CN103987844B - 具有改进活性的dna聚合酶 - Google Patents

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Abstract

公开了相对于对应的未修饰的聚合酶具有增强的逆转录酶效率的DNA聚合酶。该聚合酶可用于多种公开的引物延伸方法中。还公开了相关的组合物，包括可用于，例如，DNA聚合酶生产的重组核酸、载体以及宿主细胞。

Description

具有改进活性的DNA聚合酶
发明领域
本发明提供了具有改进活性(包括增强的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率和/或逆转录酶(RT)和聚合酶抑制剂的耐受性)的DNA聚合酶，以及这种聚合酶在各种应用中的用途，包括核酸多核苷酸延伸和扩增中的用途。
发明背景
DNA聚合酶负责基因组的复制和维护，这是在世代间(from generation to generation)精确传递遗传信息的中心职责。DNA聚合酶在细胞中的功能是作为负责DNA合成的酶。它们在有金属活化剂如Mg2+存在的情况下，以被复制的DNA模板或多核苷酸模板支配的顺序聚合脱氧核糖核苷三磷酸。在体内，DNA聚合酶参与一系列DNA合成过程，包括DNA复制、DNA修复、重组和基因扩增。在每一DNA合成过程期间，复制DNA模板一次或最多几次以产生相同的复制品。与此相反，在体外，DNA复制可以重复多次，例如在聚合酶链式反应期间(参见例如美国专利号 4,683,202)。
在聚合酶链式反应(PCR)的最初研究中，DNA聚合酶是在每一轮DNA复制的开始时添加的(参见上述美国专利号4,683,202)。后来，确认了从在高温下生长的细菌中可获得热稳定DNA聚合酶，且这些酶只需要添加一次(参见美国专利号4,889,818和美国专利号4,965,188)。在PCR期间使用的高温下，这些酶没有不可逆地失活。因此，可以进行聚合酶链式反应的重复循环而不需要在每一合成加成过程开始时添加新鲜的酶。DNA聚合酶特别是热稳定聚合酶，是重组DNA研究和疾病的医疗诊断中大量技术的关键。特别是对于诊断应用，目标核酸序列可能仅仅是所考察(in question)DNA或RNA的一小部分，因此在不扩增的情况下可能难以检测到目标核酸序列的存在。
DNA聚合酶的总体折叠模式类似人的右手，并包含手掌、手指和拇指三个不同的亚结构域。(参见Beese等, Science 260:352-355, 1993)；Patel等, Biochemistry 34:5351-5363, 1995)。尽管在大小和细胞功能不同的聚合酶之间手指和拇指亚结构域的结构变化很大，但是催化性的手掌亚结构域全部都是重叠的(superimposable)。例如，在化学催化作用期间与引入的dNTP相互作用并稳定过渡态的基序A在哺乳动物polα和原核生物的pol I家族DNA聚合酶之间是重叠的，平均偏差约为1Å(Wang等, Cell 89:1087 -1099, 1997)。在结构上基序A以主要包含疏水性残基的反向平行β-折叠链起始，并延续到α-螺旋。DNA聚合酶活性位点的主要氨基酸序列是特别保守的。在基序A的情况下，例如，序列DYSQIELR(SEQ ID NO:22)保留在从数百万年进化分离的生物体包括例如水生栖热菌(Thermus aquaticus)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和大肠杆菌(Escherichia coli)的聚合酶中。
除了高度保守以外，DNA聚合酶的活性位点也被证明是相对易变的，能够容纳某些氨基酸取代而不显著降低DNA聚合酶活性。(参见例如，美国专利号6,602,695)。这种突变型DNA聚合酶可以在例如包括核酸合成反应的诊断和研究应用中提供各种选择优势。
在DNA聚合的酶促过程中存在至少两个步骤：1 )掺入进入的核苷酸和2)延伸新掺入的核苷酸。DNA聚合酶的整体忠诚度或“保真度”通常被看作这两种酶活性的联合（conglomerate），但步骤是不同的。DNA聚合酶可错误掺入进入的核苷酸，但如果其不能被有效地延伸，延伸速率将严重降低，且整体产物形成将是极小的。或者，也可能具有错误掺入进入的核苷酸且容易错误延伸新形成的错配的DNA聚合酶。在这种情况下，整体延伸速率将是高的，但整体保真度将是低的。当使用Mn2+作为二价金属离子活化剂时，这种类型的酶的一个实例是ES112 DNA聚合酶(E683R Z05 DNA聚合酶；参见US 7,179,590)。该酶具有非常高的效率，因为不像当遇到错配时倾向于犹豫/停止的典型DNA聚合酶，ES112 DNA聚合酶容易延伸错配。ES112中显示的表型在RT步骤过程中更加明显，大概是因为RNA/DNA异源双链体相比于DNA/DNA同源双链体的结构影响。第二个实例是，如果DNA聚合酶不容易错误掺入(可能甚至不太可能错误掺入)，但确实具有增加的错误延伸错配的能力。在这种情况下，对于整体产物，保真度没有显著改变。通常，在Mn2+中，这种类型的酶比ES112的特征更有利于延伸反应，因为该产物的保真度得到了改进。然而，可以利用这种属性以允许错误延伸错配的寡核苷酸引物，诸如当单一序列的寡核苷酸引物杂交到具有序列异质性的目标(例如，病毒目标)，但正常或较低的错误掺入速率允许超越初始寡核苷酸引物完成DNA合成。这种类型的DNA聚合酶的一个实例是Z05 D580G DNA聚合酶(参见美国专利公开号2009/0148891)。这种类型的活性被称为“错配耐受的”，因为它对寡核苷酸引物中的错配更耐受。尽管上面的实例已经讨论了引物延伸型反应，但是在其中引物延伸频繁再次发生的反应诸如RT-PCR和PCR中该活性可以更加显著。数据表明，尽管酶诸如Z05 D580G对错配更加“耐受”，但是它们还具有增强的延伸含有经修饰的碱基(例如，叔丁基苄基修饰的碱基)或存在DNA结合染料诸如SYBR Green I(参见美国专利公开号2009/028053)的寡核苷酸引物的能力。
逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)是在许多应用中用于通过扩增检测和/或定量RNA目标的技术。为了通过PCR扩增RNA目标，有必要首先将RNA模板逆转录成cDNA。通常，RT-PCR测定依赖于源自嗜常温生物体、用于初始cDNA合成步骤(RT)的非热稳定的逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)。在PCR中，需要额外的热稳定DNA聚合酶用于扩增cDNA 以耐受对于核酸变性所需的温度升高。使用工程改造的热活性或热稳定DNA聚合酶以进行更有效的逆转录用于RT-PCR测定具有几个潜在的益处。增强的逆转录酶活性连同使用更高的逆转录孵育温度的能力(其允许RNA模板二级结构的松弛)可以导致整体较高的cDNA合成效率和检测灵敏度。较高温度孵育也可以通过降低逆转录步骤中的错误引发而增加特异性。具有改进的逆转录效率的酶可以通过使RT孵育时间和/或酶浓度降低而简化测定设计。当使用dUTP和UNG时，含有在非严谨设置条件过程中形成的dUMP的非特异性延伸产物被UNG所降解，且不能被用作引物或模板。当使用源自嗜常温生物体的非热稳定的逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)时，不可能利用dUTP和UNG方法。(Myers, T.W.等人, Amplification of RNA: High Temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with Thermus thermophilus DNA Polymerase, 于PCR Strategies, Innis, M.A., Gelfand, D.H.,和Sninsky, J.J.,编, Academic Press, San Diego, CA, 58-68, (1995))。然而，使用本发明的热活性或热稳定DNA聚合酶用于逆转录步骤使反应与利用dUTP/尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)遗留物预防系统完全相容(Longo等人, Use of Uracil DNA Glycosylase to Control Carry-over Contamination in Polymerase Chain Reactions. Gene 93:125-128, (1990))。除提供遗留物污染对照以外，dUTP和UNG的使用提供了“热启动”以减少非特异性扩增(Innis和Gelfand 1999)。
发明概述
本文提供了相对于对应的未修饰的对照聚合酶具有改进的活性(包括增强的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率和/或RT和聚合酶抑制剂的耐受性)的DNA聚合酶以及制备和使用这种DNA聚合酶的方法。在一些实施方案中，相比于对照DNA聚合酶，改进的DNA聚合酶具有增强的逆转录酶效率。在一些实施方案中，相比于对照DNA聚合酶，改进的DNA聚合酶具有相同或基本上相似的DNA依赖性聚合酶活性。因此，在一些实施方案中，改进的DNA聚合酶包含与SEQ ID NO:1基本上相同（例如，至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%相同）的氨基酸序列，其中所述DNA聚合酶对应于SEQ ID NO:1的640位的氨基酸是除I以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，DNA聚合酶包含与SEQ ID NO:1至少90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，对照DNA聚合酶与所述DNA聚合酶具有相同的氨基酸序列，除了对照DNA聚合酶对应于SEQ ID NO:1的640位的氨基酸是I。例如，在一些实施方案中，改进的聚合酶对应于SEQ ID NO:1的640位的氨基酸选自G、A、V、R、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、L、M、或H。在一些实施方案中，在改进的聚合酶的对应于SEQ ID NO:1的640位的氨基酸是F。
在一些实施方案中，改进的DNA聚合酶还包含与SEQ ID NO:1基本上相同（例如，至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%相同）的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:1的580位的DNA聚合酶的氨基酸是除D或E以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的580位的DNA聚合酶的氨基酸是除D以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的580位的DNA聚合酶的氨基酸选自L、G、T、Q、A、S、N、R和K。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的580位的DNA聚合酶的氨基酸是G。
在一些实施方案中，改进的DNA聚合酶还包含与SEQ ID NO:1基本上相同（例如，至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%相同）的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:1的709位的DNA聚合酶的氨基酸是除I以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的709位的DNA聚合酶的氨基酸是K、R、S、G和A。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的709位的DNA聚合酶的氨基酸是K。
在一些实施方案中，改进的DNA聚合酶包含与SEQ ID NO:1基本上相同（例如，至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%相同）的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:1的640位的DNA聚合酶的氨基酸是除I以外的任何氨基酸，对应于SEQ ID NO:1的580位的氨基酸是除D或E以外的任何氨基酸，并且对应于SEQ ID NO:1的709位的氨基酸是除I以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，改进的DNA聚合酶包含与SEQ ID NO:1基本上相同（例如，至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%相同）的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:1的640位的DNA聚合酶的氨基酸是除I以外的任何氨基酸，其中对应于SEQ ID NO:1的580位的氨基酸选自L、G、T、Q、A、S、N、R和K；并且其中对应于SEQ ID NO:1的709位的氨基酸选自K、R、S、G和A。在所述DNA聚合物的某些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的580位的氨基酸是G；并且对应于SEQ ID NO:1的709位的氨基酸是K。在一些实施方案中，改进的DNA聚合酶包含与SEQ ID NO:1基本上相同（例如，至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%相同）的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:1的640位的DNA聚合酶的氨基酸是F，其中对应于SEQ ID NO:1的580位的氨基酸是G，并且其中对应于SEQ ID NO:1的709位的氨基酸是K。在一些实施方案中，DNA聚合酶具有与对照DNA聚合酶相比相同或基本上相似的DNA依赖性聚合酶活性。
在一些实施方案中，相比于对照DNA聚合酶，改进的DNA聚合酶具有增强的逆转录酶效率，而不会显著降低DNA依赖性聚合酶活性，其中对应于SEQ ID NO:1的640位的DNA聚合酶的氨基酸是除I以外的任何氨基酸，并且对应于SEQ ID NO:1的709位的氨基酸是除I以外的任何氨基酸，并且其中对照DNA聚合酶具有与所述DNA聚合酶相同的氨基酸序列，除了对应于SEQ ID NO:1的640位的对照DNA聚合酶的氨基酸是I，并且对应于SEQ ID NO:1的709位的氨基酸是I之外。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的640位的DNA聚合酶的氨基酸是F，并且对应于SEQ ID NO:1的709位的氨基酸是K。在一些实施方案中，改进的DNA聚合酶还包含在对应于SEQ ID NO:1的580位的氨基酸处的氨基酸取代。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的640位的DNA聚合酶的氨基酸是除I以外的任何氨基酸，对应于SEQ ID NO:1的709位的氨基酸是除I以外的任何氨基酸，并且对应于SEQ ID NO:1的580位的氨基酸是除D或E之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的640位的DNA聚合酶的氨基酸是F，对应于SEQ ID NO:1的709位的氨基酸是K，并且对应于SEQ ID NO:1的580位的氨基酸是G。
各种DNA聚合酶适于本发明的突变。尤其适合的是热稳定聚合酶，包括来自各种嗜热菌(thermophilic bacteria)菌种的野生型或天然存在的热稳定聚合酶，以及通过氨基酸取代、插入或缺失或其他修饰而源自这种野生型或天然存在的酶的合成的热稳定聚合酶。示例性的聚合酶的未修饰形式包括例如CS5、CS6或Z05 DNA聚合酶，或与其具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性的功能性DNA聚合酶。在某些实施方案中，氨基酸序列同一性为至少80％，优选至少90％并更优选至少95％。其他未修饰的聚合酶包括例如来自于下列嗜热菌菌种中任一种的DNA聚合酶(或与这种聚合酶具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性的功能性DNA聚合酶)：海栖热袍菌(Thermotoga maritima)；水生栖热菌(Thermus aquaticus)；嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)；黄栖热菌(Thermus flavus)；丝状栖热菌(Thermus filiformis)；栖热菌种Sps17(Thermus sp.sps17)；栖热菌种Z05(Thermus sp.Z05)；那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neopolitana)；非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)；Thermus caldophilus，耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)或热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)。在某些实施方案中，氨基酸序列同一性为至少80％，优选至少90%并且更优选至少95%。合适的聚合酶还包括具有逆转录酶(RT)活性和/或能够掺入非常规核苷酸如核糖核苷酸或其他2'-修饰的核苷酸的那些。
尽管具有有效的逆转录酶活性的热稳定性DNA聚合酶尤其适合用于进行RT-PCR，尤其适合单一酶RT-PCR，具有有效的逆转录酶活性的热活性的、但不是热稳定的DNA聚合酶也适于本发明的突变。例如，增强的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率、和/或RT抑制剂的耐受性的属性对于RT-PCR中的RT步骤是有用的，且该步骤不需要在失活热活性但非热稳定的DNA聚合酶的温度下进行。RT步骤后，热稳定的DNA聚合酶可以进行添加，或者它可以已经包括在反应混合物中以进行PCR扩增步骤。例如，如实施例中所描述的，本文描述的改进的DNA聚合酶可以与第二热稳定DNA聚合酶在RT步骤前在适合于延伸并扩增RNA和DNA模板的缓冲液中组合。合适的热稳定DNA聚合酶的实例描述于美国专利号4,889,818和美国专利号5,773, 258和5,677,152中。在一些实施方案中，所述第二热稳定DNA聚合酶是AmpliTaq® DNA 聚合酶(脱氧核苷三磷酸: DNA脱氧核苷酸转移酶, E.C.2.7.7.7)。在一些实施方案中，所述第二热稳定DNA聚合酶是可逆失活的热稳定聚合酶，如下文所描述的。在一个实施方案中，可逆失活的热稳定聚合酶是AmpliTaq Gold® DNA聚合酶(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)。该第二种方法将特别有利的，其通过使用经化学修饰的热稳定DNA聚合酶(或其他的HotStart技术以失活热稳定DNA聚合酶)，从而使得它在RT步骤期间没有完全活性。具有高效逆转录活性的热活性但非热稳定的DNA聚合酶的一个实例是来自生氢氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)的DNA聚合酶(Chy；SEQ ID NO:39)；参见，例如，美国专利号6,468,775和6,399,320。
在一些实施方案中，DNA聚合酶与选自下列的聚合酶具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的氨基酸序列同一性：
(a) 栖热菌种Z05DNA聚合酶(Z05) (SEQ ID NO:1)；
(b) 水生栖热菌DNA聚合酶(Taq) (SEQ ID NO:2)；
(c) 丝状栖热菌DNA聚合酶(Tfi) (SEQ ID NO:3)；
(d) 黄栖热菌DNA聚合酶(Tfl) (SEQ ID NO:4)；
(e) 栖热菌种sps17DNA聚合酶(Sps17) (SEQ ID NO:5)；
(f) 嗜热栖热菌DNA聚合酶(Tth) (SEQ ID NO:6)；和
(g) Thermus caldophilus DNA聚合酶(Tca) (SEQ ID NO:7)
(h) 生氢氧化碳嗜热菌DNA聚合酶(Chy) (SEQ ID NO:39)
在某些实施方案中，氨基酸序列同一性是至少80％，优选至少90％并且更优选至少95％。
在一些实施方案中，DNA聚合酶是栖热袍菌DNA聚合酶。例如，在一些实施方案中，DNA聚合酶与选自下列的聚合酶具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的氨基酸序列同一性：
(a) 海栖热袍菌DNA聚合酶(Tma) (SEQ ID NO:34)；
(b) 那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶(Tne) (SEQ ID NO:35)。
在某些实施方案中，氨基酸序列同一性是至少80％，优选至少90％并且更优选至少95％。
在一些实施方案中，DNA聚合酶与SEQ ID NO:1具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，氨基酸序列同一性是至少80％，优选至少90％并且更优选至少95％。
在一些实施方案中，DNA聚合酶是栖热菌种Z05 DNA聚合酶(Z05)DNA聚合酶 (即, SEQ ID NO:1)，且640位的氨基酸是除I以外的任何氨基酸。例如，在一些实施方案中，640位的氨基酸选自G、A、V、R、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、L、M或H。在一些实施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，且640位的氨基酸是F。在一些实施方案中，DNA聚合酶是进一步包含580位的取代的Z05 DNA聚合酶，且580位的氨基酸是除D或E以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，且580位的氨基酸是除D以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，且580位的氨基酸选自L、G、T、Q、A、S、N、R和K。在一些实施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，且580位的氨基酸是G。在一些实施方案中，DNA聚合酶是进一步包含709位的取代的Z05 DNA聚合酶，且709位的氨基酸是除I以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，且709位的氨基酸选自K、R、S、G和A。在一些实施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，且709位的氨基酸是K。
在一些实施方案中，对照DNA聚合酶是Z05、Z05 D580G或Z05 D580G I709K聚合酶。
突变的或改进的聚合酶可以包括其他非取代的修饰。一种这种修饰是热可逆的共价修饰，其使酶失活，但是在升高的温度，如通常用于多核苷酸延伸的温度下孵育后其被逆转而激活酶。美国专利号5,773, 258和5,677,152中描述了这种热可逆的修饰的示例性试剂。
在一些实施方案中，通过进行实时RT-PCR扩增且检测从pSP64 poly(A) (Promega)的HCV基因型Ib 5’NTR的前800个碱基生成的丙型肝炎病毒(HCV)转录物而确定逆转录酶活性。两个或更多的反应混合物可以具有滴定的拷贝数的丙型肝炎病毒(HCV)转录物(例如，在数个反应混合物中，1:5滴定，1:10滴定，例如，10,000拷贝, 1000拷贝, 100拷贝, 10拷贝, 1拷贝, 0拷贝)。如本文中所述，可以在预先选择的单位时间，将本发明的聚合酶的逆转录酶活性与参照聚合酶(例如，天然存在的、未修饰的、或对照聚合酶)的逆转录酶活性相比较。与天然存在的或未修饰的聚合酶相比，具有增强的逆转录酶活性的聚合酶将以更高的效率扩增转录物，或者，将需要更小的PCR循环数来扩增转录物(即，如本文计算，表现出更低的Cp值)。此外，在一些实施方案中，具有改进的RT功能的聚合酶也具有长链RNA(例如，至少500或1000或2000或5000或更多个核苷酸长)模板的改进的复制。在一些实施方案中，改进的逆转录酶效率包括相比于对照聚合酶更短的逆转录时间。因此，在一些实施方案中，具有增强的逆转录酶效率的聚合酶将比对照对参考聚合酶更快地逆转录RNA模板。
在各种其他方面，本发明提供了编码本文所述的突变的或改进的DNA聚合酶的重组核酸，包含该重组核酸的载体，和用所述载体转化的宿主细胞。在某些实施方案中，所述载体是表达载体。包含这种表达载体的宿主细胞可用于本发明的生产突变的或改进的聚合酶的方法，所述方法通过在适于表达重组核酸的条件下培养宿主细胞。反应混合物和/或试剂盒中可以包含本发明的聚合酶。重组核酸，宿主细胞，载体，表达载体，反应混合物和试剂盒的实施方案如上面和本文中所述。
在另一方面，提供了实施多核苷酸延伸的方法。该方法总体包括在适于引物延伸的条件下将本文所述的具有增强的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率和/或RT和聚合酶抑制剂的耐受性的DNA聚合酶与引物、多核苷酸模板以及三磷酸核苷接触，从而产生延伸的引物。多核苷酸模板可以是例如RNA或DNA模板。在某些实施方案中，引物延伸包含少于约五分钟的逆转录步骤。在某些实施方案中，适合于延伸的条件包含Mg2+。三磷酸核苷可以包括非常规核苷酸如核糖核苷酸和/或标记的核苷酸。此外，引物和/或模板可以包括一个或更多个核苷酸类似物。在一些变型中，多核苷酸延伸方法是用于多核苷酸扩增的方法，包括在适于多核苷酸扩增的条件下将突变的或改进的DNA聚合酶与引物对、多核苷酸模板以及三磷酸核苷接触。多核苷酸延伸反应可以是，例如，PCR，等温延伸，或测序(例如，454测序反应)。在某些实施方案中，引物延伸方法包含聚合酶链式反应(PCR)。多核苷酸模板可以是来自生物样品的任何类型。
任选地，引物延伸反应包含参考或未修饰的聚合酶的实际的或潜在的抑制剂。抑制剂可以抑制参考或未修饰(对照)聚合酶的核酸延伸速率和/或逆转录效率。在一些实施方案中，抑制剂是血红蛋白或其降解产物。例如，在一些实施方案中，血红蛋白降解产物是血红素分解产物，如氯高铁血红素、血卟啉、或胆红素。在一些实施方案中，抑制剂是铁螯合剂或紫色素。在其他实施方案中，抑制剂是肝素或黑色素。在某些实施方案中，抑制剂是嵌入染料。在一些实施方案中，嵌入染料是[2-[N-双-(3-二甲基氨基丙基)-氨基]-4-[2,3-二氢-3-甲基-(苯并-1,3-噻唑-2-基)-亚甲基]-1-苯基-喹啉鎓]+。在一些实施方案中，嵌入染料是[2-[N-(3-二甲基氨基丙基)-N-丙基氨基]-4-[2,3-二氢-3-甲基-(苯并-1,3-噻唑-2-基)-亚甲基]-1-苯基-喹啉鎓]+。在一些实施方案中，嵌入染料不是[2-[N-(3-二甲基氨基丙基)-N-丙基氨基]-4-[2,3-二氢-3-甲基-(苯并-1,3-噻唑-2-基)-亚甲基]-1-苯基-喹啉鎓]+。在一些实施方案中，适用于延伸的条件包含Mg++。在一些实施方案中，适用于延伸的条件包含Mn++。
本发明还提供了用于这种多核苷酸延伸方法中的试剂盒。通常，试剂盒包括至少一个提供本文所述的突变的或改进的DNA聚合酶的容器。在某些实施方案中，试剂盒进一步包括提供一种或更多种额外试剂的一个或更多个额外的容器。例如，在特定的变型中，一个或更多个额外的容器提供三磷酸核苷；适于多核苷酸延伸的缓冲剂；和/或在多核苷酸延伸条件下与预定的多核苷酸模板杂交的一种或多种引物或探针多核苷酸。多核苷酸模板可以是来自生物样品的任何类型。
进一步提供了包含本发明的聚合酶的反应混合物。反应混合物也可以包含模板核酸(DNA和/或RNA)，一种或多种引物或探针多核苷酸，三磷酸核苷(包括，例如，脱氧核糖核苷三磷酸，核糖核苷三磷酸，标记的三磷酸核苷，非常规的三磷酸核苷)，缓冲剂，盐，标记(例如，荧光团)。在一些实施方案中，反应混合物包含铁螯合剂或紫色染料。在某些实施方案中，反应混合物包含血红蛋白、或血红蛋白的降解产物。例如，在某些实施方案中，血红蛋白的降解产物包括血红素分解产物(如氯高铁血红素、高铁血红素、hematophoryn和胆红素)。在其他实施方案中，反应混合物包含肝素或其盐。任选地，反应混合物包含嵌入染料(包括但不限于上述那些或本文其他地方描述的那些)。在某些实施方案中，反应混合物含有从血液分离的模板核酸。在其他实施方案中，模板核酸是RNA，且反应混合物包含肝素或其盐。在一些实施方案中，反应混合物还包含Mg2+。
在某些实施方案中，反应混合物还包含第二热稳定DNA聚合酶。在一些实施方案中，反应混合物包含两种或更多种聚合酶。例如，在一些实施方案中，反应混合物包含如本文所述的具有增强的逆转录效率（例如，增强的延伸RNA模板的活性）的改进的DNA聚合酶，和具有DNA依赖性聚合酶活性的另一聚合酶。在一个实施方案中，反应混合物包含如本文所述的具有增强的逆转录效率的改进的DNA聚合酶，和第二热稳定DNA依赖性聚合酶的掺合物。所述第二热稳定DNA依赖性聚合酶可以是如上所述的可逆修饰的聚合酶，从而所述酶在适合于逆转录步骤的温度下失活，但在合适条件例如在约90o C-100o C的升高的温度下至多约12分钟的时期里被活化。如实施例中所述，例如，在热启动PCR反应中提供活化可逆失活的热稳定聚合酶的合适条件。合适的第二热稳定DNA依赖性聚合酶的实例描述于美国专利号5,773, 258和5,677,152中，见上文。
本文描述了本发明的进一步的实施方案。
定义
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。尽管基本上与本文所述的那些相似的任何方法和材料都可用于本发明的实践或试验，但是仅仅描述了示例性的方法和材料。对于本发明的目的，下列术语定义如下。
术语 “一(a)，”“一(an)，”和“该(the)”包括复数对象，除非上下文清楚地指出别的含义。
“氨基酸”是指可以并入肽、多肽或蛋白的任何单体单位。如本文所用，术语“氨基酸”包括下列20种天然或遗传编码的α-氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷胺酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。在其中“X”残基没有定义的情况下，这些应该定义为“任何氨基酸”。这20种天然氨基酸的结构见例如Stryer 等, BioChemistry, 5th ed., Freeman and Company(2002)。额外的氨基酸如硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸也能够被遗传编码(Stadtman (1996) “Selenocysteine,” Annu Rev Biochem. 65:83-100和Ibba等(2002) “Genetic code: introducing pyrrolysine,” Curr Biol. 12(13):R464-R466)。术语“氨基酸”还包括非天然氨基酸、修饰的氨基酸(例如，具有修饰的侧链和/或骨架)和氨基酸类似物。参见，例如Zhang等(2004) “Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887, Anderson等(2004) “An expanded genetic code with a functional quadruplet codon” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20):7566-7571, Ikeda等(2003) “Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo,” Protein Eng. Des. Sel. 16(9):699-706, Chin等(2003) “An Expanded Eukaryotic Genetic Code,” Science 301(5635):964-967, James等(2001) “Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues,” Protein Eng. Des. Sel. 14(12):983-991, Kohrer等(2001) “Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25):14310-14315, Bacher等(2001) “Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue,” J. Bacteriol. 183(18):5414-5425, Hamano-Takaku等(2000) “A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine,” J. Biol. Chem. 275(51):40324-40328, 和Budisa等(2001) “Proteins with {beta}-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids,” Protein Sci. 10(7):1281-1292。
为了进一步说明，氨基酸典型地为包括取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的羧基和一种或多种侧链或基团，或这些基团的任一种的类似物的有机酸。示例性的侧链包括，例如巯基、硒基、磺酰基、烷基、芳基、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼、氰基、卤素、酰肼、链烯基、炔基、醚基、硼酸酯(borate)、硼酸盐(boronate)、二氧磷基、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺或这些基团的任何组合。其他代表性的氨基酸包括但不限于，包含光敏交联剂的氨基酸、金属结合氨基酸、自旋标记的氨基酸、发荧光的氨基酸、包含金属的氨基酸、含新官能团的氨基酸、与其他分子共价或非共价相互作用的氨基酸、对光不稳(photocaged)和/或可光异构化的氨基酸、放射性氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化的氨基酸、其他碳水化合物修饰的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、化学可裂解的和/或光可裂解的氨基酸、包含碳连接糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、包含氨基硫代酸的氨基酸和包含一个或多个毒性部分的氨基酸。
术语“生物样品”涵盖从生物体获得的各种各样的样品类型，且可以用于诊断或监测测定中。该术语涵盖尿液、尿液沉渣、血液、唾液、和其他生物来源的液体样品、实体组织样品，如活检样本或组织培养物或由其衍生的细胞和其后代。该术语涵盖在其获得后以任何方式操作，如通过用试剂处理、溶解、沉降、或针对某些成分进行富集的样品。该术语涵盖临床样品，还包括细胞培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解液、血清、血浆、生物体液和组织样品。
在本发明的DNA聚合酶上下文中的术语“突变体”是指相对于对应的功能性的DNA聚合酶包含一个或多个氨基酸取代的多肽，典型为重组的。
在突变型聚合酶上下文中的术语“未修饰的形式”在本文中是用来定义本发明的突变型DNA聚合酶的术语：术语“未修饰的形式”是指具有除指定为表征突变型聚合酶的一个或多个氨基酸位置以外的突变型聚合酶的氨基酸序列的功能性DNA聚合酶。因此，在(a)其未修饰的形式和(b)一个或多个特定氨基酸取代的方面提到突变型DNA聚合酶是指除特定的一个或多个氨基酸取代以外，突变型聚合酶在特定的基序中另外具有与未修饰的形式相同的氨基酸序列。“未修饰的聚合酶”(和因此还有具有增强的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率和/或RT和聚合酶抑制剂的耐受性的修饰的形式)可以包含额外的突变以提供期望的功能性，例如双脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、核糖核苷酸类似物、染料标记的核苷酸的改进的掺入，调节5'-核酸酶活性，调节3'-核酸酶(或校正)活性等。因此，在实施本文所述的本发明时，DNA聚合酶的未修饰的形式是预先确定的。DNA聚合酶的未修饰的形式可以是，例如野生型和/或天然存在的DNA聚合酶，或已经有意识地修饰过的DNA聚合酶。聚合酶的未修饰的形式优选热稳定DNA聚合酶，如来自各种嗜热菌的DNA聚合酶以及与野生型或天然存在的热稳定聚合酶具有基本上序列同一性的其功能性变体。这种变体可以包括，例如，嵌合DNA聚合酶，如美国专利号6,228,628和7,148,049中所述的嵌合DNA聚合酶。在某些实施方案中，聚合酶的未修饰的形式具有逆转录酶(RT)活性。
术语“热稳定聚合酶”是指对热稳定的酶，其是耐热的，当经受升高的温度并持续影响双链核酸变性所必需的时间时，其保留足够的活性以影响随后的多核苷酸延伸反应，并且没有变得不可逆变性的(失活的)。核酸变性所需的加热条件是本领域熟知的，在例如美国专利号4,683,202、4,683,195和4,965,188中举例说明。如本文所述，热稳定聚合酶适于在温度循环变化的反应如聚合酶链式反应(“PCR”)中使用。用于本文目的的不可逆变性指酶活性的永久且完全的损失。对于热稳定聚合酶，酶活性是指以适当的方式催化核苷酸的组合以形成与模板核酸链互补的多核苷酸延伸产物。来自嗜热菌的热稳定DNA聚合酶包括，例如来自海栖热袍菌，水生栖热菌，嗜热栖热菌，黄栖热菌，丝状栖热菌，栖热菌种sps17，栖热菌种Z05，Thermus caldophilus，热坚芽孢杆菌，那不勒斯栖热袍菌和非洲栖热腔菌的DNA聚合酶。
术语“热活性的”是指在通常用于RT-PCR和/或PCR反应中逆转录或退火/延伸步骤的温度(即，45-80℃)保持催化性能的酶。热稳定酶是当经受对于核酸变性所必需的高温时不会被不可逆地失活或变性的那些酶。热活性的酶可以是或可以不是热稳定的。热活性的DNA聚合酶可以是DNA或RNA依赖的来自于嗜热种或嗜常温种，包括但不限于，大肠杆菌，莫洛尼小鼠白血病病毒(Moloneymurine leukemia viruses)和禽成髓细胞瘤病毒(Avian myoblastosis virus)。
如本文使用的，“嵌合”蛋白是指其氨基酸序列代表来自至少两种不同蛋白的氨基酸序列的子序列的融合产物的蛋白。嵌合蛋白典型地不是通过氨基酸序列的直接操作产生，而是从编码该嵌合氨基酸序列的“嵌合”基因表达的。在某些实施方案中，例如，本发明的突变型DNA聚合酶的未修饰形式是由来源于栖热菌种DNA聚合酶的氨基末端(N-末端)区域和来源于Tma DNA聚合酶的羧基末端(C-末端)区域组成的嵌合蛋白。N-末端区域是指从N-末端(氨基酸位置1)延伸到内部氨基酸的区域。类似地，C-末端区域是指从内部氨基酸延伸到C-末端的区域。
术语“适配子（aptamer）”是指识别并结合DNA聚合酶并有效抑制聚合酶活性的单链DNA，如美国专利号5,693,502中所述。还讨论了适配子和dUTP/UNG在RT-PCR中的用途，例如在Smith, E.S.等人(Amplification of RNA: High-temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with a Magnesium-activated Thermostable DNA Polymerase, in PCR Primer: A Laboratory Manual, 第2版, Dieffenbach, C.W.和Dveksler, G.S.,编辑, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 211-219, (2003))中。
在突变型DNA聚合酶的上下文中，与另一条序列(例如区域、片段、核苷酸或氨基酸位置等)的“对应”是基于根据核苷酸或氨基酸位置数编号并且然后以最大化序列同一性百分比的方式比对序列的规则。“对应于[特定序列]的[X]位”的氨基酸是指与指定的序列的等同氨基酸比对的目的多肽的氨基酸。通常，如本文中所述，对应于聚合酶的位置的氨基酸可以使用比对算法诸如如下所述的BLAST来确定。因为不是给定的“对应区域”内的所有位置都需要是相同的，所以对应区域内的非匹配位置可以被认为是“对应位置”。因此，如本文使用的，特定DNA聚合酶的“对应于氨基酸位置[X]的氨基酸位置”是指，基于比对，在其他DNA聚合酶和结构同源物和家族中的等效位置。在本发明的一些实施方案中，氨基酸位置的“对应”是根据包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、32、33、34、35、36、37或39的一个或多个基序的聚合酶区域来确定的。当聚合酶多肽序列不同于SEQ ID NOS:1、2、3、4、5、6、7、32、33、34、35、36、37或39(例如，通过氨基酸的变化或氨基酸的增加或缺失)时，可能与本文所讨论的改进的活性相关的特定突变将不是在与它在SEQ ID NOS:1、2、3、4、5、6、7、32、33、34、35、36、37或39中相同的位置数。例如，在表1中说明了这一点。
如本文使用的，“重组体”是指已经通过重组方法有意识地修饰过的氨基酸序列或核苷酸序列。本文中的术语“重组核酸”是指通常通过限制性内切核酸酶的核酸操作，最初在体外形成的以自然中通常不存在的形式的核酸。因此，线性形式的分离的突变型DNA聚合酶核酸或通过连接通常不结合的DNA分子体外形成的表达载体都被认为是用于本发明的目的的重组体。可以理解的是，一旦重组核酸被制备并重新引入宿主细胞，它将非重组地复制，即，使用宿主细胞的体内细胞机制而不是体外操作；然而，这种核酸一旦重组产生，尽管随后非重组复制，仍然被认为是用于本发明的目的的重组体。“重组蛋白”是使用重组技术，即通过上述重组核酸的表达制备的蛋白。
当被置于与另一种核酸序列的功能性关系中时核酸是“可操作连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么它是与编码序列可操作连接的；或者如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，那么它是与编码序列可操作连接的。
术语“宿主细胞”是指单细胞的原核生物和真核生物有机体(例如细菌、酵母和放线菌)以及当在细胞培养物中生长时来自高等植物或者动物的单个细胞。
术语“载体”指一条DNA，典型是双链的，它可以是其中已经插入了一条外源DNA的。载体可以是例如质粒来源的。载体包含在宿主细胞中促进载体的自主复制的“复制子”多核苷酸序列。外源DNA定义为异源的DNA，其是在宿主细胞中天然不存在的DNA，例如，其复制载体分子，编码可选择或可筛选的标记，或者编码转基因。载体用于转运外源的或异源的DNA进入合适的宿主细胞。一旦在宿主细胞中，载体可以独立于宿主染色体DNA复制或与宿主染色体DNA同时复制，并可以产生数个拷贝的载体及其插入的DNA。另外，载体还可以包含容许插入的DNA转录为mRNA分子或者以其它方式导致插入的DNA复制为多拷贝的RNA的必要元件。一些表达载体还包括插入的DNA附近的序列元件，其增加表达的mRNA的半衰期，和/或允许所述mRNA翻译为蛋白分子。因此，可以迅速地合成插入的DNA编码的mRNA和多肽的许多分子。
术语“核苷酸”，除了是指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体以外，本文中还应当理解为是指其相关的结构变体，包括衍生物和类似物，其对于使用该核苷酸的特定上下文(例如，与互补碱基杂交)在功能上是等效的，除非上下文明确另外指明。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指聚合物，其可以对应于核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合物或其类似物。这包括核苷酸的聚合物如RNA和DNA，以及其合成形式、修饰(例如化学或生物化学修饰的)形式，和混合聚合物(例如包括RNA和DNA亚单位两者)。示例性的修饰包括甲基化，用类似物取代一个或更多个天然存在的核苷酸，核苷酸间的修饰如不带电的连接(例如磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、氨基甲酸盐等)，侧面部分(例如多肽)，嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)，螯合剂，烷化剂，和修饰的连接(例如α异头核酸等)。还包括模拟多核苷酸通过氢键及其他化学相互作用与指定序列结合的能力的合成分子。虽然合成形式的核酸可以包括其他连接(例如，Nielsen 等(Science 254:1497 - 1500, 1991)描述的肽核酸)，典型地核苷酸单体通过磷酸二酯键连接。核酸可以是或可以包括，例如，染色体或染色体区段、载体(例如表达载体)、表达盒、裸DNA或RNA聚合物、聚合酶链式反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针和引物。核酸可以是，例如，单链、双链、或三链的，并且不限于任何特定的长度。除非另外指出，除任何明确指出的序列以外，特定的核酸序列还任选地包含或编码互补序列。
术语“寡核苷酸”是指包括至少2个核酸单体单位(例如核苷酸)的核酸。寡核苷酸典型地包括约6-约175个核酸单体单位，更典型地约8-约100个核酸单体单位，仍更典型地约10-约50个核酸单体单位(例如约15，约20，约25，约30，约35，或更多的核酸单体单位)。寡核苷酸的确切大小取决于许多因素，包括该寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸任选地通过任何合适的方法制备，包括但不限于现有或天然序列的分离，DNA复制或扩增，逆转录，适当序列的克隆和限制性消化，或通过例如，Narang等的磷酸三酯法 (Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979)；Brown等的磷酸二酯法(Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979)；Beaucage等的二乙基亚磷酰胺法(Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981)；Matteucci 等的三酯法(J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981)；自动合成法；或美国专利号4,458,066的固相支持法，或本领域技术人员已知的其他方法的方法直接化学合成。
本文中使用的术语“引物”是指当置于起始多核苷酸延伸的条件下(例如，在包括存在所需的三磷酸核苷(在要拷贝的模板支配下)和聚合酶在适当的缓冲液中并以合适的温度或一个或多个温度的循环(例如在聚合酶链式反应中)的条件下)能够作为模板引导的核酸合成的起始点的多核苷酸。为了进一步说明，引物还可以用于多种其他寡核苷酸介导的合成过程，包括作为RNA从头合成和体外转录相关的过程(例如基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)等)的引发剂。引物典型是单链寡核苷酸(例如寡脱氧核糖核苷酸)。引物的适当长度取决于该引物预期的用途，但是典型地范围为6-40个核苷酸，更典型地为15-35个核苷酸。短的引物分子通常需要更低的温度以与模板形成足够稳定的杂合复合物。引物不需要反映模板的精确序列，但是必须是足够互补的以便与模板杂交来发生引物延伸。在某些实施方案中，术语“引物对”表示一组引物，其包括与待扩增的核酸序列的5'末端的互补序列杂交的5'有义引物(有时称为"正向")以及与待扩增的序列的3'末端杂交的3'反义引物(有时称为"反向")(例如，如果目标序列作为RNA表达或者是RNA)。如果需要，可以通过掺入通过光谱学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的或化学的方法可检测的标记来标记引物。例如，有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(如通常用于ELISA测定中的)、生物素、或者存在抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白。
当涉及核酸碱基、三磷酸核苷或核苷酸时，术语“常规的”或“天然的”是指描述的多核苷酸中天然存在的那些(即,对于DNA，这些是dATP、dGTP、dCTP和dTTP)。另外，在体外DNA合成反应如测序中，经常采用dITP和7-脱氮-dGTP来代替dGTP，且可以采用7-脱氮-dATP来代替dATP。共同地，这些称为dNTPs。
当涉及核酸碱基、核苷或核苷酸时，术语“非常规的”或“修饰的”包括在特定的多核苷酸中天然存在的常规的碱基、核苷或核苷酸的修饰物、衍生物或类似物。与常规的dNTPs相比，某些非常规核苷酸在核糖的2'位置修饰。因此，尽管对于RNA，天然存在的核苷酸是核糖核苷酸(即ATP、GTP、CTP、UTP，共称rNTPs)，因为这些核苷酸具有在糖的2'位的羟基，与之相比，dNTPs中没有所述羟基，如本文使用的，作为DNA聚合酶的底物的核糖核苷酸是非常规的核苷酸。如本文使用的，非常规的核苷酸包括但不限于在核酸测序中用作终止剂的化合物。示例性的终止剂化合物包括但不限于具有2',3'双脱氧结构的并被称为双脱氧核苷三磷酸的那些化合物。双脱氧核苷三磷酸ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP共同地称为ddNTPs。终止剂化合物的其他实例包括核糖核苷酸的2'-PO4类似物(参见，例如美国申请公开号2005/0037991和2005/0037398)。其他非常规的核苷酸包括硫代磷酸酯dNTPs([[α]-S]dNTPs)、5'-[α-硼烷(borano)]-dNTPs、[α]-磷酸甲酯dNTPs和核糖核苷三磷酸(rNTPs)。可以用放射性同位素如32P、33P或35S；荧光标记；化学发光标记；生物发光标记；半抗原标记如生物素；或者酶标记如链霉亲和素或亲和素来标记非常规的碱基。荧光标记可以包括带负电荷的染料，如荧光素家族的染料，或者电荷中性的染料，如罗丹明家族的染料，或者带正电荷的染料，如花菁家族的染料。荧光素家族的染料包括，例如FAM、HEX、TET、JOE、NAN和ZOE。罗丹明家族的染料包括Texas Red、ROX、R110、R6G和TAMRA。Perkin-Elmer(Boston, MA)、Applied Biosystems(Foster City, CA)或Invitrogen/Molecular Probes(Eugene, OR)销售各种染料或用FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G、Texas Red和TAMRA标记的核苷酸。花菁家族的染料包括Cy2、Cy3、Cy5和Cy7，且由GE Healthcare UK Limited(Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England)销售。
如本文使用的，通过在比较窗口比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性百分比”，其中对于两个序列的最佳比对，在比较窗口中的序列部分与参照序列(其不包括添加或缺失)相比可以包括添加或缺失(即缺口)。通过确定存在于两个序列中相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量以得到匹配位置的数量，用匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数并用100乘以该结果以得到序列同一性百分比来计算百分比。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中的术语“相同的”或百分比“同一性”是指相同的两个或更多个序列或子序列(subsequences)。当如使用下列序列比较算法中的一种或通过手工比对并目视检查所测量而在比较窗口或者指定的区域比较并比对最大对应时，如果它们具有特定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基(例如，在特定区域，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％同一性))，序列是彼此“基本上相同的”。如果序列是至少20%、至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％或至少55％相同，则该序列是彼此“基本上相同的”。这些定义也是指测试序列的互补序列。任选地，同一性存在于至少约50个核苷酸长度的区域中，或更典型地在100-500个或1000个或更多核苷酸长度的区域中。
在两个或更多多肽序列的上下文中，术语“相似性”或“百分比相似性”是指当如使用下列序列比较算法中的一种或通过手工比对并目视检查所测量而在比较窗口或者指定的区域比较并比对最大对应时，具有特定百分比相同的或通过保守氨基酸取代定义为相似的氨基酸残基(例如，在特定区域内60%相似性，任选地65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%相似的)的两个或更多个序列或子序列。如果序列至少20%，至少25%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，或者至少55%彼此相似，那么它们彼此是“基本上相似的”。任选地，这种相似性存在于至少约50个氨基酸长度的区域中，或更典型地在至少约100-500个或1000个或更多氨基酸长度的区域中。
对于序列比较，通常以一个序列作为参照序列，用测试序列与之比较。当使用序列比较算法时，将试验和参照序列输入电脑，指定子序列坐标(coordinate)，如果必要，还指定序列算法程序参数。通常使用默认程序参数，或者可以指定替代的参数。然后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参照序列的百分比序列同一性或相似性。
如本文使用的，“比较窗口”包括涉及选自20-600，通常约50-约200，更通常约100-约150的任一数量的连续位置的区段，其中在两个序列最佳比对后可以将序列与相同数量的连续位置的参照序列比较。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。可以，例如，通过Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv. Appl. Math. 2:482, 1970)，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J. Mol. Biol. 48:443, 1970)，通过Pearson和Lipman的搜索相似性法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988)，通过这些算法的计算机化执行(例如，the Wisconsin Genetics Software Package中的GAP, BESTFIT, FASTA, 和 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)，或者通过手工比对和目测检查(参见，例如，Ausubel 等, Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement))实施用于比较的最佳序列比对。
适合用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别由Altschul等(Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977)和Altschul等(J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)描述。用于执行BLAST分析的软件可通过国立生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开地获得。该算法涉及：首先通过在查询序列中鉴别长度W的短字段来鉴别高评分序列对(HSPs)，其在与数据库序列中相同长度字段比对时匹配或满足一些阳性值得阈值评分T。T被称作是邻近字段评分阈值(上述Altschul等)。这些最初的邻近字段命中作为起始搜索的种子以发现包含它们的更长HSPs。字段命中沿着各序列双向延伸，只要累计的比对评分可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖分；始终大于0)和N(错配残基的罚分；始终小于0)来计算累计评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累计评分。字段命中在各方向的延伸停止于：累计比对评分从它最大获得值降低数量X时；由于一个或更多个负分残基比对的累积，累计分数达到或低于0时；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(W)11，期望值(E)10，M=5，N=-4作为默认值，并比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长3，期望值(E)10，和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989)比对(B)50，期望值(E)10，M=5，N=-4作为默认值，并比较两条链。
BLAST算法也执行两个序列之间相似性的统计分析(参见，例如，Karlin 和 Altschul, ProC. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993)。BLAST算法提供的一种相似性的量度是最小总和概率(P((N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间匹配偶然发生的概率的指标。例如，如果在测试核酸与参照核酸的比较中最小总和概率低于约0.2，典型地低于约0.01，以及更典型地低于约0.001，那么该核酸被认为与参照序列是相似的。
术语“逆转录效率”指的是在给定的逆转录反应中RNA分子逆转录为cDNA的分数。在特定的实施方案中，相对于这些DNA聚合酶未经修饰的形式，本发明的突变型DNA聚合酶具有改进的逆转录效率。也就是说，在一组特定的反应条件下，这些突变型DNA聚合酶比它们的未经修饰的形式逆转录更高分数的RNA模板。不受理论的限制，本文描述的突变体DNA聚合酶逆转录更高分数的RNA模板的能力可以是由于增强的逆转录活性，例如酶增强的核苷酸掺入速率和/或增强的持续合成能力。逆转录效率可以进行测量，例如，通过测量使用RNA模板的PCR反应的交叉点(Cp)且比较该Cp值与其中扩增相同序列(除U被T替换以外)的DNA模板的对照反应的Cp值，其中所述RNA和DNA扩增使用通用引物组和相同的聚合酶，例如，如实施例中所述。使用RNA作为模板时当测试聚合酶与对照聚合酶相比具有降低的Cp值时测试聚合物具有改进的RT效率，但使用DNA作为模板时相对于对照聚合酶具有基本不变的Cp值。在一些实施方案中，本发明的聚合酶具有改进的RT效率，从而使得与在RNA模板上的相应对照聚合酶相比，Cp小至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个单位。测试聚合酶的改进的RT效率可以如实施例中所描述的测量。
术语“错配耐受性”是指当以模板依赖方式通过将一个或更多个核苷酸连接(例如共价地)于核酸而延伸核酸(例如，引物或其他寡核苷酸)时，聚合酶耐受包含错配的序列的能力。术语“3’错配耐受性”是指当被延伸的核酸(例如，引物或其他寡核苷酸)与其模板在引物的3’末端核苷酸处有错配时，聚合酶耐受包含错配(接近互补)的序列的能力。与模板的错配也可以位于引物的3’倒数第二个核苷酸处，或位于引物序列内的另一个位置处。
术语“错配辨别力”是指当通过将一个或更多个核苷酸连接(例如共价地)于核酸而以模板依赖方式延伸核酸(例如，引物或其他寡核苷酸)时，聚合酶区分完全互补的序列与包含错配的序列的能力。术语“3’-错配辨别力”是指当被延伸的核酸(例如，引物或其他寡核苷酸)与该核酸杂交的模板相比在核酸的3’末端处有错配时，聚合酶区分完全互补的序列与包含错配(接近互补)的序列的能力。术语“错配”是指在以其它形式互补的形成双链体(或可能形成双链体)的一段序列内一个或多个碱基错配(或“不互补碱基反向”)的存在。
术语“Cp值”或“交叉点”值是指允许定量投入的目标核酸的值。可以根据二阶导数最大法(the second-derivative maximum method)确定Cp值(Van Luu-The,等, “Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second derivative calculation and double correction,” BioTechniques, Vol. 38, No. 2, February 2005, pp. 287–293)。在二阶导数法中，Cp对应二阶导数曲线的第一峰。此峰对应对数线性相(log-linear phase)的开始。二阶导数法计算实时荧光强度曲线的二阶导数值，仅获得一个值。初始Cp方法基于强度值的局部定义的可区分的近似值，例如，通过多项式函数。然后计算三阶导数。Cp值是三阶导数的最小的根(root)。可以使用拟合点法确定Cp，其中通过在对数线性区域中平行线与阈值线的交叉确定Cp(Van Luu-The,等, BioTechniques, Vol. 38, No. 2, February 2005, pp.287–293)。Roche提供的LightCycler仪器提供的Cp值通过根据二阶导数最大法计算来提供。
术语“PCR效率”是指循环至循环扩增效率的指标。使用公式：% PCR效率 = (10(- 斜率 )-1) x 100计算每种条件的PCR效率，其中通过y-轴上绘制的对数拷贝数和x-轴上绘制的Cp的线性回归而计算斜率。可以使用完全匹配或错配的引物模板测量PCR效率。
术语“核酸延伸速率”指的是生物催化剂(例如酶，诸如聚合酶、连接酶等)以模板依赖或非模板依赖方式通过把一个或更多个核苷酸加到核酸上(例如共价地)来延伸该核酸(例如，引物或其他寡核苷酸)的速率。举例说明，此处描述的特定的突变型DNA聚合酶相对于这些DNA聚合酶的未修饰形式具有改进的核酸延伸速率，使得在一组给定的反应条件下它们可以以比这些未经修饰的形式更高的速率延伸引物。
术语“RT和聚合酶抑制剂的耐受性”是指在一定量的抑制对照聚合酶的聚合酶活性或逆转录活性的抑制剂存在的情况下聚合酶维持活性(聚合酶或逆转录活性)的能力。在一些实施方案中，改进的聚合酶在一定量的基本上消除对照聚合酶活性的抑制剂存在的情况下能够具有聚合酶或逆转录活性。
术语“5’-核酸酶探针”是指包含至少一个发光标记部分并用于5’-核酸酶反应中以影响目标核酸检测的寡核苷酸。在一些实施方案中，例如，5'-核酸酶探针仅包括单一的发光部分(例如，荧光染料等)。在某些实施方案中，5'-核酸酶探针包括自我互补的区域，使得该探针能够在选择的条件下形成发夹结构。为了进一步说明，在一些实施方案中，5'-核酸酶探针包括至少两个标记部分，在两个标记之一被裂解或者从寡核苷酸以其它方式分离后发射增加强度的辐射。在某些实施方案中，用两种不同的荧光染料，例如，5'末端报告染料和3'末端猝灭染料或部分标记5'-核酸酶探针。在一些实施方案中，在不同于或除了末端位置以外的一个或多个位置标记5'-核酸酶探针。当探针完整时，通常在两个荧光团之间发生能量转移，使得从报告染料的荧光发射至少部分猝灭。在聚合酶链式反应的延伸步骤期间，例如，通过，例如，Taq聚合酶或具有这种活性的另一种聚合酶的5'至3'核酸酶活性裂解结合至模板核酸的5'-核酸酶探针，使得报告染料的荧光发射不再被猝灭。示例性的5'-核酸酶探针也描述在，例如，美国专利号5,210,015、美国专利号5,994,056、和美国专利号6,171,785中。在其他实施方案中，可以用两种或更多种不同的报告染料和3'末端猝灭染料或部分标记5'核酸酶探针。
术语“FRET”或“荧光共振能量转移”或“Foerster共振能量转移”是指至少两个发色团、供体发色团和受体发色团(被称为猝灭剂)之间的能量转移。当供体被具有合适波长的光辐射激发时，供体通常将能量转移至受体。受体通常以具有不同的波长的光辐射的形式重新发射转移的能量。当受体是“黑暗”猝灭剂时，它耗散除光以外的形式的转移的能量。特定的荧光团是否作为供体或受体起作用取决于FRET对的其他成员的特性。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的黑暗猝灭剂包括BlackHole Quenchers™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa Black™ (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa), 和BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.)。
附图简要说明
图1显示来自各种细菌的示例性DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域的氨基酸序列比对： 栖热菌种Z05 (Z05) (SEQ ID NO:12), 水生栖热菌(Taq) (SEQ ID NO:13), 丝状栖热菌(Tfi) (SEQ ID NO:14), 黄栖热菌(Tfl) (SEQ ID NO:15), 栖热菌种sps17 (Sps17) (SEQ ID NO:16), 嗜热栖热菌(Tth) (SEQ ID NO:17), Thermus caldophilus (Tca) (SEQ ID NO:18), 海栖热袍菌(Tma) (SEQ ID NO:19), 那不勒斯栖热袍菌(Tne) (SEQ ID NO:20), 非洲栖热腔菌(Taf) (SEQ ID NO:21), 耐放射异常球菌(Dra) (SEQ ID NO:23), 嗜热脂肪芽孢杆菌(Bst) (SEQ ID NO:24)和热坚芽孢杆菌(Bca) (SEQ ID NO:25)。此外，显示的多肽区域包含氨基酸基序X1-X2-X3-F-X4-X5-X6-X7-D-X8-H-T-X9-T-A-X10-X11 (SEQ ID NO:26)，其可变位置在本文中进一步定义。对于每种聚合酶序列，这些基序用粗体突出显示。适于根据本发明的突变的氨基酸位置用星号(*)指出。比对中的缺口用点(.)指出。
图2提供了下列DNA聚合酶I酶间的序列同一性：栖热菌种Z05 DNA聚合酶(Z05)；水生栖热菌DNA聚合酶(Taq)；丝状栖热菌DNA聚合酶(Tfi)；黄栖热菌DNA聚合酶(Tfl)；栖热菌种sps17 DNA聚合酶(Sps17)；嗜热栖热菌DNA聚合酶(Tth)；Thermus caldophilus DNA聚合酶(Tca)；耐放射异常球菌DNA聚合酶(Dra)；海栖热袍菌DNA聚合酶(Tma)；那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶(Tne)；非洲栖热腔菌DNA聚合酶(Taf)；嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶(Bst)；和热坚芽孢杆菌DNA聚合酶(Bca)。(A) 整个聚合酶I酶(对应于Z05的氨基酸1-834)的序列同一性；和(B) 对应Z05的氨基酸420-834的聚合酶亚结构域的序列同一性。
图3提供了各种栖热菌种DNA聚合酶I间的序列同一性：栖热菌种Z05 DNA聚合酶(Z05)；水生栖热菌DNA聚合酶(Taq)；丝状栖热菌DNA聚合酶(Tfi)；黄栖热菌DNA聚合酶(Tfl)；栖热菌种sps17DNA聚合酶(Sps17)；嗜热栖热菌DNA聚合酶(Tth)；和Thermus caldophilus DNA聚合酶(Tca)。(A) 整个聚合酶I酶(对应于Z05的氨基酸1-834)的序列同一性；和(B) 对应Z05的氨基酸420-834的聚合酶亚结构域的序列同一性。
发明详述
本发明提供了改进的DNA聚合酶，其中相对于功能性DNA聚合酶，聚合酶结构域中一个或多个氨基酸已经被突变。本发明的DNA聚合酶相对于聚合酶的未修饰形式是具有增强的逆转录酶效率(例如，在Mn2+ 和Mg2+ 二价阳离子存在的情况下)和/或增强的错配耐受性、延伸速率以及RT和聚合酶抑制剂的耐受性的活性酶。在某些实施方案中，可在更低的浓度下使用突变型DNA聚合酶，来达到超过亲本酶或与其等效的性能。在一些实施方案中，突变型DNA聚合酶具有增强的逆转录酶效率，同时保持相对于未修饰的或对照聚合酶基本上相同的DNA依赖性聚合酶活性。
更有效地进行逆转录的DNA聚合酶是有帮助的，例如，在涉及采用RT-PCR来检测和/或定量RNA目标的测定的各种应用中是有帮助的。因此，DNA聚合酶在涉及多核苷酸延伸以及逆转录或多核苷酸模板的扩增的多种应用(包括，例如在重组DNA研究和疾病的医疗诊断中的应用)中是有用的。突变DNA聚合酶也是特别有用的，因为它们对于错配、对于检测可能具有可变序列(例如，病毒目标，或癌症和其他疾病遗传标记)的目标具有耐受性。
在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶的特征在于具有下列基序：
X1-X2-X3-Phe-X4-X5-X6-X7-Asp-X8-His-Thr-X9-Thr-Ala-X10-X11 (在本文中也用单字母代码称为X1-X2-X3-F-X4-X5-X6-X7-D-X8-H-T-X9-T-A-X10-X11 (SEQ ID NO:8); 其中:
X1是Ile (I)、Leu (L)、Val (V)、Gln (Q)或Met (M);
X2是Arg (R)、Lys (K)、Gln (Q) 或Glu (E);
X3是Val (V) 或Ala (A);
X4是Gln (Q)、Arg (R)、Glu (E)、Lys (K) 或Val (V);
X5是Glu (E) 或Arg (R);
X6是Gly (G) 或Asp (D);
X7是Lys (K)、Arg (R)、Ile (I)、Leu (L)、Ala (A);
X8是除Ile (I) 或Val (V)以外的任何氨基酸;
X9是Gln (Q)、Glu (E)、Leu (L)、Ile (I)、Arg (R) 或Lys (K);
X10是Ser (S)、Ala (A) 或Met (M) ;
X11是Trp (W)、Arg (R)、Lys (K)、Gln (Q) 或Asp (D)。
在一些实施方案中，X8选自G、A、W、P、S、T、F、Y、C、N、Q、D、E、K、R、L、M或H。
在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶的特征在于具有下列基序：
Ile-Arg-Val-Phe-X4-Glu-Gly-X7-Asp-X8-His-Thr-X9-Thr-Ala-X10-Trp (在本文中也用单字母代码称为I-R-V-F-X4-E-G-X7-D-X8-H-T-X9-T-A-X10-W (SEQ ID NO:9); 其中:
X4是Gln (Q)或Arg (R);
X7是Lys (K) 或Arg (R);
X8是除Ile (I)以外的任何氨基酸;
X9是Gln (Q)或Glu (E);
X10是Ser (S)或Ala (A)。
在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶的特征在于具有下列基序：
Ile-Arg-Val-Phe-Gln-Glu-Gly-Lys-Asp-X8-His-Thr-Gln-Thr-Ala-Ser-Trp (在本文中也用单字母代码称为I-R-V-F-Q-E-G-K-D-X8-H-T-Q-T-A-S-W (SEQ ID NO:10); 其中:
X8是除Ile (I)以外的任何氨基酸。
在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶的特征在于具有下列基序：
Ile-Arg-Val-Phe-Gln-Glu-Gly-Lys-Asp-X8-His-Thr-Gln-Thr-Ala-Ser-Trp (在本文中也用单字母代码称为I-R-V-F-Q-E-G-K-D-X8-H-T-Q-T-A-S-W (SEQ ID NO:11); 其中:
X8是Phe (F)。
在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶的特征在于具有以上基序(例如，SEQ ID NOs:8、9、10和11)，任选组合有下文描述的另外的基序。例如，在一些实施方案中，DNA聚合酶还包含SEQ ID NO:29和/或SEQ ID NO:38的基序。
这种基序存在于许多家族A型DNA依赖的DNA聚合酶，尤其是来自嗜热菌的热稳定DNA聚合酶的“手指”结构域（N α螺旋）中(Li等., EMBO J. 17:7514-7525, 1998)。例如，图1显示了来自下列几种细菌菌种的DNA聚合酶的“手指”结构域的区域的氨基酸序列比对：热坚芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，耐放射异常球菌，非洲栖热腔菌，海栖热袍菌, 那不勒斯栖热袍菌，水生栖热菌, Thermus caldophilus，丝状栖热菌, 黄栖热菌，栖热菌种sps17，栖热菌种Z05和嗜热栖热菌。如所示，对应于上述基序的天然序列存在于这些聚合酶中间的每一个中，表明对于聚合酶的该区域的保守功能。图2提供了这些DNA聚合酶间的序列同一性。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：8、9、10或11并具有本文所述的改进的活性和/或特征的聚合酶，其中所述DNA聚合酶另外是野生型或天然存在的DNA聚合酶，如，例如，来自上面列出的嗜热细菌的任一种的聚合酶，或者与这种野生型或天然存在的DNA聚合酶基本上相同。例如，在一些实施方案中，本发明的聚合酶包括SEQ ID NO：8、9、10或11，且与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、32、33、34、35、36、37或39至少80％，85％，90％或95％相同。在一个变型中，聚合酶的未修饰的形式来自于栖热菌种。在本发明的其他实施方案中，未修饰的聚合酶来自除栖热菌以外的嗜热菌种，例如栖热袍菌。许多热稳定DNA聚合酶的完整的核酸和氨基酸序列是可获得的。PCT国际专利公开号WO 92/06200中已经公布了水生栖热菌(Taq) (SEQ ID NO:2)、嗜热栖热菌(Tth) (SEQ ID NO:6)、栖热菌种Z05(SEQ ID NO:1)、栖热菌种sps17(SEQ ID NO:5)、海栖热袍菌(Tma) (SEQ ID NO:34)和非洲栖热腔菌(Taf) (SEQ ID NO:33)聚合酶中每一种的序列。Akhmetzjanov和Vakhitov(Nucleic Acids Research 20:5839, 1992)已经公布了来自黄栖热菌的DNA聚合酶的序列(SEQ ID NO:4)。来自Thermus caldophilus的热稳定DNA聚合酶的序列(SEQ ID NO:7)见于EMBL/GenBank登录号U62584。来自丝状栖热菌的热稳定DNA聚合酶的序列可以使用例如美国专利号4,889,818提供的方法以及表1中提供的序列信息从ATCC保藏号42380中重新获得。那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶的序列(SEQ ID NO:35)来自GeneSeq专利数据库登录号R98144和PCT WO 97/09451。例如Uemori等(J Biochem (Tokyo) 113(3):401-410, 1993；也参见Swiss-Prot数据库登录号Q04957以及GenBank登录号D12982和BAA02361)描述了来自热坚芽孢杆菌的热稳定DNA聚合酶的序列(SEQ ID NO:37)。例如，美国专利号6,228,628；6,346,379；7,030,220；6,881,559；6,468,775, 和美国专利号7,148,049；7,179,590；7,410,782；7,378,262中也描述了可以如本文所述修饰的DNA聚合酶的未修饰的形式的实例。序列表中还提供了代表性的全长聚合酶序列。
已经预先修饰过的功能性DNA聚合酶(例如通过氨基酸取代、插入或缺失)，同样适于本文描述的突变。在一些实施方案中，这样功能性修饰的聚合酶保留SEQ ID NO:8的氨基酸基序(或SEQ ID NO:9、10或 11的基序)，且任选地SEQ ID NO:38的氨基酸基序。因此，合适的未经修饰的DNA聚合酶也包括野生型或天然存在的聚合酶的功能性变体。这种变体通常与野生型或天然存在的聚合酶具有基本上的序列同一性或相似性，典型地至少80%的序列同一性，更典型地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
在一些实施方案中，本发明的以及具有包含SEQ ID NOS:8、9、10或11的聚合酶结构域的聚合酶也包含核酸酶结构域(例如，对应于Z05的1-291位)。
在一些实施方案中，本发明的聚合酶是嵌合的聚合酶，即，包含来自两种或更多种酶的多肽区域。例如美国专利号6,228,628描述了这种嵌合DNA聚合酶的实例。特别合适的是嵌合CS家族DNA聚合酶，其包括CS5(SEQ ID NO:27)和CS6(SEQ ID NO:28)聚合酶及其与SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28具有基本上的氨基酸序列同一性或相似性的变体(典型地至少80%氨基酸序列同一性，且更典型地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性)，且因此可以被修饰为包含SEQ ID NO:8。CS5和CS6 DNA聚合酶是源自栖热菌种Z05和海栖热袍菌 (Tma) DNA聚合酶的嵌合酶。它们包含栖热菌酶的N-末端的5'-核酸酶结构域和Tma酶的C-末端的3'-5'核酸外切酶以及聚合酶结构域。这些酶具有有效的逆转录酶活性，可以延伸包含核苷酸类似物的引物，并可以包含α-硫代磷酸酯dNTPs、dUTP、dITP以及还有荧光素和花菁染料家族标记的dNTPs。CS5和CS6聚合酶也是有效的Mg2+活化的PCR酶。例如，美国专利号7,148,049中进一步描述了CS5和CS6嵌合聚合酶。
在一些实施方案中，氨基酸取代是单一的氨基酸取代。相对于未修饰的聚合酶，本文提供的DNA聚合酶在活性位点可以包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代包含至少如SEQ ID NO:8所述的基序(或SEQ ID NO:9、10或 11的基序)的X8位。在该位置上的氨基酸取代赋予增强的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率和/或RT和聚合酶抑制剂的耐受性，产生了相对于未修饰的聚合酶具有增强的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率和/或RT和聚合酶抑制剂的耐受性的突变DNA聚合酶。通常，X8位的氨基酸被不对应于SEQ ID NO:8中所述基序(或SEQ ID NO:9、10或 11的基序)内的天然序列的氨基酸所取代。因此，通常，X8位的氨基酸，如果被取代，不是Ile (I)或Val (V)，因为I或V出现在天然存在的聚合酶中的该位置处（参见，例如图1）。在某些实施方案中，氨基酸取代包括在X8位的G、A、W、P、S、T、F、Y、C、N、Q、D、E、K、R、L、M或H。在某些实施方案中，氨基酸取代包括在X8位的苯丙氨酸(F)。可以使用，例如，定点诱变的已知方法和本文中进一步描述的测定中多核苷酸延伸性能的确定方法或本领域技术人员已知的其他方法确定在一个或多个鉴别的位点的其他合适的一个或多个氨基酸取代。
在一些实施方案中，本发明的聚合酶包括SEQ ID NO：8，9，10或11，并进一步包含与天然的聚合酶相比的一个或多​​个额外的氨基酸变化(例如，通过氨基酸取代，增加或缺失)。在一些实施方案中，这种聚合酶保留了SEQ ID NO：8的氨基酸基序(或SEQ ID NO:9, 10或11的基序)，并进一步包含如下的SEQ ID NO：38的氨基酸基序(对应于Z05(SEQ ID NO：1)的D580X突变)：
Thr-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser-Xb7-Xb8-Pro-Asn-Leu-Gln-Asn
(在本文中也用单字母代码称为T-G-R-L-S-S-Xb7-Xb8-P-N-L-Q-N) (SEQ ID NO:38); 其中
Xb7是Ser (S)或Thr (T); 并且
Xb8是除Asp (D)或Glu (E)以外的任何氨基酸
例如，美国专利公开号2009/0148891中更详细地讨论了由SEQ ID NO：38表征的突变。这种功能性变体聚合酶通常与野生型或天然存在的聚合酶(例如, SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、32、33、34、35、36、37、或39)具有基本上的序列同一性或相似性，典型地至少80%的氨基酸序列同一性，且更典型地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。
在一些实施方案中，本发明的聚合物包含SEQ ID NO:8、9、10或11，并且还包含如下的SEQ ID NO:29的氨基酸基序（对应于Z05 (SEQ ID NO:1)的I709X突变）：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-Gly-Tyr-Val-X14-Thr-Leu (在本文中也用单字母代码称为X1-X2-X3-Xa4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-G-Y-V-X14-T-L) (SEQ ID NO:29); 其中
X1是Ala (A)、Asp (D)、Ser (S)、Glu (E)、Arg (R)或Gln (Q);
X2是Trp (W)或Tyr (Y);
X3是除Ile (I)、Leu (L)或Met (M)以外的任何氨基酸;
X4是Glu (E)、Ala (A)、Gln (Q)、Lys (K)、Asn (N)或Asp (D);
X5是Lys (K)、Gly (G)、Arg (R)、Gln (Q)、His (H)或Asn (N);
X6是Thr (T)、Val (V)、Met (M)或Ile (I);
X7是Leu (L)、Val (V)或Lys (K);
X8是Glu (E)、Ser (S)、Ala (A)、Asp (D)或Gln (Q);
X9是Glu (E)或Phe (F);
X10是Gly (G)或Ala (A);
X11是Arg (R)或Lys (K);
X12是Lys (K)、Arg (R)、Glu (E)、Thr (T)或Gln (Q);
X13是Arg (R)、Lys (K)或His (H); 且
X14是Glu (E)、Arg (R)或Thr (T)。
在一些实施方案中，这种功能性变体聚合酶通常与野生型或天然存在的聚合酶(例如，SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、32、33、34、35、36、37或39)具有基本上的序列同一性或相似性，典型地至少80％氨基酸序列同一性，且更典型地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99% 氨基酸序列同一性。
在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶在X8位置(例如，如在选自SEQ ID NO:8、9、10或11的基序中)包含氨基酸取代，且包含对应于SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:29的氨基酸取代。
在一些实施方案中，X8位的氨基酸由如SEQ ID NO:8、9、10或11中所示的氨基酸取代，并且Xb8位的氨基酸由SEQ ID NO:38中所示的氨基酸取代。因此，在一些实施方案中，X8位的氨基酸是除Ile (I)以外的任何氨基酸，并且Xb8位的氨基酸是除Asp (D)或Glu (E)以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸取代包括在SEQ ID NO:38的Xb8位的亮氨酸(L)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、天冬氨酸(N)、精氨酸(R)和赖氨酸(K)。在一些实施方案中，氨基酸取代独立地包括在SEQ ID NO:8、9、10或11的X8位的甲硫氨酸(M)，和在SEQ ID NO:38的Xb8位的甘氨酸(G)。
在一些实施方案中，X8位的氨基酸用如SEQ ID NO:8、9、10或11中所示的氨基酸取代，并且（SEQ ID NO:29的）X3位的氨基酸由SEQ ID NO:29中所示的氨基酸取代。因此，在这些实施方案中，X8位的氨基酸是除Ile (I)以外的任何氨基酸，并且X3位的氨基酸是除Ile (I)、Leu (L)或Met (M)以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸取代包括在SEQ ID NO:29的X3位的赖氨酸(K)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、甘氨酸(G)或丙氨酸(A)。在某些实施方案中，氨基酸取代独立地包括在SEQ ID NO:8、9、10或11的X8位的甲硫氨酸(M)，和在SEQ ID NO:29的X3位的赖氨酸(K)。
可以使用，例如，定点诱变的已知方法和本文中进一步描述的测定中多核苷酸延伸性能的确定方法或本领域技术人员已知的其他方法确定在一个或多个鉴别的位点的其他合适的一个或多个氨基酸取代，例如，美国专利申请公开号2009/0148891和2009/0280539中描述的氨基酸取代。
因为DNA聚合酶的精确长度变化，对应于X8 (SEQ ID NO:8)、Xb8 (SEQ ID NO:38)和X3 (SEQ ID NO:29)的每一个的精确的氨基酸位置可以根据使用的特定突变型聚合酶而变化。氨基酸和核酸序列比对程序是容易获得的(见，例如，上文提到的那些)，考虑到本文鉴别的特定基序，所述程序用来帮助鉴别用于根据本发明的修饰的确切的氨基酸(和对应的密码子)。对于来自示例性的嗜热菌种的代表性的嵌合的热稳定DNA聚合酶和热稳定的DNA聚合酶，对应于X8、Xb8和X3中每一个的位置如表1中所示。
表1. 对应于示例性聚合酶中基序位置(例如，SEQ ID NOS:8、9、10和11的)X8、(SEQ ID NO:38的)Xb8和(SEQ ID NO:29的)X3 的氨基酸位置。
在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶源自栖热菌种Z05 DNA聚合酶(SEQ ID NO:1)或其变体(例如，携带D580G突变等)。如上面提到的，在栖热菌种Z05 DNA聚合酶中，X8位对应640位的异亮氨酸(I)；Xb8位对应580位的天冬氨酸(D)，并且X3位对应709位的异亮氨酸(I)。因此，在本发明的某些变型中，相对于栖热菌种Z05 DNA聚合酶（或与SEQ ID NO:1基本相同（例如，至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%相同）的DNA聚合酶），突变型聚合酶在I640、D580和/或I709包含至少一个氨基酸取代。因此，典型地，SEQ ID NO:1的640位的氨基酸不是I。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的640位的氨基酸选自G、A、V、R、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、L、M或H。在某些实施方案中，SEQ ID NO:1的640位的氨基酸残基是F。在某些实施方案中，SEQ ID NO:1的D580位的氨基酸残基可以选自亮氨酸(L)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、精氨酸(R)和赖氨酸(K)。因此，在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的580位的氨基酸是甘氨酸(G)。进一步，在某些实施方案中，SEQ ID NO:1的709位的氨基酸不是I。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的709位的氨基酸选自G、A、V、R、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、L、M或H。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的709位的氨基酸是K、R、S、G或A。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的709位的氨基酸是K。
示例性的栖热菌种Z05 DNA聚合酶突变体包括包含氨基酸取代I640F、和/或I709K（或I709R、I709S、I709G、I709A）和/或D580G的那些。在一些实施方案中，突变型栖热菌种Z05 DNA聚合酶包含，例如，氨基酸残基取代I640F和D580G。在一些实施方案中，突变型栖热菌种Z05 DNA聚合酶包含，例如，氨基酸残基取代I640F和I709K。在一些实施方案中，突变型栖热菌种Z05 DNA聚合酶包含，例如，氨基酸残基取代I640F、I709K和D580G。在某些实施方案中，突变型栖热菌种Z05 DNA聚合酶包含，例如，独立地选自I640F、I709K和/或D580G的氨基酸残基取代。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的324位的氨基酸是Lys (K)。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的324位的氨基酸不是Met (M)。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的461位的氨基酸是Leu (L)。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的461位的氨基酸不是Met (M)。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的517位的氨基酸是Ser (S)。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的517位的氨基酸不是Arg (R)。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的741位的氨基酸是Ser (S)。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的741位的氨基酸不是Gly (G)。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的775位的氨基酸是Arg (R)。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的775位的氨基酸不是Gly (G)。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的791位的氨基酸是Leu (L)。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的789位的氨基酸不是Phe (F)。
本发明人已显示在上文描述的对应于SEQ ID NO:1的709位氨基酸处的取代可以使DNA聚合酶相比于对照聚合酶具有改进的（例如增强的）逆转录效率、增强的RT-PCR活性（例如，更有效率地扩增RNA模板，而不会损害对DNA模板的PCR效率）、在Mg2+存在的情况下增强的RT-PCR效率、在抑制剂存在的情况下增强的逆转录活性（例如，血红蛋白诸如氯高铁血红素和/或肝素的分解产物）、增强的延伸速率和改进的3'-错配耐受性（参见美国申请号61/474,160）。因此，预期本文描述的包含对应于SEQ ID NO:1的709位的氨基酸处的取代的改进的聚合酶还将具有上述改进的特性。
除如本文所述的突变和取代以外，本发明的DNA聚合酶也可以包括其他未取代的一个或多个修饰。这种修饰可以包括，例如，本领域已知的共价修饰，以赋予包括多核苷酸延伸的应用中的额外的优势。例如，一种该修饰是热可逆的共价修饰，其使酶失活，但是在升高的温度，如通常用于多核苷酸延伸的温度下孵育后其被逆转而激活酶。美国专利号5,773,258和5,677,152中描述了这种热可逆的修饰的示例性试剂。
可以通过突变编码对应的未修饰的聚合酶(例如，野生型聚合酶或者本发明的聚合酶来源自的对应变体)的DNA序列，如通过使用通常称为定点诱变的技术来构建本发明的DNA聚合酶。可以通过本领域普通技术人员熟知的多种聚合酶链式反应(PCR)技术来突变编码聚合酶的未修饰形式的核酸分子。(参见，例如，PCR Strategies (M. A. Innis, D. H. Gelfand和J. J. Sninsky 编, 1995, Academic Press, San Diego, CA) 的第14章；PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky和T. J. White 编, Academic Press, NY, 1990)。
作为非限制性实例，来自Clontech的转化子定点诱变试剂盒(Transformer Site-Directed Mutagenesis kit)使用的双引物系统可以用来将定点突变引入编码聚合酶的未修饰的形式的多核苷酸。该系统中的目标质粒变性之后，两条引物同时退火到质粒；这些引物之一包含期望的定点突变，另一条包含在该质粒中引起限制性位点消除的另一个位点的突变。然后进行第二条链合成，紧密连接这两个突变，然后将获得的质粒转化入大肠杆菌的mutS菌株。从转化的细菌中分离质粒DNA，用相关的限制酶限制性酶切(从而线性化未突变的质粒)，然后重新转化进入大肠杆菌。该系统允许直接在表达质粒中产生突变，而不必亚克隆或者产生单链的噬菌粒(phagemids)。两个突变的紧密连接和随后的未突变质粒的线性化导致高突变效率并允许最少的筛选。在初始限制性位点引物的合成之后，对每个突变位点，该方法只需要使用一种新的引物类型。不是分别准备各个位点突变体，可以合成一组“设计的简并”寡核苷酸引物，用于同时在给定的位点引入所有期望的突变。可以通过对质粒DNA的诱变的区域测序来筛选转化体以鉴别并分类突变型克隆。然后可以限制性酶切每条突变型DNA并通过电泳分析，如，在突变检测增强凝胶(Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ)上进行以验证在该序列中没有发生其他的改变(通过与未诱变处理的对照进行条带迁移比较)。或者可以对整个DNA区域测序以验证在目标区域之外没有额外的突变事件发生。
可以以多种方式产生具有多于一个氨基酸取代的DNA聚合酶。在氨基酸紧密在一起地位于多肽链中的情况下，可以使用编码所有期望的氨基酸取代的一条寡核苷酸来同时突变它们。然而如果氨基酸彼此隔开一些距离定位(例如隔开多于10个氨基酸)，则产生编码所有期望的变化的单一寡核苷酸更困难。作为替代，可以用两种可选方法中的一种。在第一种方法中，对每个待取代的氨基酸产生单独的寡核苷酸。然后将寡核苷酸同时与单链模板DNA退火，而从模板合成的DNA第二条链将编码所有期望的氨基酸取代。一种可选方法涉及两个或更多轮的诱变以产生期望的突变体。第一轮如同单突变体描述的那样：编码未修饰的聚合酶的DNA用作模板，将编码第一期望的一个或多个氨基酸取代的寡核苷酸与该模板退火，然后产生异源双链DNA分子。第二轮的诱变利用第一轮的诱变产生的突变DNA作为模板。因此，该模板已经包含一个或更多个突变。然后将编码额外的期望的一个或多个氨基酸取代的寡核苷酸与该模板退火，且产生的DNA链现在编码来自第一轮和第二轮的诱变两者的突变。可以使用这种产生的DNA作为第三轮的诱变中的模板，等等。或者，可以利用Seyfang和Jin的多位点诱变法(Anal. BioChem. 324:285-291. 2004)。
因此，也提供编码本发明的DNA聚合酶中任一种的重组核酸。使用本发明的编码DNA聚合酶的核酸，可以制造多种载体。在本发明的实施中可以使用包含源自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的任何载体。通常，表达载体包括与编码DNA聚合酶的核酸可操纵连接的转录和翻译调控核酸区域。术语“控制序列”是指在特定的宿主生物体中为可操纵连接的编码序列的表达所必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列，例如，包括启动子，任选地操纵子序列，和核糖体结合位点。此外，载体可以包含正性反向调控元件(Positive Retroregulatory Element，PRE)以增加转录的mRNA的半衰期(参见美国专利号4,666,848)。转录和翻译调控核酸区域通常适合于用来表达聚合酶的宿主细胞。用于各种宿主细胞的许多类型的适当的表达载体和合适的调控序列是本领域已知的。通常，转录和翻译调控序列可以包括，例如，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列和增强子或激活子序列。在典型的实施方案中，调控序列包括启动子和转录起始和终止序列。载体还典型地包括包含数个用于外源DNA插入的限制性位点的多接头区域。在某些实施方案中，使用“融合标志”以帮助纯化和随后标签/标志序列的去除(如果需要的话)，例如“组氨酸标签”(“His-Tag”)。然而，当从嗜常温宿主(例如大肠杆菌)中纯化热活性和/或热稳定蛋白(其中可以使用“热步骤”(heat-step))时，这些通常是不必要的。使用标准重组DNA操作制备包含编码复制序列，调控序列，表型选择基因，和感兴趣的聚合酶的DNA的合适的载体的构建。以特定的顺序将分离的质粒、病毒载体和DNA片段切割、裁剪并连接到一起以产生期望的载体，这是本领域熟知的(参见，例如，Sambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, 2nd ed. 1989))。
在某些实施方案中，表达载体包含选择性标记基因以允许选择转化的宿主细胞。选择基因是本领域熟知的，且随使用的宿主细胞而变化。合适的选择基因可以包括，例如编码氨苄青霉素和/或四环素抗性的基因，其使以这些载体转化的细胞在这些抗生素存在的情况下生长。
在本发明的一个方面，将编码DNA聚合酶的核酸以单独或与载体组合地引入细胞。此处“引入”或语法上的等价物表示核酸以一种适于随后的核酸的整合、扩增和/或表达的方式进入细胞。引入的方法主要由目标细胞类型支配。示例性方法包括CaPO4沉淀，脂质体融合，LIPOFECTIN®，电穿孔，病毒感染等。
在一些实施方案中，通常使用原核生物作为用于本发明初始的克隆步骤的宿主细胞。它们对于大量DNA的迅速生产，对于用于定点诱变的单链DNA模板的生产，对于同时筛选许多突变体以及对于产生的突变体的DNA测序特别有用。合适的原核宿主细胞包括大肠杆菌K12菌株94(ATCC No. 31,446)、大肠杆菌菌株W3110(ATCC No. 27,325)、大肠杆菌K12菌株DG116(ATCC No. 53,606)、大肠杆菌X1776(ATCC No. 31,537)和大肠杆菌B；然而大肠杆菌的许多其他菌株如HB101、JM101、NM522、NM538、NM539，以及许多其他原核生物的种和属包括杆菌如枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、其他肠杆菌科如鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcesans)和各种假单胞菌属(Pseudomonas species)的菌种全部都可以用作宿主。典型地使用如上文的Sambrook等在1.82部分描述的氯化钙方法转化原核宿主细胞或其他具有刚性细胞壁的宿主细胞。或者，可以使用电穿孔用于这些细胞的转化。例如，Dower,在Genetic Engineering, Principles and Methods 12:275-296(Plenum Publishing Corp., 1990)；Hanahan等, Meth. Enzymol., 204:63, 1991中描述了原核生物转化技术。典型用于转化大肠杆菌的质粒包括pBR322、pUCI8、pUCI9、pUCIl8、pUC119和Bluescript M13，它们所有都描述于上文的Sambrook等的1.12-1.20部分。然而，许多其他合适的载体也是可用的。
通常通过在诱导或引起DNA聚合酶表达的适当条件下培养用包含编码DNA聚合酶的核酸的表达载体转化的宿主细胞而产生本发明的DNA聚合酶。在适于蛋白表达的条件下培养转化的宿主细胞的方法是本领域熟知的(参见，例如，上文的Sambrook等)。用于从包含λ pL启动子的质粒载体产生聚合酶的合适的宿主细胞包括大肠杆菌菌株DG116(ATCC No. 53606)(参见美国专利号5,079,352和Lawyer, F.C. 等, PCR Methods and Applications 2:275-87, 1993)。表达之后，可以收获并分离聚合酶。例如，上文的Lawyer等中描述了用于纯化热稳定DNA聚合酶的方法。一旦纯化，可以测试(例如，如在实施例中所述)DNA聚合酶具有改进的RT效率、增强的错配耐受性、延伸速率和/或RT和聚合酶抑制剂的耐受性的能力。
本发明的改进的DNA聚合酶可以用于其中需要或期望这种酶活性的任何目的。因此，在本发明的另一个方面，提供了使用聚合酶的多核苷酸延伸的方法(例如, PCR)。适合用于多核苷酸延伸的条件是本领域已知的(参见，例如，上文的Sambrook等。也参见Ausubel 等, Short Protocols in Molecular Biology(第4版，John Wiley & Sons 1999))。通常，使引物与目标核酸退火，即杂交以形成引物-模板复合物。在合适的环境中将引物-模板复合物与DNA聚合酶和三磷酸核苷接触，以允许一个或更多个核苷酸增加至引物的3'-末端，从而产生与目标核酸互补的延伸的引物。引物可以包括，例如，一个或更多个核苷酸类似物。此外，三磷酸核苷可以是常规核苷酸、非常规核苷酸(例如核糖核苷酸或标记的核苷酸)或其混合物。在一些变型中，多核苷酸延伸反应包括目标核酸的扩增。适于使用DNA聚合酶和引物对进行核酸扩增的条件也是本领域已知的(例如，PCR扩增方法)。(参见，例如，上文的Sambrook等；上文的Ausubel等；PCR Applications: Protocols for Functional Genomics(Innis 等编, Academic Press 1999)。在其他的非互相排斥的实施方案中，多核苷酸延伸反应包括逆转录RNA模板(例如RT-PCR) 。在一些实施方案中，改进的聚合酶用于454测序 (Margulies, M 等2005, Nature, 437, 376-380)。
任选地，引物延伸反应包含参考或未修饰的聚合酶的实际的或潜在的抑制剂。抑制剂可以抑制，例如，参考或未修饰(对照)聚合酶的核酸延伸速率和/或逆转录效率。在一些实施方案中，抑制剂是血红蛋白或其降解产物。例如，在一些实施方案中，血红蛋白降解产物是血红素分解产物，如氯高铁血红素、血卟啉、或胆红素。在一些实施方案中，抑制剂是铁螯合剂或紫色素。在其他实施方案中，抑制剂是肝素。在某些实施方案中，抑制剂是嵌入染料。在某些实施方案中，抑制剂是已经描述为聚合酶抑制剂的黑色素（参见，例如，Ekhardt，等人，Biochem Biophys Res Commun. 271(3):726-30 (2000)）。
本发明的DNA聚合酶可用于在从包含聚合酶抑制剂的样品(例如，诸如血液)分离的多核苷酸模板存在的情况下延伸模板。例如，本发明的DNA聚合酶可用于在血液的主要组分血红蛋白存在的情况下，或血红蛋白降解产物存在的情况下延伸模板。血红蛋白可以降解为各种血红素分解产物，诸如氯高铁血红素、高铁血红素、血卟啉和胆红素。因此，在某些实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在血红蛋白降解产物(包括但不限于氯高铁血红素、高铁血红素、血卟啉和胆红素)存在的情况下延伸模板。在特定的实施方案中，血红蛋白降解产物是氯高铁血红素。在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在约0.5至20.0 μM、约0.5至10.0 μM、约0.5至5.0 μM、约1.0至10.0 μM、约1.0至5.0 μM、约2.0至5.0 μM、或约2.0至3.0 μM氯高铁血红素存在的情况下延伸模板。在其他实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在至少约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、10.0、20.0、或大于20 μM氯高铁血红素存在的情况下延伸模板。血红蛋白分解产物包括铁螯合剂和紫色素。因此，在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在铁螯合剂和/或紫色素存在的情况下延伸模板。在其他实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在一定量的抑制通过参考或对照DNA聚合酶延伸相同模板的血红蛋白降解产物存在的情况下延伸模板。
本发明的DNA聚合酶可用于在肝素存在的情况下延伸模板。肝素通常作为从血液中分离的样品中的抗凝剂存在。在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在约1.0至400 ng/μl、1.0至300 ng/μl、1.0至200 ng/μl、5.0至400 ng/μl、5.0至300 ng/μl、5.0至200 ng/μl、10.0至400 ng/μl、10.0至300 ng/μl、或10.0至200 ng/μl肝素存在的情况下延伸模板。在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400 ng/μl、或大于400 ng/μl肝素存在的情况下延伸模板。在其他实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在一定量的抑制通过参考或对照DNA聚合酶延伸相同模板的肝素存在的情况下延伸模板。
在一些实施方案中，本发明的改进的聚合酶在逆转录反应中使用。在一些实施方案中，逆转录反应在含有RNA模板、一种或多种引物、和本发明的热稳定DNA聚合酶的混合物中实施。反应混合物通常含有所有四种标准脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和含有二价阳离子和一价阳离子的缓冲液。示例性的阳离子包括，例如，Mg2+，尽管其他阳离子，诸如Mn2+或Co2+也可以激活DNA聚合酶。在其他实施方案中，用本发明的热活性DNA聚合酶实施逆转录反应。在特定实施方案中，如实施例中所述，本发明的改进的聚合酶在Mn2+或Mg2+存在的情况下允许更有效的扩增RNA模板，而不损害DNA模板的有效扩增。
在一些实施方案中，本发明的改进的聚合酶通过降低延伸RNA模板所需的反应时间而增强逆转录效率。例如，相比于对照聚合酶，本文描述的改进的聚合酶能够显著降低转录RNA至cDNA所需的反应时间，由此增强逆转录效率。不受理论所限制，改进的聚合酶能够通过例如增强酶对RNA模板的活性（诸如增强核苷酸掺入速率和/或增强聚合酶的持续合成能力）来增强RT效率，由此有效地缩短RNA模板或RNA模板群的延伸时间。当使用未修饰的或对照聚合酶时，初始RT步骤的反应时间在65℃下通常在30分钟或更长的时间的级别上。因此，在一些实施方案中，改进的聚合酶能够在65℃下在少于约10分钟内，少于约8分钟内，少于约5分钟内，少于约4分钟内，少于约3分钟内，或少于约2分钟内转录RNA模板为cDNA。在一些实施方案中，改进的聚合酶在更少的时间或比对照聚合酶更快地将源于丙型肝炎病毒(HCV)转录物JP2-5的RNA模板（含有HCV基因型Ib 5’NTR的前800个碱基）转录为cDNA。例如，改进的聚合酶能够在相同的反应条件下比对照聚合酶少约15秒、少30秒、少1分钟、少2分钟、少3分钟、少4分钟、少5分钟、或少约10分钟内将240个碱基的HCV JP2-5 RNA模板转录为全长cDNA。在一些实施方案中，改进的聚合酶能够在相同的反应条件下比对照聚合酶快例如约5秒、10秒、15秒、30秒、45秒、或60秒或更快地将240个碱基的HCV JP2-5 RNA模板转录为全长cDNA。在一些实施方案中，反应条件为实施例中描述的那些。在一些实施方案中，将本文描述的改进的聚合酶在65℃下在上文描述的反应混合物中与RNA模板接触2分钟。如实施例中所述的，延伸步骤随后为PCR扩增延伸的模板。
已经使用Mn2+作为二价金属离子活化剂实现了热稳定DNA聚合酶的最有效的RT活性。然而，众所周知的是，当Mn2+存在于反应中时，DNA聚合酶的保真度较低。除非试图生成突变，通常倾向于维持较高保真度。幸运的是，大多数常规测序、PCR和RT-PCR应用不需要高保真度条件，因为该检测系统通常着眼于产物群体。随着下一代测序方法数字PCR等的出现，产物的保真度更加重要，且允许更高保真度DNA合成的方法是关键的。使用Mg2+作为二价金属离子活化剂实现高效RT活性对于实质性增加DNA聚合酶的保真度和允许更可靠的核酸目标的复制是优异的方式。因此，在一些实施方案中，如实施例中所描述的，本发明的改进的聚合酶允许使用Mg2+作为二价金属离子活化剂的RNA模板的有效延伸和/或扩增。
因为本文所述的聚合酶也可以具有增加的错配耐受性，所以该聚合酶可用于其中目标模板可能变化且无论目标模板上的变化但还是需要扩增模板的方法中。这种模板的实例可以包括，例如，病毒序列、细菌序列或其他病原体序列。在许多实施方案中，期望简单地确定个体(人或非人动物)是否具有病毒或其他感染，而不管已经感染个体的精确病毒变体。作为实例，可以使用引物对以使用本发明的聚合酶来扩增HCV和检测HCV的存在，即使感染个体的特定病毒具有导致在引物杂交位点错配的突变。
目标核酸可以来自生物或合成来源。目标可以是例如DNA或RNA。通常，当产生扩增子时，扩增子由DNA组成，尽管核糖核苷酸或合成的核苷酸也可以掺入扩增子。当希望检测RNA时，扩增方法通常包括使用逆转录，包括例如逆转录PCR (RT-PCR)。
特定的目标序列可以包括例如病毒核酸(例如人类免疫缺陷性病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)、(巨细胞病毒(CMV)、细小B19病毒、EB病毒、丙肝病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)、日本脑炎病毒(JEV)、西尼罗河病毒(WNV)、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)、墨累山谷脑炎病毒和Kunjin病毒)，细菌核酸(例如金黄色葡萄球菌(S. aureus)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、鼠型沙眼衣原体(Chlamydia muridarum)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis))，分枝杆菌，真菌核酸，或来自动物或植物的核酸。在一些实施方案中，目标核酸是动物(例如人)核酸或来源于动物(例如人)样品(即，病毒或其他病原生物核酸可以存在于来自动物活检的样品、血液样品、尿液样品、粪便样品、唾液等)。在一些实施方案中，目标核酸是例如可包括与疾病(例如癌症，糖尿病等等)有关的变体的人遗传区。因为在一些实施方案中，本发明的聚合酶具有错配耐受性，这种酶特别有用，例如当多种相关序列可能位于一个目标序列中的时候。作为实例，本发明可用于，在其中所述病毒病原体在其基因组中具有足够的变异以使其很难或不可能设计出能扩增大部分或所有可能病毒基因组的单个或小组引物的地方检测病毒病原体，或其中序列中的可变性是已知的或很可能发生的癌症或其他疾病基因标记中检测病毒病原体。
使用本文所述的改进的聚合酶检测延伸产物或扩增产物的其他方法包括使用荧光双链核苷酸结合染料或荧光双链核苷酸插入染料。荧光双链DNA结合染料的实例包括SYBR-green (Molecular Probes)。可以结合熔解曲线分析使用双链DNA结合染料以测量引物延伸产物和/或扩增产物。可以在实时PCR仪器，如具有机载软件(SDS 2.1)的ABI 5700/7000(96孔格式)或ABI 7900(384孔格式)仪器上进行熔解曲线分析。或者，可以进行熔解曲线分析作为终点分析。美国专利公开号2006/0172324中描述了熔点分析的示例性方法。
在本发明的另一个方面，提供了用于本文所述的引物延伸方法的试剂盒。在一些实施方案中，为了使用的便利将试剂盒区室化，该试剂盒包含至少一个提供本发明的改进的DNA聚合酶的容器。还可以包括一个或更多个提供额外的一种或多种试剂的额外的容器。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括包含肝素或其盐或将肝素释放到溶液中的血液收集管、容器、或单元。血液收集单元可以是肝素化管。这种额外的容器可以包括本领域技术人员所知的用于根据上述方法的引物延伸操作中的任何试剂或其他元件，包括用于，例如，核酸扩增操作(例如PCR、RT-PCR)，DNA测序操作或DNA标记操作中的试剂。例如，在某些实施方案中，试剂盒进一步包括容器，所述容器提供在引物延伸条件下可与预定的多核苷酸模板杂交的5'有义引物，或包括5'有义引物和对应的3'反义引物的引物对。在其他非互相排斥的变型中，试剂盒包括一个或更多个提供三磷酸核苷(常规的和/或非常规的)的容器。在特定实施方案中，试剂盒包括α-硫代磷酸酯(α-phophorothioate)dNTPs、dUTP、dITP，和/或标记的dNTPs，如荧光素-或花菁-染料家族dNTPs。在其他非互相排斥的实施方案中，试剂盒包括一个或更多个容器，所述容器提供适于引物延伸反应的缓冲剂。
在本发明的另一个方面，提供了包含本文所述的具有增强的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率和/或RT和聚合酶抑制剂的耐受性的聚合酶的反应混合物。反应混合物可以进一步包括用于，例如，核酸扩增操作(例如，PCR，RT-PCR)，DNA测序操作，或DNA标记操作中的试剂。例如，在某些实施方案中，反应混合物包括适合用于引物延伸反应的缓冲剂。反应混合物也可以包含模板核酸(DNA和/或RNA)，一种或多种引物或探针多核苷酸，三磷酸核苷(包括，例如，脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，标记的核苷酸，非常规的核苷酸)，盐(例如，Mn2+, Mg2+)，标记(例如，荧光团)。在一些实施方案中，反应混合物包含在引物延伸条件下与预定的多核苷酸模板可杂交的5'-有义引物，或包含所述5'-有义引物和对应的3'-反义引物的引物对。在一些实施方案中，反应混合物包含α-硫代磷酸酯(α-phophorothioate)dNTPs、dUTP、dITP，和/或标记的dNTPs，如荧光素-或花菁-染料家族dNTPs。在一些实施方案中，反应混合物包含铁螯合剂或紫色染料。在某些实施方案中，反应混合物包含血红蛋白、或血红蛋白的降解产物。例如，在某些实施方案中，血红蛋白的降解产物包括血红素分解产物(如氯高铁血红素、高铁血红素、hematophoryn和胆红素)。在其他实施方案中，反应混合物包含肝素或其盐。在某些实施方案中，反应混合物含有从血液分离的模板核酸。在其他实施方案中，模板核酸是RNA，且反应混合物包含肝素或其盐。
在一些实施方案中，反应混合物包含两种或更多种聚合酶。例如，在一些实施方案中，反应混合物包含相比于对照聚合酶具有增强的逆转录酶效率的第一DNA聚合酶，和具有DNA依赖性聚合酶活性的第二DNA聚合酶。第二DNA聚合酶可以是野生型或未修饰的聚合酶，或者可以是具有增强的DNA依赖性聚合酶活性的改进的聚合酶。通过提供具有增强的逆转录酶活性的聚合酶和具有DNA依赖性聚合酶活性的聚合酶，可将此类反应混合物用于RNA模板的扩增（例如，RT-PCR）。
实施例
下列实施例用于说明，但不是限制要求保护的本发明。
实施例 1 ： 文库生成
简而言之，该筛选过程中的步骤包括突变型酶的文库生成、表达和部分纯化，筛选酶的期望的性质，DNA测序，克隆纯化，和进一步表征选择的候选突变体。下面进一步描述这些步骤中的每一个。
克隆文库生成：编码Z05 D580G_I709K DNA聚合酶的聚合酶结构域的核酸经受在包括该核酸序列的质粒的Blp I和Bgl II限制性位点之间的易错(诱变)PCR。下面给出了用于这个的引物：
正向引物: 5’- CTACCTCCTGGACCCCTCCAA-3’ (SEQ ID NO:30); 和,
反向引物: 5’- ATAACCAACTGGTAGTGGCGTGTAA-3’ (SEQ ID NO:31)
使用1.8 mM的Mg2+浓度进行PCR，以便产生具有所需突变率的文库。缓冲剂条件为50 mM Bicine pH 8.2, 115 mM KOAc, 8% w/v甘油和0.2 mM每种dNTPs。以0.15 U/ µL使用GeneAmp® AccuRT热启动PCR酶。以每50 µL反应体积5x105个拷贝的线性化Z05 D580G_I709K质粒DNA起始，用94℃温度使反应变性60秒，然后使用94℃的变性温度15秒，60℃的退火温度15秒，72℃的延伸温度120秒进行30循环的扩增并随后在72℃温度的最终延伸5分钟。
用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA)纯化产生的扩增子，用Blp I和Bgl II切割，然后用QIAquick PCR纯化试剂盒重新纯化。通过用相同的两种限制性酶切割，用重组的碱性磷酸酶(RAS，目录＃03359123001)处理，并用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化而制备Z05 D580G_I709K载体质粒。将切割的载体和突变的插入片段以1:3的比例混合并用T4 DNA连接酶在室温处理5分钟(NEB Quick Ligation™ Kit)。用QIAquick PCR 纯化试剂盒纯化连接产物并通过电穿孔法将其转化入大肠杆菌宿主菌株。
将表达的培养物的等分样品涂覆在氨苄青霉素选择性培养基上以测定在每个转化中独特转化体的数量。在作为冷冻保护剂的甘油存在的情况下，合并转化物并存储于-70℃到-80℃。
然后将文库涂布在大号氨苄青霉素选择性琼脂平板上。用自动菌落挑选机(QPix2, Genetix Ltd)将单菌落转移至包含具有氨苄青霉素和10% w/v甘油的2X Luria液体培养基的384孔板。在30℃将这些平板孵育过夜以允许培养物生长，然后存储于-70℃到-80℃。加入2X Luria液体培养基的甘油量足够低以允许培养物生长，然而足够高以提供冷冻保护。以这种方式制备了数千个菌落用于后来使用。
提取物文库制备部分1—发酵：从上述克隆文库制备适于筛选目的的部分纯化提取物的对应文库。该过程的第一步是制备每个克隆的小规模表达培养物。这些培养物以96孔形式生长；因此对于每块384孔文库平板有4块表达培养平板。从克隆文库平板的每个孔将0.5 µL转移至包含150 µL培养基A的96孔种子平板的一个孔(参见下面的表3)。这种种子平板在iEMS平板孵育器/振荡器(ThermoElectron)中于30℃下在1150 rpm振荡过夜。然后使用这些种子培养物接种相同的培养基，这次将20 µL接种进大号96孔板(Nunc # 267334)中的250 µL培养基A中。这些平板于37℃振荡孵育过夜。表达质粒包含转录控制元件，其允许在37℃表达而不能在30℃表达。过夜孵育后，培养物典型地以总细胞蛋白的1-10%表达克隆蛋白。通过离心从这些培养物中收获细胞。这些细胞或冻存(-20℃)或如下所述立即处理。
表2. 培养基A(使用前过滤灭菌)
提取物文库制备部分2—提取: 将来自发酵步骤的细胞团重悬浮在25 µL裂解缓冲液(下表3)中，转移至384孔热循环仪平板并密封。注意该缓冲液包含溶菌酶以帮助细胞裂解，并包含DNase以便从提取物中除去DNA。为了裂解细胞，将板在37℃孵育15分钟，在-20℃冷冻过夜并再次在37℃下孵育15分钟。添加硫酸铵(1.5 µL的2M溶液)并在75℃孵育平板15分钟以沉淀并失活污染蛋白，包括外源添加的核酸酶。将平板在4℃ 3000 x g离心15分钟，然后将上清液转移至新的384孔热循环仪平板。在-20℃冻存这些提取物平板用于随后的筛选中。每孔包含约0.5-3 µM的突变型文库聚合酶。
表3. 裂解缓冲液
实施例 2 ： 具有改进的逆转录效率的突变型DNA聚合酶的鉴定
针对改进的逆转录效率筛选粗蛋白提取物文库： 通过比较在RT-PCR系统中从含有pSP64 poly(A) (Promega)的HCV基因型Ib 5’NTR的前800个碱基的丙型肝炎病毒(HCV)转录物JP2-5扩增240个碱基对扩增子由粗酶提取物的荧光5’核酸酶(TaqMan)活性而生成的生长曲线的Cp(交叉点)值而筛选提取物文库。
在Roche LC 480动力热循环仪上以384孔形式实施反应，各孔含有用缓冲液稀释10倍的3μL个别酶提取物，所述缓冲液含有20 mM Tris-HCl(pH 8)、100 mM KCl、0.1 mM EDTA、和0.1% Tween-20，其添加至12 μL表4中所述的RT-PCR预混物中。热循环条件为：50℃时2分钟(“UNG”步骤)；65℃时2分钟(“RT”步骤)；5个循环的94℃ 15秒和随后的62℃ 30秒；和45个循环的91℃15秒和随后的62℃ 30秒。
表4
使用上述方案筛选约5000克隆。基于如Abs Quant/二阶导数最大法计算的最早交叉点(Cp)值和高于任意截止值的荧光平台值从初始合并物中选择四十个克隆用于再次筛选。相应于最高的提取物的培养孔被取样到新鲜的生长培养基并重新生长以产生包含最好的突变体的新的培养平板，以及用于比较对照的若干亲本Z05 D580X D580G_ I709K培养物。然后使用这些培养板来制备新鲜的粗提取物，对所述新鲜的粗提取物用如之前所述用于原始筛选的相同RNA目标和条件重新筛选。表5显示获自由于FAM标记的探针的5'水解的荧光信号增加的Cp值。结果显示，克隆0691-L24以比Z05_D580G_I709K亲本更高的效率扩增RNA目标。
表5
对聚合酶基因突变区的DNA序列进行测序，以确定存在于任何单一克隆的一种或多种突变。选择克隆0691-L24用于进一步测试，所以突变型聚合酶蛋白在烧瓶培养物中表达，纯化至均一，且定量。
完全纯化的0691-L24突变体在基于Mg2+的RT-PCR中的用途：在TaqMan基于Mg2+的RT-PCR中将纯化且定量的突变体0691-L24与亲本Z05_D580G_I709K进行比较。通过比较来自JP2-5 RNA转录物和用限制性核酸内切酶EcoRI消化的pJP2-5 DNA线性质粒的扩增的Cp值来测量逆转录和PCR效率。寡核苷酸和预混物条件(表4) 和初始筛选中使用的相同。每个反应具有100,000个拷贝的JP2-5转录物RNA、100,000个拷贝的pJP2-5线性质粒DNA、或1000个拷贝的pJP2-5线性质粒DNA。如上所述，在一式两份反应中使用引物1和引物2扩增所有目标，以生成240个碱基对的扩增子。在Roche Light Cycler 480热循环仪上用15 μL的反应体积进行所有反应。通过Abs Quant/二阶导数最大法计算交叉点(Cps)并将该值平均化。预混物条件与之前表4中描述的那些相同，除了使用5 nM- 40 nM的DNA聚合酶浓度的范围实施反应之外。热循环条件为： 50℃时2分钟(“UNG”步骤)；65℃时21分钟(“RT”步骤)；5个循环的94℃ 15秒和随后的62℃ 30秒；和45个循环的91℃ 15秒和随后的62℃ 30秒。表6显示从由于在20 nM酶条件裂解TaqMan探针导致的荧光信号增加获得的Cp值。
表6
结果表明，与亲本Z05_D580G_I709K相比，突变型DNA聚合酶0691_L24允许更有效扩增RNA目标，而不损害对DNA目标的PCR效率。
一种或多种赋予表型的突变的测定：测序结果显示除了亲本D580G和I709K突变外，由克隆0691-L24表达的聚合酶携带突变N629D和I640F。将Z05 D580G_I709K_I640F突变体通过亚克隆构建，纯化，定量并在具有从40 mM- 110 mM的多种KOAc浓度和25 nM纯化酶的Mg2+活化的TaqMan RT-PCR中与0691-L24 (Z05 D580G_I709K_ N629D _ I640F)和亲本Z05 D580G_I709K比较。预混物条件与之前表4中描述的那些相同。每一反应具有100,000拷贝的JP2-5 RNA转录物、100,000拷贝的pJP2-5线性质粒DNA或1000拷贝的pJP2-5线性质粒DNA。所有目标在一式两份反应中用相同引物组扩增，以产生240碱基对的扩增子。通过比较DNA和RNA之间的Cp值来确定PCR和RT-PCR效率。所有反应在Roche Light Cycler 480热循环仪上以15 µL的反应体积进行。通过Abs Quant/二阶导数最大法计算交叉点（Cp），并将Cp平均。热循环条件为：50 ℃下2分钟(“UNG”步骤); 65 ℃ 2分钟(“RT”步骤); 94 ℃ 15秒，随后62 ℃ 30秒的5个循环; 和91 ℃ 15秒，随后62 ℃ 30秒的45个循环。表8显示了从在60 mM KOAc条件下由于切割TaqMan探针产生的荧光信号增加中获得的Cp值。
表7
0691-L24 (Z05 D580G_I709K_ N629D _ I640F)和Z05 D580G_I709K_I640F对RNA和DNA目标均具有相似的Cp值，证明I640F突变赋予在RT-PCR性能中观察到的改进。
可以理解的是，本文所述的实施例和实施方案仅仅是用于说明性目的，且基于所述实施例和实施方案的各种修改或改变将提示于本领域技术人员。
序列表
<110> Roche Diagnostics GmbH
F. Hoffmann-La Roche AG
<120> 具有改进活性的DNA聚合酶
<130> 27283 WO-HS
<140> 仍未指定
<141> 仍未指定
<150> US 61/568,375
<151> 2011-12-08
<160> 39
<170> FastSEQ用于Windows版本4.0
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<211> 834
<212> PRT
<213> 栖热菌种
<220>
<223> 栖热菌种 Z05 DNA聚合酶(Z05)
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Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu
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Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln
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Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu
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<212> PRT
<213> 水生栖热菌
<220>
<223> 水生栖热菌 DNA聚合酶(Taq)
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Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu
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Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys
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Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val
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Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly
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<211> 830
<212> PRT
<213> 丝状栖热菌
<220>
<223> 丝状栖热菌 DNA聚合酶(Tfi)
<400> 3
Met Leu Pro Leu Leu Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu Val Asp Gly
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Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala Lys Ser Leu
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Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu Ala Tyr Lys Ala
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Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu Ala Leu Ile
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Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Arg Lys Ala Glu Arg
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Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Ser Ala Asp Arg Asp Leu Tyr Gln
130 135 140
Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Leu Leu His Pro Glu Gly Glu Val Leu
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Thr Pro Gly Trp Leu Gln Glu Arg Tyr Gly Leu Ser Pro Glu Arg Trp
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Val Glu Tyr Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp Asn Leu Pro Gly
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Val Pro Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys Glu Trp
195 200 205
Gly Ser Leu Glu Ala Ile Leu Lys Asn Leu Asp Gln Val Lys Pro Glu
210 215 220
Arg Val Trp Glu Ala Ile Arg Asn Asn Leu Asp Lys Leu Gln Met Ser
225 230 235 240
Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val Asp Phe
245 250 255
Ala Lys Arg Arg Glu Pro Thr Gly Lys Gly Leu Lys Ala Phe Leu Glu
260 265 270
Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu Glu Ala
275 280 285
Pro Lys Glu Ala Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Gly Gly Ala Phe
290 295 300
Leu Gly Phe Leu Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp Ala Glu Leu Leu
305 310 315 320
Ala Leu Ala Gly Ala Lys Glu Gly Arg Val His Arg Ala Glu Asp Pro
325 330 335
Val Gly Ala Leu Lys Asp Leu Lys Glu Ile Arg Gly Leu Leu Ala Lys
340 345 350
Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Arg Glu Ile Pro Pro Gly
355 360 365
Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Gly Asn Thr Asn
370 375 380
Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Lys Glu Asp Ala
385 390 395 400
Ala Ala Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu Trp Gln Ala Leu Tyr Pro
405 410 415
Arg Val Ala Glu Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu
420 425 430
Arg Pro Leu Ala Gln Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly Val Arg
435 440 445
Leu Asp Val Pro Tyr Leu Glu Ala Leu Ser Gln Glu Val Ala Phe Glu
450 455 460
Leu Glu Arg Leu Glu Ala Glu Val His Arg Leu Ala Gly His Pro Phe
465 470 475 480
Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu
485 490 495
Gly Leu Pro Pro Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr
500 505 510
Ser Ala Ala Val Leu Glu Leu Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val Gly
515 520 525
Arg Ile Leu Glu Tyr Arg Glu Leu Met Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile
530 535 540
Asp Pro Leu Pro Arg Leu Val His Pro Lys Thr Gly Arg Leu His Thr
545 550 555 560
Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp
565 570 575
Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile
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Arg Lys Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly His Leu Leu Val Ala Leu Asp
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Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu
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Asn Leu Ile Arg Val Phe Arg Glu Gly Lys Asp Ile His Thr Glu Thr
625 630 635 640
Ala Ala Trp Met Phe Gly Val Pro Pro Glu Gly Val Asp Gly Ala Met
645 650 655
Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser
660 665 670
Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Ala
675 680 685
Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg Ala Trp
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Ile Ala Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Lys Gly Tyr Val Glu Thr
705 710 715 720
Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn Ala Arg Val Lys
725 730 735
Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val Gln
740 745 750
Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro
755 760 765
Arg Leu Arg Pro Leu Gly Val Arg Ile Leu Leu Gln Val His Asp Glu
770 775 780
Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Ala Arg Ala Glu Glu Ala Ala Gln Leu
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Ala Lys Glu Thr Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ser Val Pro Leu Glu
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Val Glu Val Gly Met Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu
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<210> 4
<211> 831
<212> PRT
<213> 黄栖热菌
<220>
<223> 黄栖热菌 DNA聚合酶(Tfl)
<400> 4
Met Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu Val
1 5 10 15
Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly Leu
20 25 30
Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala Lys
35 40 45
Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Val Val Val Val Val
50 55 60
Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu Ala Tyr
65 70 75 80
Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu Ala
85 90 95
Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Val Arg Leu Glu Val
100 105 110
Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys Arg Ala
115 120 125
Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg Asp Leu
130 135 140
Tyr Gln Leu Leu Ser Glu Arg Ile Ala Ile Leu His Pro Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Tyr Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro Glu
165 170 175
Gln Trp Val Asp Tyr Arg Ala Leu Ala Gly Asp Pro Ser Asp Asn Ile
180 185 190
Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Gln Arg Leu Ile Arg
195 200 205
Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Leu Phe Gln His Leu Asp Gln Val Lys
210 215 220
Pro Ser Leu Arg Glu Lys Leu Gln Ala Gly Met Glu Ala Leu Ala Leu
225 230 235 240
Ser Arg Lys Leu Ser Gln Val His Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val Asp
245 250 255
Phe Gly Arg Arg Arg Thr Pro Asn Leu Glu Gly Leu Arg Ala Phe Leu
260 265 270
Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu Glu
275 280 285
Gly Pro Lys Ala Ala Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly Ala
290 295 300
Phe Leu Gly Phe Ser Phe Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp Ala Glu Leu
305 310 315 320
Leu Ala Leu Ala Gly Ala Trp Glu Gly Arg Leu His Arg Ala Gln Asp
325 330 335
Pro Leu Arg Gly Leu Arg Asp Leu Lys Gly Val Arg Gly Ile Leu Ala
340 345 350
Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Asp Leu Phe Pro
355 360 365
Glu Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn Thr
370 375 380
Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu Asp
385 390 395 400
Ala Gly Glu Arg Ala Leu Leu Ala Glu Arg Leu Phe Gln Thr Leu Lys
405 410 415
Glu Arg Leu Lys Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Glu Glu Val
420 425 430
Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala Arg Met Glu Ala Thr Gly Val
435 440 445
Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Gln Ala Leu Ser Leu Glu Val Glu Ala
450 455 460
Glu Val Arg Gln Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro
465 470 475 480
Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu
485 490 495
Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ser
500 505 510
Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val
515 520 525
Asp Arg Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn Thr Tyr
530 535 540
Ile Asp Pro Leu Pro Ala Leu Val His Pro Lys Thr Gly Arg Leu His
545 550 555 560
Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser
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Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg
580 585 590
Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Glu Gly Trp Val Leu Val Val Leu
595 600 605
Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp
610 615 620
Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr Gln
625 630 635 640
Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Ser Pro Glu Gly Val Asp Pro Leu
645 650 655
Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met
660 665 670
Ser Ala His Arg Leu Ser Gly Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Glu Glu Ala
675 680 685
Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Tyr Pro Lys Val Arg Ala
690 695 700
Trp Ile Glu Gly Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val Glu
705 710 715 720
Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn Ala Arg Val
725 730 735
Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val
740 745 750
Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Arg Leu Phe
755 760 765
Pro Arg Leu Gln Glu Leu Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His Asp
770 775 780
Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Asp Arg Ala Glu Arg Val Ala Ala
785 790 795 800
Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Trp Pro Leu Gln Val Pro Leu
805 810 815
Glu Val Glu Val Gly Leu Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu
820 825 830
<210> 5
<211> 830
<212> PRT
<213> 栖热菌种
<220>
<223> 栖热菌种 sps17 DNA聚合酶(Sps17)
<400> 5
Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu Val Asp Gly
1 5 10 15
His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly Leu Thr Thr
20 25 30
Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala Lys Ser Leu
35 40 45
Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Glu Val Ala Ile Val Val Phe Asp
50 55 60
Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu Ala Tyr Lys Ala
65 70 75 80
Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu Ala Leu Ile
85 90 95
Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Val Arg Leu Glu Val Pro Gly
100 105 110
Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys Lys Ala Glu Arg
115 120 125
Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Ser Ala Asp Arg Asp Leu Tyr Gln
130 135 140
Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Leu Leu His Pro Glu Gly Glu Val Leu
145 150 155 160
Thr Pro Gly Trp Leu Gln Glu Arg Tyr Gly Leu Ser Pro Glu Arg Trp
165 170 175
Val Glu Tyr Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp Asn Leu Pro Gly
180 185 190
Val Pro Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys Glu Trp
195 200 205
Gly Ser Leu Glu Ala Ile Leu Lys Asn Leu Asp Gln Val Lys Pro Glu
210 215 220
Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Asn Asn Leu Asp Lys Leu Gln Met Ser
225 230 235 240
Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val Asp Phe
245 250 255
Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Trp Glu Gly Leu Lys Ala Phe Leu Glu
260 265 270
Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu Glu Ala
275 280 285
Pro Lys Glu Ala Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Gly Gly Ala Phe
290 295 300
Leu Gly Phe Leu Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp Ala Glu Leu Leu
305 310 315 320
Ala Leu Ala Gly Ala Lys Glu Gly Arg Val His Arg Ala Glu Asp Pro
325 330 335
Val Gly Ala Leu Lys Asp Leu Lys Glu Ile Arg Gly Leu Leu Ala Lys
340 345 350
Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Arg Glu Ile Pro Pro Gly
355 360 365
Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Gly Asn Thr Asn
370 375 380
Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Lys Glu Asp Ala
385 390 395 400
Ala Ala Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu Trp Gln Ala Leu Tyr Pro
405 410 415
Arg Val Ala Glu Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu
420 425 430
Arg Pro Leu Ala Gln Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly Val Arg
435 440 445
Leu Asp Val Pro Tyr Leu Glu Ala Leu Ser Gln Glu Val Ala Phe Glu
450 455 460
Leu Glu Arg Leu Glu Ala Glu Val His Arg Leu Ala Gly His Pro Phe
465 470 475 480
Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu
485 490 495
Gly Leu Pro Pro Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr
500 505 510
Ser Ala Ala Val Leu Glu Leu Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val Gly
515 520 525
Arg Ile Leu Glu Tyr Arg Glu Leu Met Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile
530 535 540
Asp Pro Leu Pro Arg Leu Val His Pro Lys Thr Gly Arg Leu His Thr
545 550 555 560
Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp
565 570 575
Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile
580 585 590
Arg Lys Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly His Leu Leu Val Ala Leu Asp
595 600 605
Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu
610 615 620
Asn Leu Ile Arg Val Phe Arg Glu Gly Lys Asp Ile His Thr Glu Thr
625 630 635 640
Ala Ala Trp Met Phe Gly Val Pro Pro Glu Gly Val Asp Gly Ala Met
645 650 655
Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser
660 665 670
Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Ala
675 680 685
Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg Ala Trp
690 695 700
Ile Ala Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Lys Gly Tyr Val Glu Thr
705 710 715 720
Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn Ala Arg Val Lys
725 730 735
Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val Gln
740 745 750
Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro
755 760 765
Arg Leu Arg Pro Leu Gly Val Arg Ile Leu Leu Gln Val His Asp Glu
770 775 780
Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Ala Arg Ala Glu Glu Ala Ala Gln Leu
785 790 795 800
Ala Lys Glu Thr Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ser Val Pro Leu Glu
805 810 815
Val Glu Val Gly Met Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Ala
820 825 830
<210> 6
<211> 834
<212> PRT
<213> 嗜热栖热菌
<220>
<223> 嗜热栖热菌 DNA聚合酶(Tth)
<400> 6
Met Glu Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe
50 55 60
Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu
65 70 75 80
Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln
85 90 95
Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu
100 105 110
Glu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys
115 120 125
Lys Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg
130 135 140
Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu
145 150 155 160
Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg
165 170 175
Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp
180 185 190
Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu
195 200 205
Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg
210 215 220
Val Lys Pro Glu Asn Val Arg Glu Lys Ile Lys Ala His Leu Glu Asp
225 230 235 240
Leu Arg Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu
245 250 255
Glu Val Asp Leu Ala Gln Gly Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg
260 265 270
Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly
275 280 285
Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro
290 295 300
Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp
305 310 315 320
Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Arg Asp Gly Arg Val His Arg
325 330 335
Ala Ala Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly
340 345 350
Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Ser Arg Glu Gly Leu Asp
355 360 365
Leu Val Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro
370 375 380
Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp
385 390 395 400
Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu His Arg
405 410 415
Asn Leu Leu Lys Arg Leu Glu Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr
420 425 430
His Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala
435 440 445
Thr Gly Val Arg Arg Asp Val Ala Tyr Leu Gln Ala Leu Ser Leu Glu
450 455 460
Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala
465 470 475 480
Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu
485 490 495
Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly
500 505 510
Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His
515 520 525
Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys
530 535 540
Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val His Pro Arg Thr Gly
545 550 555 560
Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu
565 570 575
Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu
580 585 590
Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu
595 600 605
Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu
610 615 620
Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile
625 630 635 640
His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Pro Glu Ala Val
645 650 655
Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu
660 665 670
Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr
675 680 685
Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys
690 695 700
Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly
705 710 715 720
Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn
725 730 735
Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn
740 745 750
Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val
755 760 765
Lys Leu Phe Pro Arg Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln
770 775 780
Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu
785 790 795 800
Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala
805 810 815
Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Met Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala
820 825 830
Lys Gly
<210> 7
<211> 834
<212> PRT
<213> Thermus caldophilus
<220>
<223> Thermus caldophilus DNA聚合酶(Tca)
<400> 7
Met Glu Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe
50 55 60
Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu
65 70 75 80
Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln
85 90 95
Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu
100 105 110
Glu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys
115 120 125
Asn Pro Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg
130 135 140
Asp Leu Asp Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu
145 150 155 160
Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Gln Lys Tyr Gly Leu Lys
165 170 175
Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp
180 185 190
Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu
195 200 205
Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg
210 215 220
Val Lys Pro Glu Asn Val Arg Glu Lys Ile Lys Ala His Leu Glu Asp
225 230 235 240
Leu Arg Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu
245 250 255
Glu Val Asp Leu Ala Gln Gly Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg
260 265 270
Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly
275 280 285
Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro
290 295 300
Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp
305 310 315 320
Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Arg Asp Gly Arg Val His Arg
325 330 335
Ala Ala Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly
340 345 350
Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Ser Arg Glu Gly Leu Asp
355 360 365
Leu Val Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro
370 375 380
Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp
385 390 395 400
Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu His Arg
405 410 415
Asn Leu Leu Lys Arg Leu Gln Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr
420 425 430
His Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala
435 440 445
Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Gln Ala Leu Ser Leu Glu
450 455 460
Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala
465 470 475 480
Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu
485 490 495
Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly
500 505 510
Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His
515 520 525
Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys
530 535 540
Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val His Pro Asn Thr Gly
545 550 555 560
Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu
565 570 575
Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu
580 585 590
Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu
595 600 605
Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu
610 615 620
Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile
625 630 635 640
His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Pro Glu Ala Val
645 650 655
Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu
660 665 670
Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr
675 680 685
Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys
690 695 700
Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly
705 710 715 720
Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn
725 730 735
Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn
740 745 750
Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val
755 760 765
Lys Leu Phe Pro Arg Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln
770 775 780
Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Gly Ala Glu Glu
785 790 795 800
Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala
805 810 815
Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Met Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala
820 825 830
Lys Gly
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的DNA聚合酶基序
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(1)
<223> Xaa = Ile, Leu, Val, Gln或Met
<220>
<221> 变体
<222> (2)...(2)
<223> Xaa = Arg, Lys, Gln或Glu
<220>
<221> 变体
<222> (3)...(3)
<223> Xaa = Val或Ala
<220>
<221> 变体
<222> (5)...(5)
<223> Xaa = Gln, Arg, Glu, Lys或Val
<220>
<221> 变体
<222> (6)...(6)
<223> Xaa = Glu或Arg
<220>
<221> 变体
<222> (7)...(7)
<223> Xaa = Gly或Asp
<220>
<221> 变体
<222> (8)...(8)
<223> Xaa = Lys, Arg, Ile, Leu或Ala
<220>
<221> 变体
<222> (10)...(10)
<223> Xaa = 除Ile或Val以外的任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (13)...(13)
<223> Xaa = Gln, Glu, Leu, Ile, Arg或Lys
<220>
<221> 变体
<222> (16)...(16)
<223> Xaa = Ser, Ala或Met
<220>
<221> 变体
<222> (17)...(17)
<223> Xaa = Trp, Arg, Lys, Gln或Asp
<400> 8
Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa His Thr Xaa Thr Ala Xaa
1 5 10 15
Xaa
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的DNA聚合酶基序
<220>
<221> 变体
<222> (5)...(5)
<223> Xaa = Gln或Arg
<220>
<221> 变体
<222> (8)...(8)
<223> Xaa = Lys或Arg
<220>
<221> 变体
<222> (10)...(10)
<223> Xaa = 除Ile以外的任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (16)...(16)
<223> Xaa = Ser或Ala
<400> 9
Ile Arg Val Phe Xaa Glu Gly Xaa Asp Xaa His Thr Glx Thr Ala Xaa
1 5 10 15
Trp
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的DNA聚合酶基序
<220>
<221> 变体
<222> (10)...(10)
<223> Xaa = 除Ile以外的任何氨基酸
<400> 10
Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Xaa His Thr Gln Thr Ala Ser
1 5 10 15
Trp
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的DNA聚合酶基序
<400> 11
Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Phe His Thr Gln Thr Ala Ser
1 5 10 15
Trp
<210> 12
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 栖热菌种Z05 DNA聚合酶(Z05)的合成的聚合酶结构域区
<400> 12
Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly
1 5 10 15
Lys Asp Ile His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Ser
20 25 30
<210> 13
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 水生栖热菌DNA聚合酶(Taq)的合成的聚合酶结构域区
<400> 13
Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly
1 5 10 15
Arg Asp Ile His Thr Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro
20 25 30
<210> 14
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 丝状栖热菌（Thermus filiformus）DNA聚合酶(Tfi)的合成的聚合酶结构域区
<400> 14
Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Arg Glu Gly
1 5 10 15
Lys Asp Ile His Thr Glu Thr Ala Ala Trp Met Phe Gly Val Pro
20 25 30
<210> 15
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 黄栖热菌DNA聚合酶(Tfl)的合成的聚合酶结构域区
<400> 15
Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly
1 5 10 15
Arg Asp Ile His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Ser
20 25 30
<210> 16
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 栖热菌种sps17 DNA聚合酶(Sps17)的合成的聚合酶结构域区
<400> 16
Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Arg Glu Gly
1 5 10 15
Lys Asp Ile His Thr Glu Thr Ala Ala Trp Met Phe Gly Val Pro
20 25 30
<210> 17
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜热栖热菌DNA聚合酶(Tth)的合成的聚合酶结构域区
<400> 17
Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly
1 5 10 15
Lys Asp Ile His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro
20 25 30
<210> 18
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Thermus caldophilus DNA聚合酶(Tca)的合成的聚合酶结构域区
<400> 18
Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly
1 5 10 15
Lys Asp Ile His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro
20 25 30
<210> 19
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 海栖热袍菌DNA聚合酶(Tma)的合成的聚合酶结构域区
<400> 19
Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Leu Arg Ala Phe Glu Glu Gly
1 5 10 15
Ile Asp Val His Thr Leu Thr Ala Ser Arg Ile Phe Asn Val Lys
20 25 30
<210> 20
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶(Tne)的合成的聚合酶结构域区
<400> 20
Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Val Lys Ala Phe Glu Glu Gly
1 5 10 15
Ile Asp Val His Thr Leu Thr Ala Ser Arg Ile Tyr Asn Val Lys
20 25 30
<210> 21
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 非洲栖热腔菌DNA聚合酶(Taf)的合成的聚合酶结构域区
<400> 21
Ala His Val Ser Lys Asp Glu Asn Leu Leu Lys Ala Phe Lys Glu Asp
1 5 10 15
Leu Asp Ile His Thr Ile Thr Ala Ala Lys Ile Phe Gly Val Ser
20 25 30
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的保守DNA聚合酶活性位点基序 A
<400> 22
Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg
1 5
<210> 23
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 耐放射异常球菌DNA聚合酶(Dra)的合成的聚合酶结构域区
<400> 23
Ala His Ile Ala Asp Asp Pro Leu Met Gln Gln Ala Phe Val Glu Gly
1 5 10 15
Ala Asp Ile His Arg Arg Thr Ala Ala Gln Val Leu Gly Leu Asp
20 25 30
<210> 24
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶(Bst)的合成的聚合酶结构域区
<400> 24
Ala His Ile Ala Glu Asp Asp Asn Leu Ile Glu Ala Phe Arg Arg Gly
1 5 10 15
Leu Asp Ile His Thr Lys Thr Ala Met Asp Ile Phe His Val Ser
20 25 30
<210> 25
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 热坚芽孢杆菌DNA聚合酶(Bca)的合成的聚合酶结构域区
<400> 25
Ala His Ile Ala Glu Asp Asp Asn Leu Met Glu Ala Phe Arg Arg Asp
1 5 10 15
Leu Asp Ile His Thr Lys Thr Ala Met Asp Ile Phe Gln Val Ser
20 25 30
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的聚合酶结构域区天然共有基序
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(1)
<223> Xaa = Ile, Leu, Val, Gln或Met
<220>
<221> 变体
<222> (2)...(2)
<223> Xaa = Arg, Lys, Gln或Glu
<220>
<221> 变体
<222> (3)...(3)
<223> Xaa = Val或Ala
<220>
<221> 变体
<222> (5)...(5)
<223> Xaa = Gln, Arg, Glu, Lys或Val
<220>
<221> 变体
<222> (6)...(6)
<223> Xaa = Glu或Arg
<220>
<221> 变体
<222> (7)...(7)
<223> Xaa = Gly或Asp
<220>
<221> 变体
<222> (8)...(8)
<223> Xaa = Lys, Arg, Ile, Leu或Ala
<220>
<221> 变体
<222> (10)...(10)
<223> Xaa = Ile或Val
<220>
<221> 变体
<222> (13)...(13)
<223> Xaa = Gln, Glu, Leu, Ile, Arg或Lys
<220>
<221> 变体
<222> (16)...(16)
<223> Xaa = Ser, Ala或Met
<220>
<221> 变体
<222> (17)...(17)
<223> Xaa = Trp, Arg, Lys, Gln或Asp
<400> 26
Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa His Thr Xaa Thr Ala Xaa
1 5 10 15
Xaa
<210> 27
<211> 893
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源于栖热菌种Z05的N末端5'核酸酶结构域和海栖热袍菌DNA聚合酶的C末端3'-5'
外切核酸酶和聚合酶结构域的合成的嵌合CS5 DNA聚合酶
<400> 27
Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe
50 55 60
Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu
65 70 75 80
Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln
85 90 95
Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu
100 105 110
Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys
115 120 125
Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg
130 135 140
Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu
145 150 155 160
Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys
165 170 175
Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp
180 185 190
Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu
195 200 205
Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg
210 215 220
Val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu Asp
225 230 235 240
Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu
245 250 255
Glu Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg
260 265 270
Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly
275 280 285
Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro Val Gly Tyr Arg Ile Val Lys Asp Leu
290 295 300
Val Glu Phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe
305 310 315 320
Ala Ile Asp Leu Glu Thr Ser Ser Leu Asp Pro Phe Asp Cys Asp Ile
325 330 335
Val Gly Ile Ser Val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro
340 345 350
Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu Val Leu Lys
355 360 365
Lys Leu Lys Glu Ile Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys Ile Val Gly Gln
370 375 380
Asn Leu Lys Phe Asp Tyr Lys Val Leu Met Val Lys Gly Val Glu Pro
385 390 395 400
Val Pro Pro Tyr Phe Asp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro
405 410 415
Asn Glu Lys Lys Phe Asn Leu Asp Asp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly
420 425 430
Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu
435 440 445
Phe Gly Phe Ser Phe Ala Asp Val Pro Val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr
450 455 460
Ser Cys Glu Asp Ala Asp Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser
465 470 475 480
Leu Lys Leu His Glu Ala Asp Leu Glu Asn Val Phe Tyr Lys Ile Glu
485 490 495
Met Pro Leu Val Asn Val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly Val Tyr
500 505 510
Val Asp Thr Glu Phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys
515 520 525
Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Tyr Arg Ile Ala Gly Glu Pro Phe
530 535 540
Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Val Ser Arg Ile Leu Phe Glu Lys Leu
545 550 555 560
Gly Ile Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly Asp Tyr Ser Thr
565 570 575
Arg Ile Glu Val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu Ile Ile Pro
580 585 590
Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile
595 600 605
Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg Ile His Ala
610 615 620
Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp
625 630 635 640
Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu Ile
645 650 655
Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile Val Ser Ala
660 665 670
Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile Leu Ala His Leu Ser Gly Asp
675 680 685
Glu Asn Leu Leu Arg Ala Phe Glu Glu Gly Ile Asp Val His Thr Leu
690 695 700
Thr Ala Ser Arg Ile Phe Asn Val Lys Pro Glu Glu Val Thr Glu Glu
705 710 715 720
Met Arg Arg Ala Gly Lys Met Val Asn Phe Ser Ile Ile Tyr Gly Val
725 730 735
Thr Pro Tyr Gly Leu Ser Val Arg Leu Gly Val Pro Val Lys Glu Ala
740 745 750
Glu Lys Met Ile Val Asn Tyr Phe Val Leu Tyr Pro Lys Val Arg Asp
755 760 765
Tyr Ile Gln Arg Val Val Ser Glu Ala Lys Glu Lys Gly Tyr Val Arg
770 775 780
Thr Leu Phe Gly Arg Lys Arg Asp Ile Pro Gln Leu Met Ala Arg Asp
785 790 795 800
Arg Asn Thr Gln Ala Glu Gly Glu Arg Ile Ala Ile Asn Thr Pro Ile
805 810 815
Gln Gly Thr Ala Ala Asp Ile Ile Lys Leu Ala Met Ile Glu Ile Asp
820 825 830
Arg Glu Leu Lys Glu Arg Lys Met Arg Ser Lys Met Ile Ile Gln Val
835 840 845
His Asp Glu Leu Val Phe Glu Val Pro Asn Glu Glu Lys Asp Ala Leu
850 855 860
Val Glu Leu Val Lys Asp Arg Met Thr Asn Val Val Lys Leu Ser Val
865 870 875 880
Pro Leu Glu Val Asp Val Thr Ile Gly Lys Thr Trp Ser
885 890
<210> 28
<211> 893
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源于栖热菌种Z05的N末端5'核酸酶结构域和海栖热袍菌DNA聚合酶的C末端3'-5'
外切核酸酶和聚合酶结构域的合成的嵌合CS6 DNA聚合酶
<400> 28
Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe
50 55 60
Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu
65 70 75 80
Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln
85 90 95
Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu
100 105 110
Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys
115 120 125
Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg
130 135 140
Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu
145 150 155 160
Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys
165 170 175
Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp
180 185 190
Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu
195 200 205
Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg
210 215 220
Val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu Asp
225 230 235 240
Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu
245 250 255
Glu Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg
260 265 270
Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly
275 280 285
Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro Val Gly Tyr Arg Ile Val Lys Asp Leu
290 295 300
Val Glu Phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe
305 310 315 320
Ala Ile Ala Leu Ala Thr Ser Ser Leu Asp Pro Phe Asp Cys Asp Ile
325 330 335
Val Gly Ile Ser Val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro
340 345 350
Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu Val Leu Lys
355 360 365
Lys Leu Lys Glu Ile Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys Ile Val Gly Gln
370 375 380
Asn Leu Lys Phe Asp Tyr Lys Val Leu Met Val Lys Gly Val Glu Pro
385 390 395 400
Val Pro Pro Tyr Phe Asp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro
405 410 415
Asn Glu Lys Lys Phe Asn Leu Asp Asp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly
420 425 430
Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu
435 440 445
Phe Gly Phe Ser Phe Ala Asp Val Pro Val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr
450 455 460
Ser Cys Glu Asp Ala Asp Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser
465 470 475 480
Leu Lys Leu His Glu Ala Asp Leu Glu Asn Val Phe Tyr Lys Ile Glu
485 490 495
Met Pro Leu Val Asn Val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly Val Tyr
500 505 510
Val Asp Thr Glu Phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys
515 520 525
Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Tyr Arg Ile Ala Gly Glu Pro Phe
530 535 540
Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Val Ser Arg Ile Leu Phe Glu Lys Leu
545 550 555 560
Gly Ile Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly Asp Tyr Ser Thr
565 570 575
Arg Ile Glu Val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu Ile Ile Pro
580 585 590
Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile
595 600 605
Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg Ile His Ala
610 615 620
Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp
625 630 635 640
Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu Ile
645 650 655
Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile Val Ser Ala
660 665 670
Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile Leu Ala His Leu Ser Gly Asp
675 680 685
Glu Asn Leu Leu Arg Ala Phe Glu Glu Gly Ile Asp Val His Thr Leu
690 695 700
Thr Ala Ser Arg Ile Phe Asn Val Lys Pro Glu Glu Val Thr Glu Glu
705 710 715 720
Met Arg Arg Ala Gly Lys Met Val Asn Phe Ser Ile Ile Tyr Gly Val
725 730 735
Thr Pro Tyr Gly Leu Ser Val Arg Leu Gly Val Pro Val Lys Glu Ala
740 745 750
Glu Lys Met Ile Val Asn Tyr Phe Val Leu Tyr Pro Lys Val Arg Asp
755 760 765
Tyr Ile Gln Arg Val Val Ser Glu Ala Lys Glu Lys Gly Tyr Val Arg
770 775 780
Thr Leu Phe Gly Arg Lys Arg Asp Ile Pro Gln Leu Met Ala Arg Asp
785 790 795 800
Arg Asn Thr Gln Ala Glu Gly Glu Arg Ile Ala Ile Asn Thr Pro Ile
805 810 815
Gln Gly Thr Ala Ala Asp Ile Ile Lys Leu Ala Met Ile Glu Ile Asp
820 825 830
Arg Glu Leu Lys Glu Arg Lys Met Arg Ser Lys Met Ile Ile Gln Val
835 840 845
His Asp Glu Leu Val Phe Glu Val Pro Asn Glu Glu Lys Asp Ala Leu
850 855 860
Val Glu Leu Val Lys Asp Arg Met Thr Asn Val Val Lys Leu Ser Val
865 870 875 880
Pro Leu Glu Val Asp Val Thr Ile Gly Lys Thr Trp Ser
885 890
<210> 29
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的DNA聚合酶基序
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(1)
<223> Xaa = Ala, Asp, Ser, Glu, Arg或Gln
<220>
<221> 变体
<222> (2)...(2)
<223> Xaa = Trp或Tyr
<220>
<221> 变体
<222> (3)...(3)
<223> Xaa = 除Ile, Leu或Met以外的任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (4)...(4)
<223> Xaa = Glu, Ala, Gln, Lys, Asn或Asp
<220>
<221> 变体
<222> (5)...(5)
<223> Xaa = Lys, Gly, Arg, Gln, His或Asn
<220>
<221> 变体
<222> (6)...(6)
<223> Xaa = Thr, Val, Met或Ile
<220>
<221> 变体
<222> (7)...(7)
<223> Xaa = Leu, Val或Lys
<220>
<221> 变体
<222> (8)...(8)
<223> Xaa = Glu, Ser, Ala, Asp或Gln
<220>
<221> 变体
<222> (9)...(9)
<223> Xaa = Glu或Phe
<220>
<221> 变体
<222> (10)...(10)
<223> Xaa = Gly或Ala
<220>
<221> 变体
<222> (11)...(11)
<223> Xaa = Arg或Lys
<220>
<221> 变体
<222> (12)...(12)
<223> Xaa = Lys, Arg, Glu, Thr或Gln
<220>
<221> 变体
<222> (13)...(13)
<223> Xaa = Arg, Lys或His
<220>
<221> 变体
<222> (17)...(17)
<223> Xaa = Glu, Arg或Thr
<400> 29
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Tyr Val
1 5 10 15
Xaa Thr Leu
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的易错（诱变）PCR扩增正向引物
<400> 30
ctacctcctg gacccctcca a 21
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的易错（诱变）PCR扩增反向引物
<400> 31
ataaccaact ggtagtggcg tgtaa 25
<210> 32
<211> 921
<212> PRT
<213> 耐放射异常球菌
<220>
<223> 耐放射异常球菌DNA聚合酶(Dra)
<400> 32
Met Ala Asp Ala Ser Pro Asp Pro Ser Lys Pro Asp Ala Leu Val Leu
1 5 10 15
Ile Asp Gly His Ala Leu Ala Phe Arg Ser Tyr Phe Ala Leu Pro Pro
20 25 30
Leu Asn Asn Ser Lys Gly Glu Met Thr Asp Ala Ile Val Gly Phe Met
35 40 45
Lys Leu Leu Leu Arg Leu Ala Arg Gln Lys Ser Asn Gln Val Ile Val
50 55 60
Val Phe Asp Pro Pro Val Lys Thr Leu Arg His Glu Gln Tyr Glu Gly
65 70 75 80
Tyr Lys Ser Gly Arg Ala Gln Thr Pro Glu Asp Leu Arg Gly Gln Ile
85 90 95
Asn Arg Ile Arg Ala Leu Val Asp Ala Leu Gly Phe Pro Arg Leu Glu
100 105 110
Glu Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Ile Ala Ser Leu Thr Arg Met
115 120 125
Ala Glu Gly Lys Gly Tyr Glu Val Arg Ile Val Thr Ser Asp Arg Asp
130 135 140
Ala Tyr Gln Leu Leu Asp Glu His Val Lys Val Ile Ala Asn Asp Phe
145 150 155 160
Ser Leu Ile Gly Pro Ala Gln Val Glu Glu Lys Tyr Gly Val Thr Val
165 170 175
Arg Gln Trp Val Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Ala Ser Asp Asn
180 185 190
Ile Pro Gly Ala Lys Gly Ile Gly Pro Lys Thr Ala Ala Lys Leu Leu
195 200 205
Gln Glu Tyr Gly Thr Leu Glu Lys Val Tyr Glu Ala Ala His Ala Gly
210 215 220
Thr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Arg Lys Lys Leu Leu Asp Ser Glu Glu
225 230 235 240
Asn Val Lys Phe Ser His Asp Leu Ser Cys Met Val Thr Asp Leu Pro
245 250 255
Leu Asp Ile Glu Phe Gly Val Arg Arg Leu Pro Asp Asn Pro Leu Val
260 265 270
Thr Glu Asp Leu Leu Thr Glu Leu Glu Leu His Ser Leu Arg Pro Met
275 280 285
Ile Leu Gly Leu Asn Gly Pro Glu Gln Asp Gly His Ala Pro Asp Asp
290 295 300
Leu Leu Glu Arg Glu His Ala Gln Thr Pro Glu Glu Asp Glu Ala Ala
305 310 315 320
Ala Leu Pro Ala Phe Ser Ala Pro Glu Leu Ala Glu Trp Gln Thr Pro
325 330 335
Ala Glu Gly Ala Val Trp Gly Tyr Val Leu Ser Arg Glu Asp Asp Leu
340 345 350
Thr Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ala Thr Phe Glu Asp Gly Val Ala Arg
355 360 365
Pro Ala Arg Val Ser Glu Pro Asp Glu Trp Ala Gln Ala Glu Ala Pro
370 375 380
Glu Asn Leu Phe Gly Glu Leu Leu Pro Ser Asp Lys Pro Leu Thr Lys
385 390 395 400
Lys Glu Gln Lys Ala Leu Glu Lys Ala Gln Lys Asp Ala Glu Lys Ala
405 410 415
Arg Ala Lys Leu Arg Glu Gln Phe Pro Ala Thr Val Asp Glu Ala Glu
420 425 430
Phe Val Gly Gln Arg Thr Val Thr Ala Ala Ala Ala Lys Ala Leu Ala
435 440 445
Ala His Leu Ser Val Arg Gly Thr Val Val Glu Pro Gly Asp Asp Pro
450 455 460
Leu Leu Tyr Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ala Asn Thr Asn Met Pro Val
465 470 475 480
Val Ala Lys Arg Tyr Leu Asp Arg Glu Trp Pro Ala Asp Ala Pro Thr
485 490 495
Arg Ala Ala Ile Thr Gly His Leu Val Arg Glu Leu Pro Pro Leu Leu
500 505 510
Asp Asp Ala Arg Arg Lys Met Tyr Asp Glu Met Glu Lys Pro Leu Ser
515 520 525
Gly Val Leu Gly Arg Met Glu Val Arg Gly Val Gln Val Asp Ser Asp
530 535 540
Phe Leu Gln Thr Leu Ser Ile Gln Ala Gly Val Arg Leu Ala Asp Leu
545 550 555 560
Glu Ser Gln Ile His Glu Tyr Ala Gly Glu Glu Phe His Ile Arg Ser
565 570 575
Pro Lys Gln Leu Glu Thr Val Leu Tyr Asp Lys Leu Glu Leu Ala Ser
580 585 590
Ser Lys Lys Thr Lys Leu Thr Gly Gln Arg Ser Thr Ala Val Ser Ala
595 600 605
Leu Glu Pro Leu Arg Asp Ala His Pro Ile Ile Pro Leu Val Leu Glu
610 615 620
Phe Arg Glu Leu Asp Lys Leu Arg Gly Thr Tyr Leu Asp Pro Ile Pro
625 630 635 640
Asn Leu Val Asn Pro His Thr Gly Arg Leu His Thr Thr Phe Ala Gln
645 650 655
Thr Ala Val Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Leu Asn Pro Asn Leu Gln
660 665 670
Asn Ile Pro Ile Arg Ser Glu Leu Gly Arg Glu Ile Arg Lys Gly Phe
675 680 685
Ile Ala Glu Asp Gly Phe Thr Leu Ile Ala Ala Asp Tyr Ser Gln Ile
690 695 700
Glu Leu Arg Leu Leu Ala His Ile Ala Asp Asp Pro Leu Met Gln Gln
705 710 715 720
Ala Phe Val Glu Gly Ala Asp Ile His Arg Arg Thr Ala Ala Gln Val
725 730 735
Leu Gly Leu Asp Glu Ala Thr Val Asp Ala Asn Gln Arg Arg Ala Ala
740 745 750
Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu
755 760 765
Ser Asn Asp Leu Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Ala Ala Thr Phe Ile Glu
770 775 780
Ile Tyr Phe Ala Thr Tyr Pro Gly Ile Arg Arg Tyr Ile Asn His Thr
785 790 795 800
Leu Asp Phe Gly Arg Thr His Gly Tyr Val Glu Thr Leu Tyr Gly Arg
805 810 815
Arg Arg Tyr Val Pro Gly Leu Ser Ser Arg Asn Arg Val Gln Arg Glu
820 825 830
Ala Glu Glu Arg Leu Ala Tyr Asn Met Pro Ile Gln Gly Thr Ala Ala
835 840 845
Asp Ile Met Lys Leu Ala Met Val Gln Leu Asp Pro Gln Leu Asp Ala
850 855 860
Ile Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Leu Ile Glu
865 870 875 880
Ala Pro Leu Asp Lys Ala Glu Gln Val Ala Ala Leu Thr Lys Lys Val
885 890 895
Met Glu Asn Val Val Gln Leu Lys Val Pro Leu Ala Val Glu Val Gly
900 905 910
Thr Gly Pro Asn Trp Phe Asp Thr Lys
915 920
<210> 33
<211> 892
<212> PRT
<213> 非洲栖热腔菌
<220>
<223> 非洲栖热腔菌DNA聚合酶(Taf)
<400> 33
Met Gly Lys Met Phe Leu Phe Asp Gly Thr Gly Leu Val Tyr Arg Ala
1 5 10 15
Phe Tyr Ala Ile Asp Gln Ser Leu Gln Thr Ser Ser Gly Leu His Thr
20 25 30
Asn Ala Val Tyr Gly Leu Thr Lys Met Leu Ile Lys Phe Leu Lys Glu
35 40 45
His Ile Ser Ile Gly Lys Asp Ala Cys Val Phe Val Leu Asp Ser Lys
50 55 60
Gly Gly Ser Lys Lys Arg Lys Asp Ile Leu Glu Thr Tyr Lys Ala Asn
65 70 75 80
Arg Pro Ser Thr Pro Asp Leu Leu Leu Glu Gln Ile Pro Tyr Val Glu
85 90 95
Glu Leu Val Asp Ala Leu Gly Ile Lys Val Leu Lys Ile Glu Gly Phe
100 105 110
Glu Ala Asp Asp Ile Ile Ala Thr Leu Ser Lys Lys Phe Glu Ser Asp
115 120 125
Phe Glu Lys Val Asn Ile Ile Thr Gly Asp Lys Asp Leu Leu Gln Leu
130 135 140
Val Ser Asp Lys Val Phe Val Trp Arg Val Glu Arg Gly Ile Thr Asp
145 150 155 160
Leu Val Leu Tyr Asp Arg Asn Lys Val Ile Glu Lys Tyr Gly Ile Tyr
165 170 175
Pro Glu Gln Phe Lys Asp Tyr Leu Ser Leu Val Gly Asp Gln Ile Asp
180 185 190
Asn Ile Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Lys Lys Thr Ala Val Ser Leu
195 200 205
Leu Lys Lys Tyr Asn Ser Leu Glu Asn Val Leu Lys Asn Ile Asn Leu
210 215 220
Leu Thr Glu Lys Leu Arg Arg Leu Leu Glu Asp Ser Lys Glu Asp Leu
225 230 235 240
Gln Lys Ser Ile Glu Leu Val Glu Leu Ile Tyr Asp Val Pro Met Asp
245 250 255
Val Glu Lys Asp Glu Ile Ile Tyr Arg Gly Tyr Asn Pro Asp Lys Leu
260 265 270
Leu Lys Val Leu Lys Lys Tyr Glu Phe Ser Ser Ile Ile Lys Glu Leu
275 280 285
Asn Leu Gln Glu Lys Leu Glu Lys Glu Tyr Ile Leu Val Asp Asn Glu
290 295 300
Asp Lys Leu Lys Lys Leu Ala Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Lys Thr Phe
305 310 315 320
Ser Ile Asp Thr Glu Thr Thr Ser Leu Asp Pro Phe Glu Ala Lys Leu
325 330 335
Val Gly Ile Ser Ile Ser Thr Met Glu Gly Lys Ala Tyr Tyr Ile Pro
340 345 350
Val Ser His Phe Gly Ala Lys Asn Ile Ser Lys Ser Leu Ile Asp Lys
355 360 365
Phe Leu Lys Gln Ile Leu Gln Glu Lys Asp Tyr Asn Ile Val Gly Gln
370 375 380
Asn Leu Lys Phe Asp Tyr Glu Ile Phe Lys Ser Met Gly Phe Ser Pro
385 390 395 400
Asn Val Pro His Phe Asp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Asn Pro
405 410 415
Asp Glu Lys Arg Phe Asn Leu Glu Glu Leu Ser Leu Lys Tyr Leu Gly
420 425 430
Tyr Lys Met Ile Ser Phe Asp Glu Leu Val Asn Glu Asn Val Pro Leu
435 440 445
Phe Gly Asn Asp Phe Ser Tyr Val Pro Leu Glu Arg Ala Val Glu Tyr
450 455 460
Ser Cys Glu Asp Ala Asp Val Thr Tyr Arg Ile Phe Arg Lys Leu Gly
465 470 475 480
Arg Lys Ile Tyr Glu Asn Glu Met Glu Lys Leu Phe Tyr Glu Ile Glu
485 490 495
Met Pro Leu Ile Asp Val Leu Ser Glu Met Glu Leu Asn Gly Val Tyr
500 505 510
Phe Asp Glu Glu Tyr Leu Lys Glu Leu Ser Lys Lys Tyr Gln Glu Lys
515 520 525
Met Asp Gly Ile Lys Glu Lys Val Phe Glu Ile Ala Gly Glu Thr Phe
530 535 540
Asn Leu Asn Ser Ser Thr Gln Val Ala Tyr Ile Leu Phe Glu Lys Leu
545 550 555 560
Asn Ile Ala Pro Tyr Lys Lys Thr Ala Thr Gly Lys Phe Ser Thr Asn
565 570 575
Ala Glu Val Leu Glu Glu Leu Ser Lys Glu His Glu Ile Ala Lys Leu
580 585 590
Leu Leu Glu Tyr Arg Lys Tyr Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp
595 600 605
Ser Ile Pro Leu Ser Ile Asn Arg Lys Thr Asn Arg Val His Thr Thr
610 615 620
Phe His Gln Thr Gly Thr Ser Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asn Pro
625 630 635 640
Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Arg Ser Glu Glu Gly Lys Glu Ile Arg
645 650 655
Lys Ala Val Arg Pro Gln Arg Gln Asp Trp Trp Ile Leu Gly Ala Asp
660 665 670
Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Val Ser Lys Asp Glu
675 680 685
Asn Leu Leu Lys Ala Phe Lys Glu Asp Leu Asp Ile His Thr Ile Thr
690 695 700
Ala Ala Lys Ile Phe Gly Val Ser Glu Met Phe Val Ser Glu Gln Met
705 710 715 720
Arg Arg Val Gly Lys Met Val Asn Phe Ala Ile Ile Tyr Gly Val Ser
725 730 735
Pro Tyr Gly Leu Ser Lys Arg Ile Gly Leu Ser Val Ser Glu Thr Lys
740 745 750
Lys Ile Ile Asp Asn Tyr Phe Arg Tyr Tyr Lys Gly Val Phe Glu Tyr
755 760 765
Leu Lys Arg Met Lys Asp Glu Ala Arg Lys Lys Gly Tyr Val Thr Thr
770 775 780
Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Ile Pro Gln Leu Arg Ser Lys Asn Gly
785 790 795 800
Asn Arg Val Gln Glu Gly Glu Arg Ile Ala Val Asn Thr Pro Ile Gln
805 810 815
Gly Thr Ala Ala Asp Ile Ile Lys Ile Ala Met Ile Asn Ile His Asn
820 825 830
Arg Leu Lys Lys Glu Asn Leu Arg Ser Lys Met Ile Leu Gln Val His
835 840 845
Asp Glu Leu Val Phe Glu Val Pro Asp Asn Glu Leu Glu Ile Val Lys
850 855 860
Asp Leu Val Arg Asp Glu Met Glu Asn Ala Val Lys Leu Asp Val Pro
865 870 875 880
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885 890
<210> 34
<211> 893
<212> PRT
<213> 海栖热袍菌
<220>
<223> 海栖热袍菌DNA聚合酶(Tma)
<400> 34
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1 5 10 15
Tyr Tyr Ala Leu Asp Arg Ser Leu Ser Thr Ser Thr Gly Ile Pro Thr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
Asn Glu Lys Ile Lys Val Trp Arg Ile Val Lys Gly Ile Ser Asp Leu
145 150 155 160
Glu Leu Tyr Asp Ala Gln Lys Val Lys Glu Lys Tyr Gly Val Glu Pro
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Pro Gln Lys Val Arg Lys Ala Leu Leu Arg Asp Arg Glu Asn Ala Ile
225 230 235 240
Leu Ser Lys Lys Leu Ala Ile Leu Glu Thr Asn Val Pro Ile Glu Ile
245 250 255
Asn Trp Glu Glu Leu Arg Tyr Gln Gly Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Leu
260 265 270
Pro Leu Leu Lys Glu Leu Glu Phe Ala Ser Ile Met Lys Glu Leu Gln
275 280 285
Leu Tyr Glu Glu Ser Glu Pro Val Gly Tyr Arg Ile Val Lys Asp Leu
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Val Gly Ile Ser Val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro
340 345 350
Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu Val Leu Lys
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
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690 695 700
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705 710 715 720
Met Arg Arg Ala Gly Lys Met Val Asn Phe Ser Ile Ile Tyr Gly Val
725 730 735
Thr Pro Tyr Gly Leu Ser Val Arg Leu Gly Val Pro Val Lys Glu Ala
740 745 750
Glu Lys Met Ile Val Asn Tyr Phe Val Leu Tyr Pro Lys Val Arg Asp
755 760 765
Tyr Ile Gln Arg Val Val Ser Glu Ala Lys Glu Lys Gly Tyr Val Arg
770 775 780
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Val Glu Leu Val Lys Asp Arg Met Thr Asn Val Val Lys Leu Ser Val
865 870 875 880
Pro Leu Glu Val Asp Val Thr Ile Gly Lys Thr Trp Ser
885 890
<210> 35
<211> 893
<212> PRT
<213> 那不勒斯栖热袍菌
<220>
<223> 那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶(Tne)
<400> 35
Met Ala Arg Leu Phe Leu Phe Asp Gly Thr Ala Leu Ala Tyr Arg Ala
1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
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Met Arg Phe Ser Leu Ile Thr Gly Asp Lys Asp Met Leu Gln Leu Val
130 135 140
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210 215 220
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Leu Ser Lys Lys Leu Ala Thr Leu Val Thr Asn Ala Pro Val Glu Val
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275 280 285
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355 360 365
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370 375 380
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Met Lys Leu His Glu Ala Glu Leu Glu Asn Val Phe Tyr Arg Ile Glu
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
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675 680 685
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690 695 700
Thr Ala Ser Arg Ile Tyr Asn Val Lys Pro Glu Glu Val Asn Glu Glu
705 710 715 720
Met Arg Arg Val Gly Lys Met Val Asn Phe Ser Ile Ile Tyr Gly Val
725 730 735
Thr Pro Tyr Gly Leu Ser Val Arg Leu Gly Ile Pro Val Lys Glu Ala
740 745 750
Glu Lys Met Ile Ile Ser Tyr Phe Thr Leu Tyr Pro Lys Val Arg Ser
755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
Lys Asn Thr Gln Ser Glu Gly Glu Arg Ile Ala Ile Asn Thr Pro Ile
805 810 815
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820 825 830
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835 840 845
His Asp Glu Leu Val Phe Glu Val Pro Asp Glu Glu Lys Glu Glu Leu
850 855 860
Val Asp Leu Val Lys Asn Lys Met Thr Asn Val Val Lys Leu Ser Val
865 870 875 880
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885 890
<210> 36
<211> 876
<212> PRT
<213> 嗜热脂肪芽孢杆菌
<220>
<223> 嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶(Bst)
<400> 36
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1 5 10 15
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50 55 60
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Val Pro Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Val Lys Leu Leu Lys Gln Phe
195 200 205
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210 215 220
Lys Leu Lys Glu Asn Leu Arg Gln Tyr Arg Asp Leu Ala Leu Leu Ser
225 230 235 240
Lys Gln Leu Ala Ala Ile Cys Arg Asp Ala Pro Val Glu Leu Thr Leu
245 250 255
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260 265 270
Phe Gln Glu Leu Gly Phe Gln Ser Phe Leu Asp Lys Met Ala Val Gln
275 280 285
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290 295 300
Asp Ser Val Thr Asp Glu Met Leu Ala Asp Lys Ala Ala Leu Val Val
305 310 315 320
Glu Val Val Gly Asp Asn Tyr His His Ala Pro Ile Val Gly Ile Ala
325 330 335
Leu Ala Asn Glu Arg Gly Arg Phe Phe Leu Arg Pro Glu Thr Ala Leu
340 345 350
Ala Asp Pro Lys Phe Leu Ala Trp Leu Gly Asp Glu Thr Lys Lys Lys
355 360 365
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Leu Asp Pro Ala Gln Ala Ala Gly Asp Val Ala Ala Val Ala Lys Met
405 410 415
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420 425 430
Ala Lys Arg Thr Val Pro Asp Glu Pro Thr Leu Ala Glu His Leu Ala
435 440 445
Arg Lys Ala Ala Ala Ile Trp Ala Leu Glu Glu Pro Leu Met Asp Glu
450 455 460
Leu Arg Arg Asn Glu Gln Asp Arg Leu Leu Thr Glu Leu Glu Gln Pro
465 470 475 480
Leu Ala Gly Ile Leu Ala Asn Met Glu Phe Thr Gly Val Lys Val Asp
485 490 495
Thr Lys Arg Leu Glu Gln Met Gly Ala Glu Leu Thr Glu Gln Leu Gln
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Ala Val Glu Arg Arg Ile Tyr Glu Leu Ala Gly Gln Glu Phe Asn Ile
515 520 525
Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Thr Val Leu Phe Asp Lys Leu Gln Leu
530 535 540
Pro Val Leu Lys Lys Thr Lys Thr Gly Tyr Ser Thr Ser Ala Asp Val
545 550 555 560
Leu Glu Lys Leu Ala Pro His His Glu Ile Val Glu His Ile Leu His
565 570 575
Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Gln Ser Thr Tyr Ile Glu Gly Leu Leu
580 585 590
Lys Val Val His Pro Val Thr Gly Lys Val His Thr Met Phe Asn Gln
595 600 605
Ala Leu Thr Gln Thr Gly Arg Leu Ser Ser Val Glu Pro Asn Leu Gln
610 615 620
Asn Ile Pro Ile Arg Leu Glu Glu Gly Arg Lys Ile Arg Gln Ala Phe
625 630 635 640
Val Pro Ser Glu Pro Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala Asp Tyr Ser Gln
645 650 655
Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Ile Ala Glu Asp Asp Asn Leu Ile
660 665 670
Glu Ala Phe Arg Arg Gly Leu Asp Ile His Thr Lys Thr Ala Met Asp
675 680 685
Ile Phe His Val Ser Glu Glu Asp Val Thr Ala Asn Met Arg Arg Gln
690 695 700
Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr Gly
705 710 715 720
Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Thr Arg Lys Glu Ala Ala Glu Phe Ile
725 730 735
Glu Arg Tyr Phe Ala Ser Phe Pro Gly Val Lys Gln Tyr Met Asp Asn
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Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile Thr Ser Arg Asn Phe Asn Val Arg
770 775 780
Ser Phe Ala Glu Arg Thr Ala Met Asn Thr Pro Ile Gln Gly Ser Ala
785 790 795 800
Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile Asp Leu Ser Val Arg Leu Arg
805 810 815
Glu Glu Arg Leu Gln Ala Arg Leu Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu
820 825 830
Ile Leu Glu Ala Pro Lys Glu Glu Ile Glu Arg Leu Cys Arg Leu Val
835 840 845
Pro Glu Val Met Glu Gln Ala Val Ala Leu Arg Val Pro Leu Lys Val
850 855 860
Asp Tyr His Tyr Gly Pro Thr Trp Tyr Asp Ala Lys
865 870 875
<210> 37
<211> 877
<212> PRT
<213> 热坚芽孢杆菌
<220>
<223> 热坚芽孢杆菌DNA聚合酶(Bca)
<400> 37
Met Lys Lys Lys Leu Val Leu Ile Asp Gly Ser Ser Val Ala Tyr Arg
1 5 10 15
Ala Phe Phe Ala Leu Pro Leu Leu His Asn Asp Lys Gly Ile His Thr
20 25 30
Asn Ala Val Tyr Gly Phe Thr Met Met Leu Asn Lys Ile Leu Ala Glu
35 40 45
Glu Glu Pro Thr His Met Leu Val Ala Phe Asp Ala Gly Lys Thr Thr
50 55 60
Phe Arg His Glu Ala Phe Gln Glu Tyr Lys Gly Gly Arg Gln Gln Thr
65 70 75 80
Pro Pro Glu Leu Ser Glu Gln Phe Pro Leu Leu Arg Glu Leu Leu Arg
85 90 95
Ala Tyr Arg Ile Pro Ala Tyr Glu Leu Glu Asn Tyr Glu Ala Asp Asp
100 105 110
Ile Ile Gly Thr Leu Ala Ala Arg Ala Glu Gln Glu Gly Phe Glu Val
115 120 125
Lys Val Ile Ser Gly Asp Arg Asp Leu Thr Gln Leu Ala Ser Pro His
130 135 140
Val Thr Val Asp Ile Thr Lys Lys Gly Ile Thr Asp Ile Glu Pro Tyr
145 150 155 160
Thr Pro Glu Ala Val Arg Glu Lys Tyr Gly Leu Thr Pro Glu Gln Ile
165 170 175
Val Asp Leu Lys Gly Leu Met Gly Asp Lys Ser Asp Asn Ile Pro Gly
180 185 190
Val Pro Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Val Lys Leu Leu Arg Gln Phe
195 200 205
Gly Thr Val Glu Asn Val Leu Ala Ser Ile Asp Glu Ile Lys Gly Glu
210 215 220
Lys Leu Lys Glu Thr Leu Arg Gln His Arg Glu Met Ala Leu Leu Ser
225 230 235 240
Lys Lys Leu Ala Ala Ile Arg Arg Asp Ala Pro Val Glu Leu Ser Leu
245 250 255
Asp Asp Ile Ala Tyr Gln Gly Glu Asp Arg Glu Lys Val Val Ala Leu
260 265 270
Phe Lys Glu Leu Gly Phe Gln Ser Phe Leu Glu Lys Met Glu Ser Pro
275 280 285
Ser Ser Glu Glu Glu Lys Pro Leu Ala Lys Met Ala Phe Thr Leu Ala
290 295 300
Asp Arg Val Thr Glu Glu Met Leu Ala Asp Lys Ala Ala Leu Val Val
305 310 315 320
Glu Val Val Glu Glu Asn Tyr His Asp Ala Pro Ile Val Gly Ile Ala
325 330 335
Val Val Asn Glu His Gly Arg Phe Phe Leu Arg Pro Glu Thr Ala Leu
340 345 350
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405 410 415
Lys Gln Tyr Glu Ala Val Arg Pro Asp Glu Ala Val Tyr Gly Lys Gly
420 425 430
Ala Lys Arg Ala Val Pro Asp Glu Pro Val Leu Ala Glu His Leu Val
435 440 445
Arg Lys Ala Ala Ala Ile Trp Ala Leu Glu Arg Pro Phe Leu Asp Glu
450 455 460
Leu Arg Arg Asn Glu Gln Asp Arg Leu Leu Val Glu Leu Glu Gln Pro
465 470 475 480
Leu Ser Ser Ile Leu Ala Glu Met Glu Phe Ala Gly Val Lys Val Asp
485 490 495
Thr Lys Arg Leu Glu Gln Met Gly Glu Glu Leu Ala Glu Gln Leu Arg
500 505 510
Thr Val Glu Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Ala Gly Gln Glu Phe Asn Ile
515 520 525
Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val Ile Leu Phe Glu Lys Leu Gln Leu
530 535 540
Pro Val Leu Lys Lys Ser Lys Thr Gly Tyr Ser Thr Ser Ala Asp Val
545 550 555 560
Leu Glu Lys Leu Ala Pro Tyr His Glu Ile Val Glu Asn Ile Leu Gln
565 570 575
His Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Gln Ser Thr Tyr Ile Glu Gly Leu
580 585 590
Leu Lys Val Val Arg Pro Asp Thr Lys Lys Val His Thr Ile Phe Asn
595 600 605
Gln Ala Leu Thr Gln Thr Gly Arg Leu Ser Ser Thr Glu Pro Asn Leu
610 615 620
Gln Asn Ile Pro Ile Arg Leu Glu Glu Gly Arg Lys Ile Arg Gln Ala
625 630 635 640
Phe Val Pro Ser Glu Ser Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala Asp Tyr Ser
645 650 655
Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Ile Ala Glu Asp Asp Asn Leu
660 665 670
Met Glu Ala Phe Arg Arg Asp Leu Asp Ile His Thr Lys Thr Ala Met
675 680 685
Asp Ile Phe Gln Val Ser Glu Asp Glu Val Thr Pro Asn Met Arg Arg
690 695 700
Gln Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr
705 710 715 720
Gly Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys Glu Ala Ala Glu Phe
725 730 735
Ile Glu Arg Tyr Phe Glu Ser Phe Pro Gly Val Lys Arg Tyr Met Glu
740 745 750
Asn Ile Val Gln Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr Val Thr Thr Leu Leu
755 760 765
His Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile Thr Ser Arg Asn Phe Asn Val
770 775 780
Arg Ser Phe Ala Glu Arg Met Ala Met Asn Thr Pro Ile Gln Gly Ser
785 790 795 800
Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile Asp Leu Asn Ala Arg Leu
805 810 815
Lys Glu Glu Arg Leu Gln Ala Arg Leu Leu Leu Gln Val His Asp Glu
820 825 830
Leu Ile Leu Glu Ala Pro Lys Glu Glu Met Glu Arg Leu Cys Arg Leu
835 840 845
Val Pro Glu Val Met Glu Gln Ala Val Thr Leu Arg Val Pro Leu Lys
850 855 860
Val Asp Tyr His Tyr Gly Ser Thr Trp Tyr Asp Ala Lys
865 870 875
<210> 38
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 对应于Z05的D580X突变的合成的聚合酶基序
<220>
<221> 变体
<222> (7)...(7)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> 变体
<222> (8)...(8)
<223> Xaa = 除Asp或Glu以外的任何氨基酸
<400> 38
Thr Gly Arg Leu Ser Ser Xaa Xaa Pro Asn Leu Gln Asn
1 5 10
<210> 39
<211> 831
<212> PRT
<213> 生氢氧化碳嗜热菌
<220>
<223> 生氢氧化碳嗜热菌DNA聚合酶(Chy)
<400> 39
Met Gly Lys Val Val Leu Val Asp Gly Asn Ser Leu Leu His Arg Ala
1 5 10 15
Phe Phe Ala Leu Pro Pro Leu Lys Thr Thr Lys Gly Glu Pro Thr Gly
20 25 30
Ala Val Tyr Glu Phe Leu Thr Met Leu Phe Arg Val Ile Lys Asp Glu
35 40 45
Lys Pro Glu Tyr Leu Ala Val Ala Phe Asp Ile Ser Arg Lys Thr Phe
50 55 60
Arg Thr Glu Gln Phe Thr Ala Tyr Lys Gly His Arg Lys Glu Ala Pro
65 70 75 80
Asp Glu Leu Val Pro Gln Phe Ala Leu Val Arg Glu Val Leu Lys Val
85 90 95
Leu Asn Val Pro Tyr Ile Glu Leu Asp Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Ile
100 105 110
Ile Gly His Leu Ser Arg Ala Phe Ala Gly Gln Gly His Glu Val Val
115 120 125
Ile Tyr Thr Ala Asp Arg Asp Met Leu Gln Leu Val Asp Glu Lys Thr
130 135 140
Val Val Tyr Leu Thr Lys Lys Gly Ile Thr Glu Leu Val Lys Met Asp
145 150 155 160
Leu Ala Ala Ile Leu Glu Asn Tyr Gly Leu Lys Pro Lys Gln Leu Val
165 170 175
Asp Val Lys Gly Leu Met Gly Asp Pro Ser Asp Asn Ile Pro Gly Val
180 185 190
Pro Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Asp Leu Ile Lys Thr Tyr Gly
195 200 205
Ser Val Glu Glu Val Leu Ala Arg Lys Asp Glu Leu Lys Pro Lys Leu
210 215 220
Arg Glu Lys Leu Ala Glu His Glu Asn Leu Ala Lys Ile Ser Lys Gln
225 230 235 240
Leu Ala Thr Ile Leu Arg Glu Ile Pro Leu Glu Ile Ser Leu Glu Asp
245 250 255
Leu Lys Val Lys Glu Pro Asn Tyr Glu Glu Val Ala Lys Leu Phe Leu
260 265 270
His Leu Glu Phe Lys Ser Phe Leu Lys Glu Ile Glu Pro Lys Ile Lys
275 280 285
Lys Glu Tyr Gln Glu Gly Lys Asp Leu Val Gln Val Glu Thr Val Glu
290 295 300
Thr Glu Gly Gln Ile Ala Val Val Phe Ser Asp Gly Phe Tyr Val Asp
305 310 315 320
Asp Gly Glu Lys Thr Lys Phe Tyr Ser Leu Asp Arg Leu Asn Glu Ile
325 330 335
Glu Glu Ile Phe Arg Asn Lys Lys Ile Ile Thr Asp Asp Ala Lys Gly
340 345 350
Ile Tyr His Val Cys Leu Glu Lys Gly Leu Thr Phe Pro Glu Val Cys
355 360 365
Phe Asp Ala Arg Ile Ala Ala Tyr Val Leu Asn Pro Ala Asp Gln Asn
370 375 380
Pro Gly Leu Lys Gly Leu Tyr Leu Lys Tyr Asp Leu Pro Val Tyr Glu
385 390 395 400
Asp Val Ser Leu Asn Ile Arg Gly Leu Phe Tyr Leu Lys Lys Glu Met
405 410 415
Met Arg Lys Ile Phe Glu Gln Glu Gln Glu Arg Leu Phe Tyr Glu Ile
420 425 430
Glu Leu Pro Leu Thr Pro Val Leu Ala Gln Met Glu His Thr Gly Ile
435 440 445
Gln Val Asp Arg Glu Ala Leu Lys Glu Met Ser Leu Glu Leu Gly Glu
450 455 460
Gln Ile Glu Glu Leu Ile Arg Glu Ile Tyr Val Leu Ala Gly Glu Glu
465 470 475 480
Phe Asn Leu Asn Ser Pro Arg Gln Leu Gly Val Ile Leu Phe Glu Lys
485 490 495
Leu Gly Leu Pro Val Ile Lys Lys Thr Lys Thr Gly Tyr Ser Thr Asp
500 505 510
Ala Glu Val Leu Glu Glu Leu Leu Pro Phe His Glu Ile Ile Gly Lys
515 520 525
Ile Leu Asn Tyr Arg Gln Leu Met Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Thr Asp
530 535 540
Gly Leu Met Pro Leu Ile Asn Glu Arg Thr Gly Lys Leu His Thr Thr
545 550 555 560
Phe Asn Gln Thr Gly Thr Leu Thr Gly Arg Leu Ala Ser Ser Glu Pro
565 570 575
Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Leu Glu Leu Gly Arg Lys Leu Arg
580 585 590
Lys Met Phe Ile Pro Ser Pro Gly Tyr Asp Tyr Ile Val Ser Ala Asp
595 600 605
Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Leu Leu Ala His Phe Ser Glu Glu Pro
610 615 620
Lys Leu Ile Glu Ala Tyr Gln Lys Gly Glu Asp Ile His Arg Lys Thr
625 630 635 640
Ala Ser Glu Val Phe Gly Val Ser Leu Glu Glu Val Thr Pro Glu Met
645 650 655
Arg Ala His Ala Lys Ser Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile Ser
660 665 670
Asp Phe Gly Leu Gly Arg Asp Leu Lys Ile Pro Arg Glu Val Ala Gly
675 680 685
Lys Tyr Ile Lys Asn Tyr Phe Ala Asn Tyr Pro Lys Val Arg Glu Tyr
690 695 700
Leu Asp Glu Leu Val Arg Thr Ala Arg Glu Lys Gly Tyr Val Thr Thr
705 710 715 720
Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Ile Pro Glu Leu Ser Ser Lys Asn Arg
725 730 735
Thr Val Gln Gly Phe Gly Glu Arg Thr Ala Met Asn Thr Pro Leu Gln
740 745 750
Gly Ser Ala Ala Asp Ile Ile Lys Leu Ala Met Ile Asn Val Glu Lys
755 760 765
Glu Leu Lys Ala Arg Lys Leu Lys Ser Arg Leu Leu Leu Ser Val His
770 775 780
Asp Glu Leu Val Leu Glu Val Pro Ala Glu Glu Leu Glu Glu Val Lys
785 790 795 800
Ala Leu Val Lys Gly Val Met Glu Ser Val Val Glu Leu Lys Val Pro
805 810 815
Leu Ile Ala Glu Val Gly Ala Gly Lys Asn Trp Tyr Glu Ala Lys
820 825 830

Claims (13)

1.DNA聚合酶，其相比于对照DNA聚合酶具有增强的逆转录酶效率，所述DNA聚合酶由SEQ ID NO:1组成，除了对应于SEQ ID NO:1的640位的所述DNA聚合酶的氨基酸是F，并且所述对照DNA聚合酶由SEQ ID NO:1组成。
2.权利要求1的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶由SEQ ID NO:1组成，除了对应于SEQ ID NO:1的640位的所述DNA聚合酶的氨基酸是F，并且对应于SEQ ID NO:1的580位的所述DNA聚合酶的氨基酸是G。
3.DNA聚合酶，其相比于对照DNA聚合酶具有增强的逆转录酶效率，而无DNA依赖性聚合酶活性的实质性降低，所述DNA聚合酶由SEQ ID NO:1组成，除了对应于SEQ ID NO:1的640位的所述DNA聚合酶的氨基酸是F，并且对应于SEQ ID NO:1的709位的所述DNA聚合酶的氨基酸是K，并且所述对照DNA聚合酶由SEQ ID NO:1组成。
4.权利要求3的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶由SEQ ID NO:1组成，除了对应于SEQ ID NO:1的640位的所述DNA聚合酶的氨基酸是F，对应于SEQ ID NO:1的709位的所述DNA聚合酶的氨基酸是K，并且对应于SEQ ID NO:1的580位的所述DNA聚合酶的氨基酸是G。
5.权利要求4的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶由SEQ ID NO:1组成，除了对应于SEQ ID NO:1的640位的所述DNA聚合酶的氨基酸是F，对应于SEQ ID NO:1的709位的所述DNA聚合酶的氨基酸是K，对应于SEQ ID NO:1的580位的所述DNA聚合酶的氨基酸是G，并且对应于SEQ ID NO:1的629位的所述DNA聚合酶的氨基酸是D。
6.重组核酸，其编码权利要求1-5中任一项的DNA聚合酶。
7.表达载体，其包含权利要求6的重组核酸。
8.宿主细胞，其包含权利要求7的表达载体。
9.产生DNA聚合酶的方法，所述方法包括：
在适合于表达编码DNA聚合酶的核酸的条件下培养权利要求8的宿主细胞。
10.进行引物延伸的方法，其包括：
在适合于引物延伸的条件下，使权利要求1-5中任一项的DNA聚合酶与引物、多核苷酸模板和核苷三磷酸接触，从而产生延伸的引物。
11.产生延伸的引物的试剂盒，其包含：
至少一个提供权利要求1－5中任一项的DNA聚合酶的容器。
12.权利要求11的试剂盒，其进一步包含一种或多种选自下列的另外的容器：
（a）提供在引物延伸条件下能够与预定多核苷酸模板杂交的引物的容器；
（b）提供核苷三磷酸的容器；和
（c）提供适合于引物延伸的缓冲液的容器。
13.反应混合物，其包含权利要求1-5中任一项的DNA聚合酶、至少一种引物、多核苷酸模板和核苷三磷酸。
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