ES2804843T3 - Variantes de polimerasa - Google Patents

Abstract

Una ADN polimerasa modificada que tiene una actividad ADN polimerasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2, secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución de acuerdo con S366 A/L y que opcionalmente incluye una o más sustituciones aminoacídicas seleccionadas del grupo que consiste en H223, N224, Y225, H227, I295, Y342, T343, I357, S360, L361, I363, S365Q, Y367, P368, D417, E475, Y476, F478, K518, H527, T529, M531, N535, G539, P542, N545, Q546, A547, L549, I550, N552, G553, F558, A596, G603, A610, V615, Y622, C623, D624, I628, Y629, R632, N635, M641, A643, I644, T647, I648, T651, I652, K655, W656, D657, V658, H660, F662, L690 y combinaciones de las mismas.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de polimerasa

SOLICITUDES RELACIONADAS

La presente solicitud es una continuación por partes de la solicitud de EE. UU. 15/012.317 presentada el 1 de febrero de 2016, titulada "Polymerase Variants", que reivindica prioridad a la solicitud de patente provisional de EE. UU. 62/161.571 que se presentó el 14 de mayo de 2015, titulada "Polymerase Variants", la solicitud de patente provisional de EE. u U. 62/202.895 que se presentó el 9 de agosto de 2015, titulada "Polymerase Variants" y la solicitud de EE. UU. 15/151.364 que se presentó el 10 de mayo de 2016, titulada "Polymerase Variants and Uses Thereof.

LISTADO DE SECUENCIAS

La presente solicitud contiene un listado de secuencias que se ha presentado electrónicamente en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 10 de mayo de 2016, se llama 20-04338.521WO2_SL.txt y tiene un tamaño de 17.989 octetos.

CAMPO TÉCNICO

En el presente documento se proporcionan, entre otras cosas, ADN polimerasas modificadas que contienen alteraciones de aminoácidos basadas en mutaciones identificadas en experimentos de evolución dirigida diseñados para seleccionar enzimas que sean más adecuadas para aplicaciones en tecnologías de ADN recombinante.

ANTECEDENTES

Las ADN polimerasas son una familia de enzimas que usan ADN monocatenario como molde para sintetizar la hebra de ADN complementaria. En particular, las ADN polimerasas pueden añadir nucleótidos libres al extremo 3' de una hebra recién formada, dando como resultado el alargamiento de la nueva hebra en sentido de 5' a 3'. La mayoría de las ADN polimerasas son proteínas multifuncionales que poseen actividades tanto polimerizantes como exonucleolíticas. Por ejemplo, muchas ADN polimerasas tienen actividad exonucleasa 3'^5'. Estas polimerasas pueden reconocer un nucleótido incorporado incorrectamente y la actividad exonucleasa 3 '^5 ' de la enzima permite que se escinda el nucleótido incorrecto (esta actividad es conocida como corrección de errores). Después de la escisión de nucleótidos, la polimerasa puede reinsertar el nucleótido correcto y la replicación puede continuar. Muchas ADN polimerasas también tienen actividad exonucleasa 5'^3'.

Las polimerasas han encontrado uso en aplicaciones de ADN recombinante, incluyendo la secuenciación de nanoporos. Sin embargo, una cadena de ADN se mueve rápidamente a una tasa de 1 ps a 5 ps por base a través del nanoporo. Esto hace que el registro sea difícil y propenso al ruido de fondo, no pudiéndose obtener una resolución de un único nucleótido. Por lo tanto, el uso de marcas detectables en nucleótidos se puede usar en la secuenciación de una hebra de ADN o fragmento de la misma. Por tanto, no solo existe una necesidad de controlar la tasa a la que se secuencia el ADN, sino también proporcionar polimerasas que tengan propiedades mejoradas (en relación con la enzima natural), tales como la incorporación de nucleótidos modificados, por ejemplo, nucleótidos polifosfato con o sin marcas.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona ADN polimerasas modificadas (por ejemplo, mutantes) basadas en experimentos de evolución dirigida diseñados para seleccionar mutaciones que confieran fenotipos ventajosos en condiciones usadas en aplicaciones industriales o de investigación, por ejemplo, catalizando la incorporación de nucleótidos polifosfato modificados, por ejemplo, nucleótidos marcados, en altas concentraciones de sal.

En un aspecto, existe una polimerasa variante que comprende al menos una alteración en la posición S366 A/L y opcionalmente en una posición correspondiente a H223, N224, Y225, H227, I295, Y342, T343, I357, S360, L361, I363, S365, Y367, P368, D417, E475, Y476, F478, K518, H527, T529, M531, N535, G539, P542, N545, Q546, A547, L549, I550, N552, G553, F558, A596, G603, A610, V615, Y622, C623, D624, I628, Y629, R632, N635, M641, A643, I644, T647, I648, T651, I652, K655, W656, D657, V658, H660, F662 y L690 de la SEQ ID NO:2 (Pol6 (con marca His)).

En un modo de realización, se proporciona una ADN polimerasa modificada que tiene una actividad ADN polimerasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 1 o 2.

En un segundo modo de realización, se proporciona una ADN polimerasa modificada que tiene una actividad ADN polimerasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 1 o 2 que tiene una o más sustituciones aminoacídicas seleccionadas del grupo que consiste en H223, N224, Y225, H227, I295, Y342, T343, I357, S360, L361, I363, S365, S366, Y367, P368, D417, E475, Y476, F478, K518, H527, T529, M531, N535, G539, P542, N545, Q546, A547, L549, I550, N552, G553, F558, A596, G603, A610, V615, Y622, C623, D624, I628, Y629, R632, N635, M641, A643, I644, T647, I648, T651, I652, K655, W656, D657, V658, H660, F662 y L690 y combinaciones de las mismas. En otro modo de realización, las una o más sustituciones aminoacídicas se seleccionan de H223A, N224Y/L/Q/M/R/K, Y225L/T/I/F/A/M, H227P/E/F/Y, I295W/F/M/E, Y342L/F, T343N/F, I357G/L/Q/H/W/M/A/E/Y/P, S360G/E/Y, L361M/W/V/F, I363V/A/R/M/W, S365Q/W/M/A/G, S366A/L, Y367L/E/M/P/N/F, P368G, D417P, E475D, Y476V, F478L, K518Q, H527W/R/L/Y/T/M, T529M/F, M531H/Y/A/K/R/W/T/L/V/G, N535L/Y/M/K/I/R/W/Q, G539Y/F, P542E/S/G, N545K/D/S/L/R/Q/W, Q546W/F, A547M/Y/W/F/V/S, L549Q/Y/H/G/R/K, I550A/W/T/G/F/S, N552L/M/S/T, G553S/T/E/Q/K/R/M, F558P/T, A596S, G603T/A/L, A610T/E, V615A/T, Y622A/M, C623G/S/Y/F, D624F/K, I628Y/V/F/L/M, Y629W/H/M/K, R632L/C, N635D, M641L/Y, A643L, I644H/M/Y, T647G/A/E/K/S/Y, I648K/R/V/N/T/L, T651Y/F/M, I652Q/G/S/N/F/T/A/L/E/K/M, K655G/F/E/N/Q/M/A, W656E, D657R/P/A/E, V658L, H660A/Y, F662I/L, L690M y combinaciones de las mismas. La ADN polimerasa modificada que tiene una o más sustituciones aminoacídicas tiene una característica alterada seleccionada de actividad enzimática, fidelidad, procesividad, tasa de alargamiento, exactitud de secuenciación, capacidad de lectura continua larga, estabilidad y solubilidad en relación con la polimerasa original. En un modo de realización, la característica alterada es la actividad enzimática. En un modo de realización, la característica alterada es la fidelidad. En un modo de realización, la característica alterada es la procesividad. En un modo de realización, la característica alterada es la tasa de alargamiento. En un modo de realización, la característica alterada es la estabilidad. En un modo de realización, la característica alterada es la solubilidad. En un modo de realización, la característica alterada es la capacidad de unir y/o incorporar nucleótidos polifosfato, por ejemplo, un nucleótido tetrafosfato, pentafosfato, hexafosfato, heptafosfato u octofosfato.

En un tercer modo de realización, se proporciona una ADN polimerasa modificada que tiene una característica alterada seleccionada de actividad enzimática, fidelidad, procesividad, tasa de alargamiento, estabilidad o solubilidad, en comparación con la SEQ ID NO: 1 o 2. En un modo de realización, la característica alterada es la actividad enzimática. En un modo de realización, la característica alterada es la fidelidad. En un modo de realización, la característica alterada es la procesividad. En un modo de realización, la característica alterada es la tasa de alargamiento. En un modo de realización, la característica alterada es la estabilidad. En un modo de realización, la característica alterada es la solubilidad.

En un cuarto modo de realización, se proporciona una ADN polimerasa modificada que tiene una actividad ADN polimerasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 1, en la que la secuencia de aminoácidos incluye una o más sustituciones aminoacídicas, seleccionándose dichas sustituciones del grupo que consiste en H223A, N224Y/L/Q/M/R/K, Y225L/T/I/F/A, H227P/E/F/Y, I295W/F/M/E, Y342L/F, T343N/F, I357G/L/Q/H/W/M/A/E/Y/P, S360G/E/Y, L361M/W/V/F, I363V/A/R/M/W, S365Q/W/M/A/G, S366A/L, Y367L/E/M/P/N/F, P368G, D417P, E475D, Y476V, F478L, K518Q, H527W/R/L/Y/T/M, T529M/F, M531H/Y/A/K/R/W/T/L/V/G, N535L/Y/M/K/I/R/W/Q, G539Y/F, P542E/S/G, N545K/D/S/L/R/Q/W, Q546W/F, A547M/Y/W/F/V/S, L549Q/Y/H/G/R/K, I550A/W/T/G/F/S, N552L/M/S/T, G553S/T/E/Q/K/R/M, F558P/T, A596S, G603T/A/L, A610T/E, V615A/T, Y622A/M, C623G/S/Y/F, D624F/K, I628Y/V/F/L/M, Y629W/H/M/K, R632L/C, N635D, M641L/Y, A643L, I644H/M/Y, T647G/A/E/K/S/Y, I648K/R/V/N/T/L, T651Y/F/M, I652Q/G/S/N/F/T/A/L/E/K/M, K655G/F/E/N/Q/M/A, W656E, D657R/P/A/E, V658L, H660A/Y, F662I/L, L690M y combinaciones de las mismas, en la que las uno o más sustituciones aminoacídicas alteran la actividad enzimática, la fidelidad, la procesividad, la tasa de alargamiento, la exactitud de secuenciación, la capacidad de lectura continua larga, la estabilidad o la solubilidad en relación con la polimerasa original. En un modo de realización, la característica alterada es la actividad enzimática. En un modo de realización, la característica alterada es la fidelidad. En un modo de realización, la característica alterada es la procesividad. En un modo de realización, la característica alterada es la tasa de alargamiento. En un modo de realización, la característica alterada es la estabilidad. En un modo de realización, la característica alterada es la solubilidad. En un modo de realización, la característica alterada es la capacidad de unir y/o incorporar nucleótidos polifosfato, por ejemplo, un nucleótido tetrafosfato, pentafosfato, hexafosfato, heptafosfato u octofosfato.

En un modo de realización, la polimerasa variante que tiene actividad enzimática alterada en comparación con la SEQ ID NO: 1 o 2 se selecciona de

a. H223A;

b. N224Y/L/Q/M/R/K;

c. Y225L/I/T/F/A/M;

d. H227P/E/F/Y;

e. I295F/E/M/W;

f. Y342L/F;

g. T343N/F;

h. I357G/L/Q/H/W/M/A/E/Y/P;

i. S360G/E/Y;

j. L361M/W/V/F;

k. I363V/A/R/M/W;

l. S365Q/W/M/A/G;

m. S366A/L;

n. Y367L/E/M/P/N/F;

o. P368G;

p. D417P;

q. E475D;

r. Y476V;

s. F478L;

t. K518Q;

u. H527W/R/L/Y/T/M;

v. T529M/F;

w. M531H/Y/A/K/R/W/T/L/V/G; x. N535L/Y/M/K/I/R/W/Q;

y. P542E/S/G;

z. N545D/K/S/L/R/Q/W;

aa. Q546W/F;

bb. A547F/M/W/Y/V/S;

cc. L549H/Y/Q/G/R/K;

dd. I550A/W;

ee. I550T/G/F/S;

ff. N552L/M/T;

gg. G553S/T/E/Q/K/R/M; hh. F558P/T;

ii. A596S;

jj. G603T/A/L;

kk. A610T/E;

II. V615A/T;

mm. Y622A/M;

nn. C623G/S/Y/A/F;

oo. D624F/K;

pp. I628Y/V/F/L/M;

qq. Y629W/H/M/K;

rr. R632L/C;

ss. N635D;

tt. M641L/Y;

uu. A643L;

vv. I644H/M/Y;

ww. T647G/A/E/K/S/Y;

xx. I648K/R/V/N/T/L;

yy. T651Y/F/M;

zz. I652Q/G/S/N/F/T/A/L/E/K/M; aaa. K655G/F/E/N/Q/M/A; bbb. W656E;

ccc. D657R/P/A/E;

ddd. V658L;

eee. H660A/Y;

fff. F662I/L;

ggg. L690M;

hhh. S366A+N535L;

iii. T651Y+N535L;

jjj. Y342L+E475D+F478L; kkk. T343N+D417P+K518Q; III. N535L+N545K+T651Y; mmm. I363V+E475D+Y476V; nnn. S366L+G553S+F558P; ooo. S366A+N535L+A547M; ppp. S366A+P542E+N545K; qqq. S366A+P542E+I652Q; rrr. S366A+N535L+T529M; sss. S366A+N535L+I652Q; ttt. S366A+N535L+N545K; uuu. T651Y+P542E+N545K; vvv. T651Y+P542E+Q546W; www. T651Y+P542E+S366A;

xxx. T651Y+N535L+N545K;

yyy. S366A+N535I+I652Q;

zzz. T651Y+S366A+A547F;

aaaa. T647G+A547F+Y225T;

bbbb. A547F+A61OT+S366A;

cccc. A547F+A610T+Y225I;

dddd. S366A+T647G+A547F;

eeee. T529M+S366A+A547F;

ffff. T647E+S366A+A547F;

gggg. T529M+T647G+A547F;

hhhh. N545K+S366A+A547F;

iiii. T647G+A547F+T529M;

jjjj. T529M+A610T+A547F;

kkkk. M641Y+T529M+A547F;

llll. T647G+C623G+A547F;

mmmm. A610T+I295W+T651Y;

nnnn. V615A+M531Y+T647G;

oooo. S366L+F478L+A596S+L690M;

pppp. H223A+G553S+A643L+F662I;

qqqq. N535L+N545K+T651Y+T529M;

rrrr. N535L+N545K+T651Y+N635D;

ssss. N535L+N545K+T651Y+I652Q;

tttt. S366A+N535L+I652Q+T529M;

uuuu. S366A+S365A+P368G+G603T;

vvvv. N535L+N545K+T651Y+T647G;

wwww. S366A+N535L+I652Q+A547Y;

xxxx. S366A+N535L+A547M+T647G;

yyyy. T529M+S366A+A547F+N545K;

zzzz. T529M+S366A+A547F+N545R;

aaaaa. T529M+S366A+A547F+N552L;

bbbbb. T529M+S366A+A547F+Y629W;

ccccc. N535I+N545K+T651Y+T529M;

ddddd. N535I+N545K+T651Y+N635D;

eeeee. N535I+N545K+T651Y+I652Q;

fffff. N535L+N545K+T651Y+T647G+C623G;

ggggg. N535L+N545K+T651Y+T647G+I628Y;

hhhhh. S366A+N535L+A547M+T647G+S360G;

iiiii. N535I+N545K+T651Y+I652Q+Y225I;

jjjjj. N535L+N545K+T651Y+T647G+K655G;

kkkkk. N535L+N545K+T651Y+T647G+L549Q;

lllll. S366A+N535L+I652Q+A547Y+K655G;

mmmmm. T529M+S366A+A547F+N545L+Y629W;

nnnnn. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L;

ooooo. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225F;

ppppp. T529M+S366A+A547F+N545L+K655F;

qqqqq. T529M+S366A+A547F+N545L+N552L;

rrrrr. T529M+S366A+A547F+N545R+M531A;

sssss. T529M+S366A+A547F+N545R+G539Y;

ttttt. T529M+S366A+A547F+N545R+V658L;

uuuuu. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+D657R;

vvvvv. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+N552L;

wwwww. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+I652G;

xxxxx. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+I652Q;

yyyyy. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+N552M

zzzzz. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+D657R+N224R;

aaaaaa. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+D657R+I628M;

bbbbbb. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+D657R+K655A; y

cccccc. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+D657R+Y629W.

En un modo de realización, la característica alterada es la actividad enzimática. En un modo de realización, la característica alterada es la fidelidad. En un modo de realización, la característica alterada es la procesividad. En un modo de realización, la característica alterada es la tasa de alargamiento. En un modo de realización, la característica alterada es la estabilidad. En un modo de realización, la característica alterada es la solubilidad. En un modo de realización, la característica alterada es la capacidad de unir y/o incorporar nucleótidos polifosfato, por ejemplo, un nucleótido tetrafosfato, pentafosfato, hexafosfato, heptafosfato u octofosfato.

En algunos modos de realización, la polimerasa variante que tiene actividad enzimática alterada, en comparación con la SEQ ID NO: 2 que tiene las mutaciones N535I+N545k+T651Y+N635D, o la SEQ ID NO: 1 o 2 se selecciona de

a. A547F+A610T+Y2251;

b. Y225T+T647G+A547F;

c. S366A+T647G+A547F;

d. S366A+A547F+A610T;

e. T529M+S366A+A547F;

f. T529M+T647G+A547F;

g. T529M+A610T+A547F;

h. N545K+S366A+A547F;

i. N545K+T647G+A547F;

j. A610T+I295W+T651Y;

k. V615A+M531Y+T647G;

l. M641Y+T529M+A547F;

m. T647E+S366A+A547F;

n. T647G+A547F+T529M;

o. T647G+C623G+A547F; y

p. T651Y+S366A+A547F.

En algunos modos de realización, la polimerasa variante se selecciona de

a. N535L+N545K+T651 Y;

b. S366A+N535L+I652Q;

c. S366A+T529M+N535L;

d. S366A+N535L+N545K;

e. S366A+N535L+A547M;

f. S366A+P542E+I652Q;

g. S366A+P542E+N545K;

h. S366A+P542E+T651 Y;

i. P542E+N545K+T651 Y;

j. P542E+Q546W+T651Y;

k. N535L+T651 Y;

l. S366A+N535L;

m. N535L+N545K+T651Y+T529M;

n. N535L+N545K+T651Y+N635D;

o. N535L+N545K+T651Y+I652Q;

p. S366A+N535L+I652Q+T529M;

q. N535L+N545K+T651Y+T647G;

r. S366A+N535L+I652Q+A547Y;

s. S366A+N535L+A547M+T647G;

t. S366A+N535I+I652Q;

u. N535I+N545K+T651Y+T529M;

v. N535I+N545K+T651Y+N635D;

w. N535I+N545K+T651Y+I652Q;

x. N535L+N545K+T651Y+T647G+C623G;

y. N535L+N545K+T651Y+T647G+I628Y;

z. S366A+N535L+A547M+T647G+S360G;

aa. N535I+N545K+T651Y+I652Q+Y225I;

bb. N535L+N545K+T651Y+T647G+K655G;

cc. N535L+N545K+T651Y+T647G+L549Q;

dd. S366A+N535L+I652Q+A547Y+K655G;

ee. T647G+A547F+Y225T;

ff. A547F+A61OT+S366A;

gg. A547 F+A610T+Y225I;

hh. S366A+T647G+A547F;

ii. T651Y+S366A+A547F;

jj. T529M+S366A+A547F;

kk. T647E+S366A+A547F;

ll. T529M+T647G+A547F;

mm. N545K+S366A+A547F;

nn. T647G+A547F+T529M;

oo. N545K+T647G+A547F;

pp. T529M+A610T+A547F;

qq. M641Y+T529M+A547F;

rr. T647G+C623G+A547F;

ss. A610T+I295W+T651Y;

tt. V615A+M531Y+T647G;

uu. T529M+S366A+A547F+N545K;

vv. T529M+S366A+A547F+N545R;

ww. T529M+S366A+A547F+N552L;

xx. T529M+S366A+A547F+Y629W;

yy. T529M+S366A+A547F+N545L+Y629W;

zz. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L;

aaa. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225F;

bbb. T529M+S366A+A547F+N545L+K655F;

ccc. T529M+S366A+A547F+N545L+N552L;

ddd. T529M+S366A+A547F+N545R+M531A;

eee. T529M+S366A+A547F+N545R+G539Y;

fff. T529M+S366A+A547F+N545R+V658L;

ggg. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+D657R;

hhh. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+N552L;

Ni. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+I652G;

jjj. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+I652Q;

kkk. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+N552M

lll. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+D657R+N224R;

mmm. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+D657R+I628M;

nnn. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+D657R+K655A; y

ooo. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+D657R+Y629W..

En algunos modos de realización, la polimerasa variante tiene actividad enzimática alterada en comparación con las SEQ ID NO: 1 o 2, o la polimerasa original.

En algunos modos de realización, la polimerasa variante que tiene actividad enzimática alterada, en comparación con la SEQ ID NO: 2 que tiene las mutaciones S366A+T529m N545L+A547F, o la SEQ ID NO: 1 o 2, se selecciona de

a. Y225L/F/A/M;

b. M531A/G;

c. G539Y;

d. N552L/T;

e. Y629W/K;

f. K655F.

En un modo de realización, la característica alterada es la actividad enzimática. En un modo de realización, la característica alterada es la fidelidad. En un modo de realización, la característica alterada es la procesividad. En un modo de realización, la característica alterada es la tasa de alargamiento. En un modo de realización, la característica alterada es la estabilidad. En un modo de realización, la característica alterada es la solubilidad. En un modo de realización, la característica alterada es la capacidad de unir y/o incorporar nucleótidos polifosfato, por ejemplo, un nucleótido tetrafosfato, pentafosfato, hexafosfato, heptafosfato u octofosfato.

En algunos modos de realización, la polimerasa original es Pol6 natural: (SEQ ID NO:1). En algunos modos de realización, la polimerasa original es Pol6 que comprende una marca His (SEQ ID NO:2). En algunos modos de realización, la polimerasa original comprende las mutaciones S366A+T529M+A547F+N545L/R. En algunos modos de realización, la polimerasa original puede ser la SEQ ID NO:1 que comprende una o más mutaciones. Por ejemplo, S366A+^t 529M+A547F+N545R usó S366A+T529M+A547F como la polimerasa original, a continuación se añadió N545R.

En algunos modos de realización, la polimerasa modificada tiene una kquím que es mayor que la polimerasa original. En algunos modos de realización, la polimerasa modificada tiene una kdes que es menor que la polimerasa original. En algunos modos de realización, la polimerasa modificada tiene una kquím/kdes (es decir, una proporción) que es al menos 1,5, 2,0 o 2,5 veces mayor que la polimerasa original.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 ilustra un molde ejemplar usado en el ensayo de desplazamiento. Se hace referencia al ejemplo 3.

La FIG. 2 muestra un esquema del ensayo de kquím usado en el presente documento para medir la tasa de incorporación de polifosfatos. Se hace referencia al ejemplo 6.

La FIG. 3 es un resumen del ensayo de kdes basado en la extinción de fluorescencia usado en el presente documento para medir las propiedades cinéticas de las polimerasas variantes. Se hace referencia al ejemplo 4. La FIG.4 es una representación del ensayo de kdes basado en la polarización de fluorescencia y un trazado de datos ejemplar. Se hace referencia al ejemplo 5.

La FIG. 5 es un gráfico que muestra datos representativos del ensayo de desplazamiento para una polimerasa variante. Se hace referencia al ejemplo 3.

La FIG. 6 es un gráfico de datos representativos del ensayo de kdes basado en polarización de fluorescencia para dos polimerasas variantes. Se hace referencia al ejemplo 5.

La FIG. 7 es un trazado de una captura estática del nucleótido timina marcado a 100 mV por el complejo Pol6 (S366A+N535L+I652Q)-ADN acoplado al nanoporo de hemolisina alfa en Hepes 7,520 mM, NaCl 300 mM, CaCh 3 mM y TCEP 5 mM por encima y por debajo de la bicapa. El eje vertical es el % de corriente de canal abierto (normalizada) y el eje horizontal es el tiempo en segundos. Se hace referencia al ejemplo 8.

La FIG. 8 es un gráfico del tiempo de permanencia frente a la curva de corriente para un experimento de captura estática a 100 mV con el complejo Pol6 (S366A+N535L+I652Q)-ADN acoplado al nanoporo de hemolisina alfa en Hepes 20 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, CaCh 3 mM y TCEP 5 mM por encima y por debajo de la bicapa. El tiempo de permanencia promedio de cada captura de nucleótido marcado con dTNP es de 1,2 segundos. Se hace referencia al ejemplo 8.

La FIG. 9 es un gráfico de datos representativos de un ensayo de kquím basado en la extinción de fluorescencia (véase la FIG. 2) para una polimerasa variante. El complejo binario preformado de polimerasa y molde de ADN-fluoresceína se mezcla rápidamente con una concentración saturante de dCnP-Alexa555 en presencia de Mg2+ usando un dispositivo de flujo interrumpido Kintek. Se realiza un seguimiento de la fluorescencia de la fluoresceína en el tiempo. La kquím estimada a partir de la etapa limitante de la velocidad es de 0,2 s-1. El eje x es el tiempo (T) en segundos y el eje y son las unidades de fluorescencia relativa (UFR).

La FIG. 10 es un gráfico de los datos representativos de un ensayo de kdes basado en la extinción de fluorescencia (véase la FIG. 3) para una polimerasa variante. El complejo ternario preformado de polimerasa, molde de ADN-fluoresceína y dCnP-Alexa555 se preincubó en presencia de Ca2+ y se cazó con un exceso de dCTP natural. Se realizó un seguimiento de la fluorescencia de la fluoresceína en el tiempo. La kdes medida a partir de esto es de 0,028 s-1. El eje x es el tiempo (T) en segundos y el eje y son las unidades de fluorescencia relativa (UFR).

La FIG. 11 es una imagen de un gel que muestra los productos de amplificación de un ensayo de círculo rodante. Los carriles extremos izquierdo y derecho son escaleras moleculares. El segundo carril desde la izquierda es el punto de tiempo cero. Todos los demás carriles son el punto de tiempo de 40 minutos para los diversos resultados positivos de polimerasa. Se hace referencia al ejemplo 9.

La FIG. 12 es un trazado de secuenciación que muestra los cambios en la corriente que proporciona un registro de los nucleótidos marcados a medida que se incorporan en la hebra de ADN creciente. También se muestra la secuencia de ADN molde y la secuencia llamada de la hebra naciente que demuestra >70 % de exactitud (SEQ ID NO 6-8, respectivamente, en orden de aparición). Se hace referencia al ejemplo 10.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La invención se describirá ahora en detalle a modo de referencia usando solo las siguientes definiciones y ejemplos. A menos que se defina de otro modo en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLo Gy AND MOLECULAR BIOLOGY, 2.a ED., John Wiley and Sons, New York (1994), y Hale y Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos usados en la presente invención. Aunque cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento se puede usar en la práctica o pruebas de la presente invención, se describen los procedimientos y materiales preferentes. Los profesionales sanitarios se dirigen en particular a Sambrook et al., 1989, y Ausubel FM et al., 1993, para consultar definiciones y términos de la técnica. Se debe entender que la presente invención no está limitada a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos, ya que estos pueden variar.

Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. El término aproximadamente se usa en el presente documento para querer decir más o menos un diez por ciento (10 %) de un valor. Por ejemplo, "aproximadamente 100" se refiere a cualquier número entre 90 y 110.

A menos que se indique de otro modo, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en una orientación de 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en una orientación de amino a carboxilo, respectivamente.

Los títulos proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diversos aspectos o modos de realización de la invención que se pueden tener por referencia a la memoria descriptiva como un todo. En consecuencia, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen más completamente por referencia a la memoria descriptiva como un todo.

Definiciones

Aminoácido: como se usa en el presente documento, el término "aminoácido", en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que se puede incorporar en una cadena polipeptídica. En algunos modos de realización, un aminoácido tiene la estructura general H²N—C(H)(R)—COOH. En algunos modos de realización, un aminoácido es un aminoácido natural. En algunos modos de realización, el aminoácido es un aminoácido sintético; en algunos modos de realización, un aminoácido es un D-aminoácido; en algunos modos de realización, un aminoácido es un L-aminoácido. "Aminoácido estándar" se refiere a cualquiera de los veinte L-aminoácidos estándar encontrados comúnmente en péptidos naturales. "Aminoácido no estándar" se refiere a cualquier aminoácido, distinto de los aminoácidos estándar, independientemente de si se prepara sintéticamente o se obtiene de una fuente natural. Como se usa en el presente documento, "aminoácido sintético" engloba aminoácidos modificados químicamente, incluyendo pero sin limitarse a sales, derivados de aminoácidos (tales como amidas) y/o sustituciones. Los aminoácidos, incluyendo aminoácidos carboxi y/o aminoterminales en péptidos, se pueden modificar por metilación, amidación, acetilación y/o sustitución con otros grupos químicos sin afectar negativamente a su actividad. Los aminoácidos pueden participar en un enlace disulfuro. El término "aminoácido" se usa de manera intercambiable con "residuo aminoacídico" y se puede referir a un aminoácido libre y/o a un residuo aminoacídico de un péptido. Será evidente a partir del contexto en el que se usa el término si se refiere a un aminoácido libre o a un residuo de un péptido. Cabe destacar que todas las secuencias de residuos aminoacídicos se representan en el presente documento por fórmulas con una orientación izquierda y derecha que está en el sentido convencional del extremo amínico al extremo carboxílico.

Par de bases (pb): como se usa en el presente documento, par de bases se refiere a una asociación de adenina (A) con timina (T), o de citosina (C) con guanina (G) en una molécula de ADN bicatenario.

Complementario: como se usa en el presente documento, el término "complementario" se refiere al concepto amplio de complementariedad de secuencia entre regiones de dos hebras polinucleotídicas o entre dos nucleótidos a través de emparejamiento de bases. Es conocido que un nucleótido adenina puede formar enlaces de hidrógeno específicos ("emparejamiento de bases") con un nucleótido que sea timina o uracilo. De forma similar, es conocido que un nucleótido citosina puede realizar emparejamiento de bases con un nucleótido guanina.

Afinidad de unión a ADN: como se usa en el presente documento, el término "afinidad de unión a ADN" típicamente se refiere a la actividad de una ADN polimerasa en la unión al ácido nucleico ADN. En algunos modos de realización, la actividad de unión a ADN se puede medir en un ensayo de desplazamiento de dos bandas. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) en 9,63-9,75 (que describe el marcaje terminal de ácidos nucleicos). Se prepara una mezcla de reacción que contiene al menos aproximadamente 0,5 pg del polipéptido en aproximadamente 10 pl de tampón de unión (tampón fosfato de sodio 50 mM (pH 8,0), glicerol al 10 %, KCl 25 mM, MgCb 25 mM). Se calienta la mezcla de reacción a 37 °C durante 10 min. Se añade aproximadamente de 1*104 a 5*104 cpm (o aproximadamente 0,5-2 ng) de ácido nucleico bicatenario marcado a la mezcla de reacción y se incuba durante 10 min adicionales. Se carga la mezcla de reacción en un gel de poliacrilamida natural en tampón tris-borato 0,5*. Se somete la mezcla de reacción a electroforesis a temperatura ambiente. Se seca el gel y se somete a autorradiografía usando procedimientos estándar. Cualquier disminución detectable en la movilidad del ácido nucleico bicatenario marcado indica la formación de un complejo de unión entre el polipéptido y el ácido nucleico bicatenario. Dicha actividad de unión a ácido nucleico se puede cuantificar usando procedimientos densitométricos estándar para medir la cantidad de radioactividad en el complejo de unión en relación con la cantidad total de radioactividad en la mezcla de reacción inicial. Otros procedimientos de medición de afinidad de unión a ADN son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Kong et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(3):1965-1975).

Tasa de alargamiento: como se usa en el presente documento, el término "tasa de alargamiento" se refiere a la tasa promedio a la que una ADN polimerasa extiende una cadena de polímero. Como se usa en el presente documento, una alta tasa de alargamiento se refiere a una tasa de alargamiento mayor de 2 nt/s (por ejemplo, mayor de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140 nt/s). Como se usa en la presente solicitud, los términos "tasa de alargamiento", "tasa de extensión" y "tasa de incorporación" se usan de manera intercambiable.

Actividad enzimática: como se usa en el presente documento, el término "actividad enzimática" se refiere a la especificidad y eficacia de una ADN polimerasa. La actividad enzimática de una ADN polimerasa también se denomina "actividad polimerasa", lo que se refiere típicamente a la actividad de una ADN polimerasa al catalizar la síntesis dirigida a molde de un polinucleótido. Se puede medir la actividad enzimática de una polimerasa usando diversas técnicas y procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar diluciones en serie de polimerasa en tampón de dilución (por ejemplo, Tris.Cl 20 mM, pH 8,0, KCl 50 mM, NP 40 al 0,5 % y Tween-20 al 0,5 %). Para cada dilución, se pueden retirar 5 pl y añadirse a 45 pl de una mezcla de reacción que contiene TAPS 25 mM (pH 9,25), KCl 50 mM, MgCh 2 mM, dATP 0,2 mM, dGTP 0,2 mM, dTTP 0,2 mM, dCTP 0,1 mM, 12,5 pg de ADN activado, [a-32P]dCTP 100 pM (0,05 pCi/nmol) y agua desionizada estéril. Se pueden incubar las mezclas de reacción a 37 °C (o 74 °C para ADN polimerasas termoestables) durante 10 minutos y a continuación detenerse enfriando de inmediato la reacción a 4 °C y añadiendo 10 pl de EDTA 60 mM helado. Se puede retirar una alícuota de 25 pl de cada mezcla de reacción. Se puede retirar dCTP marcado radioactivamente no incorporado de cada alícuota por filtración en gel (Centri-Sep, Princeton Separations, Adelphia, N.J.). Se puede mezclar el eluido de columna con líquido de centelleo (1 ml). Se cuantifica la radioactividad en el eluido de columna con un contador de centelleo para determinar la cantidad de producto sintetizado por la polimerasa. Una unidad de actividad polimerasa se puede definir como la cantidad de polimerasa necesaria para sintetizar 10 nmol de producto en 30 minutos (Lawyer et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:6427-647). Otros procedimientos de medición de la actividad polimerasa son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)).

Purificado: como se usa en el presente documento, "purificado" significa que una molécula está presente en una muestra a una concentración de al menos un 90 % en peso, o al menos un 95 % en peso, o al menos un 98 % en peso de la muestra en la que está contenida.

Aislado: una molécula "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se separa de al menos otra molécula con la que se asocia normalmente, por ejemplo, en su entorno natural. Una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que expresan habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.

% de homología: el término "% de homología" se usa de manera intercambiable en el presente documento con el término "% de identidad" en el presente documento y se refiere al nivel de identidad de secuencia de ácido nucleico o aminoácidos entre la secuencia de ácido nucleico que codifica uno cualquiera de los polipéptidos según la invención o la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la invención, cuando se alinea usando un programa de alineación de secuencias.

Por ejemplo, como se usa en el presente documento, un 80 % de homología quiere decir lo mismo que un 80 % de identidad de secuencia determinada por un algoritmo definido y, en consecuencia, un homólogo de una secuencia dada tiene más de un 80 % de identidad de secuencia en una longitud de la secuencia dada. Los niveles ejemplares de identidad de secuencia incluyen, pero no se limitan a, 80, 85, 90, 95, 98 % o más de identidad de secuencia para una secuencia dada, por ejemplo, la secuencia codificante para uno cualquiera de los polipéptidos según la invención, como se describe en el presente documento.

Los programas informáticos ejemplares que se pueden usar para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas BLAST, por ejemplo, BLASTN, BLASTX y TBLASTX, BLASTP y TBLASTN, disponibles públicamente en Internet. Véanse también, Altschul, et al., 1990 y Altschul, et al., 1997.

Las búsquedas de secuencias se llevan a cabo típicamente usando el programa BLASTN cuando se evalúa una secuencia de ácido nucleico dada relativa a las secuencias de ácido nucleico en las secuencias de ADN de GenBank y otras bases de datos públicas. El programa BLASTX es preferente para buscar secuencias de ácido nucleico que se han traducido en todos los marcos de lectura frente a secuencias de aminoácidos en las secuencias de proteínas de GenBank y otras bases de datos públicas. Tanto BLASTN como BLASTX se ejecutan usando parámetros predeterminados de una penalización por hueco abierto de 11,0 y una penalización por hueco extendido de 1,0, y utilizan la matriz BLOSUM-62. (Véase, por ejemplo, Altschul, S. F., et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997).

Se realiza una alineación preferente de secuencias seleccionadas para determinar el "% de identidad" entre dos o más secuencias, usando por ejemplo, el programa CLUSTAL-W en MacVector versión 13.0.7, operado con parámetros predeterminados, incluyendo una penalización por hueco abierto de 10,0, una penalización por hueco extendido de 0,1 y una matriz de similitud BL^o S^u M 30.

ADN polimerasa modificada: como se usa en el presente documento, el término "ADN polimerasa modificada" se refiere a una ADN polimerasa originada a partir de otra ADN polimerasa (es decir, original) y contiene una o más alteraciones de aminoácidos (por ejemplo, sustitución, deleción o inserción de aminoácidos) en comparación con la ADN polimerasa original. En algunos modos de realización, una ADN polimerasa modificada de la invención se origina o modifica a partir de una ADN polimerasa natural. En algunos modos de realización, una ADN polimerasa modificada de la invención se origina o modifica a partir de una ADN polimerasa recombinante o genomanipulada que incluye, pero sin limitarse a, ADN polimerasa quimérica, ADN polimerasa de fusión u otra ADN polimerasa modificada. Típicamente, una ADN polimerasa modificada tiene al menos un fenotipo cambiado en comparación con la polimerasa original.

Mutación: como se usa en el presente documento, el término "mutación" se refiere a un cambio introducido en una secuencia original incluyendo, pero sin limitarse a, sustituciones, inserciones, deleciones (incluyendo truncamientos). Las consecuencias de una mutación incluyen, pero no se limitan a, la creación de un nuevo carácter, propiedad, función, fenotipo o rasgo no encontrado en la proteína codificada por la secuencia original. Mutante: como se usa en el presente documento, el término "mutante" se refiere a una proteína modificada que muestra características alteradas cuando se compara con la proteína original. Los términos "variante" y "mutante" se usan de manera intercambiable en el presente documento.

Natural: como se usa en el presente documento, el término "natural" se refiere a un gen o producto génico que tiene las características de ese gen o producto génico cuando se aísla de una fuente natural.

Fidelidad: como se usa en el presente documento, el término "fidelidad" se refiere a la exactitud de la polimerización de ADN por ADN polimerasa dependiente de molde o bien la diferencia medida en la kdes del nucleótido correcto frente a la unión de nucleótido incorrecto al ADN molde. La fidelidad de una ADN polimerasa se mide típicamente por la tasa de error (la frecuencia de incorporar un nucleótido inexacto, es decir, un nucleótido que no se incorpora de una manera dependiente de molde). La exactitud o fidelidad de la polimerización de ADN se mantiene tanto para la actividad polimerasa como para la actividad 3'-5' exonucleasa de una ADN polimerasa. El término "alta fidelidad" se refiere a una tasa de error menor de 4,45*10'6 (por ejemplo, menor que 4,0*10'6, 3,5*10'6, 3,0*10-6, 2,5*10-6, 2,0*10-6, 1,5*10'6, 1,0*10'6, 0,5*10'6) mutaciones/nt/duplicación. La fidelidad o tasa de error de una ADN polimerasa se puede medir usando ensayos conocidos para la técnica. Por ejemplo, se pueden someter a prueba las tasas de error de las ADN polimerasas como se describe en el presente documento o como se describe en Johnson, et al., Biochim Biophys Acta, mayo 2010; 1804(5): 1041-1048.

Nanoporo: el término "nanoporo", como se usa en el presente documento, se refiere en general a un poro, canal o paso formado o proporcionado de otro modo en una membrana. Una membrana puede ser una membrana orgánica, tal como una bicapa lipídica, o una membrana sintética, tal como una membrana formada de un material polimérico. La membrana puede ser un material polimérico. El nanoporo se puede disponer adyacente o próximo a un circuito sensor o un electrodo acoplado a un circuito sensor, tal como, por ejemplo, un semiconductor de óxido metálico complementario (CMOS) o circuito de transistor de efecto de campo (FET). En algunos ejemplos, un nanoporo tiene un ancho o diámetro característico del orden de 0,1 nanómetros (nm) a aproximadamente 1000 nm. Algunos nanoporos son proteínas. La hemolisina alfa, la MspA son ejemplos de un nanoporo proteico.

Nucleótido: como se usa en el presente documento, una unidad monomérica de ADN o ARN que consiste en un resto glucídico (pentosa), un fosfato y una base heterocíclica nitrogenada. La base se une al resto glucídico por el carbono glucosídico (carbono 1' de la pentosa) y esa combinación de base y glúcido es un nucleósido. Cuando el nucleósido contiene un grupo fosfato enlazado a la posición 3' o 5' de la pentosa se denomina nucleótido. Una secuencia de nucleótidos unidos de forma funcional se denomina típicamente en el presente documento "secuencia de bases" o "secuencia de nucleótidos," y se representa en el presente documento por una fórmula con una orientación de izquierda a derecha que está en el sentido convencional del extremo 5' al extremo 3'. Como se usa en el presente documento, un "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido polifosfato, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 fosfatos.

Oligonucleótido o polinucleótido: como se usa en el presente documento, el término "oligonucleótido" se define como una molécula que incluye dos o más desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos, preferentemente más de tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos factores, que a su vez dependen de la función definitiva o el uso del oligonucleótido. El oligonucleótido se puede derivar sintéticamente o por clonación. Como se usa en el presente documento, el término "polinucleótido" se refiere a una molécula de polímero compuesta de monómeros nucleotídicos enlazados de forma covalente en una cadena. ADN (ácido desoxirribonucleico) y ARN (ácido ribonucleico) son ejemplos de polinucleótidos.

Polimerasa: como se usa en el presente documento, una "polimerasa" se refiere a una enzima que cataliza la polimerización de nucleótidos (es decir, la actividad polimerasa). En general, la enzima iniciará la síntesis en el extremo 3' del cebador hibridado a una secuencia molde de polinucleótido, y avanzará hacia el extremo 5' de la hebra molde. Una "ADN polimerasa" cataliza la polimerización de desoxinucleótidos.

Cebador: como se usa en el presente documento, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido, ya sea natural o producido sintéticamente, que puede actuar como un punto de inicio de la síntesis de ácido nucleico cuando se dispone en condiciones en las que la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario a una hebra de ácido nucleico se induce, por ejemplo, en presencia de cuatro nucleótidos trifosfatos diferentes y enzima termoestable en un tampón apropiado ("tampón" incluye pH, fuerza iónica, cofactores, etc.) y a una temperatura adecuada. El cebador es preferentemente monocatenario para eficacia máxima en la amplificación, pero puede ser de forma alternativa bicatenario. Si es bicatenario, en primer lugar se trata el cebador para separar sus hebras antes de usarse para preparar productos de extensión. Preferentemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de los productos de extensión en presencia de la enzima termoestable. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, incluyendo temperatura, fuente de cebador y uso del procedimiento. Por ejemplo, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, el cebador oligonucleotídico contiene típicamente 15-25 nucleótidos, aunque puede contener más o menos nucleótidos. En general, las moléculas cebadoras cortas requieren temperaturas más bajas para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde.

Procesividad: como se usa en el presente documento, "procesividad" se refiere a la capacidad de una polimerasa para mantenerse unida al molde y realizar múltiples reacciones de modificación. Las "reacciones de modificación" incluyen pero no se limitan a polimerización y escisión exonucleolítica. En algunos modos de realización, "procesividad" se refiere a la capacidad de una ADN polimerasa para realizar una secuencia de etapas de polimerización sin disociación intermedia de la enzima de las cadenas de ADN crecientes. Típicamente, la "procesividad" de una ADN polimerasa se mide por la longitud de nucleótidos (por ejemplo 20 nts, 300 nts, 0,5-1 kb, o más) que se polimerizan o se modifican sin disociación intermedia de la a Dn polimerasa de la cadena de ADN creciente. La "procesividad" puede depender de la naturaleza de la polimerasa, la secuencia de un molde de ADN, y condiciones de reacción, por ejemplo, concentración de sal, temperatura o presencia de proteínas específicas. Como se usa en el presente documento, el término "alta procesividad" se refiere a una procesividad mayor a 20 nts (por ejemplo, mayor a 40 nts, 60 nts, 80 nts, 100 nts, 120 nts, 140 nts, 160 nts, 180 nts, 200 nts, 220 nts, 240 nts, 260 nts, 280 nts, 300 nts, 320 nts, 340 nts, 360 nts, 380 nts, 400 nts o más) por asociación/disociación con el molde. La procesividad se puede medir de acuerdo con los procedimientos definidos en el presente documento y en el documento WO 01/92501 A1 (MJ Bioworks, Inc., Improved Nucleic Acid Modifying Enzymes, publicado el 6 de diciembre de 2001).

Síntesis: como se usa en el presente documento, el término "síntesis" se refiere a cualquier procedimiento in vitro para preparar una nueva hebra de polinucleótido o alargar el polinucleótido existente (es decir, ADN o ARN) de una manera dependiente de molde. La síntesis, de acuerdo con la invención, incluye amplificación, lo que incrementa el número de copias de una secuencia de molde de polinucleótido con el uso de una polimerasa. La síntesis de polinucleótidos (por ejemplo, amplificación) da como resultado la incorporación de nucleótidos en un polinucleótido (es decir, un cebador) formando de este modo una nueva molécula de polinucleótido complementaria al molde de polinucleótido. La molécula de polinucleótido formada y su molde se pueden usar como moldes para sintetizar moléculas de polinucleótidos adicionales. "Síntesis de ADN," como se usa en el presente documento, incluye, pero no se limita a, PCR, el marcaje de polinucleótido (es decir, para sondas y cebadores oligonucleotídicos), secuenciación de polinucleótidos.

Molécula de ADN molde: como se usa en el presente documento, el término "molécula de ADN molde" se refiere a una hebra de un ácido nucleico a partir de la que se sintetiza una hebra de ácido nucleico complementaria por una ADN polimerasa, por ejemplo, en una reacción de extensión de cebador.

Manera dependiente de molde: como se usa en el presente documento, el término "manera dependiente de molde" se refiere a un procedimiento que implica la extensión dependiente de molde de una molécula cebadora (por ejemplo, síntesis de ^a Dⁿ por ADN polimerasa). El término "manera dependiente de molde" se refiere típicamente a la síntesis de polinucleótidos de ARN o ADN en la que la secuencia de la hebra de polinucleótido recién sintetizada se dicta por las normas bien conocidas del emparejamiento de bases complementarias (véase, por ejemplo, Watson, J. D. et al., en: Molecular Biology of the Gene, 4.a ed., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif. (1987)).

Marca: como se usa en el presente documento, el término "marca" se refiere a un resto detectable que puede ser átomos o moléculas, o una colección de átomos o moléculas. Una marca puede proporcionar una firma óptica, electroquímica, magnética o electrostática (por ejemplo, inductiva, capacitiva), firma que se puede detectar con la ayuda de un nanoporo.

Nucleótido marcado: como se usa en el presente documento, el término "nucleótido marcado" se refiere a un nucleótido o nucleótido modificado que tiene una marca unida. La marca se puede unir de forma covalente al azúcar, el fosfato (o polifosfato) o base. La marca puede estar en el fosfato terminal.

Vector: como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para la transferencia entre diferentes células huésped. Un "vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar y expresar fragmentos de ADN heterólogos en una célula exógena. Muchos vectores de expresión procariotas y eucariotas están disponibles comercialmente. La selección de vectores de expresión apropiados está dentro del conocimiento de los expertos en la técnica.

Las variantes de polimerasa proporcionadas en el presente documento son útiles en la secuenciación de polinucleótidos basada en chip como se describe en el documento WO2013/188841 (Genia Technologies, Inc., Chip Set-Up and High-Accuracy Nucleic Acid Sequencing, publicado el 19 de diciembre de 2013).

Las características deseadas de una polimerasa que encuentra uso en la secuenciación del ADN son:

a. kdis lenta (para nucleótido modificado)

b. kaso rápida (para nucleótido modificado)

c. Alta fidelidad

d. Baja actividad de exonucleasa

e. Desplazamiento de la hebra de ADN

f. kquím más rápida (para sustratos de nucleótidos modificados)

g. Estabilidad incrementada

h. Procesividad

i. Tolerancia a la sal

j. Compatible con unión a nanoporo

k. Capacidad para incorporar un polifosfato que tenga 4, 5, 6, 7 u 8 fosfatos, por ejemplo, nucleótido cuadrafosfato, pentafosfato, hexafosfato, heptafosfato u octofosfato

l. Exactitud de secuenciación

m. Longitudes de lectura largas, es decir, lecturas continuas largas.

Nomenclatura

En la presente descripción y reivindicaciones, se usan los códigos de una letra y tres letras convencionales para los residuos aminoacídicos.

Para facilidad de referencia, las variantes de polimerasa de la solicitud se describen por el uso de la siguiente nomenclatura:

Aminoácido(s) original(es): posición/posiciones: aminoácido(s) sustituido(s). De acuerdo con esta nomenclatura, por ejemplo, la sustitución de serina por una alanina en la posición 242 se muestra como:

Ser242Ala o S242A

Las mutaciones múltiples se separan por signos de más, es decir:

Ala30Asp+Glu34Ser o A30N+E34S

representando mutaciones en las posiciones 30 y 34 sustituyendo alanina y ácido glutámico por asparagina y serina, respectivamente.

Cuando uno o más residuos aminoacídicos alternativos se pueden insertar en una posición dada, se indica como: A30N/E o A30N o A30E.

A menos que se exprese de otro modo, el número de residuos corresponde a la numeración de residuos de SEQ ID NO:2.

Mutagénesis de la polimerasa dirigida a sitio

En el presente documento se proporcionan las secuencias naturales de fago de Clostridium phiCPV4 (SEQ ID NO:3, región codificante de ácido nucleico más una marca His; SEQ ID NO:1, región codificante de proteína) y están disponibles en otros lugares (National Center for Bioinformatics o GenBank con números de acceso AFH27113).

Se pueden introducir mutaciones puntuales usando el kit QuikChange Lightning 2 (Stategene/Agilent) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se pueden encargar los cebadores a empresas comerciales, por ejemplo, IDT DNA.

Ensamblaje e inserción de nanoporos

Los procedimientos descritos en el presente documento pueden usar un nanoporo que tiene una polimerasa unida al nanoporo. En algunos casos, es deseable tener una y solo una polimerasa por nanoporo (por ejemplo, de modo que solo se secuencia una molécula de ácido nucleico en cada nanoporo). Sin embargo, muchos nanoporos, incluyendo, por ejemplo, hemolisina alfa (aHL), pueden ser proteínas multiméricas que tienen una pluralidad de subunidades (por ejemplo, 7 subunidades para aHL). Las subunidades pueden ser copias idénticas del mismo polipéptido. En el presente documento se proporcionan proteínas multiméricas (por ejemplo, nanoporos) que tienen una proporción definida de subunidades modificadas (por ejemplo, variantes de a-HL) con respecto a subunidades no modificadas (por ejemplo, a-HL). En el presente documento también se proporcionan procedimientos para producir proteínas multiméricas (por ejemplo, nanoporos) que tienen una proporción definida de subunidades modificadas con respecto a subunidades no modificadas.

Con referencia a la figura 27 del documento WO2014/074727 (Genia Technologies, Inc.), un procedimiento para ensamblar una proteína que tiene una pluralidad de subunidades comprende proporcionar una pluralidad de primeras subunidades 2705 y proporcionar una pluralidad de segundas subunidades 2710, donde las segundas subunidades se modifican en comparación con las primeras subunidades. En algunos casos, las primeras subunidades son naturales (por ejemplo, purificadas de fuentes naturales o producidas de forma recombinante). Las segundas subunidades se pueden modificar de cualquier forma adecuada. En algunos casos, las segundas subunidades tienen una proteína (por ejemplo, una polimerasa) unida (por ejemplo, como una proteína de fusión).

Las subunidades modificadas pueden comprender un resto químicamente reactivo (por ejemplo, una acida o un grupo alquino adecuado para formar un enlace). En algunos casos, el procedimiento comprende además realizar una reacción (por ejemplo, una cicloadición química Click) para unir una entidad (por ejemplo, una polimerasa) al resto químicamente reactivo.

El procedimiento puede comprender además poner en contacto las primeras subunidades con las segundas subunidades 2715 en una primera proporción para formar una pluralidad de proteínas 2720 que tienen las primeras subunidades y las segundas subunidades. Por ejemplo, una parte de las subunidades de aHL modificadas que tienen un grupo reactivo adecuado para unir una polimerasa se puede mezclar con seis partes de subunidades de aHL naturales (es decir, siendo la primera proporción 1:6). La pluralidad de proteínas puede tener una pluralidad de proporciones de las primeras subunidades con respecto a las segundas subunidades. Por ejemplo, las subunidades mixtas pueden formar varios nanoporos que tienen una distribución de estequiometrías de subunidades modificadas con respecto a no modificadas (por ejemplo, 1:6, 2:5, 3:4).

En algunos casos, las proteínas se forman simplemente mezclando las subunidades. En el caso de nanoporos de aHL, por ejemplo, un detergente (por ejemplo, ácido desoxicólico) puede provocar que el monómero de aHL adopte la conformación de poro. Los nanoporos también se pueden formar usando un lípido (por ejemplo, 1,2-difitanoil-snglicero-3-fosfocolina (DPhPC) o 1,2-di-O-fitanil-sn-glicero-3-fosfocolina (DoPhPC)) y temperatura moderada (por ejemplo, menos de aproximadamente 100 °C). En algunos casos, mezclar DPhPC con una solución tampón crea grandes vesículas multilaminares (LMV), y añadir subunidades de aHL a esta solución e incubar la mezcla a 40 °C durante 30 minutos da como resultado la formación de poro.

Si se usan dos tipos diferentes de subunidades (por ejemplo, la proteína natural y un segundo monómero de aHL que puede contener una única mutación puntual), las proteínas resultantes pueden tener una estequiometría mixta (por ejemplo, proteínas naturales y mutantes). La estequiometría de estas proteínas puede seguir una fórmula que es dependiente de la proporción de las concentraciones de las dos proteínas usadas en la reacción de formación de poros. Esta fórmula es como sigue:

100 Pm= 100[n!/m!(n-m)!] ■ fmutm ■ fwtñm, donde

Pm = probabilidad de que un poro tenga un número m de subunidades mutantes

n = número total de subunidades (por ejemplo, 7 para aHL)

m = número de subunidades "mutantes"

fmut = fracción o proporción de subunidades mutantes mezcladas entre sí

fwt = fracción o proporción de subunidades naturales mezcladas entre sí

El procedimiento puede comprender además fraccionar la pluralidad de proteínas para enriquecer proteínas que tienen una segunda proporción de las primeras subunidades con respecto a las segundas subunidades 2725. Por ejemplo, se pueden aislar proteínas de nanoporo que tienen una y solo una subunidad modificada (por ejemplo, una segunda proporción de 1:6). Sin embargo, cualquier segunda proporción es adecuada. También se puede fraccionar una distribución de segundas proporciones, tal como enriquecer proteínas que tienen una o bien dos subunidades modificadas. El número total de subunidades que forman la proteína no siempre es 7 (por ejemplo, se puede usar un nanoporo diferente o se puede formar un nanoporo de hemolisina alfa que tiene seis subunidades) como se representa en la figura 27 del documento WO2014/074727. En algunos casos, se enriquecen las proteínas que tienen solo una subunidad modificada. En dichos casos, la segunda proporción es 1 segunda subunidad por (n-1) primeras subunidades donde n es el número de subunidades que comprenden la proteína.

La primera proporción puede ser la misma que la segunda proporción, sin embargo, esto no se requiere. En algunos casos, las proteínas que tienen monómeros mutados se pueden formar menos eficazmente que las que no tienen subunidades mutadas. Si este es el caso, la primera proporción puede ser mayor que la segunda proporción (por ejemplo, si se desea una segunda proporción de 1 subunidad mutada con respecto a 6 no mutadas en un nanoporo, formar un número adecuado de 1:6 proteínas puede requerir mezclar las subunidades en una proporción mayor que 1:6).

Las proteínas que tienen segundas proporciones de subunidades diferentes se pueden comportar de manera diferente (por ejemplo, tener diferentes tiempos de retención) en una separación. En algunos casos, las proteínas se fraccionan usando cromatografía, tal como cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de afinidad. Puesto que las primeras y segundas subunidades pueden ser idénticas aparte de la modificación, el número de modificaciones en la proteína puede servir como base para la separación. En algunos casos, las primera o bien segunda subunidades tienen una marca de purificación (por ejemplo, además de la modificación) para permitir o mejorar la eficacia del fraccionamiento. En algunos casos, se usa una marca polihistidina (marca His), una marca estreptavidina (marca Strep) u otra marca peptídica. En algunos casos, las primera y segunda subunidades comprenden cada una diferentes marcas y la etapa de fraccionamiento fracciona en base a cada marca. En el caso de una marca His, se crea una carga en la marca a pH bajo (los residuos de histidina se cargan positivamente por debajo del pKa de la cadena lateral). Con una diferencia significativa de carga en una de las moléculas de aHL en comparación con las otras, se puede usar cromatografía de intercambio iónico para separar los oligómeros que tienen 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de las subunidades de aHL "marcadas con carga". En principio, esta marca de carga puede ser una cadena de cualquier aminoácido que porte una carga uniforme. La figura 28 y figura 29 muestran ejemplos de fraccionamiento de nanoporos en base a una marca His. La figura 28 muestra una curva de absorbancia ultravioleta a 280 nanómetros, absorbancia ultravioleta a 260 nanómetros y conductividad. Los picos corresponden a nanoporos con diversas proporciones de subunidades modificadas y no modificadas. La figura 29 del documento WO2014/074727 muestra el fraccionamiento de nanoporos de aHL y mutantes de los mismos usando tanto marca His como marcas Strep.

En algunos casos, una entidad (por ejemplo, una polimerasa) se une a la proteína después del fraccionamiento. La proteína puede ser un nanoporo y la entidad puede ser una polimerasa. En algunos casos, el procedimiento comprende además insertar las proteínas que tienen las segundas subunidades de proporción en una bicapa.

En algunas situaciones, un nanoporo puede comprender una pluralidad de subunidades. Se puede unir una polimerasa a una de las subunidades y al menos una y menos que todas las subunidades comprenden una primera marca de purificación. En algunos ejemplos, el nanoporo es hemolisina alfa o una variante de la misma. En algunos casos, todas las subunidades comprenden una primera marca de purificación o una segunda marca de purificación. La primera marca de purificación puede ser una marca polihistidina (por ejemplo, en la subunidad que tiene la polimerasa unida).

Polimerasa unida a nanoporo

En algunos casos, una polimerasa (por ejemplo, ADN polimerasa) se une y/o se localiza próxima al nanoporo. La polimerasa se puede unir al nanoporo antes o después de que el nanoporo se incorpore en la membrana. En algunos casos, el nanoporo y la polimerasa son una proteína de fusión (es decir, una única cadena polipeptídica). La polimerasa se puede unir al nanoporo de cualquier forma adecuada. En algunos casos, la polimerasa se une al monómero proteico de nanoporo (por ejemplo, hemolisina) y a continuación se ensambla el heptámero de nanoporo completo (por ejemplo, en una proporción de un monómero con una polimerasa unida con respecto a 6 monómeros de nanoporo (por ejemplo, hemolisina) sin una polimerasa unida). El heptámero de nanoporo se puede insertar a continuación en la membrana.

Otro procedimiento para unir una polimerasa a un nanoporo implica unir una molécula conectora a un monómero de hemolisina o mutar un monómero de hemolisina para tener un sitio de unión y a continuación ensamblar el heptámero de nanoporo completo (por ejemplo, en una proporción de un monómero con conector y/o sitio de unión con respecto a 6 monómeros de hemolisina sin conector y/o sitio de unión). A continuación se puede unir una polimerasa al sitio de unión o conector de unión (por ejemplo, en bloque, antes de insertarlo en la membrana). La polimerasa también se puede unir al sitio de unión o conector de unión después de que el nanoporo (por ejemplo, heptámero) se forme en la membrana. En algunos casos, se inserta una pluralidad de pares nanoporo-polimerasa en una pluralidad de membranas (por ejemplo, dispuestas sobre los pocillos y/o electrodos) del biochip. En algunos casos, la unión de la polimerasa al complejo de nanoporo se produce en el biochip encima de cada electrodo.

La polimerasa se puede unir al nanoporo con cualquier química adecuada (por ejemplo, enlace covalente y/o conector). En algunos casos, la polimerasa se une al nanoporo con grapas moleculares. En algunos casos, las grapas moleculares comprenden tres secuencias de aminoácidos (indicados como conectores A, B y C). El conector A se puede extender desde un monómero de hemolisina, el conector B se puede extender desde la polimerasa, y el conector C puede unir a continuación los conectores A y B (por ejemplo, envolviendo ambos conectores A y B) y por tanto, la polimerasa al nanoporo. El conector C también se puede construir para formar parte del conector A o conector B, reduciendo por tanto el número de moléculas conectoras.

En algunos casos, la polimerasa se une al nanoporo usando la química Solulink™. Solulink™ puede ser una reacción entre HyNic (ácido 6-hidracino-nicotínico, una hidracina aromática) y 4FB (4-formilbenzoato, un aldehído aromático). En algunos casos, la polimerasa se une al nanoporo usando la química Click (disponible en Life Technologies, por ejemplo). En algunos casos, se introducen mutaciones de dedos de cinc en la molécula de hemolisina y a continuación se usa una molécula (por ejemplo, una molécula intermedia de ADN) para unir la polimerasa a los sitios de dedos de cinc en la hemolisina.

Otros conectores que pueden ser útiles en la unión de la polimerasa a un nanoporo son el enlace genético directo (por ejemplo, el conector de aminoácidos (GGGGS)1-3 (SEQ ID NO: 4)), el enlace mediado por transglutaminasa (por ejemplo, RSKLG (SEQ ID NO: 5)), el enlace mediado por sortasa y enlace químico a través de modificaciones de cisteína. Los conectores específicos contemplados como útiles en el presente documento son (GGGGS)1-3 (SEQ ID NO: 4), marca K (RSKLG (SEQ ID NO: 5)) en el extremo N, sitio ATEV (12-25), sitio ATEV extremo N de SpyCatcher (12-49).

Configuración del aparato

El nanoporo se puede formar o incluirse de otro modo en una membrana dispuesta adyacente a un electrodo sensor de un circuito sensor, tal como un circuito integrado. El circuito integrado puede ser un circuito integrado específico de la aplicación (ASIC). En algunos ejemplos, el circuito integrado es un transistor de efecto de campo o un semiconductor de óxido metálico complementario (CMOS). El circuito sensor puede estar situado en un chip u otro dispositivo que tenga el nanoporo, o fuera del chip o dispositivo, tal como en una configuración fuera de chip. El semiconductor puede ser cualquier semiconductor, incluyendo, sin limitación, los semiconductores del grupo IV (por ejemplo, silicio) y grupo III-V (por ejemplo, arseniuro de galio). Véase, por ejemplo, el documento WO 2013/123450, para la configuración del aparato y dispositivo para detectar un nucleótido o marca.

Se pueden usar sensores basados en poros (por ejemplo, biochips) para consulta electrónica de moléculas individuales. Un sensor basado en poros puede incluir un nanoporo de la presente divulgación formado en una membrana que se dispone adyacente o próxima a un electrodo sensor. El sensor puede incluir un contraelectrodo. La membrana incluye un lado trans (es decir, un lado orientado hacia el electrodo sensor) y un lado cis (es decir, un lado orientado hacia el contraelectrodo).

En la divulgación experimental que sigue, se aplican las siguientes abreviaturas: eq (equivalentes); M (Molar); pM (micromolar); N (normal); mol (moles); mmol (milimoles); pmol (micromoles); nmol (nanomoles); g (gramos); mg (miligramos); kg (kilogramos); pg (microgramos); l (litros); ml (mililitros); pl (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); pm (micrómetros); nm (nanómetros); °C (grados centígrados); h (horas); min (minutos); s (segundos); ms (milisegundos).

EJEMPLOS

Las figuras adjuntas se deben considerar como partes integrales de la memoria descriptiva y la descripción de la invención. Todas las referencias citadas se incorporan específicamente en el presente documento por referencia para todo lo que se describe en el mismo. Se ofrecen los siguientes ejemplos para ilustrar, pero no para limitar la invención reivindicada.

Ejemplo 1

Mutagénesis dirigida

Este ejemplo ilustra la introducción de una mutación en una polimerasa pol6 en una posición deseada.

El ADN que codifica la pol6 natural marcada con His se adquirió de una fuente comercial (DNA 2.0, Menlo Park, California). Se verificó la secuencia por secuenciación.

Para el cribado de mutantes, se expresó la polimerasa tal cual (N-ter His-Pol6). Para someter a prueba los resultados positivos de pol en el chip, se genomanipuló en un dominio de SpyCatcher en el extremo N o extremo C de Pol6.

Las posiciones racionales para afectar a la unión de Pol6-nucleótido se identificaron en base a modelos de homología de estructuras cristalinas conocidas.

Para el cribado principal, cada una de las posiciones racionales se mutaron en Gly, Ala, Leu, Glu, Gln, Lys, His, Tyr, Pro, Trp, Thr o Met usando el protocolo de mutagénesis Q5.

Los cebadores para cada reacción de mutagénesis se diseñaron usando el protocolo de NEBaseChanger y se encargaron en formato de placa de 96 pocillos de IDT.

Los cebadores directo e inverso se fosforilaron en 5' en formato de alto rendimiento (HTP) usando la polinucleotidocinasa (PNK) T4 adquirida en NEB. Una reacción típica de 25 pl contenía 15 pl de cebador a 10 pM, 5 pl de tampón de reacción 5X (de NEB), 1,25 pl de enzima PNK, 3,75 pl de agua. Se realizó la reacción a 37 °C durante 30 min y se termoinactivó la enzima a 65 °C durante 20 min.

Se realizó la mutagénesis por PCR usando ADN polimerasa Q5 de NEB. Una reacción típica de 25 pl contenía 5 pl de tampón Q5, 5 pl de potenciador de GC, 0,5 pl de dNTP 10 mM, 1,25 pl de cebadores directo e inverso de mutagénesis fosforilada 10 pM, 0,25 pl de polimerasa Q5 y 1 pl de 5 ng/ml de molde de Pol6 natural, es decir, His-Pol6, y 10,75 pl de H²O.

Una vez que se completa la PCR, se añadieron 0,5 pl de Dpn1 a 25 pl de la mezcla de PCR y se incubó a 37 °C durante 1 h.

Añadir 2,5 pl de producto de PCR tratado con Dpn1 con 2,5 pl de Blunt/TA Ligase Master Mix. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.

Añadir 1 pl de mezcla de fijación a 20 ul de células BL21DE3 en 96 pocillos (EMD Millipore) e incubar en hielo durante 5 min.

Choque térmico a 42 °C durante exactamente 30 s usando el dispositivo de PCR y poner en hielo durante 2 min. Añadir 80 pl de SOC e incubar en una estufa de incubación a 37 °C durante 1 h sin agitar.

Añadir 100 pl de SOC o agua ultra pura y sembrarlas en placas con LB-agar de 48 pocillos con 50-100 pg/ml de kanamicina.

Ejemplo 2

Expresión y purificación

El siguiente ejemplo detalla cómo se expresaron y purificaron las variantes de pol6 usando un procedimiento de alto rendimiento.

El ADN que codifica las variantes en el vector pD441 (plásmido de expresión) se transformó en E. coli competente y se prepararon reservas de glicerol. Comenzando a partir de una pequeña selección de las reservas de glicerol, cultivar 1 ml de cultivo iniciador en LB con glucosa al 0,2 % y 100 pg/ml de kanamicina durante aproximadamente 8 h. Transferir 25 pl de cultivo iniciador en fase logarítmica a 1 ml de medio de expresión (medio de autoinducción Terrific Broth (TB) complementado con glucosa al 0,2 %, fosfato de potasio 50 mM, MgCh 5 mM y 100 pg/ml de kanamicina) en placas de 96 pocillos profundos. Se incubaron las placas con agitación a 250-300 rpm durante 36­ 40 h a 28 °C.

A continuación, se recogieron las células por medio de centrifugación a 3200 x g durante 30 minutos a 4 °C. Se decantó el medio y se resuspendió el sedimento celular en 200 pl de tampón de lisis preenfriado (fosfato de potasio 20 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, Tween20 al 0,5 %, TCEP 5 mM, imidazol 10 mM, PMSF 1 mM, BugBuster 1X, 100 pg/ml de inhibidores de lisozima y proteasa) e incubar a temperatura ambiente durante 20 min con agitación suave. A continuación, añadir 20 pl de una reserva 10x a una concentración final de 100 pg/ml de DNasa, MgCh 5 mM, 100 pg/ml de RNasa I e incubar en hielo durante 5-10 min para producir un lisado. Complementar el lisado con 200 pl de fosfato de potasio 1 M, pH 7,5 (la concentración final será de aproximadamente 0,5 M de fosfato de potasio en 400 pl de lisado) y filtrar a través de placas de filtro Pall (pieza n.° 5053, filtros de 3 micrómetros) por medio de centrifugación a aproximadamente 1500 rpm a 4 °C durante 10 minutos. A continuación, se aplicaron los lisados clarificados a placas de cobalto His-Pur de 96 pocillos equilibradas (Pierce pieza n.° 90095) y se unieron durante 15-30 min.

Se recogió el flujo pasante (FT) por centrifugación a 500xG durante 3 min. A continuación, se lavó 3 veces el FT con 400 ul de tampón de lavado 1 (fosfato de potasio 0,5 M pH 7,5, NaCl 1 M TCEP 5 mM, imidazol 20 mM Tween20 al 0,5 %). A continuación, se lavó el FT dos veces en 400 ul de tampón de lavado 2 (Tris 50 mM pH 7,4, KCl 200 mM, TCEP 5 mM, Tween20 al 0,5 %, imidazol 20 mM).

Se eluyó la Pol6 usando 200 pl de tampón de elución (Tris 50 mM pH 7,4, KCl 200 mM, TCEP 5 mM, Tween20 al 0,5 %, imidazol 300 mM, glicerol al 25 %) y se recogió después de una incubación de 1-2 min. Volver a aplicar eluido a la misma placa con His-Pur 2-3 veces para obtener Pol6 concentrada en el eluido. La polimerasa purificada es >95 % pura como se evalúa por SDS-PAGE. La concentración de proteína es de ~3 uM (0,35 mg/ml) con una proporción 260/280 de 0,6 como se evalúa por Nanodrop.

La actividad polimerasa se verifica por ensayo de desplazamiento de fluorescencia (véase el ejemplo 3).

Ejemplo 3

Determinación de actividad

Este ejemplo proporciona procedimientos para determinar la actividad de las polimerasas variantes.

Protocolo de ensayo de desplazamiento

Este ensayo caracteriza la capacidad de la polimerasa mutante de incorporar nucleótidos polifosfato en una hebra de ADN, así como su capacidad para desenrollar y desplazar el ADN bicatenario.

Los reactivos de partida son como sigue:

Bajo contenido de sal

N/A = no aplicable

Alto contenido de sal

N/A = no aplicable

Para el cribado de mutantes únicos y dobles:

Usando el reactivo A como dilu ente re arar 4 condiciones de nucleótidos diferentes a 142X:

Para el cribado de mutantes triples:

Usando el reactivo A como diluyente, preparar 4 condiciones de nucleótidos diferentes a 1,42X:

dNnP es un nucleótido polifosfato donde N es el nucleótido (es decir, A, T, C o G) y nP es 4-8 fosfatos

La condición de nucleótido 1 somete a prueba la actividad a alta concentración de hexafosfato.

La condición de nucleótido 2 somete a prueba la actividad a baja concentración de hexafosfato.

La condición de nucleótido 3 somete prueba la tasa de incorporación incorrecta (es decir, la fidelidad). Si una polimerasa mutante muestra actividad significativa con solo 3 de los 4 nucleótidos necesarios, entonces se concluye que no discrimina entre nucleótidos correctos o incorrectos mientras extiende una hebra de ADN.

La condición de nucleótido 4 somete a prueba la actividad exonucleasa. Si una polimerasa muestra actividad significativa sin nucleótidos presentes, entonces se concluye que la polimerasa presenta actividad exonucleasa. Añadir a cada pocillo de reacción en una placa transparente de mitad de área de 96 pocillos:

23 pl de reactivo A/mezcla de nucleótidos

2 pl de polimerasa (1-10 pM)

Agitar a 800 rpm en un agitador de placas durante ~10 min.

Añadir 5 pl de NaCl 1,4 M a cada pocillo para llevar la concentración de NaCl hasta 300 mM o 5 pl de NaCl 525 mM a cada pocillo para llevar la concentración de NaCl hasta 150 mM.

Incubar durante 30 minutos.

En el lector de placas BMG LABTECH, inyectar 10 pl de reactivo B y leer la señal de fluorescencia durante de 2 a 10 min.

Los datos representativos del ensayo de desplazamiento para una polimerasa variante se muestran en la FIG. 5. La actividad de la polimerasa se midió usando el ensayo de desplazamiento en presencia de A. dTnP 20 pM dA,C,G3P 15 pM (cuadrados rojos; ■), B. dTnP 5 pM dA,C,G3P 15 pM (rombos azules; ♦), C. dA,C,G3P 15 pM (triángulos verdes; ▲) o D. en ausencia de nucleótidos (X moradas). A y B muestran que una variante mutante puede incorporar y extender a lo largo de un molde de ADN con un nucleótido polifosfato. C muestra que la variante no ha perdido su fidelidad y no incorpora incorrectamente nucleótidos aleatorios en ausencia de un nucleótido T. D. muestra que la señal generada no es el resultado de la actividad exonucleasa de la polimerasa en ausencia de todos los nucleótidos. Las cuatro curvas son representativas de una única variante sometida a prueba en 4 placas de ensayo diferentes como parte del cribado de polimerasa.

Ejemplo 4

Determinación de küis

Se usó el siguiente ensayo de flujo interrumpido para determinar la velocidad kdis de las polimerasas variantes. Para el reactivo A, la polimerasa se enlaza a un cebador-molde de ADN marcado con fluoresceína con un nucleótido polifosfato unido a Cy3 (o Alexa555) en presencia de un metal divalente no catalítico como Ca2+. Esto forma un par FRET, siendo fluoresceína el fluoróforo donante y siendo Cy3 el fluoróforo aceptor. El reactivo B contiene el nucleótido de caza. Para los propósitos de este ensayo, el primer nucleótido que se va a incorporar en el molde/cebador es citosina.

Se preparó recientemente el reactivo A (NaCl 75 mM, HEPES 25 mM (pH 7,5), CaCl² 2 mM, fluoresceínamolde/cebador 250 nM, dCnP-Cy320 uM y polimerasa >250 nM) mezclando los componentes para garantizar que la polimerasa se añade al final. Permitir que la polimerasa se incube en el reactivo A durante 10 minutos.

Se preparó el reactivo B (NaCl 75 mM, HEPES 25 mM (pH 7,5), CaCl²2 mM y dCTP 200 mM).

Cuando se mezclan el reactivo A y B, dCTP compite con dCnP-Cy3 por la asociación, se observa un incremento en la fluorescencia dado que la concentración de dCTP está en exceso. El ensayo se puede realizar con un dispositivo de interrupción de flujo (Kintek Corp) o bien un lector de placas fluorescente. El incremento de la fluorescencia frente al tiempo se ajustó a una exponencial de primer orden o de segundo orden para proporcionar la constante cinética kdis para esa polimerasa particular.

Los rendimientos de purificación y kdis para variantes seleccionadas se presentan en la tabla 1.

Tabla 1 - Rendimientos de purificación y kdis para variantes de Pol6 seleccionadas

FP = polarización fluorescente

Véase la FIG. 3 para una representación esquemática del ensayo y un gráfico de una reacción ejemplar. Véase la FIG. 10 para datos representativos.

Ejemplo 5

Determinación de K^dis

Este ejemplo proporciona un procedimiento alternativo usando polarización de fluorescencia para determinar la kdis. Se usó un tampón de ensayo que comprendía Tris 25 mM pH 7,0, KCl 75 mM, Triton-X100 al 0,01 %, BSA 1X (100 ug/ml), EDTA 0,5 mM, CaCb 2 mM, DTT 2 mM, para preparar una mezcla maestra de ensayo que contenía molde de ADN marcado con fluoresceína de horquilla 250 nM y nucleótido marcado con dC6P-C6-Cy3250 nM. Se añadieron cincuenta y cinco microlitros de la mezcla maestra a cada uno de los pocillos de una placa Costar negra de 96 pocillos; y se añadieron 20 pl de mutantes de polimerasa, que se habían purificado de cultivos de 1 ml, en un formato de alto rendimiento (HTP). Se agitó la placa en un agitador de placas durante 1 minuto para permitir la formación de complejos ternarios homogéneos de polimerasa-molde de ADN-nucleótido. Se puso la placa en un lector de placa Polarstar BMG (BMG LABTECH Inc., Carolina del Norte) y se ajustó la milipolarización objetivo a 200 mP y al 10 % para obtener una ganancia de alrededor de 2000. Se estableció el filtro de excitación en 485 nM y se estableció el filtro de emisión en 590-20 nM. Se cebó el inyector con 1 ml de solución de nucleótido de caza dCTP 1 mM. Se recopilaron los datos con un mínimo de 30 destellos por pocillo por intervalo y un tiempo de lectura total de 60 s para el comienzo. Los destellos se incrementaron a 50 o más y se tomaron tiempos de lectura más largos para los mutantes con resultado positivo que mostraron una disociación lenta. La recopilación de datos empezó con la inyección de 25 pl de dCTP 1 mM.

Véase la FIG. 4 para una representación esquemática del ensayo y un gráfico de una reacción ejemplar.

Véase la FIG. 6 para datos representativos del ensayo de kdis basado en polarización de fluorescencia para dos polimerasas variantes (S366A+N535L+I652Q (B6) y S366A+P542E+I652Q (C6)). mP es milipolarización. El complejo ternario preformado de polimerasa-molde de ADN-dCnP-Alexa555 se caza con dCTP natural y se realizó un seguimiento de dCnP-Alexa555 de polarización en el tiempo.

Ejemplo 6

Determinación de K^quím

Este ejemplo proporciona un ensayo basado en FRET para determinar la kquím para las polimerasas variantes. Para el reactivo A, la polimerasa se enlaza al cebador-molde de ADN marcado con fluoresceína. El reactivo B contiene nucleótido polifosfato unido a Cy3 (o Alexa555) en presencia de un metal divalente catalítico como Mg2+. Para los propósitos de este protocolo, el primer nucleótido que se va a incorporar en el molde/cebador es citosina. Se preparó el reactivo A (NaCl 75 mM, HEPES 25 mM (pH 7,5), fluoresceína-molde/cebador 250 nM, polimerasa >250 nM). Se dejó incubar la polimerasa en el reactivo A durante 10 min.

Se preparó el reactivo B (NaCl 75 mM, HEPES 25 mM (pH 7,5), MgCb 10 mM y dCnP-Cy320 uM).

Cuando se mezclan el reactivo A y B, el complejo polimerasa-fluoresceína-molde-cebador se une a dCnP-Cy3 y se extingue la fluorescencia. Mg2+ permite que la polimerasa incorpore el nucleótido que libera el producto de escisión, pirofosfato con Cy3 unido, nP-Cy3. Puesto que se libera la molécula de extinción, se incrementa la fluorescencia. El ensayo se puede realizar con un dispositivo de interrupción de flujo (Kintek Corp) o bien un lector de placas fluorescente.

Véase la FIG. 2 para una representación esquemática del ensayo y un gráfico de una reacción ejemplar. Véase la FIG. 9 para datos representativos.

Ejemplo 7

Unión a nanoporo

Este ejemplo proporciona procedimientos de unión de una polimerasa variante a un nanoporo, por ejemplo, hemolisina a.

Se puede acoplar la polimerasa al nanoporo por cualquier medio adecuado. Véanse, por ejemplo, los documentos PCT/US2013/068967 (publicado como WO2014/074727; Genia Technologies, Inc.), PCT/US2005/009702 (publicado como W02006/028508; Presidente y miembros de la Universidad de Harvard) y PCT/US2011/065640 (publicado como WO2012/083249; Universidad de Columbia).

La polimerasa, por ejemplo, una ADN polimerasa pol6 variante, se acopló a un nanoporo proteico (por ejemplo, hemolisina alfa), a través de una molécula conectora. Específicamente, se usó el sistema SpyTag y SpyCatcher, que forma espontáneamente enlaces isopeptídicos covalentes en condiciones fisiológicas. Véase, por ejemplo, Li et al., J Mol Biol., 23 de enero de 2014;426(2):309-17.

Se expresó la marca His de variante de pol6 SpyCatcher de acuerdo con el ejemplo 2 y se purificó usando una columna de afinidad de cobalto. Se incubaron la polimerasa SpyCatcher y la proteína de nanoporo oligomerizada SpyTag durante la noche a 4 °C en SrCb 3 mM. A continuación se purificó el complejo 1:6-polimerasa-molde usando cromatografía de exclusión por tamaño.

Se unió el conector al extremo N o bien al extremo C de la variante de pol6. Se descubrió que las variantes unidas de forma N terminal eran más robustas, por ejemplo, más estables. Por lo tanto, se usaron conectores unidos de forma N terminal.

Ejemplo 8

Actividad en un biochip

Este ejemplo demuestra la capacidad de una polimerasa variante enlazada a nanoporo para unir nucleótidos marcados y, por lo tanto, permite la detección de corrientes de canal bloqueado en el nanoporo al que está unida la polimerasa.

La polimerasa se unió a un nanoporo y se incluyó en una bicapa lipídica sobre un pocillo en un chip sensor semiconductor, también llamado biochip. Se formó la bicapa lipídica y se insertó el nanoporo con polimerasa unida como se describe en el documento PCT/US2014/061853 (titulado "Methods for Forming Lipid Bilayers on Biochips" y presentado el 22 de octubre de 2014).

Las polimerasas variantes se complejaron con ADN molde en condiciones de bajo contenido de sal.

Se determinó la capacidad de la polimerasa variante enlazada a nanoporo de unir nucleótidos marcados en experimentos de captura estática con lo que los nucleótidos marcados se enlazan por la polimerasa, y se mide la corriente de canal bloqueado a medida que el nucleótido marcado se presenta al nanoporo. Los experimentos de captura estática se realizan en presencia de Ca2+, lo que evita la catálisis y el alargamiento del ADN, y permite la detección de capturas repetidas del mismo tipo de nucleótido marcado. En este experimento, el nucleótido marcado usado fue dTnP-marca.

Una Pol6 variante de polimerasa ejemplar (S366A+N535L+I652Q) se acopló a un nanoporo de hemolisina alfa en el biochip, y se complejó con ADN molde.

Se registró la captura estática del nucleótido timidina marcado (la marca es T30 (SEQ ID NO: 9)) por el complejo Pol6 (S366A+N535L+I652Q)-ADN a 100 mV en presencia de Hepes 7,520 mM, NaCl 300 mM, CaCl²3 mM y TCEP 5 mM por encima y por debajo de la bicapa.

[0019] Los resultados se muestran en las FIG. 7 y 8. Los trazados en la FIG. 7 muestran la corriente electrolítica medida a 100 mV a través del poro como función del tiempo. La corriente de poro abierto a esta tensión fue de aproximadamente 1 nA (trazado superior); y la corriente de poro bloqueado a la misma tensión fue de aproximadamente 0,33 nA (trazado del medio). La corriente de canal abierto se normalizó a 1 de acuerdo con el programa informático del sistema, y la corriente de canal bloqueado disminuyó por el dTnP-T30 (SEQ ID NO: 9) a un 33 % de la corriente de canal abierto. Los bloqueos de corriente mostrados en este trazado están asociados con la unión de timidina polifosfato por el complejo Pol6 variante-ADN, que se produce próximo al nanoporo. El histograma superior correspondiente en la FIG. 7 (derecha) muestra la frecuencia de los bloqueos de corriente observados a 100 mV con un cambio en la corriente normalizada a la corriente de poro abierto en el mismo poro; y el histograma (derecha) correspondiente al trazado del medio muestra la frecuencia de los bloqueos de corriente observados a 100 mV con un cambio en la corriente normalizada a la corriente de poro bloqueado en el mismo poro.

La FIG. 8 muestra el tiempo de permanencia para la captura estática de la timidina marcada mostrada en la FIG. 7.

La FIG. 8 (izquierda) muestra un histograma del número de veces que se enlazó dTNP marcado por Pol6 variante como función de la corriente como se normaliza con respecto a la corriente de canal abierto. Se determinó que el tiempo de permanencia promedio de cada captura de nucleótido marcado con dTNP era de 1,2 segundos. La captura de fondo (es decir, no mediada por polimerasa) de la marca en el poro tiene un tiempo de permanencia en el intervalo de unos pocos milisegundos (datos no mostrados). Un objetivo en la evolución de la enzima era mejorar la velocidad de disociación del nucleótido polifosfato marcado, para que se puedan ver tiempos de permanencia lo suficientemente largos para registrar una captura mediada por polimerasa que se distinga bien del fondo. Como se muestra en la FIG. 8. el tiempo de permanencia promedio de 1,2 s está muy por encima del fondo. El índice celular es un esquema basado en colores para las aproximadamente 8000 células presentes en el chip usado en este experimento.

Los datos muestran que la polimerasa variante ejemplar, Pol6 (S366A+N535L+I652Q), puede unir nucleótidos marcados y permitir la detección del cambio de corriente a través del nanoporo al que está unida la polimerasa. Los resultados proporcionan pruebas de que las polimerasas variantes unidas a nanoporos en un biochip pueden unir nucleótidos marcados con alta fidelidad, y presentar los nucleótidos marcados a los nanoporos para tiempos de permanencia que proporcionan tiempo suficiente para la detección de incorporación de nucleótidos, y posiblemente para disminuir la probabilidad de errores de secuenciación, por ejemplo, inserciones, deleciones, etc., durante la secuenciación de nanoporos.

Ejemplo 9

Ensayo de amplificación de círculo rodante

Este ejemplo describe la amplificación de un molde de polinucleótido en un ensayo basado en círculo rodante. El molde usado fue un molde interno, HFcirc10. Es un molde circular simple de ~150 pb de largo.

El ensayo se procesó en un volumen de reacción total de 40 pl (28 pl de reactivo A 2 pl de polimerasa 2 pM 10 pl de reactivo B).

Reactivo A:

Reactivo B:

Se añadieron dos j l de polimerasa 2 ^j M a 28 j l de reactivo A para dar una proporción molar 1:1 de ADN con respecto a polimerasa (100 nM cada uno) en la mezcla de ensayo de 40 j l final. Se incubó la mezcla de reactivo A/polimerasa durante 10 min en esta condición de sal 75 mM para permitir que la polimerasa se uniera al ADN. Seguidamente, se añadieron 10 j l de reactivo B a la mezcla de reactivo A/polimerasa para comenzar la reacción. En puntos de tiempo predeterminados, se retiraron 10 j l de muestras de la reacción y se añadieron a 10 j l de formamida con EDTA 50 mM para desactivar la reacción. Se tomaron muestras en puntos de tiempo de 0 min, 10 min, 30 min y 40 minutos.

Se calentaron las muestras de formamida hasta 94 °C durante aproximadamente 3 min para desnaturalizar proteínas y estructuras secundarias de ADN. No se dejaron enfriar las muestras hasta 4 °C. Añadir 2 j l de tinte 100X SYBR GREEN o GOLD.

Se procesaron 15 j l de cada muestra en un gel de agarosa al 1,2 % durante 1 hora y 15 minutos a 100 V.

Se obtuvo una imagen del gel usando la bandeja azul para el generador de imágenes GEL DOC EZ de Biorad. La FIG. 11 muestra los resultados de puntos de tiempo de 40 minutos del ensayo. Se muestra una escalera molecular en los carriles 1 y 19, numerando de izquierda a derecha. El carril 2 tiene una muestra de t=0; ningún producto es visible. Cada uno de los carriles 3-18 es una variante diferente de polimerasa pol6.

Todas las variantes mostradas pueden realizar desplazamiento de hebra y generar productos de ADN de kilobases de largo con todos los nucleótidos hexafosfato.

Ejemplo 10

Secuenciación de ADN molde usando nucleótidos marcados

Este ejemplo demuestra que la polimerasa variante es funcional en una secuenciación por procedimiento de síntesis en un biochip.

Secuenciación con AC de un molde de heteropolímero usando polimerasa Pol6-26i-D44A en Hepes 20 mM, pH 8, glutamato de potasio 500 mM y MgCl²3 mM a temperatura ambiente. Se incluyó un nanoporo con polimerasa unida en la bicapa lipídica como se describe en el presente documento. Se añadió ADN cebado y se dejó que se complejara con la polimerasa. Se añadieron cuatro nucleótidos marcados diferentes a una concentración de 25 j M. La secuenciación por síntesis puede proceder como se describe en el documento WO 2014/074727 titulado "Nucleic Acid Sequencing Using Tags". El trazado en la FIG. 12 muestra una exactitud de secuenciación de un 76 % para un molde de heteropolímero y una longitud de lectura de 96 pb.

TEXTO LIBRE DEL LISTADO DE SECUENCIAS

SEQ ID NO:1 - Pol6 natural (ADN polimerasa [fago de Clostridium phiCPV4]; GenBank: AFH27113.1)

1 mdkhtqyvke hsfnydeykk anfdkíecld fdtesctnye ndntgarvyg wglgvtrnhn 061 miygqnlnqf wevcqnifnd wyhdnkhtik itktkkgfpk rkyikfpiav hnlgwdvefl 121 kyslvengfn ydkgllktvf skgapyqtvt dveepktfhi vqnnnivygc nvymdkffev 181 enkdgsttei glcldffdsy kiitcaesqf hnyvhdvdpm fykmgeeydy dtwrspthkq 241 ttlelryqyn diymlrevie qfyidglcgg elpltgmrta ssiafnvlkk mtfgeektee 301 gyinyfeldk ktkfeflrkr iemesytggy thanhkavgk tinkigcsld inssypsqma 361 ykvfpygkpv rktwgrkpkt eknevyliev gfdfvepkhe eyaldlfkig avnskalspi ''121 tgavsgqeyf ctnikdgkai pvykelkdtk lttnynwlt sveyefwikh fnfgvfkkde 421 ydcfevdnle ftglkigsil yykaekgkfk pyvdhftkmk venkklgnkp ltnqakliln 541 gaygkfgtkq nkeekdlimd knglltftgs vteyegkefy rpyasfvtay grlqlwnaii 601 yavgvenfly cdtdsiycnr evnsliedmn aigetidkti lgkwdvehvf dkfkvlgqkk 661 ymyhdckedk tdlkccglps darkiíigqg fdefylgknv egkkqrkkvd ggcllldtlf 121 tikkimf

SEQ ID NO:2 - Pol6 (con marca His)

MHHHHHHHHS GGSDKHTQYV KEHSFNYDEY KKANFDKIEC LIFDTESCTN 50 YENDNTGARV YGWGLGVTRN HNMIYGQNLN QFWEVCQNIF NDWYHDNKHT

10 0

IKITKTKKGF PKRKYIKFPI AVHNLGWDVE FLKYSLVENG FNYDKGLLKT

150

VFSKGAPYQT VTDVEEPKTF HIVQNNNIVY GCNVYMDKFF EVENKDGSTT

200

EIGLCLDFFD SYKIITCAES QFHNYVHDVD PMFYKMGEEY DYDTWRSPTH

250

KQTTLELRYQ YNDIYMLREV IEQFYIDGLC GGELPLTGMR TASSIAFNVL

300

KKMTFGEEKT EEGYINYFEL DKKTKFEFLR KRIEMESYTG GYTHANHKAV

350

GKTINKIGCS LDINSSYPSQ MAYKVFPYGK PVRKTWGRKP KTEKNEVYLI

400

EVGFDFVEPK HEEYALDIFK IGAVNSKALS PITGAVSGQE YFCTNIKDGK

450

AIPVYKELKD TKLTTNYNVV LTSVEYEFWI KHFNFGVFKK DEYDCFEVDN

500

LEFTGLKIGS ILYYKAEKGK FKPYVDHFTK MKVENKKLGN KPLTNQAKLI

550

LNGAYGKFGT KQNKEEKDLI MDKNGLLTFT GSVTEYEGKE FYRPYASFVT

600

AYGRLQLWNA IIYAVGVENF LYCDTDSIYC NREVNSLIED MNAIGETIDK

650

TILGKWDVEH VFDKFKVLGQ KKYMYHDCKE DKTDLKCCGL PSDARKIIIG

700

QGFDEFYLGK NVEGKKQRKK VIGGCLLLDT LFTIKKIMF*

SEQ ID NO:3 - Pol6 con marca His (secuencia de ADN)

ATGCATCACC ATCATCATCA CCACCACAGC GGCGGTTCCG ACAAACACAC 50 GCAGTACGTC AAAGAGCATA GCTTCAATTA TGACGAGTAT AAGAAAGCGA 100 ATTTCGACAA GATCGAGTGC CTGATCTTTG ACACCGAGAG CTGCACGAAT 150 TATGAGAACG ATAATACCGG TGCACGTGTT TACGGTTGGG GTCTTGGCGT 200 CACCCGCAAC CACAATATGA TCTACGGCCA AAATCTGAAT CAGTTTTGGG 250 AAGTATGCCA GAACATTTTC AATGATTGGT ATCACGACAA CAAACATACC 300 ATTAAGATTA CCAAGACCAA GAAAGGCTTC CCGAAACGTA AGTACATTAA 350 GTTTCCGATT GCAGTTCACA ATTTGGGCTG GGATGTTGAA TTCCTGAAGT 400 ATAGCCTGGT GGAGAATGGT TTCAATTACG ACAAGGGTCT GCTGAAAACT 450 GTTTTTAGCA AGGGTGCGCC GTACCAAACC GTGACCGATG TTGAGGAACC 500 GAAAACGTTC CATATCGTCC AGAATAACAA CATCGTTTAT GGTTGTAACG 550 TGTATATGGA CAAATTCTTT GAGGTCGAGA ACAAAGACGG CTCTACCACC 600 GAGATTGGCC TGTGCTTGGA TTTCTTCGAT AGCTATAAGA TCATCACGTG 650 TGCTGAGAGC CAGTTCCACA ATTACGTTCA TGATGTGGAT CCAATGTTCT 700 ACAAAATGGG TGAAGAGTAT GATTACGATA CTTGGCGTAG CCCGACGCAC 750 AAGCAGACCA CCCTGGAGCT GCGCTACCAA TACAATGATA TCTATATGCT 800 GCGTGAAGTC ATCGAACAGT TTTACATTGA CGGTTTATGT GGCGGCGAGC 850 TGCCGCTGAC CGGCATGCGC ACCGCTTCCA GCATTGCGTT CAACGTGCTG 900 AAAAAGATGA CCTTTGGTGA GGAAAAGACG GAAGAGGGCT ACATCAACTA 950 TTTTGAATTG GACAAGAAAA CCAAATTCGA GTTTCTGCGT AAGCGCATTG 1000 AAATGGAATC GTACACCGGT GGCTATACGC ACGCAAATCA CAAAGCCGTT 1050 GGTAAGACTA TTAACAAGAT CGGTTGCTCT TTGGACATTA ACAGCTCATA 1100 CCCTTCGCAG ATGGCGTACA AGGTCTTTCC GTATGGCAAA CCGGTTCGTA 1150 AGACCTGGGG TCGTAAACCA AAGACCGAGA AGAACGAAGT TTATCTGATT 1200 GAAGTTGGCT TTGACTTCGT GGAGCCGAAA CACGAAGAAT ACGCGCTGGA 1250 TATCTTTAAG ATTGGTGCGG TGAACTCTAA AGCGCTGAGC CCGATCACCG 1300 GCGCTGTCAG CGGTCAAGAG TATTTCTGTA CGAACATTAA AGACGGCAAA 1350 GCAATCCCGG TTTACAAAGA ACTGAAGGAC ACCAAATTGA CCACTAACTA 1400 CAATGTCGTG CTGACCAGCG TGGAGTACGA GTTCTGGATC AAACACTTCA 1450 ATTTTGGTGT GTTTAAGAAA GACGAGTACG ACTGTTTCGA AGTTGACAAT 1500 CTGGAGTTTA CGGGTCTGAA GATTGGTTCC ATTCTGTACT ACAAGGCAGA 1550 GAAAGGCAAG TTTAAACCTT ACGTGGATCA CTTCACGAAA ATGAAAGTGG 1600 AGAACAAGAA ACTGGGTAAT AAGCCGCTGA CGAATCAGGC AAAGCTGATT 1650 CTGAACGGTG CGTACGGCAA ATTCGGCACC AAACAAAACA AAGAAGAGAA 1700 AGATTTGATC ATGGATAAGA ACGGTTTGCT GACCTTCACG GGTAGCGTCA 1750 CGGAATACGA GGGTAAAGAA TTCTATCGTC CGTATGCGAG CTTCGTTACT 1800 GCCTATGGTC GCCTGCAACT GTGGAACGCG ATTATCTACG CGGTTGGTGT 1850 GGAGAATTTT CTGTACTGCG ACACCGACAG CATCTATTGT AACCGTGAAG 1900 TTAACAGCCT CATTGAGGAT ATGAACGCCA TTGGTGAAAC CATCGATAAA 1950 ACGATTCTGG GTAAATGGGA CGTGGAGCAT GTCTTTGATA AGTTTAAGGT 2000 CCTGGGCCAG AAGAAGTACA TGTATCATGA TTGCAAAGAA GATAAAACGG 2050 ACCTGAAGTG TTGCGGTCTG CCGAGCGATG CCCGTAAGAT TATCATTGGT 2100 CAAGGTTTCG ACGAGTTTTA TCTGGGCAAA AATGTCGAAG GTAAGAAGCA 2150 ACGCAAAAAA GTGATCGGCG GTTGCCTGCT GCTGGACACC CTGTTTACGA 2200 TCAAGAAAAT CATGTTCTAA 2220 Lista de citas

Literatura de patentes

[1] Documento PCT/US2005/009702 (publicado como WO2006/028508 el 16 de marzo de 2006; Presidente y miembros de la Universidad de Harvard; titulado METHODS AND APPARATUS FOR CHARACTERIZING POLYNUCLEOTIDES).

[2] Documento PCT/US2011/065640 (publicado como WO2012/083249 el 21 de junio de 2012; Universidad de Columbia; titulado DNA SEQUENCING BY SYNTHESIS USING MODIFIED NUCLEOTIDES AND NANOPORE DETECTION).

[3] Documento PCT/US2013/068967 (publicado como WO2014/074727 el 15 de mayo de 2014; Genia Technologies; titulado NUCLEIC ACID SEQUENCING USING TAGS).

[4] Documento PCT/US2013/046012 (Genia Technologies, Inc., titulado CHIP SET-UP AND HIGH-ACCURACY NUCLEIC ACID SEQUENCING, publicado el 19 de diciembre de 2013 como WO2013/188841).

[5] Documento US 2013/0053544 (Isis Innovation Limited) titulado Peptide Tag Systems That Spontaneously Form an Irreversible Link to Protein Partners via Isopeptide Bonds, publicado el 28 de febrero de 2013.

Literatura distinta de patentes

[1] Altschul, S. F. et al, J. Mol. Biol. (1990) 215:403-410.

[2] Altschul, S. F., et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997.

[3] Ausubel, Frederick et al., (1992) Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols in Molecular Biology, 2.a ed., Greene Publishing Associates & John Wiley & Sons. New York, N.Y.

[4] Gardner et al., Nucleic Acids Res. (2012) páginas 1-12 (doi: 10.1093/nar/gks330; Publicado en primer lugar en línea: 8 de mayo de 2012).

[5] Hale y Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991).

[6] Johnson, et al., Biochim Biophys Acta. Mayo 2010; 1804(5):1041-1048.

[7] Kong et al., (1993) J. Biol. Chem. 268(3):1965-1975.

[8] Lawyer et al., (1989) J. Biol. Chem. 264:6427-647.

[9] Li et al., Structural Analysis and Optimization of the Covalent Association between SpyCatcher and a Peptide Tag; J Mol Biol. (23 de enero de 2014) 426(2):309-17.

[10] Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY).

[11] Sambrook et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) en 9,63-9,75 (que describe el marcaje terminal de ácidos nucleicos).

[12] Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2.a ed., John Wiley and Sons, New York (1994).

[13] Watson, J. D. et al., en: Molecular Biology of the Gene, 4.a ed., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif. (1987)).

[14] Zakari y Howarth, (2010) Spontaneous Intermolecular Amide Bond Formation between Side Chains for Irreversible Peptide Targeting, J. Am. Chem. Soc., 132(13):4526-4527.

[15] Zakari, B. et al., (2012) Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion, PNAS 109 (12):E690-E697.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Una ADN polimerasa modificada que tiene una actividad ADN polimerasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2, secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución de acuerdo con S366 A/L y que opcionalmente incluye una o más sustituciones aminoacídicas seleccionadas del grupo que consiste en H223, N224, Y225, H227, I295, Y342, T343, I357, S360, L361, I363, S365Q, Y367, P368, D417, E475, Y476, F478, K518, H527, T529, M531, N535, G539, P542, N545, Q546, A547, L549, I550, N552, G553, F558, A596, G603, A610, V615, Y622, C623, D624, I628, Y629, R632, N635, M641, A643, I644, T647, I648, T651, I652, K655, W656, D657, V658, H660, F662, L690 y combinaciones de las mismas.

2. La ADN polimerasa modificada de la reivindicación 1, en la que dicha polimerasa tiene la capacidad de incorporar un nucleótido polifosfato que tiene 4, 5, 6, 7 u 8 fosfatos en una hebra de ADN creciente.

3. La ADN polimerasa modificada de la reivindicación 1 seleccionada de

S366L+G553S+F558P;

S366A+N535L+A547M;

S366A+P542E+N545K;

S366A+P542E+I652Q;

S366A+N535L+T529M;

S366A+N535L+I652Q;

S366A+N535L+N545K;

S366A+N535I+I652Q;

T651Y+S366A+A547F;

A547F+A610T+S366A;

S366A+T647G+A547F;

T529M+S366A+A547F;

T647E+S366A+A547F;

N545K+S366A+A547F;

S366A+N535L+I652Q+T529M;

S366A+S365A+P368G+G603T;

S366A+N535L+I652Q+A547Y;

S366A+N535L+A547M+T647G;

T529M+S366A+A547F+N545K;

T529M+S366A+A547F+N545R;

T529M+S366A+A547F+N552L;

T529M+S366A+A547F+Y629W;

S366A+N535L+I652Q+A547Y+K655G;

T529M+S366A+A547F+N545L+Y629W;

T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L;

T529M+S366A+A547F+N545L+Y225F;

T529M+S366A+A547F+N545L+K655F;

T529M+S366A+A547F+N545L+N552L;

T529M+S366A+A547F+N545R+M531A;

T529M+S366A+A547F+N545R+G539Y;

T529M+S366A+A547F+N545R+V658L;

T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+D657R;

T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+N552L;

T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+I652G;

T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+I652Q; y

T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+N552M.

4. La ADN polimerasa modificada de la reivindicación 1 que comprende S366A+T529M+N545L+A547F.

5. La ADN polimerasa modificada de la reivindicación 4 que comprende además al menos una mutación seleccionada de

a. Y225L/F/A;

b. M531A;

c. G539Y;

d. N552L;

e. Y629W; y

f. K655F.

6. La ADN polimerasa modificada de la reivindicación 1 que comprende S365A+P368G+G603T.