 16的氨基酸50-56的氨基酸序列的TtMiniIIIwt，或与其具有至少80％、优选85％、更优选90％、最优选95％同一性的氨基酸序列，和/或
- 可移植的α5b-α6环，其源自具有包括SEQ ID NO: 1的85-98位氨基酸的氨基酸序列的BsMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 2的氨基酸73-86的氨基酸序列的CkMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 4的氨基酸79-88的氨基酸序列的CtMiniIIIwt、或具有包括SEQ IDNO: 6的93-106位氨基酸的氨基酸序列的CtMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 8的82-95位氨基酸的氨基酸序列的FpMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 10的氨基酸82-95的氨基酸序列的FnMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 12的82-95位氨基酸的氨基酸序列的SeMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 14的氨基酸82-93的氨基酸序列的TmMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 16的氨基酸87-100的氨基酸序列的TtMiniIIIwt，或与其具有至少80％、优选85％、更优选90％、最优选95％同一性的氨基酸序列。
一种优选的Mini-III RNA酶保持Mini-III RNA酶活性，并包含SEQ ID NO: 2所示的来自Caldicellulosiruptor kristjanssonii的氨基酸序列的序列或片段，其中Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中N= A, C, G, U; W = A, U; S = C, G; Y = C, U。
一种优选的RNA酶保持Mini-III RNA酶活性，并包含SEQ ID NO: 4所示的来自多枝梭菌的氨基酸序列的序列或片段，其中Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中N= A, C, G, U; W = A, U; S = C, G。
一种优选的RNA酶保持Mini-III RNA酶活性，并包含SEQ ID NO: 6所示的来自热纤维梭菌的氨基酸序列的序列或片段，其中Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中W = A, U; S = C, G。
一种优选的RNA酶保持Mini-III RNA酶活性，并包含SEQ ID NO: 8所示的来自Faecalibacterium prausnitzii的氨基酸序列的序列或片段，其中Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中W = A, U; S = C, G。
一种优选的RNA酶保持Mini-III RNA酶活性，并包含SEQ ID NO: 10所示的来自具核梭杆菌的氨基酸序列的序列或片段，其中Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中W = A, U; S = C, G。
一种优选的RNA酶保持Mini-III RNA酶活性，并包含SEQ ID NO: 12所示的来自表皮葡萄球菌的氨基酸序列的序列或片段，其中Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中N= A, C, G, U; W = A, U; S = C, G。
一种优选的RNA酶保持Mini-III RNA酶活性，并包含SEQ ID NO: 14所示的来自海栖热袍菌的氨基酸序列的序列或片段，其中Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中N= A, C, G, U; W = A, U; S = C, G。
一种优选的RNA酶保持Mini-III RNA酶活性，并包含SEQ ID NO: 16所示的来自腾冲热厌氧杆菌(Caldanaerobacter subterraneus subsp. Tengcongensis)的氨基酸序列的序列或片段，其中Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中N= A, C, G, U; W = A, U; S = C, G; Y = C, U。
一种优选的RNA酶是选自以下的嵌合蛋白：SEQ ID NO: 18的Ct(FpH)、SEQ ID NO:20的Ct(FpL)、SEQ ID NO: 22的Ct(FpHL)、SEQ ID NO: 24的Bs(FpH)、SEQ ID NO: 26的Bs(FpL)、SEQ ID NO: 28的Se(FpH)。
本发明还涉及获得Mini-III RNA酶嵌合蛋白的方法，其包括以下步骤：
a)克隆编码Mini-III RNA酶的基因，其中其氨基酸序列包含分别形成α4螺旋和α5b-α6环结构的片段，其在结构上对应于分别由SEQ ID NO：1所示的来自枯草芽孢杆菌的Mini-III RNA酶的氨基酸序列片段46-52和85-98形成的α4螺旋和α5b-α6环的相应片段，
b)通过用来自编码不同微生物的RNA酶的基因的分别编码α4螺旋和/或α5b-α6环结构的片段，交换至少一个分别编码α4螺旋和/或α5b-α6环结构的片段，修饰编码所述RNA酶的基因，
其中所述Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，所述dsRNA切割仅依赖于核糖核苷酸序列，并且不依赖于底物结构中二级结构的出现，并且不依赖于其它辅助蛋白的存在，
并且其中Mini-III RNA酶不是具有SEQ ID NO: 1显示的氨基酸序列的来自枯草芽孢杆菌的Mini-III蛋白，也不是具有D94R突变的SEQ ID NO: 1。
在一种获得嵌合Mini-III RNA酶的优选方法中，步骤b)涉及将可移植的α4螺旋和/或可移植的α5b-α6环插入受体部分，其中
- 受体部分源自BsMiniIIIwt (SEQ ID NO: 1)、或Caldicellulosiruptor kristjanssonii的Mini-III CkMiniIIIwt (SEQ ID NO: 2)、或多枝梭菌(Clostridium ramosum)的CrMiniIIIwt (SEQ ID NO: 4)、或热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)的CtMiniIIIwt(SEQ ID NO: 6)、或Faecalibacterium prausnitzii的FpMiniIIIwt(SEQ IDNO: 8)、或具核梭杆菌具核亚种(Fusobacterium nucleatum subsp. Nucleatum)的FnMiniIIIwt(SEQ ID NO: 10)、或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的SeMiniIIIwt(SEQ ID NO: 12)、或海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的TmMiniIIIwt(SEQID NO: 14)、或现称为Caldanaerobacter subterraneus subsp. Tengcongensis的腾冲热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)的TtMiniIIIwt (SEQ ID NO: 16)的Mini-III RNA酶，或包含与其具有至少80％、优选85％、更优选90％、最优选95％同一性的氨基酸序列；
- 可移植的α4螺旋源自
具有包括SEQ ID NO: 1的46-52位氨基酸的氨基酸序列的BsMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 2的氨基酸36-42的氨基酸序列的CkMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 4的氨基酸40-46的氨基酸序列的CtMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 6的56-62位氨基酸的氨基酸序列的CtMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 8的45-51位氨基酸的氨基酸序列的FpMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 10的氨基酸45-51的氨基酸序列的FnMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 12的43-49位氨基酸的氨基酸序列的SeMiniIIIwt、或具有包括SEQ IDNO: 14的氨基酸45-51的氨基酸序列的TmMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 16的氨基酸50-56的氨基酸序列的TtMiniIIIwt，或包含与其具有至少80％、优选85％、更优选90％、最优选95％同一性的氨基酸序列，和/或
- 可移植的α5b-α6环源自
具有包括SEQ ID NO: 1的85-98位氨基酸的氨基酸序列的BsMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 2的氨基酸73-86的氨基酸序列的CkMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 4的氨基酸79-88的氨基酸序列的CtMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 6的93-106位氨基酸的氨基酸序列的CtMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 8的82-95位氨基酸的氨基酸序列的FpMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 10的氨基酸82-95的氨基酸序列的FnMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 12的82-95位氨基酸的氨基酸序列的SeMiniIIIwt、或具有包括SEQ IDNO: 14的氨基酸82-93的氨基酸序列的TmMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 16的氨基酸87-100的氨基酸序列的TtMiniIIIwt，或包含与其具有至少80％、优选85％、更优选90％、最优选95％同一性的氨基酸序列。
优选地，在一种获得嵌合Mini-III RNA酶的方法中，编码Mini-III RNA酶的基因中的可移植的α4螺旋和可移植的α5b-α6环来自不同的微生物。
在一种获得嵌合Mini-III RNA酶的优选方法中，编码Mini-III RNA酶的基因包含编码选自SEQ ID NO: 18、20、22、24、26、28的氨基酸序列的任一序列。
一种获得嵌合Mini-III RNA酶的优选方法还包括以下步骤：
c)培养表达来自步骤b)的基因的细胞，和
d)分离和纯化来自步骤c)的表达的蛋白，和任选步骤
e)确定在步骤d)中获得的蛋白的序列特异性。
本发明还包括根据本发明所述方法获得的Mini-III RNA酶。
本发明还涉及一种编码根据本发明的方法获得的Mini-III RNA酶的构建体。
本发明还涉及含有编码根据本发明的Mini-III RNA酶的基因或根据本发明的构建体的细胞。
本发明还涉及根据本发明的Mini-III RNA酶切割dsRNA的用途，其方式以仅依赖于核糖核苷酸序列，并且不依赖于底物结构中二级结构的出现，并且不依赖于其它辅助蛋白的存在。
本发明还涉及一种切割dsRNA的方法，其方式仅依赖于核糖核苷酸序列，并且不依赖于底物结构中二级结构的出现，并且不依赖于其它辅助蛋白的存在，其中该方法包括dsRNA底物与根据本发明的Mini-III RNA酶之间的相互作用。
在一种切割dsRNA的优选方法中，所述Mini-III RNA酶包含SEQ ID NO: 2所示的来自Caldicellulosiruptor kristjanssonii的序列，其中所述Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中N= A, C, G, U; W = A, U; S = C, G; Y = C, U。
在一种切割dsRNA的优选方法中，所述Mini-III RNA酶包含SEQ ID NO: 4所示的来自多枝梭菌的序列，其中所述Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中N= A, C, G, U; W = A, U; S = C, G。
在一种切割dsRNA的优选方法中，所述Mini-III RNA酶包含SEQ ID NO: 6所示的来自热纤维梭菌的序列，其中所述Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中W = A, U; S = C, G。
在一种切割dsRNA的优选方法中，所述Mini-III RNA酶包含SEQ ID NO: 8所示的来自Faecalibacterium prausnitzii的序列，其中所述Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中W = A, U; S = C, G。
在一种切割dsRNA的优选方法中，所述Mini-III RNA酶包含SEQ ID NO: 10所示的来自具核梭杆菌的序列，其中所述Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中W = A, U; S = C, G。
在一种切割dsRNA的优选方法中，所述Mini-III RNA酶包含SEQ ID NO: 12所示的来自表皮葡萄球菌的序列，其中所述Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中N= A, C, G, U; W = A, U; S = C, G。
在一种切割dsRNA的优选方法中，所述Mini-III RNA酶包含SEQ ID NO: 14所示的来自海栖热袍菌的序列，其中所述Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中N= A, C, G, U; W = A, U; S = C, G。
在一种切割dsRNA的优选方法中，所述Mini-III RNA酶包含SEQ ID NO: 16所示的来自腾冲热厌氧杆菌(Caldanaerobacter subterraneus subsp. Tengcongensis)的序列，其中所述Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中N= A, C, G, U; W = A, U; S = C, G; Y = C, U。
本发明还涉及获得Mini-III RNA酶的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)克隆编码Mini-III RNA酶的基因，其中其氨基酸序列包含分别形成α4螺旋和α5b-α6环结构的片段，其在结构上对应于分别由SEQ ID NO：1所示的来自枯草芽孢杆菌的核糖核酸内切酶Mini-III RNA酶的氨基酸序列片段46-52和85-98形成的α4螺旋和α5b-α6环结构，其中Mini-III RNA酶不是具有SEQ ID NO: 1显示的氨基酸序列的来自枯草芽孢杆菌的Mini-III蛋白，也不是具有D94R突变的SEQ ID NO: 1，
b)培养表达来自步骤a)的基因的细胞，和
c）分离和纯化来自步骤b)的表达的蛋白；
其中所述Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，所述dsRNA切割仅依赖于核糖核苷酸序列，并且不依赖于底物结构中二级结构的出现，并且不依赖于其它辅助蛋白的存在。
在本发明的方法的一项实施方案中，编码Mini-III RNA酶的基因包含编码选自SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16的氨基酸序列的任一序列。
本发明人已经确定Mini-III RNA酶的结构元件，其负责该酶的序列偏好，并且这些元件是α4螺旋和和α5b-α6环（见图6）。发现虽然与α4螺旋和α5b-α6环相对应的蛋白Mini-III氨基酸序列的所选片段通过显著差异表征，但其末端上存在进化过程中保守的相似位置，其可以用氨基酸序列比对鉴定。对于打算用于在被分析的酶之间交换以构成准确等价物的序列片段，其边界被设置在与保守位置直接相邻的位置上（见表11）。例如，对于BsMiniIII氨基酸序列（SEQ ID NO：1），对于α4螺旋这些是46-52位的氨基酸，和对于α5b-α6环是85-98位的氨基酸。对于CtMiniIII氨基酸序列（SEQ ID NO：6），对于α4螺旋这些是56-62位的氨基酸，和对于α5b-α6环是93-106位的氨基酸。对于FpMiniIII氨基酸序列（SEQ IDNO：8），对于α4螺旋这些是45-51位的氨基酸，和对于α5b-α6环是82-95位的氨基酸。对于SeMiniIII氨基酸序列（SEQ ID NO：12），对于α4螺旋这些是43-49位的氨基酸，和对于α5b-α6环是82-95位的氨基酸。两种结构元件，参照蛋白的氨基酸序列，在图7中标出。
本发明人已经意外地发现，交换这些关键结构元件以及获得具有改变的选择性和/或具有底物切割的各种特异性和特征的酶是可能的。
本发明人已经开发了在Mini-III酶之间交换上述结构元件的方法，该方法能够获得具有改变的序列偏好的嵌合蛋白。该方法的实质涉及基于Mini-III RNA酶的嵌合蛋白的生产，该Mini-III RNA酶含有来自其它蛋白的α4螺旋和/或α5b-α6环的结构。为了生产这类嵌合蛋白，可以使用本领域技术人员已知的构建嵌合蛋白的任何合适的方法。例如，所述方法可包括：
a)合成与序列特异性dsRNA核糖核酸内切酶的一个或多个基因的片段相对应的寡核苷酸，编码特定的可移植结构元件 - α4螺旋和α5b-α6环，所述α4螺旋和α5b-α6环负责作为供体的Mini-III RNA酶的序列偏好；
b) 扩增用于过量生产特定Mini-III RNA酶的质粒，其中省略了编码负责其序列特异性的结构元件的短序列片段，意图用于交换；
c)将获得的两个DNA片段合并；
d) 从c)中获得的核苷酸序列表达Mini-III RNA酶嵌合蛋白；
e)确定所表达的Mini-III RNA酶嵌合蛋白的改变的序列特异性。
这种在Mini-III RNA酶的衍生物和/或变体中获得选择性变化的优选方法导致获得具有对dsRNA切割的序列特异性改变、提高的选择性，和/或改变的序列特异性，和/或改变和/或提高的酶活性的衍生物和/或变体。
因此，在本发明的方法的一项具体实施方案中，使用分别编码α4螺旋（进一步指可移植的α4螺旋）和α5b-α6环（进一步指可移植的α5b-α6环）结构的片段构建编码嵌合Mini-III RNA酶的基因，其中至少一个来自不同的Mini-III RNA酶编码基因的序列，其中至少一个被插入（移植）到来自另一种微生物的Mini-III RNA酶的受体部分。优选地，编码Mini-III RNA酶的基因包含编码α4螺旋结构的片段，其来自选自编码以下Mini-III RNA酶多肽的基因的任一基因：枯草芽孢杆菌的BsMiniIIIwt(SEQ ID NO: 1)、Caldicellulosiruptor kristjanssonii的CkMiniIIIwt(SEQ ID NO: 2)、多枝梭菌的CrMiniIIIwt(SEQ ID NO:4)、热纤维梭菌的CtMiniIIIwt(SEQ ID NO: 6)、Faecalibacterium prausnitzii的FpMiniIIIwt(SEQ ID NO: 8)、具核梭杆菌具核亚种的FnMiniIIIwt(SEQ ID NO: 10)、表皮葡萄球菌的SeMiniIIIwt(SEQ ID NO: 12)、海栖热袍菌的TmMiniIIIwt(SEQ ID NO: 14)、现在称为Caldanaerobacter subterraneus subsp. Tengcongensis的腾冲热厌氧杆菌的TtMiniIIIwt(SEQ ID NO: 16)。
优选地，编码Mini-III RNA酶的基因含有编码α4螺旋结构的片段，其来自具有包括SEQ ID NO: 1的46-52位氨基酸的氨基酸序列的BsMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 2的氨基酸36-42的氨基酸序列的CkMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 4的氨基酸40-46的氨基酸序列的CtMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 6的56-62位氨基酸的氨基酸序列的CtMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 8的45-51位氨基酸的氨基酸序列的FpMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 10的氨基酸45-51的氨基酸序列的FnMiniIIIwt、或具有包括SEQ IDNO: 12的43-49位氨基酸的氨基酸序列的SeMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 14的氨基酸45-51的氨基酸序列的TmMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 16的氨基酸50-56的氨基酸序列的TtMiniIIIwt。
优选地，编码Mini-III RNA酶的基因包含编码α5b-α6环结构的片段，其来自选自编码以下Mini-III RNA酶的基因的任一基因：枯草芽孢杆菌的BsMiniIIIwt(SEQ ID NO:1)、Caldicellulosiruptor kristjanssonii的CkMiniIIIwt(SEQ ID NO: 2)、多枝梭菌的CrMiniIIIwt(SEQ ID NO: 4)、热纤维梭菌的CtMiniIIIwt(SEQ ID NO: 6)、Faecalibacterium prausnitzii的FpMiniIIIwt(SEQ ID NO: 8)、具核梭杆菌具核亚种的FnMiniIIIwt(SEQ ID NO: 10)、表皮葡萄球菌的SeMiniIIIwt(SEQ ID NO: 12)、海栖热袍菌的TmMiniIIIwt(SEQ ID NO: 14)、现在称为Caldanaerobacter subterraneus subsp. Tengcongensis的腾冲热厌氧杆菌的TtMiniIIIwt(SEQ ID NO: 16)。
优选地，编码Mini-III RNA酶的基因含有编码α5b-α6环结构的片段，其来自具有包括SEQ ID NO: 1的85-98位氨基酸的氨基酸序列的BsMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO:2的氨基酸73-86的氨基酸序列的CkMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 4的氨基酸79-88的氨基酸序列的CtMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 6的93-106位氨基酸的氨基酸序列的CtMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 8的82-95位氨基酸的氨基酸序列的FpMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 10的氨基酸82-95的氨基酸序列的FnMiniIIIwt、或具有包括SEQ IDNO: 12的82-95位氨基酸的氨基酸序列的SeMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 14的氨基酸82-93的氨基酸序列的TmMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 16的氨基酸87-100的氨基酸序列的TtMiniIIIwt。
优选地，编码Mini-III RNA酶的基因包含编码选自SEQ ID NO: 18、20、22、24、26、28的氨基酸序列的任一序列。
本发明的目的还在于制备根据本发明的Mini-III RNA酶变体的方法，所述变体具有对dsRNA切割的序列特异性的提高的选择性，和/或改变的序列特异性，和/或提高的酶活性，其中该方法包括：
a)通过用来自编码Mini-III RNA酶的另一基因的分别编码α4螺旋和α5b-α6环结构的片段，交换至少一个分别编码α4螺旋和α5b-α6环结构的片段，修饰编码所述RNA酶的基因，
b)在细胞培养中表达由步骤a)中修饰的基因编码的蛋白，
c)分离和纯化来自步骤b)的表达的蛋白，
d)确定在步骤c)中获得的蛋白的序列特异性。
在一项优选的实施方案中，α4螺旋结构和α5b-α6环结构来自不同细菌物种的基因。
本发明还涉及通过获得根据本发明的Mini-III RNA酶变体的方法获得的Mini-III RNA酶。
dsRNA切割的序列特异性应理解为Mini-III RNA酶识别和切割dsRNA的能力，其仅依赖于其核糖核苷酸序列，而不依赖于在dsRNA的一条或两条链中环化(looping-out)的发生和/或与其它辅助蛋白的相互作用。
术语“Mini-III RNA酶”或“RNA酶Mini-III”是指RNas-III家族中第4类的dsRNA核糖核酸酶。属于这组的蛋白是同源二聚体，并且仅由催化结构域（RNA酶III）构成(Olmedo,G., et al., (2008)。
根据本说明书，术语“受体部分”是指Mini-III RNA酶之一的氨基酸序列，或与Mini-III RNA酶之一的受体部分的氨基酸序列具有至少80％、更优选85％、更优选90％、最优选95％或更高百分比同一性的序列，其中可能的是，部分或完全除去α4螺旋和/或α5b-α6环的氨基酸序列，并在这个/这些位点插入来自供体的可移植的α4螺旋和/或可移植的α5b-α6环。
根据本说明书，术语“Mini-III RNA酶嵌合蛋白”或“嵌合Mini-III RNA酶”是指含有Mini-III RNA酶之一（称为受体部分）的氨基酸序列、或与Mini-III RNA酶之一的氨基酸序列具有至少80％、更优选85％、更优选90％、最优选95％或更高百分比同一性的序列的构建体，其中α4螺旋和/或α5b-α6环的氨基酸序列已部分或全部被来自与受体部分不同的Mini-III RNA酶(称为供体)的可移植的α4螺旋和/或可移植的α5b-α6环的类似氨基酸序列取代；或被与来自不同Mini-III RNA酶的α4螺旋和/或α5b-α6环的类似氨基酸序列具有至少80％、更优选85％、更优选90％、最优选95％或更高百分比同一性的序列取代。
本文所用的术语“同一性”是指两条多肽链之间的序列相似性。当相同的氨基酸残基占据在两个比较的序列中的一个位置时，则各个分子在该位置上是相同的。本文使用的百分比同一性是指氨基酸序列之间的比较，并且其通过比较两个最佳比对的序列来确定，其中被比较的氨基酸序列部分与参考序列（不含有任何添加或缺失）相比较可以含有添加（即插入氨基酸残基）或缺失（即去除氨基酸残基），以便最佳地比对两个序列。
如上所述，本发明基于一种意想不到的观察结果，即通过操纵关键结构元件——α4螺旋和/或α5b-α6环可以构建以仅依赖于序列的方式以各种序列特异性切割RNA底物的酶，所述α4螺旋和/或α5b-α6环在结构上分别对应于分别由SEQ ID NO：1所示的来自枯草芽孢杆菌的核糖核酸内切酶Mini-III RNA酶的氨基酸序列的氨基酸残基46-52和85-98的片段形成的α4螺旋和α5b-α6环的结构。对于本领域技术人员显而易见的是，实施例中表示的RNA酶仅是本发明的具体实施方案。因此，本发明还涉及本文所述的Mini-III RNA酶的衍生物和/或变体，其包含与本文所述的任一种酶具有至少80％、更优选85％、更优选90％、最优选95％同一性的氨基酸序列。特别是，本文所述的Mini-III RNA酶的衍生物和/或变体包含参考序列中对应氨基酸残基的保守取代。
参考序列中的“保守取代”是包含在物理上或功能上与对应的参考残基相似的氨基酸残基的取代，例如，具有相似的尺寸、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等。特别地，优选的保守取代是满足Dayhoff等人对“可接受的点突变”定义的标准的取代("Atlas of Protein Sequence and Structure", 1978, Nat. Biomed. Res.Foundation, Washington, DC, Suppl. 3, 22: 354-352)。
根据本发明显示出序列特异性的Mini-III RNA酶和/或嵌合蛋白，和/或显示出对dsRNA的序列特异性的Mini-III RNA酶的衍生物和/或变体，及其用途，使得能够发展全新的RNA操作技术领域，以及发展这些酶的新研究方法和应用以及使用这些酶的新技术。显示出序列特异性的Mini-III RNA酶及其衍生物和/或变体，例如，将用于核糖核苷酸的修饰，RNA的结构研究以便了解RNA分子和/或其修饰的结构，产生RNAi分子、特别是siRNA，植物和动物病毒疾病的诊断和治疗，以及基于RNA的纳米技术的应用，即所谓的“RNA构造学”。
根据本发明显示出序列特异性的新型Mini-III RNA酶，和/或嵌合蛋白，和/或显示对dsRNA的序列特异性的Mini-III RNA酶的衍生物和/或变体将用于新生物技术应用。已知有酶以序列依赖性方式切割单链RNA，但其活性不仅取决于底物序列，还取决于其结构，因此它们在实践中不是非常有用。相反，根据本发明的对dsRNA显示出序列特异性的新型Mini-III RNA酶、和/或嵌合蛋白、和/或对dsRNA显示出序列特异性的Mini-III RNA酶的衍生物和/或变体没有这些缺点，并且可以用作常用于dsRNA切割的实验室试剂，例如分子生物学中用于dsDNA切割的限制酶。显示出序列特异性的Mini-III RNA酶、和/或嵌合蛋白、和/或显示出对dsRNA的序列特异性的Mini-III RNA酶的衍生物和/或变体除体外用途之外，还有在医学、诊断学和纳米技术中应用它们的可能。例如，在RNA的结构研究中，通过逆转录反应的直接RNA测序是目前最常用于确定修饰的方法，或者质谱法用于相同的目的。在两种情况下，大RNA分子（例如rRNA或mRNA）的分析都是有问题的。在这些方法中，核酸酶用于将RNA片段化，切割产物是短RNA片段或核糖核苷酸。这种切割是非特异性的，并且得到的大量产物使得对得到的结果的解释变得困难甚至不可能。使用根据本发明的显示出序列特异性的新型Mini-III RNA酶、和/或嵌合蛋白、和/或Mini-III RNA酶的衍生物和/或变体，能够以可控的方式将这些RNA分子切割成更小的可重复片段。它们的摩尔质量和性质可以分别确定，由此可以进行核糖核苷酸修饰分析以及RNA结构研究，其迄今为止是不可能或非常困难的。这些对RNA分子的修饰和结构的研究将提供关于潜在治疗靶标的信息，例如细菌对抗生素的抗性机制。使用根据本发明的显示出序列特异性的新型Mini-III RNA酶、和/或嵌合蛋白、和/或Mini-III RNA酶的衍生物和/或变体，能够开发基于RNAi、短干扰dsRNA分子的技术。根据本发明的显示出序列特异性的Mini-III RNA酶、和/或嵌合蛋白、和/或显示出对dsRNA的序列特异性的Mini-III RNA酶的衍生物和/或变体将用于使用siRNA或shRNA进行基因沉默的方法和应用，用于医学，例如，治疗癌症、代谢和神经退行性疾病。目前，导致获得短双链RNA片段的策略之一是用来自大肠杆菌的核糖核酸酶III处理从特定DNA片段获得的长dsRNA。这种酶非特异性地切割dsRNA，产生18至25个碱基对的片段。由此获得的短siRNA片段用于基因沉默。使用根据本发明的显示出序列特异性的Mini-III RNA酶、和/或嵌合蛋白、和/或Mini-III RNA酶的衍生物和/或变体为特定siRNA的产生提供了全新的和未知的可能性，使得能够产生这些dsRNA片段的确定库，其可最有效地沉默特定基因的表达，并且还将减少沉默其它基因的副作用。
根据本发明的显示出序列特异性的Mini-III RNA酶、和/或嵌合蛋白、和/或显示出对dsRNA的序列特异性的Mini-III RNA酶的衍生物和/或变体将适用于诊断以及治疗用dsRNA作为遗传信息载体的病毒引起的疾病。这种病毒的一个例子是来自呼肠孤病毒科的轮状病毒，其中三类对人类具有致病性。目前，为了检测和鉴定这些类型，使用逆转录接着PCR技术。使用根据本发明的显示出序列特异性的Mini-III RNA酶、和/或嵌合蛋白、和/或Mini-III RNA酶的衍生物和/或变体，能够操纵dsRNA，显著加速诊断。目前，轮状病毒感染的治疗非常无效。根据本发明的显示出序列特异性的Mini-III RNA酶、和/或嵌合蛋白、和/或显示出对dsRNA的序列特异性的Mini-III RNA酶的衍生物和/或变体将用作治疗由轮状病毒引起的疾病的手段，使得能够特异性切割病毒基因组，从而防止其进一步复制。
根据本发明的显示出序列特异性的Mini-III RNA酶、和/或嵌合蛋白、和/或显示出对dsRNA的序列特异性的Mini-III RNA酶的衍生物和/或变体也将用于纳米技术，特别是“RNA构造学”，以及具有给定序列和结构的基于RNA的纳米结构的形成。
本说明书中引用的出版物及其中所包含的参考文献以其整体包括在本文中作为参考。
附图简述
为了更好地理解本发明，通过实施方案和附图对其进行说明，其中：
图1.噬菌体Φ6基因组dsRNA的Mini-III RNA酶切割模式的差异。M表示dsDNA标记（Thermo Scientific，SM0223），Ø表示不添加任何酶的对照反应。
图2.通过高通量测序数据分析结果中获得的特定Mini-III RNA酶优选的序列基序。
图3.含有通过Mini-III RNA酶切割产物的高通量测序确定的位点的5个选定的噬菌体dsRNA片段的切割。黑色星号表示底物，灰色星号表示在预期位点切割底物所获得的主要产物。
图4.相对于初始dsRNA序列，在引入至910S底物的中心四核苷酸ACCU位置内的取代对所选Mini-III RNA酶的切割效率的影响。星号表示与特定dsRNA底物的四核苷酸序列互补的序列。
图5.引入至910S底物的中心四核苷酸（图中的6、7、8、9位置）之外的所选位置的取代对所选Mini-III RNA酶的切割效率的影响。含有Mini-III RNA酶切割位点的底物原始序列的片段在图的上部显示。而且，提供了特定底物中的位置编号和取代类型。在图的底部，给出了相对于初始dsRNA序列，对特定底物的切割效率。
图6. BsMiniIII RNA酶与dsRNA的复合物的理论模型。圆圈和箭头表示优选的dsRNA序列（ACCU）和负责Mini-III RNA酶的底物偏好的结构元件（A - α4螺旋，B - α5b-α6环）。
图7.所选Mini-III RNA酶的氨基酸序列比对。所提供的氨基酸残基编号和二级结构是指BsMiniIII RNA酶的序列和二级结构。保守的催化氨基酸残基用灰色字体标记（D -23位和E - 106位）。在嵌合蛋白形成期间交换的结构元件α4螺旋（H）和α5b-α6环（L）的片段用灰色背景表示。
图8.交换负责Mini-III RNA酶序列偏好的结构元件，α4螺旋和α5b-α6环，对嵌合蛋白的酶活性（A图）及其序列偏好（B图）的影响。
具体实施方式
包括以下实施例，仅用于说明本发明和解释其特定方面，而不是限制本发明，并且不应被解释为在所附权利要求中限定的本发明的整个范围。
在以下实施例中，除非另有说明，否则使用Sambrook J.等人的“MolecularCloning：A Laboratory manual，第2版. 1989. Cold Spring Harbor，NY Cold SpringHarbor laboratory Press”中描述的标准材料和方法，或按照制造商的具体材料和方法说明书进行操作。
在本说明书中，除非另有说明，否则使用氨基酸和核苷酸或核糖核苷酸的标准缩写。
实施例
实施例1
编码特定Mini-III RNA酶的序列的克隆
从DSMZ（Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms andCell Cultures）以冻干形式购买微生物（表1）。将冻干物悬浮于500μl的TE缓冲液（10mMTris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0）中后，用苯酚（用100mM Tris-HCl，pH8.5饱和）萃取悬浮液。水相用苯酚:氯仿（1/1 v/v）混合物再次萃取，随后核酸通过加入50μl 3M乙酸钠pH5.2和1mL乙醇沉淀。将沉淀的核酸离心（12000g，10分钟，4℃），并除去液体。用1mL 70％乙醇洗涤沉淀，然后干燥。将获得的DNA悬浮于20μl TE缓冲液中。
表1.编码Mini-III RNA酶的克隆序列的来源
表2.用于扩增编码特定Mini-III RNA酶的基因组DNA的引物序列。
使用Pfu聚合酶和表2中列出的引物，通过PCR从基因组DNA扩增编码Mini-III RNA酶的序列。
为了获得能够进行具有N-端六组氨酸标签的Mini-III RNA酶的诱导性过量表达的重组质粒，用NdeI和XhoI酶切割PCR产物，并与用相同酶切割的pET28a载体（Novagen）连接。在室温下用1U噬菌体T4 DNA连接酶（Thermo Scientific）连接1小时。接下来，使用10μl反应混合物转化100μl化学感受态细菌（大肠杆菌Top10菌株：F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ ∆M15 ∆lacX74 deoR recA1 araD139 ∆(araA-leu)7697 galU galKrpsL endA1 nupG [Invitrogen])，并且在补充了50μg/mL卡那霉素的固体LB培养基上选择转化子。从所选的克隆中，使用Plasmid Mini试剂盒（A＆A Biotechnology）分离质粒DNA，然后测序以验证所得构建体的正确性。
通过这种方式，获得了能够从特定微生物有效诱导性过量产生Mini-III RNA酶的构建体。
实施例2
从编码野生型Mini-III RNA酶的重组质粒表达和纯化蛋白。
用实施例1中获得的携带Mini-III核酸酶基因的重组质粒转化大肠杆菌菌株BL21（DE3）（F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1sam7 nin5]）。按照实施例1进行转化。在补充了50μg/mL卡那霉素和1%葡萄糖的LB固体培养基上选择转化子。在25mL含有50μg/mL卡那霉素和1％葡萄糖的LB液体培养基中接种选定的转化株菌落并在37℃的温度下振荡孵育5小时。然后，在500mL补充有卡那霉素至浓度为100μg/mL的液体ZY（Studier 2005）中接种在LB培养基中生长的25mL培养物，并在37℃的温度下振荡孵育24小时。培养物在4℃下以5000g离心10分钟，悬浮于STE缓冲液（0.1M NaCl，10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0）中，并再次离心。将沉淀悬浮于20mL裂解溶液（50mM Tris-HCl pH 8.0, 300mM NaCl，10mM咪唑，10％甘油）中，然后在1360个大气压的超压下一次性通过细胞破碎机（Constant Systems LTD）将细菌细胞破碎。裂解物以20000g在4℃的温度下离心20分钟澄清，以除去不溶性细胞碎片。使用多肽链中存在的多组氨酸标签，通过亲和层析法纯化重组蛋白。
将从5L培养物（10个培养瓶，每瓶500mL）获得的细胞裂解物加入到含有5mL Ni-NTA琼脂糖床（Sigma-Aldrich）的7×1.5cm柱上，该柱已用四倍体积的裂解缓冲液平衡。依次用以下缓冲液洗涤柱：裂解液（150mL），补充有2M NaCl的裂解液（50mL），补充有咪唑至浓度为20mM的裂解液（50mL）。纯化的重组蛋白用补充咪唑至250mM的浓度的裂解缓冲液洗脱，并收集1.5mL的流分。纯化过程中的流速为0.9mL/min，温度为4℃。纯化的蛋白流分与等体积的甘油混合，然后在-20℃下储存。
由此，在保持其活性的同时获得了高度纯化的酶制剂，并且在能够在-20℃的温度下方便其长期储存的缓冲液中。
实施例3
确定用纯化的酶体外切割dsRNA底物的最佳反应条件
为了确定反应缓冲液的最佳条件，在表3列出的缓冲液中进行Φ6噬菌体基因组的有限切割。
表3
在该实验中，使用1.5μg的dsRNA，以及在实施例2中获得的3.3μg的BsMiniII，80ng的CkMiniIII，23.5μg的CrMiniIII，5μg的CtMiniIII，0.8μg的FnMiniIII，1.1μg的FpMiniIII，2.1μg的SeMiniIII，0.185μg的TmMiniIII，11.5ng的TtMiniIII。在反应的5、10和15分钟后收集对应于0.5μg dsRNA的等分试样，除了TtMiniIII和SeMiniIII，它们的反应时间分别为2、4和6分钟，以及20、40和60分钟。
在补充有终浓度为0.5μg/mL的溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶中，通过电泳分离裂解产物。产生最可见条带图案的缓冲液被选为最佳缓冲液。结果，选择了以下的缓冲液：CrMiniIII – Bs缓冲液; CkMiniIII – G1缓冲液; CtMiniIII – B1缓冲液; FpMiniIII –Bs缓冲液; FnMiniIII – BG缓冲液; SpMiniIII – R缓冲液; TmMiniIII – R缓冲液;TtMiniIII – B1缓冲液。在这些条件下，在切割产物的电泳分离中获得的条带图案中观察到明显的差异（图1），这反映了所分析的酶的序列偏好的差异。
通过这种方式，确定了在体外反应中使用纯化的酶的适宜条件，并且显示出特定Mini-III RNA酶之间其序列特异性差异的存在。
实施例4
使用高通量测序确定特定Mini-III RNA酶的优选切割序列
用每种酶对5μg的Φ6基因组进行有限切割5分钟。（条件列于表4中）。反应中使用的特定酶的量在实施例3中给出。
表4.特定序列特异性Mini-III RNA酶的最适反应条件。
| 酶 | 缓冲液（组成在上表3中给出） | 反应温度[°C] |
| BsMiniIII | Bs | 37 |
| CrMiniIII | Bs | 37 |
| CkMiniIII | G1 | 65 |
| CtMiniIII | B1 | 55 |
| FpMiniIII | Bs | 37 |
| FnMiniIII | F | 37 |
| SeMiniIII | R | 37 |
| TmMiniIII | R | 65 |
| TtMiniIII | Bs | 65 |
通过加入EDTA至浓度为20mM来淬灭反应，随后使用GeneJET RNA Cleanup andConcentration Micro试剂盒（Thermo Scientific）纯化RNA。纯化的反应产物在95℃下变性1分钟，在冰上冷却，然后用截短的RNA K227Q连接酶II（New England Biolabs）在16℃的温度下将3'RNA末端与50pmol的5'预腺苷酸化衔接子UniShPreA（表5）连接16个小时。使用GeneJET RNA Cleanup and Concentration Micro试剂盒（Thermo Scientific）从未使用的衔接子中纯化出连接产物，然后将它们用作逆转录反应的模板，使用Maxima逆转录酶（Thermo Scientific）和与UniShPreA序列互补的UniShRT引物（表5）进行逆转录反应。反应在50℃的温度下孵育5分钟，并在80℃的温度下加热5分钟终止反应。使用GeneJET DNAMicro试剂盒（Thermo Scientific）纯化所获得的cDNA，然后使用热稳定连接酶App DNA/RNA（New England Biolabs）将3'-末端与50pmol的预腺苷化的衔接子PreA3Univ（表5）连接。用GeneJET DNA Micro试剂盒纯化连接产物。由此制备的双链cDNA用一对引物/衔接子(表5)通过PCR (15-18个扩增周期)进行扩增，该引物/衔接子使得得到的产物能够在MiSeq测序仪(Illumina)中进行测序。用1.5％琼脂糖凝胶分离PCR产物，并使用GeneJET凝胶提取试剂盒（Thermo Scientific）重新分离大小在200和700个碱基对之间的部分。
表5.用于制备文库的引物序列，所述文库用于dsRNA末端的高通量测序，所述dsRNA末端由序列特异性Mini-III RNA酶切割Φ6噬菌体基因组产生。
| 引物 | 序列 | SEQ ID NO: |
| UniShPreA | AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGA | 46 |
| UniShRT | TCTACACTCTTTCCCTACACGAC | 47 |
| PreA3Univ | GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC | 48 |
使用MISEQ测序仪（Illumina）对制备的材料进行高通量测序。使用Bowtie 2软件（版本0.2）将从该分析中获得的读出与Φ6噬菌体基因组序列比对，该软件可在Galaxy平台（http://usegalaxy.org）上获得，使用端-到-端模式和默认参数。考虑到Mini-III的底物切割的几何学，计算从“+”链的位置X和“-”链的位置X+1开始的读出总数。通过这种方式，我们建立了每种酶切割Φ6噬菌体基因组中特定位点的等级。为了确定每种酶的底物偏好，我们使用了位于200个最常见切割位点侧翼的14个核苷酸的序列片段。在这项分析中，使用用于从新发现基序的软件-MEME2，除了设定为14个核苷酸的基序的最小宽度外，其它参数设定为默认值。为测试的Mini-III RNA酶的优选切割序列建立的谱图显示在图2中。以这种方式，已经表征了测试的Mini-III RNA酶的序列偏好。
实施例5
用RT-PCR和使用Mini III RNA酶的酶促合成对分离的dsRNA底物进行切割
为了证实Mini-III核酸酶切割RNA的产物的高通量测序数据分析获得的结果，合成了噬菌体基因组的短片段，其含有Mini-III核酸酶的潜在切割位点（表6）。为实现此目的，使用Maxima逆转录酶（Thermo Scientific）和随机六核苷酸引物进行Φ6 dsRNA基因组的逆转录。随后，基于高通量测序结果，选择噬菌体基因组中的位点，并设计引物对以能够扩增含有dsRNA中这些位点的片段。一个引物引入了噬菌体T7 DNA依赖性RNA聚合酶的启动子序列，而另一个引入了噬菌体Φ6 RNA依赖性RNA聚合酶的启动子序列（表7）。
表6. dsRNA底物 - 包含Mini-III核酸酶潜在切割位点的噬菌体Φ6基因组的分离的短片段（给定的核苷酸位置参考Φ6基因组序列）（Φ6基因组序列：S：NC_003714.1; L:NC_003714; M:NC_003714.3的参考文献分别为McGraw, T. et al., Journal of Virology, (1986) 58(1), 142-151; Gottlieb, P. et al., Virology, (1988) 163(1), 183-190; Mindich, L. et al., Journal of Virology, (1988) 62(4), 1180-1185)。
| 切割位点 | Φ6 基因组片段 | 片段起始核苷酸位置 | 片段终止核苷酸位置 |
| 910 | S | 804 | 948 |
| 949 | S | 910 | 998 |
| 2021 | L | 1786 | 2112 |
| 3292 | L | 3041 | 3384 |
| 4486 | L | 4421 | 4569 |
| 4754 | L | 4650 | 4928 |
表7.用于制备作为Φ6噬菌体基因组的分离片段的dsRNA的引物序列。对于具体反应，使用标记有底物切割位置的引物对。
dsRNA合成反应使用Replicator RNAi试剂盒（Thermo Scientific）根据制造商推荐的方案进行。用分光光度法测量合成反应产物的浓度。
为了切割作为分离的Φ6噬菌体基因组片段的底物，所述酶组以其在表4中所述的最适条件使用。使用聚丙烯酰胺凝胶（8％，TAE：40mM Tris-HCl，20mM乙酸和1mM EDTA）通过电泳分离切割产物，用溴化乙锭染色10分钟，并使用UV光进行显现。在图3中示出了所选底物的切割结果。
以这种方式，证实了高通量测序的结果和所述方法用于鉴定Φ6噬菌体基因组中Mini-III RNA酶的切割位点的适用性。
实施例6
制备具有取代的底物文库并产生具有引入的取代的dsRNA底物
为了生产用于合成dsRNA 910S的模板DNA，并引入由Mini-III RNA酶识别的基序的取代，在噬菌体基因组片段(含有从804位到948位的噬菌体基因组S区段的片段)的RT-PCR中获得的dsDNA，被插入到pUC19质粒的SmaI位点，从而产生pUC910S质粒。切割位点的每个位置的取代使用内翻PCR（inside-out PCR）获得，其中使用pUC910S质粒作为模板，以及在变化的位置处含有简并序列的三组引物（表8）。切割位点外位置的取代使用内翻PCR获得，其中使用pUC910S质粒作为模板，以及在ACCU序列外引入单一取代的一对引物（表8）。
表8.用于构建具有取代的底物文库和产生具有引入的取代的dsRNA底物的引物序列。为了产生合适的文库，使用引物对，其中一个名称末尾有f，另一个名称末尾有r。符号N、W、S的意义如下：N= A, C, G, U; W = A, T; S = C, G。
使用T4多核苷酸激酶（Thermo Scientific）将获得的PCR产物的5'末端磷酸化，并使用噬菌体T4 DNA连接酶（Thermo Scientific）重建环状分子。对获得的质粒进行DNA测序以表征特定克隆中的取代。使用Replicator RNAi试剂盒（Thermo Scientific），将含有Mini-III识别的基序序列的变化的所选克隆（表9和10）用于dsRNA合成。
表9.来自在识别基序序列中含有取代的底物组的dsRNA底物中优选位点的核苷酸序列。
| 底物 | 序列 | 互补序列 |
| S910ACCU | ACCU | AGGU |
| S910AGGU | AGGU | ACCU |
| S910GCCU | GCCU | AGGC |
| S910ACCG | ACCG | CGGU |
| S910AGGA | AGGA | UCCU |
| S910UGGU | UGGU | ACCA |
| S910ACGU | ACGU | ACGU |
| S910ACUU | ACUU | AAGU |
| S910AGAU | AGAU | AUCU |
| S910UCCA | UCCA | UGGA |
| S910UGGA | UGGA | UCCA |
| S910CCCA | CCCA | UGGG |
| S910UCCG | UCCG | CGGA |
| S910GCCG | GCCG | CGGC |
| S910CCCG | CCCG | CGGG |
| S910UCGU | UCGU | ACGA |
| S910AAAU | AAAU | AUUU |
| S910AGUU | AGUU | AACU |
| S910UCGA | UCGA | UCGA |
| S910UGCA | UGCA | UGCA |
表10.来自包含在识别基序中ACCU序列外的取代的克隆的dsRNA底物中优选位点的核苷酸序列。ACCU序列和互补序列AGGU以粗体显示。
| 底物 | 序列 | 互补序列 |
| 910-3G-U | UAAACCUCUC | GAGAGGUUUA |
| 910-4A-C | GCAACCUCUC | GAGAGGUUGC |
| 910-4A-G | GGAACCUCUC | GAGAGGUUCC |
| 910-4A-U | GUAACCUCUC | GAGAGGUUAC |
| 910-11U-A | GAAACCUCAC | GTGAGGUUUC |
| 910-11U-G | GAAACCUCGC | GCGAGGUUUC |
| 910-12C-A | GAAACCUCUA | TAGAGGUUUC |
通过这种方式，获得了一组底物，其能够在严格控制的系统中精确和系统地确定Mini-III RNA酶的序列偏好。
实施例7
识别序列中的取代对所选Mini-III RNA酶的切割速率的影响
所合成的含有ACCU序列中的取代的910S底物组（如表9所示）被用于研究所选Mini-III酶的切割速率。在表（表4）中所述的特定酶的最适条件下进行反应。对于每个反应，添加1.2μg的dsRNA。随后，从反应开始15、30、60和120分钟后，收集15μl等分试样，并与3μl上样染料和1.5μl苯酚:氯仿（1:1 v:v）混合物混合，然后在冰上冷却样品。将5μl由此获得的混合物在聚丙烯酰胺凝胶（8％，TAE：40mM Tris-HCl，20mM乙酸和1mM EDTA）中上样，然后电泳，用溴化乙锭（0.5μg/ml）凝胶染色10分钟，使用UV光显现RNA。使用ImageQuantTL软件（GEHealtcare）通过测量对应于底物和主要反应产物的条带密度，通过密度测定法确定产物与底物的摩尔比。速率由反应随时间的线性范围确定。接下来，将所得的值归一化至切割含有ACCU序列的底物的初始速率。结果如图4所示。
所合成的在ACCU序列外含有取代的910S底物变体组（如表10所示）被用于研究所选Mini-III酶的切割效率。酶的选择基于高通量测序结果的分析进行。在本实验中，我们使用具有识别的序列基序的酶，其除了含有四个主要核苷酸外还含有在该序列外的核苷酸。如在含有ACCU序列中的取代的910S底物的情况下进行反应，其中反应在其开始60分钟后终止。通过主要产物的百分数除以反应的分钟数来确定切割效率。接下来，将所得的值归一化至切割含有ACCU序列的底物的初始速率。结果如图5所示。
以这种方式，建立了所测试的酶的精确序列偏好。
实施例8
使用dsRNA-BsMiniIII复合物结构模型选择可能参与识别优选序列的结构元件
作为具有dsRNA二聚体复合物结构的BsMiniIII模型的可视化分析的结果，发现该结构的两个元件位于足够接近RNA底物的位置，以参与选择底物序列以进行切割，并且这两个元件的氨基酸序列的差异可能是所测试的酶之间观察到的对多种底物偏好的差异的原因。所选的结构元件是α4螺旋和α5b-α6环（图6）。用于实验验证这些结构元件所起作用的方法之一是测试这些Mini-III区域的氨基酸序列的变化对切割不同序列的偏好的影响。为了准确建立功能区，对实施例1中描述的酶进行氨基酸序列的比对。发现虽然与α4螺旋和α5b-α6环相对应的蛋白Mini-III氨基酸序列的所选片段由序列水平上的显著差异表征，但其末端上有相似的位置，其在进化过程中是保守的。对于打算用于在被分析的酶之间交换的序列片段，为构成准确等价物，其边界被设置在与保守位置直接相邻的位置上。对于BsMiniIII氨基酸序列（SEQ ID NO：1），对于α4螺旋这些是氨基酸46-52，和对于α5b-α6环是氨基酸85-98。对于CtMiniIII氨基酸序列（SEQ ID NO：6），对于α4螺旋这些是56-62，和对于α5b-α6环是93-106。对于FpMiniIII氨基酸序列（SEQ ID NO：8），对于α4螺旋这些是45-51，和对于α5b-α6环是82-95。对于SeMiniIII氨基酸序列（SEQ ID NO：12），对于α4螺旋这些是43-49，和对于α5b-α6环是82-95。这两种结构元件，参照蛋白的氨基酸序列，在图7中标出。侧翼氨基酸的位置如表11所示。
表11.在特定的Mini-III中α4螺旋和α5b-α6环的等价氨基酸侧翼序列，其可用于 识别优选序列。
| 酶 | SEQ ID NO | 参与序列识别的α4螺旋片段的序列（氨基酸残基的给定位置的范围参考SEQ ID NO） | 参与序列识别的α5b-α6环片段的序列（氨基酸残基的给定位置的范围参考SEQ ID NO） |
| BsMiniIII | 1 | HKKSSRI (46-52) | AKSGTTPKNTDVQT (85-98) |
| CkMiniIII | 2 | YLRTTMY (36-42) | AKPKTIPRNAKLSD (73-86) |
| CrMiniIII | 4 | QREAVKY (40-46) | TKGSKNESLD (79-88) |
| CtMiniIII | 6 | HKRSIAY (56-62) | AKSATVPKNADITD (93-106) |
| FpMiniIII | 8 | NAEKVKY (45-51) | ASKASVAKHASPEE (82-95) |
| FnMiniIII | 10 | NKYVKAK (45-51) | SNIKTFPRSCTVME (82-95) |
| SeMiniIII | 12 | HQVSKSY (43-49) | AKSYTKAKNTDIQT (82-95) |
| TmMiniIII | 14 | HERVKEH (45-51) | SKAAKRHGNDPT (82-93) |
| TtMiniIII | 16 | NEQTVKY (50-56) | AKASTVPKGASVKE (87-100) |
通过这种方式，选择了氨基酸位置，其限定了用于在酶之间负责序列特异性的元件的交换的最适序列区域。
实施例9
在野生型Mini-III RNA酶之间交换结构元件的方法
通过PCR扩增用于过量产生特定酶（FpMiniIII，CtMiniIII，BsMiniIII和SpMiniIII）的重组质粒，以获得含有整个质粒的产物作为模板，其中省略了编码要被交换（移植）的结构元件的序列的短片段。表12中示出了所用引物的序列。
表12.用于构建特定嵌合蛋白的引物序列。表中所示的每对引物用于单独的PCR反应。
使用Pfu聚合酶进行PCR。在1mM ATP存在下用噬菌体T4多核苷酸激酶处理反应产物以使DNA 5'-末端磷酸化，随后，将它们与含有编码来自不同微生物的交换元件的序列的合成双链寡核苷酸（表10）合并。对于编码α5b-α6环的序列的情况，通过在两个具有部分互补序列的寡核苷酸（表11）的复性而得到的杂交体的3’端中填充，获得插入物。
在5％PEG 4000和5单位噬菌体T4 DNA连接酶的存在下，在室温下连接1小时。连接产物用于转化大肠杆菌Top10菌株，然后如实施例1中所述进行选择。使用Taq聚合酶和扩增整个插入物的ET-长和ET-反向引物（表12），将来自单克隆的材料用于PCR。对扩增产物进行测序，其使得能够选择相对于载体序列具有所需插入方向的克隆。所获得的嵌合蛋白列于表中（表13）。
表13.产生的嵌合蛋白中特定结构元件的来源。
| 嵌合蛋白 | 受体部分 | 可移植的α4螺旋的供体 | 可移植的α5b-α6环的供体 | 氨基酸序列SEQ ID NO: | 核苷酸序列SEQ ID NO: |
| Ct(FpH) | CtMiniIII | FpMiniIII | - | 18 | 19 |
| Ct(FpL) | CtMiniIII | - | FpMiniIII | 20 | 21 |
| Ct(FpHL) | CtMiniIII | FpMiniIII | FpMiniIII | 22 | 23 |
| Bs(FpH) | BsMiniIII | FpMiniIII | - | 24 | 25 |
| Bs(FpL) | BsMiniIII | - | FpMiniIII | 26 | 27 |
| Se(FpH) | SeMiniIII | FpMiniIII | - | 28 | 29 |
通过这种方式，已经开发并使用了交换结构元件的有效方法，所述结构元件参与Mini-III RNA酶的靶序列选择。
实施例10
具有交换的结构元件的Mini-III RNA酶蛋白变体的表达和纯化，以及其序列偏好的分
析
如实施例2中所述进行Mini-III RNA酶嵌合蛋白的过表达和纯化，其中用携带编码Mini-III嵌合体的基因的质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株。下一步是测量切割选自pUC910S取代变体的底物的初始速率。如实施例8中所述进行这些底物的切割的动力学测量。结果如图8所示。酶Ct（FpH）MiniIII、Ct（FpL）MiniIII、Ct（FpHL）MiniIII和Bs（FpH）MiniIII证实了相对于形成嵌合蛋白的两种初始酶（CtMiniIII和FpMiniIII）的活性增加。酶Ct（FpH）MiniIII、Ct（FpL）MiniIII和Ct（FpHL）MiniIII显示出显著改变的序列偏好。尽管野生型CtMiniIII切割910S-UGCA底物非常缓慢，但嵌合蛋白Ct(FpL)切割该底物快得多，并且嵌合蛋白Ct(FpH)以接近于切割910S-ACCU底物的速度的速度切割该底物。在嵌合蛋白Ct(FpHL)的情况中，以与FpMiniIII供体的效率类似的效率切割910S-UGCA底物，几乎是原始910S-ACCU底物的3倍(图8)。
通过这种方式，我们证实了交换可移植α4螺旋和/或可移植α5b-α6环的方法作为用于获得具有改变/增加的催化活性和/或改变的序列偏好的酶的方法的有效性。
序列表：
SEQ ID NO 1-来自枯草芽孢杆菌的BsMiniIIIwt RNA酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO 2-来自Caldicellulosiruptor kristjanssonii的CkMiniIIIwt RNA酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO 3-来自Caldicellulosiruptor kristjanssonii的CkMiniIIIwt RNA酶的核苷酸序列；
SEQ ID NO 4-来自多枝梭菌的CrMiniIIIwt RNA酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO 5-来自多枝梭菌的CrMiniIIIwt RNA酶的核苷酸序列；
SEQ ID NO 6-来自热纤维梭菌的CtMiniIIIwt RNA酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO 7-来自热纤维梭菌的CtMiniIIIwt RNA酶的核苷酸序列；
SEQ ID NO 8-来自Faecalibacterium prausnitzii的FpMiniIIIwt RNA酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO 9-来自Faecalibacterium prausnitzii的FpMiniIIIwt RNA酶的核苷酸序列；
SEQ ID NO 10-来自具核梭杆菌具核亚种的FnMiniIIIwt RNA酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO 11-来自具核梭杆菌具核亚种的FnMiniIIIwt RNA酶的核苷酸序列；
SEQ ID NO 12-来自表皮葡萄球菌的SeMiniIIIwt RNA酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO 13-来自表皮葡萄球菌的SeMiniIIIwt RNA酶的核苷酸序列；
SEQ ID NO 14-来自海栖热袍菌的TmMiniIIIwt RNA酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO 15-来自海栖热袍菌的TmMiniIIIwt RNA酶的核苷酸序列；
SEQ ID NO 16-来自现在称为Caldanaerobacter subterraneus subsp. Tengcongensis的腾冲热厌氧杆菌的TtMiniIIIwt RNA酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO 17-来自现在称为Caldanaerobacter subterraneus subsp. Tengcongensis的腾冲热厌氧杆菌的TtMiniIIIwt RNA酶的核苷酸序列；
SEQ ID NO 18-嵌合蛋白-Ct(FpH)的氨基酸序列;
SEQ ID NO 19-嵌合蛋白-Ct(FpH)的核苷酸序列;
SEQ ID NO 20-嵌合蛋白-Ct(FpL)的氨基酸序列;
SEQ ID NO 21-嵌合蛋白-Ct(FpL)的核苷酸序列;
SEQ ID NO 22-嵌合蛋白-Ct(FpHL)的氨基酸序列;
SEQ ID NO 23-嵌合蛋白-Ct(FpHL)的核苷酸序列;
SEQ ID NO 24-嵌合蛋白-Bs(FpH)的氨基酸序列;
SEQ ID NO 25-嵌合蛋白-Bs(FpH)的核苷酸序列;
SEQ ID NO 26-嵌合蛋白-Bs(FpL)的氨基酸序列;
SEQ ID NO 27-嵌合蛋白- Bs(FpL)的核苷酸序列;
SEQ ID NO 28-嵌合蛋白-Se(FpH)的氨基酸序列;
SEQ ID NO 29-嵌合蛋白-Se(FpH)的核苷酸序列;
SEQ ID NO 29至102-在说明书中提供含义;
SEQ ID NO 103-来自底物之一（910S）的片段的核苷酸序列，其是噬菌体phi6（Φ6）基因组的片段，在其中发生dsRNA切割。
序列表
<110> MIBMIK
<120> 用于改变Mini-III RNA酶的序列特异性的方法
<130> PZ/3534/AGR/PCT
<160> 103
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 143
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 1
Met Leu Glu Phe Asp Thr Ile Lys Asp Ser Lys Gln Leu Asn Gly Leu
1 5 10 15
Ala Leu Ala Tyr Ile Gly Asp Ala Ile Phe Glu Val Tyr Val Arg His
20 25 30
His Leu Leu Lys Gln Gly Phe Thr Lys Pro Asn Asp Leu His Lys Lys
35 40 45
Ser Ser Arg Ile Val Ser Ala Lys Ser Gln Ala Glu Ile Leu Phe Phe
50 55 60
Leu Gln Asn Gln Ser Phe Phe Thr Glu Glu Glu Glu Ala Val Leu Lys
65 70 75 80
Arg Gly Arg Asn Ala Lys Ser Gly Thr Thr Pro Lys Asn Thr Asp Val
85 90 95
Gln Thr Tyr Arg Tyr Ser Thr Ala Phe Glu Ala Leu Leu Gly Tyr Leu
100 105 110
Phe Leu Glu Lys Lys Glu Glu Arg Leu Ser Gln Leu Val Ala Glu Ala
115 120 125
Ile Gln Phe Gly Thr Ser Gly Arg Lys Thr Asn Glu Ser Ala Thr
130 135 140
<210> 2
<211> 132
<212> PRT
<213> Caldicellulosiruptor kristjanssonii
<400> 2
Met Leu Ser Pro Leu Val Tyr Ala Tyr Ile Gly Asp Ala Val Tyr Glu
1 5 10 15
Leu Phe Val Arg Asn Lys Ile Ile Ala Glu Asn Pro Asp Leu Thr Pro
20 25 30
Tyr Leu Tyr Tyr Leu Arg Thr Thr Met Tyr Val Lys Ala Ser Ser Gln
35 40 45
Ala Met Ala Ile Lys Lys Leu Tyr Glu Glu Leu Asp Glu Asp Glu Lys
50 55 60
Arg Ile Val Lys Arg Gly Arg Asn Ala Lys Pro Lys Thr Ile Pro Arg
65 70 75 80
Asn Ala Lys Leu Ser Asp Tyr Lys Tyr Ala Thr Ala Leu Glu Ala Leu
85 90 95
Ile Gly Tyr Leu Tyr Leu Ala Asn Asn Ile Glu Arg Leu Asn Tyr Ile
100 105 110
Leu Ser Gln Thr Tyr Asp Ile Ile Thr Glu Glu Tyr Ser Asn Ala Lys
115 120 125
Asn Ser Cys Gln
130
<210> 3
<211> 399
<212> DNA
<213> Caldicellulosiruptor kristjanssonii
<400> 3
atgcttagtc ctttagtata tgcttatatt ggagatgcag tatatgagtt gtttgtaaga 60
aacaaaataa tagctgaaaa tccagatttg accccctacc tatactatct tagaactact 120
atgtatgtaa aagcttcgag tcaagcaatg gctataaaaa aattatatga agagcttgat 180
gaagatgaaa aaagaattgt aaagagaggc agaaatgcaa aaccaaaaac cattcccaga 240
aatgccaagt tgagtgatta taaatatgcc acggcccttg aggcactaat tggttatctt 300
tatttagcaa ataacattga gagattaaat tatattcttt cacaaacgta tgatataata 360
actgaagaat acagcaatgc caagaatagc tgtcaataa 399
<210> 4
<211> 125
<212> PRT
<213> 多枝梭菌
<400> 4
Met Gly Pro Glu Leu Ile Asn Ala Ser Val Leu Ala Tyr Leu Gly Asp
1 5 10 15
Ser Ile Phe Glu Val Leu Val Arg Asp Tyr Leu Val Lys Glu Ser Gly
20 25 30
Phe Val Lys Pro Asn Asp Leu Gln Arg Glu Ala Val Lys Tyr Val Ser
35 40 45
Ala Ser Ser His Ala Ala Phe Met His Asp Met Leu Asp Glu Glu Phe
50 55 60
Phe Ser Ala Asp Glu Val Gly Thr Tyr Lys Arg Gly Arg Asn Thr Lys
65 70 75 80
Gly Ser Lys Asn Glu Ser Leu Asp His Met His Ser Thr Gly Phe Glu
85 90 95
Ala Val Ile Gly Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Asn Phe Asp Arg Ile Lys
100 105 110
Val Ile Phe Glu Arg Tyr Lys Gln Tyr Ile Asn Asn Lys
115 120 125
<210> 5
<211> 378
<212> DNA
<213> 多枝梭菌
<400> 5
atgggccctg aactgattaa tgcaagcgtt ctggcatatc tgggtgatag catttttgaa 60
gttctggtgc gtgattatct ggtgaaagaa agcggttttg tgaaaccgaa tgatctgcag 120
cgtgaagccg ttaaatatgt tagcgcaagc agccatgcag catttatgca tgatatgctg 180
gatgaagaat ttttcagcgc agatgaagtt ggcacctata aacgtggtcg taataccaaa 240
ggtagcaaaa atgaaagcct ggatcatatg catagcaccg gttttgaagc agttattggc 300
accctgtatc tggaagaaaa tttcgatcgc atcaaagtga tcttcgagcg ctataaacag 360
tacatcaaca acaaataa 378
<210> 6
<211> 140
<212> PRT
<213> 热纤维梭菌
<400> 6
Met Val Trp Glu Phe Phe Asp Lys Ile Thr Gly Glu Phe Asn Tyr Lys
1 5 10 15
Pro Asp Glu Val Ser Gln Leu Ser Pro Leu Val Leu Ala Tyr Ile Gly
20 25 30
Asp Ala Val Tyr Glu Val Phe Ile Arg Thr Met Leu Val Ser Gly Gly
35 40 45
Asn Val Pro Val His Val Leu His Lys Arg Ser Ile Ala Tyr Val Lys
50 55 60
Ala Lys Ala Gln Ser Asp Ile Val His Arg Ile Met Pro Leu Leu Thr
65 70 75 80
Glu Glu Glu Leu Asn Ile Val Arg Arg Gly Arg Asn Ala Lys Ser Ala
85 90 95
Thr Val Pro Lys Asn Ala Asp Ile Thr Asp Tyr Arg Tyr Ala Thr Gly
100 105 110
Phe Glu Ser Leu Leu Gly Phe Leu Tyr Leu Lys Lys Asp Tyr Asp Arg
115 120 125
Leu Met Asp Ile Leu Arg Met Ala Val Ser Gln Asn
130 135 140
<210> 7
<211> 423
<212> DNA
<213> 热纤维梭菌
<400> 7
atggtttggg aattttttga caaaattaca ggtgagttta attacaaacc ggatgaagta 60
agccaactgt cgcctttagt gcttgcatac ataggtgacg ccgtgtatga ggttttcatc 120
cgtacaatgc ttgtgtccgg aggaaacgta ccggtacatg ttctccataa gcgctccatt 180
gcttatgtca aagcaaaggc acagtcggat attgtccaca ggataatgcc tttgctgacg 240
gaggaggagc ttaatattgt ccgcagggga aggaacgcca aatcggccac ggttccgaaa 300
aatgcggata ttacggatta caggtatgct accggttttg agtctttgtt gggttttctt 360
tatttgaaaa aagattatga ccgattgatg gatatattgc gaatggctgt ttcacagaat 420
tga 423
<210> 8
<211> 134
<212> PRT
<213> Faecalibacterium prausnitzii
<400> 8
Met Asn Glu Ser Glu Lys Ile Asp Pro Arg Glu Leu Ser Pro Leu Ala
1 5 10 15
Leu Ala Phe Val Gly Asp Ser Val Leu Glu Leu Leu Val Arg Gln Arg
20 25 30
Leu Val Glu His His Arg Leu Ser Ala Gly Lys Leu Asn Ala Glu Lys
35 40 45
Val Lys Tyr Val Ser Ala Lys Ala Gln Phe Arg Glu Glu Gln Leu Leu
50 55 60
Glu Pro Leu Phe Thr Glu Asp Glu Leu Ala Val Phe Lys Arg Gly Arg
65 70 75 80
Asn Ala Ser Lys Ala Ser Val Ala Lys His Ala Ser Pro Glu Glu Tyr
85 90 95
Arg Ala Ser Thr Gly Phe Glu Cys Leu Leu Gly Trp Leu Tyr Leu Asn
100 105 110
Gly Gln Leu Glu Arg Val His Gln Leu Phe Glu Val Leu Trp Gln Gln
115 120 125
Phe Asp Pro Asp Gln Lys
130
<210> 9
<211> 405
<212> DNA
<213> Faecalibacterium prausnitzii
<400> 9
atgaatgaaa gcgaaaaaat tgatccgcgt gaactgagtc cgctggcact ggcatttgtt 60
ggtgatagcg ttctggaact gctggttcgt cagcgtctgg ttgaacatca tcgtctgagc 120
gcaggtaaac tgaatgcaga aaaagttaaa tacgttagcg ccaaagcaca gtttcgtgaa 180
gaacagctgc tggaaccgct gtttaccgaa gatgaactgg cagtttttaa acgtggtcgt 240
aatgcaagca aagcaagcgt tgcaaaacat gcaagtccgg aagaatatcg tgcaagcacc 300
ggttttgaat gtctgctggg ttggctgtat ctgaatggtc agctggaacg tgttcatcag 360
ctgtttgaag ttctgtggca gcagtttgat cctgatcaga aataa 405
<210> 10
<211> 129
<212> PRT
<213> 具核梭杆菌具核亚种
<400> 10
Met Asp Asn Val Asp Phe Ser Lys Asp Ile Arg Asp Tyr Ser Gly Leu
1 5 10 15
Glu Leu Ala Phe Leu Gly Asp Ala Ile Trp Glu Leu Glu Ile Arg Lys
20 25 30
Tyr Tyr Leu Gln Phe Gly Tyr Asn Ile Pro Thr Leu Asn Lys Tyr Val
35 40 45
Lys Ala Lys Val Asn Ala Lys Tyr Gln Ser Leu Ile Tyr Lys Lys Ile
50 55 60
Ile Asn Asp Leu Asp Glu Glu Phe Lys Val Ile Gly Lys Arg Ala Lys
65 70 75 80
Asn Ser Asn Ile Lys Thr Phe Pro Arg Ser Cys Thr Val Met Glu Tyr
85 90 95
Lys Glu Ala Thr Ala Leu Glu Ala Ile Ile Gly Ala Met Tyr Leu Leu
100 105 110
Lys Lys Glu Glu Glu Ile Lys Lys Ile Ile Asn Ile Val Ile Lys Gly
115 120 125
Glu
<210> 11
<211> 390
<212> DNA
<213> 具核梭杆菌具核亚种
<400> 11
atggacaatg tagatttttc aaaggatata agagattaca gtggactgga attagcattt 60
ttaggagatg ctatttggga actggaaata agaaaatatt acttacaatt tggctataat 120
attcctactt taaataaata tgttaaagct aaggtaaatg caaaatatca aagtctgatt 180
tataagaaaa ttataaatga tttagatgaa gaatttaaag ttataggaaa aagagctaaa 240
aatagtaaca taaaaacttt tccaaggagt tgtacagtga tggaatataa ggaagcgaca 300
gccttagaag ctattatcgg agcaatgtat ttgttaaaaa aagaagaaga aataaaaaaa 360
attataaata tagttataaa gggagaatga 390
<210> 12
<211> 132
<212> PRT
<213> 表皮葡萄球菌
<400> 12
Met Ala Lys His Met Asn Val Lys Leu Leu Asn Pro Leu Thr Leu Ala
1 5 10 15
Tyr Met Gly Asp Ala Val Leu Asp Gln His Val Arg Glu Tyr Ile Val
20 25 30
Leu Lys Leu Gln Ser Lys Pro His Arg Leu His Gln Val Ser Lys Ser
35 40 45
Tyr Val Ser Ala Lys Ser Gln Ala Lys Thr Leu Glu Tyr Leu Leu Asp
50 55 60
Ile Asp Trp Phe Thr Glu Glu Glu Leu Ser Val Leu Lys Arg Gly Arg
65 70 75 80
Asn Ala Lys Ser Tyr Thr Lys Ala Lys Asn Thr Asp Ile Gln Thr Tyr
85 90 95
Arg Lys Ser Ser Ala Leu Glu Ala Val Ile Gly Phe Leu Tyr Leu Asp
100 105 110
His Gln Ser Glu Arg Leu Glu Asn Leu Leu Glu Thr Ile Val Arg Ile
115 120 125
Val Asp Glu Arg
130
<210> 13
<211> 399
<212> DNA
<213> 表皮葡萄球菌
<400> 13
atggctaaac atatgaacgt aaaacttctt aatcctttaa cattggcata tatgggtgat 60
gcagtacttg atcaacatgt gcgtgaatat atcgtgctaa aattacaaag taaacctcat 120
cgtttgcacc aagtatcgaa aagttacgtt tcagcgaaaa gtcaagctaa gactttagag 180
tatttgttag atattgactg gtttacagag gaagagctaa gtgttttaaa acgaggacgt 240
aacgctaaaa gttatacaaa agctaaaaat actgacattc aaacttatcg taaaagttca 300
gcgttagaag ctgttatcgg atttttatat ttagaccatc aatcagaacg attagaaaac 360
ttattagaaa caattgttag gatagtggat gaaaggtaa 399
<210> 14
<211> 140
<212> PRT
<213> 海栖热袍菌
<400> 14
Met Glu Lys Leu Phe Arg Phe Glu Ala Glu Pro Glu Lys Leu Pro Pro
1 5 10 15
Ala Val Leu Ala Tyr Leu Gly Asp Ala Val Leu Glu Leu Ile Phe Arg
20 25 30
Ser Arg Phe Thr Gly Asp Tyr Arg Met Ser Val Ile His Glu Arg Val
35 40 45
Lys Glu His Thr Ser Lys His Gly Gln Ala Trp Met Leu Glu Asn Ile
50 55 60
Trp Asn Leu Leu Asp Glu Arg Glu Gln Glu Ile Val Lys Arg Ala Met
65 70 75 80
Asn Ser Lys Ala Ala Lys Arg His Gly Asn Asp Pro Thr Tyr Arg Lys
85 90 95
Ser Thr Gly Phe Glu Ala Leu Ile Gly Tyr Leu Phe Leu Lys Arg Glu
100 105 110
Phe Asp Arg Ile Glu Glu Leu Leu Arg Val Val Met Asp Leu Glu Ser
115 120 125
Leu Arg Lys Lys Asn Pro Gly Gly Ser Ala Gln Glu
130 135 140
<210> 15
<211> 423
<212> DNA
<213> 海栖热袍菌
<400> 15
atggaaaaac tcttcagatt cgaagcagaa ccggagaaac tgccaccggc cgttctagcg 60
tatctgggag atgccgttct ggagctcatc ttcagatcga gattcacagg agattacaga 120
atgtccgtca tacacgagag ggtcaaggaa cacacctcga aacacggtca ggcatggatg 180
ctggagaata tatggaatct cctcgacgaa agagagcaag aaatagttaa aagagcgatg 240
aattcgaagg cagcgaaaag acacgggaac gaccctacat acagaaagag caccggtttc 300
gaagctttga tcgggtatct attcttgaaa agagaattcg acagaattga agaactgctt 360
cgggtggtga tggatcttga gagtctacgg aagaaaaatc ctggaggaag cgctcaggaa 420
taa 423
<210> 16
<211> 136
<212> PRT
<213> 腾冲热厌氧杆菌
<400> 16
Met Glu Lys Asp Lys Met Ile Leu Val Lys Glu Lys Gly Val Leu Asp
1 5 10 15
Leu Ser Pro Leu Val Leu Ala Phe Ile Gly Asp Ala Val Tyr Ser Leu
20 25 30
Tyr Val Arg Thr Lys Ile Val Glu Lys Gly Asn Met Lys Leu Ala His
35 40 45
Leu Asn Glu Gln Thr Val Lys Tyr Val Lys Ala Ser Ser Gln Ala Arg
50 55 60
Ser Leu Glu Arg Ile Tyr Asp Leu Leu Thr Glu Glu Glu Lys Glu Ile
65 70 75 80
Val Arg Arg Gly Arg Asn Ala Lys Ala Ser Thr Val Pro Lys Gly Ala
85 90 95
Ser Val Lys Glu Tyr Lys Tyr Ala Thr Ala Phe Glu Ala Leu Val Gly
100 105 110
Tyr Leu Tyr Leu Leu Glu Arg Phe Asp Arg Leu Tyr Phe Leu Leu Ser
115 120 125
Leu Ser Met Glu Tyr Thr Glu Glu
130 135
<210> 17
<211> 477
<212> DNA
<213> 腾冲热厌氧杆菌
<400> 17
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggaagttct gttccagggg 60
ccccatatgg aaaaggataa gatgattctt gtaaaggaaa agggggtttt agacttatcc 120
ccccttgttt tggctttcat tggagatgcg gtttacagcc tttatgtcag aactaagatt 180
gtggagaaag ggaatatgaa attggctcat ttaaatgagc aaactgtgaa gtacgttaag 240
gcatcttcac aggctaggtc tcttgagcga atttacgacc ttctcactga agaagaaaag 300
gaaattgtga gaaggggaag aaatgccaaa gcttctacag ttccaaaagg agcaagtgtt 360
aaagagtata agtatgccac tgcctttgaa gcattagtgg gatatttgta ccttttagaa 420
agatttgata ggctttactt tcttttgagc ctttctatgg aatacacgga agaatga 477
<210> 18
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 嵌合蛋白Ct(FpH)的AA序列
<400> 18
Met Val Trp Glu Phe Phe Asp Lys Ile Thr Gly Glu Phe Asn Tyr Lys
1 5 10 15
Pro Asp Glu Val Ser Gln Leu Ser Pro Leu Val Leu Ala Tyr Ile Gly
20 25 30
Asp Ala Val Tyr Glu Val Phe Ile Arg Thr Met Leu Val Ser Gly Gly
35 40 45
Asn Val Pro Val His Val Leu Asn Ala Glu Lys Val Lys Tyr Val Lys
50 55 60
Ala Lys Ala Gln Ser Asp Ile Val His Arg Ile Met Pro Leu Leu Thr
65 70 75 80
Glu Glu Glu Leu Asn Ile Val Arg Arg Gly Arg Asn Ala Lys Ser Ala
85 90 95
Thr Val Pro Lys Asn Ala Asp Ile Thr Asp Tyr Arg Tyr Ala Thr Gly
100 105 110
Phe Glu Ser Leu Leu Gly Phe Leu Tyr Leu Lys Lys Asp Tyr Asp Arg
115 120 125
Leu Met Asp Ile Leu Arg Met Ala Val Ser Gln Asn
130 135 140
<210> 19
<211> 423
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 嵌合蛋白Ct(FpH)的NA序列
<400> 19
atggtttggg aattttttga caaaattaca ggtgagttta attacaaacc ggatgaagta 60
agccaactgt cgcctttagt gcttgcatac ataggtgacg ccgtgtatga ggttttcatc 120
cgtacaatgc ttgtgtccgg aggaaacgta ccggtacatg ttctgaatgc agaaaaagtt 180
aaatatgtca aagcaaaggc acagtcggat attgtccaca ggataatgcc tttgctgacg 240
gaggaggagc ttaatattgt ccgcagggga aggaacgcca aatcggccac ggttccgaaa 300
aatgcggata ttacggatta caggtatgct accggttttg agtctttgtt gggttttctt 360
tatttgaaaa aagattatga ccgattgatg gatatattgc gaatggctgt ttcacagaat 420
taa 423
<210> 20
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 嵌合蛋白Ct(FpL)的AA序列
<400> 20
Met Val Trp Glu Phe Phe Asp Lys Ile Thr Gly Glu Phe Asn Tyr Lys
1 5 10 15
Pro Asp Glu Val Ser Gln Leu Ser Pro Leu Val Leu Ala Tyr Ile Gly
20 25 30
Asp Ala Val Tyr Glu Val Phe Ile Arg Thr Met Leu Val Ser Gly Gly
35 40 45
Asn Val Pro Val His Val Leu His Lys Arg Ser Ile Ala Tyr Val Lys
50 55 60
Ala Lys Ala Gln Ser Asp Ile Val His Arg Ile Met Pro Leu Leu Thr
65 70 75 80
Glu Glu Glu Leu Asn Ile Val Arg Arg Gly Arg Asn Ala Ser Lys Ala
85 90 95
Ser Val Ala Lys His Ala Ser Pro Glu Glu Tyr Arg Tyr Ala Thr Gly
100 105 110
Phe Glu Ser Leu Leu Gly Phe Leu Tyr Leu Lys Lys Asp Tyr Asp Arg
115 120 125
Leu Met Asp Ile Leu Arg Met Ala Val Ser Gln Asn
130 135 140
<210> 21
<211> 423
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 嵌合蛋白Ct(FpL)的NA序列
<400> 21
atggtttggg aattttttga caaaattaca ggtgagttta attacaaacc ggatgaagta 60
agccaactgt cgcctttagt gcttgcatac ataggtgacg ccgtgtatga ggttttcatc 120
cgtacaatgc ttgtgtccgg aggaaacgta ccggtacatg ttctccataa gcgctccatt 180
gcttatgtca aagcaaaggc acagtcggat attgtccaca ggataatgcc tttgctgacg 240
gaggaggagc ttaatattgt ccgcagggga aggaacgcgt caaaagcaag cgttgcaaaa 300
catgcaagtc cggaagaata caggtatgct accggttttg agtctttgtt gggttttctt 360
tatttgaaaa aagattatga ccgattgatg gatatattgc gaatggctgt ttcacagaat 420
taa 423
<210> 22
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 嵌合蛋白Ct(FpHL)的AA序列
<400> 22
Met Val Trp Glu Phe Phe Asp Lys Ile Thr Gly Glu Phe Asn Tyr Lys
1 5 10 15
Pro Asp Glu Val Ser Gln Leu Ser Pro Leu Val Leu Ala Tyr Ile Gly
20 25 30
Asp Ala Val Tyr Glu Val Phe Ile Arg Thr Met Leu Val Ser Gly Gly
35 40 45
Asn Val Pro Val His Val Leu Asn Ala Glu Lys Val Lys Tyr Val Lys
50 55 60
Ala Lys Ala Gln Ser Asp Ile Val His Arg Ile Met Pro Leu Leu Thr
65 70 75 80
Glu Glu Glu Leu Asn Ile Val Arg Arg Gly Arg Asn Ala Ser Lys Ala
85 90 95
Ser Val Ala Lys His Ala Ser Pro Glu Glu Tyr Arg Tyr Ala Thr Gly
100 105 110
Phe Glu Ser Leu Leu Gly Phe Leu Tyr Leu Lys Lys Asp Tyr Asp Arg
115 120 125
Leu Met Asp Ile Leu Arg Met Ala Val Ser Gln Asn
130 135 140
<210> 23
<211> 422
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223>嵌合蛋白Ct(FpHL)的NA序列
<400> 23
atggtttggg aattttttga caaaattaca ggtgagttta attacaaacc ggatgaagta 60
agccaactgt cgcctttagt gcttgcatac ataggtgacg ccgtgtatga ggttttcatc 120
cgtacaatgc ttgtgtccgg aggaaacgta ccggtacatg ttctgaatgc agaaaaagtt 180
aaatatgtca aagcaaaggc acagtcggat attgtccaca ggataatgcc tttgctgacg 240
gaggaggagc ttaatattgt ccgcagggga aggaacgcgt caaaagcaag cgttgcaaaa 300
catgcaagtc cggaagaata caggtatgct accggttttg agtctttgtt gggttttctt 360
tatttgaaaa aagattatga ccgattgatg gatatattgc gaatggctgt ttcacagaat 420
ta 422
<210> 24
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 嵌合蛋白Bs(FpH)的AA序列
<400> 24
Met Val Glu Phe Asp Thr Ile Lys Asp Ser Lys Gln Leu Asn Gly Leu
1 5 10 15
Ala Leu Ala Tyr Ile Gly Asp Ala Ile Phe Glu Val Tyr Val Arg His
20 25 30
His Leu Leu Lys Gln Gly Phe Thr Lys Pro Asn Asp Leu Asn Ala Glu
35 40 45
Lys Tyr Val Ser Ala Lys Ser Gln Ala Glu Ile Leu Phe Phe Leu Gln
50 55 60
Asn Gln Ser Phe Phe Thr Glu Glu Glu Glu Ala Val Leu Lys Arg Gly
65 70 75 80
Arg Asn Ala Lys Ser Gly Thr Thr Pro Lys Asn Thr Asp Val Gln Thr
85 90 95
Tyr Arg Tyr Ser Thr Ala Phe Glu Ala Leu Leu Gly Tyr Leu Phe Leu
100 105 110
Glu Lys Lys Glu Glu Arg Leu Ser Gln Leu Val Ala Glu Ala Ile Gln
115 120 125
Phe Gly Thr Ser Gly Arg Lys Thr Asn Glu Ser Ala Thr
130 135 140
<210> 25
<211> 426
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 嵌合蛋白Bs(FpH)的NA序列
<400> 25
atggttgaat ttgatacgat aaaagattct aagcagctta acggtcttgc gcttgcttat 60
ataggtgatg ccatttttga agtgtatgtc aggcatcacc tgcttaagca gggctttacc 120
aaaccaaatg atctgaatgc agaaaaatat gtttcagcaa agtcacaggc tgagatccta 180
ttttttctgc agaatcaatc attttttacg gaagaagagg aagcggtgct gaaaagaggc 240
agaaatgcca agtcagggac aacacctaaa aatacagatg ttcagacgta ccgctacagt 300
acagcatttg aagcgcttct gggctacctt tttctagaga aaaaagagga acgacttagt 360
cagctcgtag ccgaagctat acaattcggg acgtcaggga ggaaaacaaa tgagtcagca 420
acataa 426
<210> 26
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 嵌合蛋白Bs(FpL)的AA序列
<400> 26
Met Val Glu Phe Asp Thr Ile Lys Asp Ser Lys Gln Leu Asn Gly Leu
1 5 10 15
Ala Leu Ala Tyr Ile Gly Asp Ala Ile Phe Glu Val Tyr Val Arg His
20 25 30
His Leu Leu Lys Gln Gly Phe Thr Lys Pro Asn Asp Leu His Lys Lys
35 40 45
Ser Ser Arg Ile Val Ser Ala Lys Ser Gln Ala Glu Ile Leu Phe Phe
50 55 60
Leu Gln Asn Gln Ser Phe Phe Thr Glu Glu Glu Glu Ala Val Leu Lys
65 70 75 80
Arg Gly Arg Asn Ala Ser Lys Ala Ser Val Ala Lys His Ala Ser Pro
85 90 95
Glu Glu Tyr Arg Tyr Ser Thr Ala Phe Glu Ala Leu Leu Gly Tyr Leu
100 105 110
Phe Leu Glu Lys Lys Glu Glu Arg Leu Ser Gln Leu Val Ala Glu Ala
115 120 125
Ile Gln Phe Gly Thr Ser Gly Arg Lys Thr Asn Glu Ser Ala Thr
130 135 140
<210> 27
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 嵌合蛋白Bs(FpL)的NA序列
<400> 27
atggttgaat ttgatacgat aaaagattct aagcagctta acggtcttgc gcttgcttat 60
ataggtgatg ccatttttga agtgtatgtc aggcatcacc tgcttaagca gggctttacc 120
aaaccaaatg atcttcataa gaaatcaagc cggattgttt cagcaaagtc acaggctgag 180
atcctatttt ttctgcagaa tcaatcattt tttacggaag aagaggaagc ggtgctgaaa 240
agaggcagaa acgcgtcaaa agcaagcgtt gcaaaacatg caagtccgga agaataccgc 300
tacagtacag catttgaagc gcttctgggc tacctttttc tagagaaaaa agaggaacga 360
cttagtcagc tcgtagccga agctatacaa ttcgggacgt cagggaggaa aacaaatgag 420
tcagcaacat aa 432
<210> 28
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 嵌合蛋白Se(FpH)的AA序列
<400> 28
Met Val Ala Lys His Met Asn Val Lys Leu Leu Asn Pro Leu Thr Leu
1 5 10 15
Ala Tyr Met Gly Asp Ala Val Leu Asp Gln His Val Arg Glu Tyr Ile
20 25 30
Val Leu Lys Leu Gln Ser Lys Pro His Arg Leu Asn Ala Glu Lys Tyr
35 40 45
Val Ser Ala Lys Ser Gln Ala Lys Thr Leu Glu Tyr Leu Leu Asp Ile
50 55 60
Asp Trp Phe Thr Glu Glu Glu Leu Ser Val Leu Lys Arg Gly Arg Asn
65 70 75 80
Ala Lys Ser Tyr Thr Lys Ala Lys Asn Thr Asp Ile Gln Thr Tyr Arg
85 90 95
Lys Ser Ser Ala Leu Glu Ala Val Ile Gly Phe Leu Tyr Leu Asp His
100 105 110
Gln Ser Glu Arg Leu Glu Asn Leu Leu Glu Thr Ile Val Arg Ile Val
115 120 125
Asp Glu Arg
130
<210> 29
<211> 394
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 嵌合蛋白Se(FpH)的NA序列
<400> 29
atggtggcta aacatatgaa cgtaaaactt cttaatcctt taacattggc atatatgggt 60
gatgcagtac ttgatcaaca tgtgcgtgaa tatatcgtgc taaaattaca aagtaaacct 120
catcgtctga atgcagaaaa atacgtttca gcgaaaagtc aagctaagac tttagagtat 180
ttgttagata ttgactggtt tacagaggaa gagctaagtg ttttaaaacg aggacgtaac 240
gctaaaagtt atacaaaagc taaaaatact gacattcaaa cttatcgtaa aagttcagcg 300
ttagaagctg ttatcggatt tttatattta gaccatcaat cagaacgatt agaaaactta 360
ttagaaacaa ttgttaggat agtggatgaa ataa 394
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物FckminiIII
<400> 30
cctccatggt cagtccttta gtatatg 27
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物RckminiIII
<400> 31
cctctcgagt tattgacagc tattcttggc 30
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物FcrminiIII
<400> 32
ggaccatggg ccctgaactg attaatgc 28
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物RcrminiIII
<400> 33
ggcctcgagt tatttgttgt tgatgtactg 30
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物FctminiIII
<400> 34
caggcatatg gtttgggaat tttttgac 28
<210> 35
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物RctminiIII
<400> 35
gacctcgagt caattctgtg aaacagcc 28
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物FfpminiIII
<400> 36
ggaccatgga cgaaagcgaa aaaattg 27
<210> 37
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物RfpminiIII
<400> 37
gcgctcgagt tatttctgat caggatcaaa c 31
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物FfnminiIII
<400> 38
ccgcatatgg acaatgtaga tttttcaaag 30
<210> 39
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物RfnminiIII
<400> 39
gtgctcgagt catcattctc cctttataac tatatttata atttttttta tttc 54
<210> 40
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物FseminiIII
<400> 40
tagacatatg gcagtggcta aacatatgaa c 31
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物RseminiIII
<400> 41
atctcgagct acctttcatc cacta 25
<210> 42
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物FtmminiIII
<400> 42
gcttcatatg gaaaaactct tcagattcg 29
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物RtmminiIII
<400> 43
cttctcgagt tattcctgag cgcttcc 27
<210> 44
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物FttminiIII
<400> 44
cgcacatatg gaaaaggata agatgattct tg 32
<210> 45
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物RttminiIII
<400> 45
gctctcgagt cattcttccg tgtattccat ag 32
<210> 46
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物UniShPreA
<400> 46
agatcggaag agcgtcgtgt agggaaagag tgtaga 36
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物UniShRT
<400> 47
tctacactct ttccctacac gac 23
<210> 48
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物PreA3Univ
<400> 48
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cac 33
<210> 49
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物910fT7
<400> 49
taatacgact cactataggg ctgctcgcgc gttg 34
<210> 50
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物910rP6
<400> 50
ggaaaaaaat cagacacaac tgacgcgatc g 31
<210> 51
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物949fT7
<400> 51
taatacgact cactataggg cctctctctc tggccacgat c 41
<210> 52
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物949rP6
<400> 52
ggaaaaaaat gccctgtaca gcaggcataa g 31
<210> 53
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物2021fT7
<400> 53
taatacgact cactataggg ctcctatcat ggccgttgc 39
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物2021rP6
<400> 54
ggaaaaaaac ttcgagatca gggttggacg 30
<210> 55
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物3292fT7
<400> 55
taatacgact cactataggg taccgcgatc aacactgtcg tc 42
<210> 56
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物3292rP6
<400> 56
ggaaaaaaac gaatcaggac gtctggacg 29
<210> 57
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物4486fT7
<400> 57
taatacgact cactataggg ctgtctcccc tcggtttcat c 41
<210> 58
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物4486rP6
<400> 58
ggaaaaaaat cgacagacga cagcgctg 28
<210> 59
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物4754fT7
<400> 59
taatacgact cactataggg ctcatcgcct cgatgaacca ag 42
<210> 60
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物4754rP6
<400> 60
ggaaaaaaac tactgctttc gagcggtcg 29
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物WSSWf
<400> 61
sswctctctc tggccacgat c 21
<210> 62
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物WSSWr
<400> 62
wttccctccc agcacg 16
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物ANNTf
<220>
<221> 其它特征
<222> (1)..(2)
<223> n是a, c, g或t
<400> 63
nntctctctc tggccacgat c 21
<210> 64
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物ANNTr
<400> 64
tttccctccc agcacg 16
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物NCCNf
<220>
<221> 其它特征
<222> (3)..(3)
<223> n是a, c, g或t
<400> 65
ccnctctctc tggccacgat c 21
<210> 66
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物NCCNr
<220>
<221> 其它特征
<222> (1)..(1)
<223> n是a, c, g或t
<400> 66
nttccctccc agcacg 16
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物3T-r
<400> 67
tttacctccc agcacgaccg cgac 24
<210> 68
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物3T-f
<400> 68
cctctctctc tggccacgat cgcgtc 26
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物4C-r
<400> 69
gccctcccag cacgaccgcg a 21
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物4G-r
<400> 70
cccctcccag cacgaccgcg ac 22
<210> 71
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物4T-r
<400> 71
accctcccag cacgaccgc 19
<210> 72
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物4-f
<400> 72
aacctctctc tctggccacg atcgcgtc 28
<210> 73
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物11C-r
<400> 73
cctccctctc tggccacgat cgcgtcag 28
<210> 74
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物11G-r
<400> 74
cctcgctctc tggccacgat cgcgtcag 28
<210> 75
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物12A-r
<400> 75
cctctatctc tggccacgat cgcgtcag 28
<210> 76
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物11/12-f
<400> 76
tttccctccc agcacgaccg cgac 24
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物CtR1Up
<400> 77
gcttcataag cgctccattg ct 22
<210> 78
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物CtR1Dw
<400> 78
agcaatggag cgcttatgaa gc 22
<210> 79
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物CtR2Up
<400> 79
caatgccaaa tcggccacgg ttccgaaaaa tg 32
<210> 80
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物CtR2Dw
<400> 80
atccgtaata tccgcatttt tcggaac 27
<210> 81
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物FpR1Up
<400> 81
atgcagaaaa agttaaa 17
<210> 82
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物FpR1Dw
<400> 82
tttaactttt tctgcat 17
<210> 83
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物FpR2Up
<400> 83
cgtcaaaagc aagcgttgca aaacatg 27
<210> 84
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物FpR2Dw
<400> 84
ttcttccgga cttgcatgtt ttgcaac 27
<210> 85
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物CpR1f
<400> 85
tatgtcaaag caaaggcac 19
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物CpR1r
<400> 86
tcagaacatg taccggtacg 20
<210> 87
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物CpR2f
<400> 87
tacaggtatg ctaccggttt tgagtctttg 30
<210> 88
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 88
cgttccttcc cctgcggac 19
<210> 89
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物FpR1f
<400> 89
tacgttagcg ccaaag 16
<210> 90
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物FpR1r
<400> 90
ttacctgcgc tcagac 16
<210> 91
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物FpR2f
<400> 91
tatcgtgcaa gcaccggttt tg 22
<210> 92
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物FpR2r
<400> 92
cgaccacgtt taaaaactgc cagttc 26
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物BsR1f
<400> 93
tatgtttcag caaagtcaca 20
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物BsR1r
<400> 94
tcagatcatt tggtttggta aag 23
<210> 95
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物BsR2f
<400> 95
taccgctaca gtacagc 17
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物BsR2r
<400> 96
cgtttctgcc tcttttcagc 20
<210> 97
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物SeR1f
<400> 97
tacgtttcag cgaaaagtc 19
<210> 98
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物SeR1rf
<400> 98
tcagacgatg aggtttactt tgtaatttta g 31
<210> 99
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物SeR2f
<400> 99
tatcgtaaaa gttcagcgtt ag 22
<210> 100
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物SeR2r
<400> 100
cgttacgtcc tcgttttaaa ac 22
<210> 101
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物ET-长
<400> 101
gtccggcgta gaggatcg 18
<210> 102
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物ET-反向
<400> 102
tcccattcgc caatcc 16
<210> 103
<211> 14
<212> RNA
<213> phi6噬菌体
<400> 103
gggaaaccuc ucuc 14
Claims (30)
1. 一种具有氨基酸序列的Mini-III RNA酶，所述氨基酸序列包含受体部分和在Mini-III RNA酶结构中分别形成α4螺旋和α5b-α6环结构的可移植的α4螺旋和可移植的α5b-α6环，
其中分别形成α4螺旋和α5b-α6环结构的片段在结构上对应于分别由SEQ ID NO：1中所示的来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的Mini-III RNA酶的氨基酸序列片段46-52和85-98形成的α4螺旋和α5b-α6环的相应结构，
其中所述Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，所述dsRNA切割仅依赖于底物的核糖核苷酸序列，并且不依赖于底物结构中二级结构的出现，并且不依赖于其它辅助蛋白的存在，
并且其中所述Mini-III RNA酶不是SEQ ID NO: 1的来自枯草芽孢杆菌的Mini-III蛋白，也不是具有D94R突变的SEQ ID NO: 1。
2. 根据权利要求1所述的Mini-III RNA酶，其特征在于氨基酸序列由源自一种微生物的Mini-III RNA酶的受体部分与分别源自来自不同微生物的Mini-III RNA酶的α4螺旋和/或α5b-α6环序列的插入的可移植的α4螺旋和/或可移植的α5b-α6环构成。
3. 根据权利要求1或2所述的Mini-III RNA酶，其特征在于其氨基酸序列包含
- 源自BsMiniIIIwt(SEQ ID NO: 1)、或Caldicellulosiruptor kristjanssonii的Mini-III CkMiniIIIwt (SEQ ID NO: 2)、或多枝梭菌(Clostridium ramosum)的CrMiniIIIwt (SEQ ID NO: 4)、或热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)的CtMiniIIIwt(SEQ ID NO: 6)、或Faecalibacterium prausnitzii的FpMiniIIIwt(SEQ ID NO: 8)、或具核梭杆菌具核亚种(Fusobacterium nucleatum subsp. Nucleatum)的FnMiniIIIwt(SEQ IDNO: 10)、或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的SeMiniIIIwt(SEQ ID NO:12)、或海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的TmMiniIIIwt(SEQ ID NO: 14)、或现称为Caldanaerobacter subterraneus subsp. Tengcongensis的腾冲热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)的TtMiniIIIwt (SEQ ID NO: 16)的Mini-III RNA酶的受体部分，或与其具有至少80％、优选85％、更优选90％、最优选95％同一性的氨基酸序列；
- 可移植的α4螺旋，其源自
具有包括SEQ ID NO: 1的46-52位氨基酸的氨基酸序列的BsMiniIIIwt、或具有包括SEQID NO: 2的氨基酸36-42的氨基酸序列的CkMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 4的氨基酸40-46的氨基酸序列的CtMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 6的56-62位氨基酸的氨基酸序列的CtMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 8的45-51位氨基酸的氨基酸序列的FpMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 10的氨基酸45-51的氨基酸序列的FnMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 12的43-49位氨基酸的氨基酸序列的SeMiniIIIwt、或具有包括SEQ IDNO: 14的氨基酸45-51的氨基酸序列的TmMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 16的氨基酸50-56的氨基酸序列的TtMiniIIIwt，或与其具有至少80％、优选85％、更优选90％、最优选95％同一性的氨基酸序列，和/或
- 可移植的α5b-α6环，其源自
具有包括SEQ ID NO: 1的85-98位氨基酸的氨基酸序列的BsMiniIIIwt、或具有包括SEQID NO: 2的氨基酸73-86的氨基酸序列的CkMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 4的氨基酸79-88的氨基酸序列的CtMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 6的93-106位氨基酸的氨基酸序列的CtMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 8的82-95位氨基酸的氨基酸序列的FpMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 10的氨基酸82-95的氨基酸序列的FnMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 12的82-95位氨基酸的氨基酸序列的SeMiniIIIwt、或具有包括SEQ IDNO: 14的氨基酸82-93的氨基酸序列的TmMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 16的氨基酸87-100的氨基酸序列的TtMiniIIIwt，或与其具有至少80％、优选85％、更优选90％、最优选95％同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的Mini-III RNA酶，其特征在于，它保持Mini-III RNA酶活性，并包含SEQ ID NO: 2所示的来自Caldicellulosiruptor kristjanssonii的氨基酸序列的序列或片段，其中Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中N= A, C, G, U; W = A, U; S = C, G; Y = C, U。
5.根据权利要求1所述的Mini-III RNA酶，其特征在于，它保持Mini-III RNA酶活性，并包含SEQ ID NO: 4所示的来自多枝梭菌的氨基酸序列的序列或片段，其中Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中N= A, C, G, U; W = A, U; S = C, G。
6.根据权利要求1所述的Mini-III RNA酶，其特征在于，它保持Mini-III RNA酶活性，并包含SEQ ID NO: 6所示的来自热纤维梭菌的氨基酸序列的序列或片段，其中Mini-IIIRNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中W = A, U; S = C, G。
7.根据权利要求1所述的Mini-III RNA酶，其特征在于，它保持Mini-III RNA酶活性，并包含SEQ ID NO: 8所示的来自Faecalibacterium prausnitzii的氨基酸序列的序列或片段，其中Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中W = A, U; S = C, G。
8.根据权利要求1所述的Mini-III RNA酶，其特征在于，它保持Mini-III RNA酶活性，并包含SEQ ID NO: 10所示的来自具核梭杆菌的氨基酸序列的序列或片段，其中Mini-IIIRNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中W = A, U; S = C, G。
9.根据权利要求1所述的Mini-III RNA酶，其特征在于，它保持Mini-III RNA酶活性，并包含SEQ ID NO: 12所示的来自表皮葡萄球菌的氨基酸序列的序列或片段，其中Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中N= A, C, G, U; W = A, U; S = C, G。
10.根据权利要求1所述的Mini-III RNA酶，其特征在于，它保持Mini-III RNA酶活性，并包含SEQ ID NO: 14所示的来自海栖热袍菌的氨基酸序列的序列或片段，其中Mini-IIIRNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中N= A, C, G, U; W = A, U; S = C, G。
11.根据权利要求1所述的Mini-III RNA酶，其特征在于，它保持Mini-III RNA酶活性，并包含SEQ ID NO: 16所示的来自腾冲热厌氧杆菌（Caldanaerobacter subterraneus subsp. Tengcongensis）的氨基酸序列的序列或片段，其中Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中N= A, C, G, U; W = A, U; S = C, G; Y = C, U。
12. 根据权利要求1-3所述的Mini-III RNA酶，其特征在于所述Mini-III RNA酶是选自以下的嵌合蛋白：SEQ ID NO: 18的Ct(FpH)、SEQ ID NO: 20的Ct(FpL)、SEQ ID NO: 22的Ct(FpHL)、SEQ ID NO: 24的Bs(FpH)、SEQ ID NO: 26的Bs(FpL)、SEQ ID NO: 28的Se(FpH)。
13. 一种获得嵌合Mini-III RNA酶的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a)克隆编码Mini-III RNA酶的基因，其中其氨基酸序列包含分别形成α4螺旋和α5b-α6环结构的片段，其在结构上对应于分别由SEQ ID NO：1所示的来自枯草芽孢杆菌的Mini-III RNA酶的氨基酸序列片段46-52和85-98形成的α4螺旋和α5b-α6环的相应结构，
b)通过用来自编码不同微生物的Mini-III RNA酶的基因的分别编码α4螺旋和/或α5b-α6环结构的片段，交换至少一个分别编码α4螺旋和/或α5b-α6环结构的片段，修饰编码所述RNA酶的基因，
其中所述Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，所述dsRNA切割仅依赖于核糖核苷酸序列，并且不依赖于底物结构中二级结构的出现，并且不依赖于其它辅助蛋白的存在，
并且其中Mini-III RNA酶不是具有SEQ ID NO: 1显示的氨基酸序列的来自枯草芽孢杆菌的Mini-III蛋白，也不是具有D94R突变的SEQ ID NO: 1。
14. 根据权利要求13所述的获得嵌合Mini-III RNA酶的方法，其特征在于步骤b)包括将可移植的α4螺旋和/或可移植的α5b-α6环插入受体部分，其中
- 受体部分源自BsMiniIIIwt(SEQ ID NO: 1)、或Caldicellulosiruptor kristjanssonii的Mini-III CkMiniIIIwt (SEQ ID NO: 2)、或多枝梭菌(Clostridium ramosum)的CrMiniIIIwt (SEQ ID NO: 4)、或热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)的CtMiniIIIwt(SEQ ID NO: 6)、或Faecalibacterium prausnitzii的FpMiniIIIwt(SEQ IDNO: 8)、或具核梭杆菌具核亚种(Fusobacterium nucleatum subsp. Nucleatum)的FnMiniIIIwt(SEQ ID NO: 10)、或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的SeMiniIIIwt(SEQ ID NO: 12)、或海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的TmMiniIIIwt(SEQID NO: 14)、或现称为Caldanaerobacter subterraneus subsp. Tengcongensis的腾冲热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)的TtMiniIIIwt (SEQ ID NO: 16)的Mini-III RNA酶，或包含与其具有至少80％、优选85％、更优选90％、最优选95％同一性的氨基酸序列；
- 可移植的α4螺旋源自
具有包括SEQ ID NO: 1的46-52位氨基酸的氨基酸序列的BsMiniIIIwt、或具有包括SEQID NO: 2的氨基酸36-42的氨基酸序列的CkMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 4的氨基酸40-46的氨基酸序列的CtMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 6的56-62位氨基酸的氨基酸序列的CtMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 8的45-51位氨基酸的氨基酸序列的FpMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 10的氨基酸45-51的氨基酸序列的FnMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 12的43-49位氨基酸的氨基酸序列的SeMiniIIIwt、或具有包括SEQ IDNO: 14的氨基酸45-51的氨基酸序列的TmMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 16的氨基酸50-56的氨基酸序列的TtMiniIIIwt，或包含与其具有至少80％、优选85％、更优选90％、最优选95％同一性的氨基酸序列，和/或
- 可移植的α5b-α6环源自
具有包括SEQ ID NO: 1的85-98位氨基酸的氨基酸序列的BsMiniIIIwt、或具有包括SEQID NO: 2的氨基酸73-86的氨基酸序列的CkMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 4的氨基酸79-88的氨基酸序列的CtMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 6的93-106位氨基酸的氨基酸序列的CtMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 8的82-95位氨基酸的氨基酸序列的FpMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 10的氨基酸82-95的氨基酸序列的FnMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 12的82-95位氨基酸的氨基酸序列的SeMiniIIIwt、或具有包括SEQ IDNO: 14的氨基酸82-93的氨基酸序列的TmMiniIIIwt、或具有包括SEQ ID NO: 16的氨基酸87-100的氨基酸序列的TtMiniIIIwt，或包含与其具有至少80％、优选85％、更优选90％、最优选95％同一性的氨基酸序列。
15. 根据权利要求13至14所述的获得嵌合Mini-III RNA酶的方法，其特征在于编码Mini-III RNA酶的基因中的可移植的α4螺旋和可移植的α5b-α6环源自不同的微生物。
16. 根据权利要求13至15所述的获得嵌合Mini-III RNA酶的方法，其特征在于编码Mini-III RNA酶的基因包含编码选自SEQ ID NO: 18、20、22、24、26、28的氨基酸序列的任一序列。
17. 根据权利要求13至16所述的获得嵌合Mini-III RNA酶的方法，其特征在于所述方法进一步包括以下步骤：
c)培养表达来自步骤b)的基因的细胞，和
d)分离和纯化来自步骤c)的表达的蛋白，和任选步骤
e)确定在步骤d)中获得的蛋白的序列特异性。
18. 一种用根据权利要求13至17的方法获得的Mini-III RNA酶。
19. 一种编码权利要求1至12、18的Mini-III RNA酶的构建体。
20. 一种细胞，其含有编码权利要求1至12、18的Mini-III RNA酶的基因或权利要求19的构建体。
21. 根据权利要求1至12及18的Mini-III RNA酶切割dsRNA的用途，其方式仅依赖于核糖核苷酸序列，并且不依赖于底物结构中二级结构的出现，并且不依赖于其它辅助蛋白的存在。
22. 一种切割dsRNA的方法，其方式仅依赖于核糖核苷酸序列，并且不依赖于底物结构中二级结构的出现，并且不依赖于其它辅助蛋白的存在，其特征在于，该方法包括dsRNA底物与根据权利要求1至12或权利要求18的Mini-III RNA酶之间的相互作用。
23.根据权利要求22的切割dsRNA的方法，其特征在于所述Mini-III RNA酶包含SEQ IDNO: 2所示的来自Caldicellulosiruptor kristjanssonii的序列，其中所述Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中N= A, C, G, U; W = A, U; S = C, G; Y = C, U。
24.根据权利要求22的切割dsRNA的方法，其特征在于所述Mini-III RNA酶包含SEQ IDNO: 4所示的来自多枝梭菌的序列，其中所述Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中N= A, C, G, U; W = A, U; S = C, G。
25.根据权利要求22的切割dsRNA的方法，其特征在于所述Mini-III RNA酶包含SEQ IDNO: 6所示的来自热纤维梭菌的序列，其中所述Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中W = A, U; S = C, G。
26.根据权利要求22的切割dsRNA的方法，其特征在于所述Mini-III RNA酶包含SEQ IDNO: 8所示的来自Faecalibacterium prausnitzii的序列，其中所述Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中W = A, U; S = C, G。
27.根据权利要求22的切割dsRNA的方法，其特征在于所述Mini-III RNA酶包含SEQ IDNO: 10所示的来自具核梭杆菌的序列，其中所述Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中W = A, U; S = C, G。
28.根据权利要求22的切割dsRNA的方法，其特征在于所述Mini-III RNA酶包含SEQ IDNO: 12所示的来自表皮葡萄球菌的序列，其中所述Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中N= A, C, G, U; W = A, U; S = C, G。
29.根据权利要求22的切割dsRNA的方法，其特征在于所述Mini-III RNA酶包含SEQ IDNO: 14所示的来自海栖热袍菌的序列，其中所述Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中N= A, C, G, U; W = A, U; S = C, G。
30.根据权利要求22的切割dsRNA的方法，其特征在于所述Mini-III RNA酶包含SEQ IDNO: 16所示的来自腾冲热厌氧杆菌(Caldanaerobacter subterraneus subsp. Tengcongensis)的序列，其中所述Mini-III RNA酶在dsRNA切割中显示出序列特异性，并在以下共有序列内切割dsRNA
其中N= A, C, G, U; W = A, U; S = C, G; Y = C, U。
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