JP6736565B2 - ポリメラーゼバリアント - Google Patents
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Description
a. H223A;
b. N224Y/L;
c. Y225L/I/T/F/A;
d. H227P;
e. I295F/E/M/W;
f. Y342L/F;
g. T343N/F;
h. I357G/L/Q/H/W/M/A/E/Y/P;
i. S360G;
j. L361M/W/V;
k. I363V;
l. S365Q/W/M/A/G;
m. S366A/L;
n. Y367L/E/M/P/N;
o. P368G;
p. D417P;
q. E475D;
r. Y476V;
s. F478L;
t. K518Q;
u. H527W/R/L;
v. T529M/F;
w. M531H/Y/A/K/R/W/T/L/V;
x. N535L/Y/M/K/I;
y. P542E/S;
z. N545D/K/S/L/R;
aa. Q546W/F;
bb. A547F/M/W/Y/V/S;
cc. L549H/Y/Q/G/R;
dd. I550A/W;
ee. I550T/G/F/S;
ff. N552L/M;
gg. G553S/T;
hh. F558P/T;
ii. A596S;
jj. G603T;
kk. A610T/E;
ll. V615A/T;
mm. Y622A/M;
nn. C623G/S/Y/A;
oo. D624F;
pp. I628Y/V/F;
qq. Y629W/H/M;
rr. R632L/C;
ss. N635D;
tt. M641L/Y;
uu. A643L;
vv. I644H/M/Y;
ww. T647G/A/E/K/S;
xx. I648K/R/V/N/T;
yy. T651Y/F/M;
zz. I652Q/G/S/N/F/T;
aaa. K655G/F/E/N;
bbb. W656E;
ccc. D657R/P/A;
ddd. V658L;
eee. H660A/Y;
fff. F662I/L;
ggg. L690M;
hhh. S366A+N535L;
iii. T651Y+N535L;
jjj. Y342L+E475D+F478L;
kkk. T343N+D417P+K518Q;
lll. N535L+N545K+T651Y;
mmm. I363V+E475D+Y476V;
nnn. S366L+G553S+F558P;
ooo. S366A+N535L+A547M;
ppp. S366A+P542E+N545K;
qqq. S366A+P542E+I652Q;
rrr. S366A+N535L+T529M;
sss. S366A+N535L+I652Q;
ttt. S366A+N535L+N545K;
uuu. T651Y+P542E+N545K;
vvv. T651Y+P542E+Q546W;
www. T651Y+P542E+S366A;
xxx. T651Y+N535L+N545K;
yyy. S366A+N535I+I652Q;
zzz. T651Y+S366A+A547F;
aaaa. T647G+A547F+Y225T;
bbbb. A547F+A610T+S366A;
cccc. A547F+A610T+Y225I;
dddd. S366A+T647G+A547F;
eeee. T529M+S366A+A547F;
ffff. T647E+S366A+A547F;
gggg. T529M+T647G+A547F;
hhhh. N545K+S366A+A547F;
iiii. T647G+A547F+T529M;
jjjj. T529M+A610T+A547F;
kkkk. M641Y+T529M+A547F;
llll. T647G+C623G+A547F;
mmmm. A610T+I295W+T651Y;
nnnn. V615A+M531Y+T647G;
oooo. S366L+F478L+A596S+L690M;
pppp. H223A+G553S+A643L+F662I;
qqqq. N535L+N545K+T651Y+T529M;
rrrr. N535L+N545K+T651Y+N635D;
ssss. N535L+N545K+T651Y+I652Q;
tttt. S366A+N535L+I652Q+T529M;
uuuu. S366A+S365A+P368G+G603T;
vvvv. N535L+N545K+T651Y+T647G;
wwww. S366A+N535L+I652Q+A547Y;
xxxx. S366A+N535L+A547M+T647G;
yyyy. T529M+S366A+A547F+N545K;
zzzz. T529M+S366A+A547F+N545R;
aaaaa. T529M+S366A+A547F+N552L;
bbbbb. T529M+S366A+A547F+Y629W;
ccccc. N535I+N545K+T651Y+T529M;
ddddd. N535I+N545K+T651Y+N635D;
eeeee. N535I+N545K+T651Y+I652Q;
fffff. N535L+N545K+T651Y+T647G+C623G;
ggggg. N535L+N545K+T651Y+T647G+I628Y;
hhhhh. S366A+N535L+A547M+T647G+S360G;
iiiii. N535I+N545K+T651Y+I652Q+Y225I;
jjjjj. N535L+N545K+T651Y+T647G+K655G;
kkkkk. N535L+N545K+T651Y+T647G+L549Q;
lllll. S366A+N535L+I652Q+A547Y+K655G;
mmmmm. T529M+S366A+A547F+N545L+Y629W;
nnnnn. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L;
ooooo. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225F;
ppppp. T529M+S366A+A547F+N545L+K655F;
qqqqq. T529M+S366A+A547F+N545L+N552L;
rrrrr. T529M+S366A+A547F+N545R+M531A;
sssss. T529M+S366A+A547F+N545R+G539Y;
ttttt. T529M+S366A+A547F+N545R+V658L;
uuuuu. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+D657R;
vvvvv. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+N552L;
wwwww. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+I652G;
xxxxx. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+I652Q;および
yyyyy. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+N552M。
から選択される。一実施形態においては、変化した特性は酵素活性である。一実施形態においては、変化した特性は忠実度である。一実施形態においては、変化した特性は処理能力である。一実施形態においては、変化した特性は伸長速度である。一実施形態においては、変化した特性は安定性である。一実施形態においては、変化した特性は溶解性である。一実施形態においては、変化した特性は、ヌクレオチドポリリン酸に結合する能力、および/またはヌクレオチドポリリン酸を組み込む能力である。ヌクレオチドポリリン酸は、例えばヌクレオチド四リン酸、ヌクレオチド五リン酸、ヌクレオチド六リン酸、ヌクレオチド七リン酸、またはヌクレオチド八リン酸である。
a. A547F+A610T+Y225I;
b. Y225T+T647G+A547F;
c. S366A+T647G+A547F;
d. S366A+A547F+A610T;
e. T529M+S366A+A547F;
f. T529M+T647G+A547F;
g. T529M+A610T+A547F;
h. N545K+S366A+A547F;
i. N545K+T647G+A547F;
j. A610T+I295W+T651Y;
k. V615A+M531Y+T647G;
l. M641Y+T529M+A547F;
m. T647E+S366A+A547F;
n. T647G+A547F+T529M;
o. T647G+C623G+A547F;および
p. T651Y+S366A+A547F。
から選択される。
a. N535L+N545K+T651Y;
b. S366A+N535L+I652Q;
c. S366A+T529M+N535L;
d. S366A+N535L+N545K;
e. S366A+N535L+A547M;
f. S366A+P542E+I652Q;
g. S366A+ P542E+N545K;
h. S366A+ P542E+T651Y;
i. P542E+N545K+T651Y;
j. P542E+Q546W+T651Y;
k. N535L+T651Y;
l. S366A+N535L;
m. N535L+N545K+T651Y+T529M;
n. N535L+N545K+T651Y+N635D;
o. N535L+N545K+T651Y+I652Q;
p. S366A+N535L+I652Q+T529M;
q. N535L+N545K+T651Y+T647G;
r. S366A+N535L+I652Q+A547Y;
s. S366A+N535L+A547M+T647G;
t. S366A+N535I+I652Q;
u. N535I+N545K+T651Y+T529M;
v. N535I+N545K+T651Y+N635D;
w. N535I+N545K+T651Y+I652Q;
x. N535L+N545K+T651Y+T647G+C623G;
y. N535L+N545K+T651Y+T647G+I628Y;
z. S366A+N535L+A547M+T647G+S360G;
aa. N535I+N545K+T651Y+I652Q+Y225I;
bb. N535L+N545K+T651Y+T647G+K655G;
cc. N535L+N545K+T651Y+T647G+L549Q;
dd. S366A+N535L+I652Q+A547Y+K655G;
ee. T647G+A547F+Y225T;
ff. A547F+A610T+S366A;
gg. A547F+A610T+Y225I;
hh. S366A+T647G+A547F;
ii. T651Y+S366A+A547F;
jj. T529M+S366A+A547F;
kk. T647E+S366A+A547F;
ll. T529M+T647G+A547F;
mm. N545K+S366A+A547F;
nn. T647G+A547F+T529M;
oo. N545K+T647G+A547F;
pp. T529M+A610T+A547F;
qq. M641Y+T529M+A547F;
rr. T647G+C623G+A547F;
ss. A610T+I295W+T651Y;
tt. V615A+M531Y+T647G;
uu. T529M+S366A+A547F+N545K;
vv. T529M+S366A+A547F+N545R;
ww. T529M+S366A+A547F+N552L;
xx. T529M+S366A+A547F+Y629W;
yy. T529M+S366A+A547F+N545L+Y629W;
zz. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L;
aaa. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225F;
bbb. T529M+S366A+A547F+N545L+K655F;
ccc. T529M+S366A+A547F+N545L+N552L;
ddd. T529M+S366A+A547F+N545R+M531A;
eee. T529M+S366A+A547F+N545R+G539Y;
fff. T529M+S366A+A547F+N545R+V658L;
ggg. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+D657R;
hhh. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+N552L;
iii. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+I652G;
jjj. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+I652Q;および
kkk. T529M+S366A+A547F+N545L+Y225L+N552M。
から選択される。一部の実施形態においては、バリアントポリメラーゼは、配列番号1もしくは2、または親ポリメラーゼと比較して変化した酵素活性を有する。
a. Y225L/F/A;
b. M531A;
c. G539Y;
d. N552L;
e. Y629W;
f. K655F。
から選択される。一実施形態においては、変化した特性は酵素活性である。一実施形態においては、変化した特性は忠実度である。一実施形態においては、変化した特性は処理能力である。一実施形態においては、変化した特性は伸長速度である。一実施形態においては、変化した特性は安定性である。一実施形態においては、変化した特性は溶解性である。一実施形態においては、変化した特性は、ヌクレオチドポリリン酸に結合する能力、および/またはヌクレオチドポリリン酸を組み込む能力である。ヌクレオチドポリリン酸は、例えばヌクレオチド四リン酸、ヌクレオチド五リン酸、ヌクレオチド六リン酸、ヌクレオチド七リン酸、またはヌクレオチド八リン酸である。
[0034]本明細書において示している見出しは、本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではなく、本発明は、明細書を全体として参照によって理解され得る。したがって、直下で定義する用語は、明細書を全体として参照によってより充分に定義される。
定義:
[0035]アミノ酸:本明細書において使用する場合、「アミノ酸」という用語は、広義には、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る任意の化合物および/または物質を指す。一部の実施形態においては、アミノ酸は、一般構造H2N−C(H)(R)−COOHを有する。一部の実施形態においては、アミノ酸は、天然由来のアミノ酸である。一部の実施形態においては、アミノ酸は合成アミノ酸であり、一部の実施形態においては、アミノ酸はD−アミノ酸であり、一部の実施形態においては、アミノ酸はL−アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然由来のペプチドにおいて一般に見出される20種の標準的なL−アミノ酸のいずれかを指す。「非標準アミノ酸」は、合成により調製されるものであるか天然源から得られるものであるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。本明細書において使用する場合、「合成アミノ酸」は化学修飾アミノ酸を包含し、化学修飾アミノ酸としては、塩、アミノ酸誘導体(アミドなど)、および/または置換体が含まれるが、これらに限定されない。ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸および/またはアミノ末端アミノ酸を含めたアミノ酸は、それらの活性に悪影響を及ぼすことなく、メチル化、アミド化、アセチル化、および/または、他の化学物質での置換によって修飾することができる。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与することができる。「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、遊離アミノ酸、および/またはペプチドのアミノ酸残基を指すことができる。その用語が遊離アミノ酸、またはペプチドの残基のいずれを指すかは、その用語が使用される文脈から明らかになる。本明細書においては、全てのアミノ酸残基配列は、左右の方向が、アミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向になっている式によって示していることに留意するべきである。
[0047]2つ以上の配列間での「同一性%」を決定するための、選択された配列の好ましいアライメントは、例えば、MacVectorバージョン13.0.7のCLUSTAL−Wプログラムを使用し、10.0のオープンギャップペナルティー、0.1のエクステンディッドギャップペナルティーを含むデフォルトパラメーター、およびBLOSUM30類似度マトリックスを用いて動作させて行う。
a.遅いkoff(改変ヌクレオチドに対して)
b.速いkon(改変ヌクレオチドに対して)
c.高忠実度
d.低エキソヌクレアーゼ活性
e.DNA鎖置換
f.より速いkchem(改変ヌクレオチド基質に対して)
g.向上した安定性
h.処理能力
i.塩耐性
j.ナノポアへの取付けの適合性
k.4、5、6、7、または8個のリン酸を有するヌクレオチドポリリン酸、例えばヌクレオチド四リン酸、ヌクレオチド五リン酸、ヌクレオチド六リン酸、ヌクレオチド七リン酸、またはヌクレオチド八リン酸を組み込む能力
l.シーケンシング精度
m.長いリード長、すなわち長時間連続性解読。
命名法
[0067]本明細書および特許請求の範囲において、アミノ酸残基の従来の1文字表記および3文字表記を使用する。
[0069]元のアミノ酸(1つまたは複数):位置(1つまたは複数):置換したアミノ酸(1つまたは複数)。この命名法によれば、例えば、位置242におけるセリンのアラニンによる置換は、
Ser242AlaまたはS242A
として示す。
Ala30Asp+Glu34SerまたはA30N+E34S
は、位置30および34における、アラニンとグルタミン酸をそれぞれアスパラギンとセリンに置換する変異を表す。
[0072]別段に述べられていない限り、残基の番号は、配列番号2の残基の番号付けに対応する。
ポリメラーゼの部位特異的突然変異誘発
[0073]クロストリジウムファージphiCPV4野生型配列は、本明細書において示しており(配列番号3、核酸コード領域およびHisタグ;配列番号1、タンパク質コード領域)、他の場所で入手可能である(National Center for BioinformaticsまたはGenBank受入番号AFH27113)。
ナノポア構築および挿入
[0076]本明細書において記載する方法は、ポリメラーゼがナノポアに付いたナノポアを使用することができる。一部の場合においては、(例えば、各ナノポアで1つのみの核酸分子がシーケンシングされるように)ナノポア1つ当たりただ1つのポリメラーゼを有することが望ましい。しかしながら、例えばアルファ溶血素(aHL)を含めた多くのナノポアは、複数のサブユニット(例えば、aHLでは7サブユニット)を有する多量体タンパク質であり得る。サブユニットは、同じポリペプチドの同一複製物であり得る。本明細書においては、無改変サブユニット(例えば、a−HL)に対する改変サブユニット(例えば、a−HLバリアント)の規定された比を有する多量体タンパク質(例えば、ナノポア)を提供する。本明細書においては、無改変サブユニットに対する改変サブユニットの規定された比を有する多量体タンパク質(例えば、ナノポア)を作製する方法も提供する。
100Pm=100[n!/m!(n−m)!]・fmut m・fwt n〜m、式中
Pm=m個の変異体サブユニットを有する細孔の確率
n=サブユニットの総数(例えば、aHLでは7個)
m=「変異体」サブユニットの数
fmut=一緒に混合した変異体サブユニットの割合または比
fwt=一緒に混合した野生型サブユニットの割合または比
[0082]当該方法は、複数のタンパク質を分画して、第2のサブユニット2725に対する第1のサブユニットの第2の比を有するタンパク質の割合を増やすことをさらに含むことができる。例えば、ただ1つの改変サブユニットを有するナノポアタンパク質を単離することができる(例えば、第2の比は1:6)。しかしながら、いずれの第2の比も好適である。第2の比の分布も分画することができ、例えば、1つまたは2つのいずれかの改変サブユニット有するタンパク質の割合を増やすことができる。WO2014/074727の図27に示されているように、タンパク質を形成するサブユニットの総数は7個であるとは限らない(例えば、異なるナノポアを使用することができ、または6個のサブユニットを有するアルファ溶血素ナノポアが形成し得る)。一部の場合においては、1つのみの改変サブユニットを有するタンパク質の割合を増やす。このような場合においては、第2の比は、第1のサブユニット(n−1)個当たり、第2のサブユニット1個であり、nはタンパク質を構成するサブユニットの数である。
ナノポアに付けられたポリメラーゼ
[0087]一部の場合においては、ポリメラーゼ(例えば、DNAポリメラーゼ)は、ナノポアに付けられ、かつ/または、ナノポアの近傍に配置される。ポリメラーゼは、ナノポアが膜に組み込まれる前または後に、ナノポアに付けることができる。一部の例においては、ナノポアおよびポリメラーゼは融合タンパク質(すなわち、単一のポリペプチド鎖)である。
装置のセットアップ
[0093]ナノポアは、集積回路などの検出回路の検出電極に隣接して配置された膜に形成するか、または他の方法で埋め込んでもよい。集積回路は、特定用途向け集積回路(ASIC)としてもよい。一部の例においては、集積回路は電界効果トランジスターまたは相補型金属酸化膜半導体(CMOS)である。検出回路は、ナノポアを有するチップもしくは他のデバイスに位置するか、または、チップもしくはデバイスの外部に、例えばオフチップ配置などで位置することができる。半導体は任意の半導体とすることができ、IV族半導体(例えば、ケイ素)、およびIII−V族半導体(例えば、ヒ化ガリウム)が含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオチドまたはタグを検出するための装置およびデバイスのセットアップについては、例えば、WO2013/123450を参照のこと。
[0097]この実施例では、pol6ポリメラーゼへの所望の位置での変異導入を説明している。
[00101]最初のスクリーニング用に、合理的位置の各々を、Q5突然変異誘発プロトコールを用いて、Gly、Ala、Leu、Glu、Gln、Lys、His、Tyr、Pro、Trp、Thr、またはMetに変異させた。
[00103]順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、NEBから購入したT4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)を使用して、ハイスループット(HTP)フォーマットで5’リン酸化した。典型的な25μl反応物は、10μMのプライマー15μl、5倍反応バッファー(NEBより)5μl、PNK酵素1.25μl、水3.75μlを含有した。反応は37℃で30分間行い、酵素は65℃で20分間熱失活させた。
[00106]Dpn1で処理したPCR産物2.5μlをBlunt/TAリガーゼマスターミックス2.5μlに加える。室温で1時間インキュベートした。
[00108]PCRデバイスを使用して、正確に30秒間、42℃で熱ショックを与え、氷上に2分間置く。
[00110]SOCまたは超純水100μlを加え、カナマイシン50〜100μg/mlを含む48ウェルLB寒天プレートに蒔く。
[00111]以下の実施例では、pol6バリアントをハイスループット法を用いてどのように発現させて精製したかを詳しく述べる。
[00117]この実施例では、バリアントポリメラーゼの活性を測定する方法を示す。
置換アッセイプロトコール
[00118]このアッセイでは、DNA鎖にヌクレオチドポリリン酸を組み込む変異体ポリメラーゼの能力、および2本鎖DNAをほどいて置換する変異体ポリメラーゼの能力を特性決定する。
低塩
[00121]試薬Aを希釈液として使用して、1.42倍にて4種の異なるヌクレオチド条件を作製する。
[00123]試薬Aを希釈液として使用して、1.42倍にて4種の異なるヌクレオチド条件を作製する。
[00125]ヌクレオチド条件2では、低濃度の六リン酸での活性について試験する。
[00126]ヌクレオチド条件3では、誤組み込み率(すなわち、忠実度)について試験する。変異体ポリメラーゼが、必要な4種のヌクレオチドのうちの3種のみでの有意な活性を示す場合には、変異体ポリメラーゼは、DNA鎖の延長中に正しいヌクレオチドまたは誤ったヌクレオチドを識別しないと結論する。
試薬A/ヌクレオチドミックス23μl
ポリメラーゼ(1〜10μM)2μl
を加える。
[00130]各ウェルに1.4M NaCl5μlを加えてNaCl濃度を300mMに上げるか、または各ウェルに525mM NaCl5μlを加えてNaCl濃度を150mMに上げる。
[00132]BMG LABTECHプレートリーダーにおいて、試薬B10μlを注入して、蛍光シグナルを2〜10分間読み取る。
[00134]下記のストップトフローアッセイを使用して、バリアントポリメラーゼのkoff速度を測定した。
[00138]試薬AとBを混合すると、dCTPはdCnP−Cy3と会合を競合し、dCTP濃度が過剰であるならば蛍光の増加が観測される。アッセイは、ストップフローデバイス(Kintek Corp)または蛍光プレートリーダーのいずれかを用いて行うことができる。時間に対する蛍光の増加を一次または二次指数関数にフィッティングして、その特定のポリメラーゼの速度定数koffを得る。
[00141]この実施例では、蛍光偏光を用いる、koffを測定する代替方法を示す。
[00142]トリス25mM pH7.0、KCl75mM、Triton−X100 0.01%、1×BSA(100ug/ml)、EDTA0.5mM、CaCl2 2mM、DTT2mMを含むアッセイバッファーを使用して、ヘアピンフルオレセイン標識DNA鋳型およびdC6P−C6−Cy3タグ付きヌクレオチド250nMを含有するアッセイマスターミックスを調製した。マスターミックス55μlを黒色96ウェルCostarプレートのウェルの各々に加え、培養物1mlから精製したポリメラーゼ変異体20μlをハイスループット(HTP)フォーマットで加えた。プレートは、プレート振盪機で1分間振盪し、ポリメラーゼ−DNA鋳型−ヌクレオチドの均一な三元複合体を形成させた。プレートをBMG Polarstarプレートリーダー(BMG LABTECH Inc.、North Carolina)に置き、2000周辺でのゲインを有するよう標的ミリ偏光を200mPおよび10%に調節した。励起フィルターは485nMに設定し、発光フィルターは590〜20nMに設定した。注射器に、1mM dCTP追跡ヌクレオチド溶液1mlを詰めた。データは、1インターバルにつき1ウェル当たり最低30フラッシュで、開始の合計読取り時間60秒で収集した。遅い解離を示したヒット変異体では、フラッシュを50以上に増加させ、より長い読取り時間を取った。データ収集は、1mM dCTP25μlの注入で開始した。
[00144]蛍光偏光に基づくkoffアッセイからの、2種のバリアントポリメラーゼ(S366A+N535L+I652Q(B6)およびS366A+P542E+I652Q(C6))の代表的なデータについては、図6を参照のこと。mPはミリ偏光である。あらかじめ形成させた、ポリメラーゼ−DNA鋳型−dCnP−Alexa555の三元複合体を、未変性dCTPを用いて追跡し、偏光dCnP−Alexa555をある時間にわたってモニターした。
[00145]この実施例では、バリアントポリメラーゼのkchemを測定するためのFRETに基づくアッセイを示す。
[00149]試薬AとBを混合すると、ポリメラーゼ−フルオレセイン−鋳型−プライマー複合体はdCnP−Cy3に結合し、蛍光が消光する。Mg2+は、ポリメラーゼがヌクレオチドを組み込むことを可能にし、ヌクレオチドは切断産物である、Cy3が付いたピロリン酸、nP−Cy3を放出する。消光剤が放出されるので、蛍光は増加する。アッセイは、ストップフローデバイス(Kintek Corp)または蛍光プレートリーダーのいずれかを用いて行うことができる。
[00151]この実施例では、バリアントポリメラーゼをナノポア、例えばα−溶血素に付ける方法を示す。
[00156]この実施例では、ナノポアに結合したバリアントポリメラーゼがタグ付きヌクレオチドに結合して、それによりポリメラーゼが付いたナノポアで閉鎖チャネル電流の検出を可能にさせる、バリアントポリメラーゼの能力を示す。
[00159]ナノポアに結合したバリアントポリメラーゼのタグ付きヌクレオチドに結合する能力は、静的捕獲実験において測定した。静的捕獲実験では、タグ付きヌクレオチドがポリメラーゼに結合し、タグ付きヌクレオチドがナノポアに呈示されたときに閉鎖チャネル電流を測定する。静的捕獲実験はCa2+の存在下で行い、Ca2+は、DNAの触媒作用および伸長を妨げ、また同じ種類のタグ付きヌクレオチドの繰り返しの捕獲を検出することを可能にする。この実験においては、使用したタグ付きヌクレオチドはdTnP−タグであった。
[00161]Pol6(S366A+N535L+I652Q)−DNA複合体によるタグ付きチミジンヌクレオチド(タグはT30である(配列番号9))の静的捕獲は、二重層の上下でのHepes7.5 20mM、NaCl300mM、CaCl2 3mM、およびTCEP5mMの存在下で、100mVで記録した。
[00166]この実施例では、ローリングサークル型アッセイにおけるポリヌクレオチド鋳型の増幅を説明する。
[00168]合計反応容量40μl(試薬A28μl+2μMポリメラーゼ2μl+試薬B10μl)でアッセイを行った。
[00173]所定の時点にて試料10μlを反応物から取り出し、EDTA50mMを含むホルムアミド10μlに加えて反応を失活させた。試料は、0分、10分、30分、および40分の時点で取った。
[00176]Biorad GEL DOC EZ撮像装置の青色トレーを使用して、ゲルの画像を取得した。
[00179]この実施例では、バリアントポリメラーゼが、バイオチップでの合成法によるシーケンシングにおいて機能的であることを示す。
配列番号1−野生型Pol6(DNAポリメラーゼ[クロストリジウムファージphiCPV4];GenBank:AFH27113.1)
1 mdkhtqyvke hsfnydeykk anfdkiecli fdtesctnye ndntgarvyg wglgvtrnhn 061 miygqnlnqf wevcqnifnd wyhdnkhtik itktkkgfpk rkyikfpiav hnlgwdvefl 121 kyslvengfn ydkgllktvf skgapyqtvt dveepktfhi vqnnnivygc nvymdkffev 181 enkdgsttei glcldffdsy kiitcaesqf hnyvhdvdpm fykmgeeydy dtwrspthkq 241 ttlelryqyn diymlrevie qfyidglcgg elpltgmrta ssiafnvlkk mtfgeektee 301 gyinyfeldk ktkfeflrkr iemesytggy thanhkavgk tinkigcsld inssypsqma 361 ykvfpygkpv rktwgrkpkt eknevyliev gfdfvepkhe eyaldifkig avnskalspi 421 tgavsgqeyf ctnikdgkai pvykelkdtk lttnynvvlt sveyefwikh fnfgvfkkde 481 ydcfevdnle ftglkigsil yykaekgkfk pyvdhftkmk venkklgnkp ltnqakliln 541 gaygkfgtkq nkeekdlimd knglltftgs vteyegkefy rpyasfvtay grlqlwnaii 601 yavgvenfly cdtdsiycnr evnsliedmn aigetidkti lgkwdvehvf dkfkvlgqkk 661 ymyhdckedk tdlkccglps darkiiigqg fdefylgknv egkkqrkkvi ggcllldtlf 721 tikkimf
配列番号2−Pol6(Hisタグ付き)
MHHHHHHHHS GGSDKHTQYV KEHSFNYDEY KKANFDKIEC LIFDTESCTN 50
YENDNTGARV YGWGLGVTRN HNMIYGQNLN QFWEVCQNIF NDWYHDNKHT 100
IKITKTKKGF PKRKYIKFPI AVHNLGWDVE FLKYSLVENG FNYDKGLLKT 150
VFSKGAPYQT VTDVEEPKTF HIVQNNNIVY GCNVYMDKFF EVENKDGSTT 200
EIGLCLDFFD SYKIITCAES QFHNYVHDVD PMFYKMGEEY DYDTWRSPTH 250
KQTTLELRYQ YNDIYMLREV IEQFYIDGLC GGELPLTGMR TASSIAFNVL 300
KKMTFGEEKT EEGYINYFEL DKKTKFEFLR KRIEMESYTG GYTHANHKAV 350
GKTINKIGCS LDINSSYPSQ MAYKVFPYGK PVRKTWGRKP KTEKNEVYLI 400
EVGFDFVEPK HEEYALDIFK IGAVNSKALS PITGAVSGQE YFCTNIKDGK 450
AIPVYKELKD TKLTTNYNVV LTSVEYEFWI KHFNFGVFKK DEYDCFEVDN 500
LEFTGLKIGS ILYYKAEKGK FKPYVDHFTK MKVENKKLGN KPLTNQAKLI 550
LNGAYGKFGT KQNKEEKDLI MDKNGLLTFT GSVTEYEGKE FYRPYASFVT 600
AYGRLQLWNA IIYAVGVENF LYCDTDSIYC NREVNSLIED MNAIGETIDK 650
TILGKWDVEH VFDKFKVLGQ KKYMYHDCKE DKTDLKCCGL PSDARKIIIG 700
QGFDEFYLGK NVEGKKQRKK VIGGCLLLDT LFTIKKIMF* 739
配列番号3−Hisタグ付きPol6(DNA配列)
ATGCATCACC ATCATCATCA CCACCACAGC GGCGGTTCCG ACAAACACAC 50
GCAGTACGTC AAAGAGCATA GCTTCAATTA TGACGAGTAT AAGAAAGCGA 100
ATTTCGACAA GATCGAGTGC CTGATCTTTG ACACCGAGAG CTGCACGAAT 150
TATGAGAACG ATAATACCGG TGCACGTGTT TACGGTTGGG GTCTTGGCGT 200
CACCCGCAAC CACAATATGA TCTACGGCCA AAATCTGAAT CAGTTTTGGG 250
AAGTATGCCA GAACATTTTC AATGATTGGT ATCACGACAA CAAACATACC 300
ATTAAGATTA CCAAGACCAA GAAAGGCTTC CCGAAACGTA AGTACATTAA 350
GTTTCCGATT GCAGTTCACA ATTTGGGCTG GGATGTTGAA TTCCTGAAGT 400
ATAGCCTGGT GGAGAATGGT TTCAATTACG ACAAGGGTCT GCTGAAAACT 450
GTTTTTAGCA AGGGTGCGCC GTACCAAACC GTGACCGATG TTGAGGAACC 500
GAAAACGTTC CATATCGTCC AGAATAACAA CATCGTTTAT GGTTGTAACG 550
TGTATATGGA CAAATTCTTT GAGGTCGAGA ACAAAGACGG CTCTACCACC 600
GAGATTGGCC TGTGCTTGGA TTTCTTCGAT AGCTATAAGA TCATCACGTG 650
TGCTGAGAGC CAGTTCCACA ATTACGTTCA TGATGTGGAT CCAATGTTCT 700
ACAAAATGGG TGAAGAGTAT GATTACGATA CTTGGCGTAG CCCGACGCAC 750
AAGCAGACCA CCCTGGAGCT GCGCTACCAA TACAATGATA TCTATATGCT 800
GCGTGAAGTC ATCGAACAGT TTTACATTGA CGGTTTATGT GGCGGCGAGC 850
TGCCGCTGAC CGGCATGCGC ACCGCTTCCA GCATTGCGTT CAACGTGCTG 900
AAAAAGATGA CCTTTGGTGA GGAAAAGACG GAAGAGGGCT ACATCAACTA 950
TTTTGAATTG GACAAGAAAA CCAAATTCGA GTTTCTGCGT AAGCGCATTG 1000
AAATGGAATC GTACACCGGT GGCTATACGC ACGCAAATCA CAAAGCCGTT 1050
GGTAAGACTA TTAACAAGAT CGGTTGCTCT TTGGACATTA ACAGCTCATA 1100
CCCTTCGCAG ATGGCGTACA AGGTCTTTCC GTATGGCAAA CCGGTTCGTA 1150
AGACCTGGGG TCGTAAACCA AAGACCGAGA AGAACGAAGT TTATCTGATT 1200
GAAGTTGGCT TTGACTTCGT GGAGCCGAAA CACGAAGAAT ACGCGCTGGA 1250
TATCTTTAAG ATTGGTGCGG TGAACTCTAA AGCGCTGAGC CCGATCACCG 1300
GCGCTGTCAG CGGTCAAGAG TATTTCTGTA CGAACATTAA AGACGGCAAA 1350
GCAATCCCGG TTTACAAAGA ACTGAAGGAC ACCAAATTGA CCACTAACTA 1400
CAATGTCGTG CTGACCAGCG TGGAGTACGA GTTCTGGATC AAACACTTCA 1450
ATTTTGGTGT GTTTAAGAAA GACGAGTACG ACTGTTTCGA AGTTGACAAT 1500
CTGGAGTTTA CGGGTCTGAA GATTGGTTCC ATTCTGTACT ACAAGGCAGA 1550
GAAAGGCAAG TTTAAACCTT ACGTGGATCA CTTCACGAAA ATGAAAGTGG 1600
AGAACAAGAA ACTGGGTAAT AAGCCGCTGA CGAATCAGGC AAAGCTGATT 1650
CTGAACGGTG CGTACGGCAA ATTCGGCACC AAACAAAACA AAGAAGAGAA 1700
AGATTTGATC ATGGATAAGA ACGGTTTGCT GACCTTCACG GGTAGCGTCA 1750
CGGAATACGA GGGTAAAGAA TTCTATCGTC CGTATGCGAG CTTCGTTACT 1800
GCCTATGGTC GCCTGCAACT GTGGAACGCG ATTATCTACG CGGTTGGTGT 1850
GGAGAATTTT CTGTACTGCG ACACCGACAG CATCTATTGT AACCGTGAAG 1900
TTAACAGCCT CATTGAGGAT ATGAACGCCA TTGGTGAAAC CATCGATAAA 1950
ACGATTCTGG GTAAATGGGA CGTGGAGCAT GTCTTTGATA AGTTTAAGGT 2000
CCTGGGCCAG AAGAAGTACA TGTATCATGA TTGCAAAGAA GATAAAACGG 2050
ACCTGAAGTG TTGCGGTCTG CCGAGCGATG CCCGTAAGAT TATCATTGGT 2100
CAAGGTTTCG ACGAGTTTTA TCTGGGCAAA AATGTCGAAG GTAAGAAGCA 2150
ACGCAAAAAA GTGATCGGCG GTTGCCTGCT GCTGGACACC CTGTTTACGA 2200
TCAAGAAAAT CATGTTCTAA 2220
特許文献
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Claims (7)
- DNAポリメラーゼ活性を有する改変DNAポリメラーゼであって、配列番号2に記載する親ポリメラーゼのアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記改変DNAポリメラーゼのアミノ酸配列が、S366Aの置換を有し、ならびにN535Lおよび/またはP542Eの置換を有する、前記改変DNAポリメラーゼ。
- 前記アミノ酸配列が、H223、N224、Y225、H227、I295、Y342、T343、I357、S360、L361、I363、S365Q、Y367、P368、D417、E475、Y476、F478、K518、H527、T529、M531、G539、N545、Q546、A547、L549、I550、N552、G553、F558、A596、G603、A610、V615、Y622、C623、D624、I628、Y629、R632、N635、M641、A643、I644、T647、I648、T651、I652、K655、W656、D657、V658、H660、F662、L690、およびそれらの組合せからなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、請求項1に記載の改変DNAポリメラーゼ。
- 前記置換が、H223A、N224Y/L、Y225L/T/I/F/A、H227P、I295W/F/M/E、Y342L/F、T343N/F、I357G/L/Q/H/W/M/A/E/Y/P、S360G、L361M/W/V、I363V、S365Q/W/M/A/G、Y367L/E/M/P/N、P368G、D417P、E475D、Y476V、F478L、K518Q、H527W/R/L、T529M/F、M531H/Y/A/K/R/W/T/L/V、G539Y/F、N545K/D/S/L/R、Q546W/F、A547M/Y/W/F/V/S、L549Q/Y/H/G/R、I550A/W/T/G/F/S、N552L/M/S、G553S/T、F558P/T、A596S、G603T、A610T/E、V615A/T、Y622A/M、C623G/S/Y、D624F、I628Y/V/F、Y629W/H/M、R632L/C、N635D、M641L/Y、A643L、I644H/M/Y、T647G/A/E/K/S、I648K/R/V/N/T、T651Y/F/M、I652Q/G/S/N/F/T、K655G/F/E/N、W656E、D657R/P/A、V658L、H660A/Y、F662I/L、L690M、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項2に記載の改変DNAポリメラーゼ。
- 前記ポリメラーゼが、4、5、6、7、または8個のリン酸を有するヌクレオチドポリリン酸を、成長しているDNA鎖に組み込む能力を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の改変DNAポリメラーゼ。
- S366A+N535L;
S366A+N535L+A547M;
S366A+P542E+N545K;
S366A+P542E+I652Q;
S366A+N535L+T529M;
S366A+N535L+I652Q;
S366A+N535L+N545K;
T651Y+P542E+S366A;
S366A+N535L+I652Q+T529M;
S366A+N535L+I652Q+A547Y;
S366A+N535L+A547M+T647G;
S366A+N535L+A547M+T647G+S360G;
S366A+N535L+I652Q+A547Y+K655G;
から選択される、請求項1に記載の改変DNAポリメラーゼ。 - 親ポリメラーゼよりも小さいk off を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の改変DNAポリメラーゼ。
- 0.0583以下のk off を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の改変DNAポリメラーゼ。
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