JPH11137284A - 配列決定のための変更された熱安定性ｄｎａポリメラーゼ - Google Patents

配列決定のための変更された熱安定性ｄｎａポリメラーゼ

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JPH11137284A
JPH11137284A JP10258414A JP25841498A JPH11137284A JP H11137284 A JPH11137284 A JP H11137284A JP 10258414 A JP10258414 A JP 10258414A JP 25841498 A JP25841498 A JP 25841498A JP H11137284 A JPH11137284 A JP H11137284A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 従来の色素−及びフルオレセイン−ラベルさ
れたヌクレオチドの両者を効果的に組込むことができ
る、商業的に利用できる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが
配列決定の精度を高めるために必要である。 【解決手段】 フルオレセイン種類の色素によりラベル
されたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性
を有する鋳型−依存性熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素
を供給することである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、フルオレセイン類
の色素によりラベルされたヌクレオシド三リン酸を組込
むための増強された効率を有する熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼに関する。本発明は、そのような変更されたポリ
メラーゼを単離し、そして生成するための手段を提供す
る。本発明の酵素は、分子生物学における多くの用途の
ために有用であり、そして核酸配列決定のために特に好
都合である。
【０００２】
【従来の技術】螢光色素によりラベルされたヌクレオチ
ド三リン酸（ｄＮＴＰ）の組込みは、多くのインビトロ
ＤＮＡ合成用途のために重要である。たとえば、色素−
ターミネーターＤＮＡ配列決定反応は、終結及びラベリ
ングのために螢光ジデオキシヌクレオチド類似体の組込
みを必要とする。さらに、ラベルされた生成物のインビ
トロ合成は、螢光ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体
の組込みを含むことができる。たとえば、螢光ラベルさ
れたＤＮＡは、固定されたプローブのマイクロアレイを
用いてのハイブリダイゼーションアッセイに使用されて
来た（Ｃｒｏｎｉｎなど., 1996, Human Mutation ７：
244 ）。
【０００３】ＤＮＡ複製の再生を確実にするためには、
ＤＮＡポリメラーゼは、従来のデオキシヌクレオチド三
リン酸（ｄＮＴＰ）として本明細書において言及される
それらの通常の基質の組込みのために、及び螢光色素に
よりラベルされたｄＮＴＰ及びｄＮＴＰ類似体を包含す
る異例なｄＮＴＰの組込みに対して非常に強い偏向を有
する。細胞においては、この性質が、成長するＤＮＡ鎖
において異常な塩基、たとえばｄＵＴＰの組込みを弱め
る。インビトロでは、この特徴は、従来及び異例な螢光
ラベルされたヌクレオチド三リン酸の両者が存在する場
合、たとえば色素−ターミネーターを用いるジデオキシ
鎖終結方法のバージョンを用いてのＤＮＡ配列決定反応
において特に明白である（Ｌｅｅなど., 1992, Acids.
Res. 20: 2471；引用により本明細書に組込まれる）。
【０００４】色素−ターミネーター方法のための市販さ
れているＤＮＡサイクル配列決定キットは、ローダミン
類の螢光色素によりラベルされた鎖ターミネーターｄｄ
ＮＴＰを使用する。しかしながら、ローダミン色素は電
荷において両性であり、そしてそれらの色素によりラベ
ルされたヌクレオシド三リン酸は検出のための配列決定
生成物を分離するために使用される電気泳動ゲルにおい
て異常に移動する。ローダミン類の色素のこの性質が、
電気泳動の前、ｄＩＴＰの使用及び追加の処理段階を包
含する、標準的配列決定プロトコールにおける変更の必
要性を引き起こす。
【０００５】対照的に、負に荷電された螢光色素、たと
えばフルオレセイン類の色素は、１）ラベルされたヌク
レオシド三リン酸とラベルされたプライマー延長生成物
との間の良好な分離、及び２）中性又は正に荷電された
螢光色素よりも、ラベルされた配列決定生成物の良好な
電気泳動移動を可能にする。従って、フルオレセイン類
の色素の使用は、ローダミン類の色素の使用により必要
とされる追加の処理段階のための必要性を回避する。し
かしながら、フルオレセイン類の利用できる色素は、現
在市販されているＤＮＡサイクル配列決定形式への使用
のためには理想的ではない。
【０００６】なぜならば、それらの色素によりラベルさ
れたｄｄＮＴＰは、それらの形式を用いて、配列決定生
成物中に効果的に組込まれないからである。従って、常
用のヌクレオチド及びフルオレセイン−ラベルされたヌ
クレオチドの両者を効果的に組込むことができる、商業
的に利用できる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼについての
必要性が存在する。本発明はその必要性を満たすように
機能する。さらに、本発明の変異酵素の思いがけない性
質は、その対応する野生型酵素に比較してプライマー延
長の早められた速度である。もう１つの思いがけない性
質は、自動化されたＤＮＡ配列分析における種々のター
ミネーターヌクレオチドの組込みの高められた均等性で
ある。
【０００７】
【発明の要約】本発明は、これまでに特徴づけられた酵
素に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルさ
れたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を
有する鋳型−依存性熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を
提供する。それらの酵素は、ヌクレオチド、たとえばデ
オキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、及び塩基類似体、た
とえばジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を組込
み、それらは常用の熱安定性酵素よりもより効果的にフ
ルオレセイン類の色素によりラベルされる。それらの酵
素をコードする遺伝子はまた、多量の精製された酵素を
供給するために組換え発現ベクターとして、本発明によ
り供給される。
【０００８】本発明によれば、天然のヌクレオチドを正
確に組込む能力を保持しながら、フルオレセイン類の色
素によりラベルされたヌクレオチドを組込むポリメラー
ゼの能力に影響を及ぼす、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
内の必須領域が同定される。この必須領域、又は必須モ
チーフ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｍｏｔｉｆ）は、本発明の
利点を供給するために組換えＤＮＡ法、たとえば部位特
異的変異誘発により熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのため
の遺伝子中に導入され得る。従って、１つの観点におい
ては、本発明は組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素
を提供し、ここで前記酵素は、必須のモチーフを生成す
るよう変異誘発されており、そしてその対応する野生型
酵素に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベル
されたヌクレオチドの組込みに対しての低められた識別
性を有するように変異誘発されていることにより特徴づ
けられる。
【０００９】この観点において、本発明は組換え熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を供給し、ここで前記酵素
は、ａ）その生来の形において、前記ポリメラーゼが次
のアミノ酸配列（一文字コードで与えられる）：ＬＳＸ
ＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘ
は任意のアミノ酸である）を含んで成り；ａ）前記配列
における位置４のＸが前記生来の配列に比較して変異誘
発されており、但し、ＸはＥには変異誘発されておら
ず；そしてｃ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、前
記酵素の生来の形に比較して、フルオレセイン類の色素
によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低め
られた識別性を有する、ことにより特徴づけられる。３
文字コードにおいては、前記アミノ酸配列は、ＬｅｕＳ
ｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＸａａＰｒｏＸａａＸａ
ａＧｌｕ（配列番号１）（ここで、この配列中の位置
３，４，６，９及び１０の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸
残基であり、そしてこの配列中の位置７の“Ｘａａ”は
Ｖａｌ又はＩｌｅである）として表わされる。
【００１０】もう１つの態様においては、組換え熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼは、ａ）そのポリメラーゼの生来
の形が次のアミノ酸配列：ＬＳ（Ｑ／Ｇ）ＸＬ（Ｓ／
Ａ）ＩＰＹＥＥ（配列番号２）（ここで、Ｘは任意のア
ミノ酸である）を含んで成り；ｂ）前記配列における位
置４のＸが前記生来の配列に比較して変異されており、
但しＸはＥへは変異誘発されておらず；そしてｃ）前記
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、前記酵素の生来の形に
比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされた
ヌクレオチドの組込みに対する低められた識別性を有す
ることにより特徴づけられる。
【００１１】３文字コードにおいて、前記アミノ酸は、
ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＩｌｅＰｒｏＴ
ｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列番号２）（ここで、位置３の
“Ｘａａ”はＧｌｎ又はＧｌｙであり、位置４の“Ｘａ
ａ”は任意のアミノ酸であり、そして位置６の“Ｘａ
ａ”はＳｅｒ又はＡｌａである）として表わされる。好
ましい態様においては、前記アミノ酸配列は、ＬＳＱＸ
ＬＡＩＰＹＥＥ（配列番号３）（ここでＸは任意のアミ
ノ酸である）である。３文字コードにおいては、このア
ミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＧｌｎＸａａＬｅｕＡｌａ
ＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列番号３）（ここ
で、位置４での“Ｘａａ”は任意のアミノ酸である）と
して表わされる。より好ましい態様においては、位置４
の“Ｘａａ”はＬｙｓである。
【００１２】さらにもう１つの態様において、組換え安
定性ＤＮＡポリメラーゼは、ａ）そのポリメラーゼの生
来形が次のアミノ酸配列：ＬＳＶＸＬＧ（Ｖ／Ｉ）ＰＶ
ＫＥ（配列番号４）を含んで成り；ｂ）前記配列におけ
るＸが前記生来の配列に比較して変異誘発されており、
但しＸはＥに変異誘発されておらず；そしてｃ）前記熱
安定性ＤＮＡポリメラーゼが前記酵素の生来の形に比較
して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌク
レオチドの組込みに対する低められた識別性を有するこ
とにより特徴づけられる。
【００１３】３文字コードにおいては、このアミノ酸配
列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＸａａＰ
ｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号４）（ここで、位置
４での“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、そして位置
７の“Ｘａａ”はＶａｌ又はＩｌｅである）として表わ
される。好ましい態様においては、前記アミノ酸配列
は、ＬＳＶＸＬＧＶＰＶＫＥ（配列番号５）（ここで、
位置４のＸは任意のアミノ酸である）である。３文字コ
ードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶ
ａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＶａｌＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌ
ｕ（配列番号５）（ここで、位置４の“Ｘａａ”は任意
のアミノ酸である）として表わされる。
【００１４】より好ましい態様において、位置４の“Ｘ
ａａ”はＡｒｇである。もう１つの好ましい態様におい
ては、アミノ酸配列は、ＬＳＶＸＬＧＩＰＶＫＥ（配列
番号６）（ここで、位置４のＸは任意のアミノ酸であ
る）である。３文字コードにおいて、このアミノ酸配列
は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＩｌｅＰｒ
ｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号６）（ここで、位置４
の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸である）として表わされ
る。より好ましい態様において、位置４の“Ｘａａ”
は、Ａｒｇである。
【００１５】本発明のもう１つの態様において、本発明
の特定の必須領域は、異例なヌクレオチド、たとえばｒ
ＮＴＰ及びｄｄＮＴＰの組込みに対して低められた識別
性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを供給すること
が知られている、ポリメラーゼ遺伝子の他の領域におけ
るモチーフと組合され得る。本明細書において例示され
る場合、２種の変異を含む組換えサーマス・アクアチカ
ス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）Ｄ
ＮＡポリメラーゼ酵素が構成された。第１の変異は、本
発明の必須モチーフの位置４のＸ残基におけるＥのＫへ
の変異であった。第２の変異は、Ｆ６６７Ｙ変異として
知られているｄｄＮＴＰのより効果的な組込みを可能に
する変異であった。
【００１６】この変異は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
の位置６６７でのフェニルアラニンのチロシンへの変異
である（アメリカ特許第５，６１４，３６５号及びアメ
リカ出願番号第８／４４８，２２３号に記載され、そし
て引用により本明細書に組込まれる）。フルオレセイン
類の色素によりラベルされたｄｄＮＴＰとの配列決定反
応に使用される場合、Ｅ６８１Ｋ Ｆ６６７Ｙ二重変異
体酵素が、読取ることができる配列決定ラダーを生成す
ることが見出された。従って、１つの態様において、ジ
デオキシヌクレオチドに対する低められた識別性を付与
するモチーフが、本発明の決定的モチーフと組合され、
ラベルされた及びラベルされていない両ｄｄＮＴＰの組
込みの高められた効率を有する酵素が提供される。
【００１７】さらに、Ｅ６８１Ｋ Ｆ６６７Ｙ変異体酵
素は、Ｆ６６７Ｙ変異のみを有する酵素に比較して、有
意に早められた延長速度を示すことが思いがけなく見出
された。従って、本発明のもう１つの態様においては、
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素中への必須のモチーフ
の、単独での又は他のモチーフと組合しての導入が、早
められた延長速度を有する酵素を生成する。
【００１８】二重変異体酵素はまた、ローダミンにより
ラベルされたターミネーターを用いての色素−ターミネ
ータージデオキシ配列決定においてより均等なピークの
高さを生成することが思いがけなく見出された。従っ
て、さらにもう１つの態様においては、熱安定性ＤＮＡ
ポリメラーゼ酵素中への必須のモチーフの導入は、ロー
ダミン類の色素によりラベルされたターミネーターを用
いてのＤＮＡ配列決定方法においてより均等なピークの
高さを示す酵素を生成する。
【００１９】もう１つの態様においては、ｒＮＴＰの一
層効果的な組込みを可能にする変異、例えばＴａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼの位置６１５のグルタミン酸からグリ
シンへの変異、又はＥ６１５Ｇ変異（引用により本明細
書に組込まれるヨーロッパ特許出願公開番号ＥＰ−Ａ−
８２３４７９に記載される）が、本発明の必須のモチー
フと組合され、フルオレセイン類の色素によりラベルさ
れたリボヌクレオチドの組込みの高められた効率を有す
る酵素が供給される。
【００２０】もう１つの観点においては、本発明のポリ
メラーゼをコードする遺伝子もまた提供される。特に、
本発明の必須のモチーフを含んで成る組換え熱安定性ポ
リメラーゼをコードする遺伝子が供給される。本発明の
必須のモチーフを生成する変異を包含する複数の変異の
組合せをコードする遺伝子もまた、この観点に包含され
る。
【００２１】さらにもう１つの観点においては、本発明
はまた、より低い濃度のフルオレセイン類の色素により
ラベルされたｄｄＮＴＰの使用を可能にし、それによ
り、反応を実施する費用を減じる、ＤＮＡ配列決定の改
良された方法を提供する。本発明の改良された方法はま
た、低い比のフルオレセイン類の色素によりラベルされ
たｄｄＮＴＰ：ｄＮＴＰの使用を可能にする。それらの
方法の使用は、多くの利点、たとえばより効果的な重
合、低濃度の必要とされる鋳型核酸、及び反応混合物へ
のインヒビターを導入する可能性の低下をもたらす。そ
れらの利点はまた、長い鋳型の配列決定を促進する。本
発明はまた、配列決定反応が、中間の精製を伴わない
で、続く電気泳動のための配列決定ゲル上に直接的に負
荷され得る、改良された配列決定方法を提供する。
【００２２】従って、本発明の１つの態様においては、
本発明は、ａ）本発明の必須のモチーフを生成する位置
４での変異を有し、そしてｂ）対応する野生型酵素に比
較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌ
クレオチドの組込みに対する低められた識別性を有する
組換え酵素を用いての標的核酸の配列を決定するための
改良された方法を提供する。
【００２３】本発明の必須のモチーフを生成する天然に
存在する配列変動を含む、好熱種に由来する熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ酵素を用いての改良された配列決定方
法はまた、本発明の範囲内である。それらの生来の酵素
はまた、異例なヌクレオチドの組込みに対する低められ
た識別性も提供することができる。この態様において、
本発明は、ａ）位置４におけるアミノ酸がＧｌｕではな
い本発明の必須のモチーフを有し、そしてｂ）フルオレ
セイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込
みに対する低められた識別性を有する生来の熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いての改良された配列決定方法を
提供する。
【００２４】フルオレセイン類の色素によりラベルされ
たＤＮＡを生成するための改良された方法もまた、本発
明の範囲内である。本発明の酵素は、種々の部位でフル
オレセイン類の色素によりラベルされる増幅された生成
物を生成するポリメラーゼ連鎖反応方法にフルオレセイ
ン−ラベルされたｄＮＴＰを効果的に組込む。従って、
１つの態様においては、ＤＮＡをラベリングする改良さ
れた方法は、ａ）フルオレセイン類の色素によりラベル
されたｄＮＴＰ及び本発明の酵素を含んで成る反応混合
物を提供し、そしてｂ）核酸増幅反応を実施することを
含んで成る。
【００２５】本発明の方法、及びそれらの酵素をコード
する遺伝子は、本発明の組換え酵素を含んで成り、そし
てさらに、負に荷電された螢光ターミネーター化合物を
含むＤＮＡ配列決定のためのキットである本発明のさら
なる観点を供給する。ＤＮＡ配列決定のための他のキッ
トは、ａ）負に荷電された螢光ターミネーター化合物、
及びｂ）本発明の生来の酵素を含んで成る。本発明はま
た、本発明の組換え酵素を含んで成る、ラベルされたＤ
ＮＡを生成するためのキットも提供する。ラベルされた
ＤＮＡを生成するための他のキットは、ａ）負に荷電さ
れた螢光ヌクレオチド三リン酸化合物、及びｂ）本発明
の生来の酵素を含んで成る。
【００２６】
【発明の実施の形態】本発明の理解を促進するために、
多くの用語が下記に定義される。用語“遺伝子”とは、
回収できる生物活性ポリペプチド又は前駆体の生成のた
めに必要な制御及びコード配列を含んで成るＤＮＡ配列
を意味する。前記ポリペプチドは、完全な長さの遺伝子
配列により、又は酵素活性が保持される限り、コード配
列のいづれかの部分によりコードされ得る。
【００２７】用語“生来の”とは、天然に存在する源か
ら単離される遺伝子又は遺伝子生成物を意味する。この
用語はまた、生来の形のアミノ酸配列と同一のアミノ酸
配列を有する、分子生物学的技法により生成された生来
のタンパク質の組換え形も言及する。用語“変異体”と
は、その核酸配列が変更されている遺伝子、又はそのア
ミノ酸配列が変更されている遺伝子生成物を意味し、そ
れにより、生来の又は野生型遺伝子又は遺伝子生成物に
比較される場合、変更された機能的性質を有する遺伝子
生成物をもたらす。そのような変更は、点変異、欠失及
び挿入を包含する。
【００２８】用語“宿主細胞”とは、単細胞原核及び真
核生物、たとえば細菌、酵母及び放線菌、及び細胞培養
において増殖される場合、高等植物又は動物からの単一
細胞を意味する。用語“発現系”とは、作用可能に連結
されたコード配列及び制御配列を含むＤＮＡ配列を意味
し、その結果、それらの配列により形質転換された宿主
細胞はコードされたタンパク質を生産することができ
る。形質転換をもたらすためには、その発現システムは
ベクター上に包含され得る、そしてその対応するＤＮＡ
もまた、宿主染色体中に組込まれ得る。
【００２９】用語“オリゴヌクレオチド”は、本明細書
において使用される場合、複数の、好ましくは３個より
も多くの、及び通常、１０個よりも多くのデオキシリボ
ヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成される分子
として定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズ
は、多くの要因、たとえばオリゴヌクレオチドの究極的
な機能又は使用に依存するであろう。
【００３０】オリゴヌクレオチドは、たとえば適切な配
列のクローニング及び制限酵素処理を包含するいづれか
適切な方法により、及びたとえば次の方法による直接的
な化学合成により調製され得る：Narangなど., 1979, M
eth. Enzymol. 68：90-99 のホスホトリエステル法；Br
own など., 1979, Meth. Enzymol. 68：109-151 のホス
ホジエステル法；Beaucageなど., 1981, Tetrahedron L
ett. 22 ：1859-1862のジエチルホスホラミジット法；M
atteucci など., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103：3185-
3191 のトリエステル法、又はアメリカ特許第４，４５
８，０６６号の固体支持法（それらは引用により本明細
書に組込まれる）。
【００３１】用語“プライマー”とは、本明細書におい
て使用される場合、プライマー延長が開始される条件下
で配置される場合、合成の開始の点として作用すること
ができる、天然又は合成のいづれかのオリゴヌクレオチ
ドを意味する。プライマーは好ましくは、一本鎖オリゴ
デオキシリボヌクレオチドである。プライマーの適切な
長さは、プライマーの意図された使用に依存するが、し
かし典型的には１５〜３５個のヌクレオチドの範囲であ
る。短いプライマー分子は一般的に、鋳型との十分に安
定したハイブリッド複合体を形成するためには、より低
い温度を必要とする。プライマーは鋳型の正確な配列を
反映する必要はないが、しかし生じるプライマー延長の
ための鋳型とハイブリダイズするために十分に相補的で
あるべきである。
【００３２】プライマーは、所望により、分光学、光化
学、生化学、免疫化学又は化学手段により検出できるラ
ベルを組込むことによってラベルされ得る。たとえば、
有用なラベルは、32Ｐ、螢光色素、電子濃試薬、酵素
（通常、ＥＬＩＳＡアッセイに使用されるような）、ビ
オチン、又は抗血清又はモノクローナル抗体が利用でき
るハプテン及びタンパク質を包含する。
【００３３】用語“熱安定性ポリメラーゼ”とは、熱に
対して安定しており、耐熱性であり、そして二本鎖核酸
の変性をもたらすのに必要な時間、高温にゆだねられる
場合、不可逆的に変性（不活性化）されない酵素を意味
する。核酸変性のために必要な加熱条件は、当業界にお
いてよく知られており、そしてアメリカ特許第４，６８
３，２０２号及び第４，６８３，１９５号（それらは引
用により本明細書に組込まれる）に例示されている。本
明細書において使用される場合、熱安定性ポリメラーゼ
は、温度サイクリング反応、たとえばポリメラーゼ連鎖
反応（“ＰＣＲ”）への使用のために適切である。本発
明の目的のための不可逆的変性とは、酵素活性の永久的
且つ完全な損失を意味する。熱安定性ポリメラーゼのた
めには、酵素活性とは、鋳型核酸鎖に対して相補的であ
るプライマー延長生成物を形成するために適切な態様で
のヌクレオチドの結合の触媒作用を意味する。
【００３４】用語“常用の”又は“天然の”とは、核酸
塩基、ヌクレオシド三リン酸、又はヌクレオチドに関す
る場合、記載されるポリヌクレオチドであって天然で存
在するものを意味する（すなわち、ＤＮＡに関しては、
それらはｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰで
ある）。さらに、ｄＩＴＰ及び７−デアザ−ｄＧＴＰが
時々、ｄＧＴＰの代わりに使用され、そして７−デアザ
−ｄＡＴＰがインビトロＤＮＡ合成反応、たとえば配列
決定においてｄＡＴＰの代わりに使用され得る。集合的
には、それらはｄＮＴＰとして言及され得る。
【００３５】用語“異例な”又は“修飾された”とは、
核酸塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドに関する場
合、特定のポリヌクレオチドにおいて天然で存在する従
来の塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドの修飾、誘導
体化又は類似体を包含する。ウラシルのデオキシリボヌ
クレオチド形は、ＤＮＡ（ｄＵＭＰ）において異例な又
は修飾された塩基であり、そしてウラシルのリボヌクレ
オチド形はＲＮＡ（ＵＭＰ）において従来の塩基であ
る。本明細書で使用される場合、異例なヌクレオチド
は、核酸配列決定のためのターミネーターとして使用さ
れる化合物類を包含するが、但しそれらだけには限定さ
れない。
【００３６】ターミネーター化合物は、２′，３′−ジ
デオキシ構造を有し、そしてジデオキシヌクレオシド三
リン酸として言及されるそれらの化合物類を包含する
が、但し、それらだけには限定されない。ジデオキシヌ
クレオシド三リン酸ｄｄＡＴＰ，ｄｄＴＴＰ，ｄｄＣＴ
Ｐ及びｄｄＧＴＰは、集合的にｄｄＮＴＰとして言及さ
れる。他の異例なヌクレオチドは、ホスホロチオエート
ｄＮＴＰ（〔α−Ｓ〕ｄＮＴＰ）、５′−α−ボラノ−
ｄＮＴＰ、α−メチル−リン酸ｄＮＴＰ、及びリボヌク
レオシド三リン酸（ｒＮＴＰ）を包含する。異例な塩基
は、放射性同位体、たとえば32Ｐ，33Ｐ又は35Ｓ；螢光
ラベル；化学発光ラベル；生物発光ラベル；ハプテンラ
ベル、たとえばビオチン；又は酵素ラベル、たとえばス
トレプタビジン又はアビジンによりラベルされ得る。
【００３７】螢光ラベルは、負に荷電された色素、たと
えばフルオレセイン類の色素、又は中性電荷の色素、た
とえばローダミン類の色素、又は正に荷電された色素、
たとえばシアニン種類の色素を包含することができる。
フルオレセイン類の色素は、たとえばＦＡＭ，ＨＥＸ，
ＴＥＴ，ＪＯＥ，ＮＡＮ及びＺＯＥを包含する。ローダ
ミン類の色素は、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ，ＲＯＸ，Ｒ１１
０，Ｒ６Ｇ、及びＴＡＭＲＡを包含する。ＦＡＭ，ＨＥ
Ｘ，ＴＥＴ，ＪＯＥ，ＮＡＮ，ＺＯＥ，ＲＯＸ，Ｒ１１
０，Ｒ６Ｇ及びＴＡＭＲＡは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により市販されて
おり、そしてＴｅｘａｓ ＲｅｄはＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓにより市販されている。シアニン種類の
色素は、Ｃｙ２，Ｃｙ３，Ｃｙ５及びＣｙ７を包含し、
そしてＡｍｅｒｓｈａｍ（Amersham Place, Little Cha
lfont, Buckinghamshire, England ）により市販されて
いる。
【００３８】用語“ＤＮＡ合成反応”とは、ＤＮＡのコ
ピーを生成する方法、たとえばＰＣＲ、標準の置換増
幅、転写介在の増幅、プライマー延長及び逆転写を言及
するが、但しそれらだけには限定されない。本発明の理
解をさらに促進するためには、特定の熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼ酵素及び螢光色素が、本発明を例示するため
に明細書中に言及され、そしてそれらの言及は本発明を
限定するものではない。
【００３９】本発明は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼで
ある新規且つ改良された組成物を提供する。本発明の酵
素は、その対応する野生型酵素に比較して、フルオレセ
イン類の色素によりラベルされたヌクレオシド三リン酸
をより効果的に組込む組換えポリメラーゼを包含する。
本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、従技術のポリ
メラーゼよりも、ラベルされた生成物のＤＮＡ配列決定
及びインビトロ合成のような方法への使用のためにより
適切であり且つより所望される。本発明の改良されたＤ
ＮＡ配列決定法は、それらの組換えポリメラーゼの使
用、及びこれまでに特徴づけられた酵素よりも、フルオ
レセイン類の色素によりラベルされたヌクレオシド三リ
ン酸をより効果的に組込む生来の酵素の使用を包含す
る。それらの酵素をコードするＤＮＡ配列、及びそのタ
ンパク質を発現するためのベクターがまた供給される。
【００４０】本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、
酵素のポリメラーゼ活性ドメインのアミノ酸配列内に必
須の領域を有する。本発明により提供される熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列内の必須の領域は、従
来の一文字アミノ酸コードを用いて下記に示される（Le
hninger, Biochemistry, New York, New York, WorthPu
blishers Inc., 1970, 967 ：引用により本明細書に組
込まれる）：配列番号７：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸ
ＸＥ（ここで、位置４の“Ｘ”はＥを除くいづれかのア
ミノ酸を示す）。
【００４１】アミノ酸のための３文字コードにおいて
は、この配列は、ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａ
ａＸａａＰｒｏＸａａＸａａＧｌｕ（配列番号７）（こ
こで、位置３，６，９及び１０の“Ｘａａ”は任意のア
ミノ酸であり、この配列中の位置４の“Ｘａａ”は任意
のアミノ酸であるが、但し、グルタミン酸残基（Ｇｌ
ｕ）ではなく、そして位置７の“Ｘａａ”はＶａｌ又は
Ｉｌｅである）として表わされる。この必須の領域は、
フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチ
ドを効果的に組込む能力により特徴づけられる熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼ酵素を供給する。
【００４２】たとえば、位置４６でのグリシンからアス
パラギン酸への変異（Ｇ４６Ｄ）及びＦ６６７Ｙをすで
に含むサーマス・アクアチカス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子の誘導体においては、完全な長さのＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ配列の残基６８１配列（必須のモ
チーフの位置４に対応する）でのグルタミン酸のための
コドンの最初の位置におけるＧからＡへの変異が、必須
のモチーフを有する酵素をもたらす。この酵素は、１）
従来のヌクレオチドの存在下でＰＣＲを介在する酵素の
能力の低下を伴わないで、フルオレセイン類の色素によ
りラベルされたヌクレオチドの組込みの効率の約２〜１
０倍の上昇；及び２）延長速度の２〜４．３倍の上昇を
示す。
【００４３】Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼにおいては、
この特別な変異は、Ｅ（グルタミン酸）からＫ（リシ
ン）へのアミノ酸の変更をもたらす。この特別なアミノ
酸変更は必須のモチーフを生成し、そして異例なヌクレ
オチドを組込む酵素の能力を有意に変えるけれども、Ｅ
からＫへの特異的な変更は、決定的領域内の現在同定さ
れる位置ほどは、本発明に対しては決定的ではないこと
が予測される。
【００４４】従って、好ましい態様においては、本発明
は、組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を供給し、
ここで前記酵素は、ａ）その生来の形において、前記酵
素がアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ
（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）
を含んで成り；ｂ）前記配列中の位置４のＸが前記生来
の配列に比較して変異誘発されているが、但し位置４の
ＸはＥへは変異誘発されておらず；そしてｃ）前記熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼが、前記酵素の生来の形に比較
して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌク
レオチドの組込みに対して低められた識別性を有するこ
とにより特徴づけられる。より好ましい態様において
は、位置４のＸは、陽性電荷を有するアミノ酸、たとえ
ばＫ，ＲもしくはＨにより、又は極性アミノ酸、たとえ
ばＱもしくはＮにより置換されている。最っとも好まし
い態様においては、位置４のＸは、Ｋにより置換され
る。
【００４５】本発明のもう１つの好ましい態様において
は、本発明の酵素は、ａ）フルオレセイン類の色素によ
りラベルされたヌクレオチドに対して低められた識別性
を有し、そしてアミノ酸配列：ＬＳ（Ｑ／Ｇ）ＸＬ（Ｓ
／Ａ）ＩＰＹＥＥ（配列番号２）（ここで、Ｘは任意の
アミノ酸である）を含んで成ることによって特徴づけら
れる。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、
次の通りに表わされる：ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅ
ｕＸａａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（ここで、位
置３の“Ｘａａ”はＧｌｎ又はＧｌｙであり、位置４の
“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、そして位置６の
“Ｘａａ”はＳｅｒ又はＡｌａである）。
【００４６】本発明のより好ましい態様においては、フ
ルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチド
に対する低められた識別性を有する酵素は、アミノ酸配
列：ＬＳＱＸＬＡＩＰＹＥＥ（配列番号３）（ここで、
Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成る。３文字コー
ドにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＧｌ
ｎＸａａＬｅｕＡｌａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ
（ここで、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であ
る）として表わされる。本発明の最とも好ましい態様に
おいては、ＸはＫ残基である。
【００４７】本発明のもう１つの好ましい態様において
は、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレ
オチドに対して低められた識別性を有する酵素は、アミ
ノ酸配列：ＬＳＶＸＬＧ（Ｖ／Ｉ）ＰＶＫＥ（配列番号
４）（ここでＸは任意のアミノ酸である）を含んで成
る。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、Ｌ
ｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＸａａＰｒｏＶａ
ｌＬｙｓＧｌｕ（ここで、位置４の“Ｘａａ”は任意の
アミノ酸であり、そして位置７の“Ｘａａ”はＶａｌ又
はＩｌｅである）として表わされる。
【００４８】本発明のより好ましい態様においては、フ
ルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチド
に対して低められた識別性を有する酵素は、アミノ酸配
列ＬＳＶＸＬＧＶＰＶＫＥ（配列番号５）（ここでＸは
任意のアミノ酸である）を含んで成る。３文字コードに
おいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸ
ａａＬｅｕＧｌｙＶａｌＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（こ
こで、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸である）と
して表わされる。最とも好ましい態様においては、Ｘは
Ｒ残基である。
【００４９】もう１つの好ましい態様においては、フル
オレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドに
対して低められた識別性を有する酵素は、アミノ酸配
列：ＬＳＶＸＬＧＩＰＶＫＥ（配列番号６）（ここでＸ
は任意のアミノ酸である）を含んで成る。３文字コード
においては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌ
ＸａａＬｅｕＧｌｙＩｌｅＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ
（ここで、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であ
る）として表わされる。最とも好ましい態様において
は、前記ＸはＲ残基である。
【００５０】本明細書に記載されるＥ６８１Ｋ変異の特
徴化は、負に荷電された螢光ヌクレオチドと相互作用す
るポリメラーゼの能力に影響を及ぼす、ＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子における領域を同定した。ヘリックスＯに対
して遠位のこの部位は、ポリメラーゼのＯa ヘリックス
の末端部及びＯb ヘリックスの開始部に存在する（Ｋｉ
ｍ，など., 1995, Nature, 376：612 ）。当業界におい
て良く知られている分子モデリング原理に基づけば、位
置６８１のＥからＫ以外のＯa −Ｏb ヘリックスの構造
の変化はまた、フルオレセイン類の色素によりラベルさ
れたヌクレオチドに対して識別するポリメラーゼの能力
の変化をもたらすことが予測される。
【００５１】従って、位置４のＸ残基における変異以外
の必須のモチーフにおける位置での変異もまた、本発明
の範囲内である。この態様においては、本発明は、組換
え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を提供し、ここで前
記酵素は、ａ）その生来の形において、前記ポリメラー
ゼはアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ
（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）
を含んで成り、ｂ）前記組換えポリメラーゼが前記アミ
ノ酸配列内での少なくとも１つの変異を含んで成り、但
し、位置４のＸはＥへは変異誘発されず、そしてｃ）前
記酵素がその対応する生来の酵素に比較して、フルオレ
セイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込
みに対して低められた識別性を有することにより特徴づ
けられる。
【００５２】同様に、アミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ
／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで位置４のＸは任
意のアミノ酸であるが、しかしＥではない）である必須
のモチーフに対して類似するが、しかし同一ではない必
須のモチーフを含んで成る熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
は、本発明の範囲内である。特に１つの態様において、
前記必須のモチーフは、アミノ酸配列：ＬＸＸＸＸＸＸ
ＸＸＸＥ（配列番号８）（ここで、位置４のＸは、Ｅを
除く任意のアミノ酸である）である。３文字コードにお
いては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＸａａＸａａＸａ
ａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＧｌｕ（配列
番号８）（ここで、位置２，３，５，６，７，８，９及
び１０の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、そして位
置４の“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸であ
る）として表わされる。
【００５３】もう１つの態様において、前記必須のモチ
ーフは、アミノ酸配列：Ｌ（Ｓ／Ａ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ）Ｘ
ＸＸＸＸＥ（配列番号９）（ここで、位置ＸのＸはＥを
除く任意のアミノ酸である）である。３文字コードにお
いては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＸａａＸａａＸａ
ａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＧｌｕ（配列
番号９）（ここで、位置３，６，７，８，９、及び１０
での“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、位置２の“Ｘ
ａａ”はＳｅｒ又はＡｌａであり、位置４の“Ｘａａ”
はＧｌｕを除く任意のアミノ酸であり、そして位置５の
“Ｘａａ”はＬｅｕ又はＩｌｅである）として表わされ
る。
【００５４】さらにもう１つの態様においては、前記必
須のモチーフは、アミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸＸＸＸＸ
Ｅ（配列番号１０）（ここで、位置４のＸはＥを除く任
意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいて
は、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬ
ｅｕＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＧｌｕ（配列番号
１０）（ここで、位置３，６，７，８，９及び１０の
“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、そして位置４の
“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸である）とし
て表わされる。
【００５５】フルオレセイン類の色素によりラベルされ
たヌクレオチドを効果的に組込む本発明の酵素の能力
は、ｄｄＮＴＰ組込みアッセイにより測定される。１つ
のそのようなアッセイは、制限鋳型の条件下で行なわれ
るプライマー延長競争アッセイである。このアッセイに
おいては、Ｍ１３ｍｐ１８鋳型（Ｉｎｎｉｓなど., 198
8, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：9436）に結合され
るプライマーＤＧ４８（５′−ＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡ
ＴＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣ）（配列番号
１１）が、種々のレベルの螢光ラベルされたｄｄＮＴ
Ｐ、Ｚｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰと共に、〔α−33Ｐ〕ｄＣ
ＴＰ及び過剰の酵素の存在下で延長される。
【００５６】ｄｄＣＴＰ残基の組込みがその延長反応を
終結するので、ＤＮＡポリメラーゼが延長されたプライ
マー中にｄｄＣＴＰをより容易に組込むほど；〔α−33
Ｐ〕ｄＣＴＰの組込みは低くなる。従って、螢光ラベル
されたｄｄＣＴＰ組込みの効率が低くなるにつれて、Ｄ
ＮＡ合成の阻害の程度は高められる。その反応はまた、
種々のレベルのラベルされていないｄｄＣＴＰによって
も実施された。５０％阻害率のために必要とされるｄｄ
ＣＴＰ及びＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの濃度が計算され、
そして比較され、螢光ラベルされたヌクレオチドを組込
む酵素の能力を相対的測定結果が付与された。ｄｄＮＴ
Ｐ組込みアッセイの詳細は、例２に供給される。
【００５７】従って、本発明の１つの態様においては、
フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチ
ドの組込みに対する低められた識別性の特徴が、例２に
記載される螢光ｄｄＮＴＰ組込みアッセイにより測定さ
れる。好ましい態様においては、ＤＮＡ合成の５０％阻
害率のために必要とされるフルオレセイン色素、すなわ
ちＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰによりラベルされたｄｄＮＴ
Ｐの濃度は、野生型酵素に比較し、本発明の変異体酵素
に関して少なくとも３倍、低められる。より好ましい態
様においては、前記濃度は、少なくとも１０倍低められ
る。もう１つの態様においては、低められた識別性の特
徴が螢光ｄＮＴＰ組込みを測定することによってアッセ
イされる。
【００５８】本発明のもう１つの観点においては、熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子配列及び酵素は、種々の
好熱種に由来する。１つの観点においては、ポリメラー
ゼ遺伝子配列及び酵素はサーマス属の種からである。本
発明の他の態様においては、遺伝子配列及び酵素は、サ
ーマス以外の好熱種からである。多くの熱安定性ＤＮＡ
ポリメラーゼのための完全な核酸及びアミノ酸配列は入
手できる。Ｔａｑ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｔ
ｈ）、サーマス・スペーシスＺ０５、サーマス・スペー
シスｓｐｓ１７、サーモトガ・マリチマ（Ｔｍａ）及び
サーモシフォ・アフリカナス（Ｔａｆ）ポリメラーゼの
個々の配列は、１９９２年４月１６日にＰＣＴ特許公開
番号ＷＯ９２／０６２００として公開されたＰＣＴ国際
特許出願番号ＰＣＴ／Ｕ．Ｓ．９１／０７０３５に公開
されている。
【００５９】サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍａｓ ｆ
ｌａｖｕｓ）、バシラス・カルドテナクス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ Ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）及びバシラス・ステア
ロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのＤＮＡポリメラーゼの
ための配列は、それそれ、Akhmetzjanov and Vakhitov,
1992, Nucleic Acids Research 20 (21）：5839；Uemo
riなど., 1993, J. Biochem. 113： 401-410；及びＮ
Ｇ：Ｎｅｗ ＧｅｎＢａｎｋデータベースからの受託番
号ＢＳＵ２３１４９ｎｇ（それぞれ引用により本明細書
に組込まれる）に公開されている。
【００６０】サーマス・カルドフィラス（Ｔｈｅｒｍａ
ｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）からの熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼの配列は、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ受託番
号Ｕ６２５８４として見出される。サーマス・フィリホ
ルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）から
の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの配列は、アメリカ特許
第４，８８９，８１８号に提供される方法及び表１に提
供される配列情報を用いて、ＡＴＣＣ寄託番号第４２３
８０号から回収され得る。サーモトガ・ネアポリタナ
（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）の
ＤＮＡポリメラーゼの配列は、GeneSeq Patent Data Ba
se Accession No. R98144(PCT W097／09451 にも開示さ
れる）からである。
【００６１】
【表１】
【００６２】１．受託番号D12982, Uemori T., Ishino
Y., Fujita k., Kato L. "Cloningof the DNA polymera
se gene of Bacillus caldotenax and characterizatio
n of the gene product" J. Biochem. 113 ：401 (199
3)からのタンパク質配列。その配列における必須の残基
は７２５である。ほとんど同一のタンパク質配列が、受
託番号Ｒ４５１５５及びＷＰＩ９３−４０８３２３／５
１において推定上の“バシラス・ステアロサーモフィラ
ス”ＤＮＡポリメラーゼとして提供される。その配列に
おける決定的な残基は７２４である。
【００６３】２．Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ又はＳｗｉｓｓ
Ｐｒｏｔ／ＰＩＲデータベースにバシラス・ステアロサ
ーモフィラスＤＮＡポリメラーゼのためのいくつかの配
列が提供されている。それらの配列はお互いひじょうに
関連しているが、しかし、いく分異なっているけれど
も、個々の配列は同一のＬ（Ｓ／Ａ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ）Ｘ
ＸＸＸＸＥ（配列番号９）モチーフ（ここで、ＸはＥを
除く任意のアミノ酸である）を含む。３文字コードにお
いては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＸａａＸａａＸａ
ａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＧｌｕ（配列
番号９）（ここで、位置３，６，７，８，９及び１０の
“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、位置２の“Ｘａ
ａ”はＳｅｒ又はＡｌａであり、位置４の“Ｘａａ”は
Ｇｌｕを除く任意のアミノ酸であり、そして位置５の
“Ｘａａ”はＬｅｕ又はＩｌｅである）として表わされ
る。
【００６４】上記表においては、位置７２４に必須のモ
チーフにおける必須の残基を含んで成るタンパク質配列
は、日本特許公開Ｊ０５３０４９６４Ａ、ヨーロッパ特
許第６９９，７６０号及び受託番号Ｕ３３５３６により
供給される。もう１つの非常に関連しているが、しかし
いく分異なっているタンパク質配列は、Gene 163：65-6
8 (1995)に公開されており、位置７２７での必須のモチ
ーフにおいて決定的残基を含む。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメ
ラーゼのためのもう１つの非常に関連するが、しかしい
く分異なっている、受託番号Ｕ２３１４９のタンパク質
配列は、位置８０２にある必須のモチーフにおいて必須
の残基を含む。
【００６５】個々の好熱種のＤＮＡポリメラーゼはユニ
ークであるので、決定的領域のアミノ酸位置は個々の酵
素に関して異なる。アミノ酸及び核酸配列の配置プログ
ラムは、容易に入手でき、そして本明細書において同定
される特定の領域が与えられる場合、本発明の正確な配
列領域の同定を助力する。そのような配列の配置プログ
ラムは、Genetics Computer Group, 575 Science Driv
e, Madison, Wisconsinから入手できる。ここで同定さ
れる特定のモチーフが与えられる場合、“ＧＡＰ”、
“ＢＥＳＴＦＩＴ”及び“ＰＩＬＥＵＰ”を包含するそ
れらのプログラムは、必須のモチーフの局在化を助け
る。決定的領域の位置は、典型的な好熱種からの熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼについての表１に示されている。
【００６６】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラー
ゼドメイン内の必須のモチーフＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）
ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４のＸはＥを除
く任意のアミノ酸である）の正確な位置にもかかわら
ず、そのモチーフの存在は、フルオレセイン類の色素に
よりラベルされたヌクレオチドを効果的に組込む能力を
有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを供給するよう作用
する。
【００６７】従って、必須のモチーフを生成するため
の、サーマス・フラバス（Ｇｌｕ６７９）、サーマス・
サーモフィラス（ＧluＵ６８３）、サーマス・スペーシ
スＺ０５（Ｇｌｕ６８３）、サーマス・スペーシスｓｐ
ｓ１７（Ｇｌｕ６７９）、サーマス・カルドフィラス
（Ｇｌｕ６８３）、サーマス・フィリホルミス（Ｇｌｕ
６７９）からの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの保存され
たグルタミン酸の変異が、フルオレセイン類の色素によ
りラベルされたヌクレオチドを効果的に組込むポリメラ
ーゼの能力に対する増強効果を提供するであろう。
【００６８】さらに、現在同定された必須のモチーフの
高く保存された性質の観点から、新規熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼは、たとえばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、
又は表１における他のＤＮＡポリメラーゼの配列に対す
るそれらの相同性に基づいて同定され得る（たとえば、
引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第５，６
１８，７１１号及び第５，６２４，８３３号を参照のこ
と）。本明細書に記載される方法により決定される場
合、そのようなポリメラーゼは、それらのペプチド配列
がＴａｑポリメラーゼアミノ酸配列に対して少なくとも
４５％及び最とも好ましくは８０％以上相同である限
り、本発明の範囲内である。
【００６９】従って、本発明はまた、熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼ、及び次の種からの対応する遺伝子及び発現
ベクターを含む種々の酵素に関する：サーマス・オシマ
イ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ）（Williams RA,
など., 1996, Int. J. Syst.Bacteriol. 46 (2)：403-4
98)；サーマス・シルバヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌ
ｖａｎｕｓ）及びサーマス・クリアロフィラス（Ｔｈｅ
ｒｍｕｓ ｃｈｌｉｏｒｏｐｈｉｌｕｓ）（Tenreiro
S, など., 1995, Int. J. Syst. Bacteriol 45(4) ：63
3-639)；サーマス・スコトグクタス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）（Tenreiro S, など., 1995,
Res. Microbiol. 146 (4)：315-324)；サーマス・ルバ
ー（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ）ＡＴＣＣ３５９４８
（L. G.Loginova, 1984, Int. J. Syst. Bacteriol. 34
：498-499)；及びサーマス・ブロキアヌス（Ｔｈｅｒ
ｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）（Munster, M. J., 19
86, J. Gen. Microbiol. 132：1677）（それらの出版物
は、引用により本明細書にそれぞれ組込まれる）。
【００７０】当業者は、フルオレセイン−ラベルされた
ヌクレオチドを組込むための増強された効率を有する上
記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが組換えＤＮＡ技法、た
とえば特定部位の変異誘発により最とも容易に構成され
ることを認識するであろう。たとえば、Sambrookなど.,
Molecular Cloning：A Laboratory Maual, Cold Sprin
g Harbor, 1989、第２版、チャプター１５．５１，“Ol
igonucleotide-mediated mutagenesis”（引用により本
明細書に組込まれる）を参照のこと。この技法は当業界
において現在、標準であり、そして遺伝子におけるいづ
れかの決定された部位ですべての可能な種類の塩基対変
更を創造するために使用され得る。
【００７１】その方法は、所望する変異を表わす、限定
されたミスマッチを除く、変異誘発される一本鎖ファー
ジ又はプラスミドＤＮＡに対して相補的である合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いて実施される。手短に
言及すれば、合成オリゴヌクレオチドは、ファージ又は
プラスミドに対して相補的な鎖の合成を指図するための
プライマーとして使用され、そして得られる二本鎖ＤＮ
Ａを用いて、ファージ−又はプラスミド−維持の宿主細
菌が形質転換される。その得られる細菌は、たとえば所
望する変異誘発された遺伝子配列を担持するそれらのプ
ラーク又はコロニーを同定するために、ＤＮＡ配列分析
又はプローブハイブリダイゼーションによりアッセイさ
れ得る。
【００７２】ＰＣＲの発明に続いて、プライマー指令変
異誘発（アメリカ特許第４，６８３，１９５号に記載さ
れる；引用により本明細書に組込まれる）、及び“オー
バーラップＰＣＲ”（Higuchi, 1989, PCR Technology,
ed. Erlich, Stockfon Press, New York, NY, pp 61-7
0 ）が、遺伝子のいづれかの位置でいづれかの変異を導
入する日常の手段になった。
【００７３】変異誘発されたＤＮＡは、従来の手段によ
りプラスミド、ファスミド、ファージ又は増幅反応から
回収され、そして得られる酵素の続く培養及び精製のた
めに発現ベクター中に連結される。多くのクローニング
及び発現ベクターは、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋな
ど．，１９８９前記に記載されるように、哺乳類及び細
菌システムを包含する発明を実施するために適切であ
る。便利さのために、本発明は、λ由来のＰL プロモー
ター（Shimatake など., 1981, Nature 292 ：128 ）を
用いて例示される。このプロモーターの使用は、引用に
より本明細書に組込まれるアメリカ特許第４，７１１，
８４５号及び第５，０７９，３５２号に特に記載され
る。
【００７４】プラスミドｐＣＳ１は、１９９７年８月２
８日にＡＴＣＣに寄託され、そして受託番号９８５２１
を付与された。このプラスミドは、グルタミン酸がその
得られるポリペプチドにおいてリシンにより置換される
ような位置６８１でのコドンで変異誘発された、熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含み、そし
てフルオレセイン類の色素によりラベルされるヌクレオ
チドを組込むための増強された効率を有する熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼを提供するための手段を提供する。
【００７５】例１は、他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
酵素を創造するためにＥ６８１Ｋ変異をサブクローニン
グするのに適切なフランキング制限部位の使用を例示す
る。他方では、多くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのた
めの完全な遺伝子配列は知られているので、Ｅ６８１Ｋ
変異を導入するための他の手段、たとえば制限消化及び
フラグメント置換は、ＡＴＣＣ寄託物の利用性及び本明
細書に供給される配列情報を有する当業者に容易に利用
できる。
【００７６】本発明の変異体の又は生来の酵素の１つ又
はそれらの酵素の誘導体又は相同体の生成を所望する場
合、前記酵素の生成は、典型的には、発現ベクターによ
る宿主細胞の形質転換、及びその形質転換された宿主細
胞の発現が生じるであろう条件下での培養を包含する。
形質転換及び形質転換された宿主細胞の培養のための手
段は、当業界において良く知られており、そしてたとえ
ば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．，１９８９、前記、に詳細
に記載される。
【００７７】本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは一
般的に、野生型又は修飾された熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼをコードする遺伝子に操作可能的に連結される発現
ベクターにより形質転換されたＥ．コリ株ＤＧ１１６
（１９８７年４月７日、ＡＴＣＣ５３６０６として寄託
されている）から精製される。熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼを精製するための方法は、たとえば例１及びLawyer
など., 1993, PCR Methods and Applications ２：275-
87（引用により本明細書に組込まれる）に記載される。
【００７８】本発明の熱安定性酵素は、そのような酵素
活性が必要であり又は所望されるいづれかの目的のため
に使用され得る。使用の例は、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ
ラベリング、及びプライマー延長生成物のラベリングを
包含する。Ｓａｎｇｅｒのジデオキシヌクレオチド方法
（Sangerなど., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. 74：54
63）によるＤＮＡ配列決定は、本発明により特に改良さ
れる。基本的なＳａｎｇｅｒなどの方法における進歩
は、新規ベクター（Yanisch-Perronなど., 1985Gene 33
：103-119 ）、及び塩基類似体（Mills など., 1979,
Proc. Natl. Acad. Sci. 76：2232-2235 、及びBarrな
ど., 1986, Biotechniques ４：428-432）を提供して
来た。
【００７９】一般的に、ＤＮＡ配列決定は、鎖−終結塩
基類似体の存在下で鋳型−依存性プライマー延長を必要
とし、結果的にサイズにより分離される部分的フラグメ
ントの分布をもたらす。基本的ジデオキシ配列決定方法
は、（ｉ）鋳型に対して、任意にラベルされたオリゴヌ
クレオチドプライマーをアニーリングし；（ii）４種の
別々の反応においてＤＮＡポリメラーゼによりプライマ
ーを延長し、ここで個々の反応はラベルされていないｄ
ＮＴＰの混合物、及び限定量の一本鎖終結剤、たとえば
任意にラベルされたｄｄＮＴＰを含み；そして（iii ）
高い分解能の変性ポリアクリルアミド／尿素ゲル上で４
組の反応生成物を分解することを包含する。反応生成物
は、使用されるラベルに依存して、オートラジオグラフ
ィー又は螢光検出によりゲルにおいて検出され得、そし
て像は、ヌクレオチド配列を推定するために試験され得
る。それらの方法は、ＤＮＡポリメラーゼ、たとえば
Ｅ．コリＰｏｌＩのクレノウフラグメント、又は変性さ
れたＴ７ ＤＮＡポリメラーゼを使用する。
【００８０】耐熱性ポリメラーゼ、たとえばＴａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼの有用性は、熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼによる配列決定のための改良された方法（Ｉｎｎｉ
ｓなど．，１９８８、前記を参照のこと）及び“サイク
ル配列決定”と呼ばれるその変法（Murray, 1989, Nuc.
Acids. Res. 17 ：8889）をもたらした。基本的なジデ
オキシ配列決定の代用としてのサイクル配列決定は、鎖
ターミネーターの存在下で鋳型配列に対して相補的な標
的配列の線状非対称増幅である。単一のサイクルは、す
べての可能な長さの種類の延長生成物を生成する。ＤＮ
Ａ鋳型からの延長反応生成物の変性に続いて、プライマ
ーアニーリング及びプライマー延長の複数のサイクル
が、ターミネーター、たとえばｄｄＮＴＰの存在下で生
じる。
【００８１】サイクル配列決定は、従来の鎖−終結配列
決定よりも少ない鋳型ＤＮＡを必要とする。熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼはサイクル配列決定においていくつか
の利点を有し、すなわちそれらは核酸標的物へのプライ
マーの特異的ハイブリダイゼーションのために必要とさ
れるきびしいアニーリング温度に対して耐性があり、そ
して個々のサイクルにおいて生じる高い温度変性、すな
わち９０〜９５℃の複数のサイクルに対して耐性があ
る。この理由のために、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商
標）ＤＮＡポリメラーゼ、及びその誘導体及び由来物
が、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ
の会社により市販されているＴａｑサイクル配列決定キ
ットに包含されて来た。
【００８２】鎖終結配列決定法の２つの変法、すなわち
色素−プライマー配列決定法及び色素−ターミネーター
配列決定法が存在する。色素−プライマー配列決定法に
おいては、ｄｄＮＴＰターミネーターはラベルされず、
そしてラベルされたプライマーが延長生成物を検出する
ために使用される（Smith など., 1986, Nature 32：67
4-679 ）。色素−ターミネーターＤＮＡ配列決定法にお
いては、ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡプライマーの末
端上にｄＮＴＰ及び螢光ラベルされたｄｄＮＴＰを組込
むために使用される（Ｌｅｅなど．，前記）。この方法
は、色素ラベルされたプライマーを合成すべきでない利
点を付与する。さらに、色素−ターミネーター反応は、
すべての４種の反応が同じ管において実施され得ること
においてより便利である。
【００８３】色素−プライマー及び色素−ターミネータ
ーの両方法は、Applied Biosystems, Foster City, CA
により製造される自動配列決定装置を用いて自動化され
得る（アメリカ特許第５，１７１，５３４号；引用によ
り本明細書に組込まれる）。前記装置を用いる場合、完
結された配列決定反応混合物が、前記装置に固定される
変性ポリアクリルアミドゲル上で分別される。装置の底
でのレーザーが、螢光生成物がゲルを通して大きさに従
って電気泳動される場合、その生成物を検出する。
【００８４】２種のタイプの螢光色素、すなわち負に荷
電された及び両性の螢光色素が、色素−ターミネーター
配列決定のために使用されるターミネーターをラベルす
るために通常使用される。負に荷電された螢光色素は、
フルオレセイン及びＢＯＤＩＰＹ種類の色素を包含す
る。ＢＯＤＩＰＹ色素（４，４−ジフルオロ−４−ボラ
−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン）が、国際特許
公開番号９７／００９６７（引用により本明細書に組込
まれる）に記載されている。両性螢光色素は、ローダミ
ン類の色素を包含する。
【００８５】市販のサイクル配列決定キットは、ローダ
ミン誘導体によりラベルされたターミネーターを使用す
る。しかしながら、ローダミン−ラベルされたターミネ
ーターはかなり高価であり、そしてその生成物は、配列
決定生成物と共に同時移動するので、ゲル上に負荷する
前、組込まれていない色素−ｄｄＮＴＰから分離される
べきである。ローダミン類の色素は、生成物の異常な移
動を引き起こす、ＧＣに富んでいる領域におけるヘアピ
ン構造体を安定化するように見える。これは、その二次
構造体をゆるめるｄＩＴＰの使用を必要とし、また、タ
ーミネーターの組込みの効率にも影響を及ぼす。
【００８６】対照的に、フルオレセインによりラベルさ
れたターミネーターは、それらが高い負の電荷を有し、
そして配列決定生成物よりも早く移動するので、ゲル負
荷の前の分離段階を排除する。さらに、フルオレセイン
によりラベルされた配列決定生成物は、ローダミンによ
りラベルされた配列決定生成物よりも良好な電気泳動移
動性を有する。野生型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはフ
ルオレセイン類の色素によりラベルされたターミネータ
ーを効果的に組込まないけれども、それは本明細書に供
給される修飾された酵素の使用により現在、効果的に達
成され得る。従って、本発明の範囲は、必須のモチーフ
を有する酵素を用いてのジデオキシ配列決定のための新
規方法、及び前記方法を実施するためのキットを包含す
る。
【００８７】１つの態様において、本発明の配列決定方
法は、 ａ）組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用意し、
ここで前記酵素は、 ｉ）その生来の形において、前記ポリメラーゼは、アミ
ノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号
１）（ここでＸは任意のアミノ酸である）を含んで成
り、 ii）前記配列中の位置４のＸが、前記生来の配列に比較
して変異誘発されており、但しＸはＥに変異誘発されて
おらず；そして iii ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、前記酵素の
生来の形に比較して、フルオレセイン類の色素によりラ
ベルされたヌクレオチドの組込みに対する低められた識
別性を有することにより特徴づけられ；そして ｂ）色素−ターミネーター配列決定反応を実施すること
も含んで成る。
【００８８】上記方法の好ましい態様においては、前記
生来の形の酵素は、アミノ酸配列：ＬＳ（Ｑ／Ｇ）ＸＬ
（Ｓ／Ａ）ＩＰＹＥＥ（配列番号２）（ここで、Ｘは任
意のアミノ酸配列である）を有する。３文字コードにお
いては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａ
ａＬｅｕＸａａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列
番号２）（ここで、位置３の“Ｘａａ”はＧｌｎ又はＧ
ｌｙであり、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であ
り、そして位置６の“Ｘａａ”はＳｅｒ又はＡｌａであ
る）として表わされる。
【００８９】より好ましい態様においては、その生来形
のアミノ酸配列は、ＬＳＱＸＬＡＩＰＹＥＥ（配列番号
３）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸配列である）であ
る。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、Ｌ
ｅｕＳｅｒＧｌｎＸａａＬｅｕＡｌａＩｌｅＰｒｏＴｙ
ｒＧｌｕＧｌｕ（配列番号３）（ここで、位置４の“Ｘ
ａａ”は任意のアミノ酸である）として表わされる。最
とも好ましい態様においては、位置４の“Ｘａａ”はＬ
ｙｓである。
【００９０】上記のように、熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼによるＤＮＡ配列決定は、鎖−ターミネーターとして
作用する異例な塩基類似体、及び従来のヌクレオチド
を、数百の塩基の距離にわたってすべての可能なフラグ
メントの長さを表わす、延長生成物の集団が生成される
ことを保証する濃度の特定の割合で含む混合物を必要と
する。配列決定のためにこれまで使用されて来たいくつ
かの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、たとえば野生型Ｔａ
ｑポリメラーゼは、それらが従来のヌクレオチド及び異
例なヌクレオチドの混合物の存在下で従来のヌクレオチ
ドを選択的に組込むことにより特徴づけられる。しかし
ながら、最近記載されるいくつかの熱安定性ＤＮＡポリ
メラーゼは、従来の塩基に対する異例な塩基類似体の割
合を、百倍〜数百倍又は数千倍まで低めることを可能に
する。
【００９１】１つのそのようなポリメラーゼは、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼのＦ６６７Ｙ変異体である。もう
１つのそのような変異体は、Ｆ６６７Ｙ変異、及び位置
４６においてグリシン残基をアスパラギン酸残基に変更
する変異（Ｇ４６Ｄ）を有するＴａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼである。Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ，ＦＳとして知られて
いるこの変異体ポリメラーゼは、Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ
Ｒｏｃｈｅにより製造され、そしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅ
ｌｍｅｒにより市販されている。Ｆ７３０ＹＴｍａ３０
ＤＮＡポリメラーゼは、もう１つのそのようなポリメ
ラーゼである。
【００９２】この変異体ポリメラーゼは、１）Ｇ４６Ｄ
変異をコードするよう修飾されたＴａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼのヌクレオチド１−５７０、及び２）位置３２３
でアスパラギン酸からアラニンへの変異、位置３２５で
グルタミン酸からアラニンへの変異、及び位置７３０で
フェニルアラニンからチロシンへの変異をコードするよ
う修飾されたＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼのヌクレオチ
ド５７１−２６７９の組合せである（アメリカ特許出願
番号６０／０５２０６５及びヨーロッパ特許出願第９８
１１２３２７．６号；両者とも引用により本明細書に組
込まれる）。
【００９３】異例な塩基類似体を組込むもう１つのポリ
メラーゼは、サーモトガ・ネアポリタナからのＦ７３０
Ｙ変異体ＤＮＡポリメラーゼである（国際特許出願番号
ＷＯ９６／１０６４０，ＷＯ９６／４１０１４及びＷＯ
９７／０９４５１；それらは引用により本明細書に組込
まれる）。一定のｄＮＴＰ濃度に関して、それらの酵素
を使用する場合、ローダミン−ｄｄＮＴＰ濃度は、これ
まで利用できる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに比較し
て、約５０倍〜数百倍、低められ得る。
【００９４】本発明のＥ６８１Ｋ変異が、例４に記載さ
れる配列決定反応に使用される二重変異体Ｔａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼ酵素を生成するために、Ｆ６６７Ｙ変異
と共に、組換えＤＮＡ方法を用いて組合された。その二
重変異体は、フルオレセインによりラベルされた色素タ
ーミネーターとの色素−ターミネーター配列決定反応に
使用された。例４に記載される結果は、前記酵素が、配
列決定反応においてフルオレセインによりラベルされた
色素ターミネーターを組込むことができ、そして自動化
された配列決定装置において正確に読取られ得る配列決
定ラダーを生成することを示す。意外なことには、Ｅ６
８１Ｋ及びＦ６６７Ｙ変異の組合せはまた、例３に記載
されるアッセイにより測定される場合、Ｆ６６７Ｙ変異
のみを有する酵素に比較して、３〜４倍早められた延長
速度で熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を生成すること
が見出された。
【００９５】従って、本発明のもう１つの観点において
は、本発明において同定される必須のモチーフは、ラベ
ルされた及びラベルされていないｄｄＮＴＰの両者の組
込みの高められた効率を有するポリメラーゼを生成する
ために、ｄｄＮＴＰに対する低められた識別性を付与す
るモチーフと組み合わされ得る。それらのポリメラーゼ
は、ＤＮＡ配列決定法において有用である。本発明の１
つの態様においては、本明細書において定義される必須
のモチーフを有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはま
た、アメリカ出願番号０８／４４８，２２３に記載され
る、Ｆ６６７Ｙ変異を含む必須のモチーフを含んで成
る。
【００９６】この態様においては、熱安定性ＤＮＡポリ
メラーゼは、 ｉ）その生来の形において、前記ポリメラーゼは、第１
のアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配
列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含
んで成り； ii）前記第１のアミノ酸配列における位置４のＸが前記
生来の配列に比較して変異誘発されており、但し、Ｘは
Ｅに変異誘発されておらず； iii ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、前記酵素の
生来の形に比較して、フルオレセイン類の色素によりラ
ベルされたヌクレオチドの組込みに対する低められた識
別性を有し； iv）前記ポリメラーゼが第２のアミノ酸配列：ＭＲＲＸ
ＸＫＸＸＮＹＸＸＸＹＧ（配列番号１２）（ここで、Ｘ
は任意のアミノ酸である）を含んで成り；そして ｖ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがまた、前記酵素
の生来の形に比較して、異例なヌクレオチドの組込みに
対する低められた識別性を有することにより特徴づけら
れる。
【００９７】３文字コードにおいては、前記第２のアミ
ノ酸配列は、ＭｅｔＡｒｇＡｒｇＸａａＸａａＬｙｓＸ
ａａＸａａＡｓｎＴｙｒＸａａＸａａＸａａＴｙｒＧｌ
ｙ（配列番号１２）（ここで、位置４，５，７，８，１
１，１２及び１３の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であ
る）により表わされる。好ましい態様においては、前記
第１のアミノ酸配列における位置４の“Ｘａａ”は、Ｌ
ｙｓに変異誘発されている。より好ましい態様において
は、前記酵素はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼであり、そ
してそれはＥ６８１Ｋ及びＦ６６７Ｙ変異を含んで成
る。上記ポリメラーゼを用いての配列決定の方法もま
た、本発明の範囲内である。
【００９８】変異により誘導されないが、しかし天然の
変異体として存在する必須のモチーフを有する熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いて実施される本発明の改
良された配列決定法もまた、本発明の範囲内である。こ
の観点においては、好熱性細菌種のＤＮＡポリメラーゼ
が、位置４での残基がＧｌｕではない必須のモチーフを
有する。たとえば、サーモトガ・ネアポリタナからの熱
安定性ＤＮＡポリメラーゼにおいては、前記モチーフＬ
ＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここ
で、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）における位置
４のＸは、アルギニン残基である。
【００９９】従って、本発明は、アミノ酸配列：ＬＳＸ
ＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、Ｘ
はＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成る生来の
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いてのＤＮＡ配列決定
の改良された方法を提供する。３文字コードにおいて
は、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬ
ｅｕＸａａＸａａＰｒｏＸａａＸａａＧｌｕ（配列番号
７）（ここで、位置３，６，９及び１０の“Ｘａａ”は
任意のアミノ酸であり、位置４の“Ｘａａ”はＧｌｕを
除く任意のアミノ酸であり、そして位置７の“Ｘａａ”
はＶａｌ又はＩｌｅである）として表わされる。
【０１００】この態様においては、本発明の配列決定方
法は、 ａ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用意し、ここで前記
ポリメラーゼが、 ｉ）前記ポリメラーゼは、アミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ
（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４の
ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成り；そ
して ii）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがフルオレセイン
類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対
して低められた識別性をすることにより特徴づけられ； ｂ）フルオレセイン類の色素によりラベルされた色素−
ターミネーターを用意し；そして ｃ）色素−ターミネーター配列決定反応を実施すること
を含んで成る。
【０１０１】より好ましい態様においては、本発明の配
列決定法は、 ａ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用意し、ここで前記
ポリメラーゼは、 ｉ）前記ポリメラーゼが、第１のアミノ酸配列：ＬＳＸ
ＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位
置４のＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成
り； ii）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがフルオレセイン
類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対
して低められた識別性を有し； iii ）前記ポリメラーゼが第２のアミノ酸配列：ＭＲＲ
ＸＸＫＸＸＮＹＸＸＸＹＧ（配列番号１２）（ここで、
Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り； iv）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが異例なヌクレオ
チドの組込みに対して低められた識別性を有することに
より特徴づけられ； ｂ）フルオレセイン類の色素によりラベルされた色素−
ターミネーターを用意し；そして ｃ）色素−ターミネーター反応を実施することを含んで
成る。
【０１０２】もう１つの好ましい態様においては、前記
酵素は、アミノ酸配列：ＬＳ（Ｑ／Ｇ）ＸＬ（Ｓ／Ａ）
ＩＰＹＥＥ（配列番号１３）（ここで、位置４のＸはＥ
を除く任意のアミノ酸配列である）を含んで成る。３文
字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅ
ｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕ
Ｇｌｕ（配列番号１３）（ここで、位置３の“Ｘａａ”
はＧｌｕ又はＧｌｙであり、位置４の“Ｘａａ”はＧｌ
ｕを除く任意のアミノ酸であり、そして位置６の“Ｘａ
ａ”はＳｅｒ又はＡｌａである）として表わされる。よ
り好ましい態様においては、前記アミノ酸配列は、ＬＳ
ＱＸＬＡＩＰＹＥＥ（配列番号１４）（ここで、ＸはＥ
を除く任意のアミノ酸である）である。３文字コードに
おいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＧｌｎＸ
ａａＬｅｕＡｌａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配
列番号１４）（ここで、位置４の“Ｘａａ”はＧｌｕを
除く任意のアミノ酸である）として表わされる。
【０１０３】さらにもう１つの好ましい態様において
は、前記酵素は、アミノ酸配列：ＬＳＶＸＬＧ（Ｖ／
Ｉ）ＰＶＫＥ（配列番号１５）（ここで、ＸはＥを除く
任意のアミノ酸である）を有する。３文字コードにおい
ては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａ
ＬｅｕＧｌｙＸａａＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番
号１５）（ここで、位置４の“Ｘａａ”は、Ｇｌｕを除
く任意のアミノ酸であり、そして位置７の“Ｘａａ”は
Ｖａｌ又はＩｌｅである）として表わされる。より好ま
しい態様においては、前記アミノ酸配列は、ＬＳＶＸＬ
ＧＶＰＶＫＥ（配列番号１６）（ここで、ＸはＥを除く
任意のアミノ酸である）である。
【０１０４】３文字コードにおいては、このアミノ酸配
列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＶａｌＰ
ｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号１６）（ここで、位
置４での“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸であ
る）として表わされる。最とも好ましい態様において
は、位置４の“Ｘａａ”はＡｒｇである。もう１つのよ
り好ましい態様においては、前記アミノ酸配列は、ＬＳ
ＶＸＬＧＩＰＶＫＥ（配列番号１７）（ここで、ＸはＥ
を除く任意のアミノ酸である）である。３文字コードに
おいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸ
ａａＬｅｕＧｌｙＩｌｅＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配
列番号１７）（ここで、位置４での“Ｘａａ”はＧｌｕ
を除く任意のアミノ酸である）として表わされる。最と
も好ましい態様においては、位置４の“Ｘａａ”はＡｒ
ｇである。
【０１０５】本発明のもう１つの態様においては、配列
決定方法は、フルオレセイン類の色素によりラベルされ
たヌクレオチドに対して低められたレベルの識別性を有
する生来の酵素を用いて実施され、ここで前記レベル
は、例２に記載されるようなｄｄＮＴＰ組込みアッセイ
を用いて測定される。ＤＮＡ合成の５０％阻害のために
必要とされるｄｄＣＴＰの濃度が、５０％阻害のために
必要とされるＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの濃度と共に決定
される。ｄｄＣＴＰのための濃度に対するＺｏｗｉｅ−
ｄｄＣＴＰのための濃度の比が計算される。好ましい態
様において、その比は１０又はそれ以下である。より好
ましい態様において、その比は４又はそれ以下である。
最とも好ましい態様において、その比は１，２又はそれ
以下である。
【０１０６】本明細書に供給される例はフルオレセイン
類の色素によりラベルされたジデオキシヌクレオチドを
使用するけれども、他の異例なヌクレオチド及び螢光色
素の使用もまた、本発明の範囲内である。他の異例なヌ
クレオチドは、ＤＮＡ合成の生成物をラベルするために
使用され得る螢光ラベルされたｄＮＴＰ、及びプライマ
ー延長生成物をラベルするために使用され得る螢光ラベ
ルされたｒＮＴＰを包含する。他の色素は、他の負に荷
電された螢光色素、たとえばフルオレセインに構造的及
び化学的に類似するＢＯＤＩＰＹを包含する。他の色素
はまた、シアニン色素を包含する。
【０１０７】シアニンによりラベルされたｄＮＴＰは、
Ｅ６８１Ｋ変異（及びＧ４６Ｄ変異）を有するＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼを包含する標準のＰＣＲ反応に添加
された。そのシアニンによりラベルされたｄＮＴＰは、
野生型酵素のためよりも高いレベルで増幅生成物中に組
込まれることが思いがけなく見出された。従って、この
観点においては、本発明のＤＮＡラベリング方法は、本
発明の生来の又は変異体のポリメラーゼ、及び負に荷電
された螢光色素又はシアニン色素のいづれかによりラベ
ルされたヌクレオチドを使用する。
【０１０８】１つの態様においては、本発明のＤＮＡラ
ベリング方法は； ａ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用意し、ここで前記
ポリメラーゼは、 ｉ）前記ポリメラーゼがアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ
（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４で
のＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成り；
そして ii）前記ポリメラーゼが異例なヌクレオチドの組込みに
対して低められた識別性を有することにより特徴づけら
れ； ｂ）負に荷電された螢光色素によりラベルされたヌクレ
オチドを用意し；そして ｃ）ＤＮＡ合成反応を実施することを含んで成る。
【０１０９】もう１つの態様においては、本発明のＤＮ
Ａラベリング方法は、 ａ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用意し、ここで前記
ポリメラーゼは、 ｉ）前記ポリメラーゼがアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ
（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４で
のＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成り；
そして ii）前記ポリメラーゼが異例なヌクレオチドの組込みに
対して低められた識別性を有することにより特徴づけら
れ； ｂ）シアニン色素によりラベルされたヌクレオチドを用
意し；そして ｃ）ＤＮＡ合成反応を実施することを含んで成る。
【０１１０】本発明のもう１つの観点においては、ｒＮ
ＴＰのより効果的な組込みを可能にする変異、たとえば
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの位置６１５でのグルタミ
ン酸からグリシンへの変異、及び本発明の必須のモチー
フを組合す熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが供給される。
その得られる酵素は、フルオレセイン類の色素によりラ
ベルされたリボヌクレオチドの組込みの高められた効率
を有することが予測される。
【０１１１】従って、１つの態様においては、本発明
は、（１）その生来の形において、アミノ酸配列：ＬＳ
ＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、
Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；（２）位置
４のＸが、その位置４のＸがＥに変異誘発されないよう
に変異誘発されており；（３）また、アミノ酸配列：Ｓ
ＱＩＸＬＲ（Ｖ／Ｉ）（配列番号１８）（ここで、Ｘは
Ｅを除く任意のアミノ酸である）である決定的領域を含
んで成り；そして（４）フルオレセイン類の色素により
ラベルされたリボヌクレオチドを効果的に組込むことが
できる組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。
３文字コードにおいては、後者の配列は、ＳｅｒＧｌｎ
ＩｌｅＸａａＬｅｕＡｒｇＸａａ（ここで、位置４での
“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸であり、そし
て位置７の“Ｘａａ”はＶａｌ又はＩｌｅである）とし
て表わされる。
【０１１２】変異体ポリメラーゼドメイン、たとえばＥ
６１５Ｇ及びＥ６８１Ｋ変異を含むＴａｑのためのドメ
インは、フルオレセイン類の色素によりラベルされたプ
ライマー延長生成物を生成する改良された方法において
有用である。たとえば、プライマー延長反応、たとえば
ＰＣＲにおいては、フルオレセイン類の色素によりラベ
ルされたｒＮＴＰが、４種の標準のｄＮＴＰの１つによ
り少なくとも部分的に置換され、そして二重変異体ポリ
メラーゼ、たとえばＥ６８１Ｋ Ｅ６１５ＧＴａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼが含まれる。
【０１１３】その変異体ポリメラーゼは、それらの長さ
にそって種々の位置で、フルオレセインによりラベルさ
れたリボヌクレオチド残基を有するプライマー延長生成
物を合成する。熱又はアルカリ処理に基づいて、そのプ
ライマー延長生成物は、個々のリボヌクレオチド残基で
フラグメント化され、末端をラベルされたフラグメント
の集団が生成される。均等にラベルされたフラグメント
のこの集団は、プライマー延長生成物の長さを通して螢
光ラベルの分布を表わす。それらの特徴を有するラベル
されたフラグメントは、珪素チップ、たとえばＣｒｏｎ
ｉｎなど．，前記のチップに基づく核酸検出型において
有用である。
【０１１４】従って、１つの態様においては、本発明
は、（１）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを供給し、ここ
で前記ポリメラーゼは、（ａ）その生来の形において、
アミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列
番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含ん
で成り；（ｂ）前記位置４のＸが、その位置４でのＸが
Ｅに変異誘発されないように変異誘発されており；
（ｃ）また、アミノ酸配列：ＳＱＩＸＬＲ（Ｖ／Ｉ）
（配列番号１８）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ
酸である）である決定的領域を含んで成り；そして
（ｄ）フルオレセイン及び／又はシアニン種類の色素に
よりラベルされたリボヌクレオチドを効果的に組込むこ
とができることにより特徴づけられ；そして（２）プラ
イマー延長反応を実施することを含んで成る、プライマ
ー延長生成物をラベリングするための方法を提供する。
【０１１５】さらにもう１つの観点においては、本発明
の必須のモチーフを有する酵素は、Ｅ６８１Ｋ Ｆ６６
７Ｙ変異体について例４に示されるように野生型酵素に
比較して早められた延長速度を示す。１つの態様におい
ては、前記酵素は、（１）その生来の形において、それ
はアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配
列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含
んで成り；（２）前記アミノ酸配列が、位置４のＸがＥ
に変異誘発されないように位置４で変異誘発されてお
り；そして（３）それが、野生型酵素に比較して早めら
れた延長速度を有することによって特徴づけられる。
【０１１６】好ましい態様においては、前記酵素は、
（１）その生来の形において、それはアミノ酸配列：Ｌ
ＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここ
で、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；（２）
前記アミノ酸配列が、位置４でのＸがＥに変異誘発され
ないように位置４で変異誘発されており；（３）それが
また、アミノ酸配列：ＭＲＲＸＸＫＸＸＮＹＸＸＸＹＧ
（配列番号１２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であ
る）を含んで成り；そして（４）早められた延長速度を
有することによって特徴づけられる。
【０１１７】より好ましい態様において、前記酵素は、
（１）その生来の形において、それがアミノ酸配列：Ｌ
ＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここ
で、Ｘは任意のアミノ酸である）を含み；そして（２）
前記アミノ酸配列が、位置４でのＸがＫに変異誘発され
ないように位置４で突然誘発されていることによって特
徴づけられる。最とも好ましい態様においては、前記酵
素は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼであり、そしてＥ６
８１Ｋ変異及びＦ６６７Ｙ変異を含む。また、早められ
た延長速度を有するポリメラーゼを用いてのＤＮＡの配
列決定及びラベリングの方法、及び前記方法を行なうた
めのキットは、本発明の範囲内である。
【０１１８】本発明の好ましいＤＮＡ配列決定方法にお
いては、熱安定性ピロホスファターゼが反応混合物に含
まれる。ピロホスファターゼは、ヨーロッパ特許出願番
号ＥＰ−Ａ−７６３５９９及びアメリカ特許第５，６６
５，５５１号に記載される中温性及び変異体の熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼを用いて、配列決定データを増強す
ることが知られている。
【０１１９】典型的な態様においては、本発明の熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼはまた、このヌクレアーゼ活性を
非常に弱くするよう作用する、５′−ヌクレアーゼドメ
インにおける変異を含む。Ｔａｑポリメラーゼの修飾さ
れた形が、１９９２年４月１６日に公開されたＰＣＴ特
許公開番号ＷＯ９２／０６２００、及びアメリカ特許第
５，４６６，５９１号に記載されている。本発明の１つ
の態様においては、アミノ酸位置４６でのグリシン残基
のためのコドンが、アスパラギン酸のためのコドンによ
り置換された（Ｇ４６Ｄ変異）。その得られる酵素は、
低められた５′−ヌクレアーゼ活性のためにサイクル配
列決定反応において高められた利用性を有する。ポリメ
ラーゼドメインアミノ酸配列、及びポリメラーゼ活性
は、野生型酵素に比較して、Ｇ４６Ｄ変異体において
は、両者とも変更されていない。
【０１２０】本発明の商業的態様においては、本発明の
使用により改良される方法を実施するためのキットが、
本発明のさらなる観点であると思われる。ＤＮＡ配列決
定のための１つのそのようなキットは、 ａ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ここで前記ポリメラ
ーゼは、 ｉ）前記ポリメラーゼがアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ
（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４の
ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成り；そ
して ii）前記ポリメラーゼがフルオレセイン類の色素により
ラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた
識別性を有することによって特徴づけられ；及び ｂ）負に荷電された螢光色素によりラベルされた色素−
ターミネーターを含んで成り、そしてさらに、ＤＮＡ配
列決定のための他の試薬、たとえばｄＮＴＰ、熱安定性
ピロホスファターゼ及び適切な緩衝液を含むことができ
る。
【０１２１】もう１つの態様においては、キットにおけ
る酵素は、アミノ酸配列：ＬＳＶＸＬＧ（Ｖ／Ｉ）ＰＶ
ＫＥ（配列番号１５）（ここで、ＸはＥを除く任意のア
ミノ酸である）を有する。３文字コードにおいては、こ
のアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧ
ｌｙＸａａＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号１５）
（ここで、位置４の“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のア
ミノ酸であり、そして位置７の“Ｘａａ”はＶａｌ又は
Ｉｌｅである）として表わされる。
【０１２２】好ましい態様においては、前記アミノ酸配
列は、ＬＳＶＸＬＧＶＰＶＫＥ（配列番号１６）（ここ
で、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）である。３文
字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅ
ｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＶａｌＰｒｏＶａｌＬｙｓ
Ｇｌｕ（配列番号１６）（ここで、位置４の“Ｘａａ”
はＥを除く任意のアミノ酸である）として表わされる。
【０１２３】より好ましい態様においては、位置４の前
記“Ｘａａ”はＡｒｇである。もう１つの好ましい態様
においては、前記アミノ酸配列は、ＬＳＶＸＬＧＩＰＶ
ＫＥ（配列番号１７）（ここで、ＸはＥを除く任意のア
ミノ酸である）である。３文字コードにおいては、この
アミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌ
ｙＩｌｅＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号１７）
（ここで、位置４での“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意の
アミノ酸である）として表わされる。より好ましい態様
においては、位置４での前記“Ｘａａ”はＡｒｇであ
る。
【０１２４】ＤＮＡ配列決定のための他のキットは、変
異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んで成り、ここで
前記ポリメラーゼは、 ａ）その生来の形において、前記ポリメラーゼがアミノ
酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号
１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成
り； ｂ）前記アミノ酸が位置４で変異誘発されており、但
し、位置４でのＸがＥに変異誘発されておらず；そして ｃ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、前記酵素の生
来の形に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベ
ルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別
性を有することによって特徴づけられ、そしてさらに、
ＤＮＡ配列決定のための試薬、たとえば鎖終結化合物、
ｄＮＴＰ、熱安定性ピロホスファターゼ及び適切な緩衝
液を含むことができる。
【０１２５】ターミネーターがラベルされる場合、好ま
しいラベルは螢光色素であり、より好ましくは、ラベル
は負に荷電された螢光色素又はシアニン色素であり、そ
して最とも好ましくは、ラベルはフルオレセイン類の色
素である。好ましい態様において、前記キット中の酵素
は、アミノ酸配列：ＬＳ（Ｑ／Ｇ）ＸＬ（Ｓ／Ａ）ＩＰ
ＹＥＥ（配列番号２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸で
ある）を有する。
【０１２６】３文字コードにおいては、このアミノ酸配
列は、ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＩｌｅＰ
ｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列番号２）（ここで、位置
３の“Ｘａａ”はＧｌｎ又はＧｌｙであり、位置４の
“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、そして位置６の
“Ｘａａ”はＳｅｒ又はＡｌａである）として表わされ
る。より好ましい態様においては、前記アミノ酸配列
は、ＬＳＱＸＬＡＩＰＹＥＥ（配列番号３）（ここで、
Ｘは任意のアミノ酸である）である。３文字コードにお
いては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＧｌｎＸａ
ａＬｅｕＡｌａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列
番号３）（ここで、位置４での“Ｘａａ”は任意のアミ
ノ酸である）として表わされる。最とも好ましい態様に
おいては、位置４での前記“Ｘａａ”は、Ｌｙｓであ
る。
【０１２７】ＤＮＡをラベリングするためのキットは、
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んで成り、ここで前記
ポリメラーゼは、（ａ）その生来の形において、前記ポ
リメラーゼがアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）Ｐ
ＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸で
ある）を含んで成り；（ｂ）前記配列中の位置４のＸが
前記生来の形に比較して変異誘発されており、但し位置
４でのＸはＥには変異誘発されておらず；そして（ｃ）
前記酵素が、その対応する野生型に比較して、フルオレ
セイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込
みに対して低められた識別性を有することによって特徴
づけられ、そしてさらに、ｄＮＴＰ及び適切な緩衝液を
含むことができる。
【０１２８】好ましい態様においては、位置４のＸはＫ
に変異誘発されている。ラベルされたＤＮＡを生成する
ための他のキットは、ａ）負に荷電された螢光化合物に
よりラベルされたヌクレオチド又はヌクレオチド類似
体、及びｂ）次の必須のモチーフ：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／
Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４でのＸ
は、Ｅを除く任意のアミノ酸である）を有する生来の熱
安定性ＤＮＡポリメラーゼ（前記ポリメラーゼは、フル
オレセインによりラベルされたヌクレオチドの組込みに
対して低められた識別性を有する）を含んで成り、そし
てさらに、ｄＮＴＰ及び適切な緩衝液を含むことができ
る。好ましい態様においては、位置４でのＸはＫであ
る。もう１つの好ましい態様においては、位置４でのＸ
はＲである。
【０１２９】プライマー延長生成物をラベリングするた
めのキットは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んで成
り、ここで前記ポリメラーゼは、（ａ）その生来の形に
おいて、前記ポリメラーゼがアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬ
Ｘ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任
意のアミノ酸である）を含んで成り；（ｂ）前記配列中
の位置４でのＸが前記生来の配列に比較して変異誘発さ
れており、但し位置４でのＸはＥに変異誘発されておら
ず；（ｃ）前記ポリメラーゼがまた、第２のアミノ酸配
列：ＳＱＩＸＬＲ（Ｖ／Ｉ）（配列番号１８）（ここ
で、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成
り；そして（ｄ）前記酵素がその対応する野生型酵素に
比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされた
リボヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を
有することによって特徴づけられ、そしてさらに、負に
荷電された螢光化合物又はシアニン化合物によりラベル
されたリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド類似体、
ｄＮＴＰ、及び適切な緩衝液を含むことができる。
【０１３０】好ましい態様においては、ポリメラーゼは
Ｅ６８１Ｋ及びＥ６１５Ｇ変異を含む。ラベルされたプ
ライマー延長生成物を生成するための他のキットは、
ａ）負に荷電された螢光化合物又はシアニン化合物によ
りラベルされたリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド
類似体；及びｂ）生来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを
含んで成り、ここで前記ポリメラーゼは、それが（ｉ）
アミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列
番号７）（ここで、位置４でのＸはＥを除く任意のアミ
ノ酸である）である必須のモチーフを含んで成り；（i
i）第２アミノ酸配列：ＳＱＩＸＬＲ（Ｖ／Ｉ）（ここ
で、ＸがＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成
り；そして（iii ）フルオレセインによりラベルされた
リボヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を
有することによって特徴づけられ、そしてさらに、ｄＮ
ＴＰ及び適切な緩衝液を含むことができる。
【０１３１】好ましい態様においては、第１のアミノ酸
配列における位置４でのＸはＫであり、そして第２のア
ミノ酸配列において、ＸはＧである。もう１つの好まし
い態様においては、第１のアミノ酸配列における位置４
でのＸはＲであり、そして第２のアミノ酸におけるＸは
Ｇである。
【０１３２】
【実施例】次の例は単に例示目的であって、本発明の範
囲を限定するものではない。例１ ．フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌク
レオチドに対して低められた識別性を有する修飾された
Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子の発現 Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＣ−末端アミノ酸部分
は、ポリメラーゼ活性部位ドメインをコードする（Lawy
erなど., 1993, PCR Methods and Applications２：275
-287 ；Freemontなど., 1986, Proteins. Stracturo. F
unction. and Genetics １：66-73 ；それらは引用に
より本明細書に組込まれる）。
【０１３３】この領域を含むＤＮＡフラグメントを、完
全な長さのＴａｑ２遺伝子から単離し、そしてマンガン
の存在下でＰＣＲ増幅により変異誘発した（Leung な
ど., 1989, Technique １ (1)：11-15 ）。この例のた
めに、すべての制限酵素は、New England Biolabs, Bev
erly, MAから入手された。変異誘発されたフラグメント
をＰｓｔＩ及びＢｇｌIIにより消化し、そしてＰｓｔＩ
及びＢｇｌIIによりすでに消化されているＴａｑ発現プ
ラスミドｐＬＫ１０２中にクローン化した。
【０１３４】プラスミドｐＬＫ１０２は、９００bpのＰ
ｓｔＩ−ＢｇｌIIフラグメントが短いＰｓｔＩ−Ｂｇｌ
IIリンカーにより置換されているｐＬＫ１０１の誘導体
である。プラスミドｐＬＫ１０１は、ポリメラーゼコー
ド領域の３′側に位置する小さなＨｉｎｃII／ＥｃｏＲ
Ｖフラグメントが欠失されている、ｐＳＹＣ１５７８
（Ｌａｗｙｅｒなど．，１９９３、前記、及びアメリカ
特許第５，０７９，３５２号）の修飾された形である。
【０１３５】得られる発現プラスミドを用いて、Ｅ．コ
リ株Ｎ１６２４（Ｅ．コリ GeneticStock Center at Ya
le University、株番号ＣＧＳＣ＃５０６６から入手で
きる）を形質転換し、そして得られる形質転換体を、野
生型酵素に比較して、〔α− 32Ｐ〕Ｔｅｔ−ｄＣＴＰを
より効果的に組込む能力についてスクリーンした。この
方法を用いて、〔α−32Ｐ〕Ｔｅｔ−ｄＣＴＰをより効
果的に組込む能力を有する変異体ＣＳ１を同定した。
【０１３６】変異体ＣＳ１の変異誘発されたＴａｑ発現
プラスミドをＨｉｎｄIII ／ＮｈｅＩにより消化し、そ
して得られる制限フラグメントを、ｐＬＫ１０１の野生
型遺伝子中にサブクローン化し、変異誘発されていない
ＨｉｎｄIII ／ＮｈｅＩフラグメントを置換し、変異誘
発されたＴａｑポリメラーゼ遺伝子の一部が変更された
表現型を担当するかどうかについて決定した。Ｈｉｎｄ
III ／ＮｈｅＩ制限フラグメントを含むサブクローン
は、野生型酵素に対して変更された表現型を付与し、こ
れは、変異がこのフラグメント内に存在することを示
す。続くサブクローン分析は、前記変異が２６５bpのＢ
ａｍＨＩ−ＮｈｅＩフラグメントに位置することを決定
した。
【０１３７】２６５bpのＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメ
ントのＤＮＡ配列分析を、AppliedBiosystems, Foster
City, CA からの Taq FS DyeDeoxyTM Terminator Cycle
Sequencing Kit、及びApplied Biosystems Model Pris
m 377 DNA Sequencing Systemを用いて、ｐＣＳ１に対
して実施した。その配列分析は、グルタミン酸（Ｅ）残
基のリシン（Ｋ）残基による置換を引き起こす、アミノ
酸位置６８１でのＴａｑポリメラーゼ遺伝子におけるミ
スセンス変異を同定した。番号付けは、アメリカ特許第
５，０７９，３５２号（引用により本明細書に組込まれ
る）におけるように、成熟タンパク質の最初のメチオニ
ン残基をコードするコドンで開始される。この変異Ｅ６
８１Ｋは特に、コドン配列におけるＧＡＧからのＡＡＧ
への変更により引き起こされる。プラスミドｐＣＳ１
は、１９９７年８月２８日にＡＴＣＣに寄託され、そし
て受託番号９８５２１を得た。
【０１３８】プラスミドｐＣＳ１は、Ｔａｑポリメラー
ゼのためのコード配列に追加の変異を含むことができ；
しかしながら、さらなるサブクローニング実験により、
Ｅ６８１Ｋ変異が、フルオレセイン色素によりラベルさ
れたヌクレオシド三リン酸の組込みにおいて高められた
効率を単独で担当することが決定された。この点変異
は、図１に示される２６５塩基対のＢａｍＨＩ−Ｎｈｅ
Ｉ ＤＮＡフラグメントに位置する。前記２６５bpのＤ
ＮＡフラグメント内でのＥ６８１Ｋ変異は、野生型Ｔａ
ｑポリメラーゼ遺伝子配列からの単なる変更である。
【０１３９】ヌクレオチド類似体の組込みの効率のさら
なる分析及び定量化のために、プラスミドｐＣＳ１の２
６５bpのＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩフラグメントを、ポリメ
ラーゼドメイン内に野生型配列を含むＴａｑ発現ベクタ
ー、ｐＲＤＡ３−２中にクローン化した。クローン３−
２として言及されるプラスミドｐＲＤＡ３−２は、ＰＣ
Ｔ特許公開番号ＷＯ９２／０６２００（引用により本明
細書に組込まれる）に十分に記載されている。Ｅ６８１
Ｋ及びＦ６６７Ｙ変異の両者をコードする第２のクロー
ンを、プライマー指図された変異誘発及びプラスミドｐ
ＲＤＡ３−２のＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ部位中への両変異
を含むＰＣＲ生成物の続くクローニングにより創造し
た。
【０１４０】発現ベクターｐＲＤＡ３−２は、ファージ
λＰL プロモーターに操作可能的に連結される完全な長
さのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む。ベクタ
ーｐＲＤＡ３−２においては、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子の５′−ヌクレアーゼドメインは、５′−ヌ
クレアーゼ活性を低める、位置４６でグリシンをコード
するコドンでの点変異（Ｇ４６Ｄ変異）を含む。しかし
ながら、発現ベクターｐＲＤＡ３−２のポリメラーゼド
メイン内の遺伝子配列は、野生型Ｔａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子配列と同一である。
【０１４１】プラスミドｐＲＤＡ３−２，ｐＣＳ１及び
Ｅ６８１Ｋ Ｆ６６７Ｙ ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩ及
びＮｈｅＩにより消化し、そしてプラスミドｐＣＳ１か
らの２６５bpのＤＮＡフラグメント又はＰＣＲ生成物
を、従来の手段によりベクターｐＲＤＡ３−２中に連結
した。それぞれ、得られるプラスミドｐＬＫ１１２及び
ｐＬＫ１１３を用いて、Ｅ．コリ株ＤＧ１１６（ＡＴＣ
Ｃ番号５３６０６）を形質転換した。それらのプラスミ
ドは、それぞれ、Ｇ４６Ｄ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ及びＧ
４６Ｄ Ｅ６８１Ｋ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑとして本明細
書において言及される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコ
ードする。その発現された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
タンパク質Ｇ４６Ｄ Ｅ６８１Ｋ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ
を、Ｌａｗｙｅｒなど．，１９９３、前記により記載さ
れる方法に従って精製した。
【０１４２】Ｇ４６Ｄ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ酵素を、次
のようにして、類似するが、しかしより小さな規模の調
製方法を用いて精製した：すべての段階は、特にことわ
らない限り４℃で行なわれた。４７５mlの培養物からの
細胞を、３０mlの緩衝液（５０mMのトリス−ＨＣｌ、pH
７．５、１０mMのＥＤＴＡ、pH８．０、０．５mMのＰｅ
ｆａｂｌｏｃ ＳＣ、０．５μｇ／mlのロイペプチン、
０．１mMのＮα−ｐ−トシル−Ｌ−リシンクロロメチル
ケトン、１mMのＤＴＴ）に再懸濁した。細胞を、１分
間、５に設定した５０％能力サイクルで音波処理し、そ
して氷上で１分間、冷却した。この段階をさらに２回く
り返した。
【０１４３】次に、４．０Ｍの硫酸アンモニウム１．５
mlを添加し、そしてその混合物を７５℃の水浴において
１５分間、加熱し、次に氷上で冷却した。ポリエチレン
イミンを添加し、０．６％にし、そしてその混合物を氷
上で１０分間インキュベートした。その混合物を１６，
０００×ｇで３０分間、遠心分離した。上清液を、５０
mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１０mMのＥＤＴＡ、pH
８．０、１mMのＤＴＴ、０．２Ｍの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4
の溶液により平衡化された１．８ml体積のフェニル−セ
ファロースカラム（Ｂｉｏ−ｒａｄ Ｐｏｌｙｐｒｅｐ
クロマトグラフィーカラム）上に負荷した。
【０１４４】カラムを次の３種の溶液それぞれ６mlによ
り洗浄した：１）２５mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、
１mMのＥＤＴＡ、１mMのＤＴＴ、０．２Ｍの（ＮＨ4 ）
2 ＳＯ4 、２）２５mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１
mMのＥＤＴＡ、１mMのＤＴＴ、及び３）２５mMのトリス
−ＨＣｌ、pH７．５、１mMのＥＤＴＡ、１mMのＤＴＴ、
２６％のエチレングリコール。ポリメラーゼを、２５mM
のトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１mMのＥＤＴＡ、１mMの
ＤＴＴ、２０％のエチレングリコール、２．５Ｍの尿素
の溶液６mlにより溶離した。
【０１４５】ポリメラーゼ調製物を３ＭのＫＣｌにより
１００mMに調整した後、その混合物を、２５mMのトリス
−ＨＣｌ、pH７．５、１mMのＥＤＴＡ、１mMのＤＴＴ、
１００mMのＫＣｌの緩衝液により平衡化されたヘパリン
−セファロースカラム（１．８mlの体積のＢｉｏ−ｒａ
ｄ Ｐｏｌｙ−ｐｒｅｐカラム）上に負荷した。同じ緩
衝液により洗浄した後、サンプルを、２５mMのトリス−
ＨＣｌ、pH７．５、１mMのＥＤＴＡ、１mMのＤＴＴ、４
００mMのＫＣｌの緩衝液に溶出した。
【０１４６】精製に続いて、修飾された酵素の活性を、
Lawyerなど., 1989, J. Biol. Chem. 264 ：6427-6437
（引用により本明細書に組込まれる）に記載される活性
アッセイにより決定した。精製された酵素の活性を、次
の通りにして計算した：１単位の酵素は、３０分間合成
された１０ｎモルの生成物に対応する。ＤＮＡポリメラ
ーゼ活性は、組込まれるｄＣＭＰ ８０〜１００ｐモル
まで酵素濃度に直線的に比例する（０．０２４〜０．０
３単位／μｌでの希釈された酵素）。精製された酵素
を、例２〜４に記載される組込み及び配列決定反応に使
用した。
【０１４７】例２．ｄｄＮＴＰの組込みの効率を比較す
るためのアッセイ フルオレセイン類の色素によりラベルされたｄｄＣＴＰ
を組込むＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ，Ｇ４６Ｄ Ｆ
６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ及びＦ７３０ＹＴｍａ３
０ ＤＮＡポリメラーゼの相対的能力を、制限鋳型、プ
ライマー延長競争アッセイの使用により比較した。Ｆ７
３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼは、１９９７
年７月９日に出願されたアメリカ出願番号６０／０５２
０６５の例Ｉ及びヨーロッパ特許出願番号９８１１２３
２７．６（両者は引用により本明細書に組込まれる）に
記載される。
【０１４８】この競争アッセイにおいては、ｄｄＣＴＰ
の組込みは延長反応を終結せしめるので、ポリメラーゼ
が延長されたプライマー中にｄｄＣＴＰをより容易に組
込むほど、〔α−33Ｐ〕ｄＣＴＰの組込みはより低くな
る。従って、ｄｄＣＴＰ組込みの効率が高まるにつれ
て、ＤＮＡ合成の阻害の程度は高められる。次に、ｄｄ
ＣＴＰの組込みの効率を、螢光ラベルされたｄｄＣＴＰ
の組込みの効率に比較し、一定の酵素について、螢光ラ
ベルされたｄｄＮＴＰの組込みの効率の相対的測定を付
与する。
【０１４９】アッセイを、前に記載されるようにして行
なった（Lawyerなど., 1989, J. Biol. Chem. 264 ：64
27）（但し、次の変法を包含する）。アッセイ混合物
は、５０mMのビシン、pH８．３、２５℃、２．５mMのＭ
ｇＣｌ2 、１mMのβ−ヘルカプトエタノール、２０μＭ
の個々のｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（Ｐｅｒｋｉ
ｎ−Ｅｌｍｅｒ）、２０μＭのｄＣＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ
−Ｅｌｍｅｒ）、及び〔α−33Ｐ〕ｄＣＴＰ（New Engl
and Nuclecu, Boston, MA ）から構成された。Ｍ１３ｍ
ｐ１８（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）をプライマーＤＧ
４８（配列番号１０）にアニーリングし、そして同等の
０．０８５ｐモルのアニーリングされた鋳型を、個々の
反応のためのアッセイ混合物に添加した。
【０１５０】鋳型ＤＮＡを有するアッセイ混合物３５μ
ｌを、３８本の０．５mlのｅｌｌｅｎｄｏｒｆ管の個々
に添加した。２５mMのＣＡＰＳＯ緩衝液（pH９．６）
中、Ｚｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの希釈溶液を、それぞれ１
０μｌが反応管に添加される場合、Ｚｏｗｉｅ−ｄｄＣ
ＴＰの最終濃度が３，１，０．５，０．２５，０．１２
５又は０．０６２５μＭになるよう調製した。Ｇ４６Ｄ
Ｆ６６７Ｙ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのためには、
それぞれ３，１，０．５，０．２５，０．１２５μＭの
Ｚｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの２つの管を調製した。
【０１５１】Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａ
ｑ及びＦ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼの
ためには、それぞれ１，０．５，０．２５，０．１２５
及び０．０６２５μＭのＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの２つ
の管を調製した。残る８本の反応管は、２５mMのＣＡＰ
Ｓ０緩衝液（pH９．６）１０μｌを受けた。従って、３
８本の管の個々は、反応混合物３５μｌ、及び２５mMの
ＣＡＰＳＯ緩衝液（pH９．６）１０μｌか又はＺｏｗｉ
ｅ−ｄｄＣＴＰ希釈溶液の１つ（１０μｌ）のいづれか
を含む。
【０１５２】試験されるべき個々の酵素のために、重合
を、個々のＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰ希釈溶液の１本の管
において、及びＣＡＰＳＯ緩衝液のみを含む２本の管に
おいて５μｌの酵素を用いて開始した。酵素の次の濃度
が使用された（個々はアッセイにおいて基質の量に対し
て酵素の過剰量であることが予備決定された）：例１に
おけるようにして調製されたＦ６６７Ｙ Ｇ４６Ｄ Ｔ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼ２．５単位；例１におけるよ
うにして調製されたＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ１．２５単位；又はＦ７
３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼ２単位。
【０１５３】バックグラウンドのレベルのための対照と
して、残る負の対照を、ポリメラーゼよりもむしろ酵素
希釈緩衝液により開始せしめた。すべの反応管はすぐ
に、短時間、かきまぜられ、そして７５℃で１０分間イ
ンキュベートされた。反応を、６０mMのＥＤＴＡ １０
μｌの添加により停止し、そして０℃で貯蔵した。
【０１５４】類似する実験において、ｄｄＣＴＰを、個
々の希釈溶液１０μｌが反応管に添加される場合、その
最終濃度が０．５，０．２５，０．１２５，０．０６２
５又は０．０３１２Ｍになるように、２５mMのＣＡＰＳ
Ｏ緩衝液（pH９．６）に希釈した。個々の希釈溶液１０
μｌを、上記のようなアッセイ混合物３５μｌを含む
０．５mlのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管の個々中にピペットで
入れた。アッセイ混合物３５μｌ及び２５mMのＣＡＰＳ
Ｏ緩衝液（pH９．６）１０μｌを含む４本の管をまた調
製した。従って、１９本の管の個々は、アッセイ混合物
３５μｌ、及び２５mMの個々のＣＡＰＳＯ（pH９．６）
又はｄｄＣＴＰ希釈溶液の１つ１０μｌを含んだ。
【０１５５】重合を、個々のｄｄＣＴＰ希釈溶液の１つ
の管において、及びＣＡＰＳＯ緩衝液の１つの管におい
て、２．５単位のＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼ、１．２５単位のＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ
Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ又は２単位
のＦ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼにより
開始せしめた。ＣＡＰＳＯを含む残りの管を、負の対照
として、ポリメラーゼ含有緩衝液よりもむしろ酵素希釈
緩衝液により開始せしめた。すべての反応はすぐにかき
まぜられ、そして７５℃で１０分間インキュベートされ
た。反応を６０mMのＥＤＴＡ １０μｌの添加により停
止し、そして０℃で貯蔵した。
【０１５６】個々の反応に関して、６０μｌの反応物の
５０μｌアリコートを、２mMのＥＤＴＡ、５０μｇ／ml
の剪断されたサケ精子ＤＮＡ（キャリヤーとしての）溶
液により希釈した。ＤＮＡを標準の方法を用いて、ＴＣ
Ａにより沈殿せしめ、そしてＧＦ／Ｃフィルターディス
ク（Ｗｈａｔｍａｎ）上に集めた。組込まれる〔α− 33
Ｐ〕ｄＣＭＰの量を、個々のサンプルについて測定し、
そしてｄｄＮＴＰを有さないＣＡＰＳＯサンプル（０％
阻害率）に対して標準化した。５０％阻害率のために必
要とされるｄｄＣＴＰ又はＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの濃
度を、個々のサンプルについて計算し、そして表２に示
す。
【０１５７】特定の酵素についての合成を５０％阻害す
るために必要とされるＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの量と合
成を５０％阻害するために必要とされるｄｄＣＴＰの量
との比較は、螢光ラベルされた類似体を組込む個々の酵
素の相対的能力に影響を及ぼす。それらのデータは、Ｇ
４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼが試
験される３種の酵素のＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰを最少の
効率で組込むことを示す（Ｚｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰ対ｄ
ｄＣＴＰによる５０％阻害率のための濃度の比＝２．
５）。
【０１５８】Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラ
ーゼは、Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼよりもより効果的にこのラベルされた類似体を組
込み（Ｚｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰ対ｄｄＣＴＰによる５０
％阻害率のための濃度の比＝４）、そしてＧ４６Ｄ Ｆ
６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
は、ラベルされた及びラベルされていないｄｄＣＴＰを
ほぼ同等の効率で組込む（Ｚｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰ対ｄ
ｄＣＴＰによる５０％阻害率のための濃度の比＝１．
２）。
【０１５９】
【表２】
【０１６０】例３．延長速度アッセイ Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ及びＧ４６Ｄ Ｆ６６７
Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑの延長速度を、延長速度アッセ
イを用いて測定した。この実験においては、酵素は、
〔α−33Ｐ〕ｄＣＴＰの存在下でＭ１３鋳型にアニーリ
ングされるプライマーを延長するために使用された。延
長反応物を変性し、そして生成物を変性アガロースゲル
電気泳動により分析した。
【０１６１】アッセイを、前に記載されるようにして行
なった（Lowyerなど., 1989, J. Biol. Chem. 264 ：64
27）（但し、次の変法を包含する）。アッセイ混合物
は、５０mMのビシン、pH８．３、２５℃、２．５mMのＭ
ｇＣｌ2 、１mMのβ−メルカプトエタノール、２００μ
Ｍの個々のｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（Ｐｅｒｋ
ｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、１００μＭのｄＣＴＰ（Ｐｅｒｋ
ｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、及び〔α−33Ｐ〕ｄＣＴＰ（New
England Nuclecu, Boston, MA ）から構成された。Ｍ１
３ｍｐ１８（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）をプライマー
ＤＧ４８（配列番号１１）にアニーリングし、そして同
等の０．０８５ｐモルのアニーリングされた鋳型を、個
々の反応のためのアッセイ混合物に添加した。鋳型ＤＮ
Ａを有するアッセイ混合物４５μｌを、１４本の０．５
mlのｅｆｆｅｎｄｏｒｆ管の個々に添加した。個々の管
を、重合反応の開始の前、７５℃で少なくとも３０秒間
プレインキュベートした。
【０１６２】重合を、５μｌのＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位）又はＧ４６
Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼ（１．２５単位）を含む１４本のアッセイ管の６本
において開始した。両酵素を例１におけるようにして調
製し、そして使用される濃度は、アッセイにおいて基質
の量に対して酵素の予定された過剰量を表わす。バック
グラウンドのレベルのための対照として、残りの負の対
照を、ポリメラーゼよりもむしろ酵素希釈緩衝液により
開始した。
【０１６３】すべての反応管は、すぐに短時間かきまぜ
られ、そして７５℃でインキュベートされた。Ｇ４６Ｄ
Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む６本
の管のうち２本を、３分間、他の２本を６分間、そして
残りの２本を１０分間インキュベートした。同様に、Ｇ
４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ ＤＮＡポリ
メラーゼにより開始された管のうち２本を３０秒間、他
の２本を１分間、そして残りの２本を２分間インキュベ
ートした。対照の管は３分間インキュベートされた。反
応を、６０mMのＥＤＴＡ １０μｌの添加により停止
し、そして０℃で貯蔵した。
【０１６４】個々の反応のために、６０μｌの反応物の
２５μｌアリコートを、２mMのＥＤＴＡ、５０μｇ／ml
の剪断されたサケ精子ＤＮＡ（キャリヤーとしての）の
溶液１mlにより希釈した。ＤＮＡを標準の方法を用い
て、ＴＣＡにより沈殿せしめ、そしてＧＦ／Ｃフィルタ
ーディスク（Ｗｈａｔｍａｎ）上に集めた。組込まれた
〔α−33Ｐ〕ｄＣＭＰの量を、個々のサンプルについて
測定した。
【０１６５】残る３５μｌの個々の反応物を組合し、そ
してサンプル７０μｌをエタノール沈殿せしめ、乾燥せ
しめ、そして５０mMのＮａＯＨ、１mMのＥＤＴＡ溶液に
再懸濁した。同数の〔α−33Ｐ〕の数が個々から取られ
るように、それらのサンプルからアリコートを除去し
た。それらのアリコートを、０．９％のアルカリアガロ
ースゲル上に負荷し、電気泳動し、乾燥せしめ、そして
これまで記載されているようにしてオートラジオグラフ
ィー処理した（Maniatisなど., 1982, MolecularClonin
g：A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Labora
tory, Cold Spring Harbor, NY ）。制限酵素ＨｉｎｄI
II （ＢＲＬ）により切断され、そして〔 32Ｐ〕により
５′末端をラベルされたバクテリオファージλＤＮＡ
を、分子量標準として使用した。
【０１６６】個々のサンプルにおける延長生成物の塩基
対の長さを、個々のサンプルの移動距離とλＤＮＡサイ
ズ標準により移動される距離とを比較することにより決
定した。個々の生成物における塩基対の数を、インキュ
ベートされた個々の延長反応の秒数により割り算し、下
記に示されるような延長速度を付与した。
【０１６７】
【表３】
【０１６８】それらの結果は、Ｅ６８１Ｋ変異の存在
が、Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ酵素の延長速度を３〜４．３
倍、早めたことを示唆する。
【０１６９】例４．Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びフルオレセイン−ラ
ベルされたｄｄＮＴＰによるサイクル配列決定 この例は、１μＭ又はそれ以下のｄｄＮＴＰ及び少なく
とも１：１００の比のｄｄＮＴＰ：ｄＮＴＰを用いて
の、フルオレセイン色素によりラベルされたターミネー
ターサイクル配列決定への本発明の修飾されたポリメラ
ーゼの適用を示す。フルオレセイン色素によりラベルさ
れたジデオキシターミネーターは、Applied Biosystems
PRISM Sequenase（登録商標）Terminator Sequencing
Kit (Perkin-Elmer, Norwalk, (T) からの試薬であり、
そしてＳｅｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡポリメラーゼ及びα
−チオｄＮＴＰと共に使用するために最適化された。
【０１７０】サイクル配列決定反応を、次の成分を含む
溶液２０μｌにおいて実施した：５０mMのトリス−ＨＣ
ｌ（pH８．８）、２．０mMのＭｇＣｌ2 、１００μＭの
個々のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ（Perkin-Elmer
, Norwalk, CT)、５００μＭのｄＩＴＰ（Pharmacia Bi
otech, Piscataway, NJ ）、０．２μｇのＭ１３ｍｐ１
８一本鎖ＤＮＡ鋳型（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、
０．１５μＭのＬａｃＺＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ
（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、５単位のＧ４６Ｄ Ｆ
６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、
２０単位のｒＴｔｈ熱安定性ピロホスファターゼ（ヨー
ロッパ特許出願、公開番号ＥＰ−Ａ−７６３５９９及び
アメリカ特許第５，６６５，５５１号）、０．０５μＭ
のＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ａ色素ターミネーター、０．８
０μＭのＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ｃ色素ターミネーター、
０．０８μＭのＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ｇ色素ターミネー
ター、及び１．０μＭのＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ｔ色素タ
ーミネーター。
【０１７１】すべての４種のＳｅｑｕｅｎａｓｅ色素タ
ーミネーターは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒから入手さ
れた。反応物を、予備加熱（７５℃）されたＰｅｒｋｉ
ｎ−Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ
Ｓｙｓｔｅｍ９６００熱サイクラーに配置し、そして９
６℃で１０分間、５０℃で５秒間、及び６０℃で４分間
の２５サイクルにゆだねた。色素によりラベルされたフ
ラグメントを、製造業者の説明書に従って、Ｃｅｎｔｒ
ｉ−ＳｅｐTMカラム（Princeton Separation,Adelphia,
NJ）により精製し、そして真空遠心分離機により乾燥
せしめた。
【０１７２】ペレットを、脱イオン化されたホルムアミ
ド：５０mg／mlのブルーデキストラン（２５mMのＥＤＴ
Ａ（pH８．０）中）の５：１（ｖ／ｖ）溶液６μｌに再
懸濁し、そして予備電気泳動された４％ポリアクリルア
ミド／６Ｍ尿素ゲル上に直接的に負荷し、そして電気泳
動せしめ、そして製造業者の説明書に従って、Perkin-E
lmer AB1 PRISM 377 DNA Sequencer上で分析した。Perk
in-Elmer AB2 PRISM 377 DNA Sequencer分析ソフトウェ
アによる自動化された塩基−コーリングは、４５０塩基
について９８．５％以上の精度をもたらした（プライマ
ーからの塩基＋１０〜＋４６０について６個の誤差）。
【０１７３】
【配列表】
（１）一般情報： （ii）発明の名称：配列決定のための変更された熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼ （iii ）配列の数：１８ （２）配列番号１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１１個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置：７ （Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｘａａ／注＝“位置７のＸ
ａａはＶａｌ又はＩｌｅである。”
【０１７４】（２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１１個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置：３．．６ （Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｘａａ／注＝“位置３のＸ
ａａはＧｌｎ又はＧｌｙである。位置６のＸａａはＳｅ
ｒ又はＡｌａである。”
【０１７５】（２）配列番号３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１１個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド
【０１７６】 （２）配列番号４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１１個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置：７ （Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｘａａ／注＝“位置７のＸ
ａａはＶａｌ又はＩｌｅである。”
【０１７７】（２）配列番号５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１１個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド
【０１７８】（２）配列番号６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１１個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド
【０１７９】（２）配列番号７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１１個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置：４．．７ （Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｘａａ／注＝“位置４のＸ
ａａは、任意のアミノ酸であるが、しかしグルタミン酸
残基ではない。位置７のＸａａはＶａｌ又はＩｌｅであ
る。”
【０１８０】（２）配列番号８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１１個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置：４ （Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｘａａ／注＝“位置４のＸ
ａａはＧｌｕを除く任意のアミノ酸である。”
【０１８１】（２）配列番号９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１１個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置：２．．５ （Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｘａａ／注＝“位置２のＸ
ａａはＳｅｒ又はＡｌａであり、位置４のＸａａはＧｌ
ｕを除く任意のアミノ酸であり、そして位置５のＸａａ
はＬｅｕ又はＩｌｅである。”
【０１８２】（２）配列番号１０についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１１個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置：４ （Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｘａａ／注＝“位置４のＸ
ａａはＧｌｕを除く任意のアミノ酸である。”
【０１８３】（２）配列番号１１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（xi）配列：配列
番号１１：GGGAAGGGCG ATCGGTGCGG GCCTCTTCGC
30
【０１８４】（２）配列番号１２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号１２： Met Arg Arg Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Asn Tyr Xaa Xaa Xaa Tyr Gly 1 5 10 15
【０１８５】（２）配列番号１３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１１個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置：３．．６ （Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｘａａ／注＝“位置３のＸ
ａａはＧｌｎ又はＧｌｙである。位置４のＸａａはＧｌ
ｕを除く任意のアミノ酸である。位置６のＸａａはＳｅ
ｒ又はＡｌａである。”
【０１８６】（２）配列番号１４についての情報：
（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１１個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロ
ジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域（Ｂ）位置：４（Ｄ）他の情
報：／ラベル＝Ｘａａ／注＝“位置４のＸａａはＧｌｕ
を除く任意のアミノ酸である。”
【０１８７】（２）配列番号１５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１１個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置：４．７ （Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｘａａ／注＝“位置４のＸ
ａａはＧｌｕを除く任意のアミノ酸である。位置７のＸ
ａａはＶａｌ又はＩｌｅである。”
【０１８８】（２）配列番号１６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１１個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置：４ （Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｘａａ／注＝“位置４のＸ
ａａはＧｌｕを除く任意のアミノ酸である。”
【０１８９】（２）配列番号１７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１１個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置：４ （Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｘａａ／注＝“位置４のＸ
ａａはＧｌｕを除く任意のアミノ酸である。”
【０１９０】（２）配列番号１８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置：４．．７ （Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｘａａ／注＝“位置４のＸ
ａａはＧｌｕを除く任意のアミノ酸である。位置７での
ＸａａはＶａｌ又はＩｌｅである。”
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の
図示である。例１、及び本明細書に提供されるさらなる
変異体及び発現ベクターを調製するための方法の記載に
関する制限部位が示される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 リサ ビビアン カルマン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94131, サン フランシスコ，パノラマ ドライブ 202 (72)発明者 トーマス ダブリュ．マイヤーズ アメリカ合衆国，カリフォルニア，アラメ ダ，フェーンサイド ブールバード 2910 (72)発明者 フレッド ロウレンス レルチャート アメリカ合衆国，カリフォルニア 94610, オークランド，ウォーフィールド アベニ ュ 859 (72)発明者 クリストファー リン シグア アメリカ合衆国，カリフォルニア，アンチ オク，ブリドル コート 4825

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであ
    って、 ａ）その生来の形において、前記ポリメラーゼが次のア
    ミノ酸配列：ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＸ
    ａａＰｒｏＸａａＸａａＧｌｕ（配列番号１）（ここ
    で、前記配列の位置３，４，６，９及び１０での“Ｘａ
    ａ”は任意のアミノ酸残基であり、そして前記配列の位
    置７の“Ｘａａ”はＶａｌ又はＩｌｅである）を含んで
    成り； ｂ）位置４での前記“Ｘａａ”が前記生来の配列に比較
    して変異誘発されており、但し位置４の“Ｘａａ”はＧ
    ｌｕには変異誘発されておらず；そして ｃ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、前記ポリメラ
    ーゼの生来の形に比較して低められた、フルオレセイン
    類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対
    する識別のレベルを有することを特徴とする組換え熱安
    定性ＤＮＡポリメラーゼ。
  2. 【請求項２】 前記ヌクレオチドがジデオキシヌクレオ
    チドであり、そして前記識別のレベルが前記ポリメラー
    ゼの生来形の識別のレベルよりも少なくとも３倍低い請
    求項１記載の組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
  3. 【請求項３】 前記識別のレベルが、ＤＮＡ合成の５０
    ％阻害のために必要とされる、フルオレセイン色素によ
    りラベルされるジデオキシヌクレオチドの濃度を決定す
    ることによって測定される請求項２記載の組換え熱安定
    性ＤＮＡポリメラーゼ。
  4. 【請求項４】 前記ポリメラーゼが、サーモシフォ・ア
    フリカナス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎ
    ｕｓ）、バシラス・カルドテナクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
    ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）及びバシラス・ステアロサー
    モフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
    ｍｏｐｈｉｌａｓ）から成る群から選択された好熱種由
    来である請求項２記載の組換え熱安定性ＤＮＡポリメラ
    ーゼ。
  5. 【請求項５】 前記ポリメラーゼが、サーマス・スペー
    シス（Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｓｐｅｃｉｅｓ）種からである
    請求項２記載の組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
  6. 【請求項６】 ａ）その生来の形において、前記ポリメ
    ラーゼが次のアミノ酸配列：ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａ
    ＬｅｕＸａａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列番
    号２）（ここで位置３の前記“Ｘａａ”はＧｌｎ又はＧ
    ｌｙであ、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であ
    り、そして位置６の“Ｘａａ”はＳｅｒ又はＡｌａであ
    る）を含んで成り； ｂ）位置４の前記“Ｘａａ”が前記生来の配列に比較し
    て変異誘発されており、但し位置４の“Ｘａａ”はＧｌ
    ｕには変異誘発されておらず；そして ｃ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、前記ポリメラ
    ーゼの生来の形に比較して低められた、フルオレセイン
    類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対
    する識別のレベルを有することを特徴とする請求項２記
    載の組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
  7. 【請求項７】 ａ）その生来の形において、前記ポリメ
    ラーゼが次のアミノ酸配列：ＬｅｕＳｅｒＧｌｎＸａａ
    ＬｅｕＡｌａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列番
    号３）（ここで、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸
    である）を含んで成り； ｂ）位置４の前記“Ｘａａ”が前記生来の配列に比較し
    て変異誘発されており、但し位置４の“Ｘａａ”はＧｌ
    ｕには変異誘発されておらず；そして ｃ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、前記ポリメラ
    ーゼの生来の形に比較して低められた、フルオレセイン
    類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対
    する識別のレベルを有することを特徴とする請求項６記
    載の組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
  8. 【請求項８】 位置４の前記“Ｘａａ”がＬｙｓに変異
    誘発されていることを特徴とする請求項７記載の組換え
    熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
  9. 【請求項９】 前記ポリメラーゼがサーモトガ・スペー
    シス（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ Ｓｐｅｃｉｅｓ）からで
    ある請求項２記載の組換え熱安定性ＤＮＡポリメラー
    ゼ。
  10. 【請求項１０】 ａ）その生来の形において、前記ポリ
    メラーゼが次のアミノ酸配列：ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａ
    ａＬｅｕＧｌｙＸａａＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列
    番号４）（ここで、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ
    酸、好ましくはＡｒｇであり、そして位置７の“Ｘａ
    ａ”がＶａｌ又はＩｌｅである）を含んで成り； ｂ）位置４の前記“Ｘａａ”が前記生来の配列に比較し
    て変異誘発されており、但し位置４の“Ｘａａ”はＧｌ
    ｕには変異誘発されず；そして ｃ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、前記ポリメラ
    ーゼの生来の形に比較して低められた、フルオレセイン
    類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対
    する識別のレベルを有することを特徴とする請求項９記
    載の組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
  11. 【請求項１１】 請求項１〜１０のいづれか１項記載の
    組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸配
    列。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜１０のいづれか１項記載の
    組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸配
    列を含んで成るベクター。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜１０のいづれか１項記載の
    組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸配
    列を含んで成る宿主細胞。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜１０のいづれか１項記載の
    組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを調製するための方
    法であって、 ａ）請求項１〜１０のいづれか１項記載の組換え熱安定
    性ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を含んで成
    る宿主細胞を、前記組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
    の発現を促進する条件下で培養し；そして ｂ）前記宿主細胞又は培地から前記組換え熱安定性ＤＮ
    Ａポリメラーゼを単離することを含んで成る方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１４記載の方法により調製され
    た組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
  16. 【請求項１６】 ＤＮＡ配列決定のための方法であっ
    て、 ａ）請求項１〜１０のいづれか１項記載の組換え熱安定
    性ＤＮＡポリメラーゼを用意し； ｂ）負に荷電された螢光色素によりラベルされた色素−
    ターミネーターを用意し；そして ｃ）色素−ターミネーター配列決定反応を行なう；こと
    を含んで成る方法。
  17. 【請求項１７】 前記組換え熱安定性ＤＮＡポリメラー
    ゼがフルオレセイン類によりラベルされたヌクレオチド
    の組込みに対する識別の低められたレベルを有し、そし
    て前記ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドであり、
    そして前記識別のレベルが、ＤＮＡ合成の５０％阻害の
    ために必要とされるフルオレセイン色素によりラベルさ
    れたジデオキシヌクレオチドの濃度対５０％阻害のため
    に必要とされるラベルされていないジデオキシヌクレオ
    チドの濃度の比を決定することによって測定される請求
    項１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記比が４以下である請求項１７記載
    の方法。
  19. 【請求項１９】 ラベルされたＤＮＡを生成するための
    方法であって、 ａ）請求項１〜１０のいづれか１項記載の組換え熱安定
    性ＤＮＡポリメラーゼを用意し； ｂ）フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレ
    オチドを用意し；そして ｃ）ＤＮＡ合成反応を実施する；ことを含んで成る方
    法。
  20. 【請求項２０】 ラベルされたプライマー延長生成物の
    生成方法であって、ａ）請求項１〜１０のいづれか１項
    記載の組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用意し、こ
    こで ｉ）前記ポリメラーゼは、次のアミノ酸配列：ＬｅｕＳ
    ｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＸａａＰｒｏＶａｌＬｙ
    ｓＧｌｕ（配列番号４）（ここで、位置４での“Ｘａ
    ａ”は任意のアミノ酸であり得るが、但し、Ｇｌｕでは
    なく、そして前記配列の位置７の“Ｘａａ”がＶａｌ又
    はＩｌｅである）を含んで成り、 ii）前記ポリメラーゼがフルオレセイン類の色素により
    ラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた
    識別レベルを有し、 iii ）前記ポリメラーゼがまた、第２アミノ酸配列ＳＱ
    ＩＸＬＲ（Ｖ／Ｉ）（配列番号１８）（ここで、“Ｘ”
    は任意のアミノ酸であり、但しＥではない）を含んで成
    り、そして iv）前記ポリメラーゼがフルオレセイン類の色素により
    ラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた
    識別を有し； ｂ）フルオレセイン類の色素によりラベルされたリボヌ
    クレオチドを用意し；そして ｃ）プライマー延長反応を実施する；ことを含んで成る
    方法。
  21. 【請求項２１】 インビトロＤＮＡ合成用途、たとえば
    ＤＮＡ配列決定、ラベルされたＤＮＡの合成、及びラベ
    ルされたプライマー延長生成物の生成への、請求項１〜
    １０のいづれか１項記載の組換え熱安定性ＤＮＡポリメ
    ラーゼの使用。
  22. 【請求項２２】 請求項１〜１０のいづれか１項記載の
    組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及び負に荷電され
    た螢光色素によりラベルされたターミネーターを含んで
    成るＤＮＡ配列決定のためのキット。
  23. 【請求項２３】 前記組換え熱安定性ＤＮＡポリメラー
    ゼが、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌク
    レオチドの組込みに対して減じられた識別性を有し、そ
    して前記低められた識別レベルが、ラベルされていない
    ｄｄＮＴＰのための濃度に比較しての、ＤＮＡ合成の５
    ０％阻害のために必要とされるフルオレセイン種類の色
    素によりラベルされたｄｄＮＴＰの濃度の比を決定する
    ことによって測定され、そして前記比が４又はそれ以下
    である請求項２２記載のキット。
  24. 【請求項２４】 前記識別レベルが、前記ポリメラーゼ
    の生来形の識別レベルよりも少なくとも５倍低い請求項
    ２３記載のキット。
  25. 【請求項２５】 請求項１〜１０のいづれか１項記載の
    組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及び負に荷電され
    た螢光色素によりラベルされたヌクレオチドを含んで成
    る、ラベルされたＤＮＡを生成するためのキット。
  26. 【請求項２６】 請求項１〜１０のいづれか１項記載の
    組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及びフルオレセイ
    ン類の色素によりラベルされたリボヌクレオチドを含ん
    で成る、ラベルされたプライマー延長生成物を生成する
    ためのキット。
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