TW513439B - Altered thermostable DNA polymerases for sequencing - Google Patents

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Lisa Vivian Kalman
Thomas W Myers
Fred Lawrence Reichert
Christopher Lim Sigua
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Description

W3439 五、發明說明（1) 發明領域 本發明是有關熱安定性DNA聚合酶’其具有加強的效率 可納入標有螢光素染料之核苷三碟酸。本發明提出分離及 產製此經改變的聚合酶之方法。本發明的酵素可應用於分 子生物學許多方面，且於核酸定序上特別有益。 . 發明背景 將標有螢光素染料之核苷三磷酸（dNTps)納入，在許多 試管内DNA合成應用上十分重要。例如，染料-終結子DNA 定序反應，需將螢光素二去氧核苷酸類似物納入以供終結 及標記。此外，經標記產物之試管内合成也可能涉及螢光 核哲酸或核百酸類似物之納入。例如，已螢光標記之DNA 已在有應用經固化探針之微排列之雜交分析中使用。 (Cronin et al·， 1996， Human Mutation 7:244) 0 為確定DNA複製之正確性，DNA聚合酶對納入其正常受 質，在此指傳統的去氧核苷三磷酸（dNTPs)，及拮抗非傳 統dNTPs(包括標有螢光染料之dNTPs及dNTP類似物）上有極 強的偏倚向。在細胞中，此特性使得漸增長之DNA股納入 不正常驗基（如d U T P )有所減緩。於試管内，當傳統的及非 傳統的螢光標記核苷三磷酸存在時此特性尤其明顯，如在 DMA定序反應中，其中使用利用到染料-終結子之二去氧鐽 終結法版本（Lee et al·， 1992，Nuc. AcLds. Res, 20:2471，其已列為本案參考）。 採用染料-終結子方法之商品化D N A循環定序套組，其中 是使用標有若丹明族螢光染料之鏈終結子ddNTPs。然而，
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MJ439 五、發明說明（3) 性酵素更高。本發明也提出編碼這些酵素的基因，以及可 提供大量純化酵素之重組體表現載體。” 經由本發明可鍵定出熱安定性D N A聚合酶中關鍵性匳 域，其可影響聚合酶納入標有螢光素族染料之核苷酸之能 力，且仍保有納入全然天然核苷酸之能力。此關鍵區威或 稱特色區域（Critical Motif)可納入熱安定性dna聚合酶 之基因中，如利用重組體DNA方法如位置—特異的突變作 用，以提出本發明之優點。 因此在一方面’本發明提出重組體熱安定性DNA聚合 酶’其特徵在於酵素經突變可產生特色區域，且與相當的 野生型酵素比較下在納入標有螢光素族染料的核苷酸方面 其區別性減低。 在此方面，本發明提出重組體熱安定性ΜΑ聚合酶，其 特徵在於a)在其天然型式下，該聚合酶含有胺基酸序列如 下（以單字碼示出）：LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 1)， 其中X是任何胺基酸；b)在該序列4位置上之X和天然序列 比較下是突變的，除了一點即不突變成E ;及c)該熱安定 性DNA聚合酶與天然型式比較下，其納入X標有螢光素族染 料之核百酸方面，在區別性上較為減低。以三字碼計，此 胺基酸序列認為LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (SEQ ID NO: 1)，其中 ” Xaa，，於此序列3，4，6，9 及1〇 位 置上為任何胺基酸殘基，而此序列7位置處之π X a a，，是v a 1 或 lie。 在另一具體實例中，重組體熱安定性DNA聚合酶特徵在
513439 五、發明說明（4) 於a )聚合酶的天然型式包括以下胺基酸序列： LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE (SEQ ID NO: 2)，其中X 是任何胺 基酸，b)在此序列第4位置處之X和天然序列比較下是經突 變的’除了 X不突變成E ;及c)該熱安定性d να聚合酶和天 然型式比較下，其納入標有螢光素族染料之核哲酸之區別 性較減低。於三字碼中，此胺基序列計 H:LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyrGluGlu(SEQIDNO: 2) ，由是在第3位置之"Xaa”是Gin或Gly，在第4位置之 nXaa”為任何胺基酸，在第6位置之，，Xaa”是Se]f或Ala。在 較佳之具體實例中，胺基酸序列是1^〇\1^1?¥££(3£<310 NO: 3)，其中X是任何胺基酸。於三字碼中，此胺基酸序 列以LeuSerGlnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu (SEQ ID NO: 3) 代表，其中在第4位置上之’’Xaan為任何胺基酸。於一個 較佳之具體實例中，在4位置上之” Xaa”是LyS。 又在另一具體實例中，重組體熱安定性MA聚合酶特徵 在於1 a)聚合酶之天然型式包括以下胺基酸序列 LSVXLG(V/I)PVKE (SEQ ID NO: 4) ;b)在該序列 4 位置處 之X和天然序列比較下是突變的，除了 X不突變成E ;及c) 該熱安定性DNA聚合酶與天然型式比較下，在納入標有螢 光素族染料核曾酸之區別性上較減低。於三字碼中，此胺 ID NO: 4)，其中在4位置上inXaan是任何胺基酸，在7位 置之’’ X a aπ是V a 1或11 e。於較佳具體實例中，胺基酸序列 是LSVXLGVPVKE (SEQ ID NO·· 5)，其中4位置上之X是任何
第10頁 D:\54773.ptd 513439 五、發明說明（5) 胺基酸。於三字碼中，此胺基酸序列是
LeuSerValXaaLeuGlyValProValLysGlu (SEQ ID NO: 5) > 其中在4位置上之” Xaan是任何胺基酸。在較佳之具體實例 中，在4位置上之” Xaan SArg。在另一較佳具體實例中， 胺基酸序列是LSVXLGIPVKE (SEQ ID NO: 6)，其中在4位 置之X是任何胺基酸。在三字碼中，此胺基酸序列是 LeuSerValXaaLeuGlyIleProValLysGlu (SEQ ID NO: 6) 其中在4位置上之” Xaan是任何胺基酸。於較佳具體實例 中，在4位置上之” Xaan SArg。 ' 在本發明另一方面，本發明關鍵性的特殊區域可與聚合 酶基因中已知可提供熱安定性DNA聚合酶在納入非傳統核口 苷酸如rNTPs及ddNTPs之區別力減低之其他特色區域組 合。如此中所示範的，構築含有二個突變的重組體水生樓 熱菌（Taq) DNA聚合酶。第一個突變是在本發明關鐽 色4位置之X殘基上由EiK之突變。帛二個突變月是關可鍵/有特效 納入ddNTPS之已知的F6 67Y突變。此突變是Taq DNA聚合酶 6 6 7位置由笨丙胺·酸至酪胺酸（述於^專利“ 5,614 36"5及 US系列號8/448, 223，且列為此中參考）。當用於有螢=素 染料族-標記之ddNTPs之定序反應中，頃發現£681}( F 6 6 7Y 雙重突變酵素可產生可譯讀之定序梯度。因此在一個呈體 實例中，將可提供對二去氧核苷酸區別性減低之特色^合 以本發明具關鍵性特色，可提供在納入經標記及未標記 ddNTPs效率上有所提高之酵素。 此外，意外地發現在E681K F 6 6 7 Y突變酵素和僅以67¥突
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五、發明說明（6) 變之酵素比較’前者有顯著增加之伸展率。因此在本發明 另一個具體實例中’將具關鍵性之特色單獨地或組合^其 他特色引入熱安定性DNA聚合酶中，可產生伸展率增加之 酵素。也意外地發現雙重突變之酵素，在利用若丹明一標 έ己之終結子之染料-終結子一去氧定序法中，可產生較為 一致之峰高。因此，在另一具體實例中，將具關鍵性特色 引入熱安定性DNA聚合酶酵素中，可在利用若丹明—標記之 終結子之DNA疋序法中產生呈現較均勻峰高之酵素。’ 在另一具體實例中，將可使rNTPs更有效納入之突變， 如在Taq DNA聚合酶615位置上由榖胺酸至甘胺酸之突變， 或E615G突變（述於歐洲專利案，ν〇· EP-A-823 479，在此 列為參考），組合以本發明之關鍵性特色，可提供標記以 螢光族染料之核苷酸更有效率納入之酵素。 在本發明另一方面，也提出編碼本發明聚合酶之基因。 特言之，可提出編碼重組體熱安定性聚合酶之基因，其中 含有本發明之關鍵特色。包括在本發明方面的也有編碼二 種以上突變組合之基因，其中包括可產生本發明關鍵特 之突變。 ^ 又在另一方面，本發明也提出DN A定序的改進方法，其 中使用較低濃度的標以螢光素染料族之ddNTPs，由是減壓 反應進行時之費用。本發明改進的方法是也可使用較低比 例的標以螢光染料之ddNTPs對dNTPs。利用這些方法可有 許多優點，包括較有效率的聚合化作用，需較低濃度之模 板核酸’及將抑制劑引入反應混合物中之可能性較低。這
513439 五、發明說明（7) 些優點也有 方法，其中 間純化下接 因此在本 體酵素決定 有突變可產 素族染料之 性較少。在 利用衍自嗜 然生成之序 酵素在納入 中，本發明 DNA聚合酶 上之胺基酸 百酸方面區 在本發明 改進方法。 率地納入標 族染料之擴 之改進方法 光素族染料 反應。 助於長模板之定序。本發明也提出改進的定序 定序反應可直接頃加至定序凝膠上，可在無中 著電泳。 發明的一個具體實例中，本發明提出利用重組 標的核酸序列之改進方法，其a)在第4位置上 生本發明具關鍵之特色，及b)在納入標以螢光 核苷酸方面與相當的野生型酵素比較，其區別 本發明範圍内也包括經改進的定序方法，其中 熱性之熱女疋性DNA聚合酶，其中酵素含有自 列變化可產生本發明具關鍵之特色。這些天然 非傳統核苷酸之區別性減低。在此具體實例 k出改進的定序方法，盆传用壬妙从血二 ^ ，、便用天然的熱安定性 ’其a)具有本發明具關鍵性特色，其中在4位 非G 1 u，及b )其在納人；| »山 你α八铩以煢先素族染料之核 別性減低。 範圍内也包括產製標以螢光素族染料之dna之 本發明的酵素在聚合酶連鎖反應方法中可有 有螢光素之dNTPs，產生在各部位標以勞光/ 大產物。因此，在一個呈f # π + 变兀π
^ 1U具脰貝例中，標記DIU 已括a) k供一種反應混合物， 之则)3，及本發明酵辛，^中3有標以螢 岭I 及bi進行核酸擴大 由本發明之酵素及編碼這些酵素之基因 方面，即DNA定序用套組，其中包 成本發明另 括本發明的重組酵素，
513439 五、發明說明（8) 且可另外包括有負電荷之螢光終結子化合物。用於Ma定 序之其他套組包括a)負電荷之螢光終結子化合物及〇本發 明之天然酵素。 X 附圖說明 不出和實例I有關之限制 額外突變株及表現載體之 圖1代表Taq DNA聚合酶基因。 位置，並說明製備此中所提供之 方法。 發明詳細說明 為有助更了解本發明 所謂π基因”係指含有 體所必要之控制及編碼 因序列或編碼序列任何 性即可。 所謂π天然的”指自天 物。此術語也指由分子 型式，其胺基酸序列和 所謂π突變株”指基因 胺基酸序列改變，結果 比較下可生成功能特性 點突變，刪除及嵌入。 所謂"宿主細胞”指單 菌，酵母及放線菌，及 細胞培養中）之單細胞。 所謂”表現系統”指含 ’於下文定義一些術語。
產製可回收之生物活性多肽或前驅 序列之ΜΑ序列。多肽由全長的基 部份所編碼，後者只要保有酵素 然生成來源中分離的基因或基因產 生物技術產生之天然蛋白質重組體 天然型式相同。 — 之核酸序列已改變者或基因產物之 和天然的或野生型基因或基因產物 已改變之基因產物。此種改變包括
細胞原核及真核細胞有機體，如細 來自較南等植物或動物（當培養在 有欲求編碼序列及控制序列（並呈
513439 五、發明說明（9) 可操作鏈結型式）之DNA序列，如此為這些序列所轉形之宿 主細胞可產生所編碼之蛋白質。為達成轉形作用，表現系 統可包括在載體中；然而，相關的DN A也可整合至宿主染 色體内。 此中所使用之π寡核苯酸”定義為含有二個以上去氧核糖 核苷或核糖核苷之分子，較好是三個以上，且通常十個以 上。券核专"酸之確實大小依據許多因素而定’包括最終的 功能或寡核甘酸之用途。 寡核曾酸可以任何適合的方法製備，包括如適合序列之 選殖及限制水解，以及利用方法如磷酸三酯方法之直接化 學合成，如 Narang et al·，1979，Meth. Enzymol, 68:90-99 ; Brown et al·, 1979， Meth Enzymol. 68:109-151 之填酸二酯方法；Beaucage et al,， 1981，
Tetrahedron Lett, 22:1 85 9- 1 8 6 2 之二乙基磷酸亞醯胺酸 酯方法；Matteucci et al.， 1981， J, Am. Chem, S〇c. 103:3185-3191之三酯方法，或自動合成方法；及美國專 利案N 〇. 4，4 5 8，0 6 6之固體載體方法，此刊物各列為此中 參考。 所謂"引子π如此中所用的指募核苷酸，其不論天然的或 合成的’當置於可啟動引子伸展之條件下可充作合成之起 點。引子較好是單股的募去氧核苷酸。引孑之適合長度依 引子欲求之用法而定，但通常由1 5至3 5個核苯酸長。短的 引子分子通常需較冷的溫度，以與模板形成充份穩定之雜 交複合物。引子勿需反映出模板之確實序列，但需與之充
:>丄 五、發明說明（10) ----- 份互補才可與模板雜交，進行引子之延長作用。 引子可予以標記之，芒、/ & β βσ ,, ^ ^ ^ 右必要時，即納入由顯微鏡，光化 螢光染料，電子-稠厚試劑，酵素（如常用 \ .1 , * 之標幟如:，…Λ予或化學方法可測及之標幟。有用 於ELISA分析中者），生物音$ A此汀^ 吊 μ > β π ^物素，或由可應用抗血清或單株 抗體之半抗原及蛋白質。 ^ :熱女疋性聚合酶"指内熱穩定，具熱抗性，及當接 ::=歷雙胺核酸變性必要時期後仍保有充份活性可達 成接下來之引子伸展反應且不致被不可逆地變性（失去活 性)之酵素：刪性所必要之加熱條件為技^中知 的、，且不轭於US專利案Nos· 4,683,2 0 2及4,683，195，已 列為t案參考。如此中所用的，熱安定性聚合酶適用於溫 度循壞反應中’如聚合酶連鎖反應（” pCRn )。在此中目的 下之不可逆變性指酵素活性永久且完全的喪失。對埶安定 性聚合酶而言，酵素活性係指核苷酸組合以適當方式催化 以形成與模板核酸股互補之引子伸展產物。 所謂^傳統的’’或”天然的”當指核酸鹼基，核苷之磷酸， 或核哲酸時’係指在所述之聚核首酸中可自然生成者（即 於 DNA 日寸為 dATP ’dGTP ’dCTP 及 dTTTP)。另外，dlTP 及 去 吖-dGTP經常替代dGTP及7_去吖-dATp使用，在試管内之 MA合成反應中可用來替代dATP ,如定序略。總言之其可 其可稱為dNTPs。 所谓π非傳統的，，或π經修飾的’’當指核酸驗基，核甘，或 核苷酸時包括傳統鹼基，核哲或在特定聚核曾酸中自然生
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第16頁 513439 五、發明說明（11) 成之核苷酸之修飾，衍生物，或類似物。尿嘧啶之去氧核 糖核苷酸為DNA中非傳統的或經修飾的鹼基（dUMP)，而尿 嘧啶之核糖核酸型式在RNA中是傳統的鹼基（UMP)。如此中 所用的，非傳統的核管包括充作核酸定序之終結子之化合 物，但不限於此。終結子化合物包括具2 ’，3 ’ -二去氧結構 之化合物’且稱之為二去氧核哲三罐酸，但不限於此。二 去氧核苷三磷酸，ddATP，ddTTP，ddCTP及ddGTP總稱為 ddMTPs。其他非傳統的核苷酸包括硫代磷酸酯dNTPs ([ α -S]dNTPs) ，5, 一 α -蝴烧一dNTPs ， α —曱基一膦酸 §旨dNTPs ， 及核糖核苷三磷酸（rNTPs)。非傳統的鹼基可標以其放射 活性之同位素，如32P，33P，或35S ;螢光標幟；化學發光 標幟；生物發光標幟；半抗原標幟，如生物素；或酵素標 幟如鏈抗生物素蛋白或抗生物素蛋白。螢光標幟包括負電 荷之染料，如螢光素族之染料，或中性電荷之染料，如若 丹明族染料，或正電荷染料，如花青哲族染料。螢光素族 染料包括如：FAM，HEX，TET，JOE，NAN及ZOE。若丹明族 染料包括 Texas Red，R0X，R110，R6G 及 TAMRA 由 Perkin-Elmer 上市（Foster City， CA)，且 Texas Red 由 Molecular Probes上市。花青苷族染料包括Cy2，Cy3， Cy5及Cy7 ，且由Amersham 上市（Amersham Place, Little Chalfont，Buckinghamshire, England)。一 所謂n DNA合成反應n指產生DNA套數之方法，包括PCR， 股置換擴大作用，轉錄作用調介之擴大作用，引子伸展作 用及反轉錄作用，但不限於此。
D:\54773.ptd 第17頁 五、發明說明（12)-- 2了進一步促進對本發明之了解，在本說明書全文中參 亏=異的熱安定性DNA聚合酶及螢光染料以示範本發明， 且這些參考文獻不欲因此限制本發明。 本發明提出新穎且改進的熱安定性ΜΑ聚合酶組成物。 本發明酵素包括和相當的野生型酵素比較下可更有納入標 =登光素族染料之核苷三磷酸之重組體聚合酶。本發明熱 安定性DNA聚合酶更適合且可更企求應用於如DNA定序及標 §己產物之試管内合成，等製程中，更勝於先前之聚合酶。 本發明經改進之MA定序方法，包括使用這些重組體聚合 酶以及使用可更有效納入標有螢光素族染料之核苷三磷酸 之天然酵素，更勝於先前具特色之酵素。編碼這些酵素之 DNA序列，及可表現蛋白質之載體也予以提供。 本發明之熱安定性DN A聚合酶在酵素聚合酶活性區域之 胺基酸序列内具有一個關鍵性區域。本發明提出之在熱安 定性DNA聚合酶胺基酸序列内之關鍵區域，利用傳統的單 子母胺基酸密碼示於下（Lehninger，Biochemistry，New
York, New York, Worth Publishers Inc., 1970, P· 67，已列為本案參考。） SEQ ID NO: 7 LSXXLX(V/I)PXXE ，其中nX"在4位置上表 示除了 Ε以外的任何胺基酸。在胺基酸的三字碼中，此序 列以LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (SEQ ID NO: 7)示出，其中在3、6、9及10位置上inXaan是任何胺基 酸，在此序列4位置上之’’ X a a"是榖胺酸殘基（G 1 u)以外之 任何胺基酸，且在7位置上之π X a aπ是V a 1或I 1 e。此關鍵性
D:\54773.ptd 第18頁 513439 五、發明說明（13) ----一"' 區域可提供特徵為可將標有螢光素族染料之核苷酸有效納 入之熱安定性DNA聚合酶。 例如’在水生棲熱菌（Taq) DNA聚合酶基因之衍生物 中’其在46位置上含有一個甘胺酸至天冬胺酸之突變 (G46D)及一個F6 6 7Y突變，在全長Taq DNA聚合酶序列第 681殘基榖胺酸第一位置密碼上有^至a之突變（相當於關鍵 特色之第4位置），可生成具有關鍵特色之酵素。此酵素呈 現1)在納入標有螢光素族染料之核管酸之效率上有約2至 10倍之增加，但並不破壞酵素在傳統核苷酸存在下調升 PCR之此力，及2)在延伸速率上有3倍之增加。在Taq DNA聚合酶中，此特殊的突變作用會造成由£(穀胺酸）至 K(賴胺酸）之胺基酸變化。 雖然此特定的胺基酸變化可產生關鍵性特色，並顯著地 改變酵素納入非傳統核苷酸之能力，但可預期的由E至κ之 特異變化對本發明之關鍵性不若目前在關鍵性區域内鍵知 之位置因此，在較佳之具體實例中，本發明提出重組的 熱安定性DNA聚合酶，其特徵在於a)在其天然型式中，該 聚合酶含有胺基酸序列LSXXLX(v/I)pxxE (SEQ ID N〇: 1)，其中X是任何胺基酸；b)與天然序列比較下，該序列 之4位置X被突變，除了在4位置上之X不突變成]£之外；及 c)與酵素之天然型式比較下，該熱安定性題八聚合酶在納 入有螢光素族染料標記之核苷酸上其區別力減低。在 具體實例中，4位置上之X為任何具有正電荷之胺基酸 代，如K，R或Η，或為極性胺基酸所替代，如Q 。在最
513439 五、發明說明（14) 佳之具體實例中，在4位置上之X為K所替代。 在本發明另一較佳具體實例中，本發明特徵在於其中酵 素a)在標以螢光素染料族之核苷酸之區別性上有所減低及 b)含有胺基酸序列LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE，其中X是任何胺 基酸（SEQ ID NO: 2)。在三字碼中，此胺基酸序列如下 示：LeuSerXaaXaaLeuXaalleProTyrGiuGlu，由是在3 位置 上之”Xaaif SGln或Gly，在4位置上之nXaa”是任何胺基 酸，且在6位置上之”xaa”是Seir或Ala。 在本發明較佳具體實例中，具標以螢光素染料族之核昔 酸區別性減低之酵素含有序列：LSQXLAIPYEE，其中X是任 何胺基酸（SEQ ID NO: 3)。在三字碼中，胺基酸序列以
LeuSerGlnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu代表，由是在4 位置 上之n Xaan是任何胺基酸。在本發明最佳具體實例中，χ是 Κ殘基。 在本發明另一較佳具體實例中，具標以螢光素染料族之 核曾酸區別性減低之酵素含有胺基酸序列 LSVXLG(V/I)PVKE，其中χ 是任何胺基（SEq ID no: 4)。在 三字碼中，此胺基酸序列以
LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu代表，由是在4 位置 上之"Xaan是任何胺基酸，在7位置上之"Xaa”是Val或 lie。 於本發明較佳具體實例中，具有標以螢光素染料族之核 哲酸之區別性減低之酵素，含有胺基酸序列 LSVXLGVPVKE ’其中X是任何胺基酸（SEq ID N〇: 5)。在三
D:\54773. ptd 513439 五、發明說明（15) 字碼中，此胺基酸序列以
LeuSerValXaaLeuGlyValProValLysGlu代表，由是在4位置 上之nXaan是任何胺基酸。在最佳具體實例中，X是r殘 基。 又較佳之具體實例中’具有標以螢光素染料族之核甘酸 之區別性減低之酵素含有胺基酸序列L S V X L G I P V K E，其中X 是任何胺基酸（SEQ ID NO: 6)。在三字碼中，此胺基酸序 列以LeuSerValXaaLeuGlylleProValLysGlu代表，由是在4 位置上之π X a aπ是任何胺基酸。在最佳之具體實例中，X是 R殘基。 此處所述之Ε681Κ突變其特色是鍵定在DNA聚合酶基因中 之區域，其可影響聚合酶與負電荷螢光素核苷酸交互作用 之能力。此位置距螺旋0末端，係位在〇a螺旋之末端而在 聚合酶 Ob 螺旋之開端（Kim，et al.，1 9 9 5，Nature，3 7 6: 6 1 2 )。依據技藝中熟知的分子模型原則，第6 8 1位置上E至 K以外的Oa-〇b螺旋結構的變化，預期在聚合酶區別標以螢 光素族染料之核曾酸能力上也可產生變化。因此在關鍵特 色中之突變’非第4位置上X殘基之變化，也在本發明範圍 之内。在此具體貫例中，本發明提出重組體熱安定性训a 聚合酶，其特徵在於（a)在其天然型式下，聚合酶含有胺 基酸序列LSXXLX(V/I)PXxe (seq id NO: i)，其中X 是任 何胺基酸，（b)重組體聚合酶在胺基酸序列内含有至少一 個突變，除了在第4位置之X並不突變成e，及c)與相當的 天然酵素比較下，酵素在納入槱以螢光素族染料之核甘酸
D:\54773.ptd 第21頁 513439 五、發明說明（16) 之區別力上較為減低。 類似地，含有關鍵性特色之熱安定性dna聚合酶，和胺 基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 7)其中第4位置 之X為E以外之任何胺基酸，之關鍵性特色相似但不相同者 也包括在本發明範圍内。特言之，在一個具體實例中，關 鍵性特色是胺基酸序列LXXXXXXXXXE (SEQ ID NO: 8)，其 中在4位置上之X是E以外的任何胺基酸。在三字碼中，此 胺基酸序列示以LeuXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGlu (SEQ ID NO: 8)，由是在2，3，5，6，7，8，9及10 位置 之n Xaan是任何胺基酸，且在4位置上之"xaa”是ciu以外的 任何胺基酸。 在另一具體實例中，關鍵性特色是胺基酸序列
L(S/A)XX(L/I)XXXXXE (SEQ ID NO: 9)其中在 4 位置上之 X 是E以外的任何胺基酸。在三字碼中，此胺基酸序列以
LeuXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGlu (SEQ ID NO: 9)代 表，由是在3、6、7、8、9及10位置上之” Xaa”是任何胺基 酸，在2位置上之” Xaa”是Ser或Ala，在4位置上之”xaa”是 除了 Glu以外之任何胺基酸，且在5位置上inXaanS Leu或 lie。 又在另一具體實例中，關鍵性特色是胺基酸 LSXXLXXXXXE (SEQ ID NO: 10)，其中在4妞置上之义是£以 外的任何胺基酸。在三字碼中，胺基酸序列以 L e u S e r X a a X a a L e u X a a X a a X a a X a a X a a G 1 u ( S E Q I D N 〇 : 1 〇 ) 代表，由是在3，6，7，8，9及10位置之nXaa"為任何胺其
第22頁 D:\54773.ptd 五、發明說明（17) 酸，在4位置上之"Xaa"是Glu以外的任何胺基酸。 本發明酵素有效納入標以螢光素族染料之核苷酸之能 :杜以ddNTP納入分析法偵測。此分析之一是在 ^牛下進行引子伸展競爭分析。在此分析中，引子板 (5 -GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGC) > (SEQ ID NO： 11)結合至 M13mpl8 模板 Innis et al,，1988，Proc Natl· Acad，Sci· USA 85:943 6 )，在[a—33p]dCTP 及有各 種螢光標記之ddNTP之過量酵素，z〇wie —ddCTp存在下伸 展。因為ddCTP殘基之納入可中止伸展反應，使ΜΑ聚合酶 將ddCTP納入展引子變得更容易，故被納入之[α _33p]dCTp 較少。因此’當榮光標記之ddCTp納入效率增加，MA合成 之抑制程度會增加。反應也在各種未標記之ddCTp水平下 進行。計算出為達50°/❾抑制所需之ddCTp & z〇wie —ddCTp濃 度’並與酵素納入螢光標記之核苷酸之能力相對測度比 較。d d N T P納入分析之詳情示於實例η中。 因此’在本發明一個具體實例中，以實例丨丨之螢光性 ddNTP納入分析法來偵測對納入標以螢光素族染料之核苷 酸區別力減低之特色。在一個較佳具體實例中，標以螢光 素染料之ddNTP，Zowie〜ddCTp為達dna合成50%抑制所需之 濃度，在本發明突變株酵素中其濃度較野生型酵素至少減 少3倍。在一個較佳具體實例中，濃度則i少減少1 〇倍。 又在另一具體實例中，由螢光性dNTp納入之測及可分析減 低區別力之特色。 在本發明另一方面，熱安定性DNA聚合酶基因序列及酵
第23頁 a D:\54773.ptd 513439 五、發明說明（18) 素衍自各種嗜熱種類。在一個具體實例中，聚合酶基因序 列及酵素得自棲熱菌屬。又在另一具體實例中，基因序列 及酵素得自棲熱菌屬菌以外之嗜熱種。各種熱安定性])NA 聚合酶之完全核酸及胺基酸序列均可應用。Taq嗜熱棲熱 囷（Tth)、樓熱囷Z05 ’ 樓熱囷spsl7，Thermotoga maritima (Tma)及Thermosipho africanus (Taf)聚合酶 已發表於PCT國際專利案No· PCT/U.S.9 1 / 0 7 0 35，其以PCT 案No· WO 92/06200於1992年4月16日出版，且已列為本案 參考。來自黃色棲熱菌、B· caldotenax及嗜熱脂肪芽孢 桿菌之DNA聚合酶發表於Akhmetzjanov及Vakhitov, 1992， Nucleic Acids Research 20 (21):5839 ^Uemori et al.，1 9 9 3，J· Biochem· 113:401-410，及編號 BSU23149，ng來自NG: New GenBank資料庫，分別地，其各 自列為本案參考。來自Τ· caldophilus熱安定性DNA聚合 酶之序列見於£^131^/^61^31^編號1^〇.1]6 25 84。來自1\ filiformis熱安定性DNA聚合酶可利用美國專利案N〇. 4, 889, 818之方法回收自ATCC貯置號No. 4238 0，且序列資 料示於表1 °Thermotoga neapolitana DNA聚合酶之序列 得自GeneSeq Patent資料庫，編號No. R98144 (也述於 PCT WO/97/09451) 〇
D:\54773.ptd 第24頁 513439 五、發明說明（19) 表I 有機體: 關鑑特色 關鑑胺基酸位置 保留區 L S / 3. - 一 L/i E 水生棲熱菌 L s Q E L A 工 P Y E E 681 :黃色棲熱菌 L s G E L S 工 P Y E E 679 嗜熱棲熱菌 L s Q E L A I p Y E E 683 棲熱菌屬Z05 L s Q E L A I P Y E E 683 棲熱菌屬spsl7 L s Q E L S I P Y E E 679 Thermus caldophilus L s Q E L A I P Y E E 683 Thermns filiformis L s Q E L S I P Y E E 679 Thermotoga maritima L s V R L G V P V K E 744 Thermotoga neapolUana L s V R L G I P V K E 744 Thermosipho africanus L s K R I G L s V S E 743 Bacillus caldotenax^ L A Q N L N I s R K E 725, 724 嗜熱脂肪芽孢桿菌2 L A Q N L N 工 T R K E 724, 727, 802 1，蛋白質序列來自Accession No· D12982， Uemori T·， Ishino Y., Fujita K., Asada K., Kato I. 11 Cloning of the DNA polymerase gene of Bacillus c^aldotenax and character i zat ion of the gene product 丨丨 J. Biochem· 1 1 3 : 4 0 1 ( 1 9 9 3 )。在此序列之關鍵性殘基是第7 2 5。幾乎 相同的蛋白質序列以DNA聚合酶提供，編號N〇· R45 1 55及
D:\54773.ptd 第25頁 513439 五、發明說明（20) WP I 9 3 -4 0 8 3 2 3 / 5 1。在此序列中之關鍵性殘性基是7 24。 2·在GeneBank或SwissPro1:/PIR資料庫中有許多嗜熱脂肪 芽孢桿菌DNA聚合酶提交的序列。雖然這些序列高度有 關，但有時互異，各含有相同的L( S/A)XX(L/ I )XXXXXE (SEQ ID NO: 9)特色，其中X是E以外之任何胺基酸。在三 字碼中，此胺基酸序列以
LeuXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGlu (SEQ ID NO: 9)代 表’由是在3，6，7，8，9及10位置之n xaa”是任何胺基 酸，在2位置上之” xaa”是ser或Ala，在4位置上之，，.xaa"是 Glu以外的任何胺基酸，且5位置上之”Xaa”是Leu或丨“。 在上表中’由日本專利案j 〇5 304 964A，EP No 699, 760及編號Ν〇· U33536提供蛋白質序列，其中含有關 鍵特色724位置上之關鍵性殘基。另一高度有關但多少有 點不同之蛋白質序列係發表於Gene 1 6 3:6 5 — 6 8 ( 1 9 95 )， 其中含有關鐽特色中727位置之關鍵性殘基。另一高度有 關但多少不同的蛋白質序列.為編號N〇· U23U9之Bst ΜΑ 聚合酶’其中含有關鐽特色中第8〇2位置處之關鍵性殘 基。 =為各嗜熱種之聚合酶均是獨特的，因此關鍵區域 份在各酵素中是各不同的。胺基酸及核酸序列 右：2 ί易地運用’且在此中鍵知之特定區域下，可 f助於鍵&本發明確實的序列區域。&區域排列程式可得 ^Genetics Computer Group, 5 75 Science Drive, ad1S〇n，fflsconsin。在此中鍵知之特殊特色下，這些程
第26頁 513439 五、發明說明（21) 式包括nGAPn，"BESTFIT” &nPILEUP”均有助於關鍵特色之 定位。關鍵性區域之位置示於表1，為來自示範的嗜熱菌 屬之熱安定性DMA聚合酶。 估不論熱安定性DNA聚合酶區域内，關鍵性特色LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 7)，其中第4 位置之X 為E 以外之任何胺基酸，之確實位置如何，特色點之存在可提 供具有可有效納入標以榮光素族染料之核甘酸能力之熱安 定性DMA聚合酶。因此，黃色棲熱菌（Glu 679)，嗜熱棲熱 菌（Glu 6 8 3 )，棲熱菌 Z05 (Glu 6 8 3 )，棲熱菌 sps17 (Glu 679) ? Thermus caldophilus (Glu 683) 5 Thermus filiformis (Glu 6 7 9 )之熱安定性DNA聚合酶因有的榖胺 酸之突變作用可產生關鍵特色，其在聚合酶有效納入標以 螢光素族染料之核苷酸能力上可提供加強之作用。 此外，基於目前鍵知之特色有高度保留性本質，可依據 其與如Taq DNA聚合酶或表I所列其他DNA聚合酶之同質 性，鍵定出新穎的熱安定性DNA聚合酶（見如美國專利案 Nos. 5, 618, 711及5, 624, 833，其已列為此中參考）。此種 聚合酶只要其肽序列以此中所述之方法決定知與T a q聚合 酶胺基酸序列有一至少4 5%且最好80%以上之同質性，均屬 於本發明範圍之内。因此，本發明是有關新一類的酵素， 其也包括如熱安定性DNA聚合酶，及來自下^列相當的基因 及表現載體：Thermus oshimai (Williams RA，et al， 1996, Int J. Syst Bacteriol 46 (2): 403-408)； Thermus silvanus 及Thermus chii aroph i1 us (Tenreiro
D:\54773.ptd 第27頁 513439 五、發明說明（22) S. et al., 1995, Int. J. Syst, Bacteriol 45 (4):633-639) ； Thermus scotoductus (Tenreiro S et al·， 1995， Res· Microbiol 146 (4):315-324); Thermus ruber ATCC 35948 (L.G. Loginova, 1984, Int· J. Syst· Bacteriol 34:498-499);及Thermus brockianus (Munster, M.J., 1986, J. Gen, Microbiol 1 3 2:1 6 77 )，以上刊物各列為本案參考。 精藝者應可確認，上述具納入標以螢光素核苷酸效率加 強之熱安定性DNA聚合酶，可以重組體DNA技術如位置-指 令之突變作用，最容易地構成。如見Sambrook et al.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor，1989，第二版，15, 51 章， "Oligonucleotide-mediated mutagenes i s，n 其已歹，J 為本 案參考。此技術目前在技藝中已是標準技術，且可用來生 成基因中任何預定位置鹼基對變化的所有可能型式。方法 之進行是利用合成的募核苷酸引子，其除了有限的誤配 (此代表欲求之突變作用）與欲突變之單股噬菌體或質體 DNA互補。簡言之，使用合成的寡核曾酸為引子以指令與 嗟菌體或質體互補之股之合成，且生成之雙股DMA再轉移 至有噬菌體或質體支持之宿主細菌中。可利用DNA序列分 析或探針雜交等方法來分析所生成之細菌j以鍵定攜有欲 求突變基因產物之嗤菌斑或集落。 在PCR發明後，引子-指令之突變作用（述於美國專利案 No· 4, 683, 1 95，在此已列為本案參考）及”重疊的pCR，，
D:\54773.ptd 第28頁 513439 五、發明說明（23) (Higuchi， 1989，於PCR Technology， ed. Erlich， Stockton Press， New Y〇rk， NY， pp，61_70)已變成將任 何突變引入基因任一位置之例常方法。 可以傳統方法自質體，噬菌質體，噬菌體或擴大反應中 回收經突變之DN A，並連接至表現載體中以供接續的培養 及生成酵素之純化。有許多選殖及表現載體均適用於本發 明’包括哺乳動物及細菌系統，如S a m b r ο 〇 k e t a 1.， 1989， ’上文中所述。為方便起見，本發明以由乂衍生之 PL 啟動子來示範（Shimatake et al.，1981，Natu]re 2 92: 128)。此啟動子之用法特別述於美國專利案N〇s. 4，711，845及5, 079, 352中，已列爲太安夂去 質體PCS1則在1 9 9 7年8月28日貯於ATy，有編號Ν〇· 98 52 1。此質體含有編碼熱安定性DNA聚合 因在6m立置處之密碼子上突變’如此在生成之多脉中榖 =以賴Tif代：並提供可生成熱安定性_聚合酶之 提升i: u _、、内入W勞光素族染料之核ΐτ酸之效力有所 Κ置繼代選變之相鄰的限 知許多熱安定性DNA聚合酶之完人另外 α為已 引入的直仙古；^ 4王基因序列，將Ε681Ι(突變 引入的其他方法，如限制酶水解 τ 精藝者運用，其有ATCC貯置之庫 ：J，可容易地為 訊。 應用性及此處供之序列資 當吾等欲產製本發明之突變株或天然 素之衍生物或同質物時，酵素之 ^時，或這2 = 座生、吊涉及以表現載體
513439 五、發明說明（24) -------- 轉形^主細，並在此表現可發生之條件下培養該經轉 二 、胞。轉形及培養經轉形宿主細胞之方法為技藝 天.、σ、’ 且詳述於如Sambr〇〇k et al·， 1 98 9，上文。 本發明的熱安定性DNA聚合酶通常純化自大腸桿菌 DG116(於1 9 8 7年4月7日貯置，ATCC 5 3 6 0 6 )，其中並以表 現載體所轉形，載體中操作鏈結有編碼野生型或經修飾之 熱女疋丨生DNA聚合酶之基因。純化熱安定性⑽a聚合酶之方 法述於如實例丨中及Lawyer et al.， 1 9 93， PCR Meth〇ds and Appllcati〇ns 2:2 7 5_87，已列為本案參考。 本發明之熱安定性酵素可應用於需要或欲求此酵素活性 之任何目的。用途實例包括DNA定序，DNA標記，及引子伸 展產物之標記。以Sanger二去氧核苷酸方法進行之⑽A定 序(Sanger et al.，i977， Proc· Natl· Acad· Sci.74· 5463 )以本發明可特別改進。在基礎仏叫^ et “方法中 之進展疋提出新穎的載體（Yanisch-perr〇n et al
Gene 33:103-119)及驗類似物（Mills et al.，i^g Proc· Natl· Acad, Sci.76:2232-2235 ，及Barr al 1 9 8 6，Biotechniques 4:428-432 )。一般而言，])NA 定序 作用需在鏈終結之鹼類似物存在下行模板-依賴性引子伸 展作用，造成部份片段之分佈，其接下來以大小予以區別 之。基本的二去氧定序步驟包括（i)回冷募核曾酸引子°°至1 模板，前者視所需標記；（i i)引子以DNA聚合酶於4個不同 反應中延展之，其中各自含有未標記之dMTPs及古阳日1 入百限I鏈 終結劑，如ddNTP(並視所需標記之）之混合物；b 、 及（1 1 1 )在
D:\54773.ptd 第30頁 513439 五、發明說明（25) 高解析之變性聚丙烯醯胺/尿素凝膠上解析4組反應產物。 反應產物可利用放射自顯術或螢光偵測法在凝膠上測及， 依所使用之標幟而定，且可檢測影像以推斷核贫酸序列。 這些方法利用到DNA聚合酶，如大腸桿菌P〇1 片 段或經修飾之T7 DNA聚合酶。 應用抗熱性聚合酶，如Taq DNA聚合酶，可造成以熱安 疋性DNA聚合酶定序之改進方法（見innis et al,， 1 9 8 8， 上文），及其修飾均稱為”循環定序”（Murray， 1 98 9，Nuc Acids Res· 17:8889)。和基礎二去氧定序法不同的，循 環定序法是在鏈終結子存在下，與模板序列互補之標的序 列線性且不對稱之擴大作用。單一次循環可產生所有可能 長度之伸展產物一族。伸展反應產物自DNA模板中變性 後 了在、冬結子如ddNTPs存在下發生引子回冷及引子伸展 之夕人循環循環疋序所需之模板D N A較傳統的鏈-終結定 序法少些。熱安定性DNA聚合酶在循環定上有許多優點； 其可耐受迫切的回冷溫度，此為引子與核酸標的特異雜交 所必要的，以及可耐受高溫變性之多次循環，此在各循環 中^會發生，即9 0 — 9 5 cc。基於此理由，AmpHTacP μα聚 合酶及其衍生物及descendants均包括在了叫循環定序套組 中，亚由Perkin-Elmer， Norwalk， CT 已商品化。 、'鏈終結定序法存在有二種變化型式：染蛛一引子定序及染 =/、.Ό子定序。在染料一引子定序中，ddNTP終結子並未 私圯，而利用已標記之引子來偵測伸展產物（Smi讣et al，1986’ Nature 32:6 74- 6 7 9 )。於染料 _ 終結子 DNA 定序 513439 五、發明說明（26) 中，使用MA聚合酶將dNTPs及螢光標記之ddNTPs納入Ma !!Iii(Leeeta1·，上文）。此方法所提供之優點為勿 而a成朱料標記之引子。再者，染料〜終結子反應較為合 宜，因為4個反應全可在相同試管中進行。 σ 染料-引子及染料-終結子方法均可利用自動化定序儀自 動進仃，此機器由 Applied Bi〇SyStems，Fc)ste：r 2(::Λ利案No·5,171，534，已列為本案參考）出品。 丙稀醯胺凝膠上分級分離。在機器下方之激 方；螢光產物依大小電泳在凝膠上時可測及。 4染Λ—ί結子定序中常用來標記終結子之螢光染料有 :::負電何及兩性離子登光染料。負電荷之勞光染料包 括螢光素及B0DIPY族。B0DIPY染料（4,4—二氟_4_蝴_3a 士安— = lndaCene)述於國際案N〇· W0 97/〇〇967，复已 列為本案參考。兩性離子螢光染料包括若丹明# ，垓$序套組係使用標有若丹明衍生物之終結子， 之染料，TPs分開，因…在定填力;至：膠 明毕斜竑"與疋序產物一起移動。若丹 姓構合二：子：乎可穩定富含GC區域之髮叉結構，因此 :& 產物反吊地移動。此點需使用dlTP，立可鬆他一 級結構但也影響終結子納入之效率。 一I弛一 相【為=螢光素之終結子可省去凝膠:真料前之分離步 此外，標以螢光辛之定庠遙％ :連罕較疋序產物快些。 疋序產物，其電泳移動情況較標以若
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丹明之定序產物為佳。雖然野生型Taq DNA聚 效納入標以螢光素族染料之终結子，此酶:法有 經修飾酵素可有效地完成。 匕中棱出之 因此，本發明範圍包括二去氧定序法之新穎方法，i 使用具有關鍵特色之酵素，以及進行此方法之套 ’、 個具體實例中，本發明之定序方法包括： 、，，。在一 a)提出一種重組體熱安定性])—聚合酶，其特徵在 於· Ο呈其天然型式，該聚合酶含有以下胺基酸序 列：LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 1)，其中X 是任何胺基 酸， 土 i i)在該序列中第4位置之X被突變，此係與天然 序列比較而言，除了 X未突變成E ;及 i i i)該熱安定性DNA聚合酶與天然型式比較下， 在納入標以螢光素族染料核苷酸之區別性上較為減低；及 b)進行染料-終結子定序反應。 在上述方法之較佳具體實例中，天然型式酵素具有胺基 酸序列 LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE (SEQ ID NO: 2)，其中X 是 任何胺基酸。在三字碼中，此胺基酸序列可以
LeuSerXaaXaaLeuXaalleProTyrGluGlu (SEQ ID NO: 2)表 示，由是在3位置之"Xaan是Gin或Gly，在4位置之，，Xaa，，是 任何胺基酸，且在6位置之"Xaa”是Ser或Ala。於較佳具體 實例中，天然型式胺基酸序列是LSQXLAIPYEE (SEQ ID NO: 3)，其中X是任何胺基酸。在三字碼中，此胺基酸序
D:\54773.ptd 第33頁 513439 五、發明說明（28) 列以LeuSerGlnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu (SEQ ID NO: 3)代表，由是在4位置之nXaan是任何胺基酸。在最佳具體 實例中，在4位置上之，’Xaan是1^3。 如上述，以熱安定性DNA聚合酶進行DNA定序需要非傳統 驗基類似物（充作鏈終結子）及傳統核苷酸之混合物，後者 以特定之濃度比例存在，可確保可產生代表所有可能片段 長度（歷數百鹼基長）的延伸產物族群。先前用於定序的某 些熱安定性DMA聚合酶，如野生型Taq聚合酶，其特徵在於 其可在傳統及非傳統核苷酸混合物存在下差別地納入傳統 核苷酸。然而，某些近來描述之熱安定性DNA聚合酶使非 傳統鹼基類似物與傳統鹼基之比例可由一百減至數百倍， 或可達數百倍之多。 此種聚合酶之一是Taq DNA聚合酶之F 667Y突變株。 此突變株有一者是Taq DNA聚合酶之F667Y突變株。另一 突變株是Taq DMA聚合酶，其中有一個F667Y突變及46位置 之突變，其將甘胺酸殘基改變成天冬胺酸殘基（G46D)之突 變。此突變株聚合酶已知稱為AmpliTaq，FS，由 Hoffmann-La Roche 製造，Perkin-Elmer 上市。 F 7 3 0 YTma3 0 DNA聚合酶為另一此聚合酶。此突變株聚合酶 為以下之組合：1口34〇[^聚合酶卜5 7 0核苷酸，經修飾編 碼G46D突變，及2)Tma DNA聚合酶5 7 1 - 2 6 72核苷酸，經修 飾編碼323位置處天冬胺酸至丙胺酸突變，325位置處榖胺 酸至丙胺酸突變，及730位置處笨丙胺酸至酪胺酸突變（美 國專利案系列No· 6 0 / 0 5 2 0 6 5及歐洲專利案No. 98 1 1 232 7. 6
D:\54773.ptd 第34頁 513439 五、發明說明（29) ’二者均列為本案參考）。另一納有非傳統鹼基類似物之 聚合酶是來自Thermotoga neapolitana之F730Y突變株DNA 聚合酶（國際專利案，No. W0 9 6/ 1 0 640，96/41014， 及WO 9 7/ 0 945 1，以上均列為本案參考）。利用這些酵素， 針對特定dNTP濃度，若丹明—ddNTIMf度測及之程度較先前 應用之熱文疋性DMA聚合酶可少至約5〇至數百倍。 本發明的E681K突變利用重組體])να方法與Ηβ7γ突變叙 合可產生雙重突變體Taq DNA聚合酶，可應用於實例^所 述之定序反應中。雙重突變將可應用於有螢光素標記之 料終結子之染料-終結子定序反應。結果示於實例^，顯、 不酵素可在定序反應中納入螢光素標記之染料終結子，〜 :產生可在㈣定序儀器中正確讀出之定序階梯。 地，組合E681K及F 6 6 7Y突變也可產生伸展速率^ :_突變之酵素增加3至4倍之熱安定性 由實例Π I之分析法測知。 κ。姆此可 因此在本發明^ . 方面’在本發明中鍵知之關 可與對ddNTP之區別性诗、柄々壯么4人楚夭之關鍵性特色 及未標記ddNTP效率均有所、t二給產生納入經標記 用於MA定序法中】之合酶。這些聚合酶可 在本發明的一個具體實例中，呈右心 L所定二關鍵性特色之熱安定性dna聚合酶，也；有勺 括F667Y突變之關鍵特色，述於us系列術酶也各有包 0 8/448, 2 2 3。在此呈俨奋么丨士 為〜· 徵在於： ’、體只例中，熱女定性MA聚合酶之特 η該聚合酶在其天然型式中含有第-胺基酸序列
513439 五、發明說明（30) LSXXLX(Vn)PXXE (SEQ ID NO: 1)，其中X 是任何胺基 酸， ii)在該第一胺基酸序列中，第4位置之X與天然序 列比較下係經突變的，除了 X不突變成E ;及 i i i)與天然型式比較下，該熱安性DNA聚合酶在納 入標以螢光素族染料之核苷酸之區別性上較為減低；及 iv) 該聚合酶有一個第二胺基酸序列 MRRXXKXXNYXXXYG (SEQ ID NO: 12)，其中X 是任何胺基 酸； v) 該熱安定性DNA聚合酶與天然型式比較下，納入 非傳統核苷酸之區別性較為減低。於三字碼中，第二胺基 酸序列記為 MetArgArgXaaXaaLysXaaXaaAsnTyrXaaXaaXaaTyrGly (SEQ ID NO: 12)，其中在第4，5，7，8 ’ll，12及13位置之 n Xaan是任何胺基酸。在較佳具體實例中，在第一胺基酸 序列第4位置之n Xaan突變成LyS。在較佳具體實例中，酵 素是Taq MA聚合酶，且其含有E681K&F 6 6 7Y突變。在本 %明範圍内也包括利用上述聚合酶定序之方法。 包括在本發明内的尚有利用熱安定性DNA聚合酶進行本 發明之經改善的定序方法，此酵素具有關鍵性特色，其並 非由突變而衍生，但此關鍵性特色以自然變型型式存在。 在此方面，嗜熱性細菌之DNA聚合酶含有關鍵特色，其中 第4位置之殘基並非giu。例如，在來自Therm〇t〇ga neapolitana之熱安定性dnA聚合酶中，X在關鍵特色
D:\54773.ptd 第36頁 513439 五、發明說明（3i) LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO·· 7)之第 4 位置中，其中 X 是 E以外的任何胺基酸，在此是精胺酸殘基。因此本發明提 出利用天然的熱安定性DNA聚合酶改善DNA定序方法，其中 含有胺基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 7)，其中 X是E以外的任何胺基酸。在三字碼中，此胺基酸序列可記 以LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (SEQ ID NO: 7)，其中在第3，6，9及10位置之” Xaan是任何胺基酸，且 在4位置之π X a aπ是G 1 u以外之任何胺基酸，在7位置之 nXaanSVal或Ile。在此具體實例中，本發明之定序方法 包括： a) 提出一種熱安定性DN a聚合酶，其特徵在於 i)該聚合酶含有胺基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 7)，其中在第4位置處之X是E以外之任何胺 基酸， i i )該熱安定性D N A聚合酶在納入標以螢光素族染 料之核苷酸之區別性較低；及 b) 提供標有螢光素族染料之染料—終結子；及 ◦)進行染料-終結子定序反應。 在又較佳之具體實例中，本發明的定序方法包括： a)提出一種熱安定性DNA聚合酶，其特徵在於： i)該聚合酶含有一個第一胺基酸穿列 lsxxlx(v/i)pXXE (SEQ ID N0: 7)，其中在第4 位置上
是E以外的任何胺基酸， X 1 i)該熱安定性D N A聚合酶在納入標有螢光素族九
513439 五、發明說明（32) .料之核苷酸之區別性上有所減低； i i i)該聚合物含有一段第二胺基酸序列： MRRXXKXXNYXXXYG (SEQ ID NO: 12)，其中X 是任何胺基 酸。 i v)該熱安定性Μ A聚合酶在納入非傳統核百酸之 區別性上有所減低；及 b)提出標以螢光素族染料之染料-終結子，及 c )進行染料-終結子定序反應。 又在另一較佳具體實例中，酵素含有胺基酸序列 LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE (SEQ ID NO: 13)，其中在第4位置 上之X為E以外之任何胺基酸。在三字碼中，此胺基酸序列 記以LeuSerXaaXaaLeuXaalleProTyrGluGlu (SEQ ID NO: 13)，由是在第3位置之”Xaa”是GU或Gly，在第4位置之 nXaan是Glu以外的任何胺基酸，且在第6位置處之” Xaa”是 Ser或Ala。在較佳具體實例中，胺基酸序列是 LSQXLAIPYEE (SEQ ID NO·· 14)，其中1是£以外之任何胺 基酸。在二字碼中，此胺基酸序列記以
LeuSerGlnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu (SEQ ID NO: 1 4) ’其中第4位置之π X a a ’’是G 1 u以外的任何胺基酸。 又另一較佳具體實例中，酵素具有胺基酸序列 LSVXLG(V/I)PVKE (SEQ ID NO: 15)，其仁义是£以外之任 何胺基酸。在三字碼中，此胺基酸序列記以
LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu (SEQ ID NO: 15) ’其中在第4位置之nXaan是Glu以外的任何胺基酸，且
D:\54773.ptd 第 38 頁 513439 五、發明說明（33) 在第7位置之nXaa”是Val或lie。又一較佳具體實例中，胺 基酸序列是LSVXLGVPVKE (SEQ ID NO: 16)，其中X是e以 外的任何胺基酸。在三字碼中，此胺基酸序列記以
LeuSerValXaaLeuGlyValProValLysGlu (SEQ ID NO: 1 6 ) ’其中在第4位置之” xaa”是G 1 u以外之任何胺基酸。又 一較佳具體實例中，在第4位置之” Xaa”是Arg。在又一較 佳具體實例中’胺基酸序列是乙”^以^^以印^⑽： 17)，其中X是E以外之任何胺基酸。在三字瑪中，此胺基 IDN0· 17)’其中在第4位置之"xaa”是Giu以外之任何胺 基酸。又較佳具體實例中，第4位置處之”Xaan是紅§。 —又本發明另一具體實例中，定序方法利用天然酵素進 订’其對納入標以螢光素族染料之核苷酸之區別性有減低 之水平’此水平則是利用如實例丨丨所述之ddNTp納入分析 法來偵測。決定出DNA合成達50%抑制所需之ddCTP濃度， 如同50%抑制所需之z〇wie_ddCTp濃度。並計算出 Zowi e ddCTP對ddCTP之濃度比例。在一較佳具體實例中， 比例為10以下。又較佳具體實例中，比例為4以下、。又較 佳具體貫例中，比例是1 · 2以下。 雖然此處提供之實例是使用標以螢 輯酸1其他㈣統核料及螢光染料^用也 明範圍之内。其他非傳統的核苷酸包括螢光標記之 dNTPs其可用來標記DNA合成產物，及螢光標記之 rNTPs ’其可用來標記引子伸展產物。其他染料包括其他
513439 五、發明說明（34) 負電荷之螢光染料，如BODIPY，其和螢光素在結構及化學 上相似。其他染料也包括花青苷染料。標以花青苷之 dNTPs加至標準的PCR反應中，其中包括有E681K突變（及 G4 6D突變）之Taq DNA聚合酶。標以花青苷之dNTPs意外地 發現可以較野生型酵素還高之水平，納入擴大產物之内。 因此’在此方面，標記本發明DNA之方法中是使用本發明 的天然或突變聚合酶，並組合標以負電荷之螢光染料或花 青苷染料之核苷酸。在一個具體實例中，本發明之DNA標 記方法包括： a) 提出一種熱安定性DNA聚合酶，其特徵在於 i)該聚合酶含有以下胺基酸序列
LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 7)，其中在第 4 位置處之 X 可為E以外之任何胺基酸， i i)該聚合酶在納入非傳統核哲酸之區別性較為 減低，及 ~ b) 提供標有負電荷螢光素染料之核苗酸，及 c) 進行DMA合成反應。 又另一具體實例中’本發明之DNA標記方法包括： a)提出熱安定性DNA聚合酶，其特徵在於 · i)該聚合酶含有以下胺基酸序列 LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID N0: 7)，其中在第4 位置上 可為E以外的任何胺基酸， 1 1 )該聚合酶在納入非傳統核苷酸之區別性上 為減低，及 x
D:\54773.ptd 第40胃 513439 五、發明說明（35) - b) 挺供標以花青百染料之核曾酸，及 c) 進行DNA合成反應。 又在本發明另一方面，提出一種熱安定性MA聚合酶， 其組合有可更有效納ArNTPs之突變，如Taq DNA聚合酶6· 3位置處滅胺酸至甘胺酸之突變，以及本發明之關鍵性特 色。所生成之酵素預期在納入標以螢光素族染料之核苷酸 之效力有所增加。因此，在一個具體實例中，本發明提出 重組體熱安定性DNA聚合酶，其（1)在其天然型式下，其含
有胺基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID No: 1)，其中X 是任何胺基酸，及（2 )在4位置處之X突變，如此第4位置之 X並不突變成E，及（3)也含有關鍵性區域，其有跨基酸序 列SQIXLR (V/I) (SEQ ID NO: 18)其中"X”是E以外之任何 胺基酸，及（4)可有效納入標以螢光素族染料之核糖核苷 酸。在三字碼中，該一序列以SerGlnlleXaaLeuArgXaa表 系，其中第4位置處之n X a aπ是G 1 u以外之任何胺基酸，且 在第7位置之”Xaap是Val或lie。 突變株聚合酶區域，如Taq中含有E615G及E681K突變， 矸用於產製標以螢光素族染料之引子伸展產物之改進方法 中。例如，於引子伸展反應中如PCR，rNTPs標以螢光素族 染料，可至少部份替代4個標準dNTPs之一，並包括有一個 雙重突變株聚合酶，如E681K E615G Taq MA聚合酶。突 變株聚合酶可合成引子伸展產物，其沿其長度各不同位置 町有螢光素標記之核糖核哲酸殘基。一旦加熱或驗處理， 弓丨子伸展產物在各核糖核苷酸殘基上成段片’產生一族末
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端標記之片段。此均句標記片段族 產物長度之營光標織之分佈。這此：声代表跨越引子伸展 •H 义二級標記之且特色片段可 用於以聚矽氧碎片為基礎之核酸偵測型式中？如。〇仏 =二文馬所Λ。因此於一個具體實例巾，本發明提出 才“己引子」申展產物之方法’其包括⑴提 ΜΑ聚合^其（a)在其天然型式下， 酸 LSXXL聊OPXXE⑽ID NG: η，其中χ是任何胺基 酸，（b)在第4位置之X突變’如此在第.4位置之不突變 成E，（c)也包括關鍵區域，其具胺基酸序列sqixlr(v/i) (SEQ ID NO: 18)，其中τ是£以外之任何胺基酸，且⑷ 可有效納人標以螢光素及/或花^菁曾族染料之核糖核苷 酸，及（2)進行引子伸展反應。 又在另一方面，具有本發明關鍵特色之酵素，其較野生 型酵素呈現更增加之伸展速率，如實例^所示之Ε68ΐκ F 6 6 7Y突變株。又一個具體實例中，酵素的特徵在於（〇在 其天然型式下，其含有胺基酸序列LSXXLX(v/][)pxxE (SEQ ID NO· 1)，其中χ是任何胺基酸，（2)胺基酸序列的第4位 置突變，如此X在第4位置上不突變成£，及（3)相較於野生 型酵素，其有較增加之伸展速率。在較佳具體實例中，酵 素特徵在於（1 )在其天然型式下，其含有胺基酸序列 LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 1)，其中工是任何胺基 酸’（2 )胺基酸序列在第4位置上突變，如此第4位置之X不 突變成E，及（3)其也含有胺基酸序列mrrxxkxxnyxxxyg (SEQ ID NO: 12)，其中X是任何胺基酸，及（4)有增加之
D:\54773.ptd 第42頁 513439 五、發明說明（37) 伸展速率。在較佳具體實例中，酵素的特徵在於在其 天然型式下，其含有胺基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 1)其中X是任何胺基酸，及（2)胺基酸序列在第4位 置處突變，如此在第4位置之X突變成κ。在最佳具體實例 中’酵素是Taq DNA聚合酶且含有E681K突變及F6 6 7Y突 變。包括在此方面的尚有以伸展速率增加之聚合酶定序之 方法及DNA標記，以及進行此之套組。 在依據本發明之DNA定序較佳方法中，熱安定性焦磷酸 酶也包括在反應混合物中。已示出集焦磷酸可加強定序數 據，是利用其適溫性，以及突變株熱安定性ΜΑ聚合酶， 其述於歐洲專利案，No. ΕΡ-Α- 76 3 5 9 9及美國專利No· 5， 665，551 中。 在不範之具體貫例中，本發明之熱安定性DNA聚合酶在 5’-核酸酶區域也含有一個突變，其可用來大大地減緩此 核酸酶活性。Taq聚合酶之經修飾型式述於pCT案N〇 92/0 6 2 0 0中，發表於1 9 92年4月16日’及美國專利宰n〇 5,46 6,5 9 1。在本發明具體實例中，饳位置處針對甘胺酸 殘基之密碼子已以天冬胺酸密碼子替代（G46D突變）。所生 成之酵素由於5’-核酸酶活性減少，因此在循環定序反應 中气加強之利用性。G46D突變株和野生型酵素 ，’ 合酶區域之胺基酸序列及聚合酶活性均未政變。 伞 =明之商品化具體實例中，用以實行在使 1Λ 法之套組’可視為本發明額外的部份。用於 DNA定序之此套組之一包含有： ”
513439 五、發明說明（38) a) —種熱安定性D N A聚合酶，其特徵在於： i)該聚合酶含有以下胺基酸序列LSXXLX(V/I)P〇E (SEQ ID NO: 7)，其中在第 4 位置之 乂可 為E以外之任何胺基酸， i i )該聚合酶在納入標以螢光素族染料之核苗酸 之區別性上較減低，及 b) —種染料-終結子’其標有負電荷之營光染料，且 可另外地包含有其他D N A定序試劑，如d N T P s，熱安定性焦 磷酸酶及適合的缓衝物質。在另一具體實例中，在套組中 之酵素具有胺基酸序列LSVXLG(V/I)PVKE (SEQ ID NO: 1 5 )，其中X是E以外之任何胺基酸。在三字碼中，此胺基ID NO: 15)，其中在第4位置之”Xaan是Glu以外之任何胺 基酸，且在7位置上之” Xaan是Val或lie。在較佳具體實例 中，胺基酸序列是LSVXLGVPVKE (SEQ ID NO: 16)，其中X 是E以外之任何胺基酸。在三字碼中，此胺基酸序列記以 LeuSerVa1XaaLeuG1yVa1Pr〇Va1LysG1u (SEQ ID NO: 16)，其中在第4位置上之” xaa”是E以外之任何胺基酸。又 較佳具體實例中，在第4位置之"Xaa"是Arg。又另一較佳 具體實例中，胺基酸序列是LSVXLGIPVKE (SEQ ID NO: 1 7)，其中X是E以外之任何胺基酸。在三吝碼中，此胺基 ID NO: 17)，由是在4位置上之” Xaan SGlu以外之任何胺 基酸。又較佳具體實例中，4位置之n Xaa，，是Arg。
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突變的熱安定性㈣人聚合 五、發明說明（39) 用於DNA定序之其他套組包括有 酶，其特徵在於 其含有胺基酸序列 1)，其中X是任何胺基 a)在聚合酶之天然型式下 LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO. 酸， b) 該胺基酸序列在第4位置處突變，除了在第4位置 之X未突變成E ;及 c) 忒熱女疋性DNA聚合酶在納入標以螢光素族染料之 核苷酸之區別性上較該酵素之天然型式減低，且另外包括 有可用於DNA定序之試劑，如鏈終結化合物dNTPs，埶安定 性焦磷酸及適合的緩衝物質。當終結子被標記，較佳之 標幟是螢光染料，又較佳者是負電荷之螢光染料或花青苷 染料’且最佳者是螢光族染料。在較佳之具體實例中，在 套組中之酵素具有胺基酸序列1^((3/〇)1以3/4)1?¥££(3£0 ID NO: 2)，其中X是任何胺基酸。在三字碼中，胺基酸序
列記以LeuSerXaaXaaLeuXaalleProTyrGluGlu (SEQ ID N〇: 2)，由是在第3位置之nXaa”是Gln或Gly ;nXaan在第4 位置是任何胺基酸，且第6位置處之” Xaa”是Ser或Ala。在 較佳具體實例中，胺基酸序列是1^卩11^1?丫££(3£<31〇 NO: 3)，其中X是任何胺基酸。在三字碼中，此胺基酸序 列記以LeuSerGlnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu (SEQ ID NO: 3)，其中第4位置處inXaan是任何胺基酸。在最佳具 體實例中，在第4位置處之” Xaan是Lys。 用於標記DMA之套組包括有熱安定性DNA聚合酶，其特徵
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在於（a)在其天然型式下，聚合酶含有胺基酸序列 LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: U，其中X 是任何胺基 酸，（b)在該序列4位置處之X與天然型式比較下係突^ 的，除了第4位置處之X並不突變成e，及（c)酵素在納入標 以螢光素族染料之核苷酸上，和相當的野生型酵素比較下 其區別性減低，且可額外地含有dNTPs及適合的緩衝物 質。在較佳具體實例中，第4位置之X突變成κ。產生終標 記DNA之其他套組含有a) 一種標以負電荷螢光化合物之核 苷酸或核苷酸類似物、及b) 一種天然的熱安定性Dna聚^ 酶、其具有以下關鍵特色： σ LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 7) /、中在第4位置之可為e以外之任何胺基酸，且該聚合酶納 入螢光素標記之核苷酸之區別性減低，且可額外的包括有 dNTPs及適合的缓衝物質。在較佳具體實例中，在第4位置 處之X是K。在另一較佳具體實例中，在第4位置上之$是
標記引子伸展產物之套組含有熱安定性ΜΑ聚合酶，其 特徵在於（a)在其天然型式下，聚合酶含有胺基酸序列八 UXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID N〇: n，其中X 是任何胺基 酸，（Μ在此序列第4位置之χ，和天然序列比較下是&變 的，除了在第4位置之X並不突變成E，c)軋合酶也含有第 二胺基酸序列 SQIXLR(V/I) (SEQ ID N〇: 18)其中 πχ，，是 £ 以外的任何胺基酸，d)酵素與相當的野生型比較下，在納 入標以螢光素族染料之核糖核苷酸之區別性上較為減低、、，
D:\54773.ptd 第46頁 513439 五 '發明說明（41) 且可額外地包括標以負電荷螢光化合物或花青苷化合物之 核糖核苷酸或其類似物，dNTPs及適合的缓衝物質。在較 佳具體實例中，聚合酶含有E681K突變及E615G突變。其他 產製經標記之引子伸展產物之套組包括a)標以負電荷螢光 化合物或花青苷化合物之核糖核苷酸或其類似物，及b) 一 種天然的熱安定性DNA聚合酶，其特徵在於其（i)含有具以 下胺基酸序列之關鍵特色： LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO： 7) 其中在第4位置之X為E以外的任何胺基酸，（丨丨）包含有第 二胺基酸序列SQIXLR(V/I)其中”χ”是£以外的任何胺基 酸，及（i i i)在納入螢光素標記之核糖核苷酸之區別性上 有所減低，在第一胺基酸序列中，第4位置之X是K，而在 第二胺基酸序列，X是G。在另一較佳具體實例中，於第一 胺基酸序列中，第4位置之X是R，而在第二胺基酸序列 中，X是G。 提出以下實例，但僅供說明不欲限制本發明範圍。
實例I 經修飾的Taq聚合酶基因之表現，其在納入標以螢光素族 染料之核百酸之區別性較減低 丁aq DNA聚合酶之C-末端胺基酸部份編碼聚合酶活性位 置區域（Lawyer et al·，1.9 9 3，PCR Methods and Applications 2:275-287, Freemont et al.5 1986, Proteins: Structure, Function and Genetics 1.66-73 ’其已列為本案參考）。含有此區域之dna片段自
D:\54773.ptd 第47頁 513439 五、發明說明（42) 全長的Taq基因中分離，並在錳存在下以PCR擴大作用突變 之（Leung et al,，1 9 8 9，Technique 1(1):11-15)。於此 實例，所有限制酶均購自New England Biolabs，Beverly MA。經突變的片段以Pst I及Bgl I I水解，再選殖至Taq表現 質體，pLK102，其先前已用PstI及Bglll水解。質體 PLK102 為 pLKlOl 之衍生物，其中900 bp PstI-Bglll 片段 為短的Pstl-Bglll連接子替代。質體pLKl 01為PSYC1 578之 修飾型（Lawer et al·， 1 9 93，上文及美國專利案ν〇· 5, 079, 352)，其中以在聚合酶編碼區域3，之小的 HincI I/EcoRV片段被省去。 生成的表現質體轉形至大腸桿菌N1624中（可得自e col i Genetic Stock Center，於Yale University Stain No· (CGSC#5066)，生成之轉形子針對可較野生型酵素更 有效率納入[a -32P]Tet-dCTP之能力而筛選。利用此步 驟，可鍵知突變株CS1，具有可更有效納入[α 一 32P]Tet-dCTP之能力。突變株CS1之突變的Taq表現質體以 Hindlll/Nhel水解，且生成之限制片段繼代選殖至pLK1〇1 之野生型基因中，替代未突變的Hindi II/Nhel片段，以決 定突變的Taq聚合酶基因中哪一部份負責此經改變之表現 型。含有Hindi I I/Nhel限片段且可對野生型酵素提供改變 之表現型之繼純糸’由此類顯示突變作用是在^片段之 内。接下來之縿繼代純系分析決定出突變作用是在2^5 BamH I -Nhe I 片段上。 在？〔31上進行265灿61-6&111[11片段之〇—序列分析，並
513439 五、發明說明（43) 使用TaqFS DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit(終結子循環定序套組），來自Applied Biosystems， Foster City, CA ，及Applied Biosystems Model Prism 377 MA Sequencing System (MA 定序系統）。序列分析 鍵定出在Taq聚合酶基因第681位置之胺基酸上有誤義的突 變，其使得榖胺酸殘基（E)為賴胺酸（K)殘基所取代。編號 由編碼成熟蛋白質第一個曱硫胺酸殘基之密碼子開始，如 美國專利案No· 5，079，352，在此已列為本案參考。如突 變，E681K，由密碼子序列中GAG至AAG之改變所致。質體 PCS1貯於1 9 9 7年8月28日之ATCC，具有編號No, 9852 1。 質體pCSl可在Taq聚合酶密碼序列中含有額外的突變； 然而，經由進一步的繼代選殖實驗，已決定出E681K突變 僅負青增加納入標以螢光素染料之核苷三磷酸之效率。此 點如圖1所示位在265 bp之BamHI-Nhel MA片段。在265 bp DNA片段内，E681K突變是野生型Taq聚合酶基因序列中 唯一的變化。 為進一步分析及定量核苷酸類似物納入的效率，質體 pCSl之265 bp BamHI-Nhel片段選殖至Taq表現載體，其中 在聚合酶區域内含有野生型序列，PRDA3-2。質體pRDA3-2 稱之為純系3-2，完全描述於PCT案No. W0 9 2/ 0 6 2 0 0，此 案已列為本案參考。編碼E68 1K突變以及F匕67Y突變的第二 純系，由引子-指令之突變作用及將含有突變之PCR產物選 殖至質體pRDA3-2之BamHI-Nhel位置内而生成。 表現載體PRDA3-2含有全長的Taq DNA聚合酶基因，其操
D:\54773.ptd 第49頁 513439 五、發明說明（44) 作鏈結至噬菌體APL啟動子。在載體pRDA3-2中，Taq DNA 水&酶基因之3 -核酸酶區域，在編碼甘胺酸之密碼子上 含有完突變，即第46位置，如此會減低5,—核酸酶活性 (G4 6D突變）。然而，在表現載體pRDA3_2聚合酶區域内之 基因序列，和野生型Taq DMA聚合酶基因序列相同。質 體 ’PRDA3-2，PCS1 及 E681K F6 6 7Y PCR 產物以 BamHI-Nhel 水解，且來自質體pCSl或PCR產物之2 6 5 bp ΜΑ片段連接 至載體PRDA3-2中，利用傳統方法進行。生成的質體分別 是PLK112及pLK113，再轉形至大腸桿菌DG116株中（ATCC No· 5 3 6 0 6 )。這些質體編碼熱安定性DNA聚合酶，在此分 別稱為 G46D E681K Taq 及 G46D E681K F 6 6 7K Taq。表現出 之熱安定性DMA聚合酶蛋白質G46D E681K F 6 6 7Y Taq，依 Lawyer et al·，1993，上文所述之方法純化。 G 4 6 D E 6 8 1 K T a q酵素利用如下相似但較小規模之製法純 化：除非另有所示，否則所有的步驟均在4它下進行。來自 475毫升培養物之細胞，懸浮在30毫升緩衝溶液中（5〇爪从
Tr is-HCl，pH 7. 5，1〇 EDTA，pH 8· 〇，〇_ 5 mM PefablocPSC ’0,5微克/毫升亮脉素，〇i Να -對位― 曱苯磺酿-L-賴胺酸氯曱基酮，1 mM DTT)。細胞以5〇%負 荷循環長波震盪，定在5處歷1分鐘，再於冰上冷卻丨分、 鐘。此步驟重覆二次以上。再加入1· 5毫乐4〇 ^硫酸錢， 且混合物在7 5 C之水洛中加熱1 5分鐘，再冷卻於冰上。力 入聚乙烯亞胺至0，6%，混合物再於冰上培育丨〇分鐘。混二 物以1 6，0 0 0 xg離心3 0分鐘。上清液填加至丨，8毫升體積%之"
513439 五、發明說明（45) 苯基-sepharose管柱上（Bio-rad Polyprep層析管柱），其 已用50 mM Tris-HCl ，ρΗ 7·5 ，10 mM EDTA ，pH 8.0 ， ImM DTT，0· 2 M (NH4)2S04溶液予以平衡。管柱以三種溶 液各 6 毫升洗滌：1) 25 mM Tris-HCl，pH 7,5，1 mM EDTA，1 mM DTT，0, 2 M (NH4)2S04，2) 25 mM Tris-HCl ， pH 7.5 ， 1 mM EDTA ， 1 mM DTT ，及3) 25 mM Tr is-HC1，pH 7· 5，1 mM EDTA，1 mM DTT，20% 乙二醇。 聚合酶以 6 毫升的 25 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA， 1 mM DTT，20%乙二醇，2·5 M尿素溶離。以3 m KC1將聚 合酶製劑調至100 inM KC1後，混合物填加至肝素 -sepharose 管柱（1,8 毫升體積，Bio-rad Poly-prep 管 柱），其並以 25 mM Tris-HC1，PH 7.5，1 mM EDTA，1 mM DTT，100 mM KC1平衡。經以相同緩衝物質洗滌後，樣品 以 25 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA，1 mM DTT，400 mM KC1缓衝溶液溶離。 經純化後，以Lawyer et al.，1 98 9, J. Biol. Chem. 2 64 ·· 6427- 6437所述之活性分析決定經修飾酵素之活性， 此已列為本案參考。經純化酵素之活性如下估計· 1單位酵 素相當於在30分鐘内合成10亳微莫耳產物。DNA聚合酶活 性與酵素濃度呈直線比例，達80-1 〇〇微微莫耳納入之 dCMP(酵素稀釋至〇·〇24-0.03單位/微升）。/經純化的酵素 利用於納入及定序反應中，如實例][丨—丨V所述。
實例I I 分析比較ddNTPs納入之效率
513439 五、發明說明（46)利用有限模板’引子伸展競爭分析法比較G46D F 6 6 7Y Taq ’G46D F 6 6 7Y E681K Taq 及 F 7 3 0Y Tma30 DNA 聚合酶納 入標有螢光素染料族之ddCTP之相對能力。F73 0Y Tma30 DNA聚合酶述於美國專利案系列N〇， 6 0 / 0 5 2 0 6 5之實例I (公 告於1997年7月9日）及歐洲專利案ν〇· 98112327.6，均列 為本案參考。在此競爭分析中，因為ddCTP之納入會中止 伸展反應，聚合酶納入ddCTP至伸展引子愈容易，則納入 之[a - P]dCTP愈少。因此，一旦ddCTP納入效率增加， DNA合成之抑制程度即增加。ddCTP納入效率再與螢光標記 之ddCTP之納入效率比較，以求出在特定酵素下，納入螢 光標記之ddNTP之效率評估。分析如先前所述地進行（Lawyer et al.， 1989，J， Biol· Chem· 264:6427 )但包括以下的修飾。組合分析混 合物，如此終濃度為 5〇niM Bicine，pH 8.3，25°C，2.5 mM MgCl2，lmM /9-¾ 基乙醇 9 各2〇 的 dATP，dGTP 及 dTTP/Perkm-Elmer)，20 //M dCTP (Perkin-Elmer)及 [a-33P]dCTP (New England Nuclear ’Boston，MA)。 M13mpl8 (Perkin-Elmer)回冷至引子DG48 (SEQ ID No: 10)，且在各反應中加〇· 0 8 5微微莫耳已回冷之模板至分析 混合物中。3 5微升有模板DNA之分析混合物加至3 8個〇 · 5毫 升eppendorf各管内。在25 mM CAPS0緩衝篇液，pH 9. 6中 製備Zowie-ddCTP稀釋液，如此當各1〇微升加至反應試管 内時，Zowie-ddCTP 之終濃度為3，1，〇. 5，〇, 25，〇. 125 ’0.0625//M。對 G46D F667Y Taq DMA 聚合酶而言，製備
D:\54773.ptd 第52頁 513439 五、發明說明（47)
3，1，0·5，0·25，〇·125/ζΜ Zowi e-ddCTP 各2 管。對G4 6D F 6 6 7Y E681K Taq 及 F 7 3 0Y Tma30 DNA 聚合酶而言，製備！ ’0.〇’0，25’0.125及0.0625//412〇说16-(1(10丁？各2管。留 下的8個反應管中接受1〇微升25 mM CAPS0緩衝溶液，PH 9.6。因此’38管中各含有35微升的分析混合物及；[q微升 或25 mM CAPS0緩衝溶液，ΡΗ 9·6或Zowie-ddCTP稀釋液之
對各欲測試之酵素，们傲开醇言在谷 釋液中一管及含有單獨的CAPS0缓衝溶液二管中啟動聚合 化作用。使用以下濃度之酵素，各自針對分析中受質之量 預定為適量之酵素：2· 5單位依實例I製備的F 6 6 7Y G46D
Taq DMA聚合酶；1,25單位依實例I製備的G46D F667Y， E681K Taq DNA 聚合酶；或2 單位 F73〇Y Tma3〇 DNA 聚合 酶至於背景水平之對照組，留下的負面對照組以酵素稀 釋緩衝溶液而非聚合酶開啟。所有的反應試管均立即快達 渦旋，亚在75 C下培育1〇分鐘。反應由加入1〇微升6〇 mM E D T A便停止，再貯於〇它下。 在類似實驗中，ddCTP稀釋於25 mM CAPS0缓衝溶液中， ^ 9,6，如此當各1〇微升稀釋液加至反應管内^可得到 / 〇·125 ’ 〇,0 6 25 或0·〇312 ^之終濃度。各10 量至3個〇·5毫升Eppendorf i中（各管中）， =士二有3 Y微升如上述之分析混合物。也製備4個試管， 二3有3d微升分析混合物加上1〇微升25 ^ cAps〇緩衝 κ ΡΗ 9· 6。因此，19根試管各自含有35微升分析混合
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物及各10微升25 mM CAPSO，pH 9.6或ddCTP稀釋液之一。 以2,5單位的G46DF 6 6 7YTaqDNA聚合酶，1·25單位的° G46D F 6 6 7Y Taq DMA 聚合酶或 2 單位的 F73 0Y Tma30 DNA 聚 合酶’在各ddCTP稀釋液一管中及CAPSO緩衝溶液一管中^ 始聚合化作用。其餘含有CAPS0的試管則以酵素稀釋緩衝汗 溶液而非含聚合酶之緩衝溶液開始，以充作陰性對照組。 所有的反應均立即渦旋，並在75t下培育1〇分鐘。^應^ 入10微升60 mM EDTA使停止，再貯於〇°c下。 . 在各反應中，於6 0微升反應中取50微升一份以j毫升2 mM EDTA稀釋，並有50微克/毫升經剪切之鮭魚精子⑽八為 載劑。DNA以TCA利用標準步驟沈澱，再以GF/C過濾圓片' (Whatman)收集。決定各樣品中[a—33p]dCMp納入^，並以 恶ddNTP之CAPS0樣品常規化（〇%抑制作用）。決定各樣'口中 為達5 0%抑制作用所需的ddCTP或z〇wie_ddCTp濃度，並"示 於表2中。針對特定酵素，將抑制合成達5〇%所需之ddc = 含量與Zowie-ddCTP之量比較，可反映出各酵素納入標以 螢光類似物之相對能力。這些數據顯示，在納入
Zowie-ddCTP上，G46D F 6 6 7Y Taq DNA聚合酶是三個受試 酵素中最無效率者（Zowie-ddCTP vs ddCiT於50%抑制作用 所需之濃度比例二25) cF 7 3 0Y Tma3 0 MA聚合酶納入此經 標記類似物之效率甚於G46D F 6 6 7Y Taq DMA聚合酶 (Z〇wie-ddCTP vs ddCTP於50%抑制作用所需之濃度比例 二4)，而G46D F 6 6 7Y E681K Taq DNA聚合酶納入經標記及 未標記ddCTP是以幾乎相同的效率（z〇wie_ddCTp vs CTp對
513439 五、發明說明（49) 於5 0 %抑制作用所需之濃度比例=1。2 )。 表2 5 0%抑制作用所需之Zowie-ddCTP或ddCTP之濃度（//M) DNA聚合醢 Zowie-ddCTP ddCTP Zowie-ddCTP/ddCTP G46D F667Y Taq 1.4 0.056 25 G46D F667YE681KTaq 0.14 0.116 1.2 F730Y Tma30 0.236 0.057 4 實例111 伸展速率分析 利用伸展速率分析來決定G46D F 6 6 7Y Taq及G46D F 6 6 7Y E681K Taq之伸展速率。在此實驗中，酵素用來於[α -33P]dCTP存在下，伸展回冷至Μ13模板之引子。伸展反應變 性，且產物以變性的瓊脂糖凝膠電泳分析。 分析如先前所述地進行（Lawyer et al,， 1 98 9，J. Biol · Cheme 2 64 : 642 7 )包括以下的變化。分析混合物組 合好，如此有以下之終濃度：50 mM Bicine pH 8，3，25 °(：，2.5 111从尬8(：12，111]从冷_巯基乙醇，各200//仏的 dATP ， dGTP 及dTTP (Perkin-Elmer) ， 100 dCTP (Pei'kin-Elmer)其中含有[a -33P]dCTP (New England Nuclear，Boston，MA) °M13mpl8 (Perkin:Elmer)回冷至 引子DG48，（SEQ ID NO: 11)，且0.085微微莫耳的回冷模 板加至各反應之分析混合物中。加有模板ΜA之45微升分 析混合物加至14個各自的0·5毫升Eppendorf管中。各管在
D:\54773.ptd 第55頁 513439 五、發明說明（50) ----—-—. 7 5 C下預先培育至少3 0秒，再開始聚合酶反應。 以5微升G46D F6 6 7Y Taq DNA聚合酶（25單〜位⑽
F 6 6 7Y E681K Taq DNA聚合酶（1·25單位）在14個分析管 的6個開啟聚合化作用。各酵素均如實例！般製備，且 用之濃度代表較分析中受質量過量之預定酵素量。至於北 景水平之對照組，以酵素稀釋緩衝物質而非聚合酶開啟 下的陰性對照組。所有的反應管均立即快速渦旋，再於U C下培育。6官含有G46D F 6 6 7Y Taq DNA聚合酶中取2管捭 育3分鐘，2管6分鐘，再2管1〇分鐘。類似地，以G46D ° F 6 6 7Y E681K Taq DNA聚合酶開始之試管中，2管培育3〇 秒，2管1分鐘，再2管2分鐘。對照組則培育3分鐘。反應 加10微升60 mM ΕΙΠΑ使中止，再貯於〇°c下。 各反應中，60微升反應中取一份25微升以1毫升2 mM EDTA稀釋，再以50微克/亳升剪切之鮭魚精子dnA為載劑。 DMA以TCA沉澱，利用傳統步驟進行，再以gf/C過濾圓片 (Whatman)收集。決定各樣品中納入之[〇： -33p]dCMP含量。 將留下的3 5微升各重覆組組合，7 0微升之樣品再以乙醇 沈澱，乾燥及再懸浮於50 mM NaOH，1 mM EDTA中。自各 樣品中取出一份，使取自其中之[α -33 P ]計數為等量。這 些各份再填加於0, 9%鹼瓊脂糖凝膠上，電泳，乾燥，再放 射自顯之，如先前所述（Maniatis et al.，J982， In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor，NY)。 噬菌體λ DNA以限制酶Hindi I I (BRL)切割，其5’ -端標以
D:\54773.ptd 第56頁 513439 五、發明說明（51) [32P]以充作分子量標準品。 將各樣品移動之距離與久D N A大小標準品移動之距離比 較，可決定出各樣品中伸展產物按鹼基對計之長度。將各 產物之鹼基對數且除以各伸展反應之培育期秒數，可得伸 展速率，如下述。 DNA聚合酶 時間 鹼基對/秒數 G46D F667Y Taq 3分 12.5 G46D F667Y Taq 6分 12.2 G46D F667Y Taq 10分 11.8 G46D F667Y E681K Taq 30秒 36.7 G46D F667Y E681K Taq 1分 41.7 G46D F667Y E681K Taq 2分 52.9 這些結果顯示’E681K突變之存在可增加G46D F667Y酵素 之伸展率達3至4.3倍之多。
實例I V 以G46D F667Y E681K Taq DNA聚合酶及螢光素標記之 ddNTPs循環定序 此實例證明，本發明經修飾之聚合酶在螢光素染料標記 之二去氧終結子循環定序上之應用，其中使用1 # Μ以下之 ddNTP及至少1:1〇〇之ddNTP:dNTP比例。螢光素染料標記之 二去氧終結子為得自Applied Biosystems PRISM Sequenase Terminator Sequencing Kits (Perkin-Elmer，Norwalk, CT)之試劑，且與Sequenase
D:\54773.ptd 第57頁 513439 五、發明說明（52) DNA聚合酶及α -硫dMTPs有更完善的使用。在20微升體積 中進行循環定序反應，其中含50 mM Tris-HC1 (pH 8.8)，0 mM MgCl2，各10 0 //M dATP，dCTP 及dTTP (Per k i n-E 1 mer ? Norwalk 5 CT) ? 5 0 0 /z M dITP (Pharmacia Biotech ，Piscataway ，NJ) ，0。2 微克 M13mpl8 單股DNA 模板（Perkin-Elmer)，（K15//M LacZ Forward Primer (Perk in-Elmer)，5 單位G46D F667Y E681Y Taq DNA聚合酶，20單位rTth熱安定性焦磷酸酶（歐 洲專利案，No. EP-A- 7 6 3 5 9 9，及美國專利案No. 5, 665, 551)，0.05//m Sequenase A Dye Terminator， 0.80/zM Sequenase C Dye Terminator ^0.08 //M Sequenase G Dye Terminator，及 1·0 /zM Sequenase T Dye Terminator 。所有四種Sequenase Dye Terminators 均購自Perk in-El mer。反應置於預加熱（75 °C )之Per k in-Elmer GeneAm^ PCR 系統 9600 熱循環機中， 並接受 25 個 96 3C，1 0秒，5 0 °C，5秒及6 0 °C，4分鐘的循環。染料標記之 片段以 Centri-Sep 管柱純化（princet〇n Separations， Adelphia，NJ)，依循廠商指示，並在吸空離心機中乾 燥。團塊再懸浮於6微升去離子之甲醯胺：5〇毫克/毫升 Blue 右旋糖（於 25 mM EDTA，ρΗ 8·0) 5:l(v/v)中，在90 °C下加熱3分鐘，直接填加至預電泳之4%聚^丙烯醯胺/6M尿 素凝膠上，再電泳，並於Perkin-Elmer ABI PRISM， 377 ΜΑ定序儀上分析，依廠商之操作指示進行（ab I PRISM 3 7 7 DNA sequencer User’s Manual (nDNA 定序儀使用手
D:\54773.ptd 第58頁 ^439 五、發明說明（53) 冊））。由 Perkin-Elmer ABI PRISM 3 7 7 MA 定序儀分析軟 體所進行的自動化驗基點名’可對4 5 0個鹼基達到9 8. 5 %以 上之正確性（ + 10至+ 460驗基有來自引子的6處失誤）。 序列表 (1) 一般資料 (i) 申請人： (A) 名稱：F. Hoffmann-La Roche Ltd (B) 街：Grenzacherstrasse 124
(C) 市：Base I
(D) 州：BS (E) 國家：瑞士 (F) 郵遞區號（ZIP) : CH-40 7 0 (G) 電話：（ 0 ) 6 1 688 24 0 3 (H) 傳真：（0)61 688 13 95 (I) 電報交換：9 6 2 2 9 2 / 9 6 5 5 1 2 hlr ch (ii) 發明名稱：經改變之定序用熱安定DN A聚合酶 (i i i)序列數目：1 8 (iv)電腦可讀型式 (A) 介質型式：軟式磁碟 (B) 電腦·· IBM PC可相容 (C) 操作系統：pc-dos/MS-DOS 一 (D) 軟體：p a t e n 11 n R e 1 e a s e # 1 · 0，V e r s i ο η # 1. 3 0 (EPO) (vi)先前申請數據：
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第59頁 513439 五、發明說明（54) (A) 中請號：US 6 0 / 0 5 2, 0 6 5 (B) 立檔日期：09-JUL-1997 (2)SEQ ID NO: 1 之資料 (i)序列特色： (A) 長度：11胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (C) 股性：單股 (D) 拓樸學：線性 (i i)分子型式：肽 (i X)特色： (A) 名稱/關鍵··區域 (B) 位置·· 7 (D)其他資料：/標幡= Xaa /註=π在7位置處之Xaa是Val或Ilen。 (X i)序列說明：S E Q I D N 0 : 1 ·· Leu Ser Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Pro Xaa Xaa G1 u 1 5 10 (2)SEQ ID NO: 2 資料 (i)序列特色： (A)長度：11個胺基酸 (B )型式：胺基酸 一 (C) 股性：單股 (D) 拓樸學：線性 (i i)分子型式：肽
D:\54773.ptd 第60頁 513439 五、發明說明（55) (i X )特色： (A)名稱/關鍵：區域 (B )位置：3 · . 6 (D)其他資料：/標幟= Xaa /註二'’在3位置處之Xaa是Gin或Gly在6位置處之Xaa是 S e r或A 1 a丨丨。 (xi)序列說明：SEQ ID N0:2: Leu Ser Xaa Xaa Leu Xaa lie Pro Tyr Glu G1 u 1 5 10 (2)SEQ ID NO: 3 之資料 (i)序列特色： (A) 長度：11胺基酸 (B) 型式：胺基酸 .(C)股性：單股 (D)拓樸學：線性 (i i )分子型式：脉 (xi)序列說明：SEQ ID NO·· 3: Leu Ser Gin Xaa Leu Ala lie Pro Tyr Glu Glu 1 5 10 (2)SEQ ID N0:4 之資料 (i)序列特色： _ (A) 長度：11胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (C) 股性：單股
D:\54773.ptd 第61頁 513439 五、發明說明（56) (D)拓樸學：線性 (i i)分子型式：肽 (ix)特色： (A) 名稱/關鍵：區域 (B) 所在：7 (D)其他資料：/標幟= Xaa /註在7位置處之xaa是Val或Ilen。 (xi)序列說明：SEQ ID N0:4: Leu Ser Val Xaa Leu Gly Xaa Pro Val Lys Glu 1 5 10 (2)SEQ ID NO: 5 資料 (i)序列特色： (A) 長度：11胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (C) 股性：單股 (D) 拓樸學··線性 (i i)分子型式：脉 (X i)序列說明：S E Q I D N 0 : 5 : Leu Ser Val Xaa Leu Gly Val Pro Val Lys Glu 1 5 10 (2)SEQ ID NO: 6 資料 一 (i)序列特色： (A) 長度：11胺基酸 (B) 型式：胺基酸
D:\54773.ptd 第62頁 513439 五、發明說明（57) (C) 股性：單股 (D )拓樸學：線性 (i i )分子型式：狀 (xi)序列說明：SEQ ID N0:6: Leu Ser Val Xaa Leu Gly lie Pro Val Lys Glu 1 5 10 (2)SEQ ID NO: 7 資料 (i)序列特色： - (A) 長度：11胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (C )股性：單股 (D) 拓樸學：線性 (i i)分子型式：肽 (i X)特色： (A) 名稱/關鍵：區域(B) 所在：4· , 7 (D)其他資料：/標幟jaa /註在4位置處之Xaa是榖胺酸殘基以外之任何胺基酸 在第7位置處之xa a是Val或lie1’。 (xi)序列說明：SEQ ID Ν0:7·. Leu Ser Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Pro Xaa^ Xaa Glu 1 5 10 (2)SEQ ID NO:8 資料 (i )序列特色：
D:\54773. ptd 第63頁 513439 五、發明說明（58) (A) 長度：11胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (C )股性：單股 (D)拓樸學：線性 (i i)分子型式：肽 (i X)特色： (A) 名稱/關鍵：區域 (B) 所在：4 (D)其他資料：/標幟= Xaa /註=π在4位置處之Xaa是Glu以外的任何胺基酸π。 (xi)序列說明：SEQ ID Ν0:8: Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu 1 5 10 (2)SEQ ID NO: 9 之資料 (i)序列特色： (A) 長度：11胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (C) 股性：單股 (D) 拓樸學：線性 (i i)分子型式：脉 (IX)特色： 破 (A)名稱/關鍵：區域 (B )所在：2 · · 5 (D)其他資料：/標幟= Xaa
D:\54773.ptd 第64頁 513439 五、發明說明（59) /δ主-在2位置處之Xaa是Ser或Ala，在4位置處之Xaa是 Glu以外的任何胺基酸，在5位置之Xaa是Leu或Ilen。 (xi)序列說明：SEQ ID N0:9: Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu 1 5 10 (2)SEQ ID NO: 10 之資料 (i)序列特色： (A)長度：11胺基酸 (B )型式：核酸 (C) 股性：單股 (D) 拓樸學：線性 (i i)分子型式··肽 (ix)特色 (A) 名稱/關鍵··區域‘ (B) 所在：4 (D)其他資料：/標幟= Xaa /註=π在4位置處之X a a是G 1 u以外的任何胺基酸π。 (xi)序列說明：SEQ ID NO: 10 Leu Ser Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu 1 5 10 (2)SEQ ID NO: 11 資料 ♦ (i)序列特色： (A) 長度：30個絵:基酸 (B) 型式：核酸
D:\54773.ptd 第65頁 513439 五、發明說明（60) (C) 股性：單股 (D) 拓樸學：線性 (ii)分子型式：DNA(基因體） (xi)序列說明：SEQ ID NO: 11 : GGGAAGGGCG ATCGGTGCGG GCCTCTTCGC (2)SEQ ID NO: 12 資料 (i)序列特色： (A) 長度：15個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (C) 股性：單股 (D) 拓樸學：線性 (ii)分子型式：肽 (xi)序列說明：SEQ ID NO·· 12: Met Arg Arg Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Asn Tyr Xaa Xaa 1 5 10 Xaa Tyr G 1 y 15 (2)SEQ ID NO: 13 之資料 (i)序列特色： (A) 長度：11胺基酸 (B) 型式：胺基酸 一 (C) 股性：單股 (D) 拓樸學：線性 (i i)分子型式：妝
D:\54773.ptd 第66頁 513439 五、發明說明（61) (i X )特色： (A) 名稱/關鍵：區域 (B) 所在：3 · . 6 (D)其他資料：/標幟= Xaa /註在3位置處之Xaa是Gin或Gly，在4位置處之Xaas Gin或Gly，在4位置之Xaa是Glu以外的任何胺基酸，在6 位置處之Xaa是Ser或Alan。 (xi)序列說明：SEQ ID NO: 13:
Leu Ser Xaa Xaa Leu Xaa lie Pro Try Glu Glu 1 5 10 (2)SEQ ID NO: 14 之資料 (i )序列特色： (A) 長度：1 1胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (C) 股性：單股 (D) 拓樸學：線性 (i i )分子型式：肽 (ix)特色： (A)名稱/關鍵：區域 (B )所在：4 (D)其他資料：/標幟= Xaa _ /註=π在4位置處之X a a是G 1 u以外的任何胺基酸”。 (xi)序列說明：SEQ ID NO: 14:
Leu Ser Gin Xaa Leu Ala lie Pro Tyr Glu Glu
D:\54773.ptd 第 67 頁 513439 五、發明說明（62) 1 5 10 (2)SEQ ID NO:15 之資料 (i)序列特色： (A) 長度：11胺基酸 (B) 型式··胺基酸 (C) 股性：單股 (D) 拓樸學：線性 (i i )分子型式：肽 (i X)特色： (A) 名稱/關鍵：區域 (B) 所在：4· · 7 (D)其他資料：/標幟= Xaa /註=π在4位置處之Xaa是Glu以外的任何胺基酸，在7 位置處之Xaa是Val或I le”。 (X i)序列說明：S E Q ID N 0 : 1 5 : Leu Ser Va 1 Xaa Leu Gly Xaa Pro Va1 Lys Glu 1 5 10 (2)SEQ ID NO:16 之資料 (i)序列特色： (A) 長度：11胺基酸 (B) 型式：胺基酸 一 (C) 股性：單股 (D) 拓樸學：線性 (i i)分子型式：肽
D:\54773.ptd 第68頁 513439 五、發明說明（63) (i X)特色： (A) 名稱/關鍵：區域 (B) 所在：4 (D)其他資料：/標幟= Xaa /註=π在4位置處之Xaa是Glu以外的任何胺基酸π。 (xi)序列說明：SEQ ID NChl6: Leu Ser Va 1 Xaa Leu G1y Va 1 Pro Va 1 Lys G 1 u 1 5 10 (2)SEQ ID NO: 17 之資料 (i )序列特色： (A) 長度：11胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (C) 股性：單股 (D )拓樸學：線性 (i i)分子型式：肽 (i X)特色： (A) 名稱/關鍵：區域 (B) 所在：4 (D) 其他資料：/標幟= Xaa /註在第4位置處之Xaa是Glu以外的任何胺基酸”。 (xi)序列說明：SEQ ID NO: 17: - Leu Ser Va 1 Xaa Leu Gly lie Pro Va 1 Lys Glu 1 5 10 (2)SEQ ID NO: 18 之資料
D:\54773. ptd 第69頁 513439 五、發明說明（64) (i )序列特色： (A) 長度：7個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (C) 股性：單股 (D) 拓樸學：線性 (i i )分子型式：妝 (i X)特色： (A) 名稱/關鍵：區域 (B) 所在：4 · · 7 (D)其他資料：/標幟= Xaa /註」在位置4處之Xaa是Glu以外的任何胺基酸，在7 位置處之Xaa是Val或lie”。 (xi)序列說明：SEQ ID N0:18: Ser Gin lie Xaa Leu Arg Xaa
D:\54773. ptd 第70頁 513439 案號87114826 A丨年心月 曰 修正
O:\54\54773.ptc 第71頁

Claims (1)

  1. 種重組喊令安定itctna聚合酶，其特徵在於 a) 在其天然型式下，該聚合酶含有以下胺基酸序 LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (SEQ ID Ν〇· 列 其中在3、4、6、9及10位置處之"Xaa"為任何胺基酸U ’ 基，且在7位置處之” Xaan是Val或I le ; 篆 b) 與該天然序列比較下，在4位置處之"xaa"被今 變，除了在4位置處之13&”不突變成6111;及 大 c )該熱安定性D N A聚合酶在對納入標以螢光素％ 之核苷酸之區別性上較天然聚合酶型式係低3倍至丨〇 '染料 2 ·根據申請專利範圍第1項之重組體熱安定性d n a $ 酶，其中該核苷酸是二去氧核苷酸，且該區別性二合 合酶之天然型式低3倍。 ^ &水+較聚 3 ·根據申請專利祀圍第2項之重組體熱安定性d n a $ 酶’其中該區別性水平之偵測係由決定標以螢光素f合 二去氧核苷酸為達D N A合成5 0 %抑制作用所需之濃^朱料之 4 ·根據申請專利範圍第2項之重組體熱安定性^伸。 酶，其中該聚合酶係來自選來自下列之嗜熱菌屬，^合 洲高熱桿菌（Thermos i pho af r i c^n us)， 鉗古、、曰# ^括非 (Baci Uus ca Uotenax)及嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bac丨u干囷 stearothermophi lus) 〇 " 5·根據申請專利範圍第2項之重組體熱安定性DNA聚合 酶’其中該聚合酶來自棲熱菌屬(Themni^ species)" 6 ·根據申請專利範圍第5項之重組體熱安定性D N a聚合 酶，其特徵在
    O:\54\54773-910703.ptc 第72頁 513439 案號87114826 年1月 曰 修正 六、申請專利範圍 a) 在其天然型式下，該聚合酶含有以下胺基酸序列 LeuSerXaaXaaLeuXaalleProTyrGluGlu (SEQ ID NO: 2) ，其中在3位置處之” Xaan SGln或Gly，在4位置處之"Xaan 為任何胺基酸，在6位置處inXaa"是Ser或Ala， b) 在位置4處之n Xaan與天然序列比較下是突變的， 除了4位置處之nXaan並不突變成Glu ;及 c) 該熱安定性DNA聚合酶在對納入標以螢光素族染料 之核苷酸，其區別性係低於聚合酶天然型式3倍至1 0倍。 7·根據申請專利範圍第6項之重組體熱安定性DNA聚合 酶，其特徵在於 a) 在其天然型式下，該聚合酶含有以下胺基酸序列 LeuSerGlnXaaLeuAlelleProTryGluGlu (SEQ ID NO: 3)， 由是在4位置處之”xaa"是任何胺基酸， b) 在位置4處之n Xaan與天然序列比較下是突變的， 除了位置4inXaa"不突變成Glu ;及 c) 該熱安定性DNA聚合酶在對納入標以螢光素族染料 之核苷酸，其區別性係低於聚合酶天然型式3倍至1 〇倍。 8·根據申請專利範圍第7項之重組體熱安定性DNA聚合 酶，其特徵在於在位置4之'1 Xaa”被突變成Lys。 9.根據申請專利範圍第2項之重組體熱安定性DNA聚合 酶’其中該聚合酶來自棲熱孢菌屬（Thermotoga)。 1 0 ·根據申請專利範圍第9項之重組體熱安定性D N A聚合 酶，其特徵在於 a)在其天然型式下，該聚合酶含有以下胺基酸序列
    O:\54\54773-910703.ptc 第73頁 513439 __案號87114826 年月 Β 修正_— 六、申請專利範圍 LeuSerVa lXaaLeuG1yXaaProVa1LysG1y (SEQ ID NO: 4) 5 其中在位置4處之n Xaan是任何胺基酸，且在位置7之” Xaa" 是Val 或Ile ， b )在位置4處之π X a a"與天然序列比較下是突變的， 除了在位置4inXaa"不突變成Glu ;及 c)該熱安定性MA聚合酶在對納入標以螢光素族染料 之核脊酸上，其區別係低於聚合酶之天然型式3倍至1 ' 倍。 11·根據申請專利範圍第10項之重組體熱安定性DNA ^人 酶，其中SEQ ID N0:4之胺基酸序列在位置4處之，，' ϋ 為Arg 。 aa係 項 1 2 · —種核酸序列，其編碼根據申請專利範圍第 中任一項之重組體熱安定性ON A聚合酶。 至11 13· —種DNA定序之方法，此方法包括： (a)提出根據申請專利範圍第1至1 1項中任_ 組體熱安定性DNA聚合酶； 壬 項之重 及 (b )提出標以負電荷螢光染料之染料〜终& (c )進行染料-終結子定序反應。 、…子； 1 4·根據申請專利範圍第1 3項之方法，其中 定性DNA聚合酶在對納入標以螢光素族染料之，體熱安 別性係低於聚合酶天然型式3倍至1 〇倍，且其^脊酸之區 是二去氧核苷酸，且區別性水平之偵測係由決中―的核苷酸 素染料之二去氧核苷酸為達DNA合成50%抑制^ =樑以鸯光 未標記二去氧核苷酸達5 〇%抑制所需之濃度之需之濃度= tb例而得V、
    O:\54\54773-910703.ptc 第74頁 513439 _案號87114826 年^月 日 修正__ 六、申請專利範圍 1 5 .根據申請專利範圍第1 4項之方法，其中該比例為1至 4 〇 16. —種產生經標記DNA之方法，此方法包括： a) 提出根據申請專利範圍第1至1 1項中任一項之重 組體熱安定性DNA聚合酶； b) 提出標以螢光素族染料之核苷酸；及 c) 進行DNA合成反應。 17. —種產生經標記之引子伸展產物之方法，此方法包 括： . a) 提出根據申請專利範圍第1至1 1項中任一項之重 組體熱安定性DNA聚合酶； i ) 該聚合酶含有以下胺基酸序列 LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu (SEQ ID NO: 4)， 其中在位置4處之nXaan可為Glu以外的任何胺基酸，且此 序列位置7之nXaan是Val或lie， i i ) 該聚合酶在對納入標以螢光素族染料之核苷 酸之區別性有低的水平； iii) 該聚合酶也含有第二胺基酸序列SQIXLRCV/I) (SEQ ID NO: 18)其中ΠΧ"是E以外的任何胺基酸， i ν ) 該聚合酶在對納入標以螢光素族染料之核糖 核苷酸之區別性係低於聚合酶天然型式3倍至1 0倍； b) 提出標以螢光素族染料之核糖核苷酸，及 c) 進行引子伸展反應。 1 8.根據申請專利範圍第1至1 1項中任一項之重組體熱安
    O:\54\54773-910703.ptc 第75頁 513439 案號 87114826 月 曰 修正 六、申請專利範圍 定性DNA聚合酶，其係用於試管内DMA合成之應用，如DNA 定序，經標記DΝΑ之合成，及經標記的引子伸展產物之產 生。 19. 一種用於DNA定序之套組，其中包括有如申請專利範 圍第1至11項中任一項之重組體熱安定性DNA聚合酶，及標 以負電荷螢光染料之終結子。 2 0 .根據申請專利範圍第1 9項之套組，其中重組體熱安 定性D Ν Α聚合酶在對納入標以螢光素染料之核苷酸的區別 性係低於聚合酶天然型式3倍至1 0倍，且此區別性減低水 平之偵測係決定標以螢光素族染料之ddNTP為達DNA合成 5 0%抑制所需之濃度與未標記之ddNTP之比例而得，且該比 例是1至4。 2 1 .根據申請專利範圍第2 0項之套組，其中該區別性水 平較聚合酶天然型式低5倍。 2 2 . —種產生經標記D Ν A之套組，其中含有根據申請專利 範圍第1至11項中任一項之重組體熱安定性DN A聚合酶及標 以負電荷螢光染料之核苷酸。 2 3. —種產生經標記之引子伸展產物之套組，其中含根 據申請專利範圍第1至11項中任一項之重組體熱安定性DN A 聚合酶，及標以螢光素族染料之核糖核苷酸。 Φ
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