JP3435416B2

JP3435416B2 - 改善された標識ヌクレオチド取込み特性を有するｄｎａポリメラーゼ

Info

Publication number: JP3435416B2
Application number: JP53989298A
Authority: JP
Inventors: ブランディス，ジョン; ブルーム，カーチス; リチャーズ，ジャック
Original assignee: ピーイーコーポレイション（エヌワイ）; カリフォルニアインスティテュートオブテクノロジー
Priority date: 1997-03-12
Filing date: 1998-03-12
Publication date: 2003-08-11
Anticipated expiration: 2018-03-12
Also published as: WO1998040496A1; EP0983364A1; EP2208789A1; EP2202312A2; US6265193B1; US20060088879A1; US7897738B2; DE69806003T2; AU743025B2; EP0983364B1; US20110244548A1; EP2202312A3; US20130273526A1; US20020164591A1; EP2208789B1; US20100311959A1; CA2283789C; JP2003144143A; EP2202312B1; JP2000510344A

Description

【発明の詳細な説明】発明者:John Brandis、Curtis Bloom、およびJack Rich
ards 発明の分野本発明は、標識ヌクレオチドをポリヌクレオチド分子
へ取り込む酵素の能力を変える変異を有するDNAポリメ
ラーゼに関する。

背景 DNAポリメラーゼは、鋳型DNA鎖および鋳型の一部とア
ニールされる相補合成プライマーを用いて、デオキシヌ
クレオチド３リン酸からのDNA分子の形成を合成する酵
素である。DNAポリメラーゼおよびそれらの酵素学的特
徴の詳細な説明は、Kornberg,DNA Replication第２版,
W.H.Freeman（1989）に見出され得る。

DNAポリメラーゼは、研究および臨床応用の両方に適
切な分子生物学技術において種々の用途を有する。これ
らの技術のうち、DNA配列決定および核酸増幅技術（例
えば、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応））が最も重要であ
る。

多くのDNAポリメラーゼのアミノ酸配列が決定されて
いる。異なるDNAポリメラーゼ間の配列比較により、異
なる酵素間での多くの相同性領域が同定された。Ｘ線回
析研究により、クレノウフラグメント、T7 DNAポリメラ
ーゼ、およびTaq DNAポリメラーゼの３次構造が決定さ
れた。DNAポリメラーゼ３次構造およびアミノ酸配列比
較の研究により、多様なDNAポリメラーゼ間の非常に多
くの構造類似性が明らかになった。一般的に、DNAポリ
メラーゼは、２重鎖DNAの結合を提供すると考えられる
大きな裂け目（cleft）を有する。この裂け目は、２組
のヘリックスにより形成され、第１の組は「指（finge
r）」領域と呼ばれ、そしてヘリックスの第２の組は
「親指（thumb）」領域と呼ばれる。裂け目の底は逆平
行βシートにより形成され、そして「手のひら（pal
m）」領域と呼ばれる。DNAポリメラーゼ構造の概説は、
JoyceおよびSteitz,Ann.Rev.Biochem.63:777−822（199
4）において見出され得る。いくつかのDNAポリメラーゼ
の３次元構造を記載するコンピューターが判読可能なデ
ータファイルは、公に普及している。

蛍光標識ヌクレオチドは、分子生物学における多くの
手順の有用性を非常に単純にし、そして改善した。合成
手順においてポリヌクレオチドを標識するための蛍光標
識ヌクレオチドの使用は、大部分は、放射性標識の使用
に取って代わった。蛍光標識ヌクレオチドは、DNA配列
決定において（Smithら、Nature 321:674−679（1986）
を参照のこと）、PCRおよび他の形態のポリヌクレオチ
ドフラグメント分析において広く使用されている。

蛍光標識ヌクレオチドを使用することに伴う主な問題
は、蛍光標識ヌクレオチドの取込みを差別するDNAポリ
メラーゼの能力である。例えば、本発明者らは、TET
（６−カルボキシ−4,7,2',7'−テトラクロロフルオレ
セイン）標識2',3'ジデオキシヌクレオチドと対応する
非標識ジデオキシヌクレオチドとの間の競合アッセイに
おいて、Taq DNAポリメラーゼが、非標識ジデオキシヌ
クレオチドを、対応する標識ヌクレオチドよりも少なく
とも85倍頻繁に、DNAに取り込むことを発見した。標識
ヌクレオチドと非標識ヌクレオチドとの間のこの差別
は、DNAを標識するためにDNAポリメラーゼを使用する手
順に絶大な影響を有する。例えば、非常に多量の蛍光標
識ヌクレオチドが配列決定反応において使用されなけれ
ばならない。この多量の蛍光標識ヌクレオチドは高価で
あり、そして過度のバックグラウンド蛍光を生じ、それ
により配列情報の収率が低減され得る。

蛍光標識ヌクレオチドの取込みを差別するDNAポリメ
ラーゼの能力から生じる問題を考慮して、本発明者ら
は、１つ以上の蛍光標識ヌクレオチドのDNAへの取込み
に対する差別が低減した、いくつかの新規のDNAポリメ
ラーゼを開発した。

要旨天然に生じるDNAポリメラーゼは、非標識ヌクレオチ
ドを、対応する蛍光標識ヌクレオチドよりも優先的にポ
リヌクレオチドに取り込む。蛍光標識ヌクレオチドを差
別するDNAポリメラーゼのこの能力は、蛍光標識ヌクレ
オチドの酵素的付加を必要とする多くの分子生物学手順
（例えば、標識ジデオキシターミネーター配列決定）に
望ましくない影響を有する。本発明は、ポリヌクレオチ
ドへの蛍光標識ヌクレオチドに対する低減した差別を示
す変異体DNAポリメラーゼに関する。

本発明のDNAポリメラーゼは、変異が蛍光標識ヌクレ
オチドに対する低減した差別をもたらすように、酵素の
ヌクレオチド標識相互作用領域において少なくとも１つ
の変異を有する。DNAポリメラーゼのヌクレオチド標識
相互作用領域は、Taq DNAポリメラーゼのＯ−ヘリック
ス、（ii）Ｋヘリックス、および（iii）Ｏ−Ｐヘリッ
クス間ループの一部、または他のDNAポリメラーゼにお
ける類似の部分により形成される。TET（II）・ddCによ
り定義されるような、ヌクレオチド標識相互作用領域内
のアミノ酸残基は、E520、A531、L522、R523、E524、A5
25、H526、P527、I528、V529、E530、K531、I532、R53
6、E537、R573、Q582、N583、V586、R587、P589、Q59
2、R593、R595、D610、T612、Q613、E615、R636、D63
7、T640、F647、V654、D655、P656、L657、R659、R66
0、T664、E681、L682、A683、I684、P685、E688、F69
2、Q754、H784、L817、E820、L828、K831、およびE832
である。R660、T664、およびE681の部位は、変異を導入
するのに好ましい部位である。フルオレセイン型色素を
用いた使用のための本発明の好ましい実施態様におい
て、変異は681位に存在し、Ｅ（グルタミン酸）をＭ
（メチオニン）に変換する（すなわち、E681M）。フル
オレセイン−フルオレセインエネルギー移動色素を用い
た使用のための本発明の好ましい実施態様において、変
異は657位に存在し、Ｌ（ロイシン）をＧ（グリシン）
に変換する。標識ヌクレオチドに対する差別が低減した
変異体Taq DNAポリメラーゼを提供することに加えて、
本発明は、広範な種々のDNAポリメラーゼ（耐熱性およ
びその他の両方）に由来する変異体を含む。

新規の変異体DNAポリメラーゼを提供することに加え
て、本発明はまた、本発明の変異体DNAポリメラーゼを
コードするポリヌクレオチドを提供する。提供されるポ
リヌクレオチドは、変異体ポリメラーゼの組換え生成の
ための発現ベクターを含み得る。本発明はまた、本発明
のポリメラーゼポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含
む。

本発明はまた、本発明のDNAポリメラーゼを使用する
非常に多くの方法を含む。本発明の方法は、標識ヌクレ
オチドのポリヌクレオチドへの取込みに対する差別が低
減した変異体DNAポリメラーゼにより触媒されるポリヌ
クレオチド合成反応により、蛍光標識ポリヌクレオチド
を合成する工程を含む。ポリヌクレオチド合成の本発明
の方法は、プライムされるポリヌクレオチド鋳型を少な
くとも１つの蛍光標識ヌクレオチドを用いて伸長する工
程を含み、ここで伸長は、ポリヌクレオチドへの標識ヌ
クレオチドに対する差別が低減したDNAポリメラーゼに
より触媒される。蛍光標識ポリヌクレオチドを合成する
本発明の方法は、種々の方法（例えば、サンガー配列決
定およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR））において使用
され得る。

本発明の別の局面は、本発明の方法に従って蛍光標識
ポリヌクレオチドを合成するためのキットを提供するこ
とである。本発明のキットは、本発明の変異体DNAポリ
メラーゼ、およびキット中の変異体DNAポリメラーゼに
関して低減した差別を示す蛍光標識ヌクレオチドを含
む。

図面の簡単な説明図１は、Taq DNAポリメラーゼに結合したDNAのコンピ
ューターモデルである。ヌクレオチド標識相互作用部位
を形成するアミノ酸残基は、オレンジ色で強調される。
ポリメラーゼの残部は緑色で示される。鋳型は青色で示
される。標識ヌクレオチドの色素部分は赤色である。標
識ヌクレオチドの残部は白色である。

図２は、次ヌクレオチド効果アッセイ（next nucleot
ide effect assay）のプロットである。

図３は、次ヌクレオチド効果アッセイのプロットであ
る。

図４は、蛍光標識ヌクレオチド「TET（II）・ddCTP」
の構造の図である。

本発明の特定の実施態様の詳細な説明用語 DNAポリメラーゼ内のアミノ酸残基の位置は、数字ま
たは数字／文字の組み合わせのいずれかにより示され
る。番号付けは、アミノ末端残基から始まる。文字は、
変異体が由来する天然に生じる酵素における示された位
置でのアミノ酸残基についての一文字アミノ酸コードで
ある。特に他に示さなければ、アミノ酸残基の位置の名
称は、一文字アミノ酸コードが、Taq DNAポリメラーゼ
における示された位置でのアミノ酸残基に具体的に関係
しているとはいえ、全てのDNAポリメラーゼにおける類
似の位置を言うと解釈されるべきである。

個々の置換変異は、文字／数字／文字の組み合わせの
形態により示される。文字は、アミノ酸残基の一文字コ
ードである。数字は、変異部位のアミノ酸残基の位置を
示す。数字付け系は、アミノ末端残基から始まる。Taq
DNAポリメラーゼにおける残基の数字付けは、米国特許
第5,079,352号（Gelfand）に記載される通りである。異
なるDNAポリメラーゼ間のアミノ酸配列相同性は、対応
する位置が、Taq以外のDNAポリメラーゼのアミノ酸残基
に割り当てられることを可能にする。他に示さなけれ
ば、所定の数字は、Taq DNAポリメラーゼにおける位置
をいう。最初の数字（すなわち、数字の左側の文字）
は、非変異体酵素における示された位置でのアミノ酸残
基を示す。第２の文字は、変異体酵素における同じ位置
でのアミノ酸残基を示す。例えば、用語「R660D」は、6
60位でのアルギニンがアスパラギン酸残基により置換さ
れたことを示す。

本明細書中で使用する用語「差別」は、非標識ヌクレ
オチドを、対応する蛍光標識ヌクレオチドよりも優先的
にDNAに取り込む、DNAポリメラーゼの特性（すなわち、
DNAポリメラーゼが蛍光標識ヌクレオチドを差別するこ
と）をいう。優先的な取り込みは、蛍光標識2',3'ジデ
オキシヌクレオチドおよび対応する非標識2',3'ジデオ
キシヌクレオチドがポリヌクレオチドの同じ部位への取
り込みについて競合するアッセイにおいて測定され得
る。このようなアッセイの例は、以下の実施例２におい
て見出され得る。

本明細書中で使用する用語「低減した差別」は、親酵
素と比較した場合の、変異体DNAポリメラーゼにおける
蛍光標識ヌクレオチド取り込みに対する差別の低減をい
う。差別の低減は、実施例２における選択性アッセイへ
の参照により、またはポリメラーゼの同じ特性の測定を
提供する他のアッセイへの参照により定量的に説明され
得る。選択性アッセイにより測定されるような選択性数
の低減は差別の低減であり、そして選択性数の比により
表され得る。例えば、選択性数８を有する変異体DNAポ
リメラーゼは、選択性数80を有する親DNAポリメラーゼ
と比較した場合、差別の10倍の低減を有する。

用語「親」または「親酵素」は、変異体DNAポリメラ
ーゼと変異体酵素が由来するDNAポリメラーゼとを区別
するために使用される。従って、任意の天然に生じるDN
Aポリメラーゼが親酵素と呼ばれ得る。天然に生じる酵
素に関して変異を有する第１のDNAポリメラーゼもま
た、さらなる変異を有する第２のDNAポリメラーゼに関
して親酵素と呼ばれる。

用語「差別を低減する変異」は、蛍光標識ヌクレオチ
ド取り込みに対して低減した差別をもたらす、DNAポリ
メラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域における変異
をいう。この用語は、蛍光標識ヌクレオチドに対する差
別を低減しない、DNAポリメラーゼにおける変異（ヌク
レオチド標識相互作用領域における変異を含む）と差別
を低減させる変異とを区別するために使用される。

本明細書中で使用する用語「ヌクレオチド」は、特に
他に言及しない限り、天然に生じるヌクレオチドおよび
種々のアナログ（2',3'ジデオキシヌクレオチドを含
む）の両方を広く言うために使用される。

用語「フルオレセイン型色素」は、以下の縮合３環
系：を含むキサンテン色素分子のクラスを言い、ここで広範
な種々の置換が各デオキシ環位置で可能である。特に好
ましいフルオレセイン型色素のサブセットは、4,7−ジ
クロロフルオレセイン（Menchen）を含む。DNA配列決定
法における蛍光標識として使用されるフルオレセイン型
色素の例は、６−カルボキシフルオレセイン（６−FA
M）、５−カルボキシフルオレセイン（５−FAM）、６−
カルボキシ−4,7,2',7'−テトラクロロフルオレセイン
（TET）、６−カルボキシ−4,7,2',4',5',7'−ヘキサク
ロロフルオレセイン（HEX）、５−（および６）カルボ
キシ−4',5'−ジクロロ−2',7'−ジメトキシフルオレセ
イン（JOE）、ならびに５−カルボキシ−2',4',5',7'−
テトラクロロフルオレセイン（ZOE）を含む。しばし
ば、名称−１または−２は、特定の色素の略語の後に置
かれる（例えば、HEX−１）。「−１」および「−２」
（または「Ｉ」および「II」）の名称は、特定の色素の
異性体が使用されることを示す。１異性体および２異性
体は、Ｃ−８カラムおよび15％アセトニトリル/85％0.1
M酢酸トリエチルアンモニウムから35％アセトニトリル/
65％0.1M酢酸トリエチルアンモニウムへの溶出勾配を利
用する逆相クロマトグラフィー分離系における遊離色素
の溶出順序（１異性体は、最初に溶出する異性体であ
る）により定義される。

用語「アルキニルアミノ型リンカー」は、米国特許第
5,047,519号（Hobbs）、米国特許第5,151,507号（Hobb
s）、および1996年８月13日に出願された米国特許出願
第08/696,808号に記載されるような型のアルキニルアミ
ノリンカーを言う。さらなるアルキニルアミノ型リンカ
ーは、1997年４月10日に出願された、米国特許出願第08
/833,855号において記載される。

用語「TET（II）・ddCTP」は、図４に示される構造の
蛍光標識ヌクレオチドを言う。

用語「蛍光エネルギー移動色素」は、２つの色素部分
間の蛍光エネルギー移動を可能にするリンカーにより結
合された色素部分を言う。鎖終結配列決定における使用
のために、リンカーは十分小さく、そしてDNAポリメラ
ーゼが目的の色素で標識されたヌクレオチド３リン酸を
取込むのを可能にするのに適切な形状および方向のリン
カーである。エネルギー移動色素の例は、欧州特許出願
番号EP 0 805 140、米国特許出願第08/642,330号（1996
年３月３日に出願）、および米国特許出願第08/726,462
号（1996年10月４日に出願）において見出され得る。

本明細書中で使用する用語「変異」は、タンパク質の
特定の位置でのアミノ酸残基における変化を言う。アミ
ノ酸残基における変化は、天然に生じるタンパク質に関
して定義される変化である。変異を有するタンパク質
は、「変異体」タンパク質と呼ばれ得る。

発明の実施態様本発明は、蛍光標識ヌクレオチドのポリヌクレオチド
への取り込みを差別するポリメラーゼの能力を低減する
変異を含むDNAポリメラーゼに関する。これらの変異
は、本明細書中で「ヌクレオチド標識相互作用領域」と
呼ばれる、DNAポリメラーゼ分子の領域にある。ヌクレ
オチド標識相互作用領域は、DNAポリメラーゼの３つの
領域の部分により形成される。これらの３つの領域は、
Taq DNAポリメラーゼの（ｉ）Ｏ−ヘリックス、（ii）
Ｋヘリックス、および（iii）Ｏ−Ｐヘリックス間ルー
プ、または他のDNAポリメラーゼにおける類似の位置に
位置する。蛍光標識ヌクレオチドに対する差別を低減し
たDNAポリメラーゼは、2',3'ジデオキシヌクレオチドを
用いる鎖終結DNA配列決定（すなわち、サンガー型配列
決定）に特に有用である。

Taq DNAポリメラーゼおよび蛍光標識ジデオキシヌク
レオチドを用いて行われた酵素反応速度実験（実施例２
および３に記載される）は、Taq DNAポリメラーゼおよ
び他のDNAポリメラーゼが、DNA合成間のヌクレオチド結
合の際に立体配座シフトを受けるという理論を支持す
る。この予測された立体配座シフトは、ヌクレオチドの
核酸塩基にリンカーにより結合された蛍光標識と相互作
用し、それにより蛍光標識されたヌクレオチドに対する
差別をもたらす、１組のアミノ酸残基を示唆する。この
組のアミノ酸残基は、ヌクレオチド標識相互作用領域を
形成する。出願人により提案された蛍光標識ヌクレオチ
ドのDNAポリメラーゼへの結合についての特定の分子モ
デルは、所定のDNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相
互作用領域を形成するアミノ酸残基を予測するために使
用される。DNA合成間のDNAポリメラーゼにおける立体配
座シフトについての出願人のモデルは、ヌクレオチド標
識相互作用領域がどのように決定されたかについての説
明として提供される。このモデルは、蛍光標識ヌクレオ
チドのポリヌクレオチドへの取り込みを差別するDNAポ
リメラーゼの能力を低減する、DNAポリメラーゼにおけ
る変異を作製することに指針を提供する。図１は、どの
ようにDNAおよびTaq DNAポリメラーゼがこのモデルにお
いて相互作用するかを示すコンピューターモデルであ
る。DNAポリメラーゼ−ヌクレオチド相互作用の真の機
構は、ヌクレオチド標識相互作用領域のパラメーターを
決定するために使用されたモデルと同じでも異なって
も、本明細書中に記載の発明の実施可能性を限定しな
い。

本発明の変異体DNAポリメラーゼは、フルオレセイン
型色素で標識されたヌクレオチドに対して低減した差別
を示す。言い換えれば、本発明の変異体DNAポリメラー
ゼは、対応する非標識ヌクレオチドと比較して、フルオ
レセイン型色素標識ヌクレオチドを取り込むポリメラー
ゼの能力を増大させる少なくとも１つの変異を含む。フ
ルオレセイン型色素で標識されたヌクレオチドに対する
低減した差別に加えて、本発明の変異体DNAポリメラー
ゼはまた、フルオレセイン型色素でない他の蛍光色素で
標識されたヌクレオチドに対する低減した差別、ならび
に他の検出可能な部分に対する低減した差別を示し得
る。本発明の変異体DNAポリメラーゼの所定の実施態様
が低減した差別を示す蛍光標識ヌクレオチドは、特定の
蛍光標識、蛍光標識をヌクレオチドに付着させるために
使用されるリンカー、蛍光標識上のリンカーの付着部
分、選択される特定のヌクレオチド塩基、およびヌクレ
オチド上のリンカーの付着部位に関して変化し得る。蛍
光標識ヌクレオチドに対する差別の低減の正確な程度
は、DNAポリメラーゼに導入される特定の変異に従って
変化する。差別の低減の正確な程度はまた、アッセイさ
れる特定の蛍光標識ヌクレオチド（例えば、塩基、色
素、またはリンカーにおける変化）に従って変化する。
本発明の変異体DNAポリメラーゼは、だいたい、蛍光標
識ヌクレオチドに対する差別のわずかな低減から、差別
の完全な排除（すなわち、変異体酵素は、標識または非
標識ヌクレオチドの取り込み率に関して有意に違わな
い）までを示し得る。１つ以上のフルオレセイン型色素
標識ヌクレオチドに対する差別の少なくとも２倍の低減
を有する、本発明の変異体DNAポリメラーゼの実施態様
を使用することが好ましい。

所定のDNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用
領域は、特定の蛍光標識ヌクレオチドに関して定義され
ることが、分子生物学の当業者により認識される。蛍光
標識ヌクレオチドの構造についての以下のパラメーター
の１つ以上における変化は、所定のDNAポリメラーゼの
ヌクレオチド標識相互作用部位を形成するアミノ酸残基
の同一性を変え得る：（１）塩基の同一性、（２）ヌク
レオチド塩基上の付着部位、（３）塩基を蛍光色素に結
合するリンカーの同一性、および（４）蛍光色素の同一
性。TET（II）・ddCTPに関して定義されるTaqのヌクレ
オチド標識相互作用領域は、アミノ酸残基E520、A531、
L522、R523、E524、A525、H526、P527、I528、V529、E5
30、K531、I532、R536、E537、R573、Q582、N583、V58
6、R587、P589、Q592、R593、R595、D610、T612、Q61
3、E615、R636、D637、T640、F647、V654、D655、P65
6、L657、R659、R660、T664、E681、L682、A683、I68
4、P685、E688、F692、Q754、H784、L817、E820、L82
8、K831、およびE832を含む。R660、T664、およびE681
の部位は、変異を導入するのに好ましい部位である。Ta
q DNAポリメラーゼ（および他のDNAポリメラーゼ）の３
次元構造が周知であり、そしてTET（II）・ddCTPの３次
元構造が高度の確信をもって理解されるのであれば、TE
T（II）・ddCTPに関する標識ヌクレオチド相互作用領域
を構成するアミノ酸残基の位置は、TET（II）・ddCTPと
他の蛍光標識ヌクレオチドとの間の構造差違を適応させ
て、他のヌクレオチドに関する標識ヌクレオチド相互作
用部位を定義するように、異なる組のアミノ酸残基に書
き換えられ得る。例えば、塩基、塩基付着部位、および
蛍光色素が同じであっても、塩基と蛍光標識と塩基との
間のリンカーの長さの増加は、標識ヌクレオチド相互作
用部位を形成するアミノ酸残基の同一性を予測可能に変
え得る。本発明のポリメラーゼの多くの実施態様におい
て、所定の蛍光標識ヌクレオチドに関する標識ヌクレオ
チド相互作用部位を形成するアミノ酸残基の組は、第２
の蛍光標識ヌクレオチドに関して定義されるような標識
ヌクレオチド相互作用部位を形成するアミノ酸残基の組
と重複する。

本発明の実施態様は、フルオレセイン型色素で標識さ
れたヌクレオチドに対して低減した差別を示す変異体DN
Aポリメラーゼを含み、ここでフルオレセイン型色素
は、アルキニルアミン型リンカーによりヌクレオチド塩
基に結合される。フルオレセイン型色素は、エネルギー
移動色素の成分としてフルオレセイン型色素部分を含
む、蛍光エネルギー移動色素であり得る。アルキニルア
ミノ型リンカーを含む蛍光標識ヌクレオチドに対する低
減した差別に加えて、本発明の変異体DNAポリメラーゼ
はまた、他の型のリンカーを含むヌクレオチドに対して
低減した差別を示し得る。ポリヌクレオチドと蛍光標識
との間の立体障害を最小にするために、プリンは、通
常、７位に標識され、そしてピリミジンは、通常、５位
に標識される。

本発明の変異体DNAポリメラーゼは、所定のDNAポリメ
ラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域内のアミノ酸残
基位置で差別を低減する１つ以上の変異を有する。差別
を低減する変異は、通常（必ずしもそうではないが）置
換変異である。いくつかの異なるアミノ酸残基は、差別
を低減する変異を生じるように、親酵素を所定の位置で
変換され得る。ヌクレオチド標識相互作用領域内の所定
の残基位置でのアミノ酸残基は系統的に変えられて、そ
の結果、どのアミノ酸置換が、目的のフルオレセイン型
色素標識ヌクレオチド色素に対する差別の低減をもたら
すのかを、およびこのような差別の低減の程度を決定し
得る。特定の変異（または変異の組）が差別を低減する
程度は、実施例２に記載のような選択性アッセイにより
測定され得る。置換変異は、好ましくは（必ずしもそう
ではないが）、親DNAポリメラーゼに存在するアミノ酸
残基のアミノ酸残基側鎖の大きさを低減する変異であ
る。変異は、好ましくは（必ずしもそうではないが）、
親分子の類似の位置でのアミノ酸残基の特定の極性また
は非極性特徴を維持するように保存的である。DNAポリ
メラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域における変異
は、好ましくは、親酵素のアミノ酸残基のファージT7 D
NAポリメラーゼの対応する位置でのアミノ酸残基での置
換をもたらす（ただし、T7ポリメラーゼおよび親酵素に
おけるその位置でのアミノ酸残基間の差違は存在す
る）。

差別を低減する変異は、DNAポリメラーゼのヌクレオ
チド標識相互作用領域にある。ヌクレオチド標識相互作
用領域は、DNAポリメラーゼの３つの領域の部分により
形成される。これらの３つの領域は、Taq DNAポリメラ
ーゼの（ｉ）Ｏ−ヘリックス、（ii）Ｋヘリックス、お
よび（iii）Ｏ−Ｐヘリックス間ループ、または他のDNA
ポリメラーゼにおける類似の位置に位置する。ヌクレオ
チド標識相互作用領域を形成するTaq DNAポリメラーゼ
における位置は、位置E520、A531、L522、R523、E524、
A525、H526、P527、I528、V529、E530、K531、I532、R5
36、E537、R573、Q582、N583、V586、R587、P589、Q59
2、R593、R595、D610、T612、Q613、E615、R636、D63
7、T640、F647、V654、D655、P656、L657、R659、R66
0、T664、E681、L682、A683、I684、P685、E688、F69
2、Q754、H784、L817、E820、L828、K831、およびE832
である。Taq以外のDNAポリメラーゼにおける類似の位置
もまた、ヌクレオチド標識相互作用領域に由来する。置
換変異に好ましい位置は、R595、D655、R660、およびE6
81である。変異に特に好ましい位置はE681であり、681
位での好ましい置換はＭである。E681での他の適切な置
換変異は以下の通りである（おおよそ同等であることを
示す＝により示す場合を除いて、優先度が減る順番に列
挙される）:M＞Ｉ＞Ｗ＞Ｌ＞Ｖ＞Ｐ＞Ｈ＝Ｋ＝Ｇ＝Ｔ＝
Ｓ＞Ｄ＝Ａ＝Ｎ＞Ｙ＝Ｃ。R660位での好ましい置換変異
はR660Dである。

ヌクレオチド相互作用領域を形成する特定のアミノ酸
残基は、差別を低減する変異の導入のために親酵素とし
て選択される特定のDNAポリメラーゼに従って変化す
る。異なるDNAポリメラーゼ間の類似のアミノ酸残基位
置の決定は、多数のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列が
決定されており、そして多くの相同性領域が、これらの
異なるDNAポリメラーゼ間で見出されているので、当業
者により容易に達成され得る。例えば、広範な生物に由
来するDNAポリメラーゼのアミノ酸配列の大規模な編
集、およびこの配列間の相同性整列は、Braithwaiteお
よびIto,Nucl.Acids Res.21（４）:787−802（1993）に
おいて見出され得る。ファージT7ポリメラーゼおよびE.
coli DNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用領域
内のアミノ酸残基の例は、表１に提供される。Taq、T
7、およびE.coli DNAポリメラーゼＩにおいて、フルオ
レセイン型色素に対する差別が低減した変異体DNAポリ
メラーゼを提供することに加えて、本発明は、多くの他
の生物に由来する変異体DNAポリメラーゼを提供する。
一般的に、本発明の教示は、Taqポリメラーゼにおける
位置E520、A531、L522、R523、E524、A525、H526、P52
7、I528、V529、E530、K531、I532、E537、R573、V58
6、R587、P589、Q592、R593、R595、D610、T612、Q61
3、E615、R636、T640、F647、V654、D655、P656、L65
7、R659、R660、T664、E681、L682、A683、I684、P68
5、E688、F692、Q754、L817、E820、L828、K831、およ
びE832と類似する、DNAポリメラーゼにおける１つ以上
のアミノ酸残基位置を当業者が同定するのを可能にする
のに十分な、Taq DNAポリメラーゼに対するアミノ酸配
列相同性を共有する任意のDNAポリメラーゼに由来す
る、フルオレセイン型色素に対する差別が低減した変異
体DNAポリメラーゼを生成するために使用され得る。ヌ
クレオチド標識相互作用領域において差別を低減する変
異を含むように改変され得る親DNAポリメラーゼは、The
rmus flavus、Pyrococcus furiosus、Thermotoga neapo
litana、Thermococcus litoralis、Sulfolobus solfata
ricus、Thermatoga maritima、E.coliファージT5、およ
びE.coliファージＴのような生物に由来するDNAポリメ
ラーゼを含むが、それらに限定されない。DNAポリメラ
ーゼは耐熱性でもよく、または耐熱性でなくてもよい。
本発明により、当業者は、フルオレセイン型色素差別を
低減する変異を、広範な種々の生物に由来するDNAポリ
メラーゼ（提供される本願の出願時に単離されていなか
ったDNAポリメラーゼを含む）に導入し得ることが認識
される。さらに、本発明の実施態様は、蛍光標識ヌクレ
オチドに対する所望の低い程度の差別を有する、いくつ
かの精製された天然に生じるDNAポリメラーゼを含む。
このような天然に生じるDNAポリメラーゼは、構造的お
よび機能的に、本明細書中に明白に記載された変異体DN
Aポリメラーゼと類似する。

所定のDNAポリメラーゼのヌクレオチド標識相互作用
領域を構成するアミノ酸残基は、ヌクレオチド標識相互
作用領域を定義するために使用される特定の蛍光標識ヌ
クレオチドに従って変化する。同様に、差別を低減する
差異である変異は、標識ヌクレオチド相互作用領域を定
義するために使用される特定の蛍光標識ヌクレオチドに
従って変化し得る。さらに、標識ヌクレオチド相互作用
部位における変異により達成される差別低減の程度は、
目的の特定の標識ヌクレオチドにより変化し得る。例え
ば、E681Mは、差別の47倍の低減および第２の蛍光標識
ヌクレオチドに対する差別の有意に低い低減をもたら
す、TET（II）・ddCTPに関してTaqにおいて差別を低減
する好ましい変異である。反対に、E681T変異は、第２
の蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の高レベルの低
減、およびTET（II）・ddCTPに対する差別の単に低レベ
ルの低減をもたらし得る。

本発明の変異体DNAポリメラーゼが、特定の蛍光標識
ヌクレオチドに対する差別の有意な程度の低減をもたら
し、そして別の蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の低
減の程度においてほとんどまたは全く低減をもたらさな
い、ヌクレオチド標識相互作用領域における差別を低減
する変異を有し得るのであれば（親DNAポリメラーゼに
よるその蛍光標識ヌクレオチドに対する有意な差別があ
ると仮定する）、所定の変異体DNAポリメラーゼは、１
つ以上の所定の蛍光標識ヌクレオチドに関して「受容性
である」と言われ得る。特定の変異体DNAポリメラーゼ
は、目的の特定の酵素のヌクレオチド標識相互作用部位
における差別を低減する変異が、所定の蛍光標識ヌクレ
オチドに対する差別の少なくとも５倍の低減をもたらす
場合、特定の蛍光標識ヌクレオチドに関して「受容性で
ある」と言われる。本発明の変異体DNAポリメラーゼ
は、１を超える蛍光標識ヌクレオチドに関して受容性で
あり得る。反対に、特定の蛍光標識ヌクレオチドは、本
発明の所定の変異体DNAポリメラーゼに関して「受容性
であり」得る。

ヌクレオチド標識相互作用領域において差別を低減す
る１を超える変異を含む、本発明の変異体DNAポリメラ
ーゼの実施態様において、変異部位は、ヌクレオチド標
識相互作用領域を形成するポリメラーゼの３つの領域の
同じ領域または異なる領域にあり得る。一般的に、本発
明の変異体DNAポリメラーゼは、差別を低減する、１、
２、または３つの変異を有する。しかし、本発明はま
た、差別を低減する３を超える変異を有する変異体DNA
ポリメラーゼを提供する。差別を低減する複数の変異を
組み合せることにより、標識ヌクレオチド差別のより大
きな低減レベルが達成され得る。しかし、本発明の多く
の実施態様において、変異体DNAポリメラーゼは、ヌク
レオチド標識相互作用領域において単一の差別低減変異
を有するDNAポリメラーゼのレベルと同じかまたはより
少ない、低減した標識ヌクレオチド差別のレベルを有す
る。Taq DNAポリメラーゼ背景における好ましい変異の
組み合わせは、R660D、E681G、およびF667Yである（す
なわち、Taq DNAポリメラーゼ変異体（R660D、E681G、
およびF667Y））。

ヌクレオチド標識相互作用領域において変異を有する
DNAポリメラーゼの異なる実施態様は、特定の蛍光標識
ヌクレオチドに対する差別の低減の程度に関して異な
る。これらの差違は、どの特定の実施態様が目的の特定
の蛍光標識ヌクレオチドに対する差別の最も大きな程度
の低減を有するかを決定するためのアッセイにより測定
され得る。一般的に、このようなアッセイは、プライム
される鋳型上の同じ部位への取り込みについての、蛍光
標識ヌクレオチドと非標識ヌクレオチドとの間の競合を
測定する。このようなアッセイの１つの例（本明細書中
で「選択性アッセイ」と呼ばれる）は、以下の実施例２
において詳細に記載される。

本発明の変異体DNAポリメラーゼは、ヌクレオチド標
識相互作用領域における差別低減変異に加えて非常に多
くの変異を含み得る。これらの２次変異は、ヌクレオチ
ド標識相互作用領域の内部または外部のいずれかであり
得る。２次変異は、変異体DNAポリメラーゼに、ある有
用な特性を有するかまたは与えるように選択され得る。
例えば、さらなる変異は、耐熱性を増大させる、耐熱性
を減少させる、進行（processivity）を増加させる、進
行を減少させる、3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を減少
させる、3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を増加させる、
5'−3'エキソヌクレアーゼ活性を減少させる、5'−3'エ
キソヌクレアーゼ活性を増加させる、そしてジデオキシ
ヌクレオチド取り込みを増加させるために導入され得
る。あるいは、２次変異は、本質的に、既知の効果に何
の変化ももたらさないかもしれない。

3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を低減する１つ以上の
２次変異を含む、本発明の変異体DNAポリメラーゼの実
施態様が特に興味深い。3'−5'エキソヌクレアーゼ活性
が欠損しているDNAポリメラーゼは、PCRおよび鎖終結ポ
リヌクレオチド配列決定に優れた特性を有する。DNAポ
リメラーゼにおいて3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を低
減する変異は、当業者に周知である。3'−5'エキソヌク
レアーゼ活性を低減する変異を導入する方法についての
詳細な指針は、特に、米国特許第4,795,699号（Tabo
r）；米国特許第5,541,099号；米国特許第5,489,523
号；およびBernadら,Cell 59:219−228（1989）におい
て見出され得る。Taq DNAポリメラーゼにおけるこのよ
うな変異の例は、G46Dを含む。配列決定のために使用さ
れる変異体DNAポリメラーゼの実施態様について、ヌク
レオチド標識相互作用領域における変異に加えて、G46D
（またはTaq以外のDNAポリメラーゼにおける類似の変
異）を含むことが好ましい。

本発明のDNAポリメラーゼ変異体における２次変異の
うち、ジデオキシヌクレオチド取り込みを増大させる
（すなわち、デオキシヌクレオチドとは対照的に、ジデ
オキシヌクレオチドを差別するDNAポリメラーゼの能力
を低減する）変異もまた興味深い。このような変異を作
製することについての指針は、特に、公開されたPCT出
願WO96/12042（出願番号PCT/US95/12928）に見出され得
る。Taqにおける変異F667Yおよび他のDNAポリメラーゼ
における類似の変異が特に興味深い。F667Yは、Tet（I
I）・ddLTPに関するTaq DNAポリメラーゼのヌクレオチ
ド標識相互作用領域の一部分ではないが、一方、F667Y
変異は、フルオレセイン型色素標識ヌクレオチドに対す
る差別を低減し得る（表１を参照のこと）。従って、特
定の手順（例えば、DNA配列決定）における使用のため
に、デオキシヌクレオチドと2',3'ジデオキシヌクレオ
チドとの間のポリメラーゼの差別を低減するように、F6
67Y変異と、ヌクレオチド標識相互作用領域における差
別を低減する１つ以上の変異とを組み合せることが望ま
しい。F667Y変異（またはその等価物）を有する本発明
の変異体DNAポリメラーゼは、蛍光標識2',3'ジデオキシ
ヌクレオチドチェーンターミネーターを用いるサンガー
型DNA配列決定に特に有用である。

DNAポリメラーゼをコードする非常に多くの遺伝子が
単離および配列決定されている。この配列情報は、公に
アクセス可能なDNA配列データベース（例えば、GENBAN
K）において利用可能である。広範な生物からのDNAポリ
メラーゼのアミノ酸配列の大規模な編集は、Braithwait
eおよびIto,Nucl.Acids Res.21（４）:787−802（199
3）に見出され得る。この情報は、本発明のDNAポリメラ
ーゼおよびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド
の種々の実施態様を設計することにおいて使用され得
る。公に利用可能な配列情報はまた、ハイブリダイゼー
ションプローブを用いた遺伝子ライブラリースクリーニ
ングのような技術によりDNAポリメラーゼをコードする
遺伝子をクローニングするために使用され得る。

本発明の他の実施態様は、本明細書中に提供される変
異体DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配
列である。本発明の変異体DNAポリメラーゼをコードす
るポリヌクレオチド配列は、変異体DNAポリメラーゼの
組換え生成のために使用され得る。蛍光標識ヌクレオチ
ドに対する差別が低減した変異体DNAポリメラーゼをコ
ードするポリヌクレオチド配列は、種々の方法により生
成され得る。蛍光標識ヌクレオチドに対する差別が低減
した変異体DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオ
チド配列を生成する好ましい方法は、差別を低減する所
望の変異を、親DNAポリメラーゼ分子をコードするポリ
ヌクレオチドに導入するために部位特異的変異誘発を使
用することによる方法である。部位特異的変異誘発技術
は、米国特許第4,711,848号；米国特許第4,873,192号；
米国特許第5,071,743号；米国特許第5,284,760号；米国
特許第5,354,670号；米国特許第5,556,747号;Zollerお
よびSmith,Nucleic Acids Res.10:6487−6500（198
2）、ならびにEdelmanらDNA 2:183（1983）により例示
されるように当該分野で周知である。部位特異的変異誘
発についての詳細なプロトコルはまた、多くの一般的な
分子生物学教科書（例えば、Sambrookら、Molecular Cl
oning a Laboratory Manual第２版,Cold Spring Harbor
Press,Cold Spring Harbor（1989）、Ausubelら、Curr
ent Protocols in Molecular Biology（最新版））に与
えられる。さらに、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）に関
する多くの教科書（例えば、DiefenbachおよびDveksle
r,PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbo
r Press,Cold Spring Harbor,NY（1995））は、指定さ
れた変異を導入するためにPCRを使用する方法を記載す
る。親DNAポリメラーゼをコードする遺伝子は、公に利
用可能な配列情報と共に従来のクローニング技術を使用
して単離され得る。あるいは、DNAポリメラーゼをコー
ドする、多くのクローニングされたポリヌクレオチド配
列は、公に利用可能な収集サイト（site）に寄託されて
いる（例えば、American type culture collection寄託
物受託番号ATCC 40336は、Taq DNAポリメラーゼのファ
ージクローンである）。

親DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドへ
の指定された変異を導入することにより、本発明の変異
体DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを生
成することに加えて、主にインビトロDNA合成技術によ
り本発明のポリヌクレオチドを生成することが（難しい
が）可能である。インビトロDNA合成技術は当業者に周
知であり、そしてインビトロDNA合成の例は、米国特許
第5,252,530号；米国特許第4,973,679号；米国特許第5,
153,319号；米国特許第4,668,777号；米国特許第4,500,
707号；米国特許第5,132,418号；米国特許第4,415,732
号；米国特許第4,458,066号；および米国特許第4,811,2
18号に見出され得る。インビトロDNA合成により関連ポ
リヌクレオチド分子を生成する場合、通常、より小さな
分子が最初に生成され、その後に、ハイブリダイゼーシ
ョンおよび連結により共に結合される。変異体DNAポリ
メラーゼをコードするポリヌクレオチドはまた、クロー
ニングされた遺伝子のインビトロ合成および部位特異的
変異誘発の組み合わせにより生成され得る。

本発明の変異体DNAポリメラーゼをコードするポリヌ
クレオチドは、変異体DNAポリメラーゼの組換え発現の
ために使用され得る。一般的に、変異体DNAポリメラー
ゼの組換え発現は、変異体DNAポリメラーゼを、特定の
型の宿主細胞における使用に適合させた発現ベクターに
導入することによりもたらされる。従って、本発明の別
の局面は、ポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド
が発現ベクターに機能的に挿入されるような、本発明の
変異体DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド
を含む発現ベクターを提供することである。本発明はま
た、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
組換え発現のための宿主細胞は、原核生物または真核生
物であり得る。宿主細胞の例は、細菌細胞、酵母細胞、
培養された昆虫細胞株、および培養された哺乳動物細胞
株を含む。好ましくは、組換え宿主細胞系は、変異体DN
Aポリメラーゼが由来した生物に密接に適合するように
選択され得る。例えば、原核生物DNAポリメラーゼは、
好ましくは、原核生物発現系において発現される。広範
な発現ベクターが当該分野で周知である。種々の発現ベ
クターの説明およびそれらを使用する方法は、特に、米
国特許第5604118号；米国特許第5,583,023号；米国特許
第5,432,082号；米国特許第5,266,490号；米国特許第5,
063,158号；米国特許第4,966,841号；米国特許第4,806,
472号；米国特許第4,801,537号；およびGoedelら、Gene
Expression Technology,Methods of Enzymology,第185
巻,Academic Press,San Diego（1989）に見出され得
る。組換え細胞系におけるDNAポリメラーゼの発現は、
十分に確立された技術である。DNAポリメラーゼの組換
え発現の例は、米国特許第5,602,756号；米国特許第5,5
45,552号；米国特許第5,541,311号；米国法定発明登録H
1,531;米国特許第5,500,363号；米国特許第5,489,523
号；米国特許第5,455,170号；米国特許第5,352,778号；
米国特許第5,322,785号；および米国特許第4,935,361号
に見出され得る。

本発明の他の実施態様は、ポリヌクレオチド配列決定
に特に有用な複数のDNAポリメラーゼ組成物を含み、こ
のような組成物は、少なくとも２つの異なる本発明の変
異体DNAポリメラーゼを含み、ここで（１）第１の変異
体DNAポリメラーゼは、第１の蛍光標識ヌクレオチドに
関して受容性であり；（２）第２の変異体DNAポリメラ
ーゼは、第２の蛍光標識ヌクレオチドに関して受容性で
あり；そして（３）この第１および第２の蛍光標識ヌク
レオチドは、それらのヌクレオチド塩基および蛍光標識
に関して互いに異なる。第１および第２の蛍光標識塩基
はまた、リンカー、塩基付着位置、または蛍光色素付着
部位によって互いに関して異なり得る。本発明の組成物
は、蛍光色素標識2',3'ジデオキシ鎖終結ヌクレオチド
を用いるサンガー型DNA配列決定において配列決定反応
を触媒するのに有用である。蛍光標識ターミネーターを
用いる鎖終結配列決定は、好ましくは、少なくとも２つ
の、そしてより好ましくは４つの異なる蛍光標識チェー
ンターミネーターを使用し、ここで各々の異なる塩基
は、特有の蛍光標識で標識される。配列決定反応に必要
とされる異なる蛍光標識チェーンターミネーター間の必
要な構造差違（すなわち、ヌクレオチド塩基および蛍光
標識）のために、所定の配列決定反応に必要な蛍光標識
ターミネーターの全てに対して受容性であるとは限らな
い、本発明の多くの変異体DNAポリメラーゼがある。従
って、配列決定反応の組において使用される標識ターミ
ネーターの１つ以上に対して望ましくなく高レベルの差
別を有し得る本発明のDNAポリメラーゼの実施態様があ
る。２つ以上の変異体ポリメラーゼの本発明の組成物
は、異なる鎖標識ターミネーターに対して受容性である
複数の変異体DNAポリメラーゼを同時に使用することに
よって、この問題を改善する。それにより、変異体ポリ
メラーゼのうちの少なくとも１つにて、配列決定反応を
触媒する他のポリメラーゼによる特定の蛍光標識ターミ
ネーターに対する差別を「矯正させる」。組成物におけ
る異なるDNAポリメラーゼの比は、好ましくは、異なる
変異体DNAポリメラーゼの各々についてほぼ等しいレベ
ルの総活性をもたらすように選択される。異なる変異体
ポリメラーゼ間の比活性における差違は、ポリメラーゼ
間の総活性比を等しくする場合に考慮され得る。本発明
の組成物における種々の変異体DNAポリメラーゼ間の活
性レベルにおける差違はまた、本発明の組成物における
異なる蛍光標識ターミネーターのレベルを調節すること
により矯正され得る。本発明の複数のポリメラーゼの組
成物は、２、３、４、またはそれより多くの異なる変異
体DNAポリメラーゼを含み得る。変異体ポリメラーゼ
は、同じ種または株に由来してもよいし、由来しなくて
もよい。本発明の変異体ポリメラーゼ組成物における異
なる変異DNAポリメラーゼは、配列決定のための所定の
組の蛍光標識ジデオキシヌクレオチドにおける１つ以上
の蛍光標識ヌクレオチドに受容性でもよく、受容性でな
くてもよい。

本発明はまた、本発明の変異体DNAポリメラーゼ（ま
たは本発明の複数の変異体DNAポリメラーゼ組成物）を
使用する種々の方法を含む。本発明の変異体DNAポリメ
ラーゼは、DNAポリメラーゼを使用するほとんどの手順
において対応する親DNAポリメラーゼの代わりに使用さ
れ得る。本発明の変異体DNAポリメラーゼの特性をより
十分に利用するために、本発明の方法において使用され
る標識および非標識ヌクレオチドの量（または濃度）
は、従来のDNAポリメラーゼを使用する対応する方法に
おいて使用される量（または濃度）に関して変更され得
る。ヌクレオチド量におけるこれらの変更は、日常的な
実験により最適化され得る。本発明の方法は、プライム
されるポリヌクレオチド鋳型を少なくとも１つの蛍光標
識ヌクレオチドを用いて伸長する工程を含み、ここで伸
長は、本発明の変異体DNAポリメラーゼにより触媒され
る。従って、本発明の方法は、プライマー伸長により生
成された１つ以上の異なる蛍光標識ポリヌクレオチドの
形成をもたらす。蛍光標識ポリヌクレオチドを合成する
本発明の方法は、種々の手順（サンガー配列決定（例え
ば、ジデオキシヌクレオチド鎖終結）、ポリメラーゼ連
鎖反応（PCR）、ポリヌクレオチド標識、微量配列決定
を含むが、それらに限定されない）において使用され得
る。本発明の変異体DNAポリメラーゼの蛍光標識ヌクレ
オチド特性に対する低減した差別は、特に、サンガーDN
A配列決定反応（サイクル配列決定を含む）に有用であ
る。サンガー配列決定のための本発明の変異体DNAポリ
メラーゼの使用は、配列決定反応に必要とされる蛍光標
識鎖終結ヌクレオチドの量を低減し、そして多くの場合
において、自動化蛍光−塩基配列決定装置（例えば、Ap
plied Biosystems 310または377（Applied Biosystems
Division of Perkin−Elmer,Foster City,CA））で分析
される単一配列決定反応において同定され得る塩基数を
増加するために使用され得る。サンガー配列決定につい
ての詳細なプロトコルは当業者に公知であり、そして例
えば、Sambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory M
anual,第２版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring
Harbor,NY（1989）に見出され得る。

本発明はまた、蛍光標識ポリヌクレオチドを合成する
ためのキットを提供する。キットは、特定のポリヌクレ
オチド合成手順（例えば、DNA配列決定またはPCR）を行
うために適合され得る。本発明のキットは、本発明の変
異体DNAポリメラーゼ、およびキットにおける変異体DNA
ポリメラーゼに関して低減した差別を示す蛍光標識ヌク
レオチドを含む。キットは、好ましくは、キットに適合
した手順を行う方法についての詳細な説明書を含む。必
要に応じて、本発明のキットは、キットが、行うために
適合した方法を行うために必要とされる少なくとも１つ
の他の試薬をさらに含み得る。このようなさらなる試薬
の例は、非標識ヌクレオチド、緩衝液、クローニングベ
クター、制限エンドヌクレアーゼ、配列決定プライマ
ー、および増幅プライマーを含む。本発明のキットに含
まれる試薬は、より大きな精度および正確さを提供する
ように予め測定された単位で供給され得る。

本発明の他の実施態様には、（１）複数の変異体DNA
ポリメラーゼの本発明の組成物、および（２）本発明の
組成物を用いる使用に適した蛍光標識鎖終結ヌクレオチ
ド（すなわち、各標識チェーンターミネーターは、組成
物における変異体DNAポリメラーゼの少なくとも１つに
関して受容性である）を含むキットが含まれる。本発明
のさらなる実施態様は、本発明の複数の変異体ポリメラ
ーゼ組成物を含むDNAを配列決定するためのキットを含
み、そして少なくとも２つの異なる蛍光標識鎖終結ヌク
レオチドは異なる塩基で標識され、ここで各々の蛍光標
識鎖終結ヌクレオチドは、組成物における少なくとも１
つの変異体DNAポリメラーゼに関して受容性である。

上記で記載してきた本発明は、以下の実施例への参照
によりより良く理解され得る。実施例は、多くの理由の
中でも特に、本発明の特定の実施態様を例示するために
提供され、そして本発明に対する制限として解釈される
べきではない。

実施例実施例１ Taq DNAポリメラーゼの変異体形態の精製組換え変異体Taq DNAポリメラーゼ生成のために設計
された組換え構築物を含むE.coli溶解物を、本質的に、
tDesai,U.J.およびPfaffle,P.K.,Biotechniques,19:780
−784（1995）に記載のように作製した。ポリメラーゼ
が、溶解物に夾雑する染色体DNAおよびプラスミドDNAに
結合するのを妨げるために、5M NaClを熱処理した清澄
化溶解物に滴下して、最終NaCl濃度を0.25Mにした。次
いで、DNAを５％ポリエチルイミン（20mM TRIS・Cl（pH
8.5）中）の滴下によりこの混合物から沈殿させて、PEI
最終濃度を0.3％にした。沈殿を、氷上で５分間継続さ
せた。白色の濁った沈殿物を、４℃で15分間、15,000×
ｇでの遠心分離により除去した。上清液をデカンテーシ
ョンし、そして取っておいた。遠心分離後、NaCl濃度
を、NaClを含まないTETT（20mM TRIS・Cl、0.1mM EDT
A、0.05％ Tween−20、0.05％ Triton−X100、１％グリ
セロール、pH8.5）の添加の間に溶液の伝導率をモニタ
ーすることにより0.13Mに下げた。

過剰なPEIを、Bio−Rex70（BIO−RAD,Richmond,CA）
カラム（2.5×30cm）を用いて除去した。カラムにTETT
緩衝液＋0.1M NaClを注ぎ、そして平衡化した。ポリメ
ラーゼは、これらの条件下でBio−Rex70に結合しない。

夾雑E.coliタンパク質を除去するために、Bio−Rex70
カラム溶出物を、ヘパリン−アガロース（Sigma Chemic
al Company,St.Louis,MO）カラム（1.5×30cm）（これ
もまたTETT緩衝液＋0.1M NaClを注ぎ、そして平衡化し
た）に直接ロードした。ヘパリン−アガロースカラム
を、２カラム容量のTETT＋0.1M NaClで洗浄し、そしてT
aq DNAポリメラーゼを、TETT＋1M NaClを用いて鋭いピ
ークとして溶出した。溶出を280nmでモニターした。

ピーク吸光度に対応するヘパリン−アガロースカラム
画分をプールし、そして遠心分離速度および時間につい
て製造者の推奨に従ってUltrafree−15 Centrifugal Fi
lter Devices（Millipore Corporation,MA）を用いて0.
15mlまで濃縮した。濃縮物を、TETT緩衝液＋５％グリセ
ロールで15mlに希釈し、そしてサンプルを0.15mlまで再
濃縮した。これをもう１回繰り返して、タンパク質サン
プル中の最終NaCl濃度を1mM未満に下げた。

濃縮ポリメラーゼサンプルをTETT＋５％グリセロール
を用いて２倍希釈し、そして等容量のTETT＋95％グリセ
ロールを添加して、最終グリセロール濃度を約50％にし
た。サンプルを−20℃で保存した。タンパク質濃度を、
「Bradford Protein Assay」（BIO−RAD,Richmond,CA）
を用いて決定した。活性を、放射分析アッセイ（他の所
に記載）を用いて測定した。

２リットルの誘導E.coli培養液（30〜50mlの熱処理し
た清澄化溶解物に相当する）に由来するポリメラーゼの
代表的な収率は、４〜24mgの範囲であった。精製サンプ
ルのSDS−PAGE分析は、クマシーブルー染色後に、分子
量約94,000の１つの濃いバンドおよびいくつかのより微
弱なバンドを示した。ゲルは、＞90％の代表的な精製レ
ベルを示した。

実施例２選択性アッセイ非標識対色素標識ターミネーターアッセイ（「ターミ
ネーター」を伸長不可能な塩基（例えば、2',3'−ddNT
P）と定義する）を使用して、変異体Taq DNAポリメラー
ゼサンプルを、このポリメラーゼのより良好なTet（I
I）・ddCTP取り込み変異体形態についてスクリーニング
した。このアッセイは、ポリメラーゼ濃度のみが律速で
ある定常状態反応の間に同時に、同じ活性部位について
競合する２つの基質に基づく。従って、このアッセイ
は、非標識対フルオレセイン標識ターミネーターについ
てのポリメラーゼの「選択性」を測定する。このアッセ
イフォーマットにおいて使用されるDNAプライマー／鋳
型を以下に示す：プライマーの3'未満に続く次の鋳型位置を、太文字お
よび下線のＧにより上記に示す。

反応は以下からなる： 80mM TRIS・Cl（20℃でpH9.0） 1000nM DNAプライマー／鋳型（5'−（FAM）25マー/36
G₁鋳型） 2mM MgCl₂ 50μM TET（II）・ddCTP １μM ddCTP 0.25単位の酵素 40μＬ反応容量 60℃反応温度サンプル（２μＬ）を、予め決定した時間（代表的
に、0.25単位ポリメラーゼ活性／μＬについて20秒間
隔）で反応混合物から取り出し、そして氷冷50μL 0.5M
EDTA（pH8.0）を添加した。定期的な（timed）アリコ
ートを混合し、そしてさらなる処理のために氷上で保持
した。

各時点のサンプルを、過剰な取り込まれなかったTET
（II）・ddCTPを除去するために処理した。代表的に、
1.6μＬの各クエンチングしたサンプルを、250μＬの0.
8M LiCl＋0.2μg/ml E.coli tRNAに添加し、続いて750
μＬの95％エタノールを添加した。混合後、核酸を、−
20℃で20分間沈殿させた。沈殿物を、標準的な手順を用
いて遠心分離により回収した。上清液を捨て、そしてペ
レットを、50μＬの50％ホルムアミドに溶解した。ゲル
サンプルを熱処理し（95℃、２分間）、そしてサンプル
レーンあたり２μＬを、16％変性DNA配列決定ゲルにロ
ードした。ゲルを、25マープライマーに相当するバン
ド、26マー産物（ddC取り込み事象を示す）、および見
かけの「27マー」産物のバンド（TET（II）・ddCTP取り
込み事象を示す）におけるFAM蛍光量を測定するため
に、GeneScan Fragment Analysisソフトウェアを用いて
Applied Biosystems Model 373 Sequencerにおいて泳動
を行った。

各バンドにおける蛍光シグナルを合計し、そしてさら
なる計算のために、各バンドにおけるシグナルのパーセ
ントを、レーン毎のローディング差を避けるための標準
化として使用した。見かけの「27マー」産物分子に存在
する％−FAM部分から、新たに取り込まれた3'塩基上のT
ET（II）部分へのエネルギー移動ha、全ての比を「野生
型」またはTaq G46Dと比較したので補正しなかった。26
マーおよび「見かけの」27マー産物のバンドにおける標
準化された蛍光シグナルを、反応に使用された２つの分
子の異なる濃度について補正し、そして補正値を時間に
対してプロットした。各基質についての取り込み速度
を、データに対する最小二乗適合（fit）を用いて決定
した。ddC/TET（II）・ddC取り込み速度の比は、サンプ
ルポリメラーゼが非標識対TET（II）標識ヌクレオチド
について示す選択性の偏りと等しく、そして以下の関係
を反映する： v_ddC÷ｖ_Tet・ddC=(k_cat/K_M)_ddC[ddC]÷(k_cat/K_M)_Tet・ddC[Tet(II)・ddC] ここで： v_ddC＝ddC取り込み速度ｖ_{Tet（II）・ddC}＝Tet（II）・ddC取り込み速度 k_cat＝触媒速度定数 K_M＝ヌクレオチド平衡結合定数［ddC］＝反応物におけるddCTP濃度［Tet（II）・ddC］＝反応物におけるTet（II）・ddC
TP濃度このアッセイフォーマットにおいて、「野生型」Taq
または（Taq G46D）は、選択性の偏りすなわち約85:1の
ddC/Tet（II）・ddC数を示した。より低い選択性偏り比
を示す変異体をさらなる試験に提示した。以下の表２
は、いくつかの例のために試験されたいくつかの変異体
についての結果を示す：表２ Taq 選択性数 WT/変異体 G46D 85 85/85すなわち１ G46D;R660D ８ 85/85すなわち約10 G46D;R595E 28 85/28すなわち約３ G46D;RF667Y 28 85/28すなわち約３ G46D;E681G 40 85/40すなわち約２ G46D;D655L 40 85/40すなわち約２実施例次ヌクレオチド速度効果アッセイ「基底状態」ヌクレオチド結合すなわち初期衝突と正
確な塩基対形成および基転移反応との間のさらなる反応
速度段階は、「次ヌクレオチド速度効果」（Patelら、1
991）と呼ばれるアッセイにおいて、3'−ジデオキシヌ
クレオチドを有する酵素−DNA複合体からのポリメラー
ゼ解離速度を遅くすると予期される。このアッセイは、
次の正確なヌクレオチドの非存在下または存在下での、
ddTTP取り込みの定常状態速度（すなわち、酵素が律速
である）を測定する。プライマー鋳型対を以下に示す：次の鋳型位置を、太文字下線のＡにより示す。Ａを越
えた次の鋳型位置はＧである。定常状態反応条件下で、
本質的に全ての利用可能なポリメラーゼがプライマー／
鋳型に結合する。ddTTPが溶液中に単独で存在する場
合、これは、その鋳型位置Ａへの結合後に取り込まれ
る。さらなる取り込み事象は、ポリメラーゼが酵素−DN
A複合体から解離することを必要とし、そしてまだ取り
込み事象を受けていない別の利用可能なプライマー／鋳
型を見出す。従って、これらの条件下の取り込み速度
は、酵素−DNA複合体からのポリメラーゼの解離速度で
ある。次の正確なヌクレオチドdGTPまたはddCTPもまた
反応混合物に存在する場合、酵素・DNA・ddCTP複合体か
らのポリメラーゼの解離速度は、例えば、ddTTPを取り
込んだ基転移反応と、合成の進行（processive）態様に
おけるポリメラーゼによってddCTPを取り込む試みとの
間でさらなる反応速度段階がある場合、より遅い。別の
正確なヌクレオチドの存在にもかかわらず、一旦ddTTP
およびポリメラーゼが進行し得ないと、化学作用は起こ
り得ないので、このより遅い解離速度はより遅いddTTP
の取り込み速度として検出され得る。図２に示すよう
に、次の正確なヌクレオチドの存在は、確かに、ポリメ
ラーゼの代謝回転または解離速度を遅くする（Taq G46
D;F667Y）。図２はまた、次の正確なヌクレオチド上の
フルオレセイン色素（この場合、Tet（II）・ddCTP）の
存在が代謝回転速度を加速すると思われることを示す。
本発明者らは、これが、ポリメラーゼが立体配座変化を
常に受け、そして次の正確なヌクレオチドの非存在下で
さえ変化を受けようと試み得ることを意味すると解釈す
る。しかし、次の正確なヌクレオチド上のフルオレセイ
ン色素の存在は、ポリメラーゼがこのような変化を受け
る能力をブロックし、それによりddTTP取り込みのため
の基転移段階後の酵素の即座の解離を引き起こす。従っ
て、フルオレセイン色素は、基転移反応後の反応速度段
階を排除することによりポリメラーゼ解離速度を加速す
ると思われる。

図３は、Taq DNAポリメラーゼの「複数の」変異体形
態、Taq G46D;R660D;F667Y;E681Gについての次ヌクレオ
チド速度効果アッセイの結果を示す。この場合、次の正
確なヌクレオチド上のTet（II）の存在は、変異体ポリ
メラーゼに対して「明白（transparent）」である。本
発明者らは、これが、変異体ポリメラーゼが、確かに、
このポリメラーゼの「野生型」バージョンが受ける基転
移後に同じ反応速度段階を受け得ることを意味すると解
釈する。本発明者らはまた、これらの結果が、F667Y変
異がR660DまたはE681G変異とは異なるクラスに属するこ
とを示すと解釈する。なぜなら、Taq G46D;F667Yは、
「次ヌクレオチド速度効果」アッセイにおいて「フルオ
レセイン効果」をなお示すが、多重変異体Taq G46D;R66
0D、F667Y;E681Gは示さないからである。

次ヌクレオチド速度効果アッセイのための代表的なア
ッセイ条件は以下の通りであった： 1000nMプライマー／鋳型DNA 80mM TRIS・Cl（20℃でpH9.0） 2.4mM MgCl₂ 0.02単位／μＬポリメラーゼ活性 400μＭ各ヌクレオチド（存在する場合）サンプルを採取し、そして「選択性アッセイ」の下で
記載されたのと同じ様式で処理した。この場合、16％ゲ
ルにおいて得られたフラグメントの移動速度により、dd
C取り込み事象とTet（II）・ddC取り込み事象とを区別
することは可能である。ddCの取り込みは、上記で予期
されたように、または25マープライマーより遅く移動す
る「正常な」26マーバンドをもたらす。Tet（II）・ddC
の取り込みは、このバンドを27マーまたは28マーに等し
い見かけのサイズに伴って移動させる、より遅い移動を
もたらす。

実施例４さらなる変異体の分析以下に提供される表１は、いくつかの異なるTaq変異
体を用いて行われた選択性アッセイにより得られた結果
の要旨を提供する。酵素E.coli DNAポリメラーゼＩおよ
びファージT7 DNAポリメラーゼにおける変異のための類
似の部位もまた示される。用語「FS」は、F667Y変異を
有するTaq DNAポリメラーゼを言う。

参考文献 Barnes,W.M.（1992）、PCRを触媒するTaqポリメラーゼ
の忠実度はＮ末端欠失により改善される。Gene 112:29
−35。

Brandis,J.W.,Edwards,S.G.およびJohnson,K.A.（199
6）、ホスホジエステル結合形成の遅い速度は、Taq DNA
ポリメラーゼが2',3'−ジデオキシヌクレオチドターミ
ネーターに対して示す強い偏りを説明する。Biochemist
ry 35:2189−2200。

Desai,U.J.およびPfaffle,P.K.、Escherichia coliにお
いて発現された耐熱性DNAポリメラーゼの一段階精製。B
iotechniques 19:780−784。

Fersht,A.（1985）、「酵素構造および機能」W.H.Freem
anおよびCompany,第２版,111−112頁。

Johnson,K.A.（1993）、DNAポリメラーゼ忠実度におけ
る立体配座カップリング。Ann.Rev.Biochem.62:685−71
3。

Patel,S.S.,Wong,I.およびJohnson,K.A.（1991）、エキ
ソヌクレアーゼ欠損変異体の完全な特徴づけを含む、進
行DNA複製の前定常状態反応速度分析。Biochemistry 3
0:511−525。

参考としての援用本願は、本明細書中でそれらの全体が参照される全て
の刊行物、特許、および特許出願を援用する。

等価物本発明は特定の実施態様に関して記載および例示され
たが、一方、当業者は、改変および変化が、上文に記載
され、そして以下の請求の範囲に示されるように、本発
明の原理を逸脱することなくなされ得ることを認識す
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 5/00 ＡＣ１２Ｒ 1:01） (72)発明者ブランディス，ジョンアメリカ合衆国カリフォルニア 94547，ハーキュールズ，シェフィールド 106 (72)発明者ブルーム，カーチスアメリカ合衆国カリフォルニア 91709，チノヒルズ，チャレットプレイス 2631 (72)発明者リチャーズ，ジャックアメリカ合衆国カリフォルニア 91010，ブラッドバリー，デオダーレーン 677 (56)参考文献特開平８−205874（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヌクレオチド標識相互作用領域において少
なくとも１つの変異を有するDNAポリメラーゼであっ
て、該変異が、R595、D655、R660およびE681からなる群
より選択されるアミノ酸残基に対応する酵素のセグメン
トであり、ここで、該DNAポリメラーゼの該アミノ酸残
基の位置は、TaqDNAポリメラーゼに関して規定され、そ
して該DNAポリメラーゼは、天然に存在するDNAポリメラ
ーゼに比較して、対応する標識されていないヌクレオチ
ドに対するフルオレセイン型色素標識ヌクレオチドに対
する差別が少なくとも２倍低減した、DNAポリメラー
ゼ。
【請求項２】前記DNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラ
ーゼである、請求項１に記載のDNAポリメラーゼ。
【請求項３】前記変異が、R660D、D655L、E681G、およ
びR595Eからなる群より選択される、請求項２に記載のD
NAポリメラーゼ。
【請求項４】（G46D,R660D,F667Y）、（G46D,R595D,R66
0D,F667Y）、および（G46D,R660D,F667Y,E681G）、およ
び（G46D,F667Y,E681G）からなる群に属する変異の組を
含む、請求項３に記載のDNAポリメラーゼ。
【請求項５】前記DNAポリメラーゼが耐熱性DNAポリメラ
ーゼである、請求項１に記載のDNAポリメラーゼ。
【請求項６】請求項１〜５のいずれか１項に記載のDNA
ポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】プロモーターを有する発現ベクターであっ
て、ここで該ベクターが、該プロモーターと機能的に組
み合せた請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む、ベ
クター。
【請求項８】請求項７に記載の発現ベクターを含む、宿
主細胞。
【請求項９】蛍光標識ポリヌクレオチドを合成する方法
であって、該方法が、請求項１〜５のいずれか１項に記
載のDNAポリメラーゼとプライムされる鋳型とを混合す
る工程を包含する、方法。
【請求項１０】前記プライムされる鋳型が、鎖終結配列
決定反応においてプライムされる鎖型である、請求項９
に記載の方法。
【請求項１１】前記プライムされる鋳型が、ポリメラー
ゼ連鎖反応におけるプライムされる鎖型である、請求項
９に記載の方法。
【請求項１２】ポリヌクレオチドを蛍光標識するための
キットであって、該キットが、請求項１〜５のいずれか
１項に記載のDNAポリメラーゼおよび蛍光標識ヌクレオ
チドを含む、キット。