CZ293217B6 - Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza, způsob její přípravy a kit, který ji obsahuje - Google Patents

Abstract

Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza se zvýšenou účinností pro začleňování nekonvenčních, například fluoresceinovými barvivy značených nukleotidů se může připravovat rekombinantní DNA technologií a má výrazné cenové a účinnostní přednosti pro DNA sekvencování. Modifikovaná DNA polymeráza je výhodná pro in vitro DNA syntézy, například pro DNA sekvencování, pro syntézu značené DNA a pro produkci značených primerních extenzních produktů. Polymerázový enzym je zvláště vhodný pro ukončování řetězce nukleové kyseliny sekvenčními způsoby. Nukleové kyseliny kódující rekombinantní, tepelně stálá DNA polymerázy a vektory a hostující buňky, které je obsahují. Kity obsahující rekombinantní, tepelně stálá DNA polymerázy.ŕ

Description

Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza, způsob její přípravy a kit, který ji obsahuje

Oblast techniky

Vynález se týká rekombinantní, tepelně stálé DNA polymerázy, která podporuje účinnost začleňování nukleosidtrifosfátů značených barvivém fluresceinové skupiny a způsobu její přípravy a izolace. Enzymy podle vynálezu jsou vhodné pro četné obory molekulární biologie a zvláště jsou výhodné pro sekvencování nukleové kyseliny. Vynález se také týká kitu, který rekombinantní, tepelně stálou polymerázu obsahuje.

Dosavadní stav techniky

Začleňování nukleosidtrifosfátů (dNTP) značených barvivém fluoresceinové skupiny je důležité v četných in vitro DNA syntetzních aplikacích. Například barevné terminátorové DNA sekvenční reakce vyžadují začlenění flurescentních dideoxynukleotidových analogů pro ukončení a značení. Kromě toho in vitro příprava značených produktů může zahrnovat začlenění fluorescentních nukleotidů nebo nukleotidových analogů. Například se fluorescenčně značená DNA používá při hybridizačních zkouškách za použití mikroseskupení imobilizovaných sond (Cronin a kol., Human Mutation 7, str. 244, 1996).

K zajištění věrnosti DNA replikace mají DNA polymeráz}’ velmi silný sklon pro začlenění svých normálních substrátů, označovaných zde jako konvenční deoxynukleosidové trifosfáty (dNTP) a proti začlenění nekonvenčních dNTP včetně dNTP a dNTP analogů značených fluorescentním barvivém. V buňkách tato vlastnost zeslabuje začlenění abnormálních bází, například dUTP pro rostoucí DNA řetězce. In vitro je tato charakteristika obzvláště zřejmá v přítomnosti jak konvenčních, tak nekonvenčních fluorescenčně značených nukleosidových trifosfátů, například v DNA sekvenčních reakcích za použití verzse způsobu dideoxy řetězového zakončení za použití barevných terminátorů (Lee a kol., Nuc. Acids. Res. 20, str. 2471, 1992).

Obchodně dostupné DNA cyklické sekvenční kity pro způsob barevného terminátoru používají řetězového terminátoru ddNTP značených fluorescentním barvivém rhodaminového typu. Avšak rhodaminová barviva jsou iontově obojetná a nukleosidtrifosfáty, značené těmito barvivý, migrují anomálně v elektroforetickém gelu, použitém pro oddělení produktů sekvence pro identifikaci. Tato vlastnosti rhodaminových barviv nutí modifikovat standardní sekvenční protokol, který zahrnuje použití dITP a přídavný stupeň před elektroforézou.

Na rozdíl od toho fluorescentní barviva se záporným nábojem, jako fluoresceinová barviva umožňují 1) lepší oddělování značených nukleosidtrifosfátů a značených primemích extenzních produktů a 2) lepší elektroforetickou migraci značených sekvenčních produktů než fluorescentní barviva sneutrálním nebo skladným nábojem. Proto při použití fluoresceinových barviv odpadají přídavné zpracovatelské stupně, potřebné při použití rhodaminových barviv. Avšak dostupná fluoresceinová barviva jsou ideální pro použití v současných, obchodně dostupných DNA cyklických sekvencujících formátech, jelikož se ddNTP značené těmito barvivý, nezačleňují účinně do sekvenčních produktů za použití těchto formátů. Proto je potřeba vyvinout obchodně dostupné tepelně stálé DNA polymerázy, které by se účinně začleňovaly do konvenčních a fluorescenčně značených nukleotidů. Vynález řeší tuto potřebu. Kromě toho neočekávatelnou vlastností mutantních enzymů podle vynálezu je zvýšená standardního typu. Jinou neočekávatelnou vlastností je zvýšená rovnoměrnost začlenění různých terminátorových nukleosidů v automatizované DNA sekvenční analýze.

Podstata vynálezu

Na matrici závislá rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza spočívá podle vynálezu v tom, že

a) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci LeSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu, SEQ ID NO:1, přičemž Xaa v poloze 3, 4, 6, 9 a 10 sekvence znamená jakýkoliv aminokyselinový zbytek a Xaa v poloze 7 znamená Val nebo Ile,

b) Xaa v poloze 4 je mutovaný ve srovnání s nativní sekvencí s výjimkou, že Xaa v poloze 4 není mutována na Glu a

c) tepelně stálá DNA polymeráza má rozlišovací schopnost proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovým barvivém, která je snížena ve srovnání s nativní formou této polymerázy.

V jednopísmenovém kódu se SEQ ID NO:1, značená ve třípísmenovém kódu jako LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu, označuje jako LSXXLX(V/I)PXXE:

Vynález se tedy týká na matrici závislých rekombinantních, tepelně stálých DNA polymerázových enzymů se sníženým rozlišováním proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý ve srovnání s dříve charakterizovanými enzymy. Tyto enzymy začleňují nukleotidy, včetně deoxynukleotidů (dNTP) a bázových analogů, jako jsou dideoxynukleotidy (ddNTP), které jsou značeny fluoresceinovými barvivý účinněji než běžné tepelně stálé enzymy. Vynález se rovněž týká genů, kódující tyto enzymy, jakožto rekombinantních expresních vektorů pro získání velkého množství čištěných enzymů.

Podle vynálezu je identifikována kritická oblast tepelně stálé DNA polymerázy, která ovlivňuje schopnost polymerázy začleňování nukleotidy, značené fluoresceinovými barvivý, za zachování schopnosti začleňování svědomité přírodní nukleotidy. Tato kritická oblast, kritický motiv, se může zavádět do genů pro tepelně stálé DNA polymerázy rekombinantními DNA způsoby, například místně specifickou mutagenezí k realizaci vynálezu.

Vynález se tedy týká rekombinantních tepelně stálých DNA polymerázových enzymů, které jsou mutovány k produkování kritického motivu a snižují rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý ve srovnání s odpovídajícími enzymy standardního typu.

Podle jiného provedení rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza spočívá podle vynálezu v tom, že

a) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE, SEQ ID NO:2, přičemž X znamená jakýkoliv aminokyselinový zbytek,

b) X v poloze 4 je mutovaný ve srovnání s nativní sekvencí s výjimkou, že X není mutován na Ea

c) tepelně stálá DNA polymeráza má rozlišovací schopnost proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovým barvivém, která je snížena ve srovnání s nativní formou této polymerázy.

Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerXaaXaaLeuXaalleProTyrGluGlu (SEQ ID NO:2), přičemž Xaa v poloze 3 znamená Gin nebo Gly, Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu a Xaa v poloze Gly, Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu a Xaa v poloze 6 Ser nebo Ala. Podle výhodného provedení

-2CZ 293217 B6 aminokyselinová sekvence je LSQXLAIPYEE (SEQ ID NO:3), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu. V třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako

LeuSerGlnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu (SEQ ID NO:3), přičemž znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu. Podle nej výhodnějšího provedení znamená Xaa v poloze 4 Lys.

Podle dalšího provedení rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza sočívá podle vynálezu v tom, že

a) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci

LSVXLG(V/I)PVKE, SEQ ID NO:4,

b) X v poloze 4 je mutovaný ve srovnání s nativní sekvencí s výjimkou, že X není mutován na Ea

c) tepelně stálá DNA polymeráza má rozlišovací schopnost proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovým barvivém, která je snížena ve srovnání s nativní formou této polymerázy.

Ve třípísmenovém kóduje tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu (SEQ ID NO:5), přičemž Xaa v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu a Xaa v poloze 7 Val nebo Ile. Podle výhodného provedení aminokyselinová sekvence je LSVXLGVPVKE, (SEW ID NO:5), kde znamená X v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu. V třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerValXaaLeuGlyValProValLysGlu (SEQ ID NO:5), přičemž znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu. Podle nejvýhodnějšího provedení znamená Xaa v poloze 4 Arg. Podle dalšího výhodného provedení aminokyselinová sekvence je LSVXLGIPVKE (SEQ ID NO:6), kde znamená X v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu. V třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerValXaaLeuGlylleProValLysGlu (SEQ ID NO:6), přičemž znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu. Podle nejvýhodnějšího provedení znamená Xaa v poloze 4 Arg.

Zvláštní kritická oblast podle vynálezu se může kombinovat s motivy jiných oblastí polymerázového genu, o němž je známé, že poskytuje tepelně stálé DNA polymerázy se sníženým rozlišováním proti začlenění nekonvenčních nukleotidů jako například rNTP a ddNTP. Příkladně byl konstruován rekombinantní Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerázový enzym obsahující dvě mutace. První mutací je E až K mutace ve zbytku X v poloze 4 kritického motivu podle vynálezu. Druhou mutací je mutace umožňující účinné začlenění ddNTP, známá jako F667Y mutace. Touto mutací je mutace fenylalaninu na tyrosin v poloze 667 Taq DNA polymerázy (popsané v americkém patentovém spisu US 5 614 365). Při použití v sekvenční reakci s fluoresceinovým barvivém značeného ddNTP se zjistilo, že E681K F667Y dvojitý mutantní enzym produkuje čitelný sekvenční žebřík. Podle takového provedení se motiv přenášející snížené rozlišení se zřetelem na dideoxynukleotidy kombinuje s kritickým motivem podle vynálezu za vytvoření enzymu majícího zvýšenou účinnost začlenění jak značeného, tak neznačeného ddNTP.

Kromě toho se zjistilo, že E681K F667Y mutantní enzym vyvíjí výrazně zvýšenou míru extenze se zřetelem na enzym se samotnou F667Y mutací. Proto podle dalšího provedení vynálezu zavedení kritického motivu do tepelně stálého DNA polymerázového enzymu, samotného nebo v kombinaci s jinými motivy, produkuje enzymy se zvýšenou mírou extenze. Také se neočekávatelně zjistilo, že dvojí mutantní enzym produkuje rovnoměrnější píkové výšky v barevně terminátorovém dideoxysekvancování za použití rhodaminovým barvivém značených terminátorů. Proto ještě podle dalšího vynálezu zavádění kritického motivu do tepelně stálého DNA polymerázového enzymu produkuje enzymy s rovnoměrnějšími výškami píků při DNA sekvenčních způsobem za použití rhodaminovým barvivém značených terminátorů.

-3CZ 293217 B6

Vynález umožňuje také mutace účinnější začleňování rNTP, jako glutaminová kyselina, do glycinové mutace v poloze 615 Taq DNA polymerázy, nebo E615G mutace (evropská zveřejněná přihláška vynálezu EP-A-8234479) se kombinuje s kritickým motivem podle vynálezu za získání enzymu majícího zvýšenou účinnost při začlenění ribonukleosidů značených fluoresceinovým barvivém.

Podle vynálezu se také produkují geny kódující polymerázy podle vynálezu. Zvláště se produkují geny kódující rekombinantní tepelně stálé polymerázy obsahující kritický motiv podle vynálezu. Zahrnutý jsou také geny kódující kombinace alespoň dvou mutací, které zahrnují mutace produkující kritický motiv podle vynálezu.

Vynález se také týká zlepšeného způsobu DNA sekvencování, který umožňuje použití nižších koncentrací fluoresceinovým barvivém značených ddNTP, čímž se snižují náklady pro provádění takových reakcí. Zlepšený způsob podle vynálezu také umožňuje použití nižších množství fluoresceinovým barvivém značených ddNTP a dNTP. Použití takových způsobů má četné přednosti, včetně účinnější polymerace, nižších koncentrací matricových žádaných nukleových kyselin a snižuje pravděpodobnost zavedení inhibitorů do reakční směsi. Tyto výhody také usnadňují sekvencování dlouhých matric. Vynález se také týká zlepšených způsobů sekvencování, přičemž se sekvencovaná reakční směs může přímo vnášet do sekvencovacích gelů pro následnou elektroforézu bez čištění meziproduktů.

Podle jednoho provedení je vynálezem zlepšený způsob stanovení sekvence štítové nukleové kyseliny za použití rekombinantního enzymu, který má a) mutaci v poloze 4, která produkuje kritický motiv podle vynálezu a b) snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý ve srovnání s odpovídajícím standardním enzymem. Vynález tedy zahrnuje zlepšený způsob sekvencování za použití tepelně stálých DNA polymerázových enzymů odvozených od termofílního druhu, přičemž enzymy obsahují přírodně se vyskytující sekvenční variace, které produkují kritický motiv podle vynálezu. Nativní enzymy mohou také poskytovat snížené rozlišování proti začlenění nekonvenčních nukleotidů. Podle tohoto provedení poskytuje vynález zlepšený způsob sekvencování za použití nativní tepelně stálé DNA polymerázy, která má a) kritický motiv podle vynálezu, přičemž aminokyselinovou v poloze 4 je Glu a b) snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý.

Vynález zahrnuje také zlepšené způsoby produkce DNA značených fluoresceinovými barvivý. Enzymy podle vynálezu účinně začleňují fluoresceinovými barvivý značené dNTP do polymerázových řetězových reakčních způsobů za produkce zesílených produktů, které jsou značeny na různých místech fluoresceinovými barvivý. Podle takového provedení zlepšený způsob značení DNA zahrnuje a) poskytnutí reakční směsi obsahující dNTP značený fluoresceinovými barvivý a enzym podle vynálezu a b) provedení reakce zesílení nukleové kyseliny.

Enzymy podle vynálezu a geny, kódující tyto enzymy, jsou dalším oborem vynálezu, kteiým jsou kity pro DNA sekvencování, které zahrnují rekombinantní enzym podle vynálezu a mohou přídavně zahrnovat fluorescentní terminátorovou sloučeninu s negativním nábojem. Jiné kity pro DNA sekvencování zahrnují a) fluorescentní terminátorovou sloučeninu s negativním nábojem a b) nativní enzym podle vynálezu.

Vynález se také týká kitů pro způsob přípravy značené DNA, který obsahuje rekombinantní enzym podle vynálezu. Jiné kity pro způsob přípravy značené DNA zahrnují a) fluorescentní nukleosidtrifosfátovou sloučeninu s negativním nábojem a b) nativní enzym podle vynálezu.

Vynález blíže objasňuje následující podrobný popis a připojený obrázek.

-4CZ 293217 B6

Přehled obrázku na výkrese

Na obr. 1 je schéma Taq DNA polymerázového genu. Jsou uvedena restrikční místa, která mají vztah k příkladu 1 a popis způsobů přípravy přídavných mutantů a expresních vektorů.

Pro usnadnění pochopení vynálezu se uvádí význam jednotlivých používaných výrazů:

Výrazem „gen“ se vždy míní DNA sekvence, která obsahuje řídicí a kódující sekvence, nutné pro reprodukovatelnou produkci bioaktivního polypeptidu nebo prekurzoru. Polypeptid se může kódovat plnou délkou genové sekvence nebo jakýmkoliv podílem kódující sekvence, pokud se udrží enzymatická aktivita.

Výrazem „nativní“ se vždy míní gen nebo genový produkt, který se izoluje z přírodně se vyskytujícího zdroje. Tento výraz se také týká rekombinantní formy nativního proteinu, produkovaného technikami molekulární biologie, které mají identickou aminokyselinovou sekvenci jako nativní forma.

Výrazem „mutant“ se vždy míní gen, který byl změněn v sekvenci jeho nukleových kyselin, nebo znamená genový produkt, který byl změněn v jeho sekvenci aminokyselin, čímž se získá genový produkt, který může být změněné funkční vlastnosti ve srovnání s nativním nebo standardním genem nebo genovým produktem. Takové změny zahrnují místo mutace, vypuštění a začlenění.

Výrazem „hostitelská buňka nebo buňky“ se vždy míní jednobuněčný prokaryotový a eukaryotový organismus, jako jsou bakterie, kvasinky a aktinomycety a jednotlivé buňky vyšších řádů rostlin nebo živočichů rostoucí v buněčné kultuře.

Výrazem „expresní systém“ se vždy míní DNA sekvence obsahující žádanou kódující sekvenci a řídicí sekvence ve funkční vazbě, takže hostitelské buňky, transformované těmito sekvencemi, jsou schopny produkovat zakódované proteiny. Pro transformaci může být expresní systém n a vektoru; avšak příslušná DNA může být začleněna do hostitelského chromosomu.

Výrazem „oligonukleotid“ se vždy míní molekula obsahující alespoň dva, s výhodou více než tři a zpravidla více než deset deoxyribonukleotidů nebo ribonukleotidů. Přesný rozměr oligonukleotidu závisí na četných faktorech, včetně konečné funkce nebo na účelu použití oligonukleotidu.

Oligonukleotidy se mohou připravovat jakýmkoliv vhodným způsobem včetně například klonování a restrikce vhodných sekvencí a přímého chemického způsobu například fosfotriesterovým způsobem (Narang a kol., Meth. Enzymol 68, str. 90 až 99, 1979), fosfodiesterovým způsobem (Brown a kol., Meth. Enzymol 68, str. 109 až 151, 1979), diethylfosforamiditovým způsobem (Beaucage a kol., Tetrahedron Lett. 22, str. 1859 až 1862, 1981), triesterovým způsobem (Matteucci a kol., J. Am. Chem. Soc. 103, str. 3185 až 3191, 1981), automatizovaných způsobů přípravy a způsobů přípravy na pevném nosiči (americký patentový spis US 4 458 066).

Výrazem „primer“ se vždy míní oligonukleotid, ať přírodního nebo syntetického původu, který je schopen působit jako bod iniciace syntézy při použití za podmínek, ve kterých se iniciuje extenze primerů. Primerem je s výhodou jednořetězcový oligodeoxyribonukleotid. Vhodná dálka primerů závisí na záměru použití primerů, zpravidla však je 15 až 35 nukleotidů. Krátké primerové molekuly zpravidla vyžadují chladnější teploty k vytvoření dostatečně stálých hybridních komplexů s matricí. Primer nemusí reflektovat přesně sekvenci matrice, musí však být dostatečně komplementární pro hybridizaci s matricí, aby došlo k prodlužování primerů.

Primer může být popřípadě značen začleněním značení zjistitelného spektroskopickým, fotochemickým, biochemickým, imunochemickým nebo chemickým způsobem. Jakožto užitelné

-5CZ 293217 B6 značení se příkladně uvádí ³²P, fluorescentní barviva, elektronově husté reagencie, enzymy (jako běžně používané při testech ELISA), biotin nebo hapteny a proteiny, pro které jsou dostupné antisera nebo monoklonální protilátky.

Výrazem „tepelně stálá polymeráza“ se vždy míní enzym, který je stálý proti působení tepla, je tepelně odolný a podržuje si dostatečnou účinnost ke způsobení následných příměrových extenzních reakcí a nedochází u něho k nevratné denaturaci (desektivaci) při působení zvýšených teplot po dobu potřebnou k denaturaci dvouřetězcových nukleových kyselin. Podmínky zahřívání, nutné pro denaturaci nukleových kyselin, jsou v oboru dobře známy a jsou v literatuře příkladně doloženy (americký patentový spis US 4 683 202 a 4 683 195)). Tepelně stálá polymeráza podle vynálezu je vhodná pro použití při tepelných cyklizačních reakcích, jako je polymerázová řetězová reakce (PCR). Nevratnou denaturaci se míní trvalá a dokonalá ztráta enzymatické účinnosti. V případě tepelně stálé polymerázy se enzymatická účinnost týká katalýzy kombinace nukleotidů vhodným způsobem pro extenzi příměrových produktů, které jsou komplementární k matricovému řetězci nukleové kyseliny.

Výrazem „konvenční nebo přírodní“ se vždy míní se zřetelem na báze nukleových kyselin, na nukleosidtrifosfáty nebo nukleotidy produkty, které se přírodně vyskytují v popisovaných polynukleotidech (například pro DNA to jsou dATP, dGTP, dCTP a dTTP). Přídavně se dITP a 7-deáza-dGTP často používají místo dGTP a 7-deaza-dATP se používá místo dATP v syntézních reakcích DNA in vitro, jako je například sekvencování. Společně se mohou označovat jako dNTP.

Výrazem „nekonvenční nebo modifikovaný“ se vždy míní se zřetelem na báze nukleových kyselin, nebo nukleosidy nebo nukleotidy modifikace, derivace nebo analogy konvenčních bází, nukleosidů nebo nukleotidů přírodně se vyskytujících, zvláště polynukleotidu. Deoxyribonukleotidová forma uracilu je nekonvenční nebo modifikovaná báze v DNA (dUMP), přičemž ribonukleotidová forma uracilu je konvenční báze RNA (UMP). Nekonvenční nukleotidy zahrnují, bez záměru na jakémkoliv omezení, sloučeniny používané jako terminátory pro sekvencování nukleových kyselin. Terminátorové sloučeniny zahrnují, bez záměru na jakémkoliv omezení, sloučeniny, které mají 2',3' dideoxystrukturu a jsou označovány jako dideoxynukleosidtrifosfáty. Dideoxynukleosidtrifosfáty ddATP, ddTTP, ddCTP a ddGTP se společně mohou označovat jako ddNTP. Jakožto jiné nekonvenční nukleotidy se příkladně uvádějí fosforothioát dNTP ([a-S]dNTP), 5'-a-boran-dNTP, α-methylfosfonát-dNTP a rubonukleosidtrifosfáty (rNTP). Nekonvenční báze mohou být značeny radioaktivními izotopy například ³²P, ³³P, ³⁵S, fluorescentními činidly, chemiluminescenčními činidly, bioluminescenčními činidly, heptanovými činidly, jako je biotin nebo enzymovými činidly, jako jsou streptavidin nebo avidin. Jakožto fluorescentní činidla se příkladně uvádějí barviva, která mají negativní náboj, jako jsou fluoresceinová barviva, nebo barviva nebo barviva, která mají pozitivní náboj, jako jsou cianinová barviva. Jakožto barviva fluoresceinová se příkladně uvádějí FAM, HEX, TET, JOE, NAN a ZOE. Jakožto barviva rhodaminová se příkladně uvádějí texaská červeň ROX, R110, R6G a TAMRA. FAM, HEX, TET, JOE, NAN a ZOE, ROX, R110, R6G, a TAMRA jsou obchodní produkty společnosti Perkin-Elmer (Foster City, CA) a texaská červeň je obchodním produktem společnosti Molecular Probes. Jakožto barviva cyaninová se příkladně uvádějí Cy2, Cy3, Cy5 a Cy7, přičemž jde o obchodní produkty společnosti Amersham (Amersham plače, Little Chalfont, Buckinghamshire, Anglie).

Výrazem „DNA syntézní reakce“ se vždy míní způsoby produkce kopií DNA včetně, nikoliv však se záměrem na jakémkoliv omezení na PCR, zesílení přenosu řetězců, transkripcí zprostředkované zesílení, extenze primerů a reverzní transkripce.

K. dalšímu usnadnění porozumění vynálezu se v popise a v příkladech uvádějí specifické tepelně stálé DNA polymerázové enzymy a fluorescentní barviva, přičemž však vynález na ně omezen není.

-6CZ 293217 B6

Vynález poskytuje nové a zlepšené sloučeniny, kterými jsou tepelně stálé DNA polymerázy. Enzymy podle vynálezu zahrnují rekombinantní polymerázy, které jsou mnohem účinnější při začlenění fluoresceinovými barvivý značených nukleosidtrifosfátů ve srovnání s odpovídajícími standardními typy enzymů. Tepelně stálé DNA polymerázy podle vynálezu jsou mnohem vhodnější a žádanější pro procesy, jako je sekvencování DNA a in vitro příprava značených produktů než polymerázy, známé ze stavu techniky. Zlepšené DNA sekvenční způsoby podle vynálezu zahrnují použití těchto rekombinantních polymeráz, jakož také použití nativních enzymů, které mnohem účinněji začleňují fluorescentními barvivý značené nukleositrifosfáty než enzymy charakterizované ve stavu techniky. DNA sekvence, kódující tyto enzymy, a vektory pro expresování proteinů vynález rovněž zahrnuje.

Tepelně stálé DNA polymerázy podle vynálezu mají oblast kritičnosti v aminokyselinové sekvenci domény polymerázové aktivity enzymu. Kritická oblast v aminokyselinové sekvenci tepelně stálé DNA polymerázy podle vynálezu je dále doložena za použití běžného jednopísmenového aminokyselinové kódu (Lehninger, Biochemistry, New York, New York, Worth Publishers lne., str. 67,1970).

SEQ ID NO: 7 LSXXLX(V/I)PXXE, kde X v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (SEQ ID NO:7), Přičemž Xaa v poloze 3, 6, 9 a 10 znamená jakoukoliv aminokyselinu, Xaa v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou zbytku glutamové kyseliny (Glu) a Xaa v poloze 7 znamená Val nebo Ile. Tato kritická oblast poskytuje tepelně stálé DNA polymerázové enzymy schopné účinně začleňovat nukleotidy značené fluoresceinovými barvivý.

Příkladně derivovaný Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerázový gen, který již obsahuje mutaci glycinu a asparagové kyseliny v poloze 46 (G46D) a F667Y mutaci, mutaci G na A v první poloze kodonu pro glutamovou kyselinu na zbytku 681 sekvence plné délky Taq DNA polymerázové sekvence (odpovídající poloze kritického motivu) vede k enzymu majícímu kritický motiv. Tento enzym vykazuje 1) přibližně dva až deseti násobný vzrůst účinnosti začleňování nukleotidů značených fluoesceinovými barvivý bez poškození enzymatické schopnosti zprostředkovávat PCR v přítomnosti konvenčních nukleotidů a 2) tří až 4,3 násobný vzrůst míry extenze. V Taq DNA polymeráze vede tato zvláštní mutace v aminokyselině k změně E (glutamová kyselina) na K (lysin).

Jakkoliv tato zvláštní aminokyselinová změna produkuje kritický motiv a výrazně mění schopnost enzymu začleňovat nekonvenční nukleotidy, očekává se, že specifická změna E na K není tak kritická pro vynález, jako je nyní identifikovaná poloha uvnitř oblasti kritičnosti. Podle výhodného provedení poskytuje vynález rekombinantní tepelně stálé DNA polymerázové enzymy, které a) v nativní formě polymerázy obsahují aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:1), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu, b) X v poloze 4 sekvence je mutován ve srovnání s nativní sekvencí s výjimkou, že X v poloze 4 není mutován na E a c) tepelně stálá DNA polymeráza má snížení rozlišování proti začlenění fluoresceinovými barvivý značených nukleotidů ve srovnání s nativní formou tohoto enzymu. Podle ještě výhodnějšího provedení vynálezu je X v poloze 4 nahrazen aminokyselinou mající pozitivní náboj, jako je K, P nebo H nebo polární aminokyselinou, jako je Q nebo N. Podle nejvýhodnějšího provedení vynález je X v poloze 4 nahrazen K.

Podle jiného výhodného provedení vynálezu má enzym a) snížené rozlišování se zřetelem na fluoresceinovými barvivý značené nukleotidy a b) obsahuje aminokyselinovou sekvenci LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE, kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu (SEQ ID NO:2). Ve třípísmenovém kóduje tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerXaaXaaLeuXaalleProTyrGluGlu, kde Xaa v poloze 3 znamená Gin nebo Gly, Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu a Xaa v poloze 6 Ser nebo Ala.

-7CZ 293217 B6

Podle ještě výhodnějšího provedení obsahuje enzym mající snížené rozlišování se zřetelem na fluoresceinovými barvivý značené nukleotidy aminokyselinovou sekvenci LSQXLAIPYEE, kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu (SEQIDNO:3). Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeSerGLnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu, kde znamená

Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu. Podle nejvýhodnějšího provedení X znamená K.

Podle jiného výhodného provedení obsahuje enzym mající snížené rozlišování se zřetelem na fluoresceinovými barvivý značené nukleotidy aminokyselinovou sekvenci LSVXLG(V/I)PVKE, kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu (SEQ ID NO:4). Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu, kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu a XAA v poloze 7 znamená Val nebo Ile.

Podle ještě výhodnějšího provedení obsahuje enzym mající snížené rozlišování se zřetelem na fluoresceinovými barvivý značené nukleotidy aminokyselinovou sekvenci LSVXLGPVKE, kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu (SEQ ID NO:5). Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerValXaaLeuGlyValproValLysGlu, kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu. Podle nejvýhodnějšího provedení X znamená R.

Podle jiného výhodného provedení obsahuje enzym mající snížené rozlišování se zřetelem na fluoresceinovými barvivý značené nukleotidy aminokyselinovou sekvenci LSVXLGIPVKE, kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu (SEQ ID NO:6). Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerValXaaLeuGlylleProValLysGlu, kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu. Podle nej výhodnějšího provedení X znamená R.

Charakterizace popsané E681K mutace identifikuje oblast v DNA polymerázovém genu, která ovlivňuje schopnost polymerázy vzájemně působit s fluorescentními nukleotidy s negativním nábojem. Toto místo vzdálené ke šroubovici O, je na konci šroubovice O_a a na začátku šroubovice Ob polymerázy (Kim a kol., Nátuře 376, str. 612, 1995). Na základě molekulárních modelových principů, v oboru dobře známých, se také očekává, že změny struktury O_a-Ob šroubovice, jiné než E na K v poloze 681 povedou ke změně schopnosti polymerázy rozlišovat proti začlenění fluoresceinovými barvivý značených nukleotidů. Proto mutace v polohách v kritickém motivu jiných než ve zbytcích X v poloze 4 spadá také do rozsahu vynálezu. Podle takového provedení se vynález týká rekombinantního tepelně stálého DNA polymerázového enzymu, který a) má ve své nativní formě polymerázu obsahující aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 1), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu, b)rekombinantní polymeráza obsahuje alespoň jednu mutaci v aminokyselinové sekvenci s tou výjimkou, že X v poloze 4 není mutován na E a c) enzym má snížené rozlišování proti začlenění fluoresceinovými barvivý značených nukleotidů ve srovnání s nativním enzymem.

Podobně tepelně stálé DNA polymerázy, které obsahují kritické motivy, které jsou podobné nikoliv však stejné jako kritický motiv, kterým je aminokyselinová sekvence LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:7), kde znamená X v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E, spadá do rozsahu vynálezu. Podle zvlášť výhodného provedení je kritickým motivem aminokyselinová sekvence LXXXXXXXXXE (SEQ ID NO:8), kde znamená X v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGlu (SEQ ID NO: 8), kde znamená Xaa v poloze 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 a 10 jakoukoliv aminokyselinu a kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu.

Podle jiného provedení je kritickým motivem aminokyselinová sekvence L(S/S)XX(L/I)XXXXXE (SEQ ID NO:9), kde znamená X v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGlu (SEQ ID NO:9), kde znamená Xaa v poloze 3, 6, 7, 8, 9 a 10 jakoukoliv aminokyselinu a kde znamená Xaa v poloze 2 Ser nebo Ala, Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu a Xaa v poloze 5 Leu nebo Ile.

-8CZ 293217 B6

Podle jiného provedení je kritickým motivem aminokyselinová sekvence LSXXLXXXXXE (SEQ ID NO: 10), kde znamená X v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaXaaXaaXaaGlu (SEQ ID NO: 10), kde znamená Xaa v poloze 3, 6, 7, 8, 9 a 10 jakoukoliv aminokyselinu a kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu.

Schopnost enzymů podle vynálezu účinně začleňovat fluoresceinovými barvivý značené nukleotidy se měří ddNTP zkouškami. Jednou takovou zkouškou je konkurenční zkouška extenze primeru přiváděná za podmínek omezující matrice. Při této zkoušce primer DG48 (5'-GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGC (SEQ ID NO: 11) vázaný na M13mpl3 matrici (Innis a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, str. 9436, 1988) se prodlužuje v přítomnosti [a-³³P]dCTP a nadbytku enzymu s různými hladinami fluorescenčně značeného ddNTP, ZowieddCTP. Jelikož začlenění ddCTP zbytku extenzní reakci ukončí, čím ochotněji DNA polymeráza začlení ddCTP do extendovaného primeru, tím méně se může začlenit [a-³³P]dCTP. Proto čím vzrůstá účinnost začlenění fluorescenčně značeného ddCTP, tím vzrůstá míra inhibici DNA syntézy. Reakce se provádějí tedy s různými úrovněmi neznačeného ddCTP. Koncentrace ddCTP a Zowie-ddCTP, potřebná pro 50% inhibici se vypočítá a porovnává k získání relativní míry schopnosti enzymu začleňovat fluorescenčně značený nukleotid. Podrobnosti zkoušky začlenění ddNTP objasňuje příklad 2.

Vynález se týká měření sníženého rozlišování proti začlenění fluoresceinovými barvivý značeného nukleotidu zkouškou začlenění fluorescenčního ddNTP, popsanou v příkladu 2. Podle výhodného provedení koncentrace fluoresceinovým barvivém ZowieddCTP značeného ddNTP, potřebná pro 50% inhibici syntézy DNA, se snižuje alespoň trojnásobně pro mutantní enzym podle vynálezu se zřetelem na standardní typ enzymu. Podle ještě výhodnějšího provedení se koncentrace snižuje alespoň pět krát a podle nej výhodnějšího provedení se snižuje alespoň deset krát. Podle jiného provedení se charakteristika sníženého rozlišení zkouší měřením začlenění fluorescentního dNTP.

Podle jiného hlediska vynálezu se tepelně stálá DNA polymerázová genová sekvence a enzym odvozují z různých termofilních druhů. Podle jednoho provedení vynálezu jsou polymerázová genová sekvence a enzym odvozeny od genus Thermus. Podle jiného provedení vynálezu jsou polymerázová genová sekvence a enzym odvozeny od jiného zdroje než je genus Thermus. Je dostupná plně nukleová kyselina a aminokyselinová sekvence pro četné termostabilní DNA polymerázy. Všechny sekvence ze souboru zahrnujícího Taq. Thermus thermopilus(Tth), Thermus species ZO5, Thermus species spsl7, Thermotoga maritima (Tma) a Thermosipho africanus (Taf) byly zveřejněny v mezinárodní přihlášce vynález PCT/U.S. 91/07035, která byla zveřejněna jako PCT přihláška vynálezu WO 92/06200 16. dubna 1992. Sekvence DNA polymerázy z Thermus flavus, Bacillus caldotenax a Bacillus stearothermophilus jsou rovněž z literatury známy (Akhmetzhanov a Vakhiitov, Nucleic Acids Research 20 (21), str. 5839,1992; Uemori a kol. J. Biochem 113, str. 401 až 410, 1993; a objednací číslo BSU23149.ng od NG:New GenBank database). Sekvence tepelně stálé DNA polymerázy z Thermus caldophilus je uložena v organizaci EMBL/GenBank pod objednacím číslem U62584. Sekvence tepelně stálé DNA polymerázy zThemus fíliformis je dosažitelná pod objednacím číslem 42380 od organizace ATCC, přičemž se využívá skutečností známých z patentového spisu US 4 889 818, přičemž je informace o sekvenci v tabulce I. Sekvence tepelně stálé DNA polymerázy zThermatoga neopolitana je dosažitelná pod objednacím číslem R98144 od GeneSeq Patento Data Base (je popsána v mezinárodním patentovém spise PCT WO 97/094451).

-9CZ 293217 B6

Tabulka

Organismus

Kritický motiv

Poloha kritické aminokyse1iny

Konsensus

L

S/a -

- L/i -

- - - - E

Thermus aquaticus

L

S

Q

E

L

A

I

P

Y

E

E

681

Thermus flavus

L

S

G

E

L

S

I

P

Y

E

E

679

Thermus thermophilus

L

S

Q

E

L

A

I

P

Y

E

E

683

Thermus specie Z05

L

S

Q

E

L

A

I

P

Y

E

E

683

Thermus specie spsl 7

L

S

Q

E

L

S

I

P

Y

E

E

679

Thermus caldophilus

L

S

Q

E

L

A

I

P

Y

E

E

683

Thermus filiformis

L

S

Q

E

L

S

I

P

Y

E

E

679

Thermotoga maritima

L

s

v

R

I»

G

v

P

v

K

E

744

Thermotoga neapolitana

L

s

v

R

L

G

I

P

v

K

E

744

Thermosipho africanus

L

s

K

R

I

G

L

s

v

s

E

743

Bacillus caldotenaxl

L

A

Q

N

L

N

I

s

R

K

E

725, 724

Bacillus stearothermophilus^ L

A

Q

N

L·

N

I

T

R

K

E

724, 727, 802

1. Proteinová sekvence objednací číslo D12982, T. Uemori, Y. Ishino, K. Fujita, K. Asada, I. Kato „Cloning of the DNA polymerase gene of Bacillus caldotenax and characterization of gene product“ (J. Biochem. 113, str. 401, 1993). Kritický zbytek v této sekvenci je 725. Téměř stejná proteinová sekvence je dostupná jak údajná „Bacillus stearothermophilus“ DNA polymeráza pod objednacím číslem R45155 a WPI93-408323/51. Kritický zbytek v této sekvenci je 724.

2. Několik sekvenčních submisí pro Baccillus Tearothermophilus DNA polymerázu je v organizaci Gene Bank nebo ve SeissProt/PIR databázích. Jakkoliv jsou tyto sekvence vysoce příbuzné, navzájem se poněkud liší, přičemž každá obsahuje identický motiv L(S/A)XX(L/I)XXXXXE (SEQ ID NO:9), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGlu (SEQ ID NO:9), přičemž Xaa v poloze 3, 6, 7, 8, 9 a 10 znamená jakoukoliv aminokyselinu, Xaa v poloze 2 znamená Ser nebo Ala, Xaa v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu a XAA v poloze 5 znamená Leu nebo Ile.

Podle shora uvedené tabulky proteinová sekvence obsahující kritický zbytek v kritickém motivu v poloze 724, jak popisuje japonská zveřejněná přihláška vynálezu J 05 304964A a evropský patentový spis EP 699760. Jiná, vysoce příbuzná avšak poněkud odlišná proteinová sekvence, popsaná v literatuře (Gene 163, str. 65 až 68, 1995), obsahuje kritický zbytek v kritickém motivu v poloze 727. Jiná, vysoce příbuzná avšak poněkud odlišná proteinová sekvence, dostupná pod objednacím číslem U23249 pro Bst DNA polymerázu, obsahuje kritický zbytek v kritickém motivu v poloze 802.

Jelikož DNA polymerázy každého termofilního druhu jsou jedinečné, je aminokyselinová poloha oblasti kritičnosti odlišná pro každý enzym. Programy řazení aminokyseliny a sekvence nukleové kyseliny jsou snadno dostupné a při dané identifikované zvláštní oblasti pomáhá k identifikaci přesné oblasti sekvence podle vynálezu. Takové programy řazení sekvence jsou dostupné

-10CZ 293217 B6 v organizaci Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wiskonsin. Za určení zvláštního, zde identifikovaného motivu tyto programy zahrnují „GAP“, „BESTFIT“ a „PILUEP“ pomáhají lokalizovat kritický motiv. Poloha oblasti kritičnosti je v tabulce I protepelně stálé DNA polymerázy příkladných termofilních druhů.

Bez zřetele na oblast kritického motivu LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:7), kde znamená X v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E, v polymerázové doméně tepelně stálé DNA polymerázy, slouží přítomnost motivu k poskytnutí tepelně stálé DNA polymerázy mající schopnost účinně začlenit fluoresceinovými barvivý značených nukleotidů. Proto mutace konzervované glutamové kyseliny tepelně stálé DNA polymerázy Thermus flavus (Glu 679), Thermus thermophilu (Glu 683), Thermus Species ZO5 (Glu 683), Thermus druh spsl7 (Glu 679), Thermus caldophilu (Glu 683), Thermus filifosmis (Glu 679) k produkci kritického motivu bude mít podpůrný vliv na schopnost polymerázy účinně začleňovat fluoresceinovými barvivý značené nukleotidy.

Kromě toho se zřetelem na vysoce zachovanou povahu nově identifikovaného kritického motivu se mohou identifikovat nové tepelně stálé DNA polymerázy na základě jejich homologie například kTaq DNA polymeráze nebo sekvencí jiných DNA polymeráz podle tabulky I (například americký patentový spis US 5 618 711 a 5 624 833). Takové polymerázy, pokud je jejich peptidová sekvence alespoň ze 45% a výhodněji zvíce než 80% homologická s aminokyselinovou sekvencí Taq polymerázy, podle zde popsaných identifikačních metod, spadá do rozsahu vynálezu. Proto se vynález týká třídy enzymů, která zahrnuje také například tepelně stálou DNA polymerázu a odpovídající gen a expresní vektory Thermus oshimai (R.A. Williams a kol., Int. J. Syst. Bacteriol. 46 (2), str. 403 až 408, 1996); Thermus silvanus a Thermus chliarophilus (S. Tenreiro a kol., Int. J. Syst. Bacterio. 45 (4), str. 633 až 639, 1995); Thermus Scotoductus (S. Tenreiro a kol., Res. Microbio. 146(4), str. 315 až 324, 1995); Thermus ruben ATCC 35948 (L.G. Loginova, Ing. J. Syst. Bacterio. 34, str. 498 až 499, 1986); a Thermus brokianus (M. J. Munster, J. Gen. Microbiol. 132, str. 1677, 1986).

Pracovníkům v oboru je zřejmé, že se shora charakterizované tepelně stálé DNA polymerázy se zvýšenou účinností k začleňování fluoresceinem značených nukleotidů jsou nejsnáze konstruovány technikou rekombinace DNA, jako je namístě zaměřená mutageneze (například Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989, druhé vydání, kapitola 15.51 „Oligonucleotide-mediated mutagenesis). Tento způsob je nyní v oboru standardní a může se ho používat pro vytvoření všech možných tříd změn páru bází v každém stanoveném místě genu. Tento způsob se provádí za použití syntetického oligonukleotidového primeru komplementárního sjednořetězcovým fágem nebo mutagenizovaného plazmidu DNA kromě omezeného chybného párování, které představuje žádanou mutaci. Syntetický oligonukleotid se tedy používá jako primer k přímé syntéze řetězce komplementárního k fágu nebo k plazmidu a získaná dvouřetězcová DNA se transformuje na fág nebo plazmid nesoucí hostitelské bakterium. Získaná bakterie se může zkouše například analýzou DNA sekvence nebo hybridizační sondou k identifikaci takových fágů nebo kolonií nesoucích žádanou mutovanou genovou sekvenci.

Následně k vynálezu PCR, primerem řízená mutageneze (popsaná v americkém patentovém spisu číslo 4 683195) a „overlap PCR“ (Higuchi, PCR Technology, 1989, vyd. Elich, Stoctom Press, New York, NY, str.61 až 70) se stála rutinní cestou zavádění jakékoliv mutace na kterékoliv poloze genu.

Mutovaná DNA se může získat z plazmidu, z plazmidu, z fágu nebo zesilovací reakcí běžnými prostředky a může se vázat na expresní vektor pro následnou kultivaci a čištění vzniklého enzymu. Četné klonovací a expresní vektory jsou vhodné pro provádění vynálezu, včetně savčích a bakteriálních systémů (například shora uvedená publikace Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989, druhé vydání). Pro jednoduchost je vynález objasněn na příkladu použití lambda odvozené P_L promotoru (Shimater a kol., Nátuře 292,

-11 CZ 293217 B6 str. 128, 1981). Použití tohoto promotoru je zvláště popsáno v americkém patentovém spisu

US 4 711 845 a 5 079 352).

Plazmid pCSl byl uložen s ATCC 28. srpna 1979 pod objednacím číslem 98521. Tento plazmid obsahuje gen kódující tepelně stálou DNA polymerázu, přičemž je tento gen mutován na kodonu v poloze 681 náhradou glutamové kyseliny lysinem v resultujícím peptidů a poskytuje prostředek pro získání tepelně stálých DNA polymeráz, majících podpořenou účinnost začleňování fluoresceinovými barvivý značených nukleotidů. Příklad 1 objasňuje použití lemovacích restrikčních míst vhodných pro subklonování E681K mutace pro vytvoření jiných tepelně stálých DNA polymerázových enzymů. Nebo jelikož je známa kompletní genová sekvence pro četné tepelně stálé DNA polymerázy, jsou jiné prostředky zavádění E681K mutace, jako je restrikční digesce a nahrazování fragmentu, snad dostupní pracovníkům v oboru, kteří mají k dispozici ATCC depozity a příslušné informace o sekvencích.

Pokud je záměr produkovat mutant nebo nativní enzymy podle vynálezu nebo deriváty nebo homology takových enzymů, zahrnuje produkce enzymu zpravidla transformaci hostitelské buňky expresním vektorem a kultivaci transformované hostitelské buňky za podmínek, při kterých dochází k expresi. Prostředky pro transformaci a kultivaci trasformované hostitelské buňky jsou v oboru dobře známy a jsou podrobně v literatuře popsány (například shora uvedená publikace Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor, 1989, druhé vydání).

Tepelně stálé DNA polymerázy podle vynálezu se obecně čistí k odstranění kmene DG116 E. coli (uloženého jako ATCC 53606 7. dubna 1987), za transformace expresním vektorem operativně vázaným na gen kódující standardní typ nebo modifikovanou tepelně stálou DNA polymerázu. Způsoby čištění tepelně stálé DNA polymerázy jsou popsány příkladně v příkladu 1 a v literatuře (například Lawyer a kol., PCR Methods and Applications 2, str. 275 až 287, 1993).

Tepelně stálé enzymy podle vynálezu se mohou používat k jakémukoliv účelu, jde je taková enzymatická účinnost, potřebná nebo žádoucí. Příkladně se uvádí sekvencování DNA, DNA značení a značení příměrových extenzních produktů. Způsobem podle vynálezu a obzvláště zlepšuje DNA sekvencování Sangerovým dideoxynukleotidovým způsobem (Sanger a kol., Proč. Nati. Acid. Sci. 74, str. 5463, 1977). Pokroky základního způsobu, který vyvinul Sanger a kol. vedly k novým vektorům (Yanisch-Perron a kol., Gene 33, str. 103 až 119, 1985) a k bázovým analogům (Mills a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. 76, str. 2232 až 2235, 1979 a Barr a kol., Biotechniques 4, str. 428 až 432, 1986). Obecně vyžaduje sekvencování DNA na matrici závislé prodlužování primerů v přítomnosti bázových analogů ukončujících řetězec za rozdělení parciálních fragmentů, které se následně oddělují podle velikosti. Bazické dideoxysekvencování zahrnuje i) kopulaci oligonukleotidového primerů popřípadě značeného na matrici, ii) extenzi primerů sDNA polymerázou ve čtyřech oddělených reakcích, přičemž každá reakční směs obsahuje směs neznačených dNTP a omezující množství jednořetězcového terminačního činidla, například ddTNP, popřípadě značeného a iii) oddělení čtyř řad reakčních produktů na vysoce oddělujícím denaturačním gelu polyakrylamid/močovina. Reakční produkty se mohou zjišťovat v gelu autoradiografií na fluorescenční detekcí v závislosti na použitém značícím činidle a může se zkoušet obraz k odvození nukleotidové sekvence. Tyto způsoby používají DNA polymerázy, například Klenowa fragmentu E. coli Pol I nebo modifikované T7 DNA polymerázy.

Dostupnost tepelně odolných polymeráz, například Taq DNA polymerázy vede ke zlepšeným způsobům sekvencování s tepelně stálou DNA polymerázou (Innis a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, str. 9436, 1988) a k jejich modifikacích, označovaným jako „cyklické sekvencování“) (Murray, Nuc. Acids Res. 17, str. 8889, 1989). Jako alternativa k bazickému dideoxysekvencování je cyklické sekvencování lineární asymetrické zesílení štítových sekvencí komplementárních k sekvenci matrice v přítomnosti terminátoru řetězce. Jeden cyklus produkuje rodinu extenzních produktů všech možných délek. Po denaturaci extenzního reakčního produktu z DNA matrice probíhají četné cykly kopulace primerů a extenze primerů v přítomnosti terminátorů, jako jsou

-12CZ 293217 B6 například ddNTP. Cyklické sekvencování vyžaduje méně matricové DNA než konvenční řetězec ukončující sekvencování. Tepelně stálé DNA polymerázy mají při cyklickém sekvencování některé přednosti: snášejí ostré kopulační teploty, kterých je zapotřebí pro specifickou hybridaci primeru na štíty nukleové kyseliny, jakož také četné cykly vysokoteplotní denaturace, ke které dochází v každém cyklu, to je 90 až 95 °C. Z tohoto důvodu AmpliTaq^R DNA polymeráza a její deriváty a produkty odbourání se začleňují do kitů pro Taq cyklické sekvencování, které jsou obchodním produktem společnosti Perkin-Elmer, Norwalk, CT.

Existují dvě obměny způsobené řetězového terminačního sekvencování, sekvencování s barevným primerem a sekvencování s barevným terminátorem. Při sekvencování s barevným primerem jsou ddNTP terminátory neznačené a značeného primeru se používá k detekci extenzních produktů (Smmith a kol. Nátuře 32, str. 674 až 679, 1986). Při sekvencování s barevným terminátorem se používá DNA polymerázy k začlenění dNTP a fluorescenčně značených ddTNP na konec DNA primeru (Lee a kol., Nuc. Acids. Res. 20, str. 2471, 1992). Tento způsob má výhodu, kterou nemá způsob přípravy s barevně značenými primery. Kromě toho jsou reakce s barevným terminátorem mnohem běžnější, jelikož se všechny čtyři reakce mohou provádět ve stejné nádobě.

Jak způsoby s barevným primerem, tak s barevným terminátorem se mohou automatizovat za použití automatizovaného sekvenčního zařízení společnosti Applied Biosystems, Foster City, CA (americký patentový spis US 5 171 534). Při použití zařízení se hotová sekvenční reakční směs frakcionuje na denaturačním polyakrylamidovém genu, namontovaném v zařízení. Laser na dně zařízení zjišťuje fluorescenční produkty po elektroforéze podle velikosti gelem.

Dvou typů fluorescentních barviv se obvykle používá ke značení terminátorů, které se používají pro sekvencování s barevným terminátorem - barviv s negativním nábojem s fluorescentních barviv s obojetným nábojem. Fluorescentní barviva s negativním nábojem zahrnují fluoresceinová bafiwa a barviva BODIPY. Barviva BODIPY (4,4-difluor-4-bor-3a,4a-diaza-s-indacen) jsou popsána ve zveřejněné mezinárodní přihlášce vynálezu číslo WO 97/00967. Fluorescentní barviva s obojetným iontem zahrnují rhodaminová barviva. Obchodně dostupné kity pro cyklické sekvencování používají terminátorů značených deriváty rhodaminu. Avšak rhodaminem značené terminátory jsou spíše drahé a produkt musí být oddělován od nezačleněných barevných ddNTP před vnesením na gel, jelikož současně migrují se produkty sekvencování. Zdá se, že terminátory s rhogaminovými barvivý stabilizují vlásenkovou strukturu vGC-bohatých oblastech, což způsobuje anomální migraci produktů. To vyžaduje použití dNTP, které uvolňují sekundární strukturu avšak také ovlivňují účinnost začlenění terminátoru.

Na rozdíl od toho fluoresceinem značené terminátory eliminují oddělovací stupeň před vnášením na gel, protože mají větší čistý náboj a migrují rychleji než produkty sekvence. Kromě toho fluoresceinem značené produkty sekvence vykazují lepší elektroforetickou migraci než sekvenční produkty značené rhodaminem. Jakkoliv standardní typ Taq DNA polymerázy nezačleňuje účinně terminátory značené fluoresceinovými barvivý, je možno účinného začlenění nyní dosáhnout použitím modifikovaných enzymů podle vynálezu.

Vynález zahrnuje nové způsoby pro dideoxysekvenvání za použití enzymů, které mají kritický motiv, jakož také kity pro provádění tohoto způsobu. Podle jednoho provedení sekvenčního způsobu podle vynálezu se

a) připravuje rekombinantní tepelně stálý DNA polymerázový enzym, který je charakterizován tím, že

i) ve své nativní formě polymeráza obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX (V/I)PXXE (SEQ ID NO:1), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu,

-13CZ 293217 B6 ii) X v poloze 4 této sekvence je mutován ve srovnání s nativní sekvencí, přičemž však neznamená E, iii) tepelně stálá DNA polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý ve srovnání s nativní formou tohoto enzymu a

b) provádí se sekvenční reakce s barevným terminátorem.

Podle výhodného provedení tohoto způsobu má nativní forma enzymu aminokyselinou sekvenci LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE (SEQ ID NO:2), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu. Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerXaaXaaLeuXaaIleproTyrGIuGlu (SEQ ID NO:2), kde znamená Xaa v poloze 3 Gin nebo Gly, Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu v Xaa v poloze 6 Ser nebo Ala. Podle ještě výhodnějšího provedení je nativní forma aminokyselinové sekvence LSQXLAIPYEE (SEQ ID NO:3), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu. V třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerGInXaaLeuAlalleProTyrGluGlu (SEQ ID NO:3), přičemž znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu. Podle nej výhodnějšího provedení znamená Xaa v poloze 4 Lys.

Jak shora uvedeno, DNA sekvencování s tepelně stálými DNA polymerázami vyžaduje směs nekonvenčních bázových analogů, které působí jako terminátory řetězce a konvečních nukleotidů ve specifických konvenčních poměrech, které zajišťují, že se získá populace extenzních produktů všech možných délek fragmentů v oboru několika stovek báze. Některé tepelně stálé DNA polymerázy dříve používané pro sekvencování, například standardní Taq polymeráza, se charakterizují tím, že přednostně začleňují konvenční nukleotidy v přítomnosti směsi konvenčních a nekonvenčních nukleotidů. Avšak nověji bylo popsáno, že tepelně stálé DNA polymerázy umožňují snížit poměr nekonvenčních bázových analogů ke konvenčním bázím stokrát až několiksetkrát až více než tisíckrát.

Jednou takovou polymerázou je F667Y mutant Taq DNA polymerázy. Jiným takovým mutantem je Taq DNA polymeráza mající F667Y mutaci a mutaci v poloze 46, která mění glycinový zbytek na zbytek kyseliny asparagové (G46D) mutace. Tato mutantová polymeráza, známá jako AmpliTaq, FS, je výrobkem společnosti Hoffman-La Roche a je obchodním produktem společnosti Perkin-Elmer. Jinou takovou polymerázou je DNA polymeráza F30Y-Tma30. Tato mutantní polymeráza je kombinací 1) nukleotidů 1-570 Taq DNA polymerázy, modifikované ke kódování G46D mutace a 2) nukleotidů 571-2679 Tma DNA polymerázy modifikované ke kódování asparagové kyseliny na alaninovou mutaci v poloze 323, glutamové kyseliny na alaninovou mutaci v poloze 325 a 323, glutamové kyseliny a alaninovou mutaci v poloze 325 a fenylalaninu a tyrosinovou mutaci v poloze 730 (americký patentový spis US 6 228 628 a evropská zveřejněná přihláška vynálezu EP 0 892058. Jinou polymerázou, která začleňuje nekonvenční bázové analogy je F703Y mutantní DNA polymeráza z Thermotoga neoplitana (mezinárodní přihláška vynález WO 96/10640, WO 96/41014 a WO 97/09451). Za použití těchto enzymů pro danou koncentraci dNTP se může snížit koncentrace rhodamin-ddNTP přibližně 50 krát až několik se krát ve srovnání s tepelně stálými DNA polymerázami dokud dosažitelnými.

Mutace E681K podle vynálezu se kombinuje za použití rekombinantních DNA způsobů s F667Y mutací za produkce dvojného mutantu Taq DNA polymerázového enzymu, používaného pro sekvenční reakce popsané v příkladu 4. Dvojného mutantu se používá při sekvenční reakci s barevným terminátorem za použití fluoresceinovým barvivém značených terminátorů. Výsledky, popsané v příkladu 4, dokládají, že enzym je schopen začleňovat fluoresceinovým barvivém značené terminátory do sekvenční reakce a produkovat sekvenční žebříky, které se mohou přesně číst v automatickém sekvenčním zařízení. Neočekávatelně se zjistilo, že kombinace E681K. a F667Y mutací produkuje tepelně stálý DNA polymerázový enzym se 3 až 4 násobnou extenzí se zřetelem na enzym se samotnou mutací F667Y podle měření, popsaného v příkladu 3.

-14CZ 293217 B6

Kritický motiv, identifikovaný podle vynálezu, že může kombinovat s motivy přispívajícími ke snížení rozlišování proti ddNTP k produkci polymeráz, majících zvýšenou účinnost začleňování jak značených, tak neznačených ddNTP. Tyto polymerázy jsou užitečné při DNA sekvenčních způsobech. Podle jednoho provedení vynálezu tepelně stálá polymeráza, mající kritický motiv definovaný podle vynálezu, obsahuje také kritický motiv, který zahrnuje F667Y mutaci. Podle tohoto provedení tepelně stálá DNA polymeráza je charakterizována tím, že

i) ve své nativní formě polymeráza obsahuje první aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:1), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu, ii) X v poloze 4 této sekvence je mutován ve srovnání s nativní sekvencí, přičemž však X není mutován na E, iii) tepelně stálá DNA polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý ve srovnání s nativní formou tohoto enzymu, iv) polymeráza obsahuje druhou aminokyselinovou sekvenci MRRXXKXXNYXXXYG (SEQ ID NO: 12), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu,

v) tepelně stálá DNA polymeráza má také snížené rozlišování proti začleňování nekonvenčních nukleotidů ve srovnání s nativní formou enzymu. Ve třípísmenovém kóduje tato aminokyselinová sekvence přepsána jako MetArgArgXaaXaaLysXaaXaaAsnTyrXaaXaaXaaTyrGly (SEQ ID NO: 12), kde znamená Xaa v poloze 4, 5, 7, 8, 11, 12 a 13 jakoukoliv aminokyselinu. Podle výhodného provedení Xaa v poloze 4 v první aminokyselinové sekvenci je mutován na Lys. Podle ještě výhodnějšího provedení je enzym Taq DNA polymeráza a obsahuje E681K a F667Y mutace.

Vynález se také týká způsobu sekvencování za použití této polymerázy.

Vynález také zahrnuje zlepšený způsob sekvencování prováděný za použití tepelně stálého DNA polymerázového enzymu, majícího kritický motiv, který není odvozen mutací nýbrž existuje jako přírodní varianta. Z tohoto hlediska DNA polymeráza termofilních bakterií má kritický motiv, ve kterém zbytek v poloze 4 není Glu. Například v tepelně stálé DNA polymeráze od Thermotoga neopolitana je X v poloze 4 v motivu LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:7), kde znamená X poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E, argininový zbytek. Proto se vynález také týká zlepšeného způsobu sekvencování GNA za použití nativní tepelně stálé DNA polymerázy, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:7), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přespána jako LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (SEQ IDNO:7), kde znamená Xaa v poloze 3, 6, 9 a 10 jakoukoliv aminokyselinu a Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu a Xaa v poloze 7 Val nebo Ile. Vynález se také týká způsobu sekvencování, při kterém se

a) vytváří tepelně stálá DNA polymeráza charakterizovaná tím, že

i) ve své nativní formě polymeráza obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:7), kde X v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu kromě E, ii) tepelně stálá DNA polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý ve srovnání s nativní formou tohoto enzymu,

b) vytvoří se barevný terminátor značený fluoresceinovým barvivém a

c) provádí se sekvenční reakce s barevným terminátorem.

-15CZ 293217 B6

Podle výhodnějšího provedení vynálezu se provádí sekvencování, při kterém se

a) vytváří tepelně stálá DNA polymeráza charakterizována tím, že

i) polymeráza obsahuje první aminokyselinou sekvenci LSXXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:7), kde X v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu kromě E, ii) tepelně stálá DNA polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý ve srovnání s nativní formou tohoto enzymu a iii) tato DNA polymeráza obsahuje druhou aminokyselinovou sekvenci MRRXXKXXNYXXXYG (SEQ ID NO: 12), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu.

iv) tato tepelně stálá DNA polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý ve srovnání s nativní formou tohoto enzymu a

b) vytváří se barevný terminátor značený fluresceinovým barvivém a

c) provádí se sekvenční reakce s barevným terminátorem.

Podle jiného výhodného provedení obsahuje enzym aminokyselinovou sekvenci LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE (SEQ ID NO: 13), kde znamená X v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerXaaXaaLeuXaalleProTyrGluGlu (SEQ ID NO: 13), kde znamená Xaa v poloze 3 Gin nebo Gly, Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu a Xaa v poloze 6 Ser nebo Ala. Podle výhodnějšího provedení je aminokyselinovou sekvencí LSQXLAIPYEE (SEQ ID NO: 14), kde znamená X v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerGlnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu (SEQ ID NO: 14), kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu v výjimkou Glu.

Podle ještě jiného dále výhodného provedení obsahuje enzym aminokyselinovou sekvenci LSVXLG(V/I)PVKE (SEQ ID NO: 15), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípísmenovém kóduje tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu (SEQ ID NO: 15), kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu a Xaa v poloze 7 Val nebi Ole. Podle výhodnějšího provedení je aminokyselinovou sekvencí LSVXLGVPVKE (SEQ ID NO: 16), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípísmenovém kóduje tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LueSerValXaaLeuGlyValProValLysGlu (SEQ ID NO: 16), kde znamená XAA v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu. Podle nej výhodnějšího provedení je Xaa v poloze 4 arg. Podle ještě dalšího výhodného provedení je aminokyselinovou sekvencí LSVXLGIPVKE (SEQ ID NO: 17), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerValXaaLeuGlylleProValLysGlu (SEQ ID NO: 17), kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu. Především znamená Xaa v poloze 4 Arg.

Podle jiného provedení se sekvencování provádí za použití nativního enzymu, který má snížené rozlišování proti začleňování nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý, jehož hladina se měří za použití zkoušek začlenění ddNTP, jak je popsáno v příkladu 2. Koncentrace ddCTP, potřebná pro 50% inhibici DNA syntézy se zjistí jako koncentrace Zowie-ddCTP potřebná pro 50% inhibici. Poměr koncentrace pro Zowie-ddCTP je poměr menší než 10. Podle ještě výhodnějšího provedení je poměr 4 nebo menší. Podle nej výhodnějšího provedení je poměr 1,2 nebo menší.

-16CZ 293217 B6

Jakkoliv se podle příkladů používá dideoxynukleotidů značených flurosceinovými barvivý, spadá použití jiných nekonvenčních nukleotidů a fluorescentních barviv do rozsahu vynálezu. Jakožto jiné nekonvenční nukleotidy se příkladně uvádějí fluorescenčně značené dNTP, kterých se může použít pro značení produktů DNA syntézy, a fluorescenčně značené rNTP, kterých se může použít pro značení příměrových extenzních produktů. Jakožto jiná barviva se příkladně uvádějí jiná fluorescenční barviva s negativním nábojem, například barvivý BODIPY, která jsou strukturně a chemicky podobná fluoresceinu. Taková jiná barviva zahrnují rovněž cyaninová barviva. Cyaninem značená dNTP se přidávají do standardní PCR reakční směsi, která obsahuje Taq DNA polymerázu s E681K mutací (aG46D mutací), neočekávatelně se zjistilo, že cyaninem značené dNTP se začleňují do zesílených produktů ve vyšší míře než standardní typ enzymu. Z tohoto hlediska způsob značení DNA podle vynálezu využívá nativní nebo mutované polymerázy podle vynálezu v kombinaci s nukleotidem značeným buď fluorescentním barvivém s negativním nábojem, nebo cyaninovým barvivém. Podle jednoho provedení vynález zahrnuje způsob značení DNA, při kterém se

a) vytváří tepelně stálá DNA polymeráza charakterizovaná tím, že

i) polymeráza obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:7), kde X v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu kromě E, ii) tepelně stálá DNA polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění nekonvenčních nukleotidů a

b) vytváří se nukleotid značený fluoresceinovým barvivém s negativním nábojem a

c) provádí se DNA syntézní reakce.

Podle jiného provedení vynález zahrnuje způsob značení DNA, při kterém se

a) vytváří tepelně stálá DNA polymeráza charakterizovaná tím, že

i) polymeráza obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:7), kde X v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu kromě E, ii) tepelně stálá DNA polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění nekonvenčních nukleotidů a

b) vytváří se nukleotid značený cyaninovým barvivém a

c) provádí se DNA syntézní rekce.

Podle jiného provedení vynálezu se vytváří tepelně stálá DNA polymeráza, která kombinuje mutaci umožňující účelnější začleňování rNTP, například glutamové kyseliny, do glycinové mutace v poloze 615 Taq DNA polymerázy a kritický motiv podle vynálezu. Očekává se, že výsledný enzym bude mít zvýšenou účinnost začleňování ribonukleotidů značených fluoresceinovými barvivý. Vynález se proto týká rekombinantní tepelně stálé DNA polymerázy, která 1) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:1), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu a 2) X v poloze 4 je mutován tak, že X v poloze 4 neznamená E a 3) obsahuje také oblast kritičnosti, kterou je aminokyselinová sekvence SQIXLR(V/I) (SEQ ID NO: 18), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E, a 4) je schopná začleňovat ribonukleotidy značené fluoresceinovými barvivý. Ve třípísmenovém kóduje tato aminokyselinová sekvence přepsána jako SerGlnlleXaaLeuArgXaa (SEQ ID NO: 18), kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu a Xaa v poloze 7 Val nebo Ile.

-17CZ 293217 B6

Oblasti mutantní polymerázy například pro Taq obsahující E614G a E681K jsou užitečné ve zlepšených způsobech produkce primárních extenzních produktů značených fluoresceinovými barvivý. Například ve primemí extenzní reakci je PCR, rNTP značený fluoresceinovými barvivý nahrazuje alespoň částečně jeden ze čtyř standardních dNTP a je zahrnuta dvojná mutantní polymeráza jako E681K E615G Taq DNA polymeráza. Mutantní polymeráza syntetizuje primemí extenzní produkty, které mají fluoresceinen značené ribonukleotidové zbytky v různých polohách svých délek. Po zahřátí nebo po alkalickém zpracování se primemí extenzní produkty fragmentují na každém ribonukleotidovém zbytku za produkce populace koncově značených fragment. Tato populace rovnoměrně značených fragmentů představuje rozdělené fluorescentní značení po celé délce primemího extanzního produktu. Značené fragmenty s touto charakteristikou jsou užitečné v detekci formátů nukleové kyseliny na základě silikonových Čipů (Cronin a kol., Human Mutation 7, str. 244, 1996). Vynález se tedy také týká způsobu značení primemích extenzních produktů, při kterém se

1) připravuje tepelně stálá DNA polymeráza, která je charakterizována tím, že

a) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:1), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu,

b) X v poloze 4 této sekvence je mutován, přičemž však neznamená E,

c) obsahuje také oblast kritičnosti s aminokyselinovou sekvencí SQIXLR(V/I) (SEQ ID NO: 18), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E,

d) je schopná účinně začleňovat ribonukleotidy značené fluoresceinovými nebo cyaninovými barvivý a

2) provádí se primemí extenzní reakce.

Enzymy, mající kritický motiv podle vynálezu, mají zvýšenou míru extenze se zřetelem na standardní typ enzymu, jak je doloženo v příkladu 4 pro mutant 4681K F667Y. Podle jednoho provedení je enzym charakterizován tím, že 1) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:1), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu, 2) aminokyselinová sekvence je mutována v poloze 4 tak, že X v poloze 4 není mutován na E a 3) má zvýšenou míru extenze ve srovnání s enzymem standardního typu. Podle výhodného provedení je enzym charakterizován tím, že 1) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/O)PXXE (SEQ ID NO:1), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu,

2) aminokyselinová sekvence je mutována v poloze 4 tak, že X v poloze 4 není mutován na E,

3) obsahuje také aminokyselinovou sekvenci MRRXXKXXNYXXXYG (SEQ ID NO:12), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu, a 4) má zvýšenou míru extenze ve srovnání s enzymem standardního typu. Podle výhodnějšího provedení je enzym charakterizován tím že 1) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:1), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu, 2) aminokyselinová sekvence je mutována v poloze 4 tak, že X v poloze 4 je mutován na K. Podle nej výhodnějšího provedení je enzym charakterizován tím, že enzymem je Taq DNA polymeráze a obsahuje E681K. mutaci a F667Y mutaci. Vynález zároveň zahrnuje způsoby sekvencování a značení DNA se použití polymeráz se zvýšenou mírou extenze a kity pro provádění takových způsobů.

Při výhodném provedení sekvencování podle vynálezu je tepelně stálá pyrofosfatáza začleňuje do reakční směsi. Zjistilo se, že pyrofosfatáza podporuje sekvencování za použití jak mesofilní, tak mutantní tepelně stálé DNA polymerázy (evropská zveřejněná přihláška vynálezu EP-A-763599 a americký patentový spis US 5 665 551).

Podle příkladného provedení tepelně stálá DNA polymeráza podle vynálezu obsahuje také mutaci v 5'-nukleázové oblasti, která značně přispívá ztenčení nukleázové aktivity. Modifikova

-18CZ 293217 B6 ná Taq polymeráza je popsána v literatuře (PCT přihláška xynálezu WO 92/06200, zveřejněná 16. dubna 1992 a americký patentový spis US 5 466 591). Podle jednoho provedení vynálezu kodon pro glycinový zbytek v aminokyselinové poloze 46 se nahrazuje kodonem pro kyselinu asparagovou (G46D mutace). Získaný enzym má zvýšenou užitečnost v cyklických sekvenčních reakcích v důsledku snížení 5'-nukleázové aktivity. Jak polymerázová oblast aminokyselinové sekvence tak polymerázová aktivita jsou nezměněny v případě G46D mutantu ve srovnání se standardním enzymem.

Obchodním provedením vynálezu jsou zlepšené kity pro provádění způsobu podle vynálezu a které vynález zahrnuje. Kit pro DNA sekvencování obsahuje

a) tepelně stálou DNA polymerázu charakterizovanou tím, že

i) polymeráza obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:7), kde X v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu kromě E, ii) tepelně stálá DNA polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý a

b) barevný terminátor značený fluorescentním barvivém s negativním nábojem a obsahuje popřípadě přídavně jiné reagencie pro DNA sekvencování, například dNTP, tepelně stálou pyrofosfatázu a vhodné pufry.

Podle jiného provedení má enzym vkitu aminokyselinovou sekvenci LSVXLG(V/I)PVKE (SEQ ID NO: 15), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu (SEQ ID NO: 15), kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu a Xaa v poloze 7 Val nebo Ile. Podle výhodného provedení je aminokyselinová sekvence LSVXLGVPKE (SEQ ID NO: 16), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerValXaaLeuGlyValLysGlu (SEQ ID NO:16), kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Podle ještě výhodnějšího provedení je aminokyselinová sekvence LSVXLGIPVKE (SEQ ID NO:17), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerValXaaLeuGlylleProValLysGlu (SEQ ID NO: 17), kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu. Podle ještě výhodnějšího provedení znamená Xaa v poloze 4 Arg.

Jiné kity pro DNA sekvencování obsahují mutantní tepelně stálou DNA polymerázu charakterizovanou tím, že

a) ve své nativní formě tato polymeráza obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:1), kde X znamená jakoukoliv aminokyselinu,

b) tato aminokyselinová sekvence je mutována v poloze 4, přičemž však X v poloze 4 neznamená E,

c) tepelně stálá DNA polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý ve srovnání s nativní formou enzymu a obsahuje popřípadě činidla pro sekvencování DNA, jako jsou sloučeniny ukončující řetězec, dNTP, tepelně stálá polyfosfatáza a vhodné pufry.

V případě, kdy jsou terminátory značeny, jsou vhodným značením fluorescentní barviva, ještě výhodnější značením jsou fluorescentní barviva s negativním nábojem nebo caninová barviva a nejvýhodnějším značením jsou fluoresceinová barviva. Podle výhodného provedení má enzym v kitu aminokyselinovou sekvenci LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE (SEQ ID NO:2), kde znamená X

-19CZ 293217 B6 jakoukoliv aminokyselinu. Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerXaaXaaLeuXaalleProTyrGluGlu (SEQ ID NO:2), kde znamená Xaa v poloze 3 Gin nebo Gly, Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu a Xaa v poloze 6 Ser nebo Ala. Podle výhodnějšího provedení má enzym v kitu aminokyselinovou sekvenci LSQXLAIPYEE (SEQ ID NO:3), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu. Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerGlnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu (SEQ ID NO:3), kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu. Nej výhodněji znamená Xaa v poloze 4 Lys.

Kity pro značení DNA obsahují tepelně stálou DNA polymerázu charakterizovanou tím, že

a) ve své nativní formě polymeráza obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:1), kde X znamená jakoukoliv aminokyselinu,

b) X v poloze 4 je mutován ve srovnání s nativní formou, není však mutován na E,

c) enzym má snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý ve srovnání s odpovídajícím standardním enzymem a popřípadě obsahuje přídavně dNTP a vhodné pufry.

Podle výhodného provedení je X v poloze 4 mutován na K.

Jiné kity pro produkci značené DNA obsahují

a) nukleotidy nebo nukleotidový analog značený fluorescentní sloučeninou s negativním nábojem,

b) nativní tepelně stálé DNA polymerázy mající kritický motiv LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:7), kde X v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu kromě E,

c) polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý a popřípadě obsahuje přídavně dNTP a hodné pufry.

Podle výhodného provedení je X v poloze 4 mutován na K.

Podle jiného výhodného provedení je X v poloze 4 mutován na R.

Kit pro značení primemích extenzních produktů obsahuje tepelně stálou DNA polymerázu charakterizovanou tím, že

a) ve své nativní formě polymeráza obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V7I)PXXE (SEQ ID NO:1), kde X znamená jakoukoliv aminokyselinu,

b) X v poloze 4 je mutován ve srovnání s nativní formou, není však mutován na E,

c) tepelně stálá DNA polymeráza obsahuje druhou aminokyselinovou sekvenci SQIXLR(V/I) (SEQ ID NO: 18), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E,

d) Enzym má snížené rozlišování proti začlenění ribonukleotidů značených fluoresceinovými barvivý ve srovnání s odpovídajícím standardním enzymem a obsahuje popřípadě přídavně rinonukleotid nebo rinonukleotidový analog značený fluoresceinovou sloučeninou s negativním nábojem nebo cyaninovou sloučeninou, dNTP a vhodné pufry.

Podle výhodného provedení obsahuje polymeráza E681K mutaci a E615G mutaci. Jiné kity pro výrobu značených primemích extenzních produktů obsahují a) ribonukleotid nebo ribonukleoti-20CZ 293217 B6 dový analog značený fluorescentní sloučeninou s negativním nábojem nebo cyaninovou sloučeninou a b) negativní tepelně stálou DNA polymerázu charakterizovanou tím, že

i) polymeráza obsahuje kritický motiv, který je aminokyselinová sekvence LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:7), kde X v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu kromě E, ii) obsahuje druhou aminokyselinovou sekvenci SQIXLR(V/I) (SEQ ID NO: 18), kde X znamená jakoukoliv aminokyselinu kromě E, iii) tepelně stálá DNA polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění ribonukleotidů značených fluoresceinovými barvivý a popřípadě obsahuje přídavně dNTP a vhodné pufry.

Podle výhodného provedení v první aminokyselinové sekvenci je X v poloze 4 mutován na K a ve druhé aminokyselinové sekvenci je X v poloze 4 mutován na G. Podle jiného výhodného provedení v první aminokyselinové sekvenci je X v poloze 4 mutován na R a ve druhé aminokyselinové sekvenci je X v poloze 4 mutován na G.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení. Procenta a díly jsou míněny vždy hmotnostně, pokud není uvedeno jinak.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Exprese modifikovaného Taq polymerázového genu majícího snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý

C-Koncový aminokyselinový podíl Taq DNA polymerázy kóduje polymerázovou aktivní oblast (Lawyer a kol., PCR Methods and Applications 2, str.275 až 287,1993; Feemont a kol., Proteins: structure, Function and Genetics 1, str. 66 až 73,1986). Fragment DNA, obsahující tuto oblast, se izoluje z první délky Taq genu a mutuje se PCR zesílením v přítomnosti mangenu (Leung a kol., Technique 1(1), str. 11 až 15, 1989). například všechny restrikční enzymy jsou obchodními produkty společnosti New England Biolabs, Beverly MA. Mutagenizované fragmenty se digerují sPsřl a 5gZII a klonují se do Taq expresního plazmidu, pLK102, který je má digerovat sPs/I aBgllI. Plazmid pLK102 je derivátem pLK.101, ve kterém je 900 bp PSň-BgHl fragment nahrazen krátkým Pstl-BgBI linkerem. Plazmid pLK.101 je modifikována forma pSYC1578 (Lawyer a kol., PCR Methods and Application 2, str. 275 až 287, 1993 a americký patentový spis číslo 5 079352), ze kterého je malý fragment HincII/EcoRV fragment v poloze 3' k polymerázové kódující oblasti vypuštěn.

Výsledné expresní plazmidy se transformují do E. coli kmenu N1624 (dostupný v organizaci E. coli Genetic Stock Center na univerzitě Yale University, kmen No. CGSC#5066) a získané transformanty se skrínují se zřetelem na schopnost účinněji začleňovat [a³²P]Tet-dCTP ve srovnání se standardním enzymem. Za použití tohoto způsobu se identifikuje Mutant CS1, mající schopnost účinněji začleňovat [a³²P]Tet-dCTP. Mutagenizovaný Taq expresní plazmid mutantu CS1 se digeruje s HináVMNhel a získaný restrikční fragment se subklonuje do standardního typu genu pLKlOl za náhrady mutagenizovaného Hinálll/Nheí fragmentu ke stanovení, který podíl mutagenizované Taq polymerázy je zodpovědný za změněný fototyp. Subklony, obsahující NhidllllNhe restrikční fragment, poskytují změněný fenotyp na standardní enzym, což naznačuje, že je mutace v tomto fragmentu. Následná analýza subklonu stanovuje, že mutace je lokalizována ve fragmentu 265 bp Zta/wHi-Atel.

-21 CZ 293217 B6

DNA sekvenční analýza 265 Nhel-Banňfl fragmentu se provádí na pCSl za použití Taq FS DyeDeoxy™ terminátorového cyklického sekvencovacího kitu společnosti Applied Biosystems, Foster DCity, CA a DNA sekvenčního systému Apolied Biosystems Model Prism 377. Sekvenční analýza identifikuje nesmyslnou mutaci v Taq polymerázovém genu na aminokyselině v poloze 681, která způsobuje náhradu zbytku glutamové kyseliny (E) zbytkem lysinu (K). Číslování se začíná na kodonů kódujícím první methioninový zbytek zralého proteinu (americký patentový spis US 5 079 352). Tato mutace, E681K, je speciálně způsobená náhradou GAG za AAG vkodonové sekvenci. Plazmid pCSl je uložen s ATCC 28. srpna 1997 pod objednacím číslem 98521.

Plazmid pCSl může obsahovat přídavek mutace v kódovací sekvenci pro Taq polymerázu; avšak dalšími sublonovacími pokusy se zjistilo, že E681K mutace je jediná zodpovědná za zvýšenou účinnost začleňování nukleosidtrifosfátů, značených fluoresceinovými barvivý. Tato bodová mutace je umístěna v 265 párů bází BamHL-Nhel DNA fragmentu, jak je ukázáno na obr. 1. V 265 bp DNA fragmentu E681K mutace je pouze změněna se zřetelem na standardní typ Taq polymerázové genové sekvence.

Pro další analýzu a kvantifikaci účinnosti začleňování nukleotidových analogů se 265 bp BamHl-Nhel fragment plazmidu pCSl klonuje do Taq expresního vektoru, který obsahuje standardní sekvenci v polymerázové doméně, pRDA3-2. Plazmid pRDA3-2, označovaný zde jako klon 3-2, je plně popsán v mezinárodním patentovém spise číslo WO 92/06200. Druhý klon, kódující jak E681K mutaci tak F667Y mutaci, se vytvořil na primer řízenou mutagenezí a následným klonováním PCR produktu obsahujícího obě mutace do BamHI-Nhel míst plazmidu pRDA3-2.

Expresní vektor pRDA3-2 obsahuje plnou délku Taq DNA polymerázového genu, funkčně napojeného na fág lambda Pl promotor. Ve vektoru pRDA3-2 5'-nukleázová doména Taq DNA polymerázového genu obsahuje bod mutace na kodonů kódujícím glycin v poloze 46, což snižuje aktivitu 5'-nukleázy (G46D mutace). Avšak genová sekvence v polymerázové doméně expresního vektoru pRDA3-2 je identická jako standardního typu Taq DNA polymerázové genové sekvence. Plazmid, pRDA3-2, pCSl a E681K F667Y PCR produkt se digerují s Ba/nHI a s Nhel a 265 bp DNA fragment z plazmidu pCSl nebo PCR produkt se ligatuje do vektoru pRDA3-2 o sobě známými způsoby. Výsledné plazmidy, pLKl 12 a pLKl 13, se transformují do E. coli kmen DG116 (ATCC No. 53606). Tyto plazmidy kódují tepelně stálé DNA polymerázy, označované zde jako G46D E681K Taq a G46D E681K F667Y Taq. Expresovaný tepelně stálý DNA polymerázy protein G46D E681K F667Y Taq se čistí způsobem popsaným v literatuře (Lawyer a kol., PCR Methods and Applications 2, str. 275 až 287, 1993).

Enzym G46D E681K Taq se čistí způsobem podobným způsobu přípravy, prováděných však v menším měřítku, jak následuje:

všechny stupně se provádějí při teplotě 4 °C, pokud není uvedeno jinak. Buňky z 475 ml kultury se resuspendují ve 30 ml pufru (50 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, 10 mM EDTA, hodnota pH 8,0, 0,5 mM Pefablo⁰ SC, 0,5 pg/ml leupeptinu, 0,1 mM Na-p-tosyl-L-lysinchlormethylketonu, 1 mM DTT). Na buňky se působí zvukem při 50% cyklu, usazují se 5 po dobu jedné minuty a chladí se na ledu po dobu jedné minuty. Tento stupeň se dvakrát opakuje. Přidá se 1,5 ml 4,0 M síranu amonného a směs se zahřívá na vodní lázni o teplotě 75 °C po dobu 15 minut a ochladí se na ledu. Přidá se polyethylenimin do 0,6 % a směs se inkubuje na ledu po dobu 10 minut. Směs se odstřeďuje při 16 OOOxg po dobu 30 minut. Supematant se vnese na sloupec 1,8 ml fenyl-sefarose (Bio-Rad Polyprep chromatografický sloupec) vyvážený roztokem 50 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, 10 mM EDTA, hodnota pH 8,0,1 mM DTT, 0,2 M síranu amonného. Sloupec se promyje 6 ml každého z následujících tří roztoků: 1) 25 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,2 M síranu amonného, 2) 25 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 3) 25 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT,

3) 25 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, 1 mM EDTA, lmM DTT, 20 % ethylenglykolu. Polymeráza se eluuje 6 ml systému 25 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5,1 mM EDTA, 1 mM DTT,

-22CZ 293217 B6

20% ethylenglykolu, 2,5M močoviny. Po adjustaci polymerázové preparace na 100 mM KCL

3M KC1 se směs vnese na sloupec heparinu a sepharosy (1,8 ml, Bio-ras Polyprep sloupec) vyvážený 25 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 100 mM KC1. Po promytí tímtéž pufrem se vzorek eluuje za použití pufru 25 mM Tris-HCl, hodnota pH

7,5, 1 mM EDTA, 400 mM KC1:

Po čištění se aktivita modifikovaných enzymů stanovuje za použití zkoušky aktivity popsané v literatuře (Lawyer a kol., J. Biol. Chem. 264, str. 6427 až 6437, 1989). Aktivita vyčištěných enzymů se vypočte tímto způsobem: jedna jednotka enzymu odpovídá 10 nmol produktu syntetizovaného v průběhu 30 minut. DNA polymerázová aktivita je přímo úměrná koncentraci enzymu až do 80 až 100 pmol začleněného dCMP (zředěný enzym při 0,024 až 0,03 jednotek/μΐ). Vyčištěných enzymů se používá pro začleňování a sekvenční reakce podle příkladu 2 až 4.

Příklad 2

Zkouška porovnávající účinnost začleňování ddNTP

Relativní schopnost G46D F6567Y Taq, G46D E667Y E681K Taq a F730Y Tma 30 DNA polymeráz začleňovat fluoresceinovými barvivý značeného ddCTP se porovnává za použití omezující matrice, příměrové extenzní konkurenční zkoušky. Polymeráza F730Y Tma 30 DNA je popsána v příkladu 1 amerického patentového spisu US 6 118 628 a v evropské zveřejněné přihlášce vynálezu EP 0 892058. Při této konkurenční zkoušce v důsledku toho, že začlenění ddCTP ukončuje extenzní reakci, čímž ochotněji polymeráza začleňuje DDCTP do extendovaného primeru, tím méně se může začlenit [a-³³P]dCTP. Proto se vzrůstající účinností ddCTP začleňování vzrůstá míra inhibice DNA syntézy. Účinnost začleňování ddCTP se pak porovnává s účinností začleňování flurescentně značené ddCTP, čímž se získá relativní míra účinnosti začlenění fluorescentně značeného ddNTP pro daný enzym.

Zkouška se provádí způsobem popsaným v literatuře (Lawyer a kol., J. Biol. Chem. 264, str. 6427, 1989), včetně následujících modifikací. Zkoušená směs má takové složení, aby konečná koncentrace byla 50 mM Bicinu pH 8,3, 25 °C, 2,5 mM MgCl₂, 1 mM β-merkaptoethanolu, 20 μΜ vždy dATP, dGTP a dTTP (Perkin-Elmer) 20 μΜ dCTP (Perkin-Elmer) a [a-³³P]dCTP (New England Nuclear, Boston, MA). M13mpl8 (Perkin-Elmer) se kopuluje na prime DG48 (SEQ ID NO: 10) a ekvivalent 0,085 pmol kopulované matrice se přidá do zkušební směsi pro každou reakci. Přidá se 35 μΐ zkoušené směsi s matricí DNA do každé z 38 Eppendorfových zkumavek o obsahu 0,5 ml. Připraví se zředění Zowie-ddCTP v 25 mM CAPSO pufru, hodnota pH 9,6, tak, aby vždy 10 μΐ každého se přidalo do reakční zkumavky, aby konečná koncentrace Zowie-ddCTP byla 3, 1, 0,5, 0,25, 0,125 nebo 0,0625 pm. Pro G46D F667Y Taq DNA polymerázu se připraví dvě zkumavky 3, 1, 0,5, 0,25, 0,125 a 0,0625 μΜ Zowie-ddCTP. Osm zbylých reakčních zkumavek obsahuje 10 μΐ 25 mM pufru CAPSO, hodnota pH 9,6. Tak každá z 36 zkumavek obsahuje 35 μΐ zkoušené směsi a 10 μΐ buď 25 mM pufru CAPSO, hodnota pH 9,6, nebo Zowie-ddCTP v příslušném zředění.

Pro každý zkoušený enzym se iniciuje polymerace ve zkumavce s každým Zowie-ddCTP v příslušném zředění a ve dvou zkumavkách obsahujících samotný pufr CAPSo za použití 5 μΐ enzymu. Používá se následujících koncentrací enzymu, přičemž se vždy dbá na nadbytek enzymu pro množství zkoušeného substrátu: 2,5 jednotek F667Y G46D Taq DNA polymerázy, připravené způsobem podle příkladu 1; 1,15 jednotek G46D, F667Y, E681K Taq DNA polymerázy, připravené způsobem podle příkladu 1; nebo 2 jednotky F730Y Tma30 DNA polymerázy. Jako kontrola pro základní koncentraci se iniciuje zbylá negativní kontrola enzymem zředěným pufrem spíše neb polymerázou. Všechny zkušební zkumavky se bezprostředně krátce intenzivně províří a inkubují se po dobu 10 minut při teplotě 75 °C. Reakce se ukončí přidáním 10 μΐ 60 mM EDTA a uloží se při teplotě 0 °C.

-23CZ 293217 B6

V analogickém testu se ddCTP zředí ve 25 ml pufru CAPSO, hodnota pH 9,6, tak, aby 10 μΐ každého zředění po přidání do reakční zkumavky vytvořilo konečnou koncentraci 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625 nebo 0,0312 μΜ. Pipetuje se 10 μΐ každého zředění do tří Epperdorfových zkumavek, obsahujících vždy 35 μΐ shora popsané testovací směsi. Také se připraví 4 zkumavky obsahující 35 μΙ testované směsi plus 10 μΐ 25 mM CAPSO pufru, hodnota pH 9,6. Každá z 19 zkumavek obsahuje 35 μΙ testované směsi a 10 μΐ buď 25 mM pufru CAPSO, hodnota pH 9,6, nebo jednoho ze zředění ddCTP.

Polymerace se iniciuje v jedné zkumavce z každého ddCTP zředění a v jedné zkumavce s pufrem CAPSO se 2,5 jednotkami G46D F667Y E681K Taq DNA polymerázy, ve zkumavce s pufrem CAPSO se 2,5 jednotkami G46D F667Y E681K Taq DNA polymerázy, s 1,25 jednotkami G46-F667Y E681K Taq DNA polymerázy nebo se 2 jednotkami F730Y Tma 30 DNA polymerázy. Zbývající zkumavka obsahující CAPSO se iniciuje enzymem zředěným pufrem místo pufrem obsahujícím polymerázu jakožto jako negativní kontrola. Všechny reakční směsi se bezprostředně intenzivně províří a inkubují se po dobu 10 minut při teplotě 75 °C. Reakce se ukončí přidáním 10 μΐ 60 mM EDTA a uloží se při teplotě 0 °C.

Pro každou reakci 50 μΐ podíl 60 μΙ reakční směsi se zředí 1 ml 2 mM EDTA, 50 μΙ/ml stříhaného losového sperma DNA jako nosiče. Vysráží se DNA použitím TCA o sobě známým způsobem a shromáždí se na GF/C filtračním kotoučku (Whatman). Stanoví se množství začleněné [a-³³P]dCMP pro každý vzorek a normalizuje se na CAPSO vzorky bez ddNTP (0% inhibice). Koncentrace ddCTP nebo Zowie-ddCTP, potřebná k 50% inhibici, se vypočte pro každý vzorek a je uvedena v tabulce II. Porovnání množství ddCTP, potřebného k inhibici syntézy 50%, se množstvím Zowie-ddCTP, potřebným pro inhibici syntézy 50% pro určitý enzym, odpovídá relativní schopnosti každého enzymu začleňovat fluorescenčně značený analog. Tyto hodnoty dokládají, že G46D F667Y Taq DNA polymeráza začleňuje Zowie-ddCTP nejméně účinně ze tří zkoušených enzymů (koncentrační poměry pro 50% inhibici Zowie-ddCTP versus ddCTP = 25). F730Y Tma30 DNA polymeráza začleňuje tento značený analog účinněji než G46D F667Y Taq DNA polymeráza (koncentrační poměry pro 50% inhibici Zowie-ddCTP versus ddCTP = 4), zatímco G46D F667Y E681K Taq DNA polymeráza začleňuje značený a neznačený analog ddCTP téměř stejně účinně (koncentrační poměry pro 50% inhibici ZowieddCTP versus ddCTP = 1,2).

Tabulka II

Koncentrace (μΜ) Zowie-ddCTP nebo ddCTP potřebné k 50% inhibici

DNA polymeráza	Zowie-ddCTP	ddCTP	Zowie-ddCTP/ddCTP
G46D F667Y Taq	1,4	0,056	25,0
G46D F667Y E681K Taq	0,14	0,116	1,2
F730YTma30	0,236	0,057	4,0

Příklad 3

Zkouška míry extenze

Míra extenze G46D F667YS Taq a G46D F667Y E681K Taq se stanoví zkouškou míry extenze. Při této zkoušce se používá enzymu k extenzi primeru kopulovaného na M13 matrici v přítomnosti [a³³P]dCTp. Extenzní reakce se denaturuje a produkty se analyzují denaturační agarózovou gelovou elektroforézou.

-24CZ 293217 B6

Zkouška se provádí jak shora popsáno (Lawyer a kol., J. Biol. Chem. 264, str. 6427, 1989) včetně následujících modifikací. Zkoušená směs je složená tak, aby konečná koncentrace byla 50 mM Bicinu, hodnota pH 8,3, 25 °C, 2,5 mM chloridu hořečnatého, 1 mM β-merkaptoethanolu, 200 μΜ vždy dATP, dGTP a dTTP (Perkin-Elmer), 100 μΜ dCTP (Perkin-Elmer) obsahujícího [a-³³P]dCTP (New England Nuclear, Boston, MA). M13mpl8 (Perkin-Elmer) se kopuluje na primker DG48 (SEQ ID NO: 11) a přidá se ekvivalent 0,085 pmol kopulované matrice ke zkoušené směsi pro každou reakci. Přidá se 55 μΐ zkušební směsi s matricovou DNA do každé ze 14 Eppendorfových zkumavek o obsahu 0,5 ml. Každá zkumavka se preinkubuje při teplotě 75 °C po dobu alespoň 30 sekund před startem polymerázové reakce.

Polymerace se iniciuje v šesti ze čtrnácti testovacích zkumavek 5 μΐ G46D F667Y Taq DNA polymerázy (2,5 jednotek) nebo G46D F667Y E681K Taq DNA polymerázy (1,25 jednotek) Oba enzymy se připraví způsobem podle příkladu 1, a použité koncentrace přestavují předem stanovený nadbytek enzymu pro množství testovaného substrátu. Jako kontrola pro základ se iniciuje zbylá negativní kontrola enzymem zředěným pufrem spíše než polymerázou. Všechny reakční zkumavky se krátce víří a inkubují se při teplotě 75 °C. Dvě z šesti zkumavek obsahující G46D F667Y Taq DNA polymerázu se inkubují tři minuty, dvě šest minut a dvě 10 minut. Podobně dvě zkumavky startující s G46D F667Y E681K Taq DNA polymerázou se inkubují 30 sekund, dvě jednu minutu a dvě minuty. Kontrolní zkumavky se inkubují tři minuty. Reakce se ukončí přidáním 10 μΐ 60 mM EDTA a uloží se při teplotě 0 °C.

Pro každou reakci 25 μΐ podíl 60 μΐ reakční směsi se zředí 1 ml 2 mM EDTA, 50 pg/ml stříhaného losového sperma DNA jako nosiče. Vysráží se DNA použitím TCA o sobě známým způsobem a shromáždí se na GF/C filtračním kotoučku (Whatman). Stanoví se množství začleněné [a-³³P]dCMP pro každý vzorek.

Zbylých 35 μΐ každého duplikátu se zkombinuje a 70 μΐ vzorku se vysráží ethanolem, vysuší se a resuspenduje se v 50 mM NaOH, 1 mM EDTA. Z těchto vzorků se odstraní podíly takže se odejme z každého stejný počet [a-³³P]. Tyto podíly se vnesou na 0,9% alkalický agarózový gel, podrobí se elektroforéze, vysuší se a autoradiografují se způsobem popsaným v literatuře (Maniatis a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982). Jako standard molekulové hmotnosti se použije bakteriofág lambda DNA řez s restrikčním enzymem HindlU (BRL) a 5'zakončení s [^j2P].

Délka páru bází extenzního produktu v každém vzorku se určí porovnáním migrační vzdálenosti každého vzorku se vzdáleností migrovaného lambda DNA standardu velikosti. Počet páru bází v každém produktu se dělí počtem sekund každé extenzní reakce inkubované, čímž se získá extenzní rychlost, jak dále uvedeno.

DNA polymeráza Doba Pár bází/sekunda

G46D F667Y Taq	3 minut	12,5
G46D F667Y Taq	6 min	12,2
G46D F667Y Taq	10 min	11,8
G46D F667Y E681KTaq	30 s	36,7
G46D F667Y E681KTaq	1 min	41,7
G46DF667Y E681KTaq	2 min	52,9

Výsledky zkoušek dokládají, že přítomnost E681K mutace zvyšuje rychlost extenze G46D F667Y enzymu 3 až 4,3 krát.

-25CZ 293217 B6

Příklad 4

Cyklické sekvencování s G46D F667Y E681K Taq DNA polymerázou a s fluoresceinem značeným ddNTP

Tento příklad dokládá použití modifikované polymerázy podle vynálezu k cyklickému sekvencování fluoresceinovým barvivém značeného dideoxyterminátoru za použití 1 μΜ nebo méně ddNTP a poměru ddNTP:dNTP alespoň 1:100. Fluoresceinovým barvivém značené dideoxyterminátory jsou reagencie sekvenčního kitu společnosti Applied Biosystems PRISM Sequenase^R Terminátor (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) a je optimalizován pro použití polymerázou Sequenase DNA a s alfa-thio dNTP. Reakce cyklického sekvencování se provádějí v 20 μΐ objemu obsahujícím 50 mM Tris-HCl (hodnota pH 8,8), 2,0 mM MgCl₂, 100 μΜ dITP (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), 0,2 μg M13mpl8 jednořetězcové DNA matrice (Perkin-Elmer), 0,15 μΜ LacZ Forward Primer (Perkin-Elmer), 5 jednotek G46D F667Y E681K Taq DNA polymerázy, 20 jednotek rTth tepelně stálé pyrofosfatázy (evropská zveřejněná přihláška vynálezu EP-A-763599 a americký patentový spis US 5 665 551), 0,05 μΜ terminátoru Sequenase A Dye Terminátor, 0,8 μΜ terminátoru Sequenase C Dye Terminátor, 0,08 μΜ terminátoru Sequenase G Dye Terminátor a 1,0 μΜ terminátoru Sequenase T Dye Terminátor. Všechny čtyři terminátory Sequenase Dye Terminátor jsou obchodními produkty společnosti Perkin-Elmer. Reakční směsi se vnesou do předehřátého (75 °C) tepelného cyklizátoru Perkin-Elmer GeneAmp^R PCR Systém 9600 a podrobí se 25 cyklům při 96 °C po dobu 10 sekund, 50 °C po dobu 5 sekund a 60 °C po dobu 4 minut. Barvivém značené fragmenty se čistí za použití sloupců Centri-Sep™ (Princeton Separations, Adelphia, NJ) podle výrobcova návodu a suší se ve vakuové odstředivce. Pelety se resuspendují v systému 6 μΐ deionizovaný formamid:50 mg/ml dextranová modř (ve 25 mM EDTA, hodnota pH 8,0) 5:1 (objem/objem), zahřátém na teplotu 90 °C po dobu tří minut a přímo se vnesou na preelektroforezovaný gel 4 % polyakrylamidu/6 M močovina, elektroforezují se a analyzují se na sekvenceru Perkin-Elmer ABI PRISM'377 DNA podle návodu výrobce (ABI PRISM 377 DNA Sequencer User's Manual). Automatizovaný analytický softwar společnosti Perkin-Elmer ABI PRISm 377 DNA Sequencer poskytuje více než 98,5% přesnost pro 450 bází (6 chyb pro báze +10 až +460 z primeru).

Průmyslová využitelnost

Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza se zvýšenou účinností pro začleňování nekonvenčních, například fluoresceinových barviv značených nukleotidů s výraznými cenovými a účinnostními přednostními pro DNA sekvencování. Je výhodná pro in vitro DNA syntézu, například pro DNA sekvencování, pro syntézu značené DNA a pro produkci značených primemích extenzních produktů.

Seznam sekvencí (1) Obecné informace (i) Přihlašovatel (A) Jméno: F. Hoffmann-La Roche Ltd (B) Ulice: Grenzacherstrasse 124 (C) Město: Basel (D) Stát: BS (E) Země: Švýcarsko (F) Poštovní kód (ZIP): CH-4070 (G) Telefon: (0)61 688 24 03 (H) Telefax: (0)61 688 13 95 (I) Telex: 962292/965512 hlr ch

-26CZ 293217 B6 (ii) Název vynálezu: Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza, způsob její přípravy a kit, který ji obsahuje (iii) Počet sekvence: 18 (iv) Forma pro počítač (A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patent Release # 1,0, Version # 1,30 (EPO) (vi) Platné přihlašovací údaje (A) Číslo přihlášky: US 60/052065 (B) Datum podání: 09-červenec-1997

2. Informace o SEQ ID. č. 1:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: Ί (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka „Xaa v poloze 7 je Val nebo Ile“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:1

Leu Ser Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Glu

5 10

2. Informace o SEQ ID. č. 2:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: 3..6 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka „Xaa v poloze 3 je Gin nebo Gly“

Xaa v poloze 6 je Ser nebo Ala“

-27CZ 293217 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:2

Leu Ser Xaa Xaa Leu Xaa Ile Pro Tyr Glu Glu 1 5 10

2. Informace o SEQ ID. č. 3:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin ίο (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:3

Leu Ser Gin Xaa Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 1 5 10

2. Informace o SEQ ID. č. 4:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: Ί (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka „Xaa v poloze 7 je Val nebo Ile“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:4

Leu Ser Val Xaa Leu Gly Xaa Pro Val Lys Glu 40 1 5 10

2. Informace o SEQ ID. č. 5:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:5

Leu Ser Val Xaa Leu Gly Val Pro Val Lys Glu

1 5 10

-28CZ 293217 B6

2. Informace o SEQ ID. č. 6:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:6

Leu Ser Val Xaa Leu Gly Ile Pro Val Lys Glu

5 10

2. Informace o SEQ ID. č. 7:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: 4..7 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka „Xaa v poloze 4 je jakákoliv aminokyselina nikoliv však zbytek glutamové kyseliny, Xaa v poloze 7 je Val nebo Ile“.

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:7

Leu Ser Xaa Xaa Leu Xaa Xaa pro Xaa Xaa Glu

5 10

2. Informace o SEQ ID. č. 8:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: 4 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka „Xaa v poloze 4 je jakákoliv aminokyselina nikoliv však Glu“

-29CZ 293217 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ IDN0:8

Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu

5 10

2. Informace o SEQ ID. č. 9:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: 2..5 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka „Xaa v poloze 2 je Ser nebo Ala, Xaa v poloze 4 je jakákoliv aminokyselina nikoliv však Glu a Xaa v poloze 5 je Leu nebo Ile“.

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:9

Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu

5 10

2. Informace o SEQ ID. č. 10:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: 4 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka „Xaa v poloze 4 je jakákoliv aminokyselina nikoliv však Glu“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10

Leu Ser Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu

5 10

2. Informace o SEQ ID. č. 11:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 30 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární

-30CZ 293217 B6 (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11

GGGAAGGGCG ATCGGTGCGG GCCTCTTCGC

2. Informace o SEQ ID. č. 12:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12

Met Arg Arg Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Asn Tyr Xaa Xaa Xaa Tyr Gly 15 10 15

2. Informace o SEQ ID. č. 13:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: 3..6 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka „Xaa v poloze 3 je Gin nebo Gly, Xaa v poloze 4 je jakákoliv aminokyselina nikoliv však Glu, Xaa v poloze 6 je Ser nebo Ala“.

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13

Leu Ser Xaa Xaa Leu Xaa Ile Pro Tyr Glu Glu

5 10

2. Informace o SEQ ID. č. 14:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid

-31 CZ 293217 B6 (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: 4 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka „Xaa v poloze 4 je jakákoliv aminokyselina nikoliv však Glu“.

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14

Leu Ser Gin Xaa Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu

5 10

2. Informace o SEQ ID. č. 15:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: 4..7 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka „Xaa v poloze 4 je jakákoliv aminokyselina nikoliv však Glu, Xaa v poloze 7 je Valn nebo Ile“.

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15

Leu Ser Val Xaa Leu Gly Xaa pro Val Lys Glu

5 10

2. Informace o SEQ ID. č. 16:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: 4 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka „Xaa v poloze 4 je jakákoliv aminokyselina nikoliv však Glu“.

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16

Leu Ser Val Xaa Leu Gly Val Pro Val Lys Glu

5 10

-32CZ 293217 B6

2. Informace o SEQ ID. č. 17:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: 4 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka „Xaa v poloze 4 je jakákoliv aminokyselina nikoliv však Glu“.

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17

Leu Ser Val Xaa Leu Gly Ile Pro Val Lys Glu

5 10

2. Informace o SEQ ID. č. 18:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 7 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: 4..7 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka „Xaa v poloze 4 je jakákoliv aminokyselina nikoliv však Glu, Xaa v poloze 7 je Val nebo Ile“.

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18

Ser Gin Ile Xaa Leu Arg Xaa

Claims (25)

1. Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza, která

a) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu, SEQ ID NO:1, přičemž Xaa v poloze 4 sekvence znamená zbytek polární aminokyseliny nebo aminokyseliny s pozitivním nábojem, v poloze 3, 6, 9 a 10 sekvence znamená jakýkoliv aminokyselinový zbytek a v poloze 7 znamená Val nebo Ile,

b) Xaa v poloze 4 je mutován ve srovnání s nativní sekvencí na lysin, arginin nebo histidin,

c) tepelně stálá DNA polymeráza má rozlišovací schopnost proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovým barvivém, která je snížena ve srovnání s nativní formou této polymerázy.

2. Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 1, kde nekleotidem je dideoxynukleotid a úroveň rozlišování je alespoň třínásobně nižší než nativní formy polymerázy.

3. Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 2, kde se úroveň rozlišování měří stanovením koncentrace dideoxynukleotidu značeného fluoresceinovým barvivém, které je zapotřebí pro 50% inhibicí DNA syntézy.

4. Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 2, která je z termofilních druhů ze souboru zahrnujícího Thermosipho africanus, Baccillus caldotenax a Baccillus stearothermophilus.

5. Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 2, která je z druhu Thermus.

6. Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza, podle nároku 5, která

a) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci LeuSerXaaXaaLeuXaalleProTyrGluGlu, SEQ ID NO:2, přičemž Xaa v poloze 3 sekvence znamená Gin nebo Gly, Xaa v poloze 4 sekvence znamená zbytek polární aminokyseliny nebo aminokyseliny s pozitivním nábojem a Xaa v poloze 6 sekvence znamená Ser nebo Ala,

b) Xaa v poloze 4 je mutován ve srovnání s nativní sekvencí na lysin, arginin nebo histidin,

c) tepelně stálá DNA polymeráza má rozlišovací schopnost proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovým barvivém, která je snížena ve srovnání s nativní formou této polymerázy.

7. Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 6, která

a) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci LeuerGlnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu, SEQ ID NO:3, přičemž Xaa v poloze 4 sekvence znamená zbytek polární aminokyseliny nebo aminokyseliny s pozitivním nábojem,

b) Xaa v poloze 4 je mutován ve srovnání s nativní sekvencí na lysin, arginin nebo histidin,

c) tepelně stálá DNA polymeráza má rozlišovací schopnost proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovým barvivém, která je snížena ve srovnání s nativní formou této polymerázy.

-34CZ 293217 B6

8. Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 7, ve které Xaa v poloze 4 je mutován na lysin.

9. Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 2, která je z druhu Thermogota.

10. Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 9, která

a) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu, SEQ ID NO:4, přičemž Xaa v poloze 4 sekvence znamená zbytek polární aminokyseliny nebo aminokyseliny s pozitivním nábojem s výhodou Arg a Xaa v poloze 7 sekvence znamená Val nebo Ile,

b) Xaa v poloze 4 je mutován ve srovnání s nativní sekvencí na lysin, arginin nebo histidin,

c) tepelně stálá DNA polymeráza má rozlišovací schopnost proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovým barvivém, která je snížena ve srovnání s nativní formou této polymerázy.

11. Nukleová kyselinová sekvence kódující rekombinantní, tepelně stálou DNA polymerázu podle nároků 1 až 10.

12. Vektor obsahující nukleovou kyselinovou sekvenci kódující rekombinantní tepelně stálou DNA polymerázu podle nároků 1 až 10.

13. Hostitelská buňka obsahující nukleovou kyselinovou sekvenci kódující rekombinantní tepelně stálou DNA polymerázu podle nároků 1 až 10.

14. Způsob přípravy rekombinantní tepelně stálé DNA polymerázy podle nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že

a) se kultivuje hostitelská buňka obsahující nukleovou kyselinovou sekvenci kódující rekombinantní tepelně stálou DNA polymerázu podle nároků 1 až 10 za podmínek promotujících expresi rekombinantní tepelně stálé DNA polymerázy a

b) izoluje se rekombinantní tepelně stálá DNA polymeráza z hostitelské buňky nebo z prostředí.

15. Použití rekombinantní, tepelně stálá DNA polymerázy podle nároků 1 až 10 pro sekvencování DNA, při kterém se pořídí barevný terminátor značený fluoresceinovým barvivém s negativním nábojem a provádí se sekvenční reakce s barevným terminátorem.

16. Použití podle nároku 15 rekombinantní, tepelně stálé DNA polymerázy se sníženou úrovní rozlišování se zřetelem na začleňování nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý, přičemž nukleotidem je ribonukleotid a úroveň rozlišování se měří poměrem koncentrace dideoxynukleotidu značeného fluoresceinovým barvivém, kterého je zapotřebí pro 50% inhibici DNA syntézy versus koncentrace neznačeného dideoxynukleotidu potřebného pro 50% inhibici.

17. Použití podle nároku 16, přičemž poměr je 4 nebo menší.

18. Použití rekombinantní, tepelně stálé DNA polymerázy podle nároků 1 až 10 pro produkci značené DNA, přičemž se pořídí nukleotid značený fluoresceinovým barvivém a provádí se DNA syntézní reakce.

-35CZ 293217 B6

19. Použití rekombinantní, tepelně stálé DNA polymeráz}· podle nároků 1 až 10 pro produkci značených příměrových extenzních produktů, přičemž

i) polymeráza obsahuje aminokyselinovou sekvenci LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu, SEQ ID NO:4, kde Xaa v poloze 4 sekvence znamená zbytek polární aminokyseliny nebo aminokyseliny s pozitivním nábojem a Xaa v poloze 7 sekvence znamená Val nebo Ile, ii) polymeráza má sníženou rozlišovací schopnost se zřetelem na začlenění nukleotidů značených fluoresceinovým barvivém, iii) polymeráza také obsahuje druhou aminokyselinovou sekvenci SQIXLR(V/I), SEQ ID NO: 18, přičemž znamená X jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E, iv) polymeráza má sníženou rozlišovací schopnost se zřetelem na začlenění ribonukleotidů značených fluoresceinovým barvivém, pořídí se nukleotid značený fluoresceinovým barvivém a provádí se primerová extenzní reakce.

20. Použití rekombinantní, tepelně stálé DNA polymerázy podle nároků 1 až 10 pro in vitro syntézní účely DNA, pro DNA sekvencování, pro syntézu značené DNA a pro produkci značených primemích extenzních produktů.

21. Kit pro DNA sekvencování, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní, tepelně stálou DNA polymerázu podle nároků 1 až 10 a terminátor značený fluorescentním barvivém s negativním nábojem.

22. Kit pro DNA sekvencování podle nároku 21,vyznačuj ící se tím, že rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza má sníženou rozlišovací schopnost se zřetelem na začlenění ribonukleotidů značených fluoresceinovým barvivém, přičemž úroveň rozlišování se měří stanovením poměru koncentrace dideoxynukleotidu ddNTP značeného fluoresceinovým barvivém, kterého je zapotřebí pro 50% inhibici DNA syntézy ve srovnání s koncentrací neznačeného ddNTP a tento poměr je 4 nebo menší.

23. Kit pro DNA sekvencování podle nároku 22, vyznaču j í cí se tím, že úroveň rozlišování je alespoň pětkrát nižší než nativní formy příslušné polymerázy.

24. Kit pro produkci značené DNA, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinanční, tepelně stálou DNA polymerázu podle nároků 1 až 10 a nukleotid značený fluorescentním barvivém s negativním nábojem.

25. Kit pro produkci značených primemích extenzních produktů, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní, tepelně stálou DNA polymerázu podle nároků 1 až 10 a ribonukleotid značený fluorescentním barvivém.

1 výkres