JP2003144143A - 改善された標識ヌクレオチド取込み特性を有するｄｎａポリメラーゼ - Google Patents
改善された標識ヌクレオチド取込み特性を有するｄｎａポリメラーゼInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明は、ポリヌクレオチドへの標識ヌクレオ
チドに対して低減した差別を示す、変異体DNAポリメラ
ーゼを提供すること。 【解決手段】ヌクレオチド標識相互作用領域は、TaqDNA
ポリメラーゼの（ｉ）O-ヘリックス、(ii)K-ヘリック
ス、および(iii)O-Pヘリックス間ループの部分、または
他のDNAポリメラーゼにおける類似の位置に変異を有す
る新規の変異体DNAポリメラーゼ。このDNAポリメラーゼ
は、フルオレセイン型色素標識ヌクレオチドに対する差
別が低減している。
チドに対して低減した差別を示す、変異体DNAポリメラ
ーゼを提供すること。 【解決手段】ヌクレオチド標識相互作用領域は、TaqDNA
ポリメラーゼの（ｉ）O-ヘリックス、(ii)K-ヘリック
ス、および(iii)O-Pヘリックス間ループの部分、または
他のDNAポリメラーゼにおける類似の位置に変異を有す
る新規の変異体DNAポリメラーゼ。このDNAポリメラーゼ
は、フルオレセイン型色素標識ヌクレオチドに対する差
別が低減している。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】発明の分野
本発明は、標識ヌクレオチドをポリヌクレオチド分子へ
取り込む酵素の能力を変える変異を有するDNAポリメラ
ーゼに関する。 【０００２】 【従来の技術】背景 DNAポリメラーゼは、鋳型DNA鎖および鋳型の一部とアニ
ールされる相補合成プライマーを用いて、デオキシヌク
レオチド３リン酸からのDNA分子の形成を合成する酵素
である。DNAポリメラーゼおよびそれらの酵素学的特徴
の詳細な説明は、Kornberg,DNAReplication 第２版,W.
H.Freeman(1989)に見出され得る。 【０００３】DNAポリメラーゼは、研究および臨床応用
の両方に適切な分子生物学技術において種々の用途を有
する。これらの技術のうち、DNA配列決定および核酸増
幅技術（例えば、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)）が最も
重要である。 【０００４】多くのDNAポリメラーゼのアミノ酸配列が
決定されている。異なるDNAポリメラーゼ間の配列比較
により、異なる酵素間での多くの相同性領域が同定され
た。Ｘ線回析研究により、クレノウフラグメント、T7DN
Aポリメラーゼ、およびTaq DNAポリメラーゼの３次構造
が決定された。DNAポリメラーゼ３次構造およびアミノ
酸配列比較の研究により、多様なDNAポリメラーゼ間の
非常に多くの構造類似性が明らかになった。一般的に、
DNAポリメラーゼは、２重鎖DNAの結合を提供すると考え
られる大きな裂け目(cleft)を有する。この裂け目は、
２組のヘリックスにより形成され、第１の組は「指(fin
ger)」領域と呼ばれ、そしてヘリックスの第２の組は
「親指(thumb)」領域と呼ばれる。裂け目の底は逆平行
βシートにより形成され、そして「手のひら(palm)」領
域と呼ばれる。DNAポリメラーゼ構造の概説は、Joyceお
よびSteitz,Ann.Rev.Biochem.63:777-822(1994)におい
て見出され得る。いくつかのDNAポリメラーゼの３次元
構造を記載するコンピューターが判読可能なデータファ
イルは、公に普及している。 【０００５】蛍光標識ヌクレオチドは、分子生物学にお
ける多くの手順の有用性を非常に単純にし、そして改善
した。合成手順においてポリヌクレオチドを標識するた
めの蛍光標識ヌクレオチドの使用は、大部分は、放射性
標識の使用に取って代わった。蛍光標識ヌクレオチド
は、DNA配列決定において（Smithら、Nature321:674-67
9(1986)を参照のこと）、PCRおよび他の形態のポリヌク
レオチドフラグメント分析において広く使用されてい
る。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】蛍光標識ヌクレオチド
を使用することに伴う主な問題は、蛍光標識ヌクレオチ
ドの取込みを差別するDNAポリメラーゼの能力である。
例えば、本発明者らは、TET(6-カルボキシ-4,7,2’,7’
-テトラクロロフルオレセイン)標識2’,3’ジデオキシ
ヌクレオチドと対応する非標識ジデオキシヌクレオチド
との間の競合アッセイにおいて、Taq DNAポリメラーゼ
が、非標識ジデオキシヌクレオチドを、対応する標識ヌ
クレオチドよりも少なくとも85倍頻繁に、DNAに取り込
むことを発見した。標識ヌクレオチドと非標識ヌクレオ
チドとの間のこの差別は、DNAを標識するためにDNAポリ
メラーゼを使用する手順に絶大な影響を有する。例え
ば、非常に多量の蛍光標識ヌクレオチドが配列決定反応
において使用されなければならない。この多量の蛍光標
識ヌクレオチドは高価であり、そして過度のバックグラ
ウンド蛍光を生じ、それにより配列情報の収率が低減さ
れ得る。 【０００７】蛍光標識ヌクレオチドの取込みを差別する
DNAポリメラーゼの能力から生じる問題を考慮して、本
発明者らは、１つ以上の蛍光標識ヌクレオチドのDNAへ
の取込みに対する差別が低減した、いくつかの新規のDN
Aポリメラーゼを開発した。 【０００８】 【課題を解決する手段】要旨 天然に生じるDNAポリメラーゼは、非標識ヌクレオチド
を、対応する蛍光標識ヌクレオチドよりも優先的にポリ
ヌクレオチドに取り込む。蛍光標識ヌクレオチドを差別
するDNAポリメラーゼのこの能力は、蛍光標識ヌクレオ
チドの酵素的付加を必要とする多くの分子生物学手順
（例えば、標識ジデオキシターミネーター配列決定）に
望ましくない影響を有する。本発明は、ポリヌクレオチ
ドへの蛍光標識ヌクレオチドに対する低減した差別を示
す変異体DNAポリメラーゼに関する。 【０００９】本発明のDNAポリメラーゼは、変異が蛍光
標識ヌクレオチドに対する低減した差別をもたらすよう
に、酵素のヌクレオチド標識相互作用領域において少な
くとも１つの変異を有する。DNAポリメラーゼのヌクレ
オチド標識相互作用領域は、TaqDNAポリメラーゼのO-ヘ
リックス、(ii)Kヘリックス、および(iii)O-Pヘリック
ス間ループの一部、または他のDNAポリメラーゼにおけ
る類似の部分により形成される。TET(II)・ddCにより定
義されるような、ヌクレオチド標識相互作用領域内のア
ミノ酸残基は、E520、A521、L522、R523、E524、A525、
H526、P527、I528、V529、E530、K521、I532、R536、E5
37、R573、Q582、N583、V586、R587、P589、Q592、R59
3、R595、D610、T612、Q613、E615、R636、D637、T64
0、F647、V654、D655、P656、L657、R659、R660、T66
4、E681、L682、A683、I684、P685、E688、F692、Q75
4、H784、L817、E820、L828、K831、およびE832であ
る。R660、T664、およびE681の部位は、変異を導入する
のに好ましい部位である。フルオレセイン型色素を用い
た使用のための本発明の好ましい実施態様において、変
異は681位に存在し、E（グルタミン酸）をM（メチオニ
ン）に変換する（すなわち、E681M）。フルオレセイン
−フルオレセインエネルギー移動色素を用いた使用のた
めの本発明の好ましい実施態様において、変異は657位
に存在し、L（ロイシン）をG（グリシン）に変換する。
標識ヌクレオチドに対する差別が低減した変異体TaqDNA
ポリメラーゼを提供することに加えて、本発明は、広範
な種々のDNAポリメラーゼ（耐熱性およびその他の両
方）に由来する変異体を含む。 【００１０】新規の変異体DNAポリメラーゼを提供する
ことに加えて、本発明はまた、本発明の変異体DNAポリ
メラーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。提
供されるポリヌクレオチドは、変異体ポリメラーゼの組
換え生成のための発現ベクターを含み得る。本発明はま
た、本発明のポリメラーゼポリヌクレオチドを含む宿主
細胞を含む。 【００１１】本発明はまた、本発明のDNAポリメラーゼ
を使用する非常に多くの方法を含む。本発明の方法は、
標識ヌクレオチドのポリヌクレオチドへの取込みに対す
る差別が低減した変異体DNAポリメラーゼにより触媒さ
れるポリヌクレオチド合成反応により、蛍光標識ポリヌ
クレオチドを合成する工程を含む。ポリヌクレオチド合
成の本発明の方法は、プライムされるポリヌクレオチド
鋳型を少なくとも１つの蛍光標識ヌクレオチドを用いて
伸長する工程を含み、ここで伸長は、ポリヌクレオチド
への標識ヌクレオチドに対する差別が低減したDNAポリ
メラーゼにより触媒される。蛍光標識ポリヌクレオチド
を合成する本発明の方法は、種々の方法（例えば、サン
ガー配列決定およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)）にお
いて使用され得る。 【００１２】本発明の別の局面は、本発明の方法に従っ
て蛍光標識ポリヌクレオチドを合成するためのキットを
提供することである。本発明のキットは、本発明の変異
体DNAポリメラーゼ、およびキット中の変異体DNAポリメ
ラーゼに関して低減した差別を示す蛍光標識ヌクレオチ
ドを含む。 【００１３】本発明はさらに、以下を提供する。 １．ヌクレオチド標識相互作用領域において少なくとも
１つの変異を有するDNAポリメラーゼであって、ここで
該DNAポリメラーゼは、フルオレセイン型色素標識ヌク
レオチドに対する差別が低減した、DNAポリメラーゼ。 ２．前記変異が、(ｉ)O-ヘリックス、(ii)Kヘリック
ス、および(iii)O-Pヘリックス間ループからなる群より
選択されるヌクレオチド標識相互作用領域の部分にあ
る、項目１に記載のDNAポリメラーゼ。 ３．前記変異が、E520、A521、L522、R523、E524、A52
5、H526、P527、I528、V529、E530、K531、I532、R53
6、E537、R573、Q582、N583、V586、R587、P589、Q59
2、R593、R595、D610、T612、Q613、E615、R636、D63
7、T640、F647、V654、D655、P656、L657、R659、R66
0、T664、E681、L682、A683、I684、P685、E688、F69
2、Q754、H784、L817、E820、L828、K831、およびE832
からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する酵素
のセグメントである、項目２に記載のDNAポリメラー
ゼ。 ４．前記変異が、R595、D655、R660、T664、およびE681
からなる群より選択される位置にある、項目３に記載の
DNAポリメラーゼ。 ５．前記DNAポリメラーゼが、TaqDNAポリメラーゼであ
る、項目４に記載のDNAポリメラーゼ。 ６．前記変異が、R660D、D655L、E618G、およびR595Eか
らなる群より選択される、項目５に記載のDNAポリメラ
ーゼ。 ７．(G46D,R660D,F667Y)、(G46D,R595D,R660D,F667Y)、
および(G46D,R660D,F667Y,E681G)、および(G46D,F667Y,
E681G)からなる群に属する変異の組を含む、項目６に記
載のDNAポリメラーゼ。 ８．前記DNAポリメラーゼが耐熱性DNAポリメラーゼであ
る、項目２に記載のDNAポリメラーゼ。 ９．項目１に記載のDNAポリメラーゼをコードするポリ
ヌクレオチド。 １０．プロモーターを有する発現ベクターであって、こ
こで該ベクターが、該プロモーターと機能的に組み合せ
た項目９に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。 １１．項目１０に記載の発現ベクターを含む、宿主細
胞。 １２．蛍光標識ポリヌクレオチドを合成する方法であっ
て、該方法が、項目１に記載のDNAポリメラーゼとプラ
イムされる鋳型とを混合する工程を包含する、方法。 １３．前記プライムされる鋳型が、鎖終結配列決定反応
においてプライムされる鋳型である、項目１２に記載の
方法。 １４．前記プライムされる鋳型が、ポリメラーゼ連鎖反
応におけるプライムされる鋳型である、項目１２に記載
の方法。 １５．ポリヌクレオチドを蛍光標識するためのキットで
あって、該キットが、項目１に記載のDNAポリメラーゼ
および蛍光標識ヌクレオチドを含む、キット。 【００１４】 【発明の実施の形態】本発明の特定の実施態様の詳細な
説明 用語 DNAポリメラーゼ内のアミノ酸残基の位置は、数字また
は数字／文字の組み合わせのいずれかにより示される。
番号付けは、アミノ末端残基から始まる。文字は、変異
体が由来する天然に生じる酵素における示された位置で
のアミノ酸残基についての一文字アミノ酸コードであ
る。特に他に示されなければ、アミノ酸残基の位置の名
称は、一文字アミノ酸コードが、TaqDNAポリメラーゼに
おける示された位置でのアミノ酸残基に具体的に関係し
ているとはいえ、全てのDNAポリメラーゼにおける類似
の位置を言うと解釈されるべきである。 【００１５】個々の置換変異は、文字／数字／文字の組
み合わせの形態により示される。文字は、アミノ酸残基
の一文字コードである。数字は、変異部位のアミノ酸残
基の位置を示す。数字付け系は、アミノ末端残基から始
まる。TaqDNAポリメラーゼにおける残基の数字付けは、
米国特許第5,079,352号(Gelfand)に記載される通りであ
る。異なるDNAポリメラーゼ間のアミノ酸配列相同性
は、対応する位置が、Taq以外のDNAポリメラーゼのアミ
ノ酸残基に割り当てられることを可能にする。他に示さ
れなければ、所定の数字は、TaqDNAポリメラーゼにおけ
る位置をいう。最初の数字（すなわち、数字の左側の文
字）は、非変異体酵素における示された位置でのアミノ
酸残基を示す。第２の文字は、変異体酵素における同じ
位置でのアミノ酸残基を示す。例えば、用語「R660D」
は、660位でのアルギニンがアスパラギン酸残基により
置換されたことを示す。 【００１６】本明細書中で使用する用語「差別」は、非
標識ヌクレオチドを、対応する蛍光標識ヌクレオチドよ
りも優先的にDNAに取り込む、DNAポリメラーゼの特性
（すなわち、DNAポリメラーゼが蛍光標識ヌクレオチド
を差別すること）をいう。優先的な取り込みは、蛍光標
識2’,3’ジデオキシヌクレオチドおよび対応する非標
識2’,3’ジデオキシヌクレオチドがポリヌクレオチド
の同じ部位への取り込みについて競合するアッセイにお
いて測定され得る。このようなアッセイの例は、以下の
実施例２において見出され得る。 【００１７】本明細書中で使用する用語「低減した差
別」は、親酵素と比較した場合の、変異体DNAポリメラ
ーゼにおける蛍光標識ヌクレオチド取り込みに対する差
別の低減をいう。差別の低減は、実施例２における選択
性アッセイへの参照により、またはポリメラーゼの同じ
特性の測定を提供する他のアッセイへの参照により定量
的に説明され得る。選択性アッセイにより測定されるよ
うな選択性数の低減は差別の低減であり、そして選択性
数の比により表され得る。例えば、選択性数８を有する
変異体DNAポリメラーゼは、選択性数80を有する親DNAポ
リメラーゼと比較した場合、差別の10倍の低減を有す
る。 【００１８】用語「親」または「親酵素」は、変異体DN
Aポリメラーゼと変異体酵素が由来するDNAポリメラーゼ
とを区別するために使用される。従って、任意の天然に
生じるDNAポリメラーゼが親酵素と呼ばれ得る。天然に
生じる酵素に関して変異を有する第１のDNAポリメラー
ゼもまた、さらなる変異を有する第２のDNAポリメラー
ゼに関して親酵素と呼ばれる。 【００１９】用語「差別を低減する変異」は、蛍光標識
ヌクレオチド取り込みに対して低減した差別をもたら
す、DNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域
における変異をいう。この用語は、蛍光標識ヌクレオチ
ドに対する差別を低減しない、DNAポリメラーゼにおけ
る変異（ヌクレオチド標識相互作用領域における変異を
含む）と差別を低減させる変異とを区別するために使用
される。 【００２０】本明細書中で使用する用語「ヌクレオチ
ド」は、特に他に言及しない限り、天然に生じるヌクレ
オチドおよび種々のアナログ（2’,3’ジデオキシヌク
レオチドを含む）の両方を広く言うために使用される。 【００２１】用語「フルオレセイン型色素」は、以下の
縮合３環系： 【００２２】 【化１】 【００２３】を含むキサンテン色素分子のクラスを言
い、ここで広範な種々の置換が各デオキシ環位置で可能
である。特に好ましいフルオレセイン型色素のサブセッ
トは、4,7-ジクロロフルオレセイン(Menchen)を含む。D
NA配列決定法における蛍光標識として使用されるフルオ
レセイン型色素の例は、6-カルボキシフルオレセイン(6
-FAM)、5-カルボキシフルオレセイン(5-FAM)、6-カルボ
キシ-4,7,2’,7’-テトラクロロフルオレセイン(TET)、
6-カルボキシ-4,7,2’,4’,5’,7’-ヘキサクロロフル
オレセイン(HEX)、5-(および6)カルボキシ-4’,5’-ジ
クロロ-2’,7’-ジメトキシフルオレセイン(JOE)、なら
びに5-カルボキシ-2’,4’,5’,7’-テトラクロロフル
オレセイン(ZOE)を含む。しばしば、名称-1または-2
は、特定の色素の略語の後に置かれる（例えば、HEX-
1）。「-1」および「-2」（または「I」および「II」）
の名称は、特定の色素の異性体が使用されることを示
す。１異性体および２異性体は、C-8カラムおよび15％
アセトニトリル／85％0.1M酢酸トリエチルアンモニウム
から35％アセトニトリル／65％ 0.1M酢酸トリエチルア
ンモニウムへの溶出勾配を利用する逆相クロマトグラフ
ィー分離系における遊離色素の溶出順序（１異性体は、
最初に溶出する異性体である）により定義される。 【００２４】用語「アルキニルアミノ型リンカー」は、
米国特許第5,047,519号（Hobbs）、米国特許第5,151,50
7号(Hobbs)、および1996年８月13日に出願された米国特
許出願第08/696,808号に記載されるような型のアルキニ
ルアミノリンカーを言う。さらなるアルキニルアミノ型
リンカーは、1997年４月10日に出願された、米国特許出
願第08/833,855号において記載される。 【００２５】用語「TET(II)・ddCTP」は、図４に示され
る構造の蛍光標識ヌクレオチドを言う。 【００２６】用語「蛍光エネルギー移動色素」は、２つ
の色素部分間の蛍光エネルギー移動を可能にするリンカ
ーにより結合された色素部分を言う。鎖終結配列決定に
おける使用のために、リンカーは十分小さく、そしてDN
Aポリメラーゼが目的の色素で標識されたヌクレオチド
３リン酸を取込むのを可能にするのに適切な形状および
方向のリンカーである。エネルギー移動色素の例は、欧
州特許出願番号EP0 805 140、米国特許出願第08/642,33
0号（1996年３月３日に出願）、および米国特許出願第0
8/726,462号（1996年10月４日に出願）において見出さ
れ得る。 【００２７】本明細書中で使用する用語「変異」は、タ
ンパク質の特定の位置でのアミノ酸残基における変化を
言う。アミノ酸残基における変化は、天然に生じるタン
パク質に関して定義される変化である。変異を有するタ
ンパク質は、「変異体」タンパク質と呼ばれ得る。 発明の実施態様 本発明は、蛍光標識ヌクレオチドのポリヌクレオチドへ
の取り込みを差別するポリメラーゼの能力を低減する変
異を含むDNAポリメラーゼに関する。これらの変異は、
本明細書中で「ヌクレオチド標識相互作用領域」と呼ば
れる、DNAポリメラーゼ分子の領域にある。ヌクレオチ
ド標識相互作用領域は、DNAポリメラーゼの３つの領域
の部分により形成される。これらの３つの領域は、TaqD
NAポリメラーゼの(ｉ)O-ヘリックス、(ii)Kヘリック
ス、および(iii)O-Pヘリックス間ループ、または他のDN
Aポリメラーゼにおける類似の位置に位置する。蛍光標
識ヌクレオチドに対する差別を低減したDNAポリメラー
ゼは、2’,3’ジデオキシヌクレオチドを用いる鎖終結D
NA配列決定（すなわち、サンガー型配列決定）に特に有
用である。 【００２８】Taq DNAポリメラーゼおよび蛍光標識ジデ
オキシヌクレオチドを用いて行われた酵素反応速度実験
（実施例２および３に記載される）は、TaqDNAポリメラ
ーゼおよび他のDNAポリメラーゼが、DNA合成間のヌクレ
オチド結合の際に立体配座シフトを受けるという理論を
支持する。この予測された立体配座シフトは、ヌクレオ
チドの核酸塩基にリンカーにより結合された蛍光標識と
相互作用し、それにより蛍光標識されたヌクレオチドに
対する差別をもたらす、１組のアミノ酸残基を示唆す
る。この組のアミノ酸残基は、ヌクレオチド標識相互作
用領域を形成する。出願人により提案された蛍光標識ヌ
クレオチドのDNAポリメラーゼへの結合についての特定
の分子モデルは、所定のDNAポリメラーゼのヌクレオチ
ド標識相互作用領域を形成するアミノ酸残基を予測する
ために使用される。DNA合成間のDNAポリメラーゼにおけ
る立体配座シフトについての出願人のモデルは、ヌクレ
オチド標識相互作用領域がどのように決定されたかにつ
いての説明として提供される。このモデルは、蛍光標識
ヌクレオチドのポリヌクレオチドへの取り込みを差別す
るDNAポリメラーゼの能力を低減する、DNAポリメラーゼ
における変異を作製することに指針を提供する。図１
は、どのようにDNAおよびTaqDNAポリメラーゼがこのモ
デルにおいて相互作用するかを示すコンピューターモデ
ルである。DNAポリメラーゼ-ヌクレオチド相互作用の真
の機構は、ヌクレオチド標識相互作用領域のパラメータ
ーを決定するために使用されたモデルと同じでも異なっ
ても、本明細書中に記載の発明の実施可能性を限定しな
い。 【００２９】本発明の変異体DNAポリメラーゼは、フル
オレセイン型色素で標識されたヌクレオチドに対して低
減した差別を示す。言い換えれば、本発明の変異体DNA
ポリメラーゼは、対応する非標識ヌクレオチドと比較し
て、フルオレセイン型色素標識ヌクレオチドを取り込む
ポリメラーゼの能力を増大させる少なくとも１つの変異
を含む。フルオレセイン型色素で標識されたヌクレオチ
ドに対する低減した差別に加えて、本発明の変異体DNA
ポリメラーゼはまた、フルオレセイン型色素でない他の
蛍光色素で標識されたヌクレオチドに対する低減した差
別、ならびに他の検出可能な部分に対する低減した差別
を示し得る。本発明の変異体DNAポリメラーゼの所定の
実施態様が低減した差別を示す蛍光標識ヌクレオチド
は、特定の蛍光標識、蛍光標識をヌクレオチドに付着さ
せるために使用されるリンカー、蛍光標識上のリンカー
の付着部分、選択される特定のヌクレオチド塩基、およ
びヌクレオチド上のリンカーの付着部位に関して変化し
得る。蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の低減の正確
な程度は、DNAポリメラーゼに導入される特定の変異に
従って変化する。差別の低減の正確な程度はまた、アッ
セイされる特定の蛍光標識ヌクレオチド（例えば、塩
基、色素、またはリンカーにおける変化）に従って変化
する。本発明の変異体DNAポリメラーゼは、だいたい、
蛍光標識ヌクレオチドに対する差別のわずかな低減か
ら、差別の完全な排除（すなわち、変異体酵素は、標識
または非標識ヌクレオチドの取り込み率に関して有意に
違わない）までを示し得る。１つ以上のフルオレセイン
型色素標識ヌクレオチドに対する差別の少なくとも２倍
の低減を有する、本発明の変異体DNAポリメラーゼの実
施態様を使用することが好ましい。 【００３０】所定のDNAポリメラーゼのヌクレオチド標
識相互作用領域は、特定の蛍光標識ヌクレオチドに関し
て定義されることが、分子生物学の当業者により認識さ
れる。蛍光標識ヌクレオチドの構造についての以下のパ
ラメーターの１つ以上における変化は、所定のDNAポリ
メラーゼのヌクレオチド標識相互作用部位を形成するア
ミノ酸残基の同一性を変え得る：（１）塩基の同一性、
（２）ヌクレオチド塩基上の付着部位、（３）塩基を蛍
光色素に結合するリンカーの同一性、および（４）蛍光
色素の同一性。TET(II)・ddCTPに関して定義されるTaqの
ヌクレオチド標識相互作用領域は、アミノ酸残基E520、
A521、L522、R523、E524、A525、H526、P527、I528、V5
29、E530、K531、I532、R536、E537、R573、Q582、N58
3、V586、R587、P589、Q592、R593、R595、D610、T61
2、Q613、E615、R636、D637、T640、F647、V654、D65
5、P656、L657、R659、R660、T664、E681、L682、A68
3、I684、P685、E688、F692、Q754、H784、L817、E82
0、L828、K831、およびE832を含む。R660、T664、およ
びE681の部位は、変異を導入するのに好ましい部位であ
る。TaqDNAポリメラーゼ（および他のDNAポリメラー
ゼ）の３次元構造が周知であり、そしてTET(II)・ddCTP
の３次元構造が高度の確信をもって理解されるのであれ
ば、TET(II)・ddCTPに関する標識ヌクレオチド相互作用
領域を構成するアミノ酸残基の位置は、TET(II)・ddCTP
と他の蛍光標識ヌクレオチドとの間の構造差違を適応さ
せて、他のヌクレオチドに関する標識ヌクレオチド相互
作用部位を定義するように、異なる組のアミノ酸残基に
書き換えられ得る。例えば、塩基、塩基付着部位、およ
び蛍光色素が同じであっても、塩基と蛍光標識と塩基と
の間のリンカーの長さの増加は、標識ヌクレオチド相互
作用部位を形成するアミノ酸残基の同一性を予測可能に
変え得る。本発明のポリメラーゼの多くの実施態様にお
いて、所定の蛍光標識ヌクレオチドに関する標識ヌクレ
オチド相互作用部位を形成するアミノ酸残基の組は、第
２の蛍光標識ヌクレオチドに関して定義されるような標
識ヌクレオチド相互作用部位を形成するアミノ酸残基の
組と重複する。 【００３１】本発明の実施態様は、フルオレセイン型色
素で標識されたヌクレオチドに対して低減した差別を示
す変異体DNAポリメラーゼを含み、ここでフルオレセイ
ン型色素は、アルキニルアミノ型リンカーによりヌクレ
オチド塩基に結合される。フルオレセイン型色素は、エ
ネルギー移動色素の成分としてフルオレセイン型色素部
分を含む、蛍光エネルギー移動色素であり得る。アルキ
ニルアミノ型リンカーを含む蛍光標識ヌクレオチドに対
する低減した差別に加えて、本発明の変異体DNAポリメ
ラーゼはまた、他の型のリンカーを含むヌクレオチドに
対して低減した差別を示し得る。ポリヌクレオチドと蛍
光標識との間の立体障害を最小にするために、プリン
は、通常、７位に標識され、そしてピリミジンは、通
常、５位に標識される。 【００３２】本発明の変異体DNAポリメラーゼは、所定
のDNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域内
のアミノ酸残基位置で差別を低減する１つ以上の変異を
有する。差別を低減する変異は、通常（必ずしもそうで
はないが）置換変異である。いくつかの異なるアミノ酸
残基は、差別を低減する変異を生じるように、親酵素の
所定の位置で置換され得る。ヌクレオチド標識相互作用
領域内の所定の残基位置でのアミノ酸残基は系統的に変
えられて、その結果、どのアミノ酸置換が、目的のフル
オレセイン型色素標識ヌクレオチド色素に対する差別の
低減をもたらすのかを、およびこのような差別の低減の
程度を決定し得る。特定の変異（または変異の組）が差
別を低減する程度は、実施例２に記載のような選択性ア
ッセイにより測定され得る。置換変異は、好ましくは
（必ずしもそうではないが）、親DNAポリメラーゼに存
在するアミノ酸残基のアミノ酸残基側鎖の大きさを低減
する変異である。変異は、好ましくは（必ずしもそうで
はないが）、親分子の類似の位置でのアミノ酸残基の特
定の極性または非極性特徴を維持するように保存的であ
る。DNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域
における変異は、好ましくは、親酵素のアミノ酸残基の
ファージT7DNAポリメラーゼの対応する位置でのアミノ
酸残基での置換をもたらす（ただし、T7ポリメラーゼお
よび親酵素におけるその位置でのアミノ酸残基間の差違
は存在する）。 【００３３】差別を低減する変異は、DNAポリメラーゼ
のヌクレオチド標識相互作用領域にある。ヌクレオチド
標識相互作用領域は、DNAポリメラーゼの３つの領域の
部分により形成される。これらの３つの領域は、TaqDNA
ポリメラーゼの(ｉ)O-ヘリックス、(ii)Kヘリックス、
および(iii)O-Pヘリックス間ループ、または他のDNAポ
リメラーゼにおける類似の位置に位置する。ヌクレオチ
ド標識相互作用領域を形成するTaqDNAポリメラーゼにお
ける位置は、位置E520、A521、L522、R523、E524、A52
5、H526、P527、I528、V529、E530、K531、I532、R53
6、E537、R573、Q582、N583、V586、R587、P589、Q59
2、R593、R595、D610、T612、Q613、E615、R636、D63
7、T640、F647、V654、D655、P656、L657、R659、R66
0、T664、E681、L682、A683、I684、P685、E688、F69
2、Q754、H784、L817、E820、L828、K831、およびE832
である。Taq以外のDNAポリメラーゼにおける類似の位置
もまた、ヌクレオチド標識相互作用領域に由来する。置
換変異に好ましい位置は、R595、D655、R660、およびE6
81である。変異に特に好ましい位置はE681であり、681
位での好ましい置換はＭである。E681での他の適切な置
換変異は以下の通りである（おおよそ同等であることを
示す＝により示す場合を除いて、優先度が減る順番に列
挙される）：Ｍ＞Ｉ＞Ｗ＞Ｌ＞Ｖ＞Ｐ＞Ｈ＝Ｋ＝Ｇ＝Ｔ
＝Ｓ＞Ｄ＝Ａ＝Ｎ＞Ｙ＝Ｃ。R660位での好ましい置換変
異はR660Dである。 【００３４】ヌクレオチド相互作用領域を形成する特定
のアミノ酸残基は、差別を低減する変異の導入のために
親酵素として選択される特定のDNAポリメラーゼに従っ
て変化する。異なるDNAポリメラーゼ間の類似のアミノ
酸残基位置の決定は、多数のDNAポリメラーゼのアミノ
酸配列が決定されており、そして多くの相同性領域が、
これらの異なるDNAポリメラーゼ間で見出されているの
で、当業者により容易に達成され得る。例えば、広範な
生物に由来するDNAポリメラーゼのアミノ酸配列の大規
模な編集、およびこの配列間の相同性整列は、Braithwa
iteおよびIto,Nucl.AcidsRes.21(4):787-802(1993)にお
いて見出され得る。ファージT7ポリメラーゼおよびE.co
li DNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域内
のアミノ酸残基の例は、表１に提供される。Taq、T7、
およびE.coliDNAポリメラーゼIにおいて、フルオレセイ
ン型色素に対する差別が低減した変異体DNAポリメラー
ゼを提供することに加えて、本発明は、多くの他の生物
に由来する変異体DNAポリメラーゼを提供する。一般的
に、本発明の教示は、Taqポリメラーゼにおける位置E52
0、A521、L522、R523、E524、A525、H526、P527、I52
8、V529、E530、K531、I532、E537、R573、V586、R58
7、P589、Q592、R593、R595、D610、T612、Q613、E61
5、R636、T640、F647、V654、D655、P656、L657、R65
9、R660、T664、E681、L682、A683、I684、P685、E68
8、F692、Q754、L817、E820、L828、K831、およびE832
と類似する、DNAポリメラーゼにおける１つ以上のアミ
ノ酸残基位置を当業者が同定するのを可能にするのに十
分な、TaqDNAポリメラーゼに対するアミノ酸配列相同性
を共有する任意のDNAポリメラーゼに由来する、フルオ
レセイン型色素に対する差別が低減した変異体DNAポリ
メラーゼを生成するために使用され得る。ヌクレオチド
標識相互作用領域において差別を低減する変異を含むよ
うに改変され得る親DNAポリメラーゼは、Thermusflavu
s、Pyrococcus furiosus、Thermotoga neapolitana、Th
ermococcus litoralis、Sulfolobussolfataricus、Ther
matoga maritima、E.coliファージT5、およびE.coliフ
ァージTのような生物に由来するDNAポリメラーゼを含む
が、それらに限定されない。DNAポリメラーゼは耐熱性
でもよく、または耐熱性でなくてもよい。本発明によ
り、当業者は、フルオレセイン型色素差別を低減する変
異を、広範な種々の生物に由来するDNAポリメラーゼ
（提供される本願の出願時に単離されていなかったDNA
ポリメラーゼを含む）に導入し得ることが認識される。
さらに、本発明の実施態様は、蛍光標識ヌクレオチドに
対する所望の低い程度の差別を有する、いくつかの精製
された天然に生じるDNAポリメラーゼを含む。このよう
な天然に生じるDNAポリメラーゼは、構造的および機能
的に、本明細書中に明白に記載された変異体DNAポリメ
ラーゼと類似する。 【００３５】所定のDNAポリメラーゼのヌクレオチド標
識相互作用領域を構成するアミノ酸残基は、ヌクレオチ
ド標識相互作用領域を定義するために使用される特定の
蛍光標識ヌクレオチドに従って変化する。同様に、差別
を低減する変異である変異は、標識ヌクレオチド相互作
用領域を定義するために使用される特定の蛍光標識ヌク
レオチドに従って変化し得る。さらに、標識ヌクレオチ
ド相互作用部位における変異により達成される差別低減
の程度は、目的の特定の標識ヌクレオチドにより変化し
得る。例えば、E681Mは、差別の47倍の低減および第２
の蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の有意に低い低減
をもたらす、TET(II)・ddCTPに関してTaqにおいて差別を
低減する好ましい変異である。反対に、E681T変異は、
第２の蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の高レベルの
低減、およびTET(II)・ddCTPに対する差別の単に低レベ
ルの低減をもたらし得る。 【００３６】本発明の変異体DNAポリメラーゼが、特定
の蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の有意な程度の低
減をもたらし、そして別の蛍光標識ヌクレオチドに対す
る差別の低減の程度においてほとんどまたは全く低減を
もたらさない、ヌクレオチド標識相互作用領域における
差別を低減する変異を有し得るのであれば（親DNAポリ
メラーゼによるその蛍光標識ヌクレオチドに対する有意
な差別があると仮定する）、所定の変異体DNAポリメラ
ーゼは、１つ以上の所定の蛍光標識ヌクレオチドに関し
て「受容性である」と言われ得る。特定の変異体DNAポ
リメラーゼは、目的の特定の酵素のヌクレオチド標識相
互作用部位における差別を低減する変異が、所定の蛍光
標識ヌクレオチドに対する差別の少なくとも５倍の低減
をもたらす場合、特定の蛍光標識ヌクレオチドに関して
「受容性である」と言われる。本発明の変異体DNAポリ
メラーゼは、１を超える蛍光標識ヌクレオチドに関して
受容性であり得る。反対に、特定の蛍光標識ヌクレオチ
ドは、本発明の所定の変異体DNAポリメラーゼに関して
「受容性であり」得る。 【００３７】ヌクレオチド標識相互作用領域において差
別を低減する１を超える変異を含む、本発明の変異体DN
Aポリメラーゼの実施態様において、変異部位は、ヌク
レオチド標識相互作用領域を形成するポリメラーゼの３
つの領域の同じ領域または異なる領域にあり得る。一般
的に、本発明の変異体DNAポリメラーゼは、差別を低減
する、１、２、または３つの変異を有する。しかし、本
発明はまた、差別を低減する３を超える変異を有する変
異体DNAポリメラーゼを提供する。差別を低減する複数
の変異を組み合せることにより、標識ヌクレオチド差別
のより大きな低減レベルが達成され得る。しかし、本発
明の多くの実施態様において、変異体DNAポリメラーゼ
は、ヌクレオチド標識相互作用領域において単一の差別
低減変異を有するDNAポリメラーゼのレベルと同じかま
たはより少ない、低減した標識ヌクレオチド差別のレベ
ルを有する。TaqDNAポリメラーゼ背景における好ましい
変異の組み合わせは、R660D、E681G、およびF667Yであ
る（すなわち、Taq DNAポリメラーゼ変異体(R660D、E68
1G、およびF667Y)）。 【００３８】ヌクレオチド標識相互作用領域において変
異を有するDNAポリメラーゼの異なる実施態様は、特定
の蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の低減の程度に関
して異なる。これらの差違は、どの特定の実施態様が目
的の特定の蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の最も大
きな程度の低減を有するかを決定するためのアッセイに
より測定され得る。一般的に、このようなアッセイは、
プライムされる鋳型上の同じ部位への取り込みについて
の、蛍光標識ヌクレオチドと非標識ヌクレオチドとの間
の競合を測定する。このようなアッセイの１つの例（本
明細書中で「選択性アッセイ」と呼ばれる）は、以下の
実施例２において詳細に記載される。 【００３９】本発明の変異体DNAポリメラーゼは、ヌク
レオチド標識相互作用領域における差別低減変異に加え
て非常に多くの変異を含み得る。これらの２次変異は、
ヌクレオチド標識相互作用領域の内部または外部のいず
れかであり得る。２次変異は、変異体DNAポリメラーゼ
に、ある有用な特性を有するかまたは与えるように選択
され得る。例えば、さらなる変異は、耐熱性を増大させ
る、耐熱性を減少させる、進行(processivity)を増加さ
せる、進行を減少させる、3’-5’エキソヌクレアーゼ
活性を減少させる、3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を
増加させる、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を減少さ
せる、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を増加させる、
そしてジデオキシヌクレオチド取り込みを増加させるた
めに導入され得る。あるいは、２次変異は、本質的に、
既知の効果に何の変化ももたらさないかもしれない。 【００４０】3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を低減す
る１つ以上の２次変異を含む、本発明の変異体DNAポリ
メラーゼの実施態様が特に興味深い。3’-5’エキソヌ
クレアーゼ活性が欠損しているDNAポリメラーゼは、PCR
および鎖終結ポリヌクレオチド配列決定に優れた特性を
有する。DNAポリメラーゼにおいて3’-5’エキソヌクレ
アーゼ活性を低減する変異は、当業者に周知である。
3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を低減する変異を導入
する方法についての詳細な指針は、特に、米国特許第4,
795,699号(Tabor)；米国特許第5,541,099号；米国特許
第5,489,523号；およびBernadら,Cell59:219-228(1989)
において見出され得る。Taq DNAポリメラーゼにおける
このような変異の例は、G46Dを含む。配列決定のために
使用される変異体DNAポリメラーゼの実施態様につい
て、ヌクレオチド標識相互作用領域における変異に加え
て、G46D（またはTaq以外のDNAポリメラーゼにおける類
似の変異）を含むことが好ましい。 【００４１】本発明のDNAポリメラーゼ変異体における
２次変異のうち、ジデオキシヌクレオチド取り込みを増
大させる（すなわち、デオキシヌクレオチドとは対照的
に、ジデオキシヌクレオチドを差別するDNAポリメラー
ゼの能力を低減する）変異もまた興味深い。このような
変異を作製することについての指針は、特に、公開され
たPCT出願WO96/12042（出願番号PCT/US95/12928）に見
出され得る。Taqにおける変異F667Yおよび他のDNAポリ
メラーゼにおける類似の変異が特に興味深い。F667Y
は、Tet(II)・ddLTPに関するTaqDNAポリメラーゼのヌク
レオチド標識相互作用領域の一部分ではないが、一方、
F667Y変異は、フルオレセイン型色素標識ヌクレオチド
に対する差別を低減し得る（表１を参照のこと）。従っ
て、特定の手順（例えば、DNA配列決定）における使用
のために、デオキシヌクレオチドと2’,3’ジデオキシ
ヌクレオチドとの間のポリメラーゼの差別を低減するよ
うに、F667Y変異と、ヌクレオチド標識相互作用領域に
おける差別を低減する１つ以上の変異とを組み合せるこ
とが望ましい。F667Y変異（またはその等価物）を有す
る本発明の変異体DNAポリメラーゼは、蛍光標識2’,3’
ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーターを用い
るサンガー型DNA配列決定に特に有用である。 【００４２】DNAポリメラーゼをコードする非常に多く
の遺伝子が単離および配列決定されている。この配列情
報は、公にアクセス可能なDNA配列データベース（例え
ば、GENBANK）において利用可能である。広範な生物か
らのDNAポリメラーゼのアミノ酸配列の大規模な編集
は、BraithwaiteおよびIto,Nucl.AcidsRes.21(4):787-8
02(1993)に見出され得る。この情報は、本発明のDNAポ
リメラーゼおよびこれらの酵素をコードするポリヌクレ
オチドの種々の実施態様を設計することにおいて使用さ
れ得る。公に利用可能な配列情報はまた、ハイブリダイ
ゼーションプローブを用いた遺伝子ライブラリースクリ
ーニングのような技術によりDNAポリメラーゼをコード
する遺伝子をクローニングするために使用され得る。 【００４３】本発明の他の実施態様は、本明細書中に提
供される変異体DNAポリメラーゼをコードするポリヌク
レオチド配列である。本発明の変異体DNAポリメラーゼ
をコードするポリヌクレオチド配列は、変異体DNAポリ
メラーゼの組換え生成のために使用され得る。蛍光標識
ヌクレオチドに対する差別が低減した変異体DNAポリメ
ラーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、種々の方
法により生成され得る。蛍光標識ヌクレオチドに対する
差別が低減した変異体DNAポリメラーゼをコードするポ
リヌクレオチド配列を生成する好ましい方法は、差別を
低減する所望の変異を、親DNAポリメラーゼ分子をコー
ドするポリヌクレオチドに導入するために部位特異的変
異誘発を使用することによる方法である。部位特異的変
異誘発技術は、米国特許第4,711,848号；米国特許第4,8
73,192号；米国特許第5,071,743号；米国特許第5,284,7
60号；米国特許第5,354,670号；米国特許第5,556,747
号；ZollerおよびSmith,NucleicAcids Res.10:6487-650
0(1982)、ならびにEdelmanらDNA 2:183(1983)により例
示されるように当該分野で周知である。部位特異的変異
誘発についての詳細なプロトコルはまた、多くの一般的
な分子生物学教科書（例えば、Sambrookら、MolecularC
loning a Laboratory Manual第２版,Cold Spring Harbo
r Press,Cold Spring Harbor(1989)、Ausubelら、Curre
ntProtocolsin Molecular Biology(最新版)）に与えら
れる。さらに、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）に関する
多くの教科書（例えば、DiefenbachおよびDveksler,PCR
Primer:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Pres
s,Cold Spring Harbor,NY(1995)）は、指定された変異
を導入するためにPCRを使用する方法を記載する。親DNA
ポリメラーゼをコードする遺伝子は、公に利用可能な配
列情報と共に従来のクローニング技術を使用して単離さ
れ得る。あるいは、DNAポリメラーゼをコードする、多
くのクローニングされたポリヌクレオチド配列は、公に
利用可能な収集サイト(site)に寄託されている（例え
ば、Americantype culture collection寄託物受託番号A
TCC 40336は、Taq DNAポリメラーゼのファージクローン
である）。 【００４４】親DNAポリメラーゼをコードするポリヌク
レオチドへの指定された変異を導入することにより、本
発明の変異体DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレ
オチドを生成することに加えて、主にインビトロDNA合
成技術により本発明のポリヌクレオチドを生成すること
が（難しいが）可能である。インビトロDNA合成技術は
当業者に周知であり、そしてインビトロDNA合成の例
は、米国特許第5,252,530号；米国特許第4,973,679号；
米国特許第5,153,319号；米国特許第4,668,777号；米国
特許第4,500,707号；米国特許第5,132,418号；米国特許
第4,415,732号；米国特許第4,458,066号；および米国特
許第4,811,218号に見出され得る。インビトロDNA合成に
より関連ポリヌクレオチド分子を生成する場合、通常、
より小さな分子が最初に生成され、その後に、ハイブリ
ダイゼーションおよび連結により共に結合される。変異
体DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドはま
た、クローニングされた遺伝子のインビトロ合成および
部位特異的変異誘発の組み合わせにより生成され得る。 【００４５】本発明の変異体DNAポリメラーゼをコード
するポリヌクレオチドは、変異体DNAポリメラーゼの組
換え発現のために使用され得る。一般的に、変異体DNA
ポリメラーゼの組換え発現は、変異体DNAポリメラーゼ
を、特定の型の宿主細胞における使用に適合させた発現
ベクターに導入することによりもたらされる。従って、
本発明の別の局面は、ポリメラーゼをコードするポリヌ
クレオチドが発現ベクターに機能的に挿入されるよう
な、本発明の変異体DNAポリメラーゼをコードするポリ
ヌクレオチドを含む発現ベクターを提供することであ
る。本発明はまた、本発明の発現ベクターを含む宿主細
胞を提供する。組換え発現のための宿主細胞は、原核生
物または真核生物であり得る。宿主細胞の例は、細菌細
胞、酵母細胞、培養された昆虫細胞株、および培養され
た哺乳動物細胞株を含む。好ましくは、組換え宿主細胞
系は、変異体DNAポリメラーゼが由来した生物に密接に
適合するように選択され得る。例えば、原核生物DNAポ
リメラーゼは、好ましくは、原核生物発現系において発
現される。広範な発現ベクターが当該分野で周知であ
る。種々の発現ベクターの説明およびそれらを使用する
方法は、特に、米国特許第5604118号；米国特許第5,58
3,023号；米国特許第5,432,082号；米国特許第5,266,49
0号；米国特許第5,063,158号；米国特許第4,966,841
号；米国特許第4,806,472号；米国特許第4,801,537号；
およびGoedelら、GeneExpression Technology,Methods
of Enzymology,第185巻,Academic Press,SanDiego(198
9)に見出され得る。組換え細胞系におけるDNAポリメラ
ーゼの発現は、十分に確立された技術である。DNAポリ
メラーゼの組換え発現の例は、米国特許第5,602,756
号；米国特許第5,545,552号；米国特許第5,541,311号；
米国法定発明登録H1,531；米国特許第5,500,363号；米
国特許第5,489,523号；米国特許第5,455,170号；米国特
許第5,352,778号；米国特許第5,322,785号；および米国
特許第4,935,361号に見出され得る。 【００４６】本発明の他の実施態様は、ポリヌクレオチ
ド配列決定に特に有用な複数のDNAポリメラーゼ組成物
を含み、このような組成物は、少なくとも２つの異なる
本発明の変異体DNAポリメラーゼを含み、ここで（１）
第１の変異体DNAポリメラーゼは、第１の蛍光標識ヌク
レオチドに関して受容性であり；（２）第２の変異体DN
Aポリメラーゼは、第２の蛍光標識ヌクレオチドに関し
て受容性であり；そして（３）この第１および第２の蛍
光標識ヌクレオチドは、それらのヌクレオチド塩基およ
び蛍光標識に関して互いに異なる。第１および第２の蛍
光標識塩基はまた、リンカー、塩基付着位置、または蛍
光色素付着部位によって互いに関して異なり得る。本発
明の組成物は、蛍光色素標識2’,3’ジデオキシ鎖終結
ヌクレオチドを用いるサンガー型DNA配列決定において
配列決定反応を触媒するのに有用である。蛍光標識ター
ミネーターを用いる鎖終結配列決定は、好ましくは、少
なくとも２つの、そしてより好ましくは４つの異なる蛍
光標識チェーンターミネーターを使用し、ここで各々の
異なる塩基は、特有の蛍光標識で標識される。配列決定
反応に必要とされる異なる蛍光標識チェーンターミネー
ター間の必要な構造差違（すなわち、ヌクレオチド塩基
および蛍光標識）のために、所定の配列決定反応に必要
な蛍光標識ターミネーターの全てに対して受容性である
とは限らない、本発明の多くの変異体DNAポリメラーゼ
がある。従って、配列決定反応の組において使用される
標識ターミネーターの１つ以上に対して望ましくなく高
レベルの差別を有し得る本発明のDNAポリメラーゼの実
施態様がある。２つ以上の変異体ポリメラーゼの本発明
の組成物は、異なる鎖標識ターミネーターに対して受容
性である複数の変異体DNAポリメラーゼを同時に使用す
ることによって、この問題を改善する。それにより、変
異体ポリメラーゼのうちの少なくとも１つにて、配列決
定反応を触媒する他のポリメラーゼによる特定の蛍光標
識ターミネーターに対する差別を「矯正させる」。組成
物における異なるDNAポリメラーゼの比は、好ましく
は、異なる変異体DNAポリメラーゼの各々についてほぼ
等しいレベルの総活性をもたらすように選択される。異
なる変異体ポリメラーゼ間の比活性における差違は、ポ
リメラーゼ間の総活性比を等しくする場合に考慮され得
る。本発明の組成物における種々の変異体DNAポリメラ
ーゼ間の活性レベルにおける差違はまた、本発明の組成
物における異なる蛍光標識ターミネーターのレベルを調
節することにより矯正され得る。本発明の複数のポリメ
ラーゼの組成物は、２、３、４、またはそれより多くの
異なる変異体DNAポリメラーゼを含み得る。変異体ポリ
メラーゼは、同じ種または株に由来してもよいし、由来
しなくてもよい。本発明の変異体ポリメラーゼ組成物に
おける異なる変異DNAポリメラーゼは、配列決定のため
の所定の組の蛍光標識ジデオキシヌクレオチドにおける
１つ以上の蛍光標識ヌクレオチドに受容性でもよく、受
容性でなくてもよい。 【００４７】本発明はまた、本発明の変異体DNAポリメ
ラーゼ（または本発明の複数の変異体DNAポリメラーゼ
組成物）を使用する種々の方法を含む。本発明の変異体
DNAポリメラーゼは、DNAポリメラーゼを使用するほとん
どの手順において対応する親DNAポリメラーゼの代わり
に使用され得る。本発明の変異体DNAポリメラーゼの特
性をより十分に利用するために、本発明の方法において
使用される標識および非標識ヌクレオチドの量（または
濃度）は、従来のDNAポリメラーゼを使用する対応する
方法において使用される量（または濃度）に関して変更
され得る。ヌクレオチド量におけるこれらの変更は、日
常的な実験により最適化され得る。本発明の方法は、プ
ライムされるポリヌクレオチド鋳型を少なくとも１つの
蛍光標識ヌクレオチドを用いて伸長する工程を含み、こ
こで伸長は、本発明の変異体DNAポリメラーゼにより触
媒される。従って、本発明の方法は、プライマー伸長に
より生成された１つ以上の異なる蛍光標識ポリヌクレオ
チドの形成をもたらす。蛍光標識ポリヌクレオチドを合
成する本発明の方法は、種々の手順（サンガー配列決定
（例えば、ジデオキシヌクレオチド鎖終結）、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（PCR）、ポリヌクレオチド標識、微量配
列決定を含むが、それらに限定されない）において使用
され得る。本発明の変異体DNAポリメラーゼの蛍光標識
ヌクレオチド特性に対する低減した差別は、特に、サン
ガーDNA配列決定反応（サイクル配列決定を含む）に有
用である。サンガー配列決定のための本発明の変異体DN
Aポリメラーゼの使用は、配列決定反応に必要とされる
蛍光標識鎖終結ヌクレオチドの量を低減し、そして多く
の場合において、自動化蛍光-塩基配列決定装置（例え
ば、AppliedBiosystems 310または377(Applied Biosyst
ems Division of Perkin-Elmer,FosterCity,CA)）で分
析される単一配列決定反応において同定され得る塩基数
を増加するために使用され得る。サンガー配列決定につ
いての詳細なプロトコルは当業者に公知であり、そして
例えば、Sambrookら、MolecularCloning,A Laboratory
Manual,第２版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring
Harbor,NY(1989)に見出され得る。 【００４８】本発明はまた、蛍光標識ポリヌクレオチド
を合成するためのキットを提供する。キットは、特定の
ポリヌクレオチド合成手順（例えば、DNA配列決定また
はPCR）を行うために適合され得る。本発明のキット
は、本発明の変異体DNAポリメラーゼ、およびキットに
おける変異体DNAポリメラーゼに関して低減した差別を
示す蛍光標識ヌクレオチドを含む。キットは、好ましく
は、キットに適合した手順を行う方法についての詳細な
説明書を含む。必要に応じて、本発明のキットは、キッ
トが、行うために適合した方法を行うために必要とされ
る少なくとも１つの他の試薬をさらに含み得る。このよ
うなさらなる試薬の例は、非標識ヌクレオチド、緩衝
液、クローニングベクター、制限エンドヌクレアーゼ、
配列決定プライマー、および増幅プライマーを含む。本
発明のキットに含まれる試薬は、より大きな精度および
正確さを提供するように予め測定された単位で供給され
得る。 【００４９】本発明の他の実施態様には、（１）複数の
変異体DNAポリメラーゼの本発明の組成物、および
（２）本発明の組成物を用いる使用に適した蛍光標識鎖
終結ヌクレオチド（すなわち、各標識チェーンターミネ
ーターは、組成物における変異体DNAポリメラーゼの少
なくとも１つに関して受容性である）を含むキットが含
まれる。本発明のさらなる実施態様は、本発明の複数の
変異体ポリメラーゼ組成物を含むDNAを配列決定するた
めのキットを含み、そして少なくとも２つの異なる蛍光
標識鎖終結ヌクレオチドは異なる塩基で標識され、ここ
で各々の蛍光標識鎖終結ヌクレオチドは、組成物におけ
る少なくとも１つの変異体DNAポリメラーゼに関して受
容性である。 【００５０】上記で記載してきた本発明は、以下の実施
例への参照によりより良く理解され得る。実施例は、多
くの理由の中でも特に、本発明の特定の実施態様を例示
するために提供され、そして本発明に対する制限として
解釈されるべきではない。 【００５１】 【実施例】実施例１ Taq DNAポリメラーゼの変異体形態の精製 組換え変異体TaqDNAポリメラーゼ生成のために設計され
た組換え構築物を含むE.coli溶解物を、本質的に、tDes
ai,U.J.およびPfaffle,P.K.,Biotechniques,19:780-784
(1995)に記載のように作製した。ポリメラーゼが、溶解
物に夾雑する染色体DNAおよびプラスミドDNAに結合する
のを妨げるために、５MNaClを熱処理した清澄化溶解物
に滴下して、最終NaCl濃度を0.25Mにした。次いで、DNA
を５％ポリエチルイミン（20mM TRIS・Cl(pH8.5)中）の
滴下によりこの混合物から沈殿させて、PEI最終濃度を
0.3％にした。沈殿を、氷上で５分間継続させた。白色
の濁った沈殿物を、４℃で15分間、15,000×gでの遠心
分離により除去した。上清液をデカンテーションし、そ
して取っておいた。遠心分離後、NaCl濃度を、NaClを含
まないTETT（20mMTRIS・Cl、0.1mM EDTA、0.05％ Tween-
20、0.05％ Triton-X100、１％グリセロール、pH8.5）
の添加の間に溶液の伝導率をモニターすることにより0.
13Mに下げた。 【００５２】過剰なPEIを、Bio-Rex70(BIO-RAD,Richmon
d,CA)カラム(2.5×30cm)を用いて除去した。カラムにTE
TT緩衝液＋0.1MNaClを注ぎ、そして平衡化した。ポリメ
ラーゼは、これらの条件下でBio-Rex70に結合しない。 【００５３】夾雑E.coliタンパク質を除去するために、
Bio-Rex70カラム溶出物を、ヘパリン-アガロース(Sigma
Chemical Company,St.Louis,MO)カラム（1.5×30cm）
（これもまたTETT緩衝液＋0.1M NaClを注ぎ、そして平
衡化した）に直接ロードした。ヘパリン-アガロースカ
ラムを、２カラム容量のTETT＋0.1MNaClで洗浄し、そし
てTaq DNAポリメラーゼを、TETT＋１M NaClを用いて鋭
いピークとして溶出した。溶出を280nmでモニターし
た。 【００５４】ピーク吸光度に対応するヘパリン-アガロ
ースカラム画分をプールし、そして遠心分離速度および
時間について製造者の推奨に従ってUltrafree-15Centri
fugal Filter Devices(Millipore Corporation,MA)を用
いて0.15mlまで濃縮した。濃縮物を、TETT緩衝液＋５％
グリセロールで15mlに希釈し、そしてサンプルを0.15ml
まで再濃縮した。これをもう１回繰り返して、タンパク
質サンプル中の最終NaCl濃度を１mM未満に下げた。 【００５５】濃縮ポリメラーゼサンプルをTETT＋５％グ
リセロールを用いて２倍希釈し、そして等容量のTETT＋
95％グリセロールを添加して、最終グリセロール濃度を
約50％にした。サンプルを-20℃で保存した。タンパク
質濃度を、「BradfordProteinAssay」(BIO-RAD,Richmon
d,CA)を用いて決定した。活性を、放射分析アッセイ
（他の所に記載）を用いて測定した。 【００５６】２リットルの誘導E.coli培養液（30〜50ml
の熱処理した清澄化溶解物に相当する）に由来するポリ
メラーゼの代表的な収率は、４〜24mgの範囲であった。
精製サンプルのSDS-PAGE分析は、クマシーブルー染色後
に、分子量約94,000の１つの濃いバンドおよびいくつか
のより微弱なバンドを示した。ゲルは、＞90％の代表的
な精製レベルを示した。 【００５７】実施例２ 選択性アッセイ 非標識対色素標識ターミネーターアッセイ（「ターミネ
ーター」を伸長不可能な塩基（例えば、2’,3’-ddNT
P）と定義する）を使用して、変異体TaqDNAポリメラー
ゼサンプルを、このポリメラーゼのより良好なTet(II)・
ddCTP取り込み変異体形態についてスクリーニングし
た。このアッセイは、ポリメラーゼ濃度のみが律速であ
る定常状態反応の間に同時に、同じ活性部位について競
合する２つの基質に基づく。従って、このアッセイは、
非標識対フルオレセイン標識ターミネーターについての
ポリメラーゼの「選択性」を測定する。このアッセイフ
ォーマットにおいて使用されるDNAプライマー／鋳型を
以下に示す： 5’-＞(FAM)-CCC TCG CAG CCG TCC AAC CAA CTC A GGG AGC GTC GGC AGG TTG GTT GAG TGC CTC TTG TTT<-
5’ プライマーの3’末端に続く次の鋳型位置を、太文字お
よび下線のＧにより上記に示す。 【００５８】反応は以下からなる： 80mM TRIS・Cl（20℃でpH9.0） 1000nM DNAプライマー／鋳型（5’-(FAM)25マー／36G1
鋳型） ２mM MgCl2 50μM TET(II)・ddCTP １μM ddCTP 0.25単位の酵素 40μL反応容量 60℃反応温度 サンプル（２μL）を、予め決定した時間（代表的に、
0.25単位ポリメラーゼ活性／μLについて20秒間隔）で
反応混合物から取り出し、そして氷冷50μL0.5MEDTA（p
H8.0）を添加した。定期的な(timed)アリコートを混合
し、そしてさらなる処理のために氷上で保持した。 【００５９】各時点のサンプルを、過剰な取り込まれな
かったTET(II)・ddCTPを除去するために処理した。代表
的に、1.6μLの各クエンチングしたサンプルを、250μL
の0.8MLiCl＋0.2μg/ml E.coli tRNAに添加し、続いて7
50μLの95％エタノールを添加した。混合後、核酸を、-
20℃で20分間沈殿させた。沈殿物を、標準的な手順を用
いて遠心分離により回収した。上清液を捨て、そしてペ
レットを、50μLの50％ホルムアミドに溶解した。ゲル
サンプルを熱処理し（95℃、２分間）、そしてサンプル
レーンあたり２μLを、16％変性DNA配列決定ゲルにロー
ドした。ゲルを、25マープライマーに相当するバンド、
26マー産物（ddC取り込み事象を示す）、および見かけ
の「27マー」産物のバンド（TET(II)・ddCTP取り込み事
象を示す）におけるFAM蛍光量を測定するために、GeneS
canFragment Analysisソフトウェアを用いてApplied Bi
osystems Model 373 Sequencerにおいて泳動を行った。 【００６０】各バンドにおける蛍光シグナルを合計し、
そしてさらなる計算のために、各バンドにおけるシグナ
ルのパーセントを、レーン毎のローディング差を避ける
ための標準化として使用した。見かけの「27マー」産物
分子に存在する％-FAM部分から、新たに取り込まれた
3’塩基上のTET(II)部分へのエネルギー移動ha、全ての
比を「野生型」またはTaqG46Dと比較したので補正しな
かった。26マーおよび「見かけの」27マー産物のバンド
における標準化された蛍光シグナルを、反応に使用され
た２つの分子の異なる濃度について補正し、そして補正
値を時間に対してプロットした。各基質についての取り
込み速度を、データに対する最小二乗適合(fit)を用い
て決定した。ddC/TET(II)・ddC取り込み速度の比は、サ
ンプルポリメラーゼが非標識対TET(II)標識ヌクレオチ
ドについて示す選択性の偏りと等しく、そして以下の関
係を反映する： 【００６１】 【数１】 【００６２】ここで： vddC＝ddC取り込み速度 vTet(II)・ddC＝Tet(II)・ddC取り込み速度 kcat＝触媒速度定数 KM＝ヌクレオチド平衡結合定数 [ddC]＝反応物におけるddCTP濃度 [Tet(II)・ddC]＝反応物におけるTet(II)・ddCTP濃度 このアッセイフォーマットにおいて、「野生型」Taqま
たは(TaqG46D)は、選択性の偏りすなわち約85：１のddC
/Tet(II)・ddC数を示した。より低い選択性偏り比を示す
変異体をさらなる試験に提示した。以下の表２は、いく
つかの例のために試験されたいくつかの変異体について
の結果を示す： 表２ Taq 選択性数 WT/変異体 G46D 85 85/85すなわち１ G46D；R660D ８ 85/８すなわち約10 G46D；R595E 28 85/28すなわち約３ G46D；F667Y 28 85/28すなわち約３ G46D；E681G 40 85/40すなわち約２ G46D；D655L 40 85/40すなわち約２。 【００６３】実施例３ 次ヌクレオチド速度効果アッセイ 「基底状態」ヌクレオチド結合すなわち初期衝突と正確
な塩基対形成および基転移反応との間のさらなる反応速
度段階は、「次ヌクレオチド速度効果」(Patelら、199
1)と呼ばれるアッセイにおいて、3’-ジデオキシヌクレ
オチドを有する酵素-DNA複合体からのポリメラーゼ解離
速度を遅くすると予期される。このアッセイは、次の正
確なヌクレオチドの非存在下または存在下での、ddTTP
取り込みの定常状態速度（すなわち、酵素が律速であ
る）を測定する。プライマー鋳型対を以下に示す： 5’->(FAM)-CCC TCG CAG CCG TCC AAC CAA CTC A GGG AGC GTC GGC AGG TTG GTT GAG TAG GTC TTG TTT<-
5’ 次の鋳型位置を、太文字下線のＡにより示す。Ａを越え
た次の鋳型位置はＧである。定常状態反応条件下で、本
質的に全ての利用可能なポリメラーゼがプライマー／鋳
型に結合する。ddTTPが溶液中に単独で存在する場合、
これは、その鋳型位置Ａへの結合後に取り込まれる。さ
らなる取り込み事象は、ポリメラーゼが酵素-DNA複合体
から解離することを必要とし、そしてまだ取り込み事象
を受けていない別の利用可能なプライマー／鋳型を見出
す。従って、これらの条件下の取り込み速度は、酵素-D
NA複合体からのポリメラーゼの解離速度である。次の正
確なヌクレオチドdGTPまたはddCTPもまた反応混合物に
存在する場合、酵素・DNA・ddCTP複合体からのポリメラ
ーゼの解離速度は、例えば、ddTTPを取り込んだ基転移
反応と、合成の進行(processive)態様におけるポリメラ
ーゼによってddCTPを取り込む試みとの間でさらなる反
応速度段階がある場合、より遅い。別の正確なヌクレオ
チドの存在にもかかわらず、一旦ddTTPおよびポリメラ
ーゼが進行し得ないと、化学作用は起こり得ないので、
このより遅い解離速度はより遅いddTTPの取り込み速度
として検出され得る。図２に示すように、次の正確なヌ
クレオチドの存在は、確かに、ポリメラーゼの代謝回転
または解離速度を遅くする（TaqG46D；F667Y）。図２は
また、次の正確なヌクレオチド上のフルオレセイン色素
（この場合、Tet(II)・ddCTP）の存在が代謝回転速度を
加速すると思われることを示す。本発明者らは、これ
が、ポリメラーゼが立体配座変化を常に受け、そして次
の正確なヌクレオチドの非存在下でさえ変化を受けよう
と試み得ることを意味すると解釈する。しかし、次の正
確なヌクレオチド上のフルオレセイン色素の存在は、ポ
リメラーゼがこのような変化を受ける能力をブロック
し、それによりddTTP取り込みのための基転移段階後の
酵素の即座の解離を引き起こす。従って、フルオレセイ
ン色素は、基転移反応後の反応速度段階を排除すること
によりポリメラーゼ解離速度を加速すると思われる。 【００６４】図３は、Taq DNAポリメラーゼの「複数
の」変異体形態、TaqG46D；R660D；F667Y；E681Gについ
ての次ヌクレオチド速度効果アッセイの結果を示す。こ
の場合、次の正確なヌクレオチド上のTet(II)の存在
は、変異体ポリメラーゼに対して「明白(transparen
t)」である。本発明者らは、これが、変異体ポリメラー
ゼが、確かに、このポリメラーゼの「野生型」バージョ
ンが受ける基転移後に同じ反応速度段階を受け得ること
を意味すると解釈する。本発明者らはまた、これらの結
果が、F667Y変異がR660DまたはE681G変異とは異なるク
ラスに属することを示すと解釈する。なぜなら、TaqG46
D；F667Yは、「次ヌクレオチド速度効果」アッセイにお
いて「フルオレセイン効果」をなお示すが、多重変異体
Taq G46D；R660D、F667Y；E681Gは示さないからであ
る。 【００６５】次ヌクレオチド速度効果アッセイのための
代表的なアッセイ条件は以下の通りであった： 1000nMプライマー／鋳型DNA 80mM TRIS・Cl（20℃でpH9.0） 2.4mM MgCl2 0.02単位／μLポリメラーゼ活性 400μM各ヌクレオチド（存在する場合） サンプルを採取し、そして「選択性アッセイ」の下で記
載されたのと同じ様式で処理した。この場合、16％ゲル
において得られたフラグメントの移動速度により、ddC
取り込み事象とTet(II)・ddC取り込み事象とを区別する
ことは可能である。ddCの取り込みは、上記で予期され
たように、または25マープライマーより遅く移動する
「正常な」26マーバンドをもたらす。Tet(II)・ddCの取
り込みは、このバンドを27マーまたは28マーに等しい見
かけのサイズに伴って移動させる、より遅い移動をもた
らす。 【００６６】実施例４ さらなる変異体の分析 以下に提供される表１は、いくつかの異なるTaq変異体
を用いて行われた選択性アッセイにより得られた結果の
要旨を提供する。酵素E.coliDNAポリメラーゼIおよびフ
ァージT7 DNAポリメラーゼにおける変異のための類似の
部位もまた示される。用語「FS」は、F667Y変異を有す
るTaq DNAポリメラーゼを言う。 【００６７】参考文献 Barnes,W.M.(1992)、PCRを触媒するTaqポリメラーゼの
忠実度はＮ末端欠失により改善される。Gene112:29-3
5。Brandis,J.W.,Edwards,S.G.およびJohnson,K.A.(199
6)、ホスホジエステル結合形成の遅い速度は、TaqDNAポ
リメラーゼが2’,3’-ジデオキシヌクレオチドターミネ
ーターに対して示す強い偏りを説明する。Biochemistry
35:2189-2200。Desai,U.J.およびPfaffle,P.K.、Esche
richiacoliにおいて発現された耐熱性DNAポリメラーゼ
の一段階精製。Biotechniques 19:780-784。Fersht,A.
(1985)、「酵素構造および機能」W.H.FreemanおよびCom
pany,第２版,111-112頁。Johnson,K.A.(1993)、DNAポリ
メラーゼ忠実度における立体配座カップリング。Ann.Re
v.Biochem.62:685-713。Patel,S.S.,Wong,I.およびJohn
son,K.A.(1991)、エキソヌクレアーゼ欠損変異体の完全
な特徴づけを含む、進行DNA複製の前定常状態反応速度
分析。Biochemistry30:511-525。 【００６８】参考としての援用 本願は、本明細書中でそれらの全体が参照される全ての
刊行物、特許、および特許出願を援用する。 【００６９】等価物 本発明は特定の実施態様に関して記載および例示された
が、一方、当業者は、改変および変化が、上文に記載さ
れ、そして以下の請求の範囲に示されるように、本発明
の原理を逸脱することなくなされ得ることを認識する。 【００７０】 【表１】【００７１】 【表２Ａ】【００７２】 【表２Ｂ】【００７３】 【表２Ｃ】【００７４】 【発明の効果】ポリヌクレオチドへの標識ヌクレオチド
に対して低減した差別を示す、変異体DNAポリメラーゼ
が提供された。
取り込む酵素の能力を変える変異を有するDNAポリメラ
ーゼに関する。 【０００２】 【従来の技術】背景 DNAポリメラーゼは、鋳型DNA鎖および鋳型の一部とアニ
ールされる相補合成プライマーを用いて、デオキシヌク
レオチド３リン酸からのDNA分子の形成を合成する酵素
である。DNAポリメラーゼおよびそれらの酵素学的特徴
の詳細な説明は、Kornberg,DNAReplication 第２版,W.
H.Freeman(1989)に見出され得る。 【０００３】DNAポリメラーゼは、研究および臨床応用
の両方に適切な分子生物学技術において種々の用途を有
する。これらの技術のうち、DNA配列決定および核酸増
幅技術（例えば、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)）が最も
重要である。 【０００４】多くのDNAポリメラーゼのアミノ酸配列が
決定されている。異なるDNAポリメラーゼ間の配列比較
により、異なる酵素間での多くの相同性領域が同定され
た。Ｘ線回析研究により、クレノウフラグメント、T7DN
Aポリメラーゼ、およびTaq DNAポリメラーゼの３次構造
が決定された。DNAポリメラーゼ３次構造およびアミノ
酸配列比較の研究により、多様なDNAポリメラーゼ間の
非常に多くの構造類似性が明らかになった。一般的に、
DNAポリメラーゼは、２重鎖DNAの結合を提供すると考え
られる大きな裂け目(cleft)を有する。この裂け目は、
２組のヘリックスにより形成され、第１の組は「指(fin
ger)」領域と呼ばれ、そしてヘリックスの第２の組は
「親指(thumb)」領域と呼ばれる。裂け目の底は逆平行
βシートにより形成され、そして「手のひら(palm)」領
域と呼ばれる。DNAポリメラーゼ構造の概説は、Joyceお
よびSteitz,Ann.Rev.Biochem.63:777-822(1994)におい
て見出され得る。いくつかのDNAポリメラーゼの３次元
構造を記載するコンピューターが判読可能なデータファ
イルは、公に普及している。 【０００５】蛍光標識ヌクレオチドは、分子生物学にお
ける多くの手順の有用性を非常に単純にし、そして改善
した。合成手順においてポリヌクレオチドを標識するた
めの蛍光標識ヌクレオチドの使用は、大部分は、放射性
標識の使用に取って代わった。蛍光標識ヌクレオチド
は、DNA配列決定において（Smithら、Nature321:674-67
9(1986)を参照のこと）、PCRおよび他の形態のポリヌク
レオチドフラグメント分析において広く使用されてい
る。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】蛍光標識ヌクレオチド
を使用することに伴う主な問題は、蛍光標識ヌクレオチ
ドの取込みを差別するDNAポリメラーゼの能力である。
例えば、本発明者らは、TET(6-カルボキシ-4,7,2’,7’
-テトラクロロフルオレセイン)標識2’,3’ジデオキシ
ヌクレオチドと対応する非標識ジデオキシヌクレオチド
との間の競合アッセイにおいて、Taq DNAポリメラーゼ
が、非標識ジデオキシヌクレオチドを、対応する標識ヌ
クレオチドよりも少なくとも85倍頻繁に、DNAに取り込
むことを発見した。標識ヌクレオチドと非標識ヌクレオ
チドとの間のこの差別は、DNAを標識するためにDNAポリ
メラーゼを使用する手順に絶大な影響を有する。例え
ば、非常に多量の蛍光標識ヌクレオチドが配列決定反応
において使用されなければならない。この多量の蛍光標
識ヌクレオチドは高価であり、そして過度のバックグラ
ウンド蛍光を生じ、それにより配列情報の収率が低減さ
れ得る。 【０００７】蛍光標識ヌクレオチドの取込みを差別する
DNAポリメラーゼの能力から生じる問題を考慮して、本
発明者らは、１つ以上の蛍光標識ヌクレオチドのDNAへ
の取込みに対する差別が低減した、いくつかの新規のDN
Aポリメラーゼを開発した。 【０００８】 【課題を解決する手段】要旨 天然に生じるDNAポリメラーゼは、非標識ヌクレオチド
を、対応する蛍光標識ヌクレオチドよりも優先的にポリ
ヌクレオチドに取り込む。蛍光標識ヌクレオチドを差別
するDNAポリメラーゼのこの能力は、蛍光標識ヌクレオ
チドの酵素的付加を必要とする多くの分子生物学手順
（例えば、標識ジデオキシターミネーター配列決定）に
望ましくない影響を有する。本発明は、ポリヌクレオチ
ドへの蛍光標識ヌクレオチドに対する低減した差別を示
す変異体DNAポリメラーゼに関する。 【０００９】本発明のDNAポリメラーゼは、変異が蛍光
標識ヌクレオチドに対する低減した差別をもたらすよう
に、酵素のヌクレオチド標識相互作用領域において少な
くとも１つの変異を有する。DNAポリメラーゼのヌクレ
オチド標識相互作用領域は、TaqDNAポリメラーゼのO-ヘ
リックス、(ii)Kヘリックス、および(iii)O-Pヘリック
ス間ループの一部、または他のDNAポリメラーゼにおけ
る類似の部分により形成される。TET(II)・ddCにより定
義されるような、ヌクレオチド標識相互作用領域内のア
ミノ酸残基は、E520、A521、L522、R523、E524、A525、
H526、P527、I528、V529、E530、K521、I532、R536、E5
37、R573、Q582、N583、V586、R587、P589、Q592、R59
3、R595、D610、T612、Q613、E615、R636、D637、T64
0、F647、V654、D655、P656、L657、R659、R660、T66
4、E681、L682、A683、I684、P685、E688、F692、Q75
4、H784、L817、E820、L828、K831、およびE832であ
る。R660、T664、およびE681の部位は、変異を導入する
のに好ましい部位である。フルオレセイン型色素を用い
た使用のための本発明の好ましい実施態様において、変
異は681位に存在し、E（グルタミン酸）をM（メチオニ
ン）に変換する（すなわち、E681M）。フルオレセイン
−フルオレセインエネルギー移動色素を用いた使用のた
めの本発明の好ましい実施態様において、変異は657位
に存在し、L（ロイシン）をG（グリシン）に変換する。
標識ヌクレオチドに対する差別が低減した変異体TaqDNA
ポリメラーゼを提供することに加えて、本発明は、広範
な種々のDNAポリメラーゼ（耐熱性およびその他の両
方）に由来する変異体を含む。 【００１０】新規の変異体DNAポリメラーゼを提供する
ことに加えて、本発明はまた、本発明の変異体DNAポリ
メラーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。提
供されるポリヌクレオチドは、変異体ポリメラーゼの組
換え生成のための発現ベクターを含み得る。本発明はま
た、本発明のポリメラーゼポリヌクレオチドを含む宿主
細胞を含む。 【００１１】本発明はまた、本発明のDNAポリメラーゼ
を使用する非常に多くの方法を含む。本発明の方法は、
標識ヌクレオチドのポリヌクレオチドへの取込みに対す
る差別が低減した変異体DNAポリメラーゼにより触媒さ
れるポリヌクレオチド合成反応により、蛍光標識ポリヌ
クレオチドを合成する工程を含む。ポリヌクレオチド合
成の本発明の方法は、プライムされるポリヌクレオチド
鋳型を少なくとも１つの蛍光標識ヌクレオチドを用いて
伸長する工程を含み、ここで伸長は、ポリヌクレオチド
への標識ヌクレオチドに対する差別が低減したDNAポリ
メラーゼにより触媒される。蛍光標識ポリヌクレオチド
を合成する本発明の方法は、種々の方法（例えば、サン
ガー配列決定およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)）にお
いて使用され得る。 【００１２】本発明の別の局面は、本発明の方法に従っ
て蛍光標識ポリヌクレオチドを合成するためのキットを
提供することである。本発明のキットは、本発明の変異
体DNAポリメラーゼ、およびキット中の変異体DNAポリメ
ラーゼに関して低減した差別を示す蛍光標識ヌクレオチ
ドを含む。 【００１３】本発明はさらに、以下を提供する。 １．ヌクレオチド標識相互作用領域において少なくとも
１つの変異を有するDNAポリメラーゼであって、ここで
該DNAポリメラーゼは、フルオレセイン型色素標識ヌク
レオチドに対する差別が低減した、DNAポリメラーゼ。 ２．前記変異が、(ｉ)O-ヘリックス、(ii)Kヘリック
ス、および(iii)O-Pヘリックス間ループからなる群より
選択されるヌクレオチド標識相互作用領域の部分にあ
る、項目１に記載のDNAポリメラーゼ。 ３．前記変異が、E520、A521、L522、R523、E524、A52
5、H526、P527、I528、V529、E530、K531、I532、R53
6、E537、R573、Q582、N583、V586、R587、P589、Q59
2、R593、R595、D610、T612、Q613、E615、R636、D63
7、T640、F647、V654、D655、P656、L657、R659、R66
0、T664、E681、L682、A683、I684、P685、E688、F69
2、Q754、H784、L817、E820、L828、K831、およびE832
からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する酵素
のセグメントである、項目２に記載のDNAポリメラー
ゼ。 ４．前記変異が、R595、D655、R660、T664、およびE681
からなる群より選択される位置にある、項目３に記載の
DNAポリメラーゼ。 ５．前記DNAポリメラーゼが、TaqDNAポリメラーゼであ
る、項目４に記載のDNAポリメラーゼ。 ６．前記変異が、R660D、D655L、E618G、およびR595Eか
らなる群より選択される、項目５に記載のDNAポリメラ
ーゼ。 ７．(G46D,R660D,F667Y)、(G46D,R595D,R660D,F667Y)、
および(G46D,R660D,F667Y,E681G)、および(G46D,F667Y,
E681G)からなる群に属する変異の組を含む、項目６に記
載のDNAポリメラーゼ。 ８．前記DNAポリメラーゼが耐熱性DNAポリメラーゼであ
る、項目２に記載のDNAポリメラーゼ。 ９．項目１に記載のDNAポリメラーゼをコードするポリ
ヌクレオチド。 １０．プロモーターを有する発現ベクターであって、こ
こで該ベクターが、該プロモーターと機能的に組み合せ
た項目９に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。 １１．項目１０に記載の発現ベクターを含む、宿主細
胞。 １２．蛍光標識ポリヌクレオチドを合成する方法であっ
て、該方法が、項目１に記載のDNAポリメラーゼとプラ
イムされる鋳型とを混合する工程を包含する、方法。 １３．前記プライムされる鋳型が、鎖終結配列決定反応
においてプライムされる鋳型である、項目１２に記載の
方法。 １４．前記プライムされる鋳型が、ポリメラーゼ連鎖反
応におけるプライムされる鋳型である、項目１２に記載
の方法。 １５．ポリヌクレオチドを蛍光標識するためのキットで
あって、該キットが、項目１に記載のDNAポリメラーゼ
および蛍光標識ヌクレオチドを含む、キット。 【００１４】 【発明の実施の形態】本発明の特定の実施態様の詳細な
説明 用語 DNAポリメラーゼ内のアミノ酸残基の位置は、数字また
は数字／文字の組み合わせのいずれかにより示される。
番号付けは、アミノ末端残基から始まる。文字は、変異
体が由来する天然に生じる酵素における示された位置で
のアミノ酸残基についての一文字アミノ酸コードであ
る。特に他に示されなければ、アミノ酸残基の位置の名
称は、一文字アミノ酸コードが、TaqDNAポリメラーゼに
おける示された位置でのアミノ酸残基に具体的に関係し
ているとはいえ、全てのDNAポリメラーゼにおける類似
の位置を言うと解釈されるべきである。 【００１５】個々の置換変異は、文字／数字／文字の組
み合わせの形態により示される。文字は、アミノ酸残基
の一文字コードである。数字は、変異部位のアミノ酸残
基の位置を示す。数字付け系は、アミノ末端残基から始
まる。TaqDNAポリメラーゼにおける残基の数字付けは、
米国特許第5,079,352号(Gelfand)に記載される通りであ
る。異なるDNAポリメラーゼ間のアミノ酸配列相同性
は、対応する位置が、Taq以外のDNAポリメラーゼのアミ
ノ酸残基に割り当てられることを可能にする。他に示さ
れなければ、所定の数字は、TaqDNAポリメラーゼにおけ
る位置をいう。最初の数字（すなわち、数字の左側の文
字）は、非変異体酵素における示された位置でのアミノ
酸残基を示す。第２の文字は、変異体酵素における同じ
位置でのアミノ酸残基を示す。例えば、用語「R660D」
は、660位でのアルギニンがアスパラギン酸残基により
置換されたことを示す。 【００１６】本明細書中で使用する用語「差別」は、非
標識ヌクレオチドを、対応する蛍光標識ヌクレオチドよ
りも優先的にDNAに取り込む、DNAポリメラーゼの特性
（すなわち、DNAポリメラーゼが蛍光標識ヌクレオチド
を差別すること）をいう。優先的な取り込みは、蛍光標
識2’,3’ジデオキシヌクレオチドおよび対応する非標
識2’,3’ジデオキシヌクレオチドがポリヌクレオチド
の同じ部位への取り込みについて競合するアッセイにお
いて測定され得る。このようなアッセイの例は、以下の
実施例２において見出され得る。 【００１７】本明細書中で使用する用語「低減した差
別」は、親酵素と比較した場合の、変異体DNAポリメラ
ーゼにおける蛍光標識ヌクレオチド取り込みに対する差
別の低減をいう。差別の低減は、実施例２における選択
性アッセイへの参照により、またはポリメラーゼの同じ
特性の測定を提供する他のアッセイへの参照により定量
的に説明され得る。選択性アッセイにより測定されるよ
うな選択性数の低減は差別の低減であり、そして選択性
数の比により表され得る。例えば、選択性数８を有する
変異体DNAポリメラーゼは、選択性数80を有する親DNAポ
リメラーゼと比較した場合、差別の10倍の低減を有す
る。 【００１８】用語「親」または「親酵素」は、変異体DN
Aポリメラーゼと変異体酵素が由来するDNAポリメラーゼ
とを区別するために使用される。従って、任意の天然に
生じるDNAポリメラーゼが親酵素と呼ばれ得る。天然に
生じる酵素に関して変異を有する第１のDNAポリメラー
ゼもまた、さらなる変異を有する第２のDNAポリメラー
ゼに関して親酵素と呼ばれる。 【００１９】用語「差別を低減する変異」は、蛍光標識
ヌクレオチド取り込みに対して低減した差別をもたら
す、DNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域
における変異をいう。この用語は、蛍光標識ヌクレオチ
ドに対する差別を低減しない、DNAポリメラーゼにおけ
る変異（ヌクレオチド標識相互作用領域における変異を
含む）と差別を低減させる変異とを区別するために使用
される。 【００２０】本明細書中で使用する用語「ヌクレオチ
ド」は、特に他に言及しない限り、天然に生じるヌクレ
オチドおよび種々のアナログ（2’,3’ジデオキシヌク
レオチドを含む）の両方を広く言うために使用される。 【００２１】用語「フルオレセイン型色素」は、以下の
縮合３環系： 【００２２】 【化１】 【００２３】を含むキサンテン色素分子のクラスを言
い、ここで広範な種々の置換が各デオキシ環位置で可能
である。特に好ましいフルオレセイン型色素のサブセッ
トは、4,7-ジクロロフルオレセイン(Menchen)を含む。D
NA配列決定法における蛍光標識として使用されるフルオ
レセイン型色素の例は、6-カルボキシフルオレセイン(6
-FAM)、5-カルボキシフルオレセイン(5-FAM)、6-カルボ
キシ-4,7,2’,7’-テトラクロロフルオレセイン(TET)、
6-カルボキシ-4,7,2’,4’,5’,7’-ヘキサクロロフル
オレセイン(HEX)、5-(および6)カルボキシ-4’,5’-ジ
クロロ-2’,7’-ジメトキシフルオレセイン(JOE)、なら
びに5-カルボキシ-2’,4’,5’,7’-テトラクロロフル
オレセイン(ZOE)を含む。しばしば、名称-1または-2
は、特定の色素の略語の後に置かれる（例えば、HEX-
1）。「-1」および「-2」（または「I」および「II」）
の名称は、特定の色素の異性体が使用されることを示
す。１異性体および２異性体は、C-8カラムおよび15％
アセトニトリル／85％0.1M酢酸トリエチルアンモニウム
から35％アセトニトリル／65％ 0.1M酢酸トリエチルア
ンモニウムへの溶出勾配を利用する逆相クロマトグラフ
ィー分離系における遊離色素の溶出順序（１異性体は、
最初に溶出する異性体である）により定義される。 【００２４】用語「アルキニルアミノ型リンカー」は、
米国特許第5,047,519号（Hobbs）、米国特許第5,151,50
7号(Hobbs)、および1996年８月13日に出願された米国特
許出願第08/696,808号に記載されるような型のアルキニ
ルアミノリンカーを言う。さらなるアルキニルアミノ型
リンカーは、1997年４月10日に出願された、米国特許出
願第08/833,855号において記載される。 【００２５】用語「TET(II)・ddCTP」は、図４に示され
る構造の蛍光標識ヌクレオチドを言う。 【００２６】用語「蛍光エネルギー移動色素」は、２つ
の色素部分間の蛍光エネルギー移動を可能にするリンカ
ーにより結合された色素部分を言う。鎖終結配列決定に
おける使用のために、リンカーは十分小さく、そしてDN
Aポリメラーゼが目的の色素で標識されたヌクレオチド
３リン酸を取込むのを可能にするのに適切な形状および
方向のリンカーである。エネルギー移動色素の例は、欧
州特許出願番号EP0 805 140、米国特許出願第08/642,33
0号（1996年３月３日に出願）、および米国特許出願第0
8/726,462号（1996年10月４日に出願）において見出さ
れ得る。 【００２７】本明細書中で使用する用語「変異」は、タ
ンパク質の特定の位置でのアミノ酸残基における変化を
言う。アミノ酸残基における変化は、天然に生じるタン
パク質に関して定義される変化である。変異を有するタ
ンパク質は、「変異体」タンパク質と呼ばれ得る。 発明の実施態様 本発明は、蛍光標識ヌクレオチドのポリヌクレオチドへ
の取り込みを差別するポリメラーゼの能力を低減する変
異を含むDNAポリメラーゼに関する。これらの変異は、
本明細書中で「ヌクレオチド標識相互作用領域」と呼ば
れる、DNAポリメラーゼ分子の領域にある。ヌクレオチ
ド標識相互作用領域は、DNAポリメラーゼの３つの領域
の部分により形成される。これらの３つの領域は、TaqD
NAポリメラーゼの(ｉ)O-ヘリックス、(ii)Kヘリック
ス、および(iii)O-Pヘリックス間ループ、または他のDN
Aポリメラーゼにおける類似の位置に位置する。蛍光標
識ヌクレオチドに対する差別を低減したDNAポリメラー
ゼは、2’,3’ジデオキシヌクレオチドを用いる鎖終結D
NA配列決定（すなわち、サンガー型配列決定）に特に有
用である。 【００２８】Taq DNAポリメラーゼおよび蛍光標識ジデ
オキシヌクレオチドを用いて行われた酵素反応速度実験
（実施例２および３に記載される）は、TaqDNAポリメラ
ーゼおよび他のDNAポリメラーゼが、DNA合成間のヌクレ
オチド結合の際に立体配座シフトを受けるという理論を
支持する。この予測された立体配座シフトは、ヌクレオ
チドの核酸塩基にリンカーにより結合された蛍光標識と
相互作用し、それにより蛍光標識されたヌクレオチドに
対する差別をもたらす、１組のアミノ酸残基を示唆す
る。この組のアミノ酸残基は、ヌクレオチド標識相互作
用領域を形成する。出願人により提案された蛍光標識ヌ
クレオチドのDNAポリメラーゼへの結合についての特定
の分子モデルは、所定のDNAポリメラーゼのヌクレオチ
ド標識相互作用領域を形成するアミノ酸残基を予測する
ために使用される。DNA合成間のDNAポリメラーゼにおけ
る立体配座シフトについての出願人のモデルは、ヌクレ
オチド標識相互作用領域がどのように決定されたかにつ
いての説明として提供される。このモデルは、蛍光標識
ヌクレオチドのポリヌクレオチドへの取り込みを差別す
るDNAポリメラーゼの能力を低減する、DNAポリメラーゼ
における変異を作製することに指針を提供する。図１
は、どのようにDNAおよびTaqDNAポリメラーゼがこのモ
デルにおいて相互作用するかを示すコンピューターモデ
ルである。DNAポリメラーゼ-ヌクレオチド相互作用の真
の機構は、ヌクレオチド標識相互作用領域のパラメータ
ーを決定するために使用されたモデルと同じでも異なっ
ても、本明細書中に記載の発明の実施可能性を限定しな
い。 【００２９】本発明の変異体DNAポリメラーゼは、フル
オレセイン型色素で標識されたヌクレオチドに対して低
減した差別を示す。言い換えれば、本発明の変異体DNA
ポリメラーゼは、対応する非標識ヌクレオチドと比較し
て、フルオレセイン型色素標識ヌクレオチドを取り込む
ポリメラーゼの能力を増大させる少なくとも１つの変異
を含む。フルオレセイン型色素で標識されたヌクレオチ
ドに対する低減した差別に加えて、本発明の変異体DNA
ポリメラーゼはまた、フルオレセイン型色素でない他の
蛍光色素で標識されたヌクレオチドに対する低減した差
別、ならびに他の検出可能な部分に対する低減した差別
を示し得る。本発明の変異体DNAポリメラーゼの所定の
実施態様が低減した差別を示す蛍光標識ヌクレオチド
は、特定の蛍光標識、蛍光標識をヌクレオチドに付着さ
せるために使用されるリンカー、蛍光標識上のリンカー
の付着部分、選択される特定のヌクレオチド塩基、およ
びヌクレオチド上のリンカーの付着部位に関して変化し
得る。蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の低減の正確
な程度は、DNAポリメラーゼに導入される特定の変異に
従って変化する。差別の低減の正確な程度はまた、アッ
セイされる特定の蛍光標識ヌクレオチド（例えば、塩
基、色素、またはリンカーにおける変化）に従って変化
する。本発明の変異体DNAポリメラーゼは、だいたい、
蛍光標識ヌクレオチドに対する差別のわずかな低減か
ら、差別の完全な排除（すなわち、変異体酵素は、標識
または非標識ヌクレオチドの取り込み率に関して有意に
違わない）までを示し得る。１つ以上のフルオレセイン
型色素標識ヌクレオチドに対する差別の少なくとも２倍
の低減を有する、本発明の変異体DNAポリメラーゼの実
施態様を使用することが好ましい。 【００３０】所定のDNAポリメラーゼのヌクレオチド標
識相互作用領域は、特定の蛍光標識ヌクレオチドに関し
て定義されることが、分子生物学の当業者により認識さ
れる。蛍光標識ヌクレオチドの構造についての以下のパ
ラメーターの１つ以上における変化は、所定のDNAポリ
メラーゼのヌクレオチド標識相互作用部位を形成するア
ミノ酸残基の同一性を変え得る：（１）塩基の同一性、
（２）ヌクレオチド塩基上の付着部位、（３）塩基を蛍
光色素に結合するリンカーの同一性、および（４）蛍光
色素の同一性。TET(II)・ddCTPに関して定義されるTaqの
ヌクレオチド標識相互作用領域は、アミノ酸残基E520、
A521、L522、R523、E524、A525、H526、P527、I528、V5
29、E530、K531、I532、R536、E537、R573、Q582、N58
3、V586、R587、P589、Q592、R593、R595、D610、T61
2、Q613、E615、R636、D637、T640、F647、V654、D65
5、P656、L657、R659、R660、T664、E681、L682、A68
3、I684、P685、E688、F692、Q754、H784、L817、E82
0、L828、K831、およびE832を含む。R660、T664、およ
びE681の部位は、変異を導入するのに好ましい部位であ
る。TaqDNAポリメラーゼ（および他のDNAポリメラー
ゼ）の３次元構造が周知であり、そしてTET(II)・ddCTP
の３次元構造が高度の確信をもって理解されるのであれ
ば、TET(II)・ddCTPに関する標識ヌクレオチド相互作用
領域を構成するアミノ酸残基の位置は、TET(II)・ddCTP
と他の蛍光標識ヌクレオチドとの間の構造差違を適応さ
せて、他のヌクレオチドに関する標識ヌクレオチド相互
作用部位を定義するように、異なる組のアミノ酸残基に
書き換えられ得る。例えば、塩基、塩基付着部位、およ
び蛍光色素が同じであっても、塩基と蛍光標識と塩基と
の間のリンカーの長さの増加は、標識ヌクレオチド相互
作用部位を形成するアミノ酸残基の同一性を予測可能に
変え得る。本発明のポリメラーゼの多くの実施態様にお
いて、所定の蛍光標識ヌクレオチドに関する標識ヌクレ
オチド相互作用部位を形成するアミノ酸残基の組は、第
２の蛍光標識ヌクレオチドに関して定義されるような標
識ヌクレオチド相互作用部位を形成するアミノ酸残基の
組と重複する。 【００３１】本発明の実施態様は、フルオレセイン型色
素で標識されたヌクレオチドに対して低減した差別を示
す変異体DNAポリメラーゼを含み、ここでフルオレセイ
ン型色素は、アルキニルアミノ型リンカーによりヌクレ
オチド塩基に結合される。フルオレセイン型色素は、エ
ネルギー移動色素の成分としてフルオレセイン型色素部
分を含む、蛍光エネルギー移動色素であり得る。アルキ
ニルアミノ型リンカーを含む蛍光標識ヌクレオチドに対
する低減した差別に加えて、本発明の変異体DNAポリメ
ラーゼはまた、他の型のリンカーを含むヌクレオチドに
対して低減した差別を示し得る。ポリヌクレオチドと蛍
光標識との間の立体障害を最小にするために、プリン
は、通常、７位に標識され、そしてピリミジンは、通
常、５位に標識される。 【００３２】本発明の変異体DNAポリメラーゼは、所定
のDNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域内
のアミノ酸残基位置で差別を低減する１つ以上の変異を
有する。差別を低減する変異は、通常（必ずしもそうで
はないが）置換変異である。いくつかの異なるアミノ酸
残基は、差別を低減する変異を生じるように、親酵素の
所定の位置で置換され得る。ヌクレオチド標識相互作用
領域内の所定の残基位置でのアミノ酸残基は系統的に変
えられて、その結果、どのアミノ酸置換が、目的のフル
オレセイン型色素標識ヌクレオチド色素に対する差別の
低減をもたらすのかを、およびこのような差別の低減の
程度を決定し得る。特定の変異（または変異の組）が差
別を低減する程度は、実施例２に記載のような選択性ア
ッセイにより測定され得る。置換変異は、好ましくは
（必ずしもそうではないが）、親DNAポリメラーゼに存
在するアミノ酸残基のアミノ酸残基側鎖の大きさを低減
する変異である。変異は、好ましくは（必ずしもそうで
はないが）、親分子の類似の位置でのアミノ酸残基の特
定の極性または非極性特徴を維持するように保存的であ
る。DNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域
における変異は、好ましくは、親酵素のアミノ酸残基の
ファージT7DNAポリメラーゼの対応する位置でのアミノ
酸残基での置換をもたらす（ただし、T7ポリメラーゼお
よび親酵素におけるその位置でのアミノ酸残基間の差違
は存在する）。 【００３３】差別を低減する変異は、DNAポリメラーゼ
のヌクレオチド標識相互作用領域にある。ヌクレオチド
標識相互作用領域は、DNAポリメラーゼの３つの領域の
部分により形成される。これらの３つの領域は、TaqDNA
ポリメラーゼの(ｉ)O-ヘリックス、(ii)Kヘリックス、
および(iii)O-Pヘリックス間ループ、または他のDNAポ
リメラーゼにおける類似の位置に位置する。ヌクレオチ
ド標識相互作用領域を形成するTaqDNAポリメラーゼにお
ける位置は、位置E520、A521、L522、R523、E524、A52
5、H526、P527、I528、V529、E530、K531、I532、R53
6、E537、R573、Q582、N583、V586、R587、P589、Q59
2、R593、R595、D610、T612、Q613、E615、R636、D63
7、T640、F647、V654、D655、P656、L657、R659、R66
0、T664、E681、L682、A683、I684、P685、E688、F69
2、Q754、H784、L817、E820、L828、K831、およびE832
である。Taq以外のDNAポリメラーゼにおける類似の位置
もまた、ヌクレオチド標識相互作用領域に由来する。置
換変異に好ましい位置は、R595、D655、R660、およびE6
81である。変異に特に好ましい位置はE681であり、681
位での好ましい置換はＭである。E681での他の適切な置
換変異は以下の通りである（おおよそ同等であることを
示す＝により示す場合を除いて、優先度が減る順番に列
挙される）：Ｍ＞Ｉ＞Ｗ＞Ｌ＞Ｖ＞Ｐ＞Ｈ＝Ｋ＝Ｇ＝Ｔ
＝Ｓ＞Ｄ＝Ａ＝Ｎ＞Ｙ＝Ｃ。R660位での好ましい置換変
異はR660Dである。 【００３４】ヌクレオチド相互作用領域を形成する特定
のアミノ酸残基は、差別を低減する変異の導入のために
親酵素として選択される特定のDNAポリメラーゼに従っ
て変化する。異なるDNAポリメラーゼ間の類似のアミノ
酸残基位置の決定は、多数のDNAポリメラーゼのアミノ
酸配列が決定されており、そして多くの相同性領域が、
これらの異なるDNAポリメラーゼ間で見出されているの
で、当業者により容易に達成され得る。例えば、広範な
生物に由来するDNAポリメラーゼのアミノ酸配列の大規
模な編集、およびこの配列間の相同性整列は、Braithwa
iteおよびIto,Nucl.AcidsRes.21(4):787-802(1993)にお
いて見出され得る。ファージT7ポリメラーゼおよびE.co
li DNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域内
のアミノ酸残基の例は、表１に提供される。Taq、T7、
およびE.coliDNAポリメラーゼIにおいて、フルオレセイ
ン型色素に対する差別が低減した変異体DNAポリメラー
ゼを提供することに加えて、本発明は、多くの他の生物
に由来する変異体DNAポリメラーゼを提供する。一般的
に、本発明の教示は、Taqポリメラーゼにおける位置E52
0、A521、L522、R523、E524、A525、H526、P527、I52
8、V529、E530、K531、I532、E537、R573、V586、R58
7、P589、Q592、R593、R595、D610、T612、Q613、E61
5、R636、T640、F647、V654、D655、P656、L657、R65
9、R660、T664、E681、L682、A683、I684、P685、E68
8、F692、Q754、L817、E820、L828、K831、およびE832
と類似する、DNAポリメラーゼにおける１つ以上のアミ
ノ酸残基位置を当業者が同定するのを可能にするのに十
分な、TaqDNAポリメラーゼに対するアミノ酸配列相同性
を共有する任意のDNAポリメラーゼに由来する、フルオ
レセイン型色素に対する差別が低減した変異体DNAポリ
メラーゼを生成するために使用され得る。ヌクレオチド
標識相互作用領域において差別を低減する変異を含むよ
うに改変され得る親DNAポリメラーゼは、Thermusflavu
s、Pyrococcus furiosus、Thermotoga neapolitana、Th
ermococcus litoralis、Sulfolobussolfataricus、Ther
matoga maritima、E.coliファージT5、およびE.coliフ
ァージTのような生物に由来するDNAポリメラーゼを含む
が、それらに限定されない。DNAポリメラーゼは耐熱性
でもよく、または耐熱性でなくてもよい。本発明によ
り、当業者は、フルオレセイン型色素差別を低減する変
異を、広範な種々の生物に由来するDNAポリメラーゼ
（提供される本願の出願時に単離されていなかったDNA
ポリメラーゼを含む）に導入し得ることが認識される。
さらに、本発明の実施態様は、蛍光標識ヌクレオチドに
対する所望の低い程度の差別を有する、いくつかの精製
された天然に生じるDNAポリメラーゼを含む。このよう
な天然に生じるDNAポリメラーゼは、構造的および機能
的に、本明細書中に明白に記載された変異体DNAポリメ
ラーゼと類似する。 【００３５】所定のDNAポリメラーゼのヌクレオチド標
識相互作用領域を構成するアミノ酸残基は、ヌクレオチ
ド標識相互作用領域を定義するために使用される特定の
蛍光標識ヌクレオチドに従って変化する。同様に、差別
を低減する変異である変異は、標識ヌクレオチド相互作
用領域を定義するために使用される特定の蛍光標識ヌク
レオチドに従って変化し得る。さらに、標識ヌクレオチ
ド相互作用部位における変異により達成される差別低減
の程度は、目的の特定の標識ヌクレオチドにより変化し
得る。例えば、E681Mは、差別の47倍の低減および第２
の蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の有意に低い低減
をもたらす、TET(II)・ddCTPに関してTaqにおいて差別を
低減する好ましい変異である。反対に、E681T変異は、
第２の蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の高レベルの
低減、およびTET(II)・ddCTPに対する差別の単に低レベ
ルの低減をもたらし得る。 【００３６】本発明の変異体DNAポリメラーゼが、特定
の蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の有意な程度の低
減をもたらし、そして別の蛍光標識ヌクレオチドに対す
る差別の低減の程度においてほとんどまたは全く低減を
もたらさない、ヌクレオチド標識相互作用領域における
差別を低減する変異を有し得るのであれば（親DNAポリ
メラーゼによるその蛍光標識ヌクレオチドに対する有意
な差別があると仮定する）、所定の変異体DNAポリメラ
ーゼは、１つ以上の所定の蛍光標識ヌクレオチドに関し
て「受容性である」と言われ得る。特定の変異体DNAポ
リメラーゼは、目的の特定の酵素のヌクレオチド標識相
互作用部位における差別を低減する変異が、所定の蛍光
標識ヌクレオチドに対する差別の少なくとも５倍の低減
をもたらす場合、特定の蛍光標識ヌクレオチドに関して
「受容性である」と言われる。本発明の変異体DNAポリ
メラーゼは、１を超える蛍光標識ヌクレオチドに関して
受容性であり得る。反対に、特定の蛍光標識ヌクレオチ
ドは、本発明の所定の変異体DNAポリメラーゼに関して
「受容性であり」得る。 【００３７】ヌクレオチド標識相互作用領域において差
別を低減する１を超える変異を含む、本発明の変異体DN
Aポリメラーゼの実施態様において、変異部位は、ヌク
レオチド標識相互作用領域を形成するポリメラーゼの３
つの領域の同じ領域または異なる領域にあり得る。一般
的に、本発明の変異体DNAポリメラーゼは、差別を低減
する、１、２、または３つの変異を有する。しかし、本
発明はまた、差別を低減する３を超える変異を有する変
異体DNAポリメラーゼを提供する。差別を低減する複数
の変異を組み合せることにより、標識ヌクレオチド差別
のより大きな低減レベルが達成され得る。しかし、本発
明の多くの実施態様において、変異体DNAポリメラーゼ
は、ヌクレオチド標識相互作用領域において単一の差別
低減変異を有するDNAポリメラーゼのレベルと同じかま
たはより少ない、低減した標識ヌクレオチド差別のレベ
ルを有する。TaqDNAポリメラーゼ背景における好ましい
変異の組み合わせは、R660D、E681G、およびF667Yであ
る（すなわち、Taq DNAポリメラーゼ変異体(R660D、E68
1G、およびF667Y)）。 【００３８】ヌクレオチド標識相互作用領域において変
異を有するDNAポリメラーゼの異なる実施態様は、特定
の蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の低減の程度に関
して異なる。これらの差違は、どの特定の実施態様が目
的の特定の蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の最も大
きな程度の低減を有するかを決定するためのアッセイに
より測定され得る。一般的に、このようなアッセイは、
プライムされる鋳型上の同じ部位への取り込みについて
の、蛍光標識ヌクレオチドと非標識ヌクレオチドとの間
の競合を測定する。このようなアッセイの１つの例（本
明細書中で「選択性アッセイ」と呼ばれる）は、以下の
実施例２において詳細に記載される。 【００３９】本発明の変異体DNAポリメラーゼは、ヌク
レオチド標識相互作用領域における差別低減変異に加え
て非常に多くの変異を含み得る。これらの２次変異は、
ヌクレオチド標識相互作用領域の内部または外部のいず
れかであり得る。２次変異は、変異体DNAポリメラーゼ
に、ある有用な特性を有するかまたは与えるように選択
され得る。例えば、さらなる変異は、耐熱性を増大させ
る、耐熱性を減少させる、進行(processivity)を増加さ
せる、進行を減少させる、3’-5’エキソヌクレアーゼ
活性を減少させる、3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を
増加させる、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を減少さ
せる、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を増加させる、
そしてジデオキシヌクレオチド取り込みを増加させるた
めに導入され得る。あるいは、２次変異は、本質的に、
既知の効果に何の変化ももたらさないかもしれない。 【００４０】3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を低減す
る１つ以上の２次変異を含む、本発明の変異体DNAポリ
メラーゼの実施態様が特に興味深い。3’-5’エキソヌ
クレアーゼ活性が欠損しているDNAポリメラーゼは、PCR
および鎖終結ポリヌクレオチド配列決定に優れた特性を
有する。DNAポリメラーゼにおいて3’-5’エキソヌクレ
アーゼ活性を低減する変異は、当業者に周知である。
3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を低減する変異を導入
する方法についての詳細な指針は、特に、米国特許第4,
795,699号(Tabor)；米国特許第5,541,099号；米国特許
第5,489,523号；およびBernadら,Cell59:219-228(1989)
において見出され得る。Taq DNAポリメラーゼにおける
このような変異の例は、G46Dを含む。配列決定のために
使用される変異体DNAポリメラーゼの実施態様につい
て、ヌクレオチド標識相互作用領域における変異に加え
て、G46D（またはTaq以外のDNAポリメラーゼにおける類
似の変異）を含むことが好ましい。 【００４１】本発明のDNAポリメラーゼ変異体における
２次変異のうち、ジデオキシヌクレオチド取り込みを増
大させる（すなわち、デオキシヌクレオチドとは対照的
に、ジデオキシヌクレオチドを差別するDNAポリメラー
ゼの能力を低減する）変異もまた興味深い。このような
変異を作製することについての指針は、特に、公開され
たPCT出願WO96/12042（出願番号PCT/US95/12928）に見
出され得る。Taqにおける変異F667Yおよび他のDNAポリ
メラーゼにおける類似の変異が特に興味深い。F667Y
は、Tet(II)・ddLTPに関するTaqDNAポリメラーゼのヌク
レオチド標識相互作用領域の一部分ではないが、一方、
F667Y変異は、フルオレセイン型色素標識ヌクレオチド
に対する差別を低減し得る（表１を参照のこと）。従っ
て、特定の手順（例えば、DNA配列決定）における使用
のために、デオキシヌクレオチドと2’,3’ジデオキシ
ヌクレオチドとの間のポリメラーゼの差別を低減するよ
うに、F667Y変異と、ヌクレオチド標識相互作用領域に
おける差別を低減する１つ以上の変異とを組み合せるこ
とが望ましい。F667Y変異（またはその等価物）を有す
る本発明の変異体DNAポリメラーゼは、蛍光標識2’,3’
ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーターを用い
るサンガー型DNA配列決定に特に有用である。 【００４２】DNAポリメラーゼをコードする非常に多く
の遺伝子が単離および配列決定されている。この配列情
報は、公にアクセス可能なDNA配列データベース（例え
ば、GENBANK）において利用可能である。広範な生物か
らのDNAポリメラーゼのアミノ酸配列の大規模な編集
は、BraithwaiteおよびIto,Nucl.AcidsRes.21(4):787-8
02(1993)に見出され得る。この情報は、本発明のDNAポ
リメラーゼおよびこれらの酵素をコードするポリヌクレ
オチドの種々の実施態様を設計することにおいて使用さ
れ得る。公に利用可能な配列情報はまた、ハイブリダイ
ゼーションプローブを用いた遺伝子ライブラリースクリ
ーニングのような技術によりDNAポリメラーゼをコード
する遺伝子をクローニングするために使用され得る。 【００４３】本発明の他の実施態様は、本明細書中に提
供される変異体DNAポリメラーゼをコードするポリヌク
レオチド配列である。本発明の変異体DNAポリメラーゼ
をコードするポリヌクレオチド配列は、変異体DNAポリ
メラーゼの組換え生成のために使用され得る。蛍光標識
ヌクレオチドに対する差別が低減した変異体DNAポリメ
ラーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、種々の方
法により生成され得る。蛍光標識ヌクレオチドに対する
差別が低減した変異体DNAポリメラーゼをコードするポ
リヌクレオチド配列を生成する好ましい方法は、差別を
低減する所望の変異を、親DNAポリメラーゼ分子をコー
ドするポリヌクレオチドに導入するために部位特異的変
異誘発を使用することによる方法である。部位特異的変
異誘発技術は、米国特許第4,711,848号；米国特許第4,8
73,192号；米国特許第5,071,743号；米国特許第5,284,7
60号；米国特許第5,354,670号；米国特許第5,556,747
号；ZollerおよびSmith,NucleicAcids Res.10:6487-650
0(1982)、ならびにEdelmanらDNA 2:183(1983)により例
示されるように当該分野で周知である。部位特異的変異
誘発についての詳細なプロトコルはまた、多くの一般的
な分子生物学教科書（例えば、Sambrookら、MolecularC
loning a Laboratory Manual第２版,Cold Spring Harbo
r Press,Cold Spring Harbor(1989)、Ausubelら、Curre
ntProtocolsin Molecular Biology(最新版)）に与えら
れる。さらに、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）に関する
多くの教科書（例えば、DiefenbachおよびDveksler,PCR
Primer:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Pres
s,Cold Spring Harbor,NY(1995)）は、指定された変異
を導入するためにPCRを使用する方法を記載する。親DNA
ポリメラーゼをコードする遺伝子は、公に利用可能な配
列情報と共に従来のクローニング技術を使用して単離さ
れ得る。あるいは、DNAポリメラーゼをコードする、多
くのクローニングされたポリヌクレオチド配列は、公に
利用可能な収集サイト(site)に寄託されている（例え
ば、Americantype culture collection寄託物受託番号A
TCC 40336は、Taq DNAポリメラーゼのファージクローン
である）。 【００４４】親DNAポリメラーゼをコードするポリヌク
レオチドへの指定された変異を導入することにより、本
発明の変異体DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレ
オチドを生成することに加えて、主にインビトロDNA合
成技術により本発明のポリヌクレオチドを生成すること
が（難しいが）可能である。インビトロDNA合成技術は
当業者に周知であり、そしてインビトロDNA合成の例
は、米国特許第5,252,530号；米国特許第4,973,679号；
米国特許第5,153,319号；米国特許第4,668,777号；米国
特許第4,500,707号；米国特許第5,132,418号；米国特許
第4,415,732号；米国特許第4,458,066号；および米国特
許第4,811,218号に見出され得る。インビトロDNA合成に
より関連ポリヌクレオチド分子を生成する場合、通常、
より小さな分子が最初に生成され、その後に、ハイブリ
ダイゼーションおよび連結により共に結合される。変異
体DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドはま
た、クローニングされた遺伝子のインビトロ合成および
部位特異的変異誘発の組み合わせにより生成され得る。 【００４５】本発明の変異体DNAポリメラーゼをコード
するポリヌクレオチドは、変異体DNAポリメラーゼの組
換え発現のために使用され得る。一般的に、変異体DNA
ポリメラーゼの組換え発現は、変異体DNAポリメラーゼ
を、特定の型の宿主細胞における使用に適合させた発現
ベクターに導入することによりもたらされる。従って、
本発明の別の局面は、ポリメラーゼをコードするポリヌ
クレオチドが発現ベクターに機能的に挿入されるよう
な、本発明の変異体DNAポリメラーゼをコードするポリ
ヌクレオチドを含む発現ベクターを提供することであ
る。本発明はまた、本発明の発現ベクターを含む宿主細
胞を提供する。組換え発現のための宿主細胞は、原核生
物または真核生物であり得る。宿主細胞の例は、細菌細
胞、酵母細胞、培養された昆虫細胞株、および培養され
た哺乳動物細胞株を含む。好ましくは、組換え宿主細胞
系は、変異体DNAポリメラーゼが由来した生物に密接に
適合するように選択され得る。例えば、原核生物DNAポ
リメラーゼは、好ましくは、原核生物発現系において発
現される。広範な発現ベクターが当該分野で周知であ
る。種々の発現ベクターの説明およびそれらを使用する
方法は、特に、米国特許第5604118号；米国特許第5,58
3,023号；米国特許第5,432,082号；米国特許第5,266,49
0号；米国特許第5,063,158号；米国特許第4,966,841
号；米国特許第4,806,472号；米国特許第4,801,537号；
およびGoedelら、GeneExpression Technology,Methods
of Enzymology,第185巻,Academic Press,SanDiego(198
9)に見出され得る。組換え細胞系におけるDNAポリメラ
ーゼの発現は、十分に確立された技術である。DNAポリ
メラーゼの組換え発現の例は、米国特許第5,602,756
号；米国特許第5,545,552号；米国特許第5,541,311号；
米国法定発明登録H1,531；米国特許第5,500,363号；米
国特許第5,489,523号；米国特許第5,455,170号；米国特
許第5,352,778号；米国特許第5,322,785号；および米国
特許第4,935,361号に見出され得る。 【００４６】本発明の他の実施態様は、ポリヌクレオチ
ド配列決定に特に有用な複数のDNAポリメラーゼ組成物
を含み、このような組成物は、少なくとも２つの異なる
本発明の変異体DNAポリメラーゼを含み、ここで（１）
第１の変異体DNAポリメラーゼは、第１の蛍光標識ヌク
レオチドに関して受容性であり；（２）第２の変異体DN
Aポリメラーゼは、第２の蛍光標識ヌクレオチドに関し
て受容性であり；そして（３）この第１および第２の蛍
光標識ヌクレオチドは、それらのヌクレオチド塩基およ
び蛍光標識に関して互いに異なる。第１および第２の蛍
光標識塩基はまた、リンカー、塩基付着位置、または蛍
光色素付着部位によって互いに関して異なり得る。本発
明の組成物は、蛍光色素標識2’,3’ジデオキシ鎖終結
ヌクレオチドを用いるサンガー型DNA配列決定において
配列決定反応を触媒するのに有用である。蛍光標識ター
ミネーターを用いる鎖終結配列決定は、好ましくは、少
なくとも２つの、そしてより好ましくは４つの異なる蛍
光標識チェーンターミネーターを使用し、ここで各々の
異なる塩基は、特有の蛍光標識で標識される。配列決定
反応に必要とされる異なる蛍光標識チェーンターミネー
ター間の必要な構造差違（すなわち、ヌクレオチド塩基
および蛍光標識）のために、所定の配列決定反応に必要
な蛍光標識ターミネーターの全てに対して受容性である
とは限らない、本発明の多くの変異体DNAポリメラーゼ
がある。従って、配列決定反応の組において使用される
標識ターミネーターの１つ以上に対して望ましくなく高
レベルの差別を有し得る本発明のDNAポリメラーゼの実
施態様がある。２つ以上の変異体ポリメラーゼの本発明
の組成物は、異なる鎖標識ターミネーターに対して受容
性である複数の変異体DNAポリメラーゼを同時に使用す
ることによって、この問題を改善する。それにより、変
異体ポリメラーゼのうちの少なくとも１つにて、配列決
定反応を触媒する他のポリメラーゼによる特定の蛍光標
識ターミネーターに対する差別を「矯正させる」。組成
物における異なるDNAポリメラーゼの比は、好ましく
は、異なる変異体DNAポリメラーゼの各々についてほぼ
等しいレベルの総活性をもたらすように選択される。異
なる変異体ポリメラーゼ間の比活性における差違は、ポ
リメラーゼ間の総活性比を等しくする場合に考慮され得
る。本発明の組成物における種々の変異体DNAポリメラ
ーゼ間の活性レベルにおける差違はまた、本発明の組成
物における異なる蛍光標識ターミネーターのレベルを調
節することにより矯正され得る。本発明の複数のポリメ
ラーゼの組成物は、２、３、４、またはそれより多くの
異なる変異体DNAポリメラーゼを含み得る。変異体ポリ
メラーゼは、同じ種または株に由来してもよいし、由来
しなくてもよい。本発明の変異体ポリメラーゼ組成物に
おける異なる変異DNAポリメラーゼは、配列決定のため
の所定の組の蛍光標識ジデオキシヌクレオチドにおける
１つ以上の蛍光標識ヌクレオチドに受容性でもよく、受
容性でなくてもよい。 【００４７】本発明はまた、本発明の変異体DNAポリメ
ラーゼ（または本発明の複数の変異体DNAポリメラーゼ
組成物）を使用する種々の方法を含む。本発明の変異体
DNAポリメラーゼは、DNAポリメラーゼを使用するほとん
どの手順において対応する親DNAポリメラーゼの代わり
に使用され得る。本発明の変異体DNAポリメラーゼの特
性をより十分に利用するために、本発明の方法において
使用される標識および非標識ヌクレオチドの量（または
濃度）は、従来のDNAポリメラーゼを使用する対応する
方法において使用される量（または濃度）に関して変更
され得る。ヌクレオチド量におけるこれらの変更は、日
常的な実験により最適化され得る。本発明の方法は、プ
ライムされるポリヌクレオチド鋳型を少なくとも１つの
蛍光標識ヌクレオチドを用いて伸長する工程を含み、こ
こで伸長は、本発明の変異体DNAポリメラーゼにより触
媒される。従って、本発明の方法は、プライマー伸長に
より生成された１つ以上の異なる蛍光標識ポリヌクレオ
チドの形成をもたらす。蛍光標識ポリヌクレオチドを合
成する本発明の方法は、種々の手順（サンガー配列決定
（例えば、ジデオキシヌクレオチド鎖終結）、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（PCR）、ポリヌクレオチド標識、微量配
列決定を含むが、それらに限定されない）において使用
され得る。本発明の変異体DNAポリメラーゼの蛍光標識
ヌクレオチド特性に対する低減した差別は、特に、サン
ガーDNA配列決定反応（サイクル配列決定を含む）に有
用である。サンガー配列決定のための本発明の変異体DN
Aポリメラーゼの使用は、配列決定反応に必要とされる
蛍光標識鎖終結ヌクレオチドの量を低減し、そして多く
の場合において、自動化蛍光-塩基配列決定装置（例え
ば、AppliedBiosystems 310または377(Applied Biosyst
ems Division of Perkin-Elmer,FosterCity,CA)）で分
析される単一配列決定反応において同定され得る塩基数
を増加するために使用され得る。サンガー配列決定につ
いての詳細なプロトコルは当業者に公知であり、そして
例えば、Sambrookら、MolecularCloning,A Laboratory
Manual,第２版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring
Harbor,NY(1989)に見出され得る。 【００４８】本発明はまた、蛍光標識ポリヌクレオチド
を合成するためのキットを提供する。キットは、特定の
ポリヌクレオチド合成手順（例えば、DNA配列決定また
はPCR）を行うために適合され得る。本発明のキット
は、本発明の変異体DNAポリメラーゼ、およびキットに
おける変異体DNAポリメラーゼに関して低減した差別を
示す蛍光標識ヌクレオチドを含む。キットは、好ましく
は、キットに適合した手順を行う方法についての詳細な
説明書を含む。必要に応じて、本発明のキットは、キッ
トが、行うために適合した方法を行うために必要とされ
る少なくとも１つの他の試薬をさらに含み得る。このよ
うなさらなる試薬の例は、非標識ヌクレオチド、緩衝
液、クローニングベクター、制限エンドヌクレアーゼ、
配列決定プライマー、および増幅プライマーを含む。本
発明のキットに含まれる試薬は、より大きな精度および
正確さを提供するように予め測定された単位で供給され
得る。 【００４９】本発明の他の実施態様には、（１）複数の
変異体DNAポリメラーゼの本発明の組成物、および
（２）本発明の組成物を用いる使用に適した蛍光標識鎖
終結ヌクレオチド（すなわち、各標識チェーンターミネ
ーターは、組成物における変異体DNAポリメラーゼの少
なくとも１つに関して受容性である）を含むキットが含
まれる。本発明のさらなる実施態様は、本発明の複数の
変異体ポリメラーゼ組成物を含むDNAを配列決定するた
めのキットを含み、そして少なくとも２つの異なる蛍光
標識鎖終結ヌクレオチドは異なる塩基で標識され、ここ
で各々の蛍光標識鎖終結ヌクレオチドは、組成物におけ
る少なくとも１つの変異体DNAポリメラーゼに関して受
容性である。 【００５０】上記で記載してきた本発明は、以下の実施
例への参照によりより良く理解され得る。実施例は、多
くの理由の中でも特に、本発明の特定の実施態様を例示
するために提供され、そして本発明に対する制限として
解釈されるべきではない。 【００５１】 【実施例】実施例１ Taq DNAポリメラーゼの変異体形態の精製 組換え変異体TaqDNAポリメラーゼ生成のために設計され
た組換え構築物を含むE.coli溶解物を、本質的に、tDes
ai,U.J.およびPfaffle,P.K.,Biotechniques,19:780-784
(1995)に記載のように作製した。ポリメラーゼが、溶解
物に夾雑する染色体DNAおよびプラスミドDNAに結合する
のを妨げるために、５MNaClを熱処理した清澄化溶解物
に滴下して、最終NaCl濃度を0.25Mにした。次いで、DNA
を５％ポリエチルイミン（20mM TRIS・Cl(pH8.5)中）の
滴下によりこの混合物から沈殿させて、PEI最終濃度を
0.3％にした。沈殿を、氷上で５分間継続させた。白色
の濁った沈殿物を、４℃で15分間、15,000×gでの遠心
分離により除去した。上清液をデカンテーションし、そ
して取っておいた。遠心分離後、NaCl濃度を、NaClを含
まないTETT（20mMTRIS・Cl、0.1mM EDTA、0.05％ Tween-
20、0.05％ Triton-X100、１％グリセロール、pH8.5）
の添加の間に溶液の伝導率をモニターすることにより0.
13Mに下げた。 【００５２】過剰なPEIを、Bio-Rex70(BIO-RAD,Richmon
d,CA)カラム(2.5×30cm)を用いて除去した。カラムにTE
TT緩衝液＋0.1MNaClを注ぎ、そして平衡化した。ポリメ
ラーゼは、これらの条件下でBio-Rex70に結合しない。 【００５３】夾雑E.coliタンパク質を除去するために、
Bio-Rex70カラム溶出物を、ヘパリン-アガロース(Sigma
Chemical Company,St.Louis,MO)カラム（1.5×30cm）
（これもまたTETT緩衝液＋0.1M NaClを注ぎ、そして平
衡化した）に直接ロードした。ヘパリン-アガロースカ
ラムを、２カラム容量のTETT＋0.1MNaClで洗浄し、そし
てTaq DNAポリメラーゼを、TETT＋１M NaClを用いて鋭
いピークとして溶出した。溶出を280nmでモニターし
た。 【００５４】ピーク吸光度に対応するヘパリン-アガロ
ースカラム画分をプールし、そして遠心分離速度および
時間について製造者の推奨に従ってUltrafree-15Centri
fugal Filter Devices(Millipore Corporation,MA)を用
いて0.15mlまで濃縮した。濃縮物を、TETT緩衝液＋５％
グリセロールで15mlに希釈し、そしてサンプルを0.15ml
まで再濃縮した。これをもう１回繰り返して、タンパク
質サンプル中の最終NaCl濃度を１mM未満に下げた。 【００５５】濃縮ポリメラーゼサンプルをTETT＋５％グ
リセロールを用いて２倍希釈し、そして等容量のTETT＋
95％グリセロールを添加して、最終グリセロール濃度を
約50％にした。サンプルを-20℃で保存した。タンパク
質濃度を、「BradfordProteinAssay」(BIO-RAD,Richmon
d,CA)を用いて決定した。活性を、放射分析アッセイ
（他の所に記載）を用いて測定した。 【００５６】２リットルの誘導E.coli培養液（30〜50ml
の熱処理した清澄化溶解物に相当する）に由来するポリ
メラーゼの代表的な収率は、４〜24mgの範囲であった。
精製サンプルのSDS-PAGE分析は、クマシーブルー染色後
に、分子量約94,000の１つの濃いバンドおよびいくつか
のより微弱なバンドを示した。ゲルは、＞90％の代表的
な精製レベルを示した。 【００５７】実施例２ 選択性アッセイ 非標識対色素標識ターミネーターアッセイ（「ターミネ
ーター」を伸長不可能な塩基（例えば、2’,3’-ddNT
P）と定義する）を使用して、変異体TaqDNAポリメラー
ゼサンプルを、このポリメラーゼのより良好なTet(II)・
ddCTP取り込み変異体形態についてスクリーニングし
た。このアッセイは、ポリメラーゼ濃度のみが律速であ
る定常状態反応の間に同時に、同じ活性部位について競
合する２つの基質に基づく。従って、このアッセイは、
非標識対フルオレセイン標識ターミネーターについての
ポリメラーゼの「選択性」を測定する。このアッセイフ
ォーマットにおいて使用されるDNAプライマー／鋳型を
以下に示す： 5’-＞(FAM)-CCC TCG CAG CCG TCC AAC CAA CTC A GGG AGC GTC GGC AGG TTG GTT GAG TGC CTC TTG TTT<-
5’ プライマーの3’末端に続く次の鋳型位置を、太文字お
よび下線のＧにより上記に示す。 【００５８】反応は以下からなる： 80mM TRIS・Cl（20℃でpH9.0） 1000nM DNAプライマー／鋳型（5’-(FAM)25マー／36G1
鋳型） ２mM MgCl2 50μM TET(II)・ddCTP １μM ddCTP 0.25単位の酵素 40μL反応容量 60℃反応温度 サンプル（２μL）を、予め決定した時間（代表的に、
0.25単位ポリメラーゼ活性／μLについて20秒間隔）で
反応混合物から取り出し、そして氷冷50μL0.5MEDTA（p
H8.0）を添加した。定期的な(timed)アリコートを混合
し、そしてさらなる処理のために氷上で保持した。 【００５９】各時点のサンプルを、過剰な取り込まれな
かったTET(II)・ddCTPを除去するために処理した。代表
的に、1.6μLの各クエンチングしたサンプルを、250μL
の0.8MLiCl＋0.2μg/ml E.coli tRNAに添加し、続いて7
50μLの95％エタノールを添加した。混合後、核酸を、-
20℃で20分間沈殿させた。沈殿物を、標準的な手順を用
いて遠心分離により回収した。上清液を捨て、そしてペ
レットを、50μLの50％ホルムアミドに溶解した。ゲル
サンプルを熱処理し（95℃、２分間）、そしてサンプル
レーンあたり２μLを、16％変性DNA配列決定ゲルにロー
ドした。ゲルを、25マープライマーに相当するバンド、
26マー産物（ddC取り込み事象を示す）、および見かけ
の「27マー」産物のバンド（TET(II)・ddCTP取り込み事
象を示す）におけるFAM蛍光量を測定するために、GeneS
canFragment Analysisソフトウェアを用いてApplied Bi
osystems Model 373 Sequencerにおいて泳動を行った。 【００６０】各バンドにおける蛍光シグナルを合計し、
そしてさらなる計算のために、各バンドにおけるシグナ
ルのパーセントを、レーン毎のローディング差を避ける
ための標準化として使用した。見かけの「27マー」産物
分子に存在する％-FAM部分から、新たに取り込まれた
3’塩基上のTET(II)部分へのエネルギー移動ha、全ての
比を「野生型」またはTaqG46Dと比較したので補正しな
かった。26マーおよび「見かけの」27マー産物のバンド
における標準化された蛍光シグナルを、反応に使用され
た２つの分子の異なる濃度について補正し、そして補正
値を時間に対してプロットした。各基質についての取り
込み速度を、データに対する最小二乗適合(fit)を用い
て決定した。ddC/TET(II)・ddC取り込み速度の比は、サ
ンプルポリメラーゼが非標識対TET(II)標識ヌクレオチ
ドについて示す選択性の偏りと等しく、そして以下の関
係を反映する： 【００６１】 【数１】 【００６２】ここで： vddC＝ddC取り込み速度 vTet(II)・ddC＝Tet(II)・ddC取り込み速度 kcat＝触媒速度定数 KM＝ヌクレオチド平衡結合定数 [ddC]＝反応物におけるddCTP濃度 [Tet(II)・ddC]＝反応物におけるTet(II)・ddCTP濃度 このアッセイフォーマットにおいて、「野生型」Taqま
たは(TaqG46D)は、選択性の偏りすなわち約85：１のddC
/Tet(II)・ddC数を示した。より低い選択性偏り比を示す
変異体をさらなる試験に提示した。以下の表２は、いく
つかの例のために試験されたいくつかの変異体について
の結果を示す： 表２ Taq 選択性数 WT/変異体 G46D 85 85/85すなわち１ G46D；R660D ８ 85/８すなわち約10 G46D；R595E 28 85/28すなわち約３ G46D；F667Y 28 85/28すなわち約３ G46D；E681G 40 85/40すなわち約２ G46D；D655L 40 85/40すなわち約２。 【００６３】実施例３ 次ヌクレオチド速度効果アッセイ 「基底状態」ヌクレオチド結合すなわち初期衝突と正確
な塩基対形成および基転移反応との間のさらなる反応速
度段階は、「次ヌクレオチド速度効果」(Patelら、199
1)と呼ばれるアッセイにおいて、3’-ジデオキシヌクレ
オチドを有する酵素-DNA複合体からのポリメラーゼ解離
速度を遅くすると予期される。このアッセイは、次の正
確なヌクレオチドの非存在下または存在下での、ddTTP
取り込みの定常状態速度（すなわち、酵素が律速であ
る）を測定する。プライマー鋳型対を以下に示す： 5’->(FAM)-CCC TCG CAG CCG TCC AAC CAA CTC A GGG AGC GTC GGC AGG TTG GTT GAG TAG GTC TTG TTT<-
5’ 次の鋳型位置を、太文字下線のＡにより示す。Ａを越え
た次の鋳型位置はＧである。定常状態反応条件下で、本
質的に全ての利用可能なポリメラーゼがプライマー／鋳
型に結合する。ddTTPが溶液中に単独で存在する場合、
これは、その鋳型位置Ａへの結合後に取り込まれる。さ
らなる取り込み事象は、ポリメラーゼが酵素-DNA複合体
から解離することを必要とし、そしてまだ取り込み事象
を受けていない別の利用可能なプライマー／鋳型を見出
す。従って、これらの条件下の取り込み速度は、酵素-D
NA複合体からのポリメラーゼの解離速度である。次の正
確なヌクレオチドdGTPまたはddCTPもまた反応混合物に
存在する場合、酵素・DNA・ddCTP複合体からのポリメラ
ーゼの解離速度は、例えば、ddTTPを取り込んだ基転移
反応と、合成の進行(processive)態様におけるポリメラ
ーゼによってddCTPを取り込む試みとの間でさらなる反
応速度段階がある場合、より遅い。別の正確なヌクレオ
チドの存在にもかかわらず、一旦ddTTPおよびポリメラ
ーゼが進行し得ないと、化学作用は起こり得ないので、
このより遅い解離速度はより遅いddTTPの取り込み速度
として検出され得る。図２に示すように、次の正確なヌ
クレオチドの存在は、確かに、ポリメラーゼの代謝回転
または解離速度を遅くする（TaqG46D；F667Y）。図２は
また、次の正確なヌクレオチド上のフルオレセイン色素
（この場合、Tet(II)・ddCTP）の存在が代謝回転速度を
加速すると思われることを示す。本発明者らは、これ
が、ポリメラーゼが立体配座変化を常に受け、そして次
の正確なヌクレオチドの非存在下でさえ変化を受けよう
と試み得ることを意味すると解釈する。しかし、次の正
確なヌクレオチド上のフルオレセイン色素の存在は、ポ
リメラーゼがこのような変化を受ける能力をブロック
し、それによりddTTP取り込みのための基転移段階後の
酵素の即座の解離を引き起こす。従って、フルオレセイ
ン色素は、基転移反応後の反応速度段階を排除すること
によりポリメラーゼ解離速度を加速すると思われる。 【００６４】図３は、Taq DNAポリメラーゼの「複数
の」変異体形態、TaqG46D；R660D；F667Y；E681Gについ
ての次ヌクレオチド速度効果アッセイの結果を示す。こ
の場合、次の正確なヌクレオチド上のTet(II)の存在
は、変異体ポリメラーゼに対して「明白(transparen
t)」である。本発明者らは、これが、変異体ポリメラー
ゼが、確かに、このポリメラーゼの「野生型」バージョ
ンが受ける基転移後に同じ反応速度段階を受け得ること
を意味すると解釈する。本発明者らはまた、これらの結
果が、F667Y変異がR660DまたはE681G変異とは異なるク
ラスに属することを示すと解釈する。なぜなら、TaqG46
D；F667Yは、「次ヌクレオチド速度効果」アッセイにお
いて「フルオレセイン効果」をなお示すが、多重変異体
Taq G46D；R660D、F667Y；E681Gは示さないからであ
る。 【００６５】次ヌクレオチド速度効果アッセイのための
代表的なアッセイ条件は以下の通りであった： 1000nMプライマー／鋳型DNA 80mM TRIS・Cl（20℃でpH9.0） 2.4mM MgCl2 0.02単位／μLポリメラーゼ活性 400μM各ヌクレオチド（存在する場合） サンプルを採取し、そして「選択性アッセイ」の下で記
載されたのと同じ様式で処理した。この場合、16％ゲル
において得られたフラグメントの移動速度により、ddC
取り込み事象とTet(II)・ddC取り込み事象とを区別する
ことは可能である。ddCの取り込みは、上記で予期され
たように、または25マープライマーより遅く移動する
「正常な」26マーバンドをもたらす。Tet(II)・ddCの取
り込みは、このバンドを27マーまたは28マーに等しい見
かけのサイズに伴って移動させる、より遅い移動をもた
らす。 【００６６】実施例４ さらなる変異体の分析 以下に提供される表１は、いくつかの異なるTaq変異体
を用いて行われた選択性アッセイにより得られた結果の
要旨を提供する。酵素E.coliDNAポリメラーゼIおよびフ
ァージT7 DNAポリメラーゼにおける変異のための類似の
部位もまた示される。用語「FS」は、F667Y変異を有す
るTaq DNAポリメラーゼを言う。 【００６７】参考文献 Barnes,W.M.(1992)、PCRを触媒するTaqポリメラーゼの
忠実度はＮ末端欠失により改善される。Gene112:29-3
5。Brandis,J.W.,Edwards,S.G.およびJohnson,K.A.(199
6)、ホスホジエステル結合形成の遅い速度は、TaqDNAポ
リメラーゼが2’,3’-ジデオキシヌクレオチドターミネ
ーターに対して示す強い偏りを説明する。Biochemistry
35:2189-2200。Desai,U.J.およびPfaffle,P.K.、Esche
richiacoliにおいて発現された耐熱性DNAポリメラーゼ
の一段階精製。Biotechniques 19:780-784。Fersht,A.
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pany,第２版,111-112頁。Johnson,K.A.(1993)、DNAポリ
メラーゼ忠実度における立体配座カップリング。Ann.Re
v.Biochem.62:685-713。Patel,S.S.,Wong,I.およびJohn
son,K.A.(1991)、エキソヌクレアーゼ欠損変異体の完全
な特徴づけを含む、進行DNA複製の前定常状態反応速度
分析。Biochemistry30:511-525。 【００６８】参考としての援用 本願は、本明細書中でそれらの全体が参照される全ての
刊行物、特許、および特許出願を援用する。 【００６９】等価物 本発明は特定の実施態様に関して記載および例示された
が、一方、当業者は、改変および変化が、上文に記載さ
れ、そして以下の請求の範囲に示されるように、本発明
の原理を逸脱することなくなされ得ることを認識する。 【００７０】 【表１】【００７１】 【表２Ａ】【００７２】 【表２Ｂ】【００７３】 【表２Ｃ】【００７４】 【発明の効果】ポリヌクレオチドへの標識ヌクレオチド
に対して低減した差別を示す、変異体DNAポリメラーゼ
が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Taq DNAポリメラーゼに結合したDNAの
コンピューターモデルである。ヌクレオチド標識相互作
用部位を形成するアミノ酸残基は、オレンジ色で強調さ
れる。ポリメラーゼの残部は緑色で示される。鋳型は青
色で示される。標識ヌクレオチドの色素部分は赤色であ
る。標識ヌクレオチドの残部は白色である。 【図２】図２は、次ヌクレオチド効果アッセイ(nextnuc
leotide effect assay)のプロットである。 【図３】図３は、次ヌクレオチド効果アッセイのプロッ
トである。 【図４】図４は、蛍光標識ヌクレオチド「TET(II)・ddCT
P」の構造の図である。
コンピューターモデルである。ヌクレオチド標識相互作
用部位を形成するアミノ酸残基は、オレンジ色で強調さ
れる。ポリメラーゼの残部は緑色で示される。鋳型は青
色で示される。標識ヌクレオチドの色素部分は赤色であ
る。標識ヌクレオチドの残部は白色である。 【図２】図２は、次ヌクレオチド効果アッセイ(nextnuc
leotide effect assay)のプロットである。 【図３】図３は、次ヌクレオチド効果アッセイのプロッ
トである。 【図４】図４は、蛍光標識ヌクレオチド「TET(II)・ddCT
P」の構造の図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 カーチス ブルーム
アメリカ合衆国 カリフォルニア 91709,
チノ ヒルズ， チャレット プレイス
2631
(72)発明者 ジャック リチャーズ
アメリカ合衆国 カリフォルニア 91010,
ブラッドバリー， デオダー レーン
677
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA10 CA02 DA06
HA08
4B050 CC03 DD02 FF04E FF11E
FF14E LL03
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 ヌクレオチド標識相互作用領域において
少なくとも１つの変異を有するDNAポリメラーゼであっ
て、ここで該DNAポリメラーゼは、フルオレセイン型色
素標識ヌクレオチドに対する差別が低減した、DNAポリ
メラーゼ。
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|---|---|---|---|
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| JP2002232167A Withdrawn JP2003144143A (ja) | 1997-03-12 | 2002-08-08 | 改善された標識ヌクレオチド取込み特性を有するｄｎａポリメラーゼ |
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