JP4417452B2 - 配列決定のための変更された熱安定性ｄｎａポリメラーゼ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオシド三リン酸を組込むための増強された効率を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに関する。本発明は、そのような変更されたポリメラーゼを単離し、そして生成するための手段を提供する。本発明の酵素は、分子生物学における多くの用途のために有用であり、そして核酸配列決定のために特に好都合である。
【０００２】
【従来の技術】
螢光色素によりラベルされたヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の組込みは、多くのインビトロＤＮＡ合成用途のために重要である。たとえば、色素−ターミネーターＤＮＡ配列決定反応は、終結及びラベリングのために螢光ジデオキシヌクレオチド類似体の組込みを必要とする。さらに、ラベルされた生成物のインビトロ合成は、螢光ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の組込みを含むことができる。たとえば、螢光ラベルされたＤＮＡは、固定されたプローブのマイクロアレイを用いてのハイブリダイゼーションアッセイに使用されて来た（Ｃｒｏｎｉｎなど., 1996, Human Mutation ７：244 ）。
【０００３】
ＤＮＡ複製の再生を確実にするためには、ＤＮＡポリメラーゼは、従来のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）として本明細書において言及されるそれらの通常の基質の組込みのために、及び螢光色素によりラベルされたｄＮＴＰ及びｄＮＴＰ類似体を包含する異例なｄＮＴＰの組込みに対して非常に強い偏向を有する。細胞においては、この性質が、成長するＤＮＡ鎖において異常な塩基、たとえばｄＵＴＰの組込みを弱める。インビトロでは、この特徴は、従来及び異例な螢光ラベルされたヌクレオチド三リン酸の両者が存在する場合、たとえば色素−ターミネーターを用いるジデオキシ鎖終結方法のバージョンを用いてのＤＮＡ配列決定反応において特に明白である（Ｌｅｅなど., 1992, Acids. Res. 20 : 2471；引用により本明細書に組込まれる）。
【０００４】
色素−ターミネーター方法のための市販されているＤＮＡサイクル配列決定キットは、ローダミン類の螢光色素によりラベルされた鎖ターミネーターｄｄＮＴＰを使用する。しかしながら、ローダミン色素は電荷において両性であり、そしてそれらの色素によりラベルされたヌクレオシド三リン酸は検出のための配列決定生成物を分離するために使用される電気泳動ゲルにおいて異常に移動する。ローダミン類の色素のこの性質が、電気泳動の前、ｄＩＴＰの使用及び追加の処理段階を包含する、標準的配列決定プロトコールにおける変更の必要性を引き起こす。
【０００５】
対照的に、負に荷電された螢光色素、たとえばフルオレセイン類の色素は、１）ラベルされたヌクレオシド三リン酸とラベルされたプライマー延長生成物との間の良好な分離、及び２）中性又は正に荷電された螢光色素よりも、ラベルされた配列決定生成物の良好な電気泳動移動を可能にする。従って、フルオレセイン類の色素の使用は、ローダミン類の色素の使用により必要とされる追加の処理段階のための必要性を回避する。しかしながら、フルオレセイン類の利用できる色素は、現在市販されているＤＮＡサイクル配列決定形式への使用のためには理想的ではない。
【０００６】
なぜならば、それらの色素によりラベルされたｄｄＮＴＰは、それらの形式を用いて、配列決定生成物中に効果的に組込まれないからである。従って、常用のヌクレオチド及びフルオレセイン−ラベルされたヌクレオチドの両者を効果的に組込むことができる、商業的に利用できる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼについての必要性が存在する。本発明はその必要性を満たすように機能する。さらに、本発明の変異酵素の思いがけない性質は、その対応する野生型酵素に比較してプライマー延長の早められた速度である。もう１つの思いがけない性質は、自動化されたＤＮＡ配列分析における種々のターミネーターヌクレオチドの組込みの高められた均等性である。
【０００７】
【発明の要約】
本発明は、これまでに特徴づけられた酵素に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有する鋳型−依存性熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を提供する。それらの酵素は、ヌクレオチド、たとえばデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、及び塩基類似体、たとえばジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を組込み、それらは常用の熱安定性酵素よりもより効果的にフルオレセイン類の色素によりラベルされる。それらの酵素をコードする遺伝子はまた、多量の精製された酵素を供給するために組換え発現ベクターとして、本発明により供給される。
【０００８】
本発明によれば、天然のヌクレオチドを正確に組込む能力を保持しながら、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドを組込むポリメラーゼの能力に影響を及ぼす、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ内の必須領域が同定される。この必須領域、又は必須モチーフ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｍｏｔｉｆ）は、本発明の利点を供給するために組換えＤＮＡ法、たとえば部位特異的変異誘発により熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのための遺伝子中に導入され得る。
従って、１つの観点においては、本発明は組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を提供し、ここで前記酵素は、必須のモチーフを生成するよう変異誘発されており、そしてその対応する野生型酵素に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対しての低められた識別性を有するように変異誘発されていることにより特徴づけられる。
【０００９】
この観点において、本発明は組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を供給し、ここで前記酵素は、ａ）その生来の形において、前記ポリメラーゼが次のアミノ酸配列（一文字コードで与えられる）：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；ａ）前記配列における位置４のＸが前記生来の配列に比較して変異誘発されており、但し、ＸはＥには変異誘発されておらず；そしてｃ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、前記酵素の生来の形に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有する、ことにより特徴づけられる。３文字コードにおいては、前記アミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＸａａＰｒｏＸａａＸａａＧｌｕ（配列番号１）（ここで、この配列中の位置３，４，６，９及び１０の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸残基であり、そしてこの配列中の位置７の“Ｘａａ”はＶａｌ又はＩｌｅである）として表わされる。
【００１０】
もう１つの態様においては、組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ａ）そのポリメラーゼの生来の形が次のアミノ酸配列：ＬＳ（Ｑ／Ｇ）ＸＬ（Ｓ／Ａ）ＩＰＹＥＥ（配列番号２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；ｂ）前記配列における位置４のＸが前記生来の配列に比較して変異されており、但しＸはＥへは変異誘発されておらず；そしてｃ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、前記酵素の生来の形に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対する低められた識別性を有することにより特徴づけられる。
【００１１】
３文字コードにおいて、前記アミノ酸は、ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列番号２）（ここで、位置３の“Ｘａａ”はＧｌｎ又はＧｌｙであり、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、そして位置６の“Ｘａａ”はＳｅｒ又はＡｌａである）として表わされる。好ましい態様においては、前記アミノ酸配列は、ＬＳＱＸＬＡＩＰＹＥＥ（配列番号３）（ここでＸは任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＧｌｎＸａａＬｅｕＡｌａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列番号３）（ここで、位置４での“Ｘａａ”は任意のアミノ酸である）として表わされる。より好ましい態様においては、位置４の“Ｘａａ”はＬｙｓである。
【００１２】
さらにもう１つの態様において、組換え安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ａ）そのポリメラーゼの生来形が次のアミノ酸配列：ＬＳＶＸＬＧ（Ｖ／Ｉ）ＰＶＫＥ（配列番号４）を含んで成り；ｂ）前記配列におけるＸが前記生来の配列に比較して変異誘発されており、但しＸはＥに変異誘発されておらず；そしてｃ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが前記酵素の生来の形に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対する低められた識別性を有することにより特徴づけられる。
【００１３】
３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＸａａＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号４）（ここで、位置４での“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、そして位置７の“Ｘａａ”はＶａｌ又はＩｌｅである）として表わされる。好ましい態様においては、前記アミノ酸配列は、ＬＳＶＸＬＧＶＰＶＫＥ（配列番号５）（ここで、位置４のＸは任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＶａｌＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号５）（ここで、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸である）として表わされる。
【００１４】
より好ましい態様において、位置４の“Ｘａａ”はＡｒｇである。もう１つの好ましい態様においては、アミノ酸配列は、ＬＳＶＸＬＧＩＰＶＫＥ（配列番号６）（ここで、位置４のＸは任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいて、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＩｌｅＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号６）（ここで、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸である）として表わされる。より好ましい態様において、位置４の“Ｘａａ”は、Ａｒｇである。
【００１５】
本発明のもう１つの態様において、本発明の特定の必須領域は、異例なヌクレオチド、たとえばｒＮＴＰ及びｄｄＮＴＰの組込みに対して低められた識別性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを供給することが知られている、ポリメラーゼ遺伝子の他の領域におけるモチーフと組合され得る。本明細書において例示される場合、２種の変異を含む組換えサーマス・アクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ酵素が構成された。第１の変異は、本発明の必須モチーフの位置４のＸ残基におけるＥのＫへの変異であった。第２の変異は、Ｆ６６７Ｙ変異として知られているｄｄＮＴＰのより効果的な組込みを可能にする変異であった。
【００１６】
この変異は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの位置６６７でのフェニルアラニンのチロシンへの変異である（アメリカ特許第５，６１４，３６５号及びアメリカ出願番号第８／４４８，２２３号に記載され、そして引用により本明細書に組込まれる）。フルオレセイン類の色素によりラベルされたｄｄＮＴＰとの配列決定反応に使用される場合、Ｅ６８１Ｋ Ｆ６６７Ｙ二重変異体酵素が、読取ることができる配列決定ラダーを生成することが見出された。従って、１つの態様において、ジデオキシヌクレオチドに対する低められた識別性を付与するモチーフが、本発明の決定的モチーフと組合され、ラベルされた及びラベルされていない両ｄｄＮＴＰの組込みの高められた効率を有する酵素が提供される。
【００１７】
さらに、Ｅ６８１Ｋ Ｆ６６７Ｙ変異体酵素は、Ｆ６６７Ｙ変異のみを有する酵素に比較して、有意に早められた延長速度を示すことが思いがけなく見出された。従って、本発明のもう１つの態様においては、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素中への必須のモチーフの、単独での又は他のモチーフと組合しての導入が、早められた延長速度を有する酵素を生成する。
【００１８】
二重変異体酵素はまた、ローダミンによりラベルされたターミネーターを用いての色素−ターミネータージデオキシ配列決定においてより均等なピークの高さを生成することが思いがけなく見出された。従って、さらにもう１つの態様においては、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素中への必須のモチーフの導入は、ローダミン類の色素によりラベルされたターミネーターを用いてのＤＮＡ配列決定方法においてより均等なピークの高さを示す酵素を生成する。
【００１９】
もう１つの態様においては、ｒＮＴＰの一層効果的な組込みを可能にする変異、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの位置６１５のグルタミン酸からグリシンへの変異、又はＥ６１５Ｇ変異（引用により本明細書に組込まれるヨーロッパ特許出願公開番号ＥＰ−Ａ−８２３４７９に記載される）が、本発明の必須のモチーフと組合され、フルオレセイン類の色素によりラベルされたリボヌクレオチドの組込みの高められた効率を有する酵素が供給される。
【００２０】
もう１つの観点においては、本発明のポリメラーゼをコードする遺伝子もまた提供される。特に、本発明の必須のモチーフを含んで成る組換え熱安定性ポリメラーゼをコードする遺伝子が供給される。本発明の必須のモチーフを生成する変異を包含する複数の変異の組合せをコードする遺伝子もまた、この観点に包含される。
【００２１】
さらにもう１つの観点においては、本発明はまた、より低い濃度のフルオレセイン類の色素によりラベルされたｄｄＮＴＰの使用を可能にし、それにより、反応を実施する費用を減じる、ＤＮＡ配列決定の改良された方法を提供する。本発明の改良された方法はまた、低い比のフルオレセイン類の色素によりラベルされたｄｄＮＴＰ：ｄＮＴＰの使用を可能にする。それらの方法の使用は、多くの利点、たとえばより効果的な重合、低濃度の必要とされる鋳型核酸、及び反応混合物へのインヒビターを導入する可能性の低下をもたらす。それらの利点はまた、長い鋳型の配列決定を促進する。本発明はまた、配列決定反応が、中間の精製を伴わないで、続く電気泳動のための配列決定ゲル上に直接的に負荷され得る、改良された配列決定方法を提供する。
【００２２】
従って、本発明の１つの態様においては、本発明は、ａ）本発明の必須のモチーフを生成する位置４での変異を有し、そしてｂ）対応する野生型酵素に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対する低められた識別性を有する組換え酵素を用いての標的核酸の配列を決定するための改良された方法を提供する。
【００２３】
本発明の必須のモチーフを生成する天然に存在する配列変動を含む、好熱種に由来する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いての改良された配列決定方法はまた、本発明の範囲内である。それらの生来の酵素はまた、異例なヌクレオチドの組込みに対する低められた識別性も提供することができる。この態様において、本発明は、ａ）位置４におけるアミノ酸がＧｌｕではない本発明の必須のモチーフを有し、そしてｂ）フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対する低められた識別性を有する生来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いての改良された配列決定方法を提供する。
【００２４】
フルオレセイン類の色素によりラベルされたＤＮＡを生成するための改良された方法もまた、本発明の範囲内である。本発明の酵素は、種々の部位でフルオレセイン類の色素によりラベルされる増幅された生成物を生成するポリメラーゼ連鎖反応方法にフルオレセイン−ラベルされたｄＮＴＰを効果的に組込む。従って、１つの態様においては、ＤＮＡをラベリングする改良された方法は、ａ）フルオレセイン類の色素によりラベルされたｄＮＴＰ及び本発明の酵素を含んで成る反応混合物を提供し、そしてｂ）核酸増幅反応を実施することを含んで成る。
【００２５】
本発明の方法、及びそれらの酵素をコードする遺伝子は、本発明の組換え酵素を含んで成り、そしてさらに、負に荷電された螢光ターミネーター化合物を含むＤＮＡ配列決定のためのキットである本発明のさらなる観点を供給する。ＤＮＡ配列決定のための他のキットは、ａ）負に荷電された螢光ターミネーター化合物、及びｂ）本発明の生来の酵素を含んで成る。
本発明はまた、本発明の組換え酵素を含んで成る、ラベルされたＤＮＡを生成するためのキットも提供する。ラベルされたＤＮＡを生成するための他のキットは、ａ）負に荷電された螢光ヌクレオチド三リン酸化合物、及びｂ）本発明の生来の酵素を含んで成る。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本発明の理解を促進するために、多くの用語が下記に定義される。
用語“遺伝子”とは、回収できる生物活性ポリペプチド又は前駆体の生成のために必要な制御及びコード配列を含んで成るＤＮＡ配列を意味する。前記ポリペプチドは、完全な長さの遺伝子配列により、又は酵素活性が保持される限り、コード配列のいづれかの部分によりコードされ得る。
【００２７】
用語“生来の”とは、天然に存在する源から単離される遺伝子又は遺伝子生成物を意味する。この用語はまた、生来の形のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する、分子生物学的技法により生成された生来のタンパク質の組換え形も言及する。
用語“変異体”とは、その核酸配列が変更されている遺伝子、又はそのアミノ酸配列が変更されている遺伝子生成物を意味し、それにより、生来の又は野生型遺伝子又は遺伝子生成物に比較される場合、変更された機能的性質を有する遺伝子生成物をもたらす。そのような変更は、点変異、欠失及び挿入を包含する。
【００２８】
用語“宿主細胞”とは、単細胞原核及び真核生物、たとえば細菌、酵母及び放線菌、及び細胞培養において増殖される場合、高等植物又は動物からの単一細胞を意味する。
用語“発現系”とは、作用可能に連結されたコード配列及び制御配列を含むＤＮＡ配列を意味し、その結果、それらの配列により形質転換された宿主細胞はコードされたタンパク質を生産することができる。形質転換をもたらすためには、その発現システムはベクター上に包含され得る、そしてその対応するＤＮＡもまた、宿主染色体中に組込まれ得る。
【００２９】
用語“オリゴヌクレオチド”は、本明細書において使用される場合、複数の、好ましくは３個よりも多くの、及び通常、１０個よりも多くのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成される分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、多くの要因、たとえばオリゴヌクレオチドの究極的な機能又は使用に依存するであろう。
【００３０】
オリゴヌクレオチドは、たとえば適切な配列のクローニング及び制限酵素処理を包含するいづれか適切な方法により、及びたとえば次の方法による直接的な化学合成により調製され得る：Narangなど., 1979, Meth. Enzymol. 68：90-99 のホスホトリエステル法；Brown など., 1979, Meth. Enzymol. 68：109-151 のホスホジエステル法；Beaucageなど., 1981, Tetrahedron Lett. 22 ：1859-1862 のジエチルホスホラミジット法；Matteucci など., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103：3185-3191 のトリエステル法、又はアメリカ特許第４，４５８，０６６号の固体支持法（それらは引用により本明細書に組込まれる）。
【００３１】
用語“プライマー”とは、本明細書において使用される場合、プライマー延長が開始される条件下で配置される場合、合成の開始の点として作用することができる、天然又は合成のいづれかのオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは好ましくは、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーの適切な長さは、プライマーの意図された使用に依存するが、しかし典型的には１５〜３５個のヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一般的に、鋳型との十分に安定したハイブリッド複合体を形成するためには、より低い温度を必要とする。プライマーは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、しかし生じるプライマー延長のための鋳型とハイブリダイズするために十分に相補的であるべきである。
【００３２】
プライマーは、所望により、分光学、光化学、生化学、免疫化学又は化学手段により検出できるラベルを組込むことによってラベルされ得る。たとえば、有用なラベルは、32Ｐ、螢光色素、電子濃試薬、酵素（通常、ＥＬＩＳＡアッセイに使用されるような）、ビオチン、又は抗血清又はモノクローナル抗体が利用できるハプテン及びタンパク質を包含する。
【００３３】
用語“熱安定性ポリメラーゼ”とは、熱に対して安定しており、耐熱性であり、そして二本鎖核酸の変性をもたらすのに必要な時間、高温にゆだねられる場合、不可逆的に変性（不活性化）されない酵素を意味する。核酸変性のために必要な加熱条件は、当業界においてよく知られており、そしてアメリカ特許第４，６８３，２０２号及び第４，６８３，１９５号（それらは引用により本明細書に組込まれる）に例示されている。本明細書において使用される場合、熱安定性ポリメラーゼは、温度サイクリング反応、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）への使用のために適切である。本発明の目的のための不可逆的変性とは、酵素活性の永久的且つ完全な損失を意味する。熱安定性ポリメラーゼのためには、酵素活性とは、鋳型核酸鎖に対して相補的であるプライマー延長生成物を形成するために適切な態様でのヌクレオチドの結合の触媒作用を意味する。
【００３４】
用語“常用の”又は“天然の”とは、核酸塩基、ヌクレオシド三リン酸、又はヌクレオチドに関する場合、記載されるポリヌクレオチドであって天然で存在するものを意味する（すなわち、ＤＮＡに関しては、それらはｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰである）。さらに、ｄＩＴＰ及び７−デアザ−ｄＧＴＰが時々、ｄＧＴＰの代わりに使用され、そして７−デアザ−ｄＡＴＰがインビトロＤＮＡ合成反応、たとえば配列決定においてｄＡＴＰの代わりに使用され得る。集合的には、それらはｄＮＴＰとして言及され得る。
【００３５】
用語“異例な”又は“修飾された”とは、核酸塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドに関する場合、特定のポリヌクレオチドにおいて天然で存在する従来の塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドの修飾、誘導体化又は類似体を包含する。ウラシルのデオキシリボヌクレオチド形は、ＤＮＡ（ｄＵＭＰ）において異例な又は修飾された塩基であり、そしてウラシルのリボヌクレオチド形はＲＮＡ（ＵＭＰ）において従来の塩基である。本明細書で使用される場合、異例なヌクレオチドは、核酸配列決定のためのターミネーターとして使用される化合物類を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００３６】
ターミネーター化合物は、２′，３′−ジデオキシ構造を有し、そしてジデオキシヌクレオシド三リン酸として言及されるそれらの化合物類を包含するが、但し、それらだけには限定されない。ジデオキシヌクレオシド三リン酸ｄｄＡＴＰ，ｄｄＴＴＰ，ｄｄＣＴＰ及びｄｄＧＴＰは、集合的にｄｄＮＴＰとして言及される。他の異例なヌクレオチドは、ホスホロチオエートｄＮＴＰ（〔α−Ｓ〕ｄＮＴＰ）、５′−α−ボラノ−ｄＮＴＰ、α−メチル−リン酸ｄＮＴＰ、及びリボヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰ）を包含する。異例な塩基は、放射性同位体、たとえば32Ｐ，33Ｐ又は35Ｓ；螢光ラベル；化学発光ラベル；生物発光ラベル；ハプテンラベル、たとえばビオチン；又は酵素ラベル、たとえばストレプタビジン又はアビジンによりラベルされ得る。
【００３７】
螢光ラベルは、負に荷電された色素、たとえばフルオレセイン類の色素、又は中性電荷の色素、たとえばローダミン類の色素、又は正に荷電された色素、たとえばシアニン種類の色素を包含することができる。フルオレセイン類の色素は、たとえばＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＪＯＥ，ＮＡＮ及びＺＯＥを包含する。ローダミン類の色素は、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ，ＲＯＸ，Ｒ１１０，Ｒ６Ｇ、及びＴＡＭＲＡを包含する。ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＪＯＥ，ＮＡＮ，ＺＯＥ，ＲＯＸ，Ｒ１１０，Ｒ６Ｇ及びＴＡＭＲＡは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により市販されており、そしてＴｅｘａｓ ＲｅｄはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓにより市販されている。シアニン種類の色素は、Ｃｙ２，Ｃｙ３，Ｃｙ５及びＣｙ７を包含し、そしてＡｍｅｒｓｈａｍ（Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England ）により市販されている。
【００３８】
用語“ＤＮＡ合成反応”とは、ＤＮＡのコピーを生成する方法、たとえばＰＣＲ、標準の置換増幅、転写介在の増幅、プライマー延長及び逆転写を言及するが、但しそれらだけには限定されない。
本発明の理解をさらに促進するためには、特定の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素及び螢光色素が、本発明を例示するために明細書中に言及され、そしてそれらの言及は本発明を限定するものではない。
【００３９】
本発明は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである新規且つ改良された組成物を提供する。本発明の酵素は、その対応する野生型酵素に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオシド三リン酸をより効果的に組込む組換えポリメラーゼを包含する。本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、従技術のポリメラーゼよりも、ラベルされた生成物のＤＮＡ配列決定及びインビトロ合成のような方法への使用のためにより適切であり且つより所望される。本発明の改良されたＤＮＡ配列決定法は、それらの組換えポリメラーゼの使用、及びこれまでに特徴づけられた酵素よりも、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオシド三リン酸をより効果的に組込む生来の酵素の使用を包含する。それらの酵素をコードするＤＮＡ配列、及びそのタンパク質を発現するためのベクターがまた供給される。
【００４０】
本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、酵素のポリメラーゼ活性ドメインのアミノ酸配列内に必須の領域を有する。本発明により提供される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列内の必須の領域は、従来の一文字アミノ酸コードを用いて下記に示される（Lehninger, Biochemistry, New York, New York, Worth Publishers Inc., 1970, 967 ：引用により本明細書に組込まれる）：配列番号７：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（ここで、位置４の“Ｘ”はＥを除くいづれかのアミノ酸を示す）。
【００４１】
アミノ酸のための３文字コードにおいては、この配列は、ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＸａａＰｒｏＸａａＸａａＧｌｕ（配列番号７）（ここで、位置３，６，９及び１０の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、この配列中の位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であるが、但し、グルタミン酸残基（Ｇｌｕ）ではなく、そして位置７の“Ｘａａ”はＶａｌ又はＩｌｅである）として表わされる。この必須の領域は、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドを効果的に組込む能力により特徴づけられる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を供給する。
【００４２】
たとえば、位置４６でのグリシンからアスパラギン酸への変異（Ｇ４６Ｄ）及びＦ６６７Ｙをすでに含むサーマス・アクアチカス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の誘導体においては、完全な長さのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ配列の残基６８１配列（必須のモチーフの位置４に対応する）でのグルタミン酸のためのコドンの最初の位置におけるＧからＡへの変異が、必須のモチーフを有する酵素をもたらす。この酵素は、１）従来のヌクレオチドの存在下でＰＣＲを介在する酵素の能力の低下を伴わないで、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みの効率の約２〜１０倍の上昇；及び２）延長速度の２〜４．３倍の上昇を示す。
【００４３】
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼにおいては、この特別な変異は、Ｅ（グルタミン酸）からＫ（リシン）へのアミノ酸の変更をもたらす。
この特別なアミノ酸変更は必須のモチーフを生成し、そして異例なヌクレオチドを組込む酵素の能力を有意に変えるけれども、ＥからＫへの特異的な変更は、決定的領域内の現在同定される位置ほどは、本発明に対しては決定的ではないことが予測される。
【００４４】
従って、好ましい態様においては、本発明は、組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を供給し、ここで前記酵素は、ａ）その生来の形において、前記酵素がアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；ｂ）前記配列中の位置４のＸが前記生来の配列に比較して変異誘発されているが、但し位置４のＸはＥへは変異誘発されておらず；そしてｃ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、前記酵素の生来の形に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有することにより特徴づけられる。より好ましい態様においては、位置４のＸは、陽性電荷を有するアミノ酸、たとえばＫ，ＲもしくはＨにより、又は極性アミノ酸、たとえばＱもしくはＮにより置換されている。最っとも好ましい態様においては、位置４のＸは、Ｋにより置換される。
【００４５】
本発明のもう１つの好ましい態様においては、本発明の酵素は、ａ）フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドに対して低められた識別性を有し、そしてアミノ酸配列：ＬＳ（Ｑ／Ｇ）ＸＬ（Ｓ／Ａ）ＩＰＹＥＥ（配列番号２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成ることによって特徴づけられる。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、次の通りに表わされる：ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（ここで、位置３の“Ｘａａ”はＧｌｎ又はＧｌｙであり、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、そして位置６の“Ｘａａ”はＳｅｒ又はＡｌａである）。
【００４６】
本発明のより好ましい態様においては、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドに対する低められた識別性を有する酵素は、アミノ酸配列：ＬＳＱＸＬＡＩＰＹＥＥ（配列番号３）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成る。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＧｌｎＸａａＬｅｕＡｌａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（ここで、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸である）として表わされる。本発明の最とも好ましい態様においては、ＸはＫ残基である。
【００４７】
本発明のもう１つの好ましい態様においては、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドに対して低められた識別性を有する酵素は、アミノ酸配列：ＬＳＶＸＬＧ（Ｖ／Ｉ）ＰＶＫＥ（配列番号４）（ここでＸは任意のアミノ酸である）を含んで成る。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＸａａＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（ここで、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、そして位置７の“Ｘａａ”はＶａｌ又はＩｌｅである）として表わされる。
【００４８】
本発明のより好ましい態様においては、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドに対して低められた識別性を有する酵素は、アミノ酸配列ＬＳＶＸＬＧＶＰＶＫＥ（配列番号５）（ここでＸは任意のアミノ酸である）を含んで成る。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＶａｌＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（ここで、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸である）として表わされる。最とも好ましい態様においては、ＸはＲ残基である。
【００４９】
もう１つの好ましい態様においては、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドに対して低められた識別性を有する酵素は、アミノ酸配列：ＬＳＶＸＬＧＩＰＶＫＥ（配列番号６）（ここでＸは任意のアミノ酸である）を含んで成る。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＩｌｅＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（ここで、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸である）として表わされる。最とも好ましい態様においては、前記ＸはＲ残基である。
【００５０】
本明細書に記載されるＥ６８１Ｋ変異の特徴化は、負に荷電された螢光ヌクレオチドと相互作用するポリメラーゼの能力に影響を及ぼす、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子における領域を同定した。ヘリックスＯに対して遠位のこの部位は、ポリメラーゼのＯa ヘリックスの末端部及びＯb ヘリックスの開始部に存在する（Ｋｉｍ，など., 1995, Nature, 376：612 ）。当業界において良く知られている分子モデリング原理に基づけば、位置６８１のＥからＫ以外のＯa −Ｏb ヘリックスの構造の変化はまた、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドに対して識別するポリメラーゼの能力の変化をもたらすことが予測される。
【００５１】
従って、位置４のＸ残基における変異以外の必須のモチーフにおける位置での変異もまた、本発明の範囲内である。この態様においては、本発明は、組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を提供し、ここで前記酵素は、ａ）その生来の形において、前記ポリメラーゼはアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り、ｂ）前記組換えポリメラーゼが前記アミノ酸配列内での少なくとも１つの変異を含んで成り、但し、位置４のＸはＥへは変異誘発されず、そしてｃ）前記酵素がその対応する生来の酵素に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有することにより特徴づけられる。
【００５２】
同様に、アミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで位置４のＸは任意のアミノ酸であるが、しかしＥではない）である必須のモチーフに対して類似するが、しかし同一ではない必須のモチーフを含んで成る熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、本発明の範囲内である。特に１つの態様において、前記必須のモチーフは、アミノ酸配列：ＬＸＸＸＸＸＸＸＸＸＥ（配列番号８）（ここで、位置４のＸは、Ｅを除く任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＧｌｕ（配列番号８）（ここで、位置２，３，５，６，７，８，９及び１０の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、そして位置４の“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸である）として表わされる。
【００５３】
もう１つの態様において、前記必須のモチーフは、アミノ酸配列：Ｌ（Ｓ／Ａ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ）ＸＸＸＸＸＥ（配列番号９）（ここで、位置ＸのＸはＥを除く任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＧｌｕ（配列番号９）（ここで、位置３，６，７，８，９、及び１０での“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、位置２の“Ｘａａ”はＳｅｒ又はＡｌａであり、位置４の“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸であり、そして位置５の“Ｘａａ”はＬｅｕ又はＩｌｅである）として表わされる。
【００５４】
さらにもう１つの態様においては、前記必須のモチーフは、アミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸＸＸＸＸＥ（配列番号１０）（ここで、位置４のＸはＥを除く任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＧｌｕ（配列番号１０）（ここで、位置３，６，７，８，９及び１０の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、そして位置４の“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸である）として表わされる。
【００５５】
フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドを効果的に組込む本発明の酵素の能力は、ｄｄＮＴＰ組込みアッセイにより測定される。１つのそのようなアッセイは、制限鋳型の条件下で行なわれるプライマー延長競争アッセイである。このアッセイにおいては、Ｍ１３ｍｐ１８鋳型（Ｉｎｎｉｓなど., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：9436）に結合されるプライマーＤＧ４８（５′−ＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣ）（配列番号１１）が、種々のレベルの螢光ラベルされたｄｄＮＴＰ、Ｚｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰと共に、〔α−33Ｐ〕ｄＣＴＰ及び過剰の酵素の存在下で延長される。
【００５６】
ｄｄＣＴＰ残基の組込みがその延長反応を終結するので、ＤＮＡポリメラーゼが延長されたプライマー中にｄｄＣＴＰをより容易に組込むほど；〔α−33Ｐ〕ｄＣＴＰの組込みは低くなる。従って、螢光ラベルされたｄｄＣＴＰ組込みの効率が低くなるにつれて、ＤＮＡ合成の阻害の程度は高められる。その反応はまた、種々のレベルのラベルされていないｄｄＣＴＰによっても実施された。５０％阻害率のために必要とされるｄｄＣＴＰ及びＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの濃度が計算され、そして比較され、螢光ラベルされたヌクレオチドを組込む酵素の能力を相対的測定結果が付与された。ｄｄＮＴＰ組込みアッセイの詳細は、例２に供給される。
【００５７】
従って、本発明の１つの態様においては、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対する低められた識別性の特徴が、例２に記載される螢光ｄｄＮＴＰ組込みアッセイにより測定される。好ましい態様においては、ＤＮＡ合成の５０％阻害率のために必要とされるフルオレセイン色素、すなわちＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰによりラベルされたｄｄＮＴＰの濃度は、野生型酵素に比較し、本発明の変異体酵素に関して少なくとも３倍、低められる。より好ましい態様においては、前記濃度は、少なくとも１０倍低められる。もう１つの態様においては、低められた識別性の特徴が螢光ｄＮＴＰ組込みを測定することによってアッセイされる。
【００５８】
本発明のもう１つの観点においては、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子配列及び酵素は、種々の好熱種に由来する。１つの観点においては、ポリメラーゼ遺伝子配列及び酵素はサーマス属の種からである。本発明の他の態様においては、遺伝子配列及び酵素は、サーマス以外の好熱種からである。多くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのための完全な核酸及びアミノ酸配列は入手できる。Ｔａｑ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｔｈ）、サーマス・スペーシスＺ０５、サーマス・スペーシスｓｐｓ１７、サーモトガ・マリチマ（Ｔｍａ）及びサーモシフォ・アフリカナス（Ｔａｆ）ポリメラーゼの個々の配列は、１９９２年４月１６日にＰＣＴ特許公開番号ＷＯ９２／０６２００として公開されたＰＣＴ国際特許出願番号ＰＣＴ／Ｕ．Ｓ．９１／０７０３５に公開されている。
【００５９】
サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍａｓ ｆｌａｖｕｓ）、バシラス・カルドテナクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）及びバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのＤＮＡポリメラーゼのための配列は、それそれ、Akhmetzjanov and Vakhitov, 1992, Nucleic Acids Research 20 (21）：5839；Uemoriなど., 1993, J. Biochem. 113： 401-410；及びＮＧ：Ｎｅｗ ＧｅｎＢａｎｋデータベースからの受託番号ＢＳＵ２３１４９ｎｇ（それぞれ引用により本明細書に組込まれる）に公開されている。
【００６０】
サーマス・カルドフィラス（Ｔｈｅｒｍａｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）からの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの配列は、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ６２５８４として見出される。サーマス・フィリホルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）からの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの配列は、アメリカ特許第４，８８９，８１８号に提供される方法及び表１に提供される配列情報を用いて、ＡＴＣＣ寄託番号第４２３８０号から回収され得る。サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）のＤＮＡポリメラーゼの配列は、GeneSeq Patent Data Base Accession No. R98144(PCT W097／09451 にも開示される）からである。
【００６１】
【表１】
【００６２】
１．受託番号D12982, Uemori T., Ishino Y., Fujita k., Kato L. “Cloning of the DNA polymerase gene of Bacillus caldotenax and characterization of the gene product" J. Biochem. 113 ：401 (1993)からのタンパク質配列。その配列における必須の残基は７２５である。ほとんど同一のタンパク質配列が、受託番号Ｒ４５１５５及びＷＰＩ９３−４０８３２３／５１において推定上の“バシラス・ステアロサーモフィラス”ＤＮＡポリメラーゼとして提供される。その配列における決定的な残基は７２４である。
【００６３】
２．Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ又はＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ／ＰＩＲデータベースにバシラス・ステアロサーモフィラスＤＮＡポリメラーゼのためのいくつかの配列が提供されている。それらの配列はお互いひじょうに関連しているが、しかし、いく分異なっているけれども、個々の配列は同一のＬ（Ｓ／Ａ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ）ＸＸＸＸＸＥ（配列番号９）モチーフ（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含む。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＧｌｕ（配列番号９）（ここで、位置３，６，７，８，９及び１０の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、位置２の“Ｘａａ”はＳｅｒ又はＡｌａであり、位置４の“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸であり、そして位置５の“Ｘａａ”はＬｅｕ又はＩｌｅである）として表わされる。
【００６４】
上記表においては、位置７２４に必須のモチーフにおける必須の残基を含んで成るタンパク質配列は、日本特許公開Ｊ０５３０４９６４Ａ、ヨーロッパ特許第６９９，７６０号及び受託番号Ｕ３３５３６により供給される。もう１つの非常に関連しているが、しかしいく分異なっているタンパク質配列は、Gene 163：65-68 (1995)に公開されており、位置７２７での必須のモチーフにおいて決定的残基を含む。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのためのもう１つの非常に関連するが、しかしいく分異なっている、受託番号Ｕ２３１４９のタンパク質配列は、位置８０２にある必須のモチーフにおいて必須の残基を含む。
【００６５】
個々の好熱種のＤＮＡポリメラーゼはユニークであるので、決定的領域のアミノ酸位置は個々の酵素に関して異なる。アミノ酸及び核酸配列の配置プログラムは、容易に入手でき、そして本明細書において同定される特定の領域が与えられる場合、本発明の正確な配列領域の同定を助力する。そのような配列の配置プログラムは、Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsinから入手できる。ここで同定される特定のモチーフが与えられる場合、“ＧＡＰ”、“ＢＥＳＴＦＩＴ”及び“ＰＩＬＥＵＰ”を包含するそれらのプログラムは、必須のモチーフの局在化を助ける。決定的領域の位置は、典型的な好熱種からの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼについての表１に示されている。
【００６６】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼドメイン内の必須のモチーフＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４のＸはＥを除く任意のアミノ酸である）の正確な位置にもかかわらず、そのモチーフの存在は、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドを効果的に組込む能力を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを供給するよう作用する。
【００６７】
従って、必須のモチーフを生成するための、サーマス・フラバス（Ｇｌｕ６７９）、サーマス・サーモフィラス（ＧluＵ６８３）、サーマス・スペーシスＺ０５（Ｇｌｕ６８３）、サーマス・スペーシスｓｐｓ１７（Ｇｌｕ６７９）、サーマス・カルドフィラス（Ｇｌｕ６８３）、サーマス・フィリホルミス（Ｇｌｕ６７９）からの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの保存されたグルタミン酸の変異が、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドを効果的に組込むポリメラーゼの能力に対する増強効果を提供するであろう。
【００６８】
さらに、現在同定された必須のモチーフの高く保存された性質の観点から、新規熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、たとえばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、又は表１における他のＤＮＡポリメラーゼの配列に対するそれらの相同性に基づいて同定され得る（たとえば、引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第５，６１８，７１１号及び第５，６２４，８３３号を参照のこと）。本明細書に記載される方法により決定される場合、そのようなポリメラーゼは、それらのペプチド配列がＴａｑポリメラーゼアミノ酸配列に対して少なくとも４５％及び最とも好ましくは８０％以上相同である限り、本発明の範囲内である。
【００６９】
従って、本発明はまた、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及び次の種からの対応する遺伝子及び発現ベクターを含む種々の酵素に関する：サーマス・オシマイ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ）（Williams RA,など., 1996, Int. J. Syst. Bacteriol. 46 (2)：403-498)；サーマス・シルバヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ）及びサーマス・クリアロフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉｏｒｏｐｈｉｌｕｓ）（Tenreiro S, など., 1995, Int. J. Syst. Bacteriol 45 (4) ：633-639)；サーマス・スコトグクタス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）（Tenreiro S, など., 1995, Res. Microbiol. 146 (4)：315-324)；サーマス・ルバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ）ＡＴＣＣ３５９４８（L. G. Loginova, 1984, Int. J. Syst. Bacteriol. 34 ：498-499)；及びサーマス・ブロキアヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）（Munster, M. J., 1986, J. Gen. Microbiol. 132：1677）（それらの出版物は、引用により本明細書にそれぞれ組込まれる）。
【００７０】
当業者は、フルオレセイン−ラベルされたヌクレオチドを組込むための増強された効率を有する上記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが組換えＤＮＡ技法、たとえば特定部位の変異誘発により最とも容易に構成されることを認識するであろう。たとえば、Sambrookなど., Molecular Cloning ： A Laboratory Maual, Cold Spring Harbor, 1989、第２版、チャプター１５．５１，“Oligonucleotide-mediated mutagenesis”（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。この技法は当業界において現在、標準であり、そして遺伝子におけるいづれかの決定された部位ですべての可能な種類の塩基対変更を創造するために使用され得る。
【００７１】
その方法は、所望する変異を表わす、限定されたミスマッチを除く、変異誘発される一本鎖ファージ又はプラスミドＤＮＡに対して相補的である合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施される。手短に言及すれば、合成オリゴヌクレオチドは、ファージ又はプラスミドに対して相補的な鎖の合成を指図するためのプライマーとして使用され、そして得られる二本鎖ＤＮＡを用いて、ファージ−又はプラスミド−維持の宿主細菌が形質転換される。その得られる細菌は、たとえば所望する変異誘発された遺伝子配列を担持するそれらのプラーク又はコロニーを同定するために、ＤＮＡ配列分析又はプローブハイブリダイゼーションによりアッセイされ得る。
【００７２】
ＰＣＲの発明に続いて、プライマー指令変異誘発（アメリカ特許第４，６８３，１９５号に記載される；引用により本明細書に組込まれる）、及び“オーバーラップＰＣＲ”（Higuchi, 1989, PCR Technology, ed. Erlich, Stockfon Press, New York, NY, pp 61-70 ）が、遺伝子のいづれかの位置でいづれかの変異を導入する日常の手段になった。
【００７３】
変異誘発されたＤＮＡは、従来の手段によりプラスミド、ファスミド、ファージ又は増幅反応から回収され、そして得られる酵素の続く培養及び精製のために発現ベクター中に連結される。多くのクローニング及び発現ベクターは、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋなど．，１９８９前記に記載されるように、哺乳類及び細菌システムを包含する発明を実施するために適切である。便利さのために、本発明は、λ由来のＰL プロモーター（Shimatake など., 1981, Nature 292 ：128 ）を用いて例示される。このプロモーターの使用は、引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第４，７１１，８４５号及び第５，０７９，３５２号に特に記載される。
【００７４】
プラスミドｐＣＳ１は、１９９７年８月２８日にＡＴＣＣに寄託され、そして受託番号９８５２１を付与された。このプラスミドは、グルタミン酸がその得られるポリペプチドにおいてリシンにより置換されるような位置６８１でのコドンで変異誘発された、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含み、そしてフルオレセイン類の色素によりラベルされるヌクレオチドを組込むための増強された効率を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを提供するための手段を提供する。
【００７５】
例１は、他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を創造するためにＥ６８１Ｋ変異をサブクローニングするのに適切なフランキング制限部位の使用を例示する。他方では、多くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのための完全な遺伝子配列は知られているので、Ｅ６８１Ｋ変異を導入するための他の手段、たとえば制限消化及びフラグメント置換は、ＡＴＣＣ寄託物の利用性及び本明細書に供給される配列情報を有する当業者に容易に利用できる。
【００７６】
本発明の変異体の又は生来の酵素の１つ又はそれらの酵素の誘導体又は相同体の生成を所望する場合、前記酵素の生成は、典型的には、発現ベクターによる宿主細胞の形質転換、及びその形質転換された宿主細胞の発現が生じるであろう条件下での培養を包含する。形質転換及び形質転換された宿主細胞の培養のための手段は、当業界において良く知られており、そしてたとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．，１９８９、前記、に詳細に記載される。
【００７７】
本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは一般的に、野生型又は修飾された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子に操作可能的に連結される発現ベクターにより形質転換されたＥ．コリ株ＤＧ１１６（１９８７年４月７日、ＡＴＣＣ５３６０６として寄託されている）から精製される。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを精製するための方法は、たとえば例１及びLawyerなど., 1993, PCR Methods and Applications ２：275-87（引用により本明細書に組込まれる）に記載される。
【００７８】
本発明の熱安定性酵素は、そのような酵素活性が必要であり又は所望されるいづれかの目的のために使用され得る。使用の例は、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡラベリング、及びプライマー延長生成物のラベリングを包含する。Ｓａｎｇｅｒのジデオキシヌクレオチド方法（Sangerなど., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. 74：5463）によるＤＮＡ配列決定は、本発明により特に改良される。基本的なＳａｎｇｅｒなどの方法における進歩は、新規ベクター（Yanisch-Perronなど., 1985 Gene 33 ：103-119 ）、及び塩基類似体（Mills など., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. 76：2232-2235 、及びBarrなど., 1986, Biotechniques ４：428-432 ）を提供して来た。
【００７９】
一般的に、ＤＮＡ配列決定は、鎖−終結塩基類似体の存在下で鋳型−依存性プライマー延長を必要とし、結果的にサイズにより分離される部分的フラグメントの分布をもたらす。基本的ジデオキシ配列決定方法は、（ｉ）鋳型に対して、任意にラベルされたオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングし；（ii）４種の別々の反応においてＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを延長し、ここで個々の反応はラベルされていないｄＮＴＰの混合物、及び限定量の一本鎖終結剤、たとえば任意にラベルされたｄｄＮＴＰを含み；そして（iii ）高い分解能の変性ポリアクリルアミド／尿素ゲル上で４組の反応生成物を分解することを包含する。反応生成物は、使用されるラベルに依存して、オートラジオグラフィー又は螢光検出によりゲルにおいて検出され得、そして像は、ヌクレオチド配列を推定するために試験され得る。それらの方法は、ＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＥ．コリＰｏｌＩのクレノウフラグメント、又は変性されたＴ７ ＤＮＡポリメラーゼを使用する。
【００８０】
耐熱性ポリメラーゼ、たとえばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの有用性は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによる配列決定のための改良された方法（Ｉｎｎｉｓなど．，１９８８、前記を参照のこと）及び“サイクル配列決定”と呼ばれるその変法（Murray, 1989, Nuc. Acids. Res. 17 ：8889）をもたらした。基本的なジデオキシ配列決定の代用としてのサイクル配列決定は、鎖ターミネーターの存在下で鋳型配列に対して相補的な標的配列の線状非対称増幅である。単一のサイクルは、すべての可能な長さの種類の延長生成物を生成する。ＤＮＡ鋳型からの延長反応生成物の変性に続いて、プライマーアニーリング及びプライマー延長の複数のサイクルが、ターミネーター、たとえばｄｄＮＴＰの存在下で生じる。
【００８１】
サイクル配列決定は、従来の鎖−終結配列決定よりも少ない鋳型ＤＮＡを必要とする。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはサイクル配列決定においていくつかの利点を有し、すなわちそれらは核酸標的物へのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションのために必要とされるきびしいアニーリング温度に対して耐性があり、そして個々のサイクルにおいて生じる高い温度変性、すなわち９０〜９５℃の複数のサイクルに対して耐性がある。この理由のために、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、及びその誘導体及び由来物が、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴの会社により市販されているＴａｑサイクル配列決定キットに包含されて来た。
【００８２】
鎖終結配列決定法の２つの変法、すなわち色素−プライマー配列決定法及び色素−ターミネーター配列決定法が存在する。色素−プライマー配列決定法においては、ｄｄＮＴＰターミネーターはラベルされず、そしてラベルされたプライマーが延長生成物を検出するために使用される（Smith など., 1986, Nature 32：674-679 ）。色素−ターミネーターＤＮＡ配列決定法においては、ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡプライマーの末端上にｄＮＴＰ及び螢光ラベルされたｄｄＮＴＰを組込むために使用される（Ｌｅｅなど．，前記）。この方法は、色素ラベルされたプライマーを合成すべきでない利点を付与する。さらに、色素−ターミネーター反応は、すべての４種の反応が同じ管において実施され得ることにおいてより便利である。
【００８３】
色素−プライマー及び色素−ターミネーターの両方法は、Applied Biosystems, Foster City, CA により製造される自動配列決定装置を用いて自動化され得る（アメリカ特許第５，１７１，５３４号；引用により本明細書に組込まれる）。前記装置を用いる場合、完結された配列決定反応混合物が、前記装置に固定される変性ポリアクリルアミドゲル上で分別される。装置の底でのレーザーが、螢光生成物がゲルを通して大きさに従って電気泳動される場合、その生成物を検出する。
【００８４】
２種のタイプの螢光色素、すなわち負に荷電された及び両性の螢光色素が、色素−ターミネーター配列決定のために使用されるターミネーターをラベルするために通常使用される。負に荷電された螢光色素は、フルオレセイン及びＢＯＤＩＰＹ種類の色素を包含する。ＢＯＤＩＰＹ色素（４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン）が、国際特許公開番号９７／００９６７（引用により本明細書に組込まれる）に記載されている。両性螢光色素は、ローダミン類の色素を包含する。
【００８５】
市販のサイクル配列決定キットは、ローダミン誘導体によりラベルされたターミネーターを使用する。しかしながら、ローダミン−ラベルされたターミネーターはかなり高価であり、そしてその生成物は、配列決定生成物と共に同時移動するので、ゲル上に負荷する前、組込まれていない色素−ｄｄＮＴＰから分離されるべきである。ローダミン類の色素は、生成物の異常な移動を引き起こす、ＧＣに富んでいる領域におけるヘアピン構造体を安定化するように見える。これは、その二次構造体をゆるめるｄＩＴＰの使用を必要とし、また、ターミネーターの組込みの効率にも影響を及ぼす。
【００８６】
対照的に、フルオレセインによりラベルされたターミネーターは、それらが高い負の電荷を有し、そして配列決定生成物よりも早く移動するので、ゲル負荷の前の分離段階を排除する。さらに、フルオレセインによりラベルされた配列決定生成物は、ローダミンによりラベルされた配列決定生成物よりも良好な電気泳動移動性を有する。野生型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはフルオレセイン類の色素によりラベルされたターミネーターを効果的に組込まないけれども、それは本明細書に供給される修飾された酵素の使用により現在、効果的に達成され得る。
従って、本発明の範囲は、必須のモチーフを有する酵素を用いてのジデオキシ配列決定のための新規方法、及び前記方法を実施するためのキットを包含する。
【００８７】
１つの態様において、本発明の配列決定方法は、
ａ）組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用意し、ここで前記酵素は、
ｉ）その生来の形において、前記ポリメラーゼは、アミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここでＸは任意のアミノ酸である）を含んで成り、
ii）前記配列中の位置４のＸが、前記生来の配列に比較して変異誘発されており、但しＸはＥに変異誘発されておらず；そして
iii ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、前記酵素の生来の形に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対する低められた識別性を有することにより特徴づけられ；そして
ｂ）色素−ターミネーター配列決定反応を実施することも含んで成る。
【００８８】
上記方法の好ましい態様においては、前記生来の形の酵素は、アミノ酸配列：ＬＳ（Ｑ／Ｇ）ＸＬ（Ｓ／Ａ）ＩＰＹＥＥ（配列番号２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸配列である）を有する。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列番号２）（ここで、位置３の“Ｘａａ”はＧｌｎ又はＧｌｙであり、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、そして位置６の“Ｘａａ”はＳｅｒ又はＡｌａである）として表わされる。
【００８９】
より好ましい態様においては、その生来形のアミノ酸配列は、ＬＳＱＸＬＡＩＰＹＥＥ（配列番号３）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸配列である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＧｌｎＸａａＬｅｕＡｌａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列番号３）（ここで、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸である）として表わされる。最とも好ましい態様においては、位置４の“Ｘａａ”はＬｙｓである。
【００９０】
上記のように、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ配列決定は、鎖−ターミネーターとして作用する異例な塩基類似体、及び従来のヌクレオチドを、数百の塩基の距離にわたってすべての可能なフラグメントの長さを表わす、延長生成物の集団が生成されることを保証する濃度の特定の割合で含む混合物を必要とする。配列決定のためにこれまで使用されて来たいくつかの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、たとえば野生型Ｔａｑポリメラーゼは、それらが従来のヌクレオチド及び異例なヌクレオチドの混合物の存在下で従来のヌクレオチドを選択的に組込むことにより特徴づけられる。しかしながら、最近記載されるいくつかの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、従来の塩基に対する異例な塩基類似体の割合を、百倍〜数百倍又は数千倍まで低めることを可能にする。
【００９１】
１つのそのようなポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＦ６６７Ｙ変異体である。もう１つのそのような変異体は、Ｆ６６７Ｙ変異、及び位置４６においてグリシン残基をアスパラギン酸残基に変更する変異（Ｇ４６Ｄ）を有するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼである。Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ，ＦＳとして知られているこの変異体ポリメラーゼは、Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅにより製造され、そしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒにより市販されている。Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼは、もう１つのそのようなポリメラーゼである。
【００９２】
この変異体ポリメラーゼは、１）Ｇ４６Ｄ変異をコードするよう修飾されたＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのヌクレオチド１−５７０、及び２）位置３２３でアスパラギン酸からアラニンへの変異、位置３２５でグルタミン酸からアラニンへの変異、及び位置７３０でフェニルアラニンからチロシンへの変異をコードするよう修飾されたＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼのヌクレオチド５７１−２６７９の組合せである（アメリカ特許出願番号６０／０５２０６５及びヨーロッパ特許出願第９８１１２３２７．６号；両者とも引用により本明細書に組込まれる）。
【００９３】
異例な塩基類似体を組込むもう１つのポリメラーゼは、サーモトガ・ネアポリタナからのＦ７３０Ｙ変異体ＤＮＡポリメラーゼである（国際特許出願番号ＷＯ９６／１０６４０，ＷＯ９６／４１０１４及びＷＯ９７／０９４５１；それらは引用により本明細書に組込まれる）。一定のｄＮＴＰ濃度に関して、それらの酵素を使用する場合、ローダミン−ｄｄＮＴＰ濃度は、これまで利用できる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに比較して、約５０倍〜数百倍、低められ得る。
【００９４】
本発明のＥ６８１Ｋ変異が、例４に記載される配列決定反応に使用される二重変異体Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素を生成するために、Ｆ６６７Ｙ変異と共に、組換えＤＮＡ方法を用いて組合された。その二重変異体は、フルオレセインによりラベルされた色素ターミネーターとの色素−ターミネーター配列決定反応に使用された。例４に記載される結果は、前記酵素が、配列決定反応においてフルオレセインによりラベルされた色素ターミネーターを組込むことができ、そして自動化された配列決定装置において正確に読取られ得る配列決定ラダーを生成することを示す。意外なことには、Ｅ６８１Ｋ及びＦ６６７Ｙ変異の組合せはまた、例３に記載されるアッセイにより測定される場合、Ｆ６６７Ｙ変異のみを有する酵素に比較して、３〜４倍早められた延長速度で熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を生成することが見出された。
【００９５】
従って、本発明のもう１つの観点においては、本発明において同定される必須のモチーフは、ラベルされた及びラベルされていないｄｄＮＴＰの両者の組込みの高められた効率を有するポリメラーゼを生成するために、ｄｄＮＴＰに対する低められた識別性を付与するモチーフと組み合わされ得る。それらのポリメラーゼは、ＤＮＡ配列決定法において有用である。本発明の１つの態様においては、本明細書において定義される必須のモチーフを有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはまた、アメリカ出願番号０８／４４８，２２３に記載される、Ｆ６６７Ｙ変異を含む必須のモチーフを含んで成る。
【００９６】
この態様においては、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、
ｉ）その生来の形において、前記ポリメラーゼは、第１のアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；
ii）前記第１のアミノ酸配列における位置４のＸが前記生来の配列に比較して変異誘発されており、但し、ＸはＥに変異誘発されておらず；
iii ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、前記酵素の生来の形に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対する低められた識別性を有し；
iv）前記ポリメラーゼが第２のアミノ酸配列：ＭＲＲＸＸＫＸＸＮＹＸＸＸＹＧ（配列番号１２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；そして
ｖ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがまた、前記酵素の生来の形に比較して、異例なヌクレオチドの組込みに対する低められた識別性を有することにより特徴づけられる。
【００９７】
３文字コードにおいては、前記第２のアミノ酸配列は、ＭｅｔＡｒｇＡｒｇＸａａＸａａＬｙｓＸａａＸａａＡｓｎＴｙｒＸａａＸａａＸａａＴｙｒＧｌｙ（配列番号１２）（ここで、位置４，５，７，８，１１，１２及び１３の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸である）により表わされる。好ましい態様においては、前記第１のアミノ酸配列における位置４の“Ｘａａ”は、Ｌｙｓに変異誘発されている。より好ましい態様においては、前記酵素はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼであり、そしてそれはＥ６８１Ｋ及びＦ６６７Ｙ変異を含んで成る。上記ポリメラーゼを用いての配列決定の方法もまた、本発明の範囲内である。
【００９８】
変異により誘導されないが、しかし天然の変異体として存在する必須のモチーフを有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いて実施される本発明の改良された配列決定法もまた、本発明の範囲内である。この観点においては、好熱性細菌種のＤＮＡポリメラーゼが、位置４での残基がＧｌｕではない必須のモチーフを有する。たとえば、サーモトガ・ネアポリタナからの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにおいては、前記モチーフＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）における位置４のＸは、アルギニン残基である。
【００９９】
従って、本発明は、アミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成る生来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いてのＤＮＡ配列決定の改良された方法を提供する。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＸａａＰｒｏＸａａＸａａＧｌｕ（配列番号７）（ここで、位置３，６，９及び１０の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、位置４の“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸であり、そして位置７の“Ｘａａ”はＶａｌ又はＩｌｅである）として表わされる。
【０１００】
この態様においては、本発明の配列決定方法は、
ａ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用意し、ここで前記ポリメラーゼが、
ｉ）前記ポリメラーゼは、アミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４のＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成り；そして
ii）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがフルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性をすることにより特徴づけられ；
ｂ）フルオレセイン類の色素によりラベルされた色素−ターミネーターを用意し；そして
ｃ）色素−ターミネーター配列決定反応を実施することを含んで成る。
【０１０１】
より好ましい態様においては、本発明の配列決定法は、
ａ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用意し、ここで前記ポリメラーゼは、
ｉ）前記ポリメラーゼが、第１のアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４のＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成り；
ii）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがフルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有し；
iii ）前記ポリメラーゼが第２のアミノ酸配列：ＭＲＲＸＸＫＸＸＮＹＸＸＸＹＧ（配列番号１２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；
iv）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが異例なヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有することにより特徴づけられ；
ｂ）フルオレセイン類の色素によりラベルされた色素−ターミネーターを用意し；そして
ｃ）色素−ターミネーター反応を実施することを含んで成る。
【０１０２】
もう１つの好ましい態様においては、前記酵素は、アミノ酸配列：ＬＳ（Ｑ／Ｇ）ＸＬ（Ｓ／Ａ）ＩＰＹＥＥ（配列番号１３）（ここで、位置４のＸはＥを除く任意のアミノ酸配列である）を含んで成る。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列番号１３）（ここで、位置３の“Ｘａａ”はＧｌｕ又はＧｌｙであり、位置４の“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸であり、そして位置６の“Ｘａａ”はＳｅｒ又はＡｌａである）として表わされる。より好ましい態様においては、前記アミノ酸配列は、ＬＳＱＸＬＡＩＰＹＥＥ（配列番号１４）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＧｌｎＸａａＬｅｕＡｌａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列番号１４）（ここで、位置４の“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸である）として表わされる。
【０１０３】
さらにもう１つの好ましい態様においては、前記酵素は、アミノ酸配列：ＬＳＶＸＬＧ（Ｖ／Ｉ）ＰＶＫＥ（配列番号１５）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を有する。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＸａａＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号１５）（ここで、位置４の“Ｘａａ”は、Ｇｌｕを除く任意のアミノ酸であり、そして位置７の“Ｘａａ”はＶａｌ又はＩｌｅである）として表わされる。より好ましい態様においては、前記アミノ酸配列は、ＬＳＶＸＬＧＶＰＶＫＥ（配列番号１６）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）である。
【０１０４】
３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＶａｌＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号１６）（ここで、位置４での“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸である）として表わされる。最とも好ましい態様においては、位置４の“Ｘａａ”はＡｒｇである。もう１つのより好ましい態様においては、前記アミノ酸配列は、ＬＳＶＸＬＧＩＰＶＫＥ（配列番号１７）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＩｌｅＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号１７）（ここで、位置４での“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸である）として表わされる。最とも好ましい態様においては、位置４の“Ｘａａ”はＡｒｇである。
【０１０５】
本発明のもう１つの態様においては、配列決定方法は、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドに対して低められたレベルの識別性を有する生来の酵素を用いて実施され、ここで前記レベルは、例２に記載されるようなｄｄＮＴＰ組込みアッセイを用いて測定される。ＤＮＡ合成の５０％阻害のために必要とされるｄｄＣＴＰの濃度が、５０％阻害のために必要とされるＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの濃度と共に決定される。ｄｄＣＴＰのための濃度に対するＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰのための濃度の比が計算される。好ましい態様において、その比は１０又はそれ以下である。より好ましい態様において、その比は４又はそれ以下である。最とも好ましい態様において、その比は１，２又はそれ以下である。
【０１０６】
本明細書に供給される例はフルオレセイン類の色素によりラベルされたジデオキシヌクレオチドを使用するけれども、他の異例なヌクレオチド及び螢光色素の使用もまた、本発明の範囲内である。他の異例なヌクレオチドは、ＤＮＡ合成の生成物をラベルするために使用され得る螢光ラベルされたｄＮＴＰ、及びプライマー延長生成物をラベルするために使用され得る螢光ラベルされたｒＮＴＰを包含する。他の色素は、他の負に荷電された螢光色素、たとえばフルオレセインに構造的及び化学的に類似するＢＯＤＩＰＹを包含する。他の色素はまた、シアニン色素を包含する。
【０１０７】
シアニンによりラベルされたｄＮＴＰは、Ｅ６８１Ｋ変異（及びＧ４６Ｄ変異）を有するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを包含する標準のＰＣＲ反応に添加された。そのシアニンによりラベルされたｄＮＴＰは、野生型酵素のためよりも高いレベルで増幅生成物中に組込まれることが思いがけなく見出された。従って、この観点においては、本発明のＤＮＡラベリング方法は、本発明の生来の又は変異体のポリメラーゼ、及び負に荷電された螢光色素又はシアニン色素のいづれかによりラベルされたヌクレオチドを使用する。
【０１０８】
１つの態様においては、本発明のＤＮＡラベリング方法は；
ａ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用意し、ここで前記ポリメラーゼは、
ｉ）前記ポリメラーゼがアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４でのＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成り；そして
ii）前記ポリメラーゼが異例なヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有することにより特徴づけられ；
ｂ）負に荷電された螢光色素によりラベルされたヌクレオチドを用意し；そして
ｃ）ＤＮＡ合成反応を実施することを含んで成る。
【０１０９】
もう１つの態様においては、本発明のＤＮＡラベリング方法は、
ａ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用意し、ここで前記ポリメラーゼは、
ｉ）前記ポリメラーゼがアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４でのＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成り；そして
ii）前記ポリメラーゼが異例なヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有することにより特徴づけられ；
ｂ）シアニン色素によりラベルされたヌクレオチドを用意し；そして
ｃ）ＤＮＡ合成反応を実施することを含んで成る。
【０１１０】
本発明のもう１つの観点においては、ｒＮＴＰのより効果的な組込みを可能にする変異、たとえばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの位置６１５でのグルタミン酸からグリシンへの変異、及び本発明の必須のモチーフを組合す熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが供給される。その得られる酵素は、フルオレセイン類の色素によりラベルされたリボヌクレオチドの組込みの高められた効率を有することが予測される。
【０１１１】
従って、１つの態様においては、本発明は、（１）その生来の形において、アミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；（２）位置４のＸが、その位置４のＸがＥに変異誘発されないように変異誘発されており；（３）また、アミノ酸配列：ＳＱＩＸＬＲ（Ｖ／Ｉ）（配列番号１８）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）である決定的領域を含んで成り；そして（４）フルオレセイン類の色素によりラベルされたリボヌクレオチドを効果的に組込むことができる組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。３文字コードにおいては、後者の配列は、ＳｅｒＧｌｎＩｌｅＸａａＬｅｕＡｒｇＸａａ（ここで、位置４での“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸であり、そして位置７の“Ｘａａ”はＶａｌ又はＩｌｅである）として表わされる。
【０１１２】
変異体ポリメラーゼドメイン、たとえばＥ６１５Ｇ及びＥ６８１Ｋ変異を含むＴａｑのためのドメインは、フルオレセイン類の色素によりラベルされたプライマー延長生成物を生成する改良された方法において有用である。たとえば、プライマー延長反応、たとえばＰＣＲにおいては、フルオレセイン類の色素によりラベルされたｒＮＴＰが、４種の標準のｄＮＴＰの１つにより少なくとも部分的に置換され、そして二重変異体ポリメラーゼ、たとえばＥ６８１Ｋ Ｅ６１５Ｇ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
【０１１３】
その変異体ポリメラーゼは、それらの長さにそって種々の位置で、フルオレセインによりラベルされたリボヌクレオチド残基を有するプライマー延長生成物を合成する。熱又はアルカリ処理に基づいて、そのプライマー延長生成物は、個々のリボヌクレオチド残基でフラグメント化され、末端をラベルされたフラグメントの集団が生成される。均等にラベルされたフラグメントのこの集団は、プライマー延長生成物の長さを通して螢光ラベルの分布を表わす。それらの特徴を有するラベルされたフラグメントは、珪素チップ、たとえばＣｒｏｎｉｎなど．，前記のチップに基づく核酸検出型において有用である。
【０１１４】
従って、１つの態様においては、本発明は、（１）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを供給し、ここで前記ポリメラーゼは、（ａ）その生来の形において、アミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；（ｂ）前記位置４のＸが、その位置４でのＸがＥに変異誘発されないように変異誘発されており；（ｃ）また、アミノ酸配列：ＳＱＩＸＬＲ（Ｖ／Ｉ）（配列番号１８）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）である決定的領域を含んで成り；そして（ｄ）フルオレセイン及び／又はシアニン種類の色素によりラベルされたリボヌクレオチドを効果的に組込むことができることにより特徴づけられ；そして（２）プライマー延長反応を実施することを含んで成る、プライマー延長生成物をラベリングするための方法を提供する。
【０１１５】
さらにもう１つの観点においては、本発明の必須のモチーフを有する酵素は、Ｅ６８１Ｋ Ｆ６６７Ｙ変異体について例４に示されるように野生型酵素に比較して早められた延長速度を示す。１つの態様においては、前記酵素は、（１）その生来の形において、それはアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；（２）前記アミノ酸配列が、位置４のＸがＥに変異誘発されないように位置４で変異誘発されており；そして（３）それが、野生型酵素に比較して早められた延長速度を有することによって特徴づけられる。
【０１１６】
好ましい態様においては、前記酵素は、（１）その生来の形において、それはアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；（２）前記アミノ酸配列が、位置４でのＸがＥに変異誘発されないように位置４で変異誘発されており；（３）それがまた、アミノ酸配列：ＭＲＲＸＸＫＸＸＮＹＸＸＸＹＧ（配列番号１２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；そして（４）早められた延長速度を有することによって特徴づけられる。
【０１１７】
より好ましい態様において、前記酵素は、（１）その生来の形において、それがアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含み；そして（２）前記アミノ酸配列が、位置４でのＸがＫに変異誘発されないように位置４で突然誘発されていることによって特徴づけられる。最とも好ましい態様においては、前記酵素は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼであり、そしてＥ６８１Ｋ変異及びＦ６６７Ｙ変異を含む。また、早められた延長速度を有するポリメラーゼを用いてのＤＮＡの配列決定及びラベリングの方法、及び前記方法を行なうためのキットは、本発明の範囲内である。
【０１１８】
本発明の好ましいＤＮＡ配列決定方法においては、熱安定性ピロホスファターゼが反応混合物に含まれる。ピロホスファターゼは、ヨーロッパ特許出願番号ＥＰ−Ａ−７６３５９９及びアメリカ特許第５，６６５，５５１号に記載される中温性及び変異体の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、配列決定データを増強することが知られている。
【０１１９】
典型的な態様においては、本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはまた、このヌクレアーゼ活性を非常に弱くするよう作用する、５′−ヌクレアーゼドメインにおける変異を含む。Ｔａｑポリメラーゼの修飾された形が、１９９２年４月１６日に公開されたＰＣＴ特許公開番号ＷＯ９２／０６２００、及びアメリカ特許第５，４６６，５９１号に記載されている。本発明の１つの態様においては、アミノ酸位置４６でのグリシン残基のためのコドンが、アスパラギン酸のためのコドンにより置換された（Ｇ４６Ｄ変異）。その得られる酵素は、低められた５′−ヌクレアーゼ活性のためにサイクル配列決定反応において高められた利用性を有する。ポリメラーゼドメインアミノ酸配列、及びポリメラーゼ活性は、野生型酵素に比較して、Ｇ４６Ｄ変異体においては、両者とも変更されていない。
【０１２０】
本発明の商業的態様においては、本発明の使用により改良される方法を実施するためのキットが、本発明のさらなる観点であると思われる。ＤＮＡ配列決定のための１つのそのようなキットは、
ａ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ここで前記ポリメラーゼは、
ｉ）前記ポリメラーゼがアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４のＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成り；そして
ii）前記ポリメラーゼがフルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有することによって特徴づけられ；及び
ｂ）負に荷電された螢光色素によりラベルされた色素−ターミネーターを含んで成り、そしてさらに、ＤＮＡ配列決定のための他の試薬、たとえばｄＮＴＰ、熱安定性ピロホスファターゼ及び適切な緩衝液を含むことができる。
【０１２１】
もう１つの態様においては、キットにおける酵素は、アミノ酸配列：ＬＳＶＸＬＧ（Ｖ／Ｉ）ＰＶＫＥ（配列番号１５）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を有する。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＸａａＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号１５）（ここで、位置４の“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸であり、そして位置７の“Ｘａａ”はＶａｌ又はＩｌｅである）として表わされる。
【０１２２】
好ましい態様においては、前記アミノ酸配列は、ＬＳＶＸＬＧＶＰＶＫＥ（配列番号１６）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＶａｌＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号１６）（ここで、位置４の“Ｘａａ”はＥを除く任意のアミノ酸である）として表わされる。
【０１２３】
より好ましい態様においては、位置４の前記“Ｘａａ”はＡｒｇである。もう１つの好ましい態様においては、前記アミノ酸配列は、ＬＳＶＸＬＧＩＰＶＫＥ（配列番号１７）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＩｌｅＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号１７）（ここで、位置４での“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸である）として表わされる。より好ましい態様においては、位置４での前記“Ｘａａ”はＡｒｇである。
【０１２４】
ＤＮＡ配列決定のための他のキットは、変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んで成り、ここで前記ポリメラーゼは、
ａ）その生来の形において、前記ポリメラーゼがアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；
ｂ）前記アミノ酸が位置４で変異誘発されており、但し、位置４でのＸがＥに変異誘発されておらず；そして
ｃ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、前記酵素の生来の形に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有することによって特徴づけられ、そしてさらに、ＤＮＡ配列決定のための試薬、たとえば鎖終結化合物、ｄＮＴＰ、熱安定性ピロホスファターゼ及び適切な緩衝液を含むことができる。
【０１２５】
ターミネーターがラベルされる場合、好ましいラベルは螢光色素であり、より好ましくは、ラベルは負に荷電された螢光色素又はシアニン色素であり、そして最とも好ましくは、ラベルはフルオレセイン類の色素である。好ましい態様において、前記キット中の酵素は、アミノ酸配列：ＬＳ（Ｑ／Ｇ）ＸＬ（Ｓ／Ａ）ＩＰＹＥＥ（配列番号２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を有する。
【０１２６】
３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列番号２）（ここで、位置３の“Ｘａａ”はＧｌｎ又はＧｌｙであり、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、そして位置６の“Ｘａａ”はＳｅｒ又はＡｌａである）として表わされる。より好ましい態様においては、前記アミノ酸配列は、ＬＳＱＸＬＡＩＰＹＥＥ（配列番号３）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＧｌｎＸａａＬｅｕＡｌａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列番号３）（ここで、位置４での“Ｘａａ”は任意のアミノ酸である）として表わされる。最とも好ましい態様においては、位置４での前記“Ｘａａ”は、Ｌｙｓである。
【０１２７】
ＤＮＡをラベリングするためのキットは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んで成り、ここで前記ポリメラーゼは、（ａ）その生来の形において、前記ポリメラーゼがアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；（ｂ）前記配列中の位置４のＸが前記生来の形に比較して変異誘発されており、但し位置４でのＸはＥには変異誘発されておらず；そして（ｃ）前記酵素が、その対応する野生型に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有することによって特徴づけられ、そしてさらに、ｄＮＴＰ及び適切な緩衝液を含むことができる。
【０１２８】
好ましい態様においては、位置４のＸはＫに変異誘発されている。ラベルされたＤＮＡを生成するための他のキットは、ａ）負に荷電された螢光化合物によりラベルされたヌクレオチド又はヌクレオチド類似体、及びｂ）次の必須のモチーフ：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４でのＸは、Ｅを除く任意のアミノ酸である）を有する生来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（前記ポリメラーゼは、フルオレセインによりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有する）を含んで成り、そしてさらに、ｄＮＴＰ及び適切な緩衝液を含むことができる。好ましい態様においては、位置４でのＸはＫである。もう１つの好ましい態様においては、位置４でのＸはＲである。
【０１２９】
プライマー延長生成物をラベリングするためのキットは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んで成り、ここで前記ポリメラーゼは、（ａ）その生来の形において、前記ポリメラーゼがアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；（ｂ）前記配列中の位置４でのＸが前記生来の配列に比較して変異誘発されており、但し位置４でのＸはＥに変異誘発されておらず；（ｃ）前記ポリメラーゼがまた、第２のアミノ酸配列：ＳＱＩＸＬＲ（Ｖ／Ｉ）（配列番号１８）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成り；そして（ｄ）前記酵素がその対応する野生型酵素に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたリボヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有することによって特徴づけられ、そしてさらに、負に荷電された螢光化合物又はシアニン化合物によりラベルされたリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド類似体、ｄＮＴＰ、及び適切な緩衝液を含むことができる。
【０１３０】
好ましい態様においては、ポリメラーゼはＥ６８１Ｋ及びＥ６１５Ｇ変異を含む。ラベルされたプライマー延長生成物を生成するための他のキットは、ａ）負に荷電された螢光化合物又はシアニン化合物によりラベルされたリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド類似体；及びｂ）生来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んで成り、ここで前記ポリメラーゼは、それが（ｉ）アミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４でのＸはＥを除く任意のアミノ酸である）である必須のモチーフを含んで成り；（ii）第２アミノ酸配列：ＳＱＩＸＬＲ（Ｖ／Ｉ）（ここで、ＸがＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成り；そして（iii ）フルオレセインによりラベルされたリボヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有することによって特徴づけられ、そしてさらに、ｄＮＴＰ及び適切な緩衝液を含むことができる。
【０１３１】
好ましい態様においては、第１のアミノ酸配列における位置４でのＸはＫであり、そして第２のアミノ酸配列において、ＸはＧである。もう１つの好ましい態様においては、第１のアミノ酸配列における位置４でのＸはＲであり、そして第２のアミノ酸におけるＸはＧである。
【０１３２】
【実施例】
次の例は単に例示目的であって、本発明の範囲を限定するものではない。
例１．フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドに対して低められた識別性を有する修飾されたＴａｑポリメラーゼ遺伝子の発現
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＣ−末端アミノ酸部分は、ポリメラーゼ活性部位ドメインをコードする（Lawyerなど., 1993, PCR Methods and Applications ２：275-287 ；Freemontなど., 1986, Proteins. Stracturo. Function. and Genetics １：66-73 ；それらは引用により本明細書に組込まれる）。
【０１３３】
この領域を含むＤＮＡフラグメントを、完全な長さのＴａｑ２遺伝子から単離し、そしてマンガンの存在下でＰＣＲ増幅により変異誘発した（Leung など., 1989, Technique １ (1)：11-15 ）。この例のために、すべての制限酵素は、New England Biolabs, Beverly, MAから入手された。変異誘発されたフラグメントをＰｓｔＩ及びＢｇｌIIにより消化し、そしてＰｓｔＩ及びＢｇｌIIによりすでに消化されているＴａｑ発現プラスミドｐＬＫ１０２中にクローン化した。
【０１３４】
プラスミドｐＬＫ１０２は、９００bpのＰｓｔＩ−ＢｇｌIIフラグメントが短いＰｓｔＩ−ＢｇｌIIリンカーにより置換されているｐＬＫ１０１の誘導体である。プラスミドｐＬＫ１０１は、ポリメラーゼコード領域の３′側に位置する小さなＨｉｎｃII／ＥｃｏＲＶフラグメントが欠失されている、ｐＳＹＣ１５７８（Ｌａｗｙｅｒなど．，１９９３、前記、及びアメリカ特許第５，０７９，３５２号）の修飾された形である。
【０１３５】
得られる発現プラスミドを用いて、Ｅ．コリ株Ｎ１６２４（Ｅ．コリ Genetic Stock Center at Yale University、株番号ＣＧＳＣ＃５０６６から入手できる）を形質転換し、そして得られる形質転換体を、野生型酵素に比較して、〔α−32Ｐ〕Ｔｅｔ−ｄＣＴＰをより効果的に組込む能力についてスクリーンした。この方法を用いて、〔α−32Ｐ〕Ｔｅｔ−ｄＣＴＰをより効果的に組込む能力を有する変異体ＣＳ１を同定した。
【０１３６】
変異体ＣＳ１の変異誘発されたＴａｑ発現プラスミドをＨｉｎｄIII ／ＮｈｅＩにより消化し、そして得られる制限フラグメントを、ｐＬＫ１０１の野生型遺伝子中にサブクローン化し、変異誘発されていないＨｉｎｄIII ／ＮｈｅＩフラグメントを置換し、変異誘発されたＴａｑポリメラーゼ遺伝子の一部が変更された表現型を担当するかどうかについて決定した。ＨｉｎｄIII ／ＮｈｅＩ制限フラグメントを含むサブクローンは、野生型酵素に対して変更された表現型を付与し、これは、変異がこのフラグメント内に存在することを示す。続くサブクローン分析は、前記変異が２６５bpのＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩフラグメントに位置することを決定した。
【０１３７】
２６５bpのＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントのＤＮＡ配列分析を、Applied Biosystems, Foster City, CA からの Taq FS DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit、及びApplied Biosystems Model Prism 377 DNA Sequencing Systemを用いて、ｐＣＳ１に対して実施した。その配列分析は、グルタミン酸（Ｅ）残基のリシン（Ｋ）残基による置換を引き起こす、アミノ酸位置６８１でのＴａｑポリメラーゼ遺伝子におけるミスセンス変異を同定した。番号付けは、アメリカ特許第５，０７９，３５２号（引用により本明細書に組込まれる）におけるように、成熟タンパク質の最初のメチオニン残基をコードするコドンで開始される。この変異Ｅ６８１Ｋは特に、コドン配列におけるＧＡＧからのＡＡＧへの変更により引き起こされる。プラスミドｐＣＳ１は、１９９７年８月２８日にＡＴＣＣに寄託され、そして受託番号９８５２１を得た。
【０１３８】
プラスミドｐＣＳ１は、Ｔａｑポリメラーゼのためのコード配列に追加の変異を含むことができ；しかしながら、さらなるサブクローニング実験により、Ｅ６８１Ｋ変異が、フルオレセイン色素によりラベルされたヌクレオシド三リン酸の組込みにおいて高められた効率を単独で担当することが決定された。この点変異は、図１に示される２６５塩基対のＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ ＤＮＡフラグメントに位置する。前記２６５bpのＤＮＡフラグメント内でのＥ６８１Ｋ変異は、野生型Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子配列からの単なる変更である。
【０１３９】
ヌクレオチド類似体の組込みの効率のさらなる分析及び定量化のために、プラスミドｐＣＳ１の２６５bpのＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩフラグメントを、ポリメラーゼドメイン内に野生型配列を含むＴａｑ発現ベクター、ｐＲＤＡ３−２中にクローン化した。クローン３−２として言及されるプラスミドｐＲＤＡ３−２は、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ９２／０６２００（引用により本明細書に組込まれる）に十分に記載されている。Ｅ６８１Ｋ及びＦ６６７Ｙ変異の両者をコードする第２のクローンを、プライマー指図された変異誘発及びプラスミドｐＲＤＡ３−２のＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ部位中への両変異を含むＰＣＲ生成物の続くクローニングにより創造した。
【０１４０】
発現ベクターｐＲＤＡ３−２は、ファージλＰL プロモーターに操作可能的に連結される完全な長さのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む。ベクターｐＲＤＡ３−２においては、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の５′−ヌクレアーゼドメインは、５′−ヌクレアーゼ活性を低める、位置４６でグリシンをコードするコドンでの点変異（Ｇ４６Ｄ変異）を含む。しかしながら、発現ベクターｐＲＤＡ３−２のポリメラーゼドメイン内の遺伝子配列は、野生型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子配列と同一である。
【０１４１】
プラスミドｐＲＤＡ３−２，ｐＣＳ１及びＥ６８１Ｋ Ｆ６６７Ｙ ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩ及びＮｈｅＩにより消化し、そしてプラスミドｐＣＳ１からの２６５bpのＤＮＡフラグメント又はＰＣＲ生成物を、従来の手段によりベクターｐＲＤＡ３−２中に連結した。それぞれ、得られるプラスミドｐＬＫ１１２及びｐＬＫ１１３を用いて、Ｅ．コリ株ＤＧ１１６（ＡＴＣＣ番号５３６０６）を形質転換した。それらのプラスミドは、それぞれ、Ｇ４６Ｄ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ及びＧ４６Ｄ Ｅ６８１Ｋ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑとして本明細書において言及される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする。その発現された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼタンパク質Ｇ４６Ｄ Ｅ６８１Ｋ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑを、Ｌａｗｙｅｒなど．，１９９３、前記により記載される方法に従って精製した。
【０１４２】
Ｇ４６Ｄ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ酵素を、次のようにして、類似するが、しかしより小さな規模の調製方法を用いて精製した：すべての段階は、特にことわらない限り４℃で行なわれた。４７５mlの培養物からの細胞を、３０mlの緩衝液（５０mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１０mMのＥＤＴＡ、pH８．０、０．５mMのＰｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ、０．５μｇ／mlのロイペプチン、０．１mMのＮα−ｐ−トシル−Ｌ−リシンクロロメチルケトン、１mMのＤＴＴ）に再懸濁した。細胞を、１分間、５に設定した５０％能力サイクルで音波処理し、そして氷上で１分間、冷却した。この段階をさらに２回くり返した。
【０１４３】
次に、４．０Ｍの硫酸アンモニウム１．５mlを添加し、そしてその混合物を７５℃の水浴において１５分間、加熱し、次に氷上で冷却した。ポリエチレンイミンを添加し、０．６％にし、そしてその混合物を氷上で１０分間インキュベートした。その混合物を１６，０００×ｇで３０分間、遠心分離した。上清液を、５０mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１０mMのＥＤＴＡ、pH８．０、１mMのＤＴＴ、０．２Ｍの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 の溶液により平衡化された１．８ml体積のフェニル−セファロースカラム（Ｂｉｏ−ｒａｄ Ｐｏｌｙｐｒｅｐクロマトグラフィーカラム）上に負荷した。
【０１４４】
カラムを次の３種の溶液それぞれ６mlにより洗浄した：１）２５mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１mMのＥＤＴＡ、１mMのＤＴＴ、０．２Ｍの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、２）２５mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１mMのＥＤＴＡ、１mMのＤＴＴ、及び３）２５mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１mMのＥＤＴＡ、１mMのＤＴＴ、２６％のエチレングリコール。ポリメラーゼを、２５mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１mMのＥＤＴＡ、１mMのＤＴＴ、２０％のエチレングリコール、２．５Ｍの尿素の溶液６mlにより溶離した。
【０１４５】
ポリメラーゼ調製物を３ＭのＫＣｌにより１００mMに調整した後、その混合物を、２５mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１mMのＥＤＴＡ、１mMのＤＴＴ、１００mMのＫＣｌの緩衝液により平衡化されたヘパリン−セファロースカラム（１．８mlの体積のＢｉｏ−ｒａｄ Ｐｏｌｙ−ｐｒｅｐカラム）上に負荷した。同じ緩衝液により洗浄した後、サンプルを、２５mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１mMのＥＤＴＡ、１mMのＤＴＴ、４００mMのＫＣｌの緩衝液に溶出した。
【０１４６】
精製に続いて、修飾された酵素の活性を、Lawyerなど., 1989, J. Biol. Chem. 264 ：6427-6437 （引用により本明細書に組込まれる）に記載される活性アッセイにより決定した。精製された酵素の活性を、次の通りにして計算した：１単位の酵素は、３０分間合成された１０ｎモルの生成物に対応する。ＤＮＡポリメラーゼ活性は、組込まれるｄＣＭＰ ８０〜１００ｐモルまで酵素濃度に直線的に比例する（０．０２４〜０．０３単位／μｌでの希釈された酵素）。精製された酵素を、例２〜４に記載される組込み及び配列決定反応に使用した。
【０１４７】
例２．ｄｄＮＴＰの組込みの効率を比較するためのアッセイ
フルオレセイン類の色素によりラベルされたｄｄＣＴＰを組込むＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ，Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ及びＦ７３０ＹＴｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼの相対的能力を、制限鋳型、プライマー延長競争アッセイの使用により比較した。Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼは、１９９７年７月９日に出願されたアメリカ出願番号６０／０５２０６５の例Ｉ及びヨーロッパ特許出願番号９８１１２３２７．６（両者は引用により本明細書に組込まれる）に記載される。
【０１４８】
この競争アッセイにおいては、ｄｄＣＴＰの組込みは延長反応を終結せしめるので、ポリメラーゼが延長されたプライマー中にｄｄＣＴＰをより容易に組込むほど、〔α−33Ｐ〕ｄＣＴＰの組込みはより低くなる。従って、ｄｄＣＴＰ組込みの効率が高まるにつれて、ＤＮＡ合成の阻害の程度は高められる。次に、ｄｄＣＴＰの組込みの効率を、螢光ラベルされたｄｄＣＴＰの組込みの効率に比較し、一定の酵素について、螢光ラベルされたｄｄＮＴＰの組込みの効率の相対的測定を付与する。
【０１４９】
アッセイを、前に記載されるようにして行なった（Lawyerなど., 1989, J. Biol. Chem. 264 ：6427）（但し、次の変法を包含する）。アッセイ混合物は、５０mMのビシン、pH８．３、２５℃、２．５mMのＭｇＣｌ2 、１mMのβ−ヘルカプトエタノール、２０μＭの個々のｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、２０μＭのｄＣＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、及び〔α−33Ｐ〕ｄＣＴＰ（New England Nuclecu, Boston, MA ）から構成された。Ｍ１３ｍｐ１８（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）をプライマーＤＧ４８（配列番号１０）にアニーリングし、そして同等の０．０８５ｐモルのアニーリングされた鋳型を、個々の反応のためのアッセイ混合物に添加した。
【０１５０】
鋳型ＤＮＡを有するアッセイ混合物３５μｌを、３８本の０．５mlのｅｌｌｅｎｄｏｒｆ管の個々に添加した。２５mMのＣＡＰＳＯ緩衝液（pH９．６）中、Ｚｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの希釈溶液を、それぞれ１０μｌが反応管に添加される場合、Ｚｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの最終濃度が３，１，０．５，０．２５，０．１２５又は０．０６２５μＭになるよう調製した。Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのためには、それぞれ３，１，０．５，０．２５，０．１２５μＭのＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの２つの管を調製した。
【０１５１】
Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ及びＦ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼのためには、それぞれ１，０．５，０．２５，０．１２５及び０．０６２５μＭのＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの２つの管を調製した。残る８本の反応管は、２５mMのＣＡＰＳ０緩衝液（pH９．６）１０μｌを受けた。従って、３８本の管の個々は、反応混合物３５μｌ、及び２５mMのＣＡＰＳＯ緩衝液（pH９．６）１０μｌか又はＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰ希釈溶液の１つ（１０μｌ）のいづれかを含む。
【０１５２】
試験されるべき個々の酵素のために、重合を、個々のＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰ希釈溶液の１本の管において、及びＣＡＰＳＯ緩衝液のみを含む２本の管において５μｌの酵素を用いて開始した。酵素の次の濃度が使用された（個々はアッセイにおいて基質の量に対して酵素の過剰量であることが予備決定された）：例１におけるようにして調製されたＦ６６７Ｙ Ｇ４６Ｄ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ２．５単位；例１におけるようにして調製されたＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ１．２５単位；又はＦ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼ２単位。
【０１５３】
バックグラウンドのレベルのための対照として、残る負の対照を、ポリメラーゼよりもむしろ酵素希釈緩衝液により開始せしめた。すべの反応管はすぐに、短時間、かきまぜられ、そして７５℃で１０分間インキュベートされた。反応を、６０mMのＥＤＴＡ １０μｌの添加により停止し、そして０℃で貯蔵した。
【０１５４】
類似する実験において、ｄｄＣＴＰを、個々の希釈溶液１０μｌが反応管に添加される場合、その最終濃度が０．５，０．２５，０．１２５，０．０６２５又は０．０３１２Ｍになるように、２５mMのＣＡＰＳＯ緩衝液（pH９．６）に希釈した。個々の希釈溶液１０μｌを、上記のようなアッセイ混合物３５μｌを含む０．５mlのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管の個々中にピペットで入れた。アッセイ混合物３５μｌ及び２５mMのＣＡＰＳＯ緩衝液（pH９．６）１０μｌを含む４本の管をまた調製した。従って、１９本の管の個々は、アッセイ混合物３５μｌ、及び２５mMの個々のＣＡＰＳＯ（pH９．６）又はｄｄＣＴＰ希釈溶液の１つ１０μｌを含んだ。
【０１５５】
重合を、個々のｄｄＣＴＰ希釈溶液の１つの管において、及びＣＡＰＳＯ緩衝液の１つの管において、２．５単位のＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１．２５単位のＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ又は２単位のＦ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼにより開始せしめた。ＣＡＰＳＯを含む残りの管を、負の対照として、ポリメラーゼ含有緩衝液よりもむしろ酵素希釈緩衝液により開始せしめた。すべての反応はすぐにかきまぜられ、そして７５℃で１０分間インキュベートされた。反応を６０mMのＥＤＴＡ １０μｌの添加により停止し、そして０℃で貯蔵した。
【０１５６】
個々の反応に関して、６０μｌの反応物の５０μｌアリコートを、２mMのＥＤＴＡ、５０μｇ／mlの剪断されたサケ精子ＤＮＡ（キャリヤーとしての）溶液により希釈した。ＤＮＡを標準の方法を用いて、ＴＣＡにより沈殿せしめ、そしてＧＦ／Ｃフィルターディスク（Ｗｈａｔｍａｎ）上に集めた。組込まれる〔α−33Ｐ〕ｄＣＭＰの量を、個々のサンプルについて測定し、そしてｄｄＮＴＰを有さないＣＡＰＳＯサンプル（０％阻害率）に対して標準化した。５０％阻害率のために必要とされるｄｄＣＴＰ又はＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの濃度を、個々のサンプルについて計算し、そして表２に示す。
【０１５７】
特定の酵素についての合成を５０％阻害するために必要とされるＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの量と合成を５０％阻害するために必要とされるｄｄＣＴＰの量との比較は、螢光ラベルされた類似体を組込む個々の酵素の相対的能力に影響を及ぼす。それらのデータは、Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼが試験される３種の酵素のＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰを最少の効率で組込むことを示す（Ｚｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰ対ｄｄＣＴＰによる５０％阻害率のための濃度の比＝２．５）。
【０１５８】
Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼよりもより効果的にこのラベルされた類似体を組込み（Ｚｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰ対ｄｄＣＴＰによる５０％阻害率のための濃度の比＝４）、そしてＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、ラベルされた及びラベルされていないｄｄＣＴＰをほぼ同等の効率で組込む（Ｚｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰ対ｄｄＣＴＰによる５０％阻害率のための濃度の比＝１．２）。
【０１５９】
【表２】
【０１６０】
例３．延長速度アッセイ
Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ及びＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑの延長速度を、延長速度アッセイを用いて測定した。この実験においては、酵素は、〔α−33Ｐ〕ｄＣＴＰの存在下でＭ１３鋳型にアニーリングされるプライマーを延長するために使用された。延長反応物を変性し、そして生成物を変性アガロースゲル電気泳動により分析した。
【０１６１】
アッセイを、前に記載されるようにして行なった（Lowyerなど., 1989, J. Biol. Chem. 264 ：6427）（但し、次の変法を包含する）。アッセイ混合物は、５０mMのビシン、pH８．３、２５℃、２．５mMのＭｇＣｌ2 、１mMのβ−メルカプトエタノール、２００μＭの個々のｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、１００μＭのｄＣＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、及び〔α−33Ｐ〕ｄＣＴＰ（New England Nuclecu, Boston, MA ）から構成された。Ｍ１３ｍｐ１８（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）をプライマーＤＧ４８（配列番号１１）にアニーリングし、そして同等の０．０８５ｐモルのアニーリングされた鋳型を、個々の反応のためのアッセイ混合物に添加した。鋳型ＤＮＡを有するアッセイ混合物４５μｌを、１４本の０．５mlのｅｆｆｅｎｄｏｒｆ管の個々に添加した。個々の管を、重合反応の開始の前、７５℃で少なくとも３０秒間プレインキュベートした。
【０１６２】
重合を、５μｌのＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位）又はＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１．２５単位）を含む１４本のアッセイ管の６本において開始した。両酵素を例１におけるようにして調製し、そして使用される濃度は、アッセイにおいて基質の量に対して酵素の予定された過剰量を表わす。バックグラウンドのレベルのための対照として、残りの負の対照を、ポリメラーゼよりもむしろ酵素希釈緩衝液により開始した。
【０１６３】
すべての反応管は、すぐに短時間かきまぜられ、そして７５℃でインキュベートされた。Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む６本の管のうち２本を、３分間、他の２本を６分間、そして残りの２本を１０分間インキュベートした。同様に、Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼにより開始された管のうち２本を３０秒間、他の２本を１分間、そして残りの２本を２分間インキュベートした。対照の管は３分間インキュベートされた。反応を、６０mMのＥＤＴＡ １０μｌの添加により停止し、そして０℃で貯蔵した。
【０１６４】
個々の反応のために、６０μｌの反応物の２５μｌアリコートを、２mMのＥＤＴＡ、５０μｇ／mlの剪断されたサケ精子ＤＮＡ（キャリヤーとしての）の溶液１mlにより希釈した。ＤＮＡを標準の方法を用いて、ＴＣＡにより沈殿せしめ、そしてＧＦ／Ｃフィルターディスク（Ｗｈａｔｍａｎ）上に集めた。組込まれた〔α−33Ｐ〕ｄＣＭＰの量を、個々のサンプルについて測定した。
【０１６５】
残る３５μｌの個々の反応物を組合し、そしてサンプル７０μｌをエタノール沈殿せしめ、乾燥せしめ、そして５０mMのＮａＯＨ、１mMのＥＤＴＡ溶液に再懸濁した。同数の〔α−33Ｐ〕の数が個々から取られるように、それらのサンプルからアリコートを除去した。それらのアリコートを、０．９％のアルカリアガロースゲル上に負荷し、電気泳動し、乾燥せしめ、そしてこれまで記載されているようにしてオートラジオグラフィー処理した（Maniatisなど., 1982, Molecular Cloning ： A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY ）。制限酵素ＨｉｎｄIII （ＢＲＬ）により切断され、そして〔32Ｐ〕により５′末端をラベルされたバクテリオファージλＤＮＡを、分子量標準として使用した。
【０１６６】
個々のサンプルにおける延長生成物の塩基対の長さを、個々のサンプルの移動距離とλＤＮＡサイズ標準により移動される距離とを比較することにより決定した。個々の生成物における塩基対の数を、インキュベートされた個々の延長反応の秒数により割り算し、下記に示されるような延長速度を付与した。
【０１６７】
【表３】
【０１６８】
それらの結果は、Ｅ６８１Ｋ変異の存在が、Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ酵素の延長速度を３〜４．３倍、早めたことを示唆する。
【０１６９】
例４．Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びフルオレセイン−ラベルされたｄｄＮＴＰによるサイクル配列決定
この例は、１μＭ又はそれ以下のｄｄＮＴＰ及び少なくとも１：１００の比のｄｄＮＴＰ：ｄＮＴＰを用いての、フルオレセイン色素によりラベルされたターミネーターサイクル配列決定への本発明の修飾されたポリメラーゼの適用を示す。フルオレセイン色素によりラベルされたジデオキシターミネーターは、Applied Biosystems PRISM Sequenase（登録商標）Terminator Sequencing Kit (Perkin-Elmer, Norwalk, (T) からの試薬であり、そしてＳｅｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡポリメラーゼ及びα−チオｄＮＴＰと共に使用するために最適化された。
【０１７０】
サイクル配列決定反応を、次の成分を含む溶液２０μｌにおいて実施した：５０mMのトリス−ＨＣｌ（pH８．８）、２．０mMのＭｇＣｌ2 、１００μＭの個々のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ（Perkin-Elmer, Norwalk, CT)、５００μＭのｄＩＴＰ（Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ ）、０．２μｇのＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ鋳型（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、０．１５μＭのＬａｃＺＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、５単位のＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、２０単位のｒＴｔｈ熱安定性ピロホスファターゼ（ヨーロッパ特許出願、公開番号ＥＰ−Ａ−７６３５９９及びアメリカ特許第５，６６５，５５１号）、０．０５μＭのＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ａ色素ターミネーター、０．８０μＭのＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ｃ色素ターミネーター、０．０８μＭのＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ｇ色素ターミネーター、及び１．０μＭのＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ｔ色素ターミネーター。
【０１７１】
すべての４種のＳｅｑｕｅｎａｓｅ色素ターミネーターは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒから入手された。反応物を、予備加熱（７５℃）されたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９６００熱サイクラーに配置し、そして９６℃で１０分間、５０℃で５秒間、及び６０℃で４分間の２５サイクルにゆだねた。色素によりラベルされたフラグメントを、製造業者の説明書に従って、Ｃｅｎｔｒｉ−ＳｅｐTMカラム（Princeton Separation, Adelphia, NJ）により精製し、そして真空遠心分離機により乾燥せしめた。
【０１７２】
ペレットを、脱イオン化されたホルムアミド：５０mg／mlのブルーデキストラン（２５mMのＥＤＴＡ（pH８．０）中）の５：１（ｖ／ｖ）溶液６μｌに再懸濁し、そして予備電気泳動された４％ポリアクリルアミド／６Ｍ尿素ゲル上に直接的に負荷し、そして電気泳動せしめ、そして製造業者の説明書に従って、Perkin-Elmer AB1 PRISM 377 DNA Sequencer上で分析した。Perkin-Elmer AB2 PRISM 377 DNA Sequencer分析ソフトウェアによる自動化された塩基−コーリングは、４５０塩基について９８．５％以上の精度をもたらした（プライマーからの塩基＋１０〜＋４６０について６個の誤差）。
【０１７３】
【配列表】
【０１７４】
【０１７５】
【０１７６】
【０１７７】
【０１７８】
【０１７９】
【０１８０】
【０１８１】
【０１８２】
【０１８３】
【０１８４】
【０１８５】
【０１８６】
【０１８７】
【０１８８】
【０１８９】
【０１９０】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の図示である。例１、及び本明細書に提供されるさらなる変異体及び発現ベクターを調製するための方法の記載に関する制限部位が示される。
【発明の属する技術分野】
本発明は、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオシド三リン酸を組込むための増強された効率を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに関する。本発明は、そのような変更されたポリメラーゼを単離し、そして生成するための手段を提供する。本発明の酵素は、分子生物学における多くの用途のために有用であり、そして核酸配列決定のために特に好都合である。
【０００２】
【従来の技術】
螢光色素によりラベルされたヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の組込みは、多くのインビトロＤＮＡ合成用途のために重要である。たとえば、色素−ターミネーターＤＮＡ配列決定反応は、終結及びラベリングのために螢光ジデオキシヌクレオチド類似体の組込みを必要とする。さらに、ラベルされた生成物のインビトロ合成は、螢光ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の組込みを含むことができる。たとえば、螢光ラベルされたＤＮＡは、固定されたプローブのマイクロアレイを用いてのハイブリダイゼーションアッセイに使用されて来た（Ｃｒｏｎｉｎなど., 1996, Human Mutation ７：244 ）。
【０００３】
ＤＮＡ複製の再生を確実にするためには、ＤＮＡポリメラーゼは、従来のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）として本明細書において言及されるそれらの通常の基質の組込みのために、及び螢光色素によりラベルされたｄＮＴＰ及びｄＮＴＰ類似体を包含する異例なｄＮＴＰの組込みに対して非常に強い偏向を有する。細胞においては、この性質が、成長するＤＮＡ鎖において異常な塩基、たとえばｄＵＴＰの組込みを弱める。インビトロでは、この特徴は、従来及び異例な螢光ラベルされたヌクレオチド三リン酸の両者が存在する場合、たとえば色素−ターミネーターを用いるジデオキシ鎖終結方法のバージョンを用いてのＤＮＡ配列決定反応において特に明白である（Ｌｅｅなど., 1992, Acids. Res. 20 : 2471；引用により本明細書に組込まれる）。
【０００４】
色素−ターミネーター方法のための市販されているＤＮＡサイクル配列決定キットは、ローダミン類の螢光色素によりラベルされた鎖ターミネーターｄｄＮＴＰを使用する。しかしながら、ローダミン色素は電荷において両性であり、そしてそれらの色素によりラベルされたヌクレオシド三リン酸は検出のための配列決定生成物を分離するために使用される電気泳動ゲルにおいて異常に移動する。ローダミン類の色素のこの性質が、電気泳動の前、ｄＩＴＰの使用及び追加の処理段階を包含する、標準的配列決定プロトコールにおける変更の必要性を引き起こす。
【０００５】
対照的に、負に荷電された螢光色素、たとえばフルオレセイン類の色素は、１）ラベルされたヌクレオシド三リン酸とラベルされたプライマー延長生成物との間の良好な分離、及び２）中性又は正に荷電された螢光色素よりも、ラベルされた配列決定生成物の良好な電気泳動移動を可能にする。従って、フルオレセイン類の色素の使用は、ローダミン類の色素の使用により必要とされる追加の処理段階のための必要性を回避する。しかしながら、フルオレセイン類の利用できる色素は、現在市販されているＤＮＡサイクル配列決定形式への使用のためには理想的ではない。
【０００６】
なぜならば、それらの色素によりラベルされたｄｄＮＴＰは、それらの形式を用いて、配列決定生成物中に効果的に組込まれないからである。従って、常用のヌクレオチド及びフルオレセイン−ラベルされたヌクレオチドの両者を効果的に組込むことができる、商業的に利用できる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼについての必要性が存在する。本発明はその必要性を満たすように機能する。さらに、本発明の変異酵素の思いがけない性質は、その対応する野生型酵素に比較してプライマー延長の早められた速度である。もう１つの思いがけない性質は、自動化されたＤＮＡ配列分析における種々のターミネーターヌクレオチドの組込みの高められた均等性である。
【０００７】
【発明の要約】
本発明は、これまでに特徴づけられた酵素に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有する鋳型−依存性熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を提供する。それらの酵素は、ヌクレオチド、たとえばデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、及び塩基類似体、たとえばジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を組込み、それらは常用の熱安定性酵素よりもより効果的にフルオレセイン類の色素によりラベルされる。それらの酵素をコードする遺伝子はまた、多量の精製された酵素を供給するために組換え発現ベクターとして、本発明により供給される。
【０００８】
本発明によれば、天然のヌクレオチドを正確に組込む能力を保持しながら、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドを組込むポリメラーゼの能力に影響を及ぼす、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ内の必須領域が同定される。この必須領域、又は必須モチーフ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｍｏｔｉｆ）は、本発明の利点を供給するために組換えＤＮＡ法、たとえば部位特異的変異誘発により熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのための遺伝子中に導入され得る。
従って、１つの観点においては、本発明は組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を提供し、ここで前記酵素は、必須のモチーフを生成するよう変異誘発されており、そしてその対応する野生型酵素に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対しての低められた識別性を有するように変異誘発されていることにより特徴づけられる。
【０００９】
この観点において、本発明は組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を供給し、ここで前記酵素は、ａ）その生来の形において、前記ポリメラーゼが次のアミノ酸配列（一文字コードで与えられる）：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；ａ）前記配列における位置４のＸが前記生来の配列に比較して変異誘発されており、但し、ＸはＥには変異誘発されておらず；そしてｃ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、前記酵素の生来の形に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有する、ことにより特徴づけられる。３文字コードにおいては、前記アミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＸａａＰｒｏＸａａＸａａＧｌｕ（配列番号１）（ここで、この配列中の位置３，４，６，９及び１０の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸残基であり、そしてこの配列中の位置７の“Ｘａａ”はＶａｌ又はＩｌｅである）として表わされる。
【００１０】
もう１つの態様においては、組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ａ）そのポリメラーゼの生来の形が次のアミノ酸配列：ＬＳ（Ｑ／Ｇ）ＸＬ（Ｓ／Ａ）ＩＰＹＥＥ（配列番号２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；ｂ）前記配列における位置４のＸが前記生来の配列に比較して変異されており、但しＸはＥへは変異誘発されておらず；そしてｃ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、前記酵素の生来の形に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対する低められた識別性を有することにより特徴づけられる。
【００１１】
３文字コードにおいて、前記アミノ酸は、ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列番号２）（ここで、位置３の“Ｘａａ”はＧｌｎ又はＧｌｙであり、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、そして位置６の“Ｘａａ”はＳｅｒ又はＡｌａである）として表わされる。好ましい態様においては、前記アミノ酸配列は、ＬＳＱＸＬＡＩＰＹＥＥ（配列番号３）（ここでＸは任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＧｌｎＸａａＬｅｕＡｌａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列番号３）（ここで、位置４での“Ｘａａ”は任意のアミノ酸である）として表わされる。より好ましい態様においては、位置４の“Ｘａａ”はＬｙｓである。
【００１２】
さらにもう１つの態様において、組換え安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ａ）そのポリメラーゼの生来形が次のアミノ酸配列：ＬＳＶＸＬＧ（Ｖ／Ｉ）ＰＶＫＥ（配列番号４）を含んで成り；ｂ）前記配列におけるＸが前記生来の配列に比較して変異誘発されており、但しＸはＥに変異誘発されておらず；そしてｃ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが前記酵素の生来の形に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対する低められた識別性を有することにより特徴づけられる。
【００１３】
３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＸａａＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号４）（ここで、位置４での“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、そして位置７の“Ｘａａ”はＶａｌ又はＩｌｅである）として表わされる。好ましい態様においては、前記アミノ酸配列は、ＬＳＶＸＬＧＶＰＶＫＥ（配列番号５）（ここで、位置４のＸは任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＶａｌＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号５）（ここで、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸である）として表わされる。
【００１４】
より好ましい態様において、位置４の“Ｘａａ”はＡｒｇである。もう１つの好ましい態様においては、アミノ酸配列は、ＬＳＶＸＬＧＩＰＶＫＥ（配列番号６）（ここで、位置４のＸは任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいて、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＩｌｅＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号６）（ここで、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸である）として表わされる。より好ましい態様において、位置４の“Ｘａａ”は、Ａｒｇである。
【００１５】
本発明のもう１つの態様において、本発明の特定の必須領域は、異例なヌクレオチド、たとえばｒＮＴＰ及びｄｄＮＴＰの組込みに対して低められた識別性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを供給することが知られている、ポリメラーゼ遺伝子の他の領域におけるモチーフと組合され得る。本明細書において例示される場合、２種の変異を含む組換えサーマス・アクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ酵素が構成された。第１の変異は、本発明の必須モチーフの位置４のＸ残基におけるＥのＫへの変異であった。第２の変異は、Ｆ６６７Ｙ変異として知られているｄｄＮＴＰのより効果的な組込みを可能にする変異であった。
【００１６】
この変異は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの位置６６７でのフェニルアラニンのチロシンへの変異である（アメリカ特許第５，６１４，３６５号及びアメリカ出願番号第８／４４８，２２３号に記載され、そして引用により本明細書に組込まれる）。フルオレセイン類の色素によりラベルされたｄｄＮＴＰとの配列決定反応に使用される場合、Ｅ６８１Ｋ Ｆ６６７Ｙ二重変異体酵素が、読取ることができる配列決定ラダーを生成することが見出された。従って、１つの態様において、ジデオキシヌクレオチドに対する低められた識別性を付与するモチーフが、本発明の決定的モチーフと組合され、ラベルされた及びラベルされていない両ｄｄＮＴＰの組込みの高められた効率を有する酵素が提供される。
【００１７】
さらに、Ｅ６８１Ｋ Ｆ６６７Ｙ変異体酵素は、Ｆ６６７Ｙ変異のみを有する酵素に比較して、有意に早められた延長速度を示すことが思いがけなく見出された。従って、本発明のもう１つの態様においては、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素中への必須のモチーフの、単独での又は他のモチーフと組合しての導入が、早められた延長速度を有する酵素を生成する。
【００１８】
二重変異体酵素はまた、ローダミンによりラベルされたターミネーターを用いての色素−ターミネータージデオキシ配列決定においてより均等なピークの高さを生成することが思いがけなく見出された。従って、さらにもう１つの態様においては、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素中への必須のモチーフの導入は、ローダミン類の色素によりラベルされたターミネーターを用いてのＤＮＡ配列決定方法においてより均等なピークの高さを示す酵素を生成する。
【００１９】
もう１つの態様においては、ｒＮＴＰの一層効果的な組込みを可能にする変異、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの位置６１５のグルタミン酸からグリシンへの変異、又はＥ６１５Ｇ変異（引用により本明細書に組込まれるヨーロッパ特許出願公開番号ＥＰ−Ａ−８２３４７９に記載される）が、本発明の必須のモチーフと組合され、フルオレセイン類の色素によりラベルされたリボヌクレオチドの組込みの高められた効率を有する酵素が供給される。
【００２０】
もう１つの観点においては、本発明のポリメラーゼをコードする遺伝子もまた提供される。特に、本発明の必須のモチーフを含んで成る組換え熱安定性ポリメラーゼをコードする遺伝子が供給される。本発明の必須のモチーフを生成する変異を包含する複数の変異の組合せをコードする遺伝子もまた、この観点に包含される。
【００２１】
さらにもう１つの観点においては、本発明はまた、より低い濃度のフルオレセイン類の色素によりラベルされたｄｄＮＴＰの使用を可能にし、それにより、反応を実施する費用を減じる、ＤＮＡ配列決定の改良された方法を提供する。本発明の改良された方法はまた、低い比のフルオレセイン類の色素によりラベルされたｄｄＮＴＰ：ｄＮＴＰの使用を可能にする。それらの方法の使用は、多くの利点、たとえばより効果的な重合、低濃度の必要とされる鋳型核酸、及び反応混合物へのインヒビターを導入する可能性の低下をもたらす。それらの利点はまた、長い鋳型の配列決定を促進する。本発明はまた、配列決定反応が、中間の精製を伴わないで、続く電気泳動のための配列決定ゲル上に直接的に負荷され得る、改良された配列決定方法を提供する。
【００２２】
従って、本発明の１つの態様においては、本発明は、ａ）本発明の必須のモチーフを生成する位置４での変異を有し、そしてｂ）対応する野生型酵素に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対する低められた識別性を有する組換え酵素を用いての標的核酸の配列を決定するための改良された方法を提供する。
【００２３】
本発明の必須のモチーフを生成する天然に存在する配列変動を含む、好熱種に由来する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いての改良された配列決定方法はまた、本発明の範囲内である。それらの生来の酵素はまた、異例なヌクレオチドの組込みに対する低められた識別性も提供することができる。この態様において、本発明は、ａ）位置４におけるアミノ酸がＧｌｕではない本発明の必須のモチーフを有し、そしてｂ）フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対する低められた識別性を有する生来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いての改良された配列決定方法を提供する。
【００２４】
フルオレセイン類の色素によりラベルされたＤＮＡを生成するための改良された方法もまた、本発明の範囲内である。本発明の酵素は、種々の部位でフルオレセイン類の色素によりラベルされる増幅された生成物を生成するポリメラーゼ連鎖反応方法にフルオレセイン−ラベルされたｄＮＴＰを効果的に組込む。従って、１つの態様においては、ＤＮＡをラベリングする改良された方法は、ａ）フルオレセイン類の色素によりラベルされたｄＮＴＰ及び本発明の酵素を含んで成る反応混合物を提供し、そしてｂ）核酸増幅反応を実施することを含んで成る。
【００２５】
本発明の方法、及びそれらの酵素をコードする遺伝子は、本発明の組換え酵素を含んで成り、そしてさらに、負に荷電された螢光ターミネーター化合物を含むＤＮＡ配列決定のためのキットである本発明のさらなる観点を供給する。ＤＮＡ配列決定のための他のキットは、ａ）負に荷電された螢光ターミネーター化合物、及びｂ）本発明の生来の酵素を含んで成る。
本発明はまた、本発明の組換え酵素を含んで成る、ラベルされたＤＮＡを生成するためのキットも提供する。ラベルされたＤＮＡを生成するための他のキットは、ａ）負に荷電された螢光ヌクレオチド三リン酸化合物、及びｂ）本発明の生来の酵素を含んで成る。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本発明の理解を促進するために、多くの用語が下記に定義される。
用語“遺伝子”とは、回収できる生物活性ポリペプチド又は前駆体の生成のために必要な制御及びコード配列を含んで成るＤＮＡ配列を意味する。前記ポリペプチドは、完全な長さの遺伝子配列により、又は酵素活性が保持される限り、コード配列のいづれかの部分によりコードされ得る。
【００２７】
用語“生来の”とは、天然に存在する源から単離される遺伝子又は遺伝子生成物を意味する。この用語はまた、生来の形のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する、分子生物学的技法により生成された生来のタンパク質の組換え形も言及する。
用語“変異体”とは、その核酸配列が変更されている遺伝子、又はそのアミノ酸配列が変更されている遺伝子生成物を意味し、それにより、生来の又は野生型遺伝子又は遺伝子生成物に比較される場合、変更された機能的性質を有する遺伝子生成物をもたらす。そのような変更は、点変異、欠失及び挿入を包含する。
【００２８】
用語“宿主細胞”とは、単細胞原核及び真核生物、たとえば細菌、酵母及び放線菌、及び細胞培養において増殖される場合、高等植物又は動物からの単一細胞を意味する。
用語“発現系”とは、作用可能に連結されたコード配列及び制御配列を含むＤＮＡ配列を意味し、その結果、それらの配列により形質転換された宿主細胞はコードされたタンパク質を生産することができる。形質転換をもたらすためには、その発現システムはベクター上に包含され得る、そしてその対応するＤＮＡもまた、宿主染色体中に組込まれ得る。
【００２９】
用語“オリゴヌクレオチド”は、本明細書において使用される場合、複数の、好ましくは３個よりも多くの、及び通常、１０個よりも多くのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成される分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、多くの要因、たとえばオリゴヌクレオチドの究極的な機能又は使用に依存するであろう。
【００３０】
オリゴヌクレオチドは、たとえば適切な配列のクローニング及び制限酵素処理を包含するいづれか適切な方法により、及びたとえば次の方法による直接的な化学合成により調製され得る：Narangなど., 1979, Meth. Enzymol. 68：90-99 のホスホトリエステル法；Brown など., 1979, Meth. Enzymol. 68：109-151 のホスホジエステル法；Beaucageなど., 1981, Tetrahedron Lett. 22 ：1859-1862 のジエチルホスホラミジット法；Matteucci など., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103：3185-3191 のトリエステル法、又はアメリカ特許第４，４５８，０６６号の固体支持法（それらは引用により本明細書に組込まれる）。
【００３１】
用語“プライマー”とは、本明細書において使用される場合、プライマー延長が開始される条件下で配置される場合、合成の開始の点として作用することができる、天然又は合成のいづれかのオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは好ましくは、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーの適切な長さは、プライマーの意図された使用に依存するが、しかし典型的には１５〜３５個のヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一般的に、鋳型との十分に安定したハイブリッド複合体を形成するためには、より低い温度を必要とする。プライマーは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、しかし生じるプライマー延長のための鋳型とハイブリダイズするために十分に相補的であるべきである。
【００３２】
プライマーは、所望により、分光学、光化学、生化学、免疫化学又は化学手段により検出できるラベルを組込むことによってラベルされ得る。たとえば、有用なラベルは、32Ｐ、螢光色素、電子濃試薬、酵素（通常、ＥＬＩＳＡアッセイに使用されるような）、ビオチン、又は抗血清又はモノクローナル抗体が利用できるハプテン及びタンパク質を包含する。
【００３３】
用語“熱安定性ポリメラーゼ”とは、熱に対して安定しており、耐熱性であり、そして二本鎖核酸の変性をもたらすのに必要な時間、高温にゆだねられる場合、不可逆的に変性（不活性化）されない酵素を意味する。核酸変性のために必要な加熱条件は、当業界においてよく知られており、そしてアメリカ特許第４，６８３，２０２号及び第４，６８３，１９５号（それらは引用により本明細書に組込まれる）に例示されている。本明細書において使用される場合、熱安定性ポリメラーゼは、温度サイクリング反応、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）への使用のために適切である。本発明の目的のための不可逆的変性とは、酵素活性の永久的且つ完全な損失を意味する。熱安定性ポリメラーゼのためには、酵素活性とは、鋳型核酸鎖に対して相補的であるプライマー延長生成物を形成するために適切な態様でのヌクレオチドの結合の触媒作用を意味する。
【００３４】
用語“常用の”又は“天然の”とは、核酸塩基、ヌクレオシド三リン酸、又はヌクレオチドに関する場合、記載されるポリヌクレオチドであって天然で存在するものを意味する（すなわち、ＤＮＡに関しては、それらはｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰである）。さらに、ｄＩＴＰ及び７−デアザ−ｄＧＴＰが時々、ｄＧＴＰの代わりに使用され、そして７−デアザ−ｄＡＴＰがインビトロＤＮＡ合成反応、たとえば配列決定においてｄＡＴＰの代わりに使用され得る。集合的には、それらはｄＮＴＰとして言及され得る。
【００３５】
用語“異例な”又は“修飾された”とは、核酸塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドに関する場合、特定のポリヌクレオチドにおいて天然で存在する従来の塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドの修飾、誘導体化又は類似体を包含する。ウラシルのデオキシリボヌクレオチド形は、ＤＮＡ（ｄＵＭＰ）において異例な又は修飾された塩基であり、そしてウラシルのリボヌクレオチド形はＲＮＡ（ＵＭＰ）において従来の塩基である。本明細書で使用される場合、異例なヌクレオチドは、核酸配列決定のためのターミネーターとして使用される化合物類を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００３６】
ターミネーター化合物は、２′，３′−ジデオキシ構造を有し、そしてジデオキシヌクレオシド三リン酸として言及されるそれらの化合物類を包含するが、但し、それらだけには限定されない。ジデオキシヌクレオシド三リン酸ｄｄＡＴＰ，ｄｄＴＴＰ，ｄｄＣＴＰ及びｄｄＧＴＰは、集合的にｄｄＮＴＰとして言及される。他の異例なヌクレオチドは、ホスホロチオエートｄＮＴＰ（〔α−Ｓ〕ｄＮＴＰ）、５′−α−ボラノ−ｄＮＴＰ、α−メチル−リン酸ｄＮＴＰ、及びリボヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰ）を包含する。異例な塩基は、放射性同位体、たとえば32Ｐ，33Ｐ又は35Ｓ；螢光ラベル；化学発光ラベル；生物発光ラベル；ハプテンラベル、たとえばビオチン；又は酵素ラベル、たとえばストレプタビジン又はアビジンによりラベルされ得る。
【００３７】
螢光ラベルは、負に荷電された色素、たとえばフルオレセイン類の色素、又は中性電荷の色素、たとえばローダミン類の色素、又は正に荷電された色素、たとえばシアニン種類の色素を包含することができる。フルオレセイン類の色素は、たとえばＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＪＯＥ，ＮＡＮ及びＺＯＥを包含する。ローダミン類の色素は、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ，ＲＯＸ，Ｒ１１０，Ｒ６Ｇ、及びＴＡＭＲＡを包含する。ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＪＯＥ，ＮＡＮ，ＺＯＥ，ＲＯＸ，Ｒ１１０，Ｒ６Ｇ及びＴＡＭＲＡは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により市販されており、そしてＴｅｘａｓ ＲｅｄはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓにより市販されている。シアニン種類の色素は、Ｃｙ２，Ｃｙ３，Ｃｙ５及びＣｙ７を包含し、そしてＡｍｅｒｓｈａｍ（Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England ）により市販されている。
【００３８】
用語“ＤＮＡ合成反応”とは、ＤＮＡのコピーを生成する方法、たとえばＰＣＲ、標準の置換増幅、転写介在の増幅、プライマー延長及び逆転写を言及するが、但しそれらだけには限定されない。
本発明の理解をさらに促進するためには、特定の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素及び螢光色素が、本発明を例示するために明細書中に言及され、そしてそれらの言及は本発明を限定するものではない。
【００３９】
本発明は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである新規且つ改良された組成物を提供する。本発明の酵素は、その対応する野生型酵素に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオシド三リン酸をより効果的に組込む組換えポリメラーゼを包含する。本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、従技術のポリメラーゼよりも、ラベルされた生成物のＤＮＡ配列決定及びインビトロ合成のような方法への使用のためにより適切であり且つより所望される。本発明の改良されたＤＮＡ配列決定法は、それらの組換えポリメラーゼの使用、及びこれまでに特徴づけられた酵素よりも、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオシド三リン酸をより効果的に組込む生来の酵素の使用を包含する。それらの酵素をコードするＤＮＡ配列、及びそのタンパク質を発現するためのベクターがまた供給される。
【００４０】
本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、酵素のポリメラーゼ活性ドメインのアミノ酸配列内に必須の領域を有する。本発明により提供される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列内の必須の領域は、従来の一文字アミノ酸コードを用いて下記に示される（Lehninger, Biochemistry, New York, New York, Worth Publishers Inc., 1970, 967 ：引用により本明細書に組込まれる）：配列番号７：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（ここで、位置４の“Ｘ”はＥを除くいづれかのアミノ酸を示す）。
【００４１】
アミノ酸のための３文字コードにおいては、この配列は、ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＸａａＰｒｏＸａａＸａａＧｌｕ（配列番号７）（ここで、位置３，６，９及び１０の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、この配列中の位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であるが、但し、グルタミン酸残基（Ｇｌｕ）ではなく、そして位置７の“Ｘａａ”はＶａｌ又はＩｌｅである）として表わされる。この必須の領域は、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドを効果的に組込む能力により特徴づけられる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を供給する。
【００４２】
たとえば、位置４６でのグリシンからアスパラギン酸への変異（Ｇ４６Ｄ）及びＦ６６７Ｙをすでに含むサーマス・アクアチカス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の誘導体においては、完全な長さのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ配列の残基６８１配列（必須のモチーフの位置４に対応する）でのグルタミン酸のためのコドンの最初の位置におけるＧからＡへの変異が、必須のモチーフを有する酵素をもたらす。この酵素は、１）従来のヌクレオチドの存在下でＰＣＲを介在する酵素の能力の低下を伴わないで、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みの効率の約２〜１０倍の上昇；及び２）延長速度の２〜４．３倍の上昇を示す。
【００４３】
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼにおいては、この特別な変異は、Ｅ（グルタミン酸）からＫ（リシン）へのアミノ酸の変更をもたらす。
この特別なアミノ酸変更は必須のモチーフを生成し、そして異例なヌクレオチドを組込む酵素の能力を有意に変えるけれども、ＥからＫへの特異的な変更は、決定的領域内の現在同定される位置ほどは、本発明に対しては決定的ではないことが予測される。
【００４４】
従って、好ましい態様においては、本発明は、組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を供給し、ここで前記酵素は、ａ）その生来の形において、前記酵素がアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；ｂ）前記配列中の位置４のＸが前記生来の配列に比較して変異誘発されているが、但し位置４のＸはＥへは変異誘発されておらず；そしてｃ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、前記酵素の生来の形に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有することにより特徴づけられる。より好ましい態様においては、位置４のＸは、陽性電荷を有するアミノ酸、たとえばＫ，ＲもしくはＨにより、又は極性アミノ酸、たとえばＱもしくはＮにより置換されている。最っとも好ましい態様においては、位置４のＸは、Ｋにより置換される。
【００４５】
本発明のもう１つの好ましい態様においては、本発明の酵素は、ａ）フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドに対して低められた識別性を有し、そしてアミノ酸配列：ＬＳ（Ｑ／Ｇ）ＸＬ（Ｓ／Ａ）ＩＰＹＥＥ（配列番号２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成ることによって特徴づけられる。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、次の通りに表わされる：ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（ここで、位置３の“Ｘａａ”はＧｌｎ又はＧｌｙであり、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、そして位置６の“Ｘａａ”はＳｅｒ又はＡｌａである）。
【００４６】
本発明のより好ましい態様においては、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドに対する低められた識別性を有する酵素は、アミノ酸配列：ＬＳＱＸＬＡＩＰＹＥＥ（配列番号３）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成る。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＧｌｎＸａａＬｅｕＡｌａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（ここで、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸である）として表わされる。本発明の最とも好ましい態様においては、ＸはＫ残基である。
【００４７】
本発明のもう１つの好ましい態様においては、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドに対して低められた識別性を有する酵素は、アミノ酸配列：ＬＳＶＸＬＧ（Ｖ／Ｉ）ＰＶＫＥ（配列番号４）（ここでＸは任意のアミノ酸である）を含んで成る。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＸａａＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（ここで、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、そして位置７の“Ｘａａ”はＶａｌ又はＩｌｅである）として表わされる。
【００４８】
本発明のより好ましい態様においては、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドに対して低められた識別性を有する酵素は、アミノ酸配列ＬＳＶＸＬＧＶＰＶＫＥ（配列番号５）（ここでＸは任意のアミノ酸である）を含んで成る。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＶａｌＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（ここで、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸である）として表わされる。最とも好ましい態様においては、ＸはＲ残基である。
【００４９】
もう１つの好ましい態様においては、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドに対して低められた識別性を有する酵素は、アミノ酸配列：ＬＳＶＸＬＧＩＰＶＫＥ（配列番号６）（ここでＸは任意のアミノ酸である）を含んで成る。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＩｌｅＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（ここで、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸である）として表わされる。最とも好ましい態様においては、前記ＸはＲ残基である。
【００５０】
本明細書に記載されるＥ６８１Ｋ変異の特徴化は、負に荷電された螢光ヌクレオチドと相互作用するポリメラーゼの能力に影響を及ぼす、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子における領域を同定した。ヘリックスＯに対して遠位のこの部位は、ポリメラーゼのＯa ヘリックスの末端部及びＯb ヘリックスの開始部に存在する（Ｋｉｍ，など., 1995, Nature, 376：612 ）。当業界において良く知られている分子モデリング原理に基づけば、位置６８１のＥからＫ以外のＯa −Ｏb ヘリックスの構造の変化はまた、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドに対して識別するポリメラーゼの能力の変化をもたらすことが予測される。
【００５１】
従って、位置４のＸ残基における変異以外の必須のモチーフにおける位置での変異もまた、本発明の範囲内である。この態様においては、本発明は、組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を提供し、ここで前記酵素は、ａ）その生来の形において、前記ポリメラーゼはアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り、ｂ）前記組換えポリメラーゼが前記アミノ酸配列内での少なくとも１つの変異を含んで成り、但し、位置４のＸはＥへは変異誘発されず、そしてｃ）前記酵素がその対応する生来の酵素に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有することにより特徴づけられる。
【００５２】
同様に、アミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで位置４のＸは任意のアミノ酸であるが、しかしＥではない）である必須のモチーフに対して類似するが、しかし同一ではない必須のモチーフを含んで成る熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、本発明の範囲内である。特に１つの態様において、前記必須のモチーフは、アミノ酸配列：ＬＸＸＸＸＸＸＸＸＸＥ（配列番号８）（ここで、位置４のＸは、Ｅを除く任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＧｌｕ（配列番号８）（ここで、位置２，３，５，６，７，８，９及び１０の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、そして位置４の“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸である）として表わされる。
【００５３】
もう１つの態様において、前記必須のモチーフは、アミノ酸配列：Ｌ（Ｓ／Ａ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ）ＸＸＸＸＸＥ（配列番号９）（ここで、位置ＸのＸはＥを除く任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＧｌｕ（配列番号９）（ここで、位置３，６，７，８，９、及び１０での“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、位置２の“Ｘａａ”はＳｅｒ又はＡｌａであり、位置４の“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸であり、そして位置５の“Ｘａａ”はＬｅｕ又はＩｌｅである）として表わされる。
【００５４】
さらにもう１つの態様においては、前記必須のモチーフは、アミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸＸＸＸＸＥ（配列番号１０）（ここで、位置４のＸはＥを除く任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＧｌｕ（配列番号１０）（ここで、位置３，６，７，８，９及び１０の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、そして位置４の“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸である）として表わされる。
【００５５】
フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドを効果的に組込む本発明の酵素の能力は、ｄｄＮＴＰ組込みアッセイにより測定される。１つのそのようなアッセイは、制限鋳型の条件下で行なわれるプライマー延長競争アッセイである。このアッセイにおいては、Ｍ１３ｍｐ１８鋳型（Ｉｎｎｉｓなど., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：9436）に結合されるプライマーＤＧ４８（５′−ＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣ）（配列番号１１）が、種々のレベルの螢光ラベルされたｄｄＮＴＰ、Ｚｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰと共に、〔α−33Ｐ〕ｄＣＴＰ及び過剰の酵素の存在下で延長される。
【００５６】
ｄｄＣＴＰ残基の組込みがその延長反応を終結するので、ＤＮＡポリメラーゼが延長されたプライマー中にｄｄＣＴＰをより容易に組込むほど；〔α−33Ｐ〕ｄＣＴＰの組込みは低くなる。従って、螢光ラベルされたｄｄＣＴＰ組込みの効率が低くなるにつれて、ＤＮＡ合成の阻害の程度は高められる。その反応はまた、種々のレベルのラベルされていないｄｄＣＴＰによっても実施された。５０％阻害率のために必要とされるｄｄＣＴＰ及びＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの濃度が計算され、そして比較され、螢光ラベルされたヌクレオチドを組込む酵素の能力を相対的測定結果が付与された。ｄｄＮＴＰ組込みアッセイの詳細は、例２に供給される。
【００５７】
従って、本発明の１つの態様においては、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対する低められた識別性の特徴が、例２に記載される螢光ｄｄＮＴＰ組込みアッセイにより測定される。好ましい態様においては、ＤＮＡ合成の５０％阻害率のために必要とされるフルオレセイン色素、すなわちＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰによりラベルされたｄｄＮＴＰの濃度は、野生型酵素に比較し、本発明の変異体酵素に関して少なくとも３倍、低められる。より好ましい態様においては、前記濃度は、少なくとも１０倍低められる。もう１つの態様においては、低められた識別性の特徴が螢光ｄＮＴＰ組込みを測定することによってアッセイされる。
【００５８】
本発明のもう１つの観点においては、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子配列及び酵素は、種々の好熱種に由来する。１つの観点においては、ポリメラーゼ遺伝子配列及び酵素はサーマス属の種からである。本発明の他の態様においては、遺伝子配列及び酵素は、サーマス以外の好熱種からである。多くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのための完全な核酸及びアミノ酸配列は入手できる。Ｔａｑ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｔｈ）、サーマス・スペーシスＺ０５、サーマス・スペーシスｓｐｓ１７、サーモトガ・マリチマ（Ｔｍａ）及びサーモシフォ・アフリカナス（Ｔａｆ）ポリメラーゼの個々の配列は、１９９２年４月１６日にＰＣＴ特許公開番号ＷＯ９２／０６２００として公開されたＰＣＴ国際特許出願番号ＰＣＴ／Ｕ．Ｓ．９１／０７０３５に公開されている。
【００５９】
サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍａｓ ｆｌａｖｕｓ）、バシラス・カルドテナクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）及びバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのＤＮＡポリメラーゼのための配列は、それそれ、Akhmetzjanov and Vakhitov, 1992, Nucleic Acids Research 20 (21）：5839；Uemoriなど., 1993, J. Biochem. 113： 401-410；及びＮＧ：Ｎｅｗ ＧｅｎＢａｎｋデータベースからの受託番号ＢＳＵ２３１４９ｎｇ（それぞれ引用により本明細書に組込まれる）に公開されている。
【００６０】
サーマス・カルドフィラス（Ｔｈｅｒｍａｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）からの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの配列は、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ６２５８４として見出される。サーマス・フィリホルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）からの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの配列は、アメリカ特許第４，８８９，８１８号に提供される方法及び表１に提供される配列情報を用いて、ＡＴＣＣ寄託番号第４２３８０号から回収され得る。サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）のＤＮＡポリメラーゼの配列は、GeneSeq Patent Data Base Accession No. R98144(PCT W097／09451 にも開示される）からである。
【００６１】
【表１】
１．受託番号D12982, Uemori T., Ishino Y., Fujita k., Kato L. “Cloning of the DNA polymerase gene of Bacillus caldotenax and characterization of the gene product" J. Biochem. 113 ：401 (1993)からのタンパク質配列。その配列における必須の残基は７２５である。ほとんど同一のタンパク質配列が、受託番号Ｒ４５１５５及びＷＰＩ９３−４０８３２３／５１において推定上の“バシラス・ステアロサーモフィラス”ＤＮＡポリメラーゼとして提供される。その配列における決定的な残基は７２４である。
【００６３】
２．Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ又はＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ／ＰＩＲデータベースにバシラス・ステアロサーモフィラスＤＮＡポリメラーゼのためのいくつかの配列が提供されている。それらの配列はお互いひじょうに関連しているが、しかし、いく分異なっているけれども、個々の配列は同一のＬ（Ｓ／Ａ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ）ＸＸＸＸＸＥ（配列番号９）モチーフ（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含む。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＧｌｕ（配列番号９）（ここで、位置３，６，７，８，９及び１０の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、位置２の“Ｘａａ”はＳｅｒ又はＡｌａであり、位置４の“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸であり、そして位置５の“Ｘａａ”はＬｅｕ又はＩｌｅである）として表わされる。
【００６４】
上記表においては、位置７２４に必須のモチーフにおける必須の残基を含んで成るタンパク質配列は、日本特許公開Ｊ０５３０４９６４Ａ、ヨーロッパ特許第６９９，７６０号及び受託番号Ｕ３３５３６により供給される。もう１つの非常に関連しているが、しかしいく分異なっているタンパク質配列は、Gene 163：65-68 (1995)に公開されており、位置７２７での必須のモチーフにおいて決定的残基を含む。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのためのもう１つの非常に関連するが、しかしいく分異なっている、受託番号Ｕ２３１４９のタンパク質配列は、位置８０２にある必須のモチーフにおいて必須の残基を含む。
【００６５】
個々の好熱種のＤＮＡポリメラーゼはユニークであるので、決定的領域のアミノ酸位置は個々の酵素に関して異なる。アミノ酸及び核酸配列の配置プログラムは、容易に入手でき、そして本明細書において同定される特定の領域が与えられる場合、本発明の正確な配列領域の同定を助力する。そのような配列の配置プログラムは、Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsinから入手できる。ここで同定される特定のモチーフが与えられる場合、“ＧＡＰ”、“ＢＥＳＴＦＩＴ”及び“ＰＩＬＥＵＰ”を包含するそれらのプログラムは、必須のモチーフの局在化を助ける。決定的領域の位置は、典型的な好熱種からの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼについての表１に示されている。
【００６６】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼドメイン内の必須のモチーフＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４のＸはＥを除く任意のアミノ酸である）の正確な位置にもかかわらず、そのモチーフの存在は、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドを効果的に組込む能力を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを供給するよう作用する。
【００６７】
従って、必須のモチーフを生成するための、サーマス・フラバス（Ｇｌｕ６７９）、サーマス・サーモフィラス（ＧluＵ６８３）、サーマス・スペーシスＺ０５（Ｇｌｕ６８３）、サーマス・スペーシスｓｐｓ１７（Ｇｌｕ６７９）、サーマス・カルドフィラス（Ｇｌｕ６８３）、サーマス・フィリホルミス（Ｇｌｕ６７９）からの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの保存されたグルタミン酸の変異が、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドを効果的に組込むポリメラーゼの能力に対する増強効果を提供するであろう。
【００６８】
さらに、現在同定された必須のモチーフの高く保存された性質の観点から、新規熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、たとえばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、又は表１における他のＤＮＡポリメラーゼの配列に対するそれらの相同性に基づいて同定され得る（たとえば、引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第５，６１８，７１１号及び第５，６２４，８３３号を参照のこと）。本明細書に記載される方法により決定される場合、そのようなポリメラーゼは、それらのペプチド配列がＴａｑポリメラーゼアミノ酸配列に対して少なくとも４５％及び最とも好ましくは８０％以上相同である限り、本発明の範囲内である。
【００６９】
従って、本発明はまた、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及び次の種からの対応する遺伝子及び発現ベクターを含む種々の酵素に関する：サーマス・オシマイ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ）（Williams RA,など., 1996, Int. J. Syst. Bacteriol. 46 (2)：403-498)；サーマス・シルバヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ）及びサーマス・クリアロフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉｏｒｏｐｈｉｌｕｓ）（Tenreiro S, など., 1995, Int. J. Syst. Bacteriol 45 (4) ：633-639)；サーマス・スコトグクタス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）（Tenreiro S, など., 1995, Res. Microbiol. 146 (4)：315-324)；サーマス・ルバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ）ＡＴＣＣ３５９４８（L. G. Loginova, 1984, Int. J. Syst. Bacteriol. 34 ：498-499)；及びサーマス・ブロキアヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）（Munster, M. J., 1986, J. Gen. Microbiol. 132：1677）（それらの出版物は、引用により本明細書にそれぞれ組込まれる）。
【００７０】
当業者は、フルオレセイン−ラベルされたヌクレオチドを組込むための増強された効率を有する上記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが組換えＤＮＡ技法、たとえば特定部位の変異誘発により最とも容易に構成されることを認識するであろう。たとえば、Sambrookなど., Molecular Cloning ： A Laboratory Maual, Cold Spring Harbor, 1989、第２版、チャプター１５．５１，“Oligonucleotide-mediated mutagenesis”（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。この技法は当業界において現在、標準であり、そして遺伝子におけるいづれかの決定された部位ですべての可能な種類の塩基対変更を創造するために使用され得る。
【００７１】
その方法は、所望する変異を表わす、限定されたミスマッチを除く、変異誘発される一本鎖ファージ又はプラスミドＤＮＡに対して相補的である合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施される。手短に言及すれば、合成オリゴヌクレオチドは、ファージ又はプラスミドに対して相補的な鎖の合成を指図するためのプライマーとして使用され、そして得られる二本鎖ＤＮＡを用いて、ファージ−又はプラスミド−維持の宿主細菌が形質転換される。その得られる細菌は、たとえば所望する変異誘発された遺伝子配列を担持するそれらのプラーク又はコロニーを同定するために、ＤＮＡ配列分析又はプローブハイブリダイゼーションによりアッセイされ得る。
【００７２】
ＰＣＲの発明に続いて、プライマー指令変異誘発（アメリカ特許第４，６８３，１９５号に記載される；引用により本明細書に組込まれる）、及び“オーバーラップＰＣＲ”（Higuchi, 1989, PCR Technology, ed. Erlich, Stockfon Press, New York, NY, pp 61-70 ）が、遺伝子のいづれかの位置でいづれかの変異を導入する日常の手段になった。
【００７３】
変異誘発されたＤＮＡは、従来の手段によりプラスミド、ファスミド、ファージ又は増幅反応から回収され、そして得られる酵素の続く培養及び精製のために発現ベクター中に連結される。多くのクローニング及び発現ベクターは、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋなど．，１９８９前記に記載されるように、哺乳類及び細菌システムを包含する発明を実施するために適切である。便利さのために、本発明は、λ由来のＰL プロモーター（Shimatake など., 1981, Nature 292 ：128 ）を用いて例示される。このプロモーターの使用は、引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第４，７１１，８４５号及び第５，０７９，３５２号に特に記載される。
【００７４】
プラスミドｐＣＳ１は、１９９７年８月２８日にＡＴＣＣに寄託され、そして受託番号９８５２１を付与された。このプラスミドは、グルタミン酸がその得られるポリペプチドにおいてリシンにより置換されるような位置６８１でのコドンで変異誘発された、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含み、そしてフルオレセイン類の色素によりラベルされるヌクレオチドを組込むための増強された効率を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを提供するための手段を提供する。
【００７５】
例１は、他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を創造するためにＥ６８１Ｋ変異をサブクローニングするのに適切なフランキング制限部位の使用を例示する。他方では、多くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのための完全な遺伝子配列は知られているので、Ｅ６８１Ｋ変異を導入するための他の手段、たとえば制限消化及びフラグメント置換は、ＡＴＣＣ寄託物の利用性及び本明細書に供給される配列情報を有する当業者に容易に利用できる。
【００７６】
本発明の変異体の又は生来の酵素の１つ又はそれらの酵素の誘導体又は相同体の生成を所望する場合、前記酵素の生成は、典型的には、発現ベクターによる宿主細胞の形質転換、及びその形質転換された宿主細胞の発現が生じるであろう条件下での培養を包含する。形質転換及び形質転換された宿主細胞の培養のための手段は、当業界において良く知られており、そしてたとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．，１９８９、前記、に詳細に記載される。
【００７７】
本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは一般的に、野生型又は修飾された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子に操作可能的に連結される発現ベクターにより形質転換されたＥ．コリ株ＤＧ１１６（１９８７年４月７日、ＡＴＣＣ５３６０６として寄託されている）から精製される。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを精製するための方法は、たとえば例１及びLawyerなど., 1993, PCR Methods and Applications ２：275-87（引用により本明細書に組込まれる）に記載される。
【００７８】
本発明の熱安定性酵素は、そのような酵素活性が必要であり又は所望されるいづれかの目的のために使用され得る。使用の例は、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡラベリング、及びプライマー延長生成物のラベリングを包含する。Ｓａｎｇｅｒのジデオキシヌクレオチド方法（Sangerなど., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. 74：5463）によるＤＮＡ配列決定は、本発明により特に改良される。基本的なＳａｎｇｅｒなどの方法における進歩は、新規ベクター（Yanisch-Perronなど., 1985 Gene 33 ：103-119 ）、及び塩基類似体（Mills など., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. 76：2232-2235 、及びBarrなど., 1986, Biotechniques ４：428-432 ）を提供して来た。
【００７９】
一般的に、ＤＮＡ配列決定は、鎖−終結塩基類似体の存在下で鋳型−依存性プライマー延長を必要とし、結果的にサイズにより分離される部分的フラグメントの分布をもたらす。基本的ジデオキシ配列決定方法は、（ｉ）鋳型に対して、任意にラベルされたオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングし；（ii）４種の別々の反応においてＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを延長し、ここで個々の反応はラベルされていないｄＮＴＰの混合物、及び限定量の一本鎖終結剤、たとえば任意にラベルされたｄｄＮＴＰを含み；そして（iii ）高い分解能の変性ポリアクリルアミド／尿素ゲル上で４組の反応生成物を分解することを包含する。反応生成物は、使用されるラベルに依存して、オートラジオグラフィー又は螢光検出によりゲルにおいて検出され得、そして像は、ヌクレオチド配列を推定するために試験され得る。それらの方法は、ＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＥ．コリＰｏｌＩのクレノウフラグメント、又は変性されたＴ７ ＤＮＡポリメラーゼを使用する。
【００８０】
耐熱性ポリメラーゼ、たとえばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの有用性は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによる配列決定のための改良された方法（Ｉｎｎｉｓなど．，１９８８、前記を参照のこと）及び“サイクル配列決定”と呼ばれるその変法（Murray, 1989, Nuc. Acids. Res. 17 ：8889）をもたらした。基本的なジデオキシ配列決定の代用としてのサイクル配列決定は、鎖ターミネーターの存在下で鋳型配列に対して相補的な標的配列の線状非対称増幅である。単一のサイクルは、すべての可能な長さの種類の延長生成物を生成する。ＤＮＡ鋳型からの延長反応生成物の変性に続いて、プライマーアニーリング及びプライマー延長の複数のサイクルが、ターミネーター、たとえばｄｄＮＴＰの存在下で生じる。
【００８１】
サイクル配列決定は、従来の鎖−終結配列決定よりも少ない鋳型ＤＮＡを必要とする。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはサイクル配列決定においていくつかの利点を有し、すなわちそれらは核酸標的物へのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションのために必要とされるきびしいアニーリング温度に対して耐性があり、そして個々のサイクルにおいて生じる高い温度変性、すなわち９０〜９５℃の複数のサイクルに対して耐性がある。この理由のために、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、及びその誘導体及び由来物が、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴの会社により市販されているＴａｑサイクル配列決定キットに包含されて来た。
【００８２】
鎖終結配列決定法の２つの変法、すなわち色素−プライマー配列決定法及び色素−ターミネーター配列決定法が存在する。色素−プライマー配列決定法においては、ｄｄＮＴＰターミネーターはラベルされず、そしてラベルされたプライマーが延長生成物を検出するために使用される（Smith など., 1986, Nature 32：674-679 ）。色素−ターミネーターＤＮＡ配列決定法においては、ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡプライマーの末端上にｄＮＴＰ及び螢光ラベルされたｄｄＮＴＰを組込むために使用される（Ｌｅｅなど．，前記）。この方法は、色素ラベルされたプライマーを合成すべきでない利点を付与する。さらに、色素−ターミネーター反応は、すべての４種の反応が同じ管において実施され得ることにおいてより便利である。
【００８３】
色素−プライマー及び色素−ターミネーターの両方法は、Applied Biosystems, Foster City, CA により製造される自動配列決定装置を用いて自動化され得る（アメリカ特許第５，１７１，５３４号；引用により本明細書に組込まれる）。前記装置を用いる場合、完結された配列決定反応混合物が、前記装置に固定される変性ポリアクリルアミドゲル上で分別される。装置の底でのレーザーが、螢光生成物がゲルを通して大きさに従って電気泳動される場合、その生成物を検出する。
【００８４】
２種のタイプの螢光色素、すなわち負に荷電された及び両性の螢光色素が、色素−ターミネーター配列決定のために使用されるターミネーターをラベルするために通常使用される。負に荷電された螢光色素は、フルオレセイン及びＢＯＤＩＰＹ種類の色素を包含する。ＢＯＤＩＰＹ色素（４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン）が、国際特許公開番号９７／００９６７（引用により本明細書に組込まれる）に記載されている。両性螢光色素は、ローダミン類の色素を包含する。
【００８５】
市販のサイクル配列決定キットは、ローダミン誘導体によりラベルされたターミネーターを使用する。しかしながら、ローダミン−ラベルされたターミネーターはかなり高価であり、そしてその生成物は、配列決定生成物と共に同時移動するので、ゲル上に負荷する前、組込まれていない色素−ｄｄＮＴＰから分離されるべきである。ローダミン類の色素は、生成物の異常な移動を引き起こす、ＧＣに富んでいる領域におけるヘアピン構造体を安定化するように見える。これは、その二次構造体をゆるめるｄＩＴＰの使用を必要とし、また、ターミネーターの組込みの効率にも影響を及ぼす。
【００８６】
対照的に、フルオレセインによりラベルされたターミネーターは、それらが高い負の電荷を有し、そして配列決定生成物よりも早く移動するので、ゲル負荷の前の分離段階を排除する。さらに、フルオレセインによりラベルされた配列決定生成物は、ローダミンによりラベルされた配列決定生成物よりも良好な電気泳動移動性を有する。野生型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはフルオレセイン類の色素によりラベルされたターミネーターを効果的に組込まないけれども、それは本明細書に供給される修飾された酵素の使用により現在、効果的に達成され得る。
従って、本発明の範囲は、必須のモチーフを有する酵素を用いてのジデオキシ配列決定のための新規方法、及び前記方法を実施するためのキットを包含する。
【００８７】
１つの態様において、本発明の配列決定方法は、
ａ）組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用意し、ここで前記酵素は、
ｉ）その生来の形において、前記ポリメラーゼは、アミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここでＸは任意のアミノ酸である）を含んで成り、
ii）前記配列中の位置４のＸが、前記生来の配列に比較して変異誘発されており、但しＸはＥに変異誘発されておらず；そして
iii ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、前記酵素の生来の形に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対する低められた識別性を有することにより特徴づけられ；そして
ｂ）色素−ターミネーター配列決定反応を実施することも含んで成る。
【００８８】
上記方法の好ましい態様においては、前記生来の形の酵素は、アミノ酸配列：ＬＳ（Ｑ／Ｇ）ＸＬ（Ｓ／Ａ）ＩＰＹＥＥ（配列番号２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸配列である）を有する。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列番号２）（ここで、位置３の“Ｘａａ”はＧｌｎ又はＧｌｙであり、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、そして位置６の“Ｘａａ”はＳｅｒ又はＡｌａである）として表わされる。
【００８９】
より好ましい態様においては、その生来形のアミノ酸配列は、ＬＳＱＸＬＡＩＰＹＥＥ（配列番号３）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸配列である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＧｌｎＸａａＬｅｕＡｌａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列番号３）（ここで、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸である）として表わされる。最とも好ましい態様においては、位置４の“Ｘａａ”はＬｙｓである。
【００９０】
上記のように、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ配列決定は、鎖−ターミネーターとして作用する異例な塩基類似体、及び従来のヌクレオチドを、数百の塩基の距離にわたってすべての可能なフラグメントの長さを表わす、延長生成物の集団が生成されることを保証する濃度の特定の割合で含む混合物を必要とする。配列決定のためにこれまで使用されて来たいくつかの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、たとえば野生型Ｔａｑポリメラーゼは、それらが従来のヌクレオチド及び異例なヌクレオチドの混合物の存在下で従来のヌクレオチドを選択的に組込むことにより特徴づけられる。しかしながら、最近記載されるいくつかの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、従来の塩基に対する異例な塩基類似体の割合を、百倍〜数百倍又は数千倍まで低めることを可能にする。
【００９１】
１つのそのようなポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＦ６６７Ｙ変異体である。もう１つのそのような変異体は、Ｆ６６７Ｙ変異、及び位置４６においてグリシン残基をアスパラギン酸残基に変更する変異（Ｇ４６Ｄ）を有するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼである。Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ，ＦＳとして知られているこの変異体ポリメラーゼは、Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅにより製造され、そしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒにより市販されている。Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼは、もう１つのそのようなポリメラーゼである。
【００９２】
この変異体ポリメラーゼは、１）Ｇ４６Ｄ変異をコードするよう修飾されたＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのヌクレオチド１−５７０、及び２）位置３２３でアスパラギン酸からアラニンへの変異、位置３２５でグルタミン酸からアラニンへの変異、及び位置７３０でフェニルアラニンからチロシンへの変異をコードするよう修飾されたＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼのヌクレオチド５７１−２６７９の組合せである（アメリカ特許出願番号６０／０５２０６５及びヨーロッパ特許出願第９８１１２３２７．６号；両者とも引用により本明細書に組込まれる）。
【００９３】
異例な塩基類似体を組込むもう１つのポリメラーゼは、サーモトガ・ネアポリタナからのＦ７３０Ｙ変異体ＤＮＡポリメラーゼである（国際特許出願番号ＷＯ９６／１０６４０，ＷＯ９６／４１０１４及びＷＯ９７／０９４５１；それらは引用により本明細書に組込まれる）。一定のｄＮＴＰ濃度に関して、それらの酵素を使用する場合、ローダミン−ｄｄＮＴＰ濃度は、これまで利用できる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに比較して、約５０倍〜数百倍、低められ得る。
【００９４】
本発明のＥ６８１Ｋ変異が、例４に記載される配列決定反応に使用される二重変異体Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素を生成するために、Ｆ６６７Ｙ変異と共に、組換えＤＮＡ方法を用いて組合された。その二重変異体は、フルオレセインによりラベルされた色素ターミネーターとの色素−ターミネーター配列決定反応に使用された。例４に記載される結果は、前記酵素が、配列決定反応においてフルオレセインによりラベルされた色素ターミネーターを組込むことができ、そして自動化された配列決定装置において正確に読取られ得る配列決定ラダーを生成することを示す。意外なことには、Ｅ６８１Ｋ及びＦ６６７Ｙ変異の組合せはまた、例３に記載されるアッセイにより測定される場合、Ｆ６６７Ｙ変異のみを有する酵素に比較して、３〜４倍早められた延長速度で熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を生成することが見出された。
【００９５】
従って、本発明のもう１つの観点においては、本発明において同定される必須のモチーフは、ラベルされた及びラベルされていないｄｄＮＴＰの両者の組込みの高められた効率を有するポリメラーゼを生成するために、ｄｄＮＴＰに対する低められた識別性を付与するモチーフと組み合わされ得る。それらのポリメラーゼは、ＤＮＡ配列決定法において有用である。本発明の１つの態様においては、本明細書において定義される必須のモチーフを有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはまた、アメリカ出願番号０８／４４８，２２３に記載される、Ｆ６６７Ｙ変異を含む必須のモチーフを含んで成る。
【００９６】
この態様においては、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、
ｉ）その生来の形において、前記ポリメラーゼは、第１のアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；
ii）前記第１のアミノ酸配列における位置４のＸが前記生来の配列に比較して変異誘発されており、但し、ＸはＥに変異誘発されておらず；
iii ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、前記酵素の生来の形に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対する低められた識別性を有し；
iv）前記ポリメラーゼが第２のアミノ酸配列：ＭＲＲＸＸＫＸＸＮＹＸＸＸＹＧ（配列番号１２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；そして
ｖ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがまた、前記酵素の生来の形に比較して、異例なヌクレオチドの組込みに対する低められた識別性を有することにより特徴づけられる。
【００９７】
３文字コードにおいては、前記第２のアミノ酸配列は、ＭｅｔＡｒｇＡｒｇＸａａＸａａＬｙｓＸａａＸａａＡｓｎＴｙｒＸａａＸａａＸａａＴｙｒＧｌｙ（配列番号１２）（ここで、位置４，５，７，８，１１，１２及び１３の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸である）により表わされる。好ましい態様においては、前記第１のアミノ酸配列における位置４の“Ｘａａ”は、Ｌｙｓに変異誘発されている。より好ましい態様においては、前記酵素はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼであり、そしてそれはＥ６８１Ｋ及びＦ６６７Ｙ変異を含んで成る。上記ポリメラーゼを用いての配列決定の方法もまた、本発明の範囲内である。
【００９８】
変異により誘導されないが、しかし天然の変異体として存在する必須のモチーフを有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いて実施される本発明の改良された配列決定法もまた、本発明の範囲内である。この観点においては、好熱性細菌種のＤＮＡポリメラーゼが、位置４での残基がＧｌｕではない必須のモチーフを有する。たとえば、サーモトガ・ネアポリタナからの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにおいては、前記モチーフＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）における位置４のＸは、アルギニン残基である。
【００９９】
従って、本発明は、アミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成る生来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いてのＤＮＡ配列決定の改良された方法を提供する。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＸａａＰｒｏＸａａＸａａＧｌｕ（配列番号７）（ここで、位置３，６，９及び１０の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、位置４の“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸であり、そして位置７の“Ｘａａ”はＶａｌ又はＩｌｅである）として表わされる。
【０１００】
この態様においては、本発明の配列決定方法は、
ａ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用意し、ここで前記ポリメラーゼが、
ｉ）前記ポリメラーゼは、アミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４のＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成り；そして
ii）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがフルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性をすることにより特徴づけられ；
ｂ）フルオレセイン類の色素によりラベルされた色素−ターミネーターを用意し；そして
ｃ）色素−ターミネーター配列決定反応を実施することを含んで成る。
【０１０１】
より好ましい態様においては、本発明の配列決定法は、
ａ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用意し、ここで前記ポリメラーゼは、
ｉ）前記ポリメラーゼが、第１のアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４のＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成り；
ii）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがフルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有し；
iii ）前記ポリメラーゼが第２のアミノ酸配列：ＭＲＲＸＸＫＸＸＮＹＸＸＸＹＧ（配列番号１２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；
iv）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが異例なヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有することにより特徴づけられ；
ｂ）フルオレセイン類の色素によりラベルされた色素−ターミネーターを用意し；そして
ｃ）色素−ターミネーター反応を実施することを含んで成る。
【０１０２】
もう１つの好ましい態様においては、前記酵素は、アミノ酸配列：ＬＳ（Ｑ／Ｇ）ＸＬ（Ｓ／Ａ）ＩＰＹＥＥ（配列番号１３）（ここで、位置４のＸはＥを除く任意のアミノ酸配列である）を含んで成る。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列番号１３）（ここで、位置３の“Ｘａａ”はＧｌｕ又はＧｌｙであり、位置４の“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸であり、そして位置６の“Ｘａａ”はＳｅｒ又はＡｌａである）として表わされる。より好ましい態様においては、前記アミノ酸配列は、ＬＳＱＸＬＡＩＰＹＥＥ（配列番号１４）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＧｌｎＸａａＬｅｕＡｌａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列番号１４）（ここで、位置４の“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸である）として表わされる。
【０１０３】
さらにもう１つの好ましい態様においては、前記酵素は、アミノ酸配列：ＬＳＶＸＬＧ（Ｖ／Ｉ）ＰＶＫＥ（配列番号１５）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を有する。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＸａａＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号１５）（ここで、位置４の“Ｘａａ”は、Ｇｌｕを除く任意のアミノ酸であり、そして位置７の“Ｘａａ”はＶａｌ又はＩｌｅである）として表わされる。より好ましい態様においては、前記アミノ酸配列は、ＬＳＶＸＬＧＶＰＶＫＥ（配列番号１６）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）である。
【０１０４】
３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＶａｌＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号１６）（ここで、位置４での“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸である）として表わされる。最とも好ましい態様においては、位置４の“Ｘａａ”はＡｒｇである。もう１つのより好ましい態様においては、前記アミノ酸配列は、ＬＳＶＸＬＧＩＰＶＫＥ（配列番号１７）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＩｌｅＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号１７）（ここで、位置４での“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸である）として表わされる。最とも好ましい態様においては、位置４の“Ｘａａ”はＡｒｇである。
【０１０５】
本発明のもう１つの態様においては、配列決定方法は、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドに対して低められたレベルの識別性を有する生来の酵素を用いて実施され、ここで前記レベルは、例２に記載されるようなｄｄＮＴＰ組込みアッセイを用いて測定される。ＤＮＡ合成の５０％阻害のために必要とされるｄｄＣＴＰの濃度が、５０％阻害のために必要とされるＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの濃度と共に決定される。ｄｄＣＴＰのための濃度に対するＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰのための濃度の比が計算される。好ましい態様において、その比は１０又はそれ以下である。より好ましい態様において、その比は４又はそれ以下である。最とも好ましい態様において、その比は１，２又はそれ以下である。
【０１０６】
本明細書に供給される例はフルオレセイン類の色素によりラベルされたジデオキシヌクレオチドを使用するけれども、他の異例なヌクレオチド及び螢光色素の使用もまた、本発明の範囲内である。他の異例なヌクレオチドは、ＤＮＡ合成の生成物をラベルするために使用され得る螢光ラベルされたｄＮＴＰ、及びプライマー延長生成物をラベルするために使用され得る螢光ラベルされたｒＮＴＰを包含する。他の色素は、他の負に荷電された螢光色素、たとえばフルオレセインに構造的及び化学的に類似するＢＯＤＩＰＹを包含する。他の色素はまた、シアニン色素を包含する。
【０１０７】
シアニンによりラベルされたｄＮＴＰは、Ｅ６８１Ｋ変異（及びＧ４６Ｄ変異）を有するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを包含する標準のＰＣＲ反応に添加された。そのシアニンによりラベルされたｄＮＴＰは、野生型酵素のためよりも高いレベルで増幅生成物中に組込まれることが思いがけなく見出された。従って、この観点においては、本発明のＤＮＡラベリング方法は、本発明の生来の又は変異体のポリメラーゼ、及び負に荷電された螢光色素又はシアニン色素のいづれかによりラベルされたヌクレオチドを使用する。
【０１０８】
１つの態様においては、本発明のＤＮＡラベリング方法は；
ａ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用意し、ここで前記ポリメラーゼは、
ｉ）前記ポリメラーゼがアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４でのＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成り；そして
ii）前記ポリメラーゼが異例なヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有することにより特徴づけられ；
ｂ）負に荷電された螢光色素によりラベルされたヌクレオチドを用意し；そして
ｃ）ＤＮＡ合成反応を実施することを含んで成る。
【０１０９】
もう１つの態様においては、本発明のＤＮＡラベリング方法は、
ａ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用意し、ここで前記ポリメラーゼは、
ｉ）前記ポリメラーゼがアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４でのＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成り；そして
ii）前記ポリメラーゼが異例なヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有することにより特徴づけられ；
ｂ）シアニン色素によりラベルされたヌクレオチドを用意し；そして
ｃ）ＤＮＡ合成反応を実施することを含んで成る。
【０１１０】
本発明のもう１つの観点においては、ｒＮＴＰのより効果的な組込みを可能にする変異、たとえばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの位置６１５でのグルタミン酸からグリシンへの変異、及び本発明の必須のモチーフを組合す熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが供給される。その得られる酵素は、フルオレセイン類の色素によりラベルされたリボヌクレオチドの組込みの高められた効率を有することが予測される。
【０１１１】
従って、１つの態様においては、本発明は、（１）その生来の形において、アミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；（２）位置４のＸが、その位置４のＸがＥに変異誘発されないように変異誘発されており；（３）また、アミノ酸配列：ＳＱＩＸＬＲ（Ｖ／Ｉ）（配列番号１８）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）である決定的領域を含んで成り；そして（４）フルオレセイン類の色素によりラベルされたリボヌクレオチドを効果的に組込むことができる組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。３文字コードにおいては、後者の配列は、ＳｅｒＧｌｎＩｌｅＸａａＬｅｕＡｒｇＸａａ（ここで、位置４での“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸であり、そして位置７の“Ｘａａ”はＶａｌ又はＩｌｅである）として表わされる。
【０１１２】
変異体ポリメラーゼドメイン、たとえばＥ６１５Ｇ及びＥ６８１Ｋ変異を含むＴａｑのためのドメインは、フルオレセイン類の色素によりラベルされたプライマー延長生成物を生成する改良された方法において有用である。たとえば、プライマー延長反応、たとえばＰＣＲにおいては、フルオレセイン類の色素によりラベルされたｒＮＴＰが、４種の標準のｄＮＴＰの１つにより少なくとも部分的に置換され、そして二重変異体ポリメラーゼ、たとえばＥ６８１Ｋ Ｅ６１５Ｇ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
【０１１３】
その変異体ポリメラーゼは、それらの長さにそって種々の位置で、フルオレセインによりラベルされたリボヌクレオチド残基を有するプライマー延長生成物を合成する。熱又はアルカリ処理に基づいて、そのプライマー延長生成物は、個々のリボヌクレオチド残基でフラグメント化され、末端をラベルされたフラグメントの集団が生成される。均等にラベルされたフラグメントのこの集団は、プライマー延長生成物の長さを通して螢光ラベルの分布を表わす。それらの特徴を有するラベルされたフラグメントは、珪素チップ、たとえばＣｒｏｎｉｎなど．，前記のチップに基づく核酸検出型において有用である。
【０１１４】
従って、１つの態様においては、本発明は、（１）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを供給し、ここで前記ポリメラーゼは、（ａ）その生来の形において、アミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；（ｂ）前記位置４のＸが、その位置４でのＸがＥに変異誘発されないように変異誘発されており；（ｃ）また、アミノ酸配列：ＳＱＩＸＬＲ（Ｖ／Ｉ）（配列番号１８）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）である決定的領域を含んで成り；そして（ｄ）フルオレセイン及び／又はシアニン種類の色素によりラベルされたリボヌクレオチドを効果的に組込むことができることにより特徴づけられ；そして（２）プライマー延長反応を実施することを含んで成る、プライマー延長生成物をラベリングするための方法を提供する。
【０１１５】
さらにもう１つの観点においては、本発明の必須のモチーフを有する酵素は、Ｅ６８１Ｋ Ｆ６６７Ｙ変異体について例４に示されるように野生型酵素に比較して早められた延長速度を示す。１つの態様においては、前記酵素は、（１）その生来の形において、それはアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；（２）前記アミノ酸配列が、位置４のＸがＥに変異誘発されないように位置４で変異誘発されており；そして（３）それが、野生型酵素に比較して早められた延長速度を有することによって特徴づけられる。
【０１１６】
好ましい態様においては、前記酵素は、（１）その生来の形において、それはアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；（２）前記アミノ酸配列が、位置４でのＸがＥに変異誘発されないように位置４で変異誘発されており；（３）それがまた、アミノ酸配列：ＭＲＲＸＸＫＸＸＮＹＸＸＸＹＧ（配列番号１２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；そして（４）早められた延長速度を有することによって特徴づけられる。
【０１１７】
より好ましい態様において、前記酵素は、（１）その生来の形において、それがアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含み；そして（２）前記アミノ酸配列が、位置４でのＸがＫに変異誘発されないように位置４で突然誘発されていることによって特徴づけられる。最とも好ましい態様においては、前記酵素は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼであり、そしてＥ６８１Ｋ変異及びＦ６６７Ｙ変異を含む。また、早められた延長速度を有するポリメラーゼを用いてのＤＮＡの配列決定及びラベリングの方法、及び前記方法を行なうためのキットは、本発明の範囲内である。
【０１１８】
本発明の好ましいＤＮＡ配列決定方法においては、熱安定性ピロホスファターゼが反応混合物に含まれる。ピロホスファターゼは、ヨーロッパ特許出願番号ＥＰ−Ａ−７６３５９９及びアメリカ特許第５，６６５，５５１号に記載される中温性及び変異体の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、配列決定データを増強することが知られている。
【０１１９】
典型的な態様においては、本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはまた、このヌクレアーゼ活性を非常に弱くするよう作用する、５′−ヌクレアーゼドメインにおける変異を含む。Ｔａｑポリメラーゼの修飾された形が、１９９２年４月１６日に公開されたＰＣＴ特許公開番号ＷＯ９２／０６２００、及びアメリカ特許第５，４６６，５９１号に記載されている。本発明の１つの態様においては、アミノ酸位置４６でのグリシン残基のためのコドンが、アスパラギン酸のためのコドンにより置換された（Ｇ４６Ｄ変異）。その得られる酵素は、低められた５′−ヌクレアーゼ活性のためにサイクル配列決定反応において高められた利用性を有する。ポリメラーゼドメインアミノ酸配列、及びポリメラーゼ活性は、野生型酵素に比較して、Ｇ４６Ｄ変異体においては、両者とも変更されていない。
【０１２０】
本発明の商業的態様においては、本発明の使用により改良される方法を実施するためのキットが、本発明のさらなる観点であると思われる。ＤＮＡ配列決定のための１つのそのようなキットは、
ａ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ここで前記ポリメラーゼは、
ｉ）前記ポリメラーゼがアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４のＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成り；そして
ii）前記ポリメラーゼがフルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有することによって特徴づけられ；及び
ｂ）負に荷電された螢光色素によりラベルされた色素−ターミネーターを含んで成り、そしてさらに、ＤＮＡ配列決定のための他の試薬、たとえばｄＮＴＰ、熱安定性ピロホスファターゼ及び適切な緩衝液を含むことができる。
【０１２１】
もう１つの態様においては、キットにおける酵素は、アミノ酸配列：ＬＳＶＸＬＧ（Ｖ／Ｉ）ＰＶＫＥ（配列番号１５）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を有する。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＸａａＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号１５）（ここで、位置４の“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸であり、そして位置７の“Ｘａａ”はＶａｌ又はＩｌｅである）として表わされる。
【０１２２】
好ましい態様においては、前記アミノ酸配列は、ＬＳＶＸＬＧＶＰＶＫＥ（配列番号１６）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＶａｌＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号１６）（ここで、位置４の“Ｘａａ”はＥを除く任意のアミノ酸である）として表わされる。
【０１２３】
より好ましい態様においては、位置４の前記“Ｘａａ”はＡｒｇである。もう１つの好ましい態様においては、前記アミノ酸配列は、ＬＳＶＸＬＧＩＰＶＫＥ（配列番号１７）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＶａｌＸａａＬｅｕＧｌｙＩｌｅＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｕ（配列番号１７）（ここで、位置４での“Ｘａａ”はＧｌｕを除く任意のアミノ酸である）として表わされる。より好ましい態様においては、位置４での前記“Ｘａａ”はＡｒｇである。
【０１２４】
ＤＮＡ配列決定のための他のキットは、変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んで成り、ここで前記ポリメラーゼは、
ａ）その生来の形において、前記ポリメラーゼがアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；
ｂ）前記アミノ酸が位置４で変異誘発されており、但し、位置４でのＸがＥに変異誘発されておらず；そして
ｃ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、前記酵素の生来の形に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有することによって特徴づけられ、そしてさらに、ＤＮＡ配列決定のための試薬、たとえば鎖終結化合物、ｄＮＴＰ、熱安定性ピロホスファターゼ及び適切な緩衝液を含むことができる。
【０１２５】
ターミネーターがラベルされる場合、好ましいラベルは螢光色素であり、より好ましくは、ラベルは負に荷電された螢光色素又はシアニン色素であり、そして最とも好ましくは、ラベルはフルオレセイン類の色素である。好ましい態様において、前記キット中の酵素は、アミノ酸配列：ＬＳ（Ｑ／Ｇ）ＸＬ（Ｓ／Ａ）ＩＰＹＥＥ（配列番号２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を有する。
【０１２６】
３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＸａａＸａａＬｅｕＸａａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列番号２）（ここで、位置３の“Ｘａａ”はＧｌｎ又はＧｌｙであり、位置４の“Ｘａａ”は任意のアミノ酸であり、そして位置６の“Ｘａａ”はＳｅｒ又はＡｌａである）として表わされる。より好ましい態様においては、前記アミノ酸配列は、ＬＳＱＸＬＡＩＰＹＥＥ（配列番号３）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）である。３文字コードにおいては、このアミノ酸配列は、ＬｅｕＳｅｒＧｌｎＸａａＬｅｕＡｌａＩｌｅＰｒｏＴｙｒＧｌｕＧｌｕ（配列番号３）（ここで、位置４での“Ｘａａ”は任意のアミノ酸である）として表わされる。最とも好ましい態様においては、位置４での前記“Ｘａａ”は、Ｌｙｓである。
【０１２７】
ＤＮＡをラベリングするためのキットは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んで成り、ここで前記ポリメラーゼは、（ａ）その生来の形において、前記ポリメラーゼがアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；（ｂ）前記配列中の位置４のＸが前記生来の形に比較して変異誘発されており、但し位置４でのＸはＥには変異誘発されておらず；そして（ｃ）前記酵素が、その対応する野生型に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有することによって特徴づけられ、そしてさらに、ｄＮＴＰ及び適切な緩衝液を含むことができる。
【０１２８】
好ましい態様においては、位置４のＸはＫに変異誘発されている。ラベルされたＤＮＡを生成するための他のキットは、ａ）負に荷電された螢光化合物によりラベルされたヌクレオチド又はヌクレオチド類似体、及びｂ）次の必須のモチーフ：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４でのＸは、Ｅを除く任意のアミノ酸である）を有する生来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（前記ポリメラーゼは、フルオレセインによりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有する）を含んで成り、そしてさらに、ｄＮＴＰ及び適切な緩衝液を含むことができる。好ましい態様においては、位置４でのＸはＫである。もう１つの好ましい態様においては、位置４でのＸはＲである。
【０１２９】
プライマー延長生成物をラベリングするためのキットは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んで成り、ここで前記ポリメラーゼは、（ａ）その生来の形において、前記ポリメラーゼがアミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成り；（ｂ）前記配列中の位置４でのＸが前記生来の配列に比較して変異誘発されており、但し位置４でのＸはＥに変異誘発されておらず；（ｃ）前記ポリメラーゼがまた、第２のアミノ酸配列：ＳＱＩＸＬＲ（Ｖ／Ｉ）（配列番号１８）（ここで、ＸはＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成り；そして（ｄ）前記酵素がその対応する野生型酵素に比較して、フルオレセイン類の色素によりラベルされたリボヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有することによって特徴づけられ、そしてさらに、負に荷電された螢光化合物又はシアニン化合物によりラベルされたリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド類似体、ｄＮＴＰ、及び適切な緩衝液を含むことができる。
【０１３０】
好ましい態様においては、ポリメラーゼはＥ６８１Ｋ及びＥ６１５Ｇ変異を含む。ラベルされたプライマー延長生成物を生成するための他のキットは、ａ）負に荷電された螢光化合物又はシアニン化合物によりラベルされたリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド類似体；及びｂ）生来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んで成り、ここで前記ポリメラーゼは、それが（ｉ）アミノ酸配列：ＬＳＸＸＬＸ（Ｖ／Ｉ）ＰＸＸＥ（配列番号７）（ここで、位置４でのＸはＥを除く任意のアミノ酸である）である必須のモチーフを含んで成り；（ii）第２アミノ酸配列：ＳＱＩＸＬＲ（Ｖ／Ｉ）（ここで、ＸがＥを除く任意のアミノ酸である）を含んで成り；そして（iii ）フルオレセインによりラベルされたリボヌクレオチドの組込みに対して低められた識別性を有することによって特徴づけられ、そしてさらに、ｄＮＴＰ及び適切な緩衝液を含むことができる。
【０１３１】
好ましい態様においては、第１のアミノ酸配列における位置４でのＸはＫであり、そして第２のアミノ酸配列において、ＸはＧである。もう１つの好ましい態様においては、第１のアミノ酸配列における位置４でのＸはＲであり、そして第２のアミノ酸におけるＸはＧである。
【０１３２】
【実施例】
次の例は単に例示目的であって、本発明の範囲を限定するものではない。
例１．フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドに対して低められた識別性を有する修飾されたＴａｑポリメラーゼ遺伝子の発現
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＣ−末端アミノ酸部分は、ポリメラーゼ活性部位ドメインをコードする（Lawyerなど., 1993, PCR Methods and Applications ２：275-287 ；Freemontなど., 1986, Proteins. Stracturo. Function. and Genetics １：66-73 ；それらは引用により本明細書に組込まれる）。
【０１３３】
この領域を含むＤＮＡフラグメントを、完全な長さのＴａｑ２遺伝子から単離し、そしてマンガンの存在下でＰＣＲ増幅により変異誘発した（Leung など., 1989, Technique １ (1)：11-15 ）。この例のために、すべての制限酵素は、New England Biolabs, Beverly, MAから入手された。変異誘発されたフラグメントをＰｓｔＩ及びＢｇｌIIにより消化し、そしてＰｓｔＩ及びＢｇｌIIによりすでに消化されているＴａｑ発現プラスミドｐＬＫ１０２中にクローン化した。
【０１３４】
プラスミドｐＬＫ１０２は、９００bpのＰｓｔＩ−ＢｇｌIIフラグメントが短いＰｓｔＩ−ＢｇｌIIリンカーにより置換されているｐＬＫ１０１の誘導体である。プラスミドｐＬＫ１０１は、ポリメラーゼコード領域の３′側に位置する小さなＨｉｎｃII／ＥｃｏＲＶフラグメントが欠失されている、ｐＳＹＣ１５７８（Ｌａｗｙｅｒなど．，１９９３、前記、及びアメリカ特許第５，０７９，３５２号）の修飾された形である。
【０１３５】
得られる発現プラスミドを用いて、Ｅ．コリ株Ｎ１６２４（Ｅ．コリ Genetic Stock Center at Yale University、株番号ＣＧＳＣ＃５０６６から入手できる）を形質転換し、そして得られる形質転換体を、野生型酵素に比較して、〔α−32Ｐ〕Ｔｅｔ−ｄＣＴＰをより効果的に組込む能力についてスクリーンした。この方法を用いて、〔α−32Ｐ〕Ｔｅｔ−ｄＣＴＰをより効果的に組込む能力を有する変異体ＣＳ１を同定した。
【０１３６】
変異体ＣＳ１の変異誘発されたＴａｑ発現プラスミドをＨｉｎｄIII ／ＮｈｅＩにより消化し、そして得られる制限フラグメントを、ｐＬＫ１０１の野生型遺伝子中にサブクローン化し、変異誘発されていないＨｉｎｄIII ／ＮｈｅＩフラグメントを置換し、変異誘発されたＴａｑポリメラーゼ遺伝子の一部が変更された表現型を担当するかどうかについて決定した。ＨｉｎｄIII ／ＮｈｅＩ制限フラグメントを含むサブクローンは、野生型酵素に対して変更された表現型を付与し、これは、変異がこのフラグメント内に存在することを示す。続くサブクローン分析は、前記変異が２６５bpのＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩフラグメントに位置することを決定した。
【０１３７】
２６５bpのＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントのＤＮＡ配列分析を、Applied Biosystems, Foster City, CA からの Taq FS DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit、及びApplied Biosystems Model Prism 377 DNA Sequencing Systemを用いて、ｐＣＳ１に対して実施した。その配列分析は、グルタミン酸（Ｅ）残基のリシン（Ｋ）残基による置換を引き起こす、アミノ酸位置６８１でのＴａｑポリメラーゼ遺伝子におけるミスセンス変異を同定した。番号付けは、アメリカ特許第５，０７９，３５２号（引用により本明細書に組込まれる）におけるように、成熟タンパク質の最初のメチオニン残基をコードするコドンで開始される。この変異Ｅ６８１Ｋは特に、コドン配列におけるＧＡＧからのＡＡＧへの変更により引き起こされる。プラスミドｐＣＳ１は、１９９７年８月２８日にＡＴＣＣに寄託され、そして受託番号９８５２１を得た。
【０１３８】
プラスミドｐＣＳ１は、Ｔａｑポリメラーゼのためのコード配列に追加の変異を含むことができ；しかしながら、さらなるサブクローニング実験により、Ｅ６８１Ｋ変異が、フルオレセイン色素によりラベルされたヌクレオシド三リン酸の組込みにおいて高められた効率を単独で担当することが決定された。この点変異は、図１に示される２６５塩基対のＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ ＤＮＡフラグメントに位置する。前記２６５bpのＤＮＡフラグメント内でのＥ６８１Ｋ変異は、野生型Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子配列からの単なる変更である。
【０１３９】
ヌクレオチド類似体の組込みの効率のさらなる分析及び定量化のために、プラスミドｐＣＳ１の２６５bpのＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩフラグメントを、ポリメラーゼドメイン内に野生型配列を含むＴａｑ発現ベクター、ｐＲＤＡ３−２中にクローン化した。クローン３−２として言及されるプラスミドｐＲＤＡ３−２は、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ９２／０６２００（引用により本明細書に組込まれる）に十分に記載されている。Ｅ６８１Ｋ及びＦ６６７Ｙ変異の両者をコードする第２のクローンを、プライマー指図された変異誘発及びプラスミドｐＲＤＡ３−２のＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ部位中への両変異を含むＰＣＲ生成物の続くクローニングにより創造した。
【０１４０】
発現ベクターｐＲＤＡ３−２は、ファージλＰL プロモーターに操作可能的に連結される完全な長さのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む。ベクターｐＲＤＡ３−２においては、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の５′−ヌクレアーゼドメインは、５′−ヌクレアーゼ活性を低める、位置４６でグリシンをコードするコドンでの点変異（Ｇ４６Ｄ変異）を含む。しかしながら、発現ベクターｐＲＤＡ３−２のポリメラーゼドメイン内の遺伝子配列は、野生型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子配列と同一である。
【０１４１】
プラスミドｐＲＤＡ３−２，ｐＣＳ１及びＥ６８１Ｋ Ｆ６６７Ｙ ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩ及びＮｈｅＩにより消化し、そしてプラスミドｐＣＳ１からの２６５bpのＤＮＡフラグメント又はＰＣＲ生成物を、従来の手段によりベクターｐＲＤＡ３−２中に連結した。それぞれ、得られるプラスミドｐＬＫ１１２及びｐＬＫ１１３を用いて、Ｅ．コリ株ＤＧ１１６（ＡＴＣＣ番号５３６０６）を形質転換した。それらのプラスミドは、それぞれ、Ｇ４６Ｄ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ及びＧ４６Ｄ Ｅ６８１Ｋ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑとして本明細書において言及される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする。その発現された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼタンパク質Ｇ４６Ｄ Ｅ６８１Ｋ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑを、Ｌａｗｙｅｒなど．，１９９３、前記により記載される方法に従って精製した。
【０１４２】
Ｇ４６Ｄ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ酵素を、次のようにして、類似するが、しかしより小さな規模の調製方法を用いて精製した：すべての段階は、特にことわらない限り４℃で行なわれた。４７５mlの培養物からの細胞を、３０mlの緩衝液（５０mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１０mMのＥＤＴＡ、pH８．０、０．５mMのＰｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ、０．５μｇ／mlのロイペプチン、０．１mMのＮα−ｐ−トシル−Ｌ−リシンクロロメチルケトン、１mMのＤＴＴ）に再懸濁した。細胞を、１分間、５に設定した５０％能力サイクルで音波処理し、そして氷上で１分間、冷却した。この段階をさらに２回くり返した。
【０１４３】
次に、４．０Ｍの硫酸アンモニウム１．５mlを添加し、そしてその混合物を７５℃の水浴において１５分間、加熱し、次に氷上で冷却した。ポリエチレンイミンを添加し、０．６％にし、そしてその混合物を氷上で１０分間インキュベートした。その混合物を１６，０００×ｇで３０分間、遠心分離した。上清液を、５０mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１０mMのＥＤＴＡ、pH８．０、１mMのＤＴＴ、０．２Ｍの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 の溶液により平衡化された１．８ml体積のフェニル−セファロースカラム（Ｂｉｏ−ｒａｄ Ｐｏｌｙｐｒｅｐクロマトグラフィーカラム）上に負荷した。
【０１４４】
カラムを次の３種の溶液それぞれ６mlにより洗浄した：１）２５mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１mMのＥＤＴＡ、１mMのＤＴＴ、０．２Ｍの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、２）２５mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１mMのＥＤＴＡ、１mMのＤＴＴ、及び３）２５mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１mMのＥＤＴＡ、１mMのＤＴＴ、２６％のエチレングリコール。ポリメラーゼを、２５mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１mMのＥＤＴＡ、１mMのＤＴＴ、２０％のエチレングリコール、２．５Ｍの尿素の溶液６mlにより溶離した。
【０１４５】
ポリメラーゼ調製物を３ＭのＫＣｌにより１００mMに調整した後、その混合物を、２５mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１mMのＥＤＴＡ、１mMのＤＴＴ、１００mMのＫＣｌの緩衝液により平衡化されたヘパリン−セファロースカラム（１．８mlの体積のＢｉｏ−ｒａｄ Ｐｏｌｙ−ｐｒｅｐカラム）上に負荷した。同じ緩衝液により洗浄した後、サンプルを、２５mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１mMのＥＤＴＡ、１mMのＤＴＴ、４００mMのＫＣｌの緩衝液に溶出した。
【０１４６】
精製に続いて、修飾された酵素の活性を、Lawyerなど., 1989, J. Biol. Chem. 264 ：6427-6437 （引用により本明細書に組込まれる）に記載される活性アッセイにより決定した。精製された酵素の活性を、次の通りにして計算した：１単位の酵素は、３０分間合成された１０ｎモルの生成物に対応する。ＤＮＡポリメラーゼ活性は、組込まれるｄＣＭＰ ８０〜１００ｐモルまで酵素濃度に直線的に比例する（０．０２４〜０．０３単位／μｌでの希釈された酵素）。精製された酵素を、例２〜４に記載される組込み及び配列決定反応に使用した。
【０１４７】
例２．ｄｄＮＴＰの組込みの効率を比較するためのアッセイ
フルオレセイン類の色素によりラベルされたｄｄＣＴＰを組込むＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ，Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ及びＦ７３０ＹＴｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼの相対的能力を、制限鋳型、プライマー延長競争アッセイの使用により比較した。Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼは、１９９７年７月９日に出願されたアメリカ出願番号６０／０５２０６５の例Ｉ及びヨーロッパ特許出願番号９８１１２３２７．６（両者は引用により本明細書に組込まれる）に記載される。
【０１４８】
この競争アッセイにおいては、ｄｄＣＴＰの組込みは延長反応を終結せしめるので、ポリメラーゼが延長されたプライマー中にｄｄＣＴＰをより容易に組込むほど、〔α−33Ｐ〕ｄＣＴＰの組込みはより低くなる。従って、ｄｄＣＴＰ組込みの効率が高まるにつれて、ＤＮＡ合成の阻害の程度は高められる。次に、ｄｄＣＴＰの組込みの効率を、螢光ラベルされたｄｄＣＴＰの組込みの効率に比較し、一定の酵素について、螢光ラベルされたｄｄＮＴＰの組込みの効率の相対的測定を付与する。
【０１４９】
アッセイを、前に記載されるようにして行なった（Lawyerなど., 1989, J. Biol. Chem. 264 ：6427）（但し、次の変法を包含する）。アッセイ混合物は、５０mMのビシン、pH８．３、２５℃、２．５mMのＭｇＣｌ2 、１mMのβ−ヘルカプトエタノール、２０μＭの個々のｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、２０μＭのｄＣＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、及び〔α−33Ｐ〕ｄＣＴＰ（New England Nuclecu, Boston, MA ）から構成された。Ｍ１３ｍｐ１８（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）をプライマーＤＧ４８（配列番号１０）にアニーリングし、そして同等の０．０８５ｐモルのアニーリングされた鋳型を、個々の反応のためのアッセイ混合物に添加した。
【０１５０】
鋳型ＤＮＡを有するアッセイ混合物３５μｌを、３８本の０．５mlのｅｌｌｅｎｄｏｒｆ管の個々に添加した。２５mMのＣＡＰＳＯ緩衝液（pH９．６）中、Ｚｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの希釈溶液を、それぞれ１０μｌが反応管に添加される場合、Ｚｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの最終濃度が３，１，０．５，０．２５，０．１２５又は０．０６２５μＭになるよう調製した。Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのためには、それぞれ３，１，０．５，０．２５，０．１２５μＭのＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの２つの管を調製した。
【０１５１】
Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ及びＦ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼのためには、それぞれ１，０．５，０．２５，０．１２５及び０．０６２５μＭのＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの２つの管を調製した。残る８本の反応管は、２５mMのＣＡＰＳ０緩衝液（pH９．６）１０μｌを受けた。従って、３８本の管の個々は、反応混合物３５μｌ、及び２５mMのＣＡＰＳＯ緩衝液（pH９．６）１０μｌか又はＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰ希釈溶液の１つ（１０μｌ）のいづれかを含む。
【０１５２】
試験されるべき個々の酵素のために、重合を、個々のＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰ希釈溶液の１本の管において、及びＣＡＰＳＯ緩衝液のみを含む２本の管において５μｌの酵素を用いて開始した。酵素の次の濃度が使用された（個々はアッセイにおいて基質の量に対して酵素の過剰量であることが予備決定された）：例１におけるようにして調製されたＦ６６７Ｙ Ｇ４６Ｄ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ２．５単位；例１におけるようにして調製されたＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ１．２５単位；又はＦ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼ２単位。
【０１５３】
バックグラウンドのレベルのための対照として、残る負の対照を、ポリメラーゼよりもむしろ酵素希釈緩衝液により開始せしめた。すべの反応管はすぐに、短時間、かきまぜられ、そして７５℃で１０分間インキュベートされた。反応を、６０mMのＥＤＴＡ １０μｌの添加により停止し、そして０℃で貯蔵した。
【０１５４】
類似する実験において、ｄｄＣＴＰを、個々の希釈溶液１０μｌが反応管に添加される場合、その最終濃度が０．５，０．２５，０．１２５，０．０６２５又は０．０３１２Ｍになるように、２５mMのＣＡＰＳＯ緩衝液（pH９．６）に希釈した。個々の希釈溶液１０μｌを、上記のようなアッセイ混合物３５μｌを含む０．５mlのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管の個々中にピペットで入れた。アッセイ混合物３５μｌ及び２５mMのＣＡＰＳＯ緩衝液（pH９．６）１０μｌを含む４本の管をまた調製した。従って、１９本の管の個々は、アッセイ混合物３５μｌ、及び２５mMの個々のＣＡＰＳＯ（pH９．６）又はｄｄＣＴＰ希釈溶液の１つ１０μｌを含んだ。
【０１５５】
重合を、個々のｄｄＣＴＰ希釈溶液の１つの管において、及びＣＡＰＳＯ緩衝液の１つの管において、２．５単位のＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１．２５単位のＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ又は２単位のＦ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼにより開始せしめた。ＣＡＰＳＯを含む残りの管を、負の対照として、ポリメラーゼ含有緩衝液よりもむしろ酵素希釈緩衝液により開始せしめた。すべての反応はすぐにかきまぜられ、そして７５℃で１０分間インキュベートされた。反応を６０mMのＥＤＴＡ １０μｌの添加により停止し、そして０℃で貯蔵した。
【０１５６】
個々の反応に関して、６０μｌの反応物の５０μｌアリコートを、２mMのＥＤＴＡ、５０μｇ／mlの剪断されたサケ精子ＤＮＡ（キャリヤーとしての）溶液により希釈した。ＤＮＡを標準の方法を用いて、ＴＣＡにより沈殿せしめ、そしてＧＦ／Ｃフィルターディスク（Ｗｈａｔｍａｎ）上に集めた。組込まれる〔α−33Ｐ〕ｄＣＭＰの量を、個々のサンプルについて測定し、そしてｄｄＮＴＰを有さないＣＡＰＳＯサンプル（０％阻害率）に対して標準化した。５０％阻害率のために必要とされるｄｄＣＴＰ又はＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの濃度を、個々のサンプルについて計算し、そして表２に示す。
【０１５７】
特定の酵素についての合成を５０％阻害するために必要とされるＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰの量と合成を５０％阻害するために必要とされるｄｄＣＴＰの量との比較は、螢光ラベルされた類似体を組込む個々の酵素の相対的能力に影響を及ぼす。それらのデータは、Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼが試験される３種の酵素のＺｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰを最少の効率で組込むことを示す（Ｚｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰ対ｄｄＣＴＰによる５０％阻害率のための濃度の比＝２．５）。
【０１５８】
Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼよりもより効果的にこのラベルされた類似体を組込み（Ｚｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰ対ｄｄＣＴＰによる５０％阻害率のための濃度の比＝４）、そしてＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、ラベルされた及びラベルされていないｄｄＣＴＰをほぼ同等の効率で組込む（Ｚｏｗｉｅ−ｄｄＣＴＰ対ｄｄＣＴＰによる５０％阻害率のための濃度の比＝１．２）。
【０１５９】
【表２】
例３．延長速度アッセイ
Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ及びＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑの延長速度を、延長速度アッセイを用いて測定した。この実験においては、酵素は、〔α−33Ｐ〕ｄＣＴＰの存在下でＭ１３鋳型にアニーリングされるプライマーを延長するために使用された。延長反応物を変性し、そして生成物を変性アガロースゲル電気泳動により分析した。
【０１６１】
アッセイを、前に記載されるようにして行なった（Lowyerなど., 1989, J. Biol. Chem. 264 ：6427）（但し、次の変法を包含する）。アッセイ混合物は、５０mMのビシン、pH８．３、２５℃、２．５mMのＭｇＣｌ2 、１mMのβ−メルカプトエタノール、２００μＭの個々のｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、１００μＭのｄＣＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、及び〔α−33Ｐ〕ｄＣＴＰ（New England Nuclecu, Boston, MA ）から構成された。Ｍ１３ｍｐ１８（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）をプライマーＤＧ４８（配列番号１１）にアニーリングし、そして同等の０．０８５ｐモルのアニーリングされた鋳型を、個々の反応のためのアッセイ混合物に添加した。鋳型ＤＮＡを有するアッセイ混合物４５μｌを、１４本の０．５mlのｅｆｆｅｎｄｏｒｆ管の個々に添加した。個々の管を、重合反応の開始の前、７５℃で少なくとも３０秒間プレインキュベートした。
【０１６２】
重合を、５μｌのＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位）又はＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１．２５単位）を含む１４本のアッセイ管の６本において開始した。両酵素を例１におけるようにして調製し、そして使用される濃度は、アッセイにおいて基質の量に対して酵素の予定された過剰量を表わす。バックグラウンドのレベルのための対照として、残りの負の対照を、ポリメラーゼよりもむしろ酵素希釈緩衝液により開始した。
【０１６３】
すべての反応管は、すぐに短時間かきまぜられ、そして７５℃でインキュベートされた。Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む６本の管のうち２本を、３分間、他の２本を６分間、そして残りの２本を１０分間インキュベートした。同様に、Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼにより開始された管のうち２本を３０秒間、他の２本を１分間、そして残りの２本を２分間インキュベートした。対照の管は３分間インキュベートされた。反応を、６０mMのＥＤＴＡ １０μｌの添加により停止し、そして０℃で貯蔵した。
【０１６４】
個々の反応のために、６０μｌの反応物の２５μｌアリコートを、２mMのＥＤＴＡ、５０μｇ／mlの剪断されたサケ精子ＤＮＡ（キャリヤーとしての）の溶液１mlにより希釈した。ＤＮＡを標準の方法を用いて、ＴＣＡにより沈殿せしめ、そしてＧＦ／Ｃフィルターディスク（Ｗｈａｔｍａｎ）上に集めた。組込まれた〔α−33Ｐ〕ｄＣＭＰの量を、個々のサンプルについて測定した。
【０１６５】
残る３５μｌの個々の反応物を組合し、そしてサンプル７０μｌをエタノール沈殿せしめ、乾燥せしめ、そして５０mMのＮａＯＨ、１mMのＥＤＴＡ溶液に再懸濁した。同数の〔α−33Ｐ〕の数が個々から取られるように、それらのサンプルからアリコートを除去した。それらのアリコートを、０．９％のアルカリアガロースゲル上に負荷し、電気泳動し、乾燥せしめ、そしてこれまで記載されているようにしてオートラジオグラフィー処理した（Maniatisなど., 1982, Molecular Cloning ： A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY ）。制限酵素ＨｉｎｄIII （ＢＲＬ）により切断され、そして〔32Ｐ〕により５′末端をラベルされたバクテリオファージλＤＮＡを、分子量標準として使用した。
【０１６６】
個々のサンプルにおける延長生成物の塩基対の長さを、個々のサンプルの移動距離とλＤＮＡサイズ標準により移動される距離とを比較することにより決定した。個々の生成物における塩基対の数を、インキュベートされた個々の延長反応の秒数により割り算し、下記に示されるような延長速度を付与した。
【０１６７】
【表３】
それらの結果は、Ｅ６８１Ｋ変異の存在が、Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ酵素の延長速度を３〜４．３倍、早めたことを示唆する。
【０１６９】
例４．Ｇ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びフルオレセイン−ラベルされたｄｄＮＴＰによるサイクル配列決定
この例は、１μＭ又はそれ以下のｄｄＮＴＰ及び少なくとも１：１００の比のｄｄＮＴＰ：ｄＮＴＰを用いての、フルオレセイン色素によりラベルされたターミネーターサイクル配列決定への本発明の修飾されたポリメラーゼの適用を示す。フルオレセイン色素によりラベルされたジデオキシターミネーターは、Applied Biosystems PRISM Sequenase（登録商標）Terminator Sequencing Kit (Perkin-Elmer, Norwalk, (T) からの試薬であり、そしてＳｅｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡポリメラーゼ及びα−チオｄＮＴＰと共に使用するために最適化された。
【０１７０】
サイクル配列決定反応を、次の成分を含む溶液２０μｌにおいて実施した：５０mMのトリス−ＨＣｌ（pH８．８）、２．０mMのＭｇＣｌ2 、１００μＭの個々のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ（Perkin-Elmer, Norwalk, CT)、５００μＭのｄＩＴＰ（Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ ）、０．２μｇのＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ鋳型（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、０．１５μＭのＬａｃＺＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、５単位のＧ４６Ｄ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｋ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、２０単位のｒＴｔｈ熱安定性ピロホスファターゼ（ヨーロッパ特許出願、公開番号ＥＰ−Ａ−７６３５９９及びアメリカ特許第５，６６５，５５１号）、０．０５μＭのＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ａ色素ターミネーター、０．８０μＭのＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ｃ色素ターミネーター、０．０８μＭのＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ｇ色素ターミネーター、及び１．０μＭのＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ｔ色素ターミネーター。
【０１７１】
すべての４種のＳｅｑｕｅｎａｓｅ色素ターミネーターは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒから入手された。反応物を、予備加熱（７５℃）されたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９６００熱サイクラーに配置し、そして９６℃で１０分間、５０℃で５秒間、及び６０℃で４分間の２５サイクルにゆだねた。色素によりラベルされたフラグメントを、製造業者の説明書に従って、Ｃｅｎｔｒｉ−ＳｅｐTMカラム（Princeton Separation, Adelphia, NJ）により精製し、そして真空遠心分離機により乾燥せしめた。
【０１７２】
ペレットを、脱イオン化されたホルムアミド：５０mg／mlのブルーデキストラン（２５mMのＥＤＴＡ（pH８．０）中）の５：１（ｖ／ｖ）溶液６μｌに再懸濁し、そして予備電気泳動された４％ポリアクリルアミド／６Ｍ尿素ゲル上に直接的に負荷し、そして電気泳動せしめ、そして製造業者の説明書に従って、Perkin-Elmer AB1 PRISM 377 DNA Sequencer上で分析した。Perkin-Elmer AB2 PRISM 377 DNA Sequencer分析ソフトウェアによる自動化された塩基−コーリングは、４５０塩基について９８．５％以上の精度をもたらした（プライマーからの塩基＋１０〜＋４６０について６個の誤差）。
【０１７３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の図示である。例１、及び本明細書に提供されるさらなる変異体及び発現ベクターを調製するための方法の記載に関する制限部位が示される。
Claims (10)
- サーマス（Thermus）属に由来する組換え熱安定性DNAポリメラーゼであって、
ａ）その生来の形において、前記ポリメラーゼが次のアミノ酸配列：Leu Ser Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Glu（配列番号１）を含んで成り、ここで、前記配列の位置３，９及び10での“Xaa”は任意のアミノ酸残基であり、そして前記配列の位置７の“Xaa”はVal又はIleであり；
ｂ）位置４での前記“Xaa”がLys又はArgに変異誘発されており；
ｃ）位置６での前記“Xaa”がGly, Ser又はAlaであり；
ｄ）前記熱安定性DNAポリメラーゼが、G46D変異を有しており；そして
ｅ）前記熱安定性DNAポリメラーゼが、前記ポリメラーゼの生来の形に比較して低められた、フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対する識別のレベルを有することを特徴とし、ここで前記ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドであり、そして前記識別のレベルが前記ポリメラーゼの生来形の識別のレベルよりも少なくとも３倍低く、ここで前記識別のレベルが、DNA合成の50％阻害のために必要とされるフルオレセイン色素によりラベルされるジデオキシヌクレオチドの濃度を決定することによって測定される、ことを特徴とする組換え熱安定性DNAポリメラーゼ。 - その生来の形において、前記ポリメラーゼが次のアミノ酸配列：Leu Ser Xaa Xaa Leu Xaa Ile Pro Tyr Glu Glu（配列番号２）を含んで成り、ここで位置３の前記“Xaa”がGln又はGlyであり、位置４の“Xaa”がLys又はArgに変異誘発されており、そして位置６の“Xaa”がSer又はAlaである、請求項１記載の組換え熱安定性DNAポリメラーゼ。
- ａ）その生来の形において、前記ポリメラーゼが次のアミノ酸配列：
Leu Ser Val Xaa Leu Gly Xaa Pro Val Lys Glu（配列番号４）を含んで成り、ここで、位置４の“Xaa”がLys又はArgに変異誘発されており；そして
ｂ）位置７の前記“Xaa”がVal又はIleである、請求項１記載の組換え熱安定性DNAポリメラーゼ。 - 請求項１〜３のいずれか１項記載の組換え熱安定性DNAポリメラーゼをコードする核酸。
- 請求項１〜３のいずれか１項記載の組換え熱安定性DNAポリメラーゼを調製するための方法であって、
ａ）請求項１〜３のいずれか１項記載の組換え熱安定性DNAポリメラーゼをコードする核酸を含んで成る宿主細胞を、前記組換え熱安定性DNAポリメラーゼの発現を促進する条件下で培養し；そして
ｂ）前記宿主細胞又は培地から前記組換え熱安定性DNAポリメラーゼを単離する；
ことを含んで成る方法。 - DNA配列決定のための方法であって、
ａ）請求項１〜３のいずれか１項記載の組換え熱安定性DNAポリメラーゼを用意し；
ｂ）負に荷電された螢光色素によりラベルされた色素−ターミネーターを用意し；そして
ｃ）色素−ターミネーター配列決定反応を行なう；
ことを含んで成る方法。 - ラベルされたDNAを生成するための方法であって、
ａ）請求項１〜３のいずれか１項記載の組換え熱安定性DNAポリメラーゼを用意し；
ｂ）フルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドを用意し；そして
ｃ）DNA合成反応を実施する；
ことを含んで成る方法。 - ラベルされたプライマー延長生成物の生成方法であって、
ａ）請求項１〜３のいずれか１項記載の組換え熱安定性DNAポリメラーゼを用意し、ここで
ｉ）前記ポリメラーゼは、次のアミノ酸配列：Leu Ser Val Xaa Leu Gly Xaa Pro Val Lys Glu（配列番号４）を含んで成り、ここで、位置４での“Xaa”はLys又はArgに変異誘発されており、そして前記配列の位置７の“Xaa”がVal又はIleであり、
ii）前記ポリメラーゼがフルオレセイン類の色素によりラベルされたヌクレオチドの組込みに対して低められた識別レベルを有し；
ｂ）フルオレセイン類の色素によりラベルされたリボヌクレオチドを用意し；そして
ｃ）プライマー延長反応を実施する；
ことを含んで成る方法。 - 請求項１〜３のいずれか１項記載の組換え熱安定性DNAポリメラーゼ、及び負に荷電された螢光色素によりラベルされたターミネーター、を含んで成るDNA配列決定のためのキット。
- 請求項１〜３のいずれか１項記載の組換え熱安定性DNAポリメラーゼ及び負に荷電された螢光色素によりラベルされたヌクレオチド、又はフルオレセイン類の色素によりラベルされたリボヌクレオチドを含んで成る、ラベルされたDNA又はプライマー延長生成物を生成するためのキット。
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