MX2012013959A - Adn polimerasas con dicriminacion incrementada de apareamiento erroneo en el extremo 3'. - Google Patents

Adn polimerasas con dicriminacion incrementada de apareamiento erroneo en el extremo 3'.

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MX2012013959A
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Fred L Reichert
Keith A Bauer
Thomas W Myers
Nancy J Schoenbrunner
Joseph San Filippo
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Hoffmann La Roche
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Abstract

Se dan a conocer ADN polimerasas mutantes que tienen discriminación incrementada de apareamiento erróneo en el extremo 3´ con relación a una polimerasa no modificada, correspondiente. Las polimerasas mutantes son útiles en una variedad de métodos de extensión de cebadores dados a conocer. También se dan a conocer composiciones relacionadas, que incluyen ácidos nucleicos recombinantes, vectores y células hospedantes, los cuales son útiles, por ejemplo, para la producción de las ADN polimerasas mutantes.

Description

ADN POLIMERASAS CON DISCRIMINACION INCREMENTADA DE APAREAMIENTO ERRONEO EN EL EXTREMO 3' Campo de la Invención La presente invención proporciona ADN polimerasas con discriminación incrementada de apareamiento erróneo en el extremo 3' y su uso en varias aplicaciones, que incluyen la extensión y amplificación de polinucleótidos de ácido nucleico.
Antecedentes de la Invención Las ADN polimerasas son responsables de la replicación y el mantenimiento del genoma, un papel que es central para transmitir de manera exacta la información genética de generación en generación. Las ADN polimerasas funcionan en células como las enzimas responsables de la síntesis de ADN. Estas polimerizan los trifosfatos de desoxirribonucleósido en presencia de un activador de metal, tal como Mg2+, en un orden dictado por la plantilla de ADN o plantilla de polinucleótido que es copiada. In vivo, las ADN polimerasas participan en un espectro de procesos sintéticos de ADN que incluyen la replicación de ADN, reparación de ADN, recombinación y amplificación génica. Durante cada proceso sintético de ADN, la plantilla de ADN es copiada una vez o a lo sumo algunas veces para producir réplicas idénticas. En contraste, in vitro, la replicación de ADN se puede repetir REF : 237481 muchas veces tal como, por ejemplo, durante la reacción en cadena de la polimerasa (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 4,683,202).
En los estudios iniciales con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) , la ADN polimerasa se agregó al inicio en cada periodo de replicación de ADN {véase la Patente de los Estados Unidos No. 4,683,202, supra) . Subsecuentemente, se determinó que las ADN polimerasas termoestables podrían obtenerse a partir de bacterias que crecen a temperaturas elevadas y que es necesario que estas enzimas sean agregadas solo una vez (véase la patente de los Estados Unidos No. 4,889,818 y la Patente de los Estados Unidos No. 4,965,188). A las temperaturas elevadas que se utilizan durante la PCR, estas enzimas no son inactivadas irreversiblemente. Como resultado, uno puede llevar a cabo ciclos repetitivos de reacciones en cadena de la polimerasa sin agregar enzimas nuevas al inicio de cada proceso de adición sintético. Las ADN polimerasas, particularmente las polimerasas termoestables, son la clave para un gran número de técnicas en estudios de ADN recombinante y en la diagnosis médica de una enfermedad. Para aplicaciones de diagnóstico en particular, una secuencia de ácido nucleico objetivo puede ser únicamente una pequeña porción del ADN o ARN en cuestión, de modo que puede ser difícil detectar la presencia de una secuencia de ácido nucleico objetivo sin la amplificación.
El patrón de plegamiento global de las ADN polimerasas se asemeja a la mano derecha humana y contiene tres subdominios distintos de palma, dedos y dedo pulgar. {Véase Beese y colaboradores, Science 260:352-355, 1993); Patel y colaboradores, Biochemistry 34:5351-5363, 1995). Mientras que la estructura de los subdominios de dedos y dedo pulgar varía en gran medida entre las polimerasas que difieren en tamaño y en funciones celulares, los subdominios catalíticos de palma son todos sobreponibles . Por ejemplo, la porción A, la cual interactúa con el dNTP entrante y estabiliza el estado de transición durante la catálisis química, es sobreponible con una desviación media de aproximadamente un Á entre ADN polimerasas de la familia pol a de mamífero y la familia pol I procariótica (Wang y colaboradores, Cell 89:1087-1099, 1997). La porción A comienza estructuralmente en la cadena ß antiparalela que contiene residuos predominantemente hidrófobos y continúa hasta una hélice a. La secuencia de aminoácidos primaria de sitios activos de ADN polimerasa se conserva excepcionalmente . En el caso de la porción A, por ejemplo, la secuencia DYSQIELR (SEC ID NO: 28) es retenida en polimerasas de organismos separados por muchos millones de años de evolución que incluyen, por ejemplo, Therm s aquaticus, Chlamydia trachomatis y Escherichia coli.
Además de ser bien conservado, también se ha mostrado que el sitio activo de ADN polimerasas es relativamente mutable, capaz de incorporar ciertas sustituciones de aminoácidos sin reducir significativamente la actividad de ADN polimerasa. {Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,602,695). Estas ADN polimerasas mutantes pueden ofrecer varias ventajas selectivas en, por ejemplo, aplicaciones de diagnóstico y de investigación que comprenden reacciones de síntesis de ácido nucleico. De esta manera, existe la necesidad en el campo de la identificación de posiciones de aminoácidos factibles para la mutación para producir actividades mejoradas de polimerasa. La presente invención, como se expone en este documento, satisface estas y otras necesidades.
Breve Descripción de la Invención En este documento se proporcionan ADN polimerasas que tienen una discriminación incrementada de apareamiento erróneo en el extremo 3' en relación con una polimerasa de control no modificada, correspondiente y métodos para hacer y utilizar estas ADN polimerasas. En algunas modalidades, la polimerasa es una ADN polimerasa termoestable . En algunas modalidades, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa termoactiva. En algunas modalidades, la ADN polimerasa de la presente invención se deriva de una especie Thermus . En algunas modalidades, la ADN polimerasa se deriva de una especie Thermotoga.
De acuerdo con la invención, se descubrió que el aminoácido de la ADN polimerasa que corresponde a la posición 493 de la SEC ID N0:1 puede ser mutado del aminoácido nativo en esa posición para producir una enzima que tiene una discriminación incrementada de apareamiento erróneo en el extremo 3' en relación con una polimerasa de control no modificada, correspondiente. En las ADN polimerasas derivadas de una especie Thermus, el aminoácido nativo que corresponde a la posición 493 de la SEC ID NO:l es E. En las ADN polimerasas derivadas de una especie Thermotoga, el aminoácido nativo que corresponde a la posición 493 de la SEC ID N0:1 es S. En las ADN polimerasas derivadas de otras especies que no son Thermus y que no son Thermotoga, el aminoácido correspondiente a la posición 493 de la SEC ID NO:l puede ser un aminoácido diferente de E o S, por ejemplo, A o G. Véase la Figura 1.
En algunas modalidades, el aminoácido de la ADN polimerasa que corresponde a la posición 493 de la SEC ID NO:l es cualquier aminoácido diferente de E, S, A o G y la ADN polimerasa de control tiene la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa excepto que el aminoácido de la ADN polimerasa de control que corresponde a la posición 493 de la SEC ID NO:l es E, S, A o G. Por ejemplo, en algunas modalidades, el aminoácido en la posición que corresponde a la posición 493 de la SEC ID NO:l se selecciona de V, L, I, M, F, W, P, T, C, Y, N, Q, D, K, R o H.
Sin embargo, se descubrió además que la inserción de A o G (el aminoácido nativo en algunas especies que no son Thermus y no son Thermotoga) en lugar de E en la posición 493 de las polimerasas de Thermus también incrementó la discriminación de apareamiento erróneo en el extremo 3'. De esta manera, en algunas modalidades, la ADN polimerasa de la invención se deriva de una especie Thermus y el aminoácido de la ADN polimerasa que corresponde a la posición 493 de la SEC ID NO:l es cualquier aminoácido diferente de E y la ADN polimerasa de control tiene la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa excepto que el aminoácido de la ADN polimerasa de control que corresponde a la posición 493 de la SEC ID NO:l es E. Por ejemplo, donde la ADN polimerasa se deriva de una especie Thermus;, el aminoácido en la posición que corresponde a la posición 493 de la SEC ID NO:l se puede seleccionar de S, A, G, V, L, I, M, F, W, P, T, C, Y, N, Q, D, K, R o H. En algunas modalidades, el aminoácido en la posición que corresponde a la posición 493 de la SEC ID NO:l se selecciona de S, A, Q, G, K o R. En algunas modalidades, el aminoácido en la posición que corresponde a la posición 493 de la SEC ID NO:l se selecciona de A, G, K o R. En algunas modalidades, el aminoácido en la posición que corresponde a la posición 493 de la SEC ID NO:l es K.
En algunas modalidades, la ADN polimerasa de la invención se deriva de una especie Thermus y el aminoácido que corresponde a la posición 493 de la SEC ID N0:1 es un aminoácido que tiene una cadena lateral sin carga, polar (por ejemplo N, Q, H, S, T o Y) , una cadena lateral sin carga, no polar (por ejemplo G, A, L, M, , P, F, C, V o I) o una cadena lateral con carga positiva, polar (por ejemplo, R o K) en pH neutro. En algunas modalidades, el aminoácido que corresponde a la posición 493 de la SEC ID N0:1 que tiene una cadena lateral sin carga, no polar es A o G. En algunas modalidades, el aminoácido que corresponde a la posición 493 de la SEC ID NO-.l que tiene una cadena lateral con carga positiva, polar es R o K. En algunas modalidades, el aminoácido que corresponde a la posición 493 de la SEC ID NO:l que tiene una cadena lateral con carga positiva, polar es K.
Además, de acuerdo con la invención otros aminoácidos, localizados cerca del aminoácido que corresponde a la posición 493 de la SEC ID NO:l, también pueden ser mutados para producir una enzima que tiene una discriminación incrementada de apareamiento erróneo en el extremo 3'. en relación con una polimerasa de control no modificada, correspondiente. Por ejemplo, las mutaciones en aminoácidos que corresponden a las posiciones 488 y/o 497 de la SEC ID N0:1 también producen una enzima que tiene una discriminación incrementada de apareamiento erróneo en el extremo 3' en relación con una polimerasa de control no modificada, correspondiente .
En algunas modalidades, la ADN polimerasa que tiene discriminación mejorada de apareamiento erróneo en el extremo 3' comprende una oporción en el dominio de polimerasa que comprende A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-Xio-R-V-L-Xi3-D-E-L, en donde : X6 es S, G, A, D, F, K, C, T o Y; Xio es cualquier aminoácido diferente de E; Xi3 es F, A, G, S, T, Y, D o K (SEC ID NO: 8) .
En algunas modalidades, Xi0 se selecciona de L, M, W, P, T, F, Y, C, N, D, V, I, R, K, Q, H, S, A o G.
En algunas modalidades, Xi0 se selecciona de R, K, A O G (SEC ID NO: 49) .
En algunas modalidades, la ADN polimerasa que tiene discriminación mejorada de apareamiento erróneo en el extremo 3' comprende una oporción en el dominio de polimerasa que comprende A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-Xio-R-V-L-F-D-E-L, en donde: X10 es cualquier aminoácido diferente de E (SEC ID NO : 9) .
En algunas modalidades, X10 se selecciona de L, M, W, P, T, F, Y, C, N, D, V, I, R, K, Q, H, S, A o G.
En algunas modalidades, ??0 se selecciona de , K, A o G (SEC ID NO: 50) .
En algunas modalidades, la ADN polimerasa que tiene discriminación mejorada de apareamiento erróneo en el extremo 3' comprende una oporción en el dominio de polimerasa que comprende A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-Xio-R-V-L-F-D-E-L, en donde: X10 es A, G, K O R (SEC ID NO: 10) .
En algunas modalidades, de la ADN polimerasa Xi0 se selecciona de L, M, W, P, T, F, Y, C, N, D, V, I, R, K, Q, H, S, A o G.
En algunas modalidades, de la ADN polimerasa se selecciona de A, G, K o R (SEC ID NO: 50) .
En algunas modalidades, de la ADN polimerasa se selecciona de A o G.
En algunas modalidades, la ADN polimerasa que tiene discriminación mejorada de apareamiento erróneo en el extremo 3' comprende una oporción en el dominio de polimerasa que comprende A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-Xio-R-V-L-F-D-E-L, en donde: X10 es K (SEC ID NO: 11) .
En algunas modalidades, el aminoácido de la ADN polimerasa que corresponde a la posición 580 de la SEC ID NO:l es cualquier aminoácido diferente de D o E . En algunas modalidades, el aminoácido de la ADN polimerasa que corresponde a la posición 580 de la SEC ID NO:l es cualquier aminoácido diferente de D. En algunas modalidades, el aminoácido de la ADN polimerasa que corresponde a la posición 580 de la SEC ID NO:l se selecciona del grupo que consiste de L, G, T, Q, A, S, N, R y K. En algunas modalidades, el aminoácido de la ADN polimerasa que corresponde a la posición 580 de la SEC ID NO:l es G.
En algunas modalidades, la ADN polimerasa de acuerdo con la invención comprende además una porción que comprende T-G-R-L-S-S-X7-X8-P-N-L-Q-N; en donde X7 es Ser (S) o Thr (T) ; y X8 es cualquier aminoácido diferente de D o E (SEC ID NO: 27) .
En algunas modalidades, el aminoácido que corresponde a la posición X8 se selecciona del grupo que consiste de L, G, T, Q, A, S, N, R y K (SEC ID NO:51).
En algunas modalidades, la ADN polimerasa comprende además una mutación en uno o más aminoácidos que corresponden a la posición seleccionada de 488 y/o 497 SEC ID NO:l. En algunas modalidades, el aminoácido de la ADN polimerasa que corresponde a la posición 488 de la SEC ID NO.-l es cualquier aminoácido diferente de S. En algunas modalidades, el aminoácido de la ADN polimerasa que corresponde a la posición 488 de la SEC ID NO:l se selecciona de G, A, V, L, I, M, F, W, P, E, T, C, N, Q, D , Y, K, R o H. En algunas modalidades, el aminoácido de la ADN polimerasa que corresponde a la posición 488 de la SEC ID N0:1 es G, A, D, F, K, C, T o Y. En algunas modalidades, el aminoácido de la ADN polimerasa que corresponde a la posición 497 de la SEC ID N0:1 es cualquier aminoácido diferente de F o Y. En algunas modalidades, el aminoácido de la ADN polimerasa que corresponde a la posición 497 de la SEC ID N0:1 se selecciona de R, V, L, I, M, W, P, T, C, N, D, E, S, A, G, K, E o H. En algunas modalidades, la ADN polimerasa se deriva de especies Thermus y el aminoácido de la ADN polimerasa que corresponde a la posición 497 de la SEC ID NO:l es cualquier aminoácido diferente de F. De esta manera, en algunas modalidades, el aminoácido de la ADN polimerasa que corresponde a la posición 497 de la SEC ID NO:l es A, G, S, T, Y, D o K.
Varias ADN polimerasas son factibles para la mutación de acuerdo con la presente invención. Son particularmente adecuadas las polimerasas termoestables , que incluyen las polimerasas termoestables de tipo silvestre o de origen natural de varias especies de bacterias termófilas, así como también polimerasas termoestables sintéticas que se derivan de estas enzimas de tipo silvestre o de origen natural por medio de la sustitución, inserción o supresión de aminoácidos u otra modificación. Las formas no modificadas ejemplares de polimerasa incluyen, por ejemplo, la ADN polimerasa CS5 (SEC ID NO:29), CS6 (SEC ID NO:30) O Z05 (SEC ID NO:l), o una ADN polimerasa funcional que tiene por lo menos 80%, preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95% de identidad de secuencias con las mismas. Otras polimerasas no modificadas' incluyen, por ejemplo, ADN polimerasas de cualquiera de la siguientes especies de bacterias termófilas (o una ADN polimerasa funcional que tiene por lo menos 80%, preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95% de identidad de secuencias con esta polimerasa) : Ther otoga marítima (SEC ID NO:38); Thermus aquaticus (SEC ID NO:2); Thermus thermophilus (SEC ID NO:6); Thermus flavus (SEC ID NO:4) ; Thermus filiformís (SEC ID NO: 3); Spsl7 de Thermus sp. (SEC ID NO: 5); Z05 de Thermus sp. (SEC ID N0:1); Thermotoga neopolitana (SEC ID NO: 39); Ther osipho africanus (SEC ID NO:37); Thermus caldophilus (SEC ID NO:7), Deinococcus radiodurans (SEC ID NO: 36), Bacillus stearothermophilus (SEC ID NO: 0) o Bacillus caldotenax (SEC ID NO: 41) . Las polimerasas adecuadas también incluyen aquellas que tienen actividad de transcriptasa inversa (RT, por sus siglas en inglés) y/o la capacidad para incorporar nucleótidos no convencionales, tales como ribonucleótidos o otros nucleótidos 2 ' -modificados . .
Mientras que las ADN polimerasas termoestables que poseen una actividad eficiente de discriminación de apareamiento erróneo en el extremo 3' son particularmente adecuadas para realizar la PCR, las ADN polimerasas termoactivas , pero no termoestables , que poseen una actividad eficiente de discriminación de apareamiento erróneo en el extremo 3' también son factibles para la mutación de acuerdo con la presente invención.
En algunas modalidades, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa de Thermus. Por ejemplo, en algunas modalidades, la ADN polimerasa tiene por lo menos 80%, preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95% de identidad de secuencias con una polimerasa seleccionada del grupo que consiste de: (a) una ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. (Z05) (SEC ID NO:l (b una ADN polimerasa de Thermus aguaticus (Taq) (SEC ID NO: 2 (c una ADN polimerasa de Thermus filifor is (SEC ID NO: 3 (d una ADN polimerasa de Thermus flavus (Tfl) (SEC ID NO: 4) ; (e una ADN polimerasa Spsl7 de Thermus sp. (Spsl7) (SEC ID NO: 5 (f) una ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth) (SEC ID NO: 6) y (g) una ADN polimerasa de Thermus caldophilus (Tea) (SEC ID NO: 7) .
En algunas modalidades, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa de Thermotoga. Por ejemplo, en algunas modalidades, la ADN polimerasa tiene por lo menos 80%, preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95% de identidad de secuencias con una polimerasa seleccionada del grupo que consiste de: (a) una ADN polimerasa de Thermotoga marítima (Tma) (SEC ID NO: 38) ; (b) una ADN polimerasa de Thermotoga neopolitana (Tne) (SEC ID NO: 39) ; En ciertas modalidades, la ADN polimerasa tiene por lo menos 80%, preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95% de identidad de secuencias con la SEC ID NO:l. En algunas modalidades, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. , ADN polimerasa (Z05) (es decir, SEC ID NO:l), excepto que el aminoácido en la posición 493 es cualquier aminoácido diferente de E o S. En algunas modalidades, la ADN polimerasa es la ADN polimerasa Z05 y el aminoácido en la posición 493 es cualquier aminoácido diferente de E. Por ejemplo, en algunas modalidades, el aminoácido en la posición 493 se selecciona de V, L, I, M, F, W, P, T, C, Y, N, Q, D, K, R, S, A, G o H. En algunas modalidades, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa Z05 y el aminoácido en la posición 493 es G, A, K o R. En algunas modalidades, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa Z05 y el aminoácido en la posición 493 es K. En algunas modalidades, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa Z05 que comprende además una sustitución en la posición 580 y el aminoácido en la posición 580 es cualquier aminoácido diferente de D o E. En algunas modalidades, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa Z05 y el aminoácido en la posición 580 es cualquier aminoácido diferente de D. En algunas modalidades, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa Z05 y el aminoácido en la posición 580 se selecciona del grupo que consiste de L, G, T, Q, A, S, N, R y K. En algunas modalidades, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa Z05 y el aminoácido en la posición 580 es G.
La polimerasa mutante o mejorada puede incluir otras modificaciones que no son de sustitución. Una modificación de ese tipo es una modificación covalente térmicamente reversible que inactiva la enzima, pero la cual es invertida para activar la enzima con la incubación a una temperatura elevada, tal como una temperatura utilizada típicamente para la extensión de polinucleótidos . Los reactivos ejemplares para estas modificaciones térmicamente reversibles se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,773,258 y 5,677,152.
En algunas modalidades, la actividad de apareamiento erróneo en el extremo 3' se determina utilizando un polinucleótido objetivo de BRAF V600R mutante que tiene la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 35 (BRAF de tipo silvestre = SEC ID NO: 34) en presencia de un cebador directo que se aparea preferiblemente a la secuencia mutante y tiene un apareamiento erróneo en el extremo 3' A:C individual con la secuencia de tipo silvestre en una o más mezclas de reacción que tienen un número predeterminado de copias del polinucleótido objetivo de BRAF V600 de tipo silvestre y un número predeterminado de copias del polinucleótido objetivo de BRAF V600R igual mutante en cuanto al número o menor que el número de copias del objetivo de tipo silvestre (por ejemplo, 10,000 o menos copias). Dos o más mezclas de reacción pueden tener números titulados de copias del polinucleótido objetivo de BRAF V600R mutante (por ejemplo, 1:5 titulaciones, 1:10 titulaciones, por ejemplo 10,000 copias, 1,000 copias, 100 copias, 10 copias, 1 copia, 0 copias en varias mezclas de reacción) . La capacidad de discriminación de apareamiento erróneo en el extremo 3' de una polimerasa de la invención se puede comparar a la capacidad de discriminación de apareamiento erróneo en el extremo 3' de una polimerasa de referencia (por ejemplo, una polimerasa de origen natural o no modificada) , durante una unidad de tiempo preseleccionada, como se describe en este documento. Las polimerasas con una capacidad incrementada de discriminación de apareamiento erróneo en el extremo 3' no amplificarán la secuencia de tipo silvestre cuando se ponen en contacto con un cebador que se aparea perfectamente con un alelo mutante o requerirán un número más grande de ciclos de PCR para amplificar la secuencia de tipo silvestre utilizando el cebador específico para el alelo mutante (es decir, exhibirán un valor Cp más alto) , en comparación con una polimerasa de origen natural o no modificada.
En otros diversos aspectos, la presente invención proporciona un ácido nucleico recombinante que codifica una ADN polimerasa mutante o mejorada como se describe en este documento, un vector que comprende el ácido nucleico recombinante y/o una célula hospedante transformada con el vector. En ciertas modalidades, el vector es un vector de expresión. Las células hospedantes que comprenden estos vectores de expresión son útiles en métodos de la invención para producir la polimerasa mutante o mejorada al cultivar las células hospedantes bajo condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico recombinante. Las polimerasas de la invención pueden estar contenidas en mezclas de reacción y/o kits. Las modalidades de los ácidos nucleicos recombinantes , células hospedantes, vectores, vectores de expresión, mezclas de reacción y kits son como se describiera anteriormente y en este documento.
En todavía otro aspecto, se proporciona un método para conducir la extensión de polinucleótidos . El método incluye generalmente poner en contacto una ADN polimerasa que tiene una discriminación incrementada de apareamiento erróneo en el extremo 3' como se describe en este documento con un cebador, una plantilla de polinucleótido y trifosfatos de nucleósido bajo condiciones que son adecuadas para la extensión del cebador, produciendo de ese modo un cebador extendido. La plantilla de polinucleótido puede ser, por ejemplo, una plantilla de ARN o ADN. Los trifosfatos de nucleósido pueden incluir nucleótidos que no son convencionales tales como, por ejemplo, ribonucleótidos y/o nucleótidos etiquetados. Además, el cebador y/o la plantilla pueden incluir uno o más análogos de nucleótidos . En algunas variaciones, el método de extensión de polinucleótidos es un método para la amplificación de polinucleótidos que incluye poner en contacto la ADN polimerasa imitante o mejorada con un par de cebadores, la plantilla de polinucleótido y los trifosfatos de nucleósidos bajo condiciones que son adecuadas para la amplificación del polinucleótido. La reacción de extensión de polinucleótidos puede ser, por ejemplo, PCR, extensión isotérmica o secuenciación (por ejemplo, reacción de secuenciación 454) . En algunas modalidades, el método de extensión de cebadores es un método para conducir la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) .
La presente invención también proporciona un kit que es útil en este método de extensión de polinucleótidos.
Generalmente, el kit incluye por lo menos un envase que proporciona una ADN polimerasa mutante o mejorada como se describe en este documento. En ciertas modalidades, el kit incluye además uno o más envases adicionales que proporcionan uno o más reactivos adicionales. Por ejemplo, en variaciones específicas, uno o más de los envases adicionales proporcionan trifosfatos de nucleósidos; un amortiguador adecuado para la extensión de polinucleótidos; y/o un cebador hibridizable, bajo condiciones de extensión de polinucleótidos, a una plantilla de polinucleótido predeterminada .
Además se proporcionan mezclas de reacción que comprenden las polimerasas de la invención. Las mezclas de reacción también pueden contener un ácido nucleico de plantilla (ADN y/o ARN) , uno o más polinucleótidos de cebador o sonda, trifosfatos de nucleósidos (que incluyen, por ejemplo, desoxirribonucleótidos , ribonucleótidos , nucleótidos etiquetados, nucleótidos que no son convencionales), amortiguadores, sales, etiquetas (por ejemplo, fluoróforos) .
Las modalidades adicionales de la invención se describen en este documento.
DEFINICIONES A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en este documento tienen el mismo significado que es entendido comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en el campo al cual pertenece esta invención. Aunque esencialmente cualquier método y material similar a aquellos descritos en este documento se puede utilizar en la práctica o la prueba de la presente invención, solo se describen métodos y materiales ejemplares. Para efectos de la presente invención, a continuación se definen los siguientes términos.
Los términos "un", "una", "el" y "la" incluyen referentes plurales, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.
Un "aminoácido" se refiere a cualquier unidad monomérica que se pueda incorporar en un pép ido, polipéptido o proteína. Como se utiliza en este documento, el término "aminoácido" incluye los siguientes veinte alfa-aminoácidos naturales o genéticamente codificados: alanina (Ala o A), arginina (Arg o R) , asparagina (Asn o N) , ácido aspártico (Asp o D) , cisteína (Cys o C) , glutamina (Gln o Q) , ácido glutámico (Glu o E) , glicina (Gly o G) , histidina (His o H) , isoleucina (lie o I) , leucina (Leu o L) , lisina (Lys o K) , metionina (Met o M) , fenilalanina (Phe o F) , prolina (Pro o P) , serina (Ser o S) , treonina (Thr o T) , triptófano (Trp o W) , tirosina (Tyr o Y) y valina (Val o V) . En casos donde "X" residuos no son definidos, éstos se deben definir como "cualquier aminoácido" . Las estructuras de estos veinte aminoácidos naturales se muestran en, por ejemplo, Stryer y colaboradores, Biochemistry, 5a ed., Freeman and Corapany (2002) . Los aminoácidos adicionales, tales como selenocisteína y pirrolisina, también se pueden codificar genéticamente (Stadtman (1996) "Selenocysteine" , Annu Rev Biochem. 65:83-100 e Ibba y colaboradores (2002) "Genetic code: introducing pyrrolysine" , Curr Biol. 12 (13) :R464-R466) . El término "aminoácido" también incluye aminoácidos no naturales, aminoácidos modificados (por ejemplo, que tienen cadenas laterales y/o estructuras principales modificadas) , y análogos de aminoácidos. Véase, por ejemplo, Zhang y colaboradores (2004) "Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells" , Proc . Nati. Acad. Sci. E.U.A. 101 (24) : 8882-8887 , Anderson y colaboradores (2004) "An expanded genetic code wit a functional quadruplet codon" Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 101 (20) : 7566-7571, Ikeda y colaboradores (2003) "Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo", Protein Eng. Des. Sel. 16(9) :699-706, Chin y colaboradores (2003) "An Expanded Eukaryotic Genetic Code", Science 301 (5635) :964-967, James y colaboradores (2001) "Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues" , Protein Eng. Des. Sel. 14 (12) : 983-991, Kohrer y colaboradores (2001) "Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins" , Proc. Nati. Acad. Sci . E.U.A. 98(25): 14310-14315, Bacher y colaboradores (2001) "Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue" , J. Bacteriol . 183 (18) : 5414-5425 , Hamano-Takaku y colaboradores (2000) "A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine" , J. Biol. Chem. 275 (51) :40324-40328 y Budisa y colaboradores (2001) "Proteins with {beta}-(thienopyrrolyl) alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids" , Protein Sci. 10(7): 1281-1292.
Para ilustrar adicionalmente, un aminoácido es típicamente un ácido orgánico que incluye un grupo amino sustituido o no sustituido, un grupo carboxi sustituido o no sustituido y una o más cadenas o grupos laterales, o análogos de cualquiera de estos grupos. Las cadenas laterales ejemplares incluyen, por ejemplo, tiol, seleno, sulfonilo, alquilo, arilo, acilo, ceto, azido, hidroxilo, hidrazina, ciano, halo, hidrazida, alquenilo, alquinilo, éter, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldehido, éster, tioácido, hidroxilamina o cualquier combinación de estos grupos. Otros aminoácidos representativos incluyen, pero no están limitados a, aminoácidos que comprenden reticuladores fotoactivables , aminoácidos que se enlazan a metales, aminoácidos etiquetados por centrifugación, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos que contienen metales, aminoácidos con grupos funcionales novedosos, aminoácidos que interactúan covalentemente o no covalentemente con otras moléculas, aminoácidos fotoconfinados y/o fotoisomerizables, aminoácidos radioactivos, aminoácidos que comprenden biotina o un análogo de biotina, aminoácidos glicosilados , otros aminoácidos modificados por carbohidratos, aminoácidos que comprenden polietilenglicol o poliéter, aminoácidos sustituidos con átomos pesados, aminoácidos escindibles químicamente y/o fotoescindibles , aminoácidos que contienen azúcar unidos a carbono, aminoácidos con actividad de redox, aminoácidos que contienen amino-tioácido y aminoácidos que comprenden una o más porciones tóxicas.
El término "aptámero" se refiere a un ADN de hebra simple que reconoce y se enlaza a la ADN polimerasa e inhibe eficientemente la actividad de polimerasa como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,693,502.
El término "mutante" , en el contexto de las ADN polimerasas de la presente invención, significa un polipéptido, típicamente recombinante, que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en relación con una ADN polimerasa de origen natural o no modificada, correspondiente .
El término "forma no modificada", en el contexto de una polimerasa mutante, es un término utilizado en este documento con objeto de definir una ADN polimerasa mutante de la presente invención: el término "forma no modificada" se refiere a una ADN polimerasa funcional que tiene la secuencia de aminoácidos de la polimerasa mutante excepto en una o más posiciones de aminoácidos especificadas como que caracterizan la polimerasa mutante. De esta manera, una referencia a una ADN polimerasa mutante en términos de (a) su forma no modificada y (b) una o más sustituciones de aminoácidos específicas significa que, con la excepción de la(s) sustitución (es) de aminoácido específica (s) , la polimerasa mutante tiene de otra manera una secuencia de aminoácidos idéntica a la forma no modificada en la porción especificada. La "polimerasa no modificada" (y por lo tanto también la forma modificada que tiene una discriminación incrementada de apareamiento erróneo en el extremo 3') puede contener mutaciones adicionales para proporcionar una funcionalidad deseada, por ejemplo, la incorporación mejorada de didesoxirribonucleótidos , ribonucleótidos , análogos de ribonucleótidos , nucleótidos etiquetados con tinte, actividad moduladora de 5'-nucleasa, actividad moduladora de 3'-nucleasa (o corrección de pruebas) o similares. Por consiguiente, al llevar a cabo la presente invención como se describe en este documento, se predetermina la forma no modificada de una ADN polimerasa. La forma no modificada de una ADN polimerasa puede ser, por ejemplo, una ADN polimerasa de tipo silvestre y/o de origen natural o una ADN polimerasa que ya ha sido modificada intencionalmente . Una forma no modificada de la polimerasa es preferiblemente una ADN polimerasa termoestable , tal como las ADN polimerasas de varias bacterias termófilas, así como también variantes funcionales de las mismas que tienen una identidad de secuencias sustancial con una polimerasa termoestable de tipo silvestre o de origen natural. Estas variantes pueden incluir, por ejemplo, ADN polimerasas quiméricas tales como, por ejemplo, las ADN polimerasas quiméricas descritas en la Patente de los Estados Unidos No. 6,228,628 y la Publicación de Solicitud de los Estados Unidos No. 2004/0005599. En ciertas modalidades, la forma no modificada de una polimerasa tiene actividad de transcriptasa inversa (RT, por sus siglas en inglés) .
El término "polimerasa termoestable" se refiere a una enzima que es estable hacia el calor, es resistente al calor y retiene suficiente actividad para efectuar reacciones de extensión de polinucleótidos subsecuentes y no se desnaturaliza (no se inactiva) irreversiblemente cuando se sujeta a las temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de ácidos nucleicos de hebra doble. Las condiciones de calentamiento necesarias para la desnaturalización de ácido nucleico son bien conocidas en el campo y se ejemplifican, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,683,202, 4,683,195 y 4,965,188. Como se utiliza en este documento, una polimerasa termoestable es adecuada para el uso en una reacción de ciclado de temperatura tal como la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR"). La desnaturalización irreversible a objeto de este documento se refiere a la pérdida permanente y completa de actividad enzimática. Para una polimerasa termoestable, la actividad enzimática se refiere a la catálisis de la combinación de los nucleótidos de manera apropiada para formar productos de extensión de polinucleótidos que son complementarios para una cadena de ácido nucleico de plantilla. Las ADN polimerasas termoestables de bacterias termófilas incluyen, por ejemplo, ADN polimerasas de Thermotoga marítima, Thermus aquaticus, Therm s thermophilus, Thermus flavus, Thermus filiformis, especies Spsl7 de Thermus, especies Z05 de Thermus, Thermus caldophilus, Bacillus caldotenax, Thermotoga neopolitana y Thermosipho africanus .
El término "termoactivo" se refiere a una enzima que mantiene propiedades catalíticas a temperaturas utilizadas comúnmente para pasos de transcripción inversa o hibridación/extensión en reacciones de RT-PCR y/o PCR (es decir 45-80°C) . Las enzimas termoestables son aquellas las cuales no son inactivadas o desnaturalizadas irreversiblemente cuando se sujetan a temperaturas elevadas que son necesarias para la desnaturalización de ácido nucleico. Las enzimas termoactivas pueden ser o no termoestables .
Las ADN polimerasas termoactivas pueden ser ADN o ARN dependiente de especies termófilas o de especies mesófilas que incluyen, pero no están limitadas a, Escherichia coli, Moloney murine leuke ia viruses y Avian myoblastosis virus.
Como se utiliza en este documento, una proteína "quimérica" se refiere a una proteína cuya secuencia de aminoácidos representa un producto de fusión de subsecuencias de las secuencias de aminoácidos de por lo menos dos proteínas distintas. Una proteína quimérica no es producida típicamente mediante la manipulación directa de secuencias de aminoácidos sino que, más bien, se expresa a partir de un gen "quimérico" que codifica la secuencia de aminoácidos quimérica. En ciertas modalidades, por ejemplo, una forma no modificada de una ADN polimerasa mutante de la presente invención es una proteína quimérica que consiste de una región amino-terminal (N-terminal) derivada de una ADN polimerasa de especie Thermus y una región carboxi-terminal (C-terminal) derivada de una ADN polimerasa de Tma. La región N-terminal se refiere a una región que se extiende desde la terminación N (posición de aminoácido 1) hasta un aminoácido interno. Similarmente, la región C-terminal se refiere a una región que se extiende desde un aminoácido interno hasta la terminación C.
En el contexto de las ADN polimerasas, "correspondencia" con otra secuencia (por ejemplo, regiones, fragmentos, posiciones de nucleótidos o aminoácidos o similares) se basa en la convención de la numeración de acuerdo con el número de posición de nucleótido o aminoácido y luego la alineación de las secuencias de una manera que maximiza el porcentaje de identidad de secuencias. Debido a que no todas las posiciones dentro de una "región correspondiente" determinada necesitan ser idénticas, las posiciones que no se aparean dentro de una región correspondiente pueden considerarse como "posiciones correspondientes" . Por consiguiente, como se utiliza en este documento, una referencia a una "posición de aminoácido que corresponde a una posición de aminoácido [X] " de una ADN polimerasa específica se refiere a posiciones equivalentes, con base en el alineamiento, en otras ADN polimerasas y homólogos estructurales y familias. En algunas modalidades de la presente invención, la "correspondencia" de posiciones de aminoácidos se determina con respecto a una región de la polimerasa que comprende una o más configuraciones de las SEC ID N0:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 36, 37, 38, 39, 40 O 41. Cuando una secuencia de polipéptido de polimerasa difiere de las SEC ID NO:l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 36, 37, 38, 39, 40 o 41 (por ejemplo, por cambios en aminoácidos o la adición o supresión de aminoácidos) , puede ser que una mutación particular asociada con una actividad mejorada como se plantea en este documento no estará en el mismo número de posición como está en las SEC ID NO:l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 36, 37, 38, 39, 40 o 41. Esto se ilustra, por ejemplo, en la Tabla 1.
"Recombinante", como se utiliza en este documento, se refiere a una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que ha sido modificada intencionalmente por medio de métodos recombinantes . Por el término "ácido nucleico recombinante" se da a entender en este documento un ácido nucleico, formado originalmente in vitro, en general, mediante la manipulación de un ácido nucleico por endonucleasas, en una forma que no se encuentra normalmente en la naturaleza. De esta manera, un ácido nucleico de ADN polimerasa mutante, aislado, en una forma lineal, o un vector de expresión formado in vitro al ligar moléculas de ADN que no están unidas normalmente, se consideran ambos recombinantes para los propósitos de esta invención. Se entiende que una vez que un ácido nucleico se hace recombinante y se reintroduce en una célula hospedante, se replicará de manera no recombinante, es decir, utilizando la maquinaria celular in vivo de la célula hospedante en lugar de manipulaciones in vitro; sin embargo, estos ácidos nucleicos, una vez que son producidos de manera recorabinante, aunque se replican subsecuentemente de manera no recombinante, aún se consideran recombinantes para los propósitos de la invención. Una "proteína recombinante" es una proteína hecha utilizando técnicas recombinantes, es decir, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante como se ilustrara anteriormente.
Un ácido nucleico es "vinculado de manera operable" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador se vincula de manera operable con una secuencia de codificación si es que afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de enlace a ribosoma se une operablemente a una secuencia de codificación si se coloca con el fin de facilitar la traducción.
El término "célula hospedante" se refiere a organismos tanto procarióticos como eucarióticos unicelulares (por ejemplo, bacterias, levadura y actinomicetos) y células individuales de plantas o animales de orden superior cuando se desarrollan en un cultivo de células.
El término "vector" se refiere a una pieza de ADN, típicamente de hebra doble, la cual puede tener insertada en la misma una pieza de ADN extraño. El vector puede ser, por ejemplo, de origen plasmídico. Los vectores contienen secuencias de polinucleótidos de "replicón" que facilitan la replicación autónoma del vector en una célula hospedante. El ADN extraño se define como el ADN heterólogo, el cual es ADN que no se encuentra naturalmente en la célula hospedante, el cual, por ejemplo, replica la molécula del vector, codifica un marcador seleccionable o examinable o codifica un transgén. El vector se utiliza para transportar el ADN extraño o heterólogo dentro de una célula hospedante adecuada. Una vez que está en la célula hospedante, el vector puede replicarse independientemente de o coincidentemente con el ADN cromosómico del hospedante y se pueden generar varias copias del vector y su ADN insertado. Además, el vector también puede contener los elementos necesarios que permiten la transcripción del ADN insertado en una molécula de ARNm o puede causar de otra manera la replicación del ADN insertado en múltiples copias de ARN.
Algunos vectores de expresión contienen adicionalmente elementos de secuencia adyacentes al ADN insertado que incrementan la vida media del ARNm expresado y/o permiten la traducción del ARNm en una molécula de proteína. Muchas moléculas de ARNm y polipéptido codificadas por el ADN insertado se pueden sintetizar rápidamente de esta manera .
El término "nucleótido" , además de referirse a los monómeros de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos de origen natural, se deberá entender en este documento que se refiere a variantes estructurales, relacionadas del mismo, que incluyen derivados y análogos, que son funcionalmente equivalentes con respecto al contexto particular en el cual está siendo utilizado el nucleotido (por ejemplo, hibridación a una base complementaria) , a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
El término "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refiere a un polímero que puede corresponder a un ácido nucleico de ribosa (ARN) o ácido nucleico de desoxirribosa (ADN) , o un análogo de los mismos. Esto incluye polímeros de nucleótidos tales como ARN y ADN, así como también formas sintéticas, formas modificadas (por ejemplo, modificadas química o bioquímicamente) de los mismos y polímeros mezclados (por ejemplo, que incluyen subunidades tanto de ARN como de ADN) . Las modificaciones ejemplares incluyen metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural por un análogo, modificaciones internucleótidos tales como uniones sin carga (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres , fosfoamidatos, carbamatos y similares) , porciones pendientes (por ejemplo, polipéptidos) , intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno y similares), ligandos quelantes, alquiladores y uniones modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos anoméricos alfa y similares) . También están incluidas las moléculas sintéticas que imitan los polinucleótidos en su capacidad para enlazarse a una secuencia designada por vía de un enlace de hidrógeno y otras interacciones químicas. Típicamente, los monómeros de nucleótidos se unen por vía de enlaces de fosfodiéster, aunque las formas sintéticas de ácidos nucleicos pueden comprender otras uniones (por ejemplo, ácidos nucleicos de péptidos como se describe en Nielsen y colaboradores (Science 254:1497-1500, 1991). Un ácido nucleico puede ser o puede incluir, por ejemplo, un cromosoma, o un segmento cromosómico, un vector (por ejemplo, un vector de expresión) , un cásete de expresión, un polímero de ADN o ARN desnudo, el producto de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , un oligonucleótido, una sonda y un cebador. Un ácido nucleico puede ser, por ejemplo, de hebra simple, de hebra doble o de triple cadena y no está limitado a ninguna longitud particular. A menos que se indique de otra manera, una secuencia de ácido nucleico particular comprende o codifica secuencias complementarias, además de cualquier secuencia indicada explícitamente.
El término "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico que incluye por lo menos dos unidades monoméricas de ácido nucleico (por ejemplo, nucleótidos) . Un oligonucleótido incluye típicamente de aproximadamente seis a aproximadamente 175 unidades monoméricas de ácido nucleico, más típicamente de aproximadamente ocho a aproximadamente 100 unidades monoméricas de ácido nucleico y aún más típicamente de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 unidades monoméricas de ácido nucleico (por ejemplo, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35 o más unidades monoméricas de ácido nucleico) . El tamaño exacto de un oligonucleótido dependerá de muchos factores, que incluyen la función o uso final del oligonucleótido. Los oligonucleótidos se preparan opcionalmente por medio de cualquier método adecuado, que incluye, pero no está limitado a, el aislamiento de una secuencia existente o natural, la replicación o amplificación de ADN, transcripción inversa, clonación y digestión de restricción de secuencias apropiadas o síntesis química directa por medio de un método tal como el método de fosfotriéster de Narang y colaboradores (Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979); el método de fosfodiéster de Brown y colaboradores (Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979); el método de dietilfosforamidita de Beaucage y colaboradores (Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862, 1981); el método de triéster de Matteucci y colaboradores (J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981) ; métodos de síntesis automatizados; o el método de soporte sólido de la Patente de los Estados Unidos No. 4,458,066, u otros métodos conocidos para aquellas personas expertas en el campo.
El término "cebador" como se utiliza en este documento se refiere a un polinucleótido capaz de actuar como un punto de inicio de síntesis de ácido nucleico dirigida a una plantilla cuando se coloca bajo condiciones en las cuales se inicia la extensión de polinucleótidos (por ejemplo, bajo condiciones que comprenden la presencia de trifosfatos de nucleósido necesarios (como sea dictado por la plantilla que es copiada) y una polimerasa en un amortiguador apropiado y a una temperatura o ciclo (s) de temperatura adecuado (s) (por ejemplo, como en una reacción en cadena de la polimerasa) ) . Para ilustrar adicionalmente, los cebadores también se pueden utilizar en una variedad de otros procesos de síntesis mediados por oligonucleótidos , que incluyen como iniciadores de la síntesis de ARN de novo y procesos relacionados con la transcripción in vitro (por ejemplo, amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) , amplificación mediada por la transcripción (TMA) , etcétera) . Un cebador es típicamente un oligonucleótido de hebra. simple (por ejemplo, oligodesoxirribonucleótido) . La longitud apropiada de un cebador depende del uso pretendido del cebador pero varía típicamente de 6 a 40 nucleótidos, más típicamente de 15 a 35 nucleótidos . Las moléculas cortas de cebador requieren generalmente temperaturas de enfriamiento para formar complejos híbridos suficientemente estables con la plantilla. Un cebador no necesita reflejar la secuencia exacta de la plantilla pero debe ser suficientemente complementario para hibridizarse con una plantilla para que ocurra el alargamiento del cebador. En ciertas modalidades, el término "par de cebadores" significa un conjunto de cebadores que incluyen un cebador homosentido 5' (algunas veces llamado "directo") que se hibridiza con el complemento del extremo 5' de la secuencia de ácidos nucleicos que es amplificada y un cebador antisentido 3' (algunas veces llamado "inverso") que se hibridiza con el extremo 3' de la secuencia a ser amplificada (por ejemplo, si la secuencia objetivo se expresa como ARN o es un ARN) . Un cebador puede ser etiquetado, si se desea, al incorporar una etiqueta detectable por un medio espectroscópico, fotoquimico, bioquímico, inmunoquímico o químico. Por ejemplo, las etiquetas útiles incluyen 32P, tintes fluorescentes, reactivos densos a electrones, enzimas (como se utilizan comúnmente en ensayos ELISA) , biotina o haptenos y proteínas para las cuales están disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales .
El término "sonda de 5'-nucleasa" se refiere a un oligonucleótido que comprende por lo menos una porción de etiquetado emisora de luz y que se utiliza en una reacción de 5'-nucleasa para efectuar la detección de ácido nucleico objetivo. En algunas modalidades, por ejemplo, una sonda de 5'-nucleasa incluye únicamente una porción emisora de luz individual (por ejemplo, un tinte fluorescente, etcétera) . En ciertas modalidades, las sondas de 5 '-nucleasa incluyen regiones de autocomplementariedad de tal manera que las sondas son capaces de formar estructuras de horquilla bajo condiciones seleccionadas. Para ilustrar adicionalmente, en algunas modalidades una sonda de 5' -nucleasa comprende por lo menos dos porciones de etiquetado y emite radiación de intensidad incrementada después de que una de las dos etiquetas es escindida o separada de otra manera del oligonucleótido . En ciertas modalidades, una sonda de 5'-nucleasa es etiquetada con dos diferentes tintes fluorescentes, por ejemplo, un tinte reportero de la terminación 5' y el tinte o porción estabilizadora de la terminación 3'. En algunas modalidades, las sondas de 5'-nucleasa son etiquetadas en una o más posiciones diferentes de, o además de, las posiciones terminales. Cuando la sonda está intacta, ocurre típicamente la transferencia de energía entre los dos fluoróforos de tal manera que la emisión de fluorescencia del tinte reportero es estabilizada por lo menos en parte. Durante un paso de extensión de una reacción en cadena de la polimerasa, por ejemplo, una sonda de 5'-nucleasa enlazada a un ácido nucleico de plantilla es escindida por la actividad de nucleasa de 5' a 3' de, por ejemplo, una polimerasa Taq u otra polimerasa que tiene esta actividad de tal manera que la emisión de fluorescencia del tinte reportero ya no es estabilizada. Las sondas de 5'-nucleasa ejemplares también se describen en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,210,015; la Patente de los Estados Unidos No. 5,994,056 y la Patente de los Estados Unidos No. 6,171,785. En algunas modalidades, una sonda de 5 '-nucleasa se puede etiquetar con dos o más tintes reporteros diferentes y un tinte o porción estabilizadora de la terminación 3' .
El término "FRET" o "transferencia de energía por resonancia fluorescente" o "transferencia de energía por resonancia de Foerster" se refiere a la transferencia de energía entre por lo menos dos cromóforos, un cromóforo donador y un cromóforo receptor (referido como un estabilizador) . El donador transfiere típicamente la energía al receptor cuando el donador es excitado por radiación de luz con una longitud de onda adecuada. El receptor emite de nuevo típicamente la energía transferida en la forma de radiación de luz con una longitud de onda diferente. Cuando el receptor es un estabilizador "oscuro" , disipa la energía transferida en una forma diferente de luz. Si un fluoróforo particular actúa como un donador o un receptor depende de las propiedades del otro miembro del par de FRET. Los pares de donador-receptor utilizados comúnmente incluyen el par de FAM-TAMRA. Los estabilizadores utilizados comúnmente son DABCYL y TAMRA. Los estabilizadores oscuros utilizados comúnmente incluyen BlackHole QuenchersMR (BHQ) , (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa BlackMR (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa) y BlackBerry Quencher 650R (BBQ-650) (Berry & Assoc, Dexter, Mich.).
El término "convencional" o "natural" cuando se refiere a bases de ácido nucleico, trifosfatos de nucleósidos o nucleótidos se refiere a aquellos los cuales se encuentran naturalmente en el polinucleótido que es descrito (es decir, para el ADN esos son dATP, dGTP, dCTP y dTTP) . Adicionalmente, dITP y 7-desaza-dGTP se utilizan frecuentemente en lugar de dGTP y 7-desaza-dATP se pueden utilizar en lugar de dATP en reacciones in vitro de síntesis de ADN, tal como la secuenciación. Colectivamente, éstos pueden ser referidos como dNTPs .
El término "que no es convencional" o "modificado" cuando se refiere a una base de ácido nucleico, nucleósido o nucleótido incluye la modificación, derivaciones o análogos de bases, nucleósidos o nucleótidos convencionales que se encuentran naturalmente en un polinucleótido particular. Ciertos nucleótidos que no son convencionales son modificados en la posición 2' del azúcar ribosa en comparación con los dNTPs convencionales. De esta manera, aunque para el ARN los nucleótidos de origen natural son ribonucleótidos (es decir, ATP, GTP, CTP, UTP, colectivamente rNTPs) , debido a que estos nucleótidos tienen un grupo hidroxilo en la posición 2' del azúcar, la cual, por comparación está ausente en dNTPs, como se utiliza en este documento, los ribonucleótidos son nucleótidos que no son convencionales como substratos para las ADN polimerasas. Como se utiliza en este documento, los nucleótidos que no son convencionales incluyen, pero no están limitados a, compuestos utilizados como terminadores para la secuenciacion de ácido nucleico. Los compuestos terminadores, ejemplares incluyen pero no están limitados a aquellos que tienen una estructura de 2 ' , 3 ' -didesoxi y son referidos como trifosfatos de didesoxinucleósidos . Los trifosfatos de didesoxinucleósidos ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP son referidos colectivamente como ddNTPs . Los ejemplos adicionales de compuestos terminadores incluyen análogos de 2'-P04 de ribonucleótidos {véase, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitud de los Estados Unidos Nos. 2005/0037991 y 2005/0037398) . Otros nucleótidos que no son convencionales incluyen los dNTPs de fosforotioato ( [ [a] -S] dNTPs) , 5'-[a]-borano-dNTPs, dNTPs de [a] -metil-fosfonato y trifosfatos de ribonucleósidos (rNTPs) . Las bases que no son convencionales pueden ser etiquetadas con isótopos radiactivos tales como 32P, 33P o 35S; etiquetas fluorescentes; etiquetas quimioluminiscentes ; etiquetas bioluminiscentes ; etiquetas de hapteno tales como biotina; o etiquetas de enzimas tales como estreptavidina o avidina. Las etiquetas fluorescentes pueden incluir tintes que tienen cargas negativas, tales como tintes de la familia fluoresceína, o tintes que son neutros en cuanto a la carga, tales como tintes de la familia rodamina o tintes que tienen carga positiva, tales como tintes de la familia cianina. Los tintes de la familia fluoresceína incluyen, por ejemplo, FAM, HEX, TET, JOE, NAN y ZOE. Los tintes de la familia de rodamina incluyen Texas Red, ROX, RUO, R6G y TAMRA. Varios tintes o nucleótidos etiquetados con FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, RUO, R6G, Texas Red y TAMRA son comercializados por Perkin-Elmer (Bost n, MA) , Applied Biosystems (Foster City, CA) o Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR) . Los tintes de la familia de cianina incluyen Cy2 , Cy3, Cy5 y Cy7 y son comercializados por GE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, Inglaterra) .
Como se utiliza en este documento, el "porcentaje dé identidad de secuencias" se determina al comparar dos secuencias alineadas óptimamente sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) en comparación con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o supresiones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico o residuo de aminoácido idéntico se encuentran en ambas secuencias para producir el número de posiciones apareadas, dividir el número de posiciones apareadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencias .
Los términos "idéntico" o "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas . Las secuencias son "sustancialmente idénticas" entre sí si es que tienen un porcentaje especificado de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son los mismos (por ejemplo, por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% de identidad sobre una región especificada) , cuando se comparan y se alinean para la correspondencia máxima sobre una ventana de comparación o una región designada que es medida utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o por medio del alineamiento manual y la inspección visual. Estas definiciones también se refieren al complemento de una secuencia de prueba. Opcionalmente, la identidad existe sobre una región que es de por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud o más típicamente sobre una región que es de 100 a 500 o 1,000 o más nucleótidos de longitud.
Los términos "similitud" o "porcentaje de similitud" , en el contexto de dos o más secuencias de polipéptidos , se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos que son ya sea los mismos o similares definidos por sustituciones de aminoácidos conservadoras (por ejemplo, 60% de similitud, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% similares sobre una región especificada) , cuando se comparan y se alinean para la correspondencia máxima sobre una ventana de comparación o una región designada que es medida utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o por medio del alineamiento manual y la inspección visual. Las secuencias son entre sí "sustancialmente similares" si son por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50% o por lo menos 55% similares entre sí. Opcionalmente, esta similitud existe sobre una región que es de por lo menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud o más típicamente sobre una región que es de por lo menos aproximadamente 100 a 500 o 1,000 o más aminoácidos de longitud.
Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en una computadora, se designan coordenadas de subsecuencias , si es necesario, y se designan parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Los parámetros de programa por omisión se utilizan comúnmente, o se pueden designar parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias entonces calcula el porcentaje de identidades o similitudes de secuencias para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, con base en los parámetros de programa.
Una "ventana de comparación" , como se utiliza en este documento, incluye una referencia para un segmento de cualquiera de la variedad de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste de 20 a 600, usualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más usualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en la cual una secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alinean óptimamente. Los métodos de alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en el campo. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede ser conducido, por ejemplo, por medio del algoritmo por homología local de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1970), por medio del algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (J\ Mol.
Biol. 48:443, 1970), por medio del método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85:2444, 1988), por medio de implementaciones computarizadas de estos algoritmos (por ejemplo, GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) o por medio del alineamiento manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology (1995 suplemento) ) .
Los algoritmos adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y similitud de secuencias son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, los cuales se describen en Altschul y colaboradores (Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977) y Altschul y colaboradores (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990), respectivamente. El software para realizar los análisis BLAST está disponible para el público a través de the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo involucra identificar primero los pares de secuencias de registro alto (HSPs, por sus siglas en inglés) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia desconocida, las cuales ya sea se aparean o satisfacen algún registro de umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T es referido como el umbral de registro de palabra vecina (Altschul y colaboradores, Suprá) . Estos aciertos iniciales de palabra vecina actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSPs más grandes que las contienen. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia siempre y cuando se pueda incrementar el registro de alineamiento acumulativo. Los registros acumulativos se calculan utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (registro de recompensa para un par de residuos de apareamiento; siempre >0) y N (registro de penalización para residuos de apareamiento erróneo; siempre <0) . Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de registro para calcular el registro acumulativo. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: el registro de alineamiento acumulativo desciende por la cantidad X de su valor máximo logrado; el registro acumulativo llega a cero o por debajo, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de registro negativo; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como omisiones una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como omisiones una longitud de palabra de 3 y una expectativa (E) de 10 y la matriz de registro BLOSUM62 {véase Henikoff y Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 89:10915, 1989) alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas .
El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias [véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 90:5873-87, 1993). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), la cual proporciona una indicación de la probabilidad por la cual un apareamiento entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos ocurriría por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0.2, típicamente menor que aproximadamente 0.01 y más típicamente menor que aproximadamente 0.001.
El término "discriminación de apareamiento erróneo" se refiere a la capacidad de un biocatalizador (por ejemplo, una enzima, tal como una polimerasa, ligasa o similares) para distinguir una secuencia totalmente complementaria de una secuencia que contiene apareamientos erróneos cuando se extiende un ácido nucleico (por ejemplo, un cebador u otro oligonucleótido) de una manera dependiente de la plantilla al unir (por ejemplo, covalentemente) uno o más nucleó idos al ácido nucleico. El término "discriminación de apareamiento erróneo en el extremo 3'" se refiere a la capacidad de un biocatalizador para distinguir una secuencia totalmente complementaria de una secuencia que contiene apareamientos erróneos (casi complementaria) donde el ácido nucleico a ser extendido (por ejemplo, un cebador u otro oligonucleótido) tiene un apareamiento erróneo en la terminación 3' del ácido nucleico en comparación con la plantilla con la cual se ibridiza el ácido nucleico. En algunas modalidades, el ácido nucleico que se extiende comprende un apareamiento erróneo en el extremo 3' en relación con la secuencia totalmente complementaria. En algunas modalidades, el ácido nucleico que se extiende comprende un apareamiento erróneo en la penúltima posición (?-1)3' y/o en la posición N-2 en relación con la secuencia totalmente complementaria.
El término "valor Cp" o valor de "punto de cruce" se refiere a un valor que permite la cuantificación de ácidos nucleicos objetivo de entrada. El valor Cp se puede determinar de acuerdo con el método del máximo del segundo derivado (Van Luu-The y colaboradores, "Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second derivative calculation and double correction" , BioTechniques, Volumen 38, No. 2, Febrero de 2005, páginas 287-293). En el método del segundo derivado, un valor Cp corresponde al primer pico de una curva del segundo derivado. Este pico corresponde al inicio de una fase logarítmica-lineal . El método del segundo derivado calcula un valor del segundo derivado de la curva de intensidad de fluorescencia en tiempo real y solo se obtiene un valor. El método de Cp original se basa en una aproximación diferenciable , definida localmente de los valores de intensidad, por ejemplo, por una función polinómica. Luego se calcula el tercer derivado. El valor Cp es la raíz más pequeña del tercer derivado. El valor Cp también se puede determinar utilizando el método de puntos de ajuste, en el cual el valor Cp se determina por la intersección de una paralela a la línea de umbral en la región logarítmica-lineal (Van Luu-The y colaboradores, BioTechniques , Volumen 38, No. 2, Febrero de 2005, páginas 87-293) . Estos cálculos son llevados a cabo fácilmente por una persona experta en el campo.
El término "eficiencia de PCR" se refiere a una indicación de una eficiencia de amplificación de ciclo a ciclo para la plantilla de cebador perfectamente apareada. La eficiencia de PCR se calcula para cada condición utilizando la ecuación: % de eficiencia de PCR = (10(-Pendiente) -i) x loo, en donde la pendiente se calculó por medio de la regresión lineal con el número logarítmico de copias representado gráficamente en el eje y el valor Cp representado gráficamente en el eje x.
El término "multiplex" se refiere a la amplificación con más de un conjunto de cebadores o la amplificación de más de un sitio de polimorfismo en una reacción individual.
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 ilustra un alineamiento de secuencias de aminoácidos de una región del dominio de polimerasa de las ADN polimerasas ejemplares de varias especies de bacterias: especie Z05 de Thermus (Z05) (SEC ID N0:12), Thermus aquaticus (Taq) (SEC ID N0:13), Thermus filiformus (Tfi) (SEC ID NO:14), Thermus flavus (Tfl) (SEC ID NO:15), especies Spsl7 de Thermus (Spsl7) (SEC ID NO: 16), Thermus thermophilus (Tth) (SEC ID NO:17), Thermus caldophilus (Tea) (SEC ID NO:18), Thermotoga marítima (Tma) (SEC ID NO: 19), Thermotoga neopolitana (Tne) (SEC ID NO:20), Thermosipho africanus (Taf) (SEC ID NO:21), Deinococcus radiodurans (Dra) (SEC ID NO:23), Bacillus stearother ophilus (Bst) (SEC ID NO: 24) y Bacillus caldotenax (Bca) (SEC ID NO:25). Además, las regiones de polipéptido mostradas comprenden la porción de aminoácidos A-G- Xi - X2 - F-X3 ""X4 ~ 5 ~ ß ~ X7 -Xs _Q~X9 - X10 - X11 ~ i2 ~I"-^i3 ~Xi ~ i5 ~ L (SEC ID NO:26), las posiciones variables de los cuales se definen adicionalmente en este documento. Esta porción se resalta en letra negrita para cada secuencia de polimerasa. Las posiciones de aminoácidos factibles para la mutación de acuerdo con la presente invención se indican con un asterisco (*) · Las Figuras 2A-2B proporcionan identidades de secuencias entre las siguientes enzimas ADN polimerasa I: ADN polimerasa Z05 de Therm s sp. (ZQ5) ; ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) ; ADN polimerasa de Thermus filiformis (Tfi) ; ADN polimerasa de Thermus flavus (Tfl) ; ADN polimerasa Spsl7 de Thermus sp. (Spsl7) ; ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth) ; ADN polimerasa de Thermus caldophilus (Tea) ; ADN polimerasa de Deinococcus radÍQdurans (Dra) ; ADN polimerasa de Thermotoga marítima (Tma) ; ADN polimerasa de Thermotoga neopolitana (Tne) ; ADN polimerasa de Thermosipho africanus (Taf ) ; ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus (Bst) ; y ADN polimerasa de Bacillus caldotenax (Bca) . (la Figura 2A) identidades de secuencias sobre la enzima completa polimerasa I (que corresponde a los aminoácidos 1-834 de Z05) ; y (la Figura 2B) identidades de secuencias sobre el subdominio de polimerasa que corresponde a los aminoácidos 420-834 de Z05.
Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona ADN polimerasas mejoradas en las cuales uno o más aminoácidos en el dominio de polimerasa han sido identificados como que mejoran una o más actividades o características de polimerasa. Las ADN polimerasas de la invención son enzimas activas que tienen una actividad incrementada de discriminación de apareamiento erróneo en el extremo 3' (es decir, es menos probable que las polimerasas inventivas que se describen en este documento extiendan cebadores que están apareados erróneamente a la plantilla en o cerca del extremo 3' del cebador) en relación con la forma no modificada de la polimerasa de otra manera idéntica excepto por la diferencia de aminoácidos observada en este documento. Las ADN polimerasas son útiles en una variedad de aplicaciones que involucran la extensión o amplificación de polinucleótidos de plantillas de polinucleótidos que incluyen, por ejemplo, aplicaciones en estudios de ADN recombinante y la diagnosis médica de una enfermedad.
Polimerasas de la Invención En algunas modalidades, las ADN polimerasas de la invención se pueden caracterizar por tener la siguiente porción : Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-X6-Arg-Asp-Gln-Leu-X10-Arg-Val-Leu-Xi3-Asp-Glu-Leu (también referida en este documento en el código de una letra como A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L) ; en donde X6 es Ser (S) , Gly (G) , Ala (A) , Asp (D) , Phe (F) , Lys (K) , Cys (C) , Thr (T) o Tyr (Y) ; X10 es cualquier aminoácido diferente de Glu (E) ; y X13 es Phe (F) , Ala (A), Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Tyr (Y), Asp (D) o Lys (K) (SEC ID NO: 8) En algunas modalidades, X10 se selecciona de L, M, W, P, T, F, Y, C, N, D, V, I, R, K, Q, H, S , A o G. En algunas modalidades, Xi0 se selecciona de R, K, A o G (SEC ID NO: 49 ) .
En algunas modalidades, las ADN polimerasas de la invención derivadas de una especie del género Thermus se pueden caracterizar por tener la siguiente porción: Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-Ser-Arg-Asp-Gln-Leu-X10-Arg-Val-Leu-Phe-Asp-Glu-Leu (también referida en este documento en el código de una letra como A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-Xi0 - R-V-L-F-D-E-L) ; en donde Xio es cualquier aminoácido diferente de Glu (E) (SEC ID NO: 9 ) .
En algunas modalidades, las ADN polimerasas de la invención derivadas de una especie del género Thermus se pueden caracterizar por tener la siguiente porción: Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-Ser-Arg-Asp-Gln-Leu-Xio-Arg-Val-Leu-Phe-Asp-Glu-Leu (también referida en este documento en el código de una letra como A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-Xio-R-V-L-F-D-E-L) ; en donde Xio es Ala (A), Gly (G) , Lys (K) o Arg (R) (SEC ID NO: 10 ) .
En algunas modalidades, las ADN polimerasas de la invención derivadas de una especie del género Thermus se pueden caracterizar por tener la siguiente porción: Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-Ser-Arg-Asp-Gln-Leu-X10-Arg-Val-Leu-Phe-Asp-Glu-Leu (también referida en este documento en el código de una letra como A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-X10-R-V-L-F-D-E-L) ; en donde X10 es Lys (K) (SEC ID NO: 11) .
Además, en algunas modalidades, las ADN polimerasas de la invención pueden comprender sustituciones de aminoácidos adicionales, por ejemplo, en las posiciones X6 y X13 de la porción nativa (SEC ID NO:26). Las sustituciones adicionales en las posiciones Xe y X13 también pueden dar por resultado una discriminación incrementada de apareamiento erróneo en el extremo 3'. De esta manera, en algunas modalidades, las ADN polimerasas de la invención se pueden caracterizar por tener la siguiente porción: Al -Gly-Xi-X2-Phe-X3-X4-X5 - 6-X7- 8-Gln- 3-X1o-Xii-Xi2-Leu-X13-X14-Xi5- Leu (también referida en este documento en el código de una letra como A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Q-X9-X10-X11-X12-L-X13-X14-X15-L) ; en donde Xx es His (H) , Glu (E) o Gln (Q) ; X2 es Pro (P) , Thr (T) o Glu (E) ; X3 es Asn (N) O His (H) ; X4 es Leu (L) o lie (I) ,· X5 es Asn (N) o Arg (R) ; X6 es cualquier aminoácido; X7 es Arg (R) , Pro (P) o Ser (S) ; X8 es Asp (D) , Lys (K) o Thr (T) ; X9 es Leu (L) o Val (V) ; Xio es cualquier aminoácido diferente de Glu (E) , Ser (S) , Ala (A) o Gly (G) ; Xn es Arg (R) , Asn (N) , Tyr (Y) , Thr (T) o Val (V) ; X12 es Val (V) o lie (I) ; X13 es cualquier aminoácido; Xi4 es Asp (D) o Glu (E) ; y X15 es Glu (E) o Lys (K) (SEC ID NO: 42) En algunas modalidades, las ADN polimerasas de la invención se pueden caracterizar por tener la siguiente porción : Ala-Gly-Xi-Pro-Phe-Asn-X4-Asn-X6-X7-X8-Gln-X9-X10- n-Xi2-Leu-X13- Xi - i5- eu (también referida en este documento en el código de una letra como A-G-Xi-P-F-N-X4-N-X6-X7-X8-Q-X9-X1o-X1i-Xi2-L-Xi3-X14- Xi5-L) ; en donde Xi es His (H) o Glu (E) ; X4 es Leu (L) o lie (I) ; X6 es cualquier aminoácido; X7 es Arg (R) o Pro (P) ; X8 es Asp (D) o Lys (K) ; X9 es Leu (L) o Val (V) ; Xio es cualquier aminoácido diferente de Glu (E) o Ser (S) ; Xn es Arg (R) o Asn (N) ; X12 es Val (V) o lie (I) ; Xi3 es cualquier aminoácido; Xi4 es Asp (D) o Glu (E) ; y X15 es Glu (E) o Lys (K) (SEC ID NO: 43) En algunas modalidades, las ADN polimerasas de la invención se pueden caracterizar por tener la siguiente porción (correspondiente a las ADN polimerasas derivadas de Thermus y Thermotoga) : Ala-Gly-Xi-Pro-Phe-Asn-X4-Asn-Ser-X7-X8-Gln-X9-X1o-Arg-X12-Leu- Phe-Xi4-Xis-Leu (también referida en este documento en el código de una letra como A-G-Xi-P-F-N-X4-N-S-X7-X8-Q-X9-Xio-R-Xi2-L-F- X14-X15-D ; e donde: Xx es His (H) o Glu (E) ; X4 es Leu (L) o lie (I) ; X7 es Arg (R) o Pro (P) ; X8 es Asp (D) o Lys (K) ; X9 es Leu (L) o Val (V) ; X10 es cualquier aminoácido diferente de Glu (E) o Ser (S) ; X12 es Val (V) o lie (I) ; X14 es Asp (D) o Glu (E) ; y X15 es GlU (E) O Lys (K) (SEC ID NO: 44) .
En algunas modalidades, las ADN polimerasas de la invención se pueden caracterizar por tener la siguiente porción: Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-X6-Arg-Asp-Gln-Leu-Xi0-Arg-Val-Leu-Xi3-Asp-Glu-Leu (también referida en este documento en el código de una letra como A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-Xi0-R-V-L-X13-D-E-L) ; en donde X6 es cualquier aminoácido; X10 es cualquier aminoácido diferente de Glu (E) ; y X13 es cualquier aminoácido (SEC ID NO: 45) .
En algunas modalidades, las ADN polimerasas de la invención se pueden caracterizar por tener la siguiente porción: Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-Xg-Arg-Asp-Gln-Leu-Xio-Arg-Val-Leu-Xi3-Asp-Glu-Leu (también referida en este documento en el código de una letra como A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L) ; en donde X6 es cualquier aminoácido diferente de Ser (S) ; X10 es cualquier aminoácido diferente de Glu (E) ; y X13 es cualquier aminoácido diferente de Phe (F) (SEC ID NO: 46) .
En algunas modalidades, las ADN polimerasas de la invención se pueden caracterizar por tener la siguiente porción : Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-X6-Arg-Asp-Gln-Leu-Xi0-Arg-Val-Leu-Xi3-Asp-Glu-Leu (también referida en este documento en el código de una letra como A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L) ; en donde X6 es Ser (S) , Gly (G) , Ala (A) , Asp (D) , Phe (F) , Lys (K) , Cys (C) , Thr (T) o Tyr (Y) ; Xio es Ser (S) , Gln (Q) , Ala (A) , Gly (G) , Lys (K) o Arg (R) ; y Xi3 es Phe (F) , Ala (A), Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Tyr (Y), Asp (D) O Lys (K) (SEC ID NO: 47) .
En algunas modalidades, las ADN polimerasas de la invención se pueden caracterizar por tener la siguiente porción : Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-X6-Arg-Asp-Gln-Leu-Xi0-Arg-Val-Leu-Xi3-Asp-Glu-Leu (también referida en este documento en el código de una letra como A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-Xi0-R-V-L-X13-D-E-L) ; en donde Xe es Ser (S) , Gly (G) , Ala (A) , Asp (D) , Phe (F) , Lys (K) , Cys (C) , Thr (T) o Tyr (Y) ; Xio es Lys ( ) ; y X13 es Phe (F) , Ala (A), Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Tyr (Y), Asp (D) o Lys (K) (SEC ID NO:48) .
Esta porción se presenta dentro del dominio de "dedo pulgar" de muchas ADN polimerasas dependientes del tipo de ADN de la Familia A, particularmente las ADN polimerasas termoestables de bacterias termófilas (Li y colaboradores, EMBO J. 17:7514-7525, 1998) . Por ejemplo, la Figura 1 muestra un alineamiento de secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia nativa que corresponde a la porción anterior en ADN polimerasas de varias especies de bacterias : Escherichia coli, Bacillus caldotenax, Bacillus stearothermophilus, Deinococcus radiodurans, Thermosipho africanus, Thermotoga marítima, Thermotoga neopolitana, Thermus aquaticus, Ther us caldophilus, Thermus filifor us, Thermus flavus, Spsl7 de Thermus sp. , Z05 de Thermus sp. y Thermus ther ophilus . Como se muestra, la porción de la SEC ID NO: 8, excepto donde X10 es E, S, A o G, está presente en cada una de estas polimerasas, lo que indica una función conservada para esta región de la polimerasa. La Figura 2 proporciona identidades de secuencias entre estas ADN polimerasas.
Por consiguiente, en algunas modalidades, la invención proporciona una polimerasa que comprende las SEC ID NO: 8, 9, 10 u 11 (por ejemplo, donde X10 se selecciona, cuando sea apropiado en la secuencia consensual, de G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, K, R o H) que tiene la actividad y/o características mejoradas descritas en este documento y en donde la ADN polimerasa es de otra manera una ADN polimerasa de tipo silvestre o de origen natural, tal como, por ejemplo, una polimerasa de cualquiera de las especies de bacterias termófilas listadas anteriormente o es sustancialmente idéntica a esta ADN polimerasa de tipo silvestre o de origen natural. Por ejemplo, en algunas modalidades, la polimerasa de la invención comprende las SEC ID NO: 8, 9, 10 u 11 y es por lo menos 80%, 85%, 90% o 95% idéntica a las SEC ID NO:l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 36, 37, 38, 39, 40 o 41. En alguna variación, la forma no modificada de la polimerasa es de una especie del género Thermus. En algunas modalidades de la invención, la polimerasa no modificada es de una especie termófila diferente de Thermus, por ejemplo, Thermotoga. La secuencia completa de ácidos nucleicos y aminoácidos para numerosas ADN polimerasas termoestables está disponible. Cada una de las secuencias de Thermus aquaticus (Taq) (SEC ID NO:2), Thermus thermophilus (Tth) (SEC ID NO:6), especie Z05 de Thermus (SEC ID NO:l), especie Spsl7 de Thermus (SEC ID NO: 5), Thermotoga marítima (Tma) (SEC ID NO: 38) y Thermosipho africanus (Taf) (SEC ID NO: 37) la polimerasa ha sido publicada en la Publicación de Patente Internacional del PCT No. WO 92/06200. La secuencia para la ADN polimerasa de Thermus flavus (SEC ID NO: 4) ha sido publicada en Akhmetzjanov y Vakhitov (Nucleic Acids Research 20:5839, 1992). La secuencia de la ADN polimerasa termoestable de Thermus caldophilus (SEC ID NO: 7) se encuentra en EMBL/No. de Acceso de GenBank U62584. La secuencia de la ADN polimerasa termoestable de Thermus filiformis puede ser recuperada de ATCC No. de Depósito 42380 utilizando, por ejemplo, los métodos proporcionados en Patente de los Estados Unidos. No. 4,889,818, así como también la información de secuencias proporcionada en la Tabla 1. La secuencia de la ADN polimerasa de Thermotoga neapolitana (SEC ID NO: 39) es de GeneSeq Patent No. de Acceso de la Base de Datos R98144 y el documento PCT WO 97/09451. La secuencia de la ADN polimerasa termoestable de Bacillus caldotenax (SEC ID NO: 41) se describe en, por ejemplo, Uemori y colaboradores (J Biochem (Tokio) 113 (3) : 401-410, 1993; véase también, Swiss-Prot No. de Acceso de la base de datos Q04957 y Nos. de Acceso de GenBank D12982 y BAA02361) . Los ejemplos de formas no modificadas de las ADN polimerasas que se pueden modificar como se describiera en este documento también se describen en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,228,628; 6,346,379; 7,030,220; 6,881,559; 6,794,177; 6,468,775 y Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Nos. 20040005599; 20020012970; 20060078928; 20040115639. Las secuencias de polimerasa de longitud completa representativas también se proporcionan en el listado de secuencias.
En algunas modalidades, la polimerasa de la invención, igual que tiene un dominio de polimerasa que comprende las SEC ID NO: 8, 9, 10 u 11, también comprende un dominio de nucleasa (por ejemplo, que corresponde a las posiciones 1 a 291 de Z05) .
En algunas modalidades, una polimerasa de la invención es una polimerasa quimérica, es decir, que comprende regiones de polipéptidos de dos o más enzimas. Los ejemplos de estas ADN polimerasas quiméricas se describen en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,228,628. Son particularmente adecuadas las ADN polimerasas quiméricas de la familia CS, las cuales incluyen las polimerasas CS5 (SEC ID NO: 29) y CS6 (SEC ID NO: 30) y variantes de las mismas que tienen una identidad o similitud de secuencias sustancial con la SEC ID NO: 29 o la SEC ID NO: 30 (típicamente por lo menos 80% de identidad de secuencias y más típicamente por lo menos 90%, mucho más típicamente por lo menos 95% de identidad de secuencias) y de esta manera se puede modificar para contener la SEC ID NO: 8. Las ADN polimerasas CS5 y CS6 son enzimas quiméricas derivadas de Z05 de Thermus sp. y ADN polimerasas de Ther otoga marítima. (Tma) . Comprenden el dominio de 5'-nucleasa N-terminal de la enzima Thermus y la 3 ' -5 ' -exonucleasa C-terminal y los dominios de polimerasa de la enzima Tma. Estas enzimas tienen una eficiente actividad de transcriptasa inversa, pueden extender cebadores que contienen análogos de nucleótidos y pueden utilizar alfa-fosforotioato dNTPs, dUTP, dITP y también dNTPs etiquetados con la familia de tintes de fluoresceína y cianina. Las polimerasas CS5 y CS6 también son unas eficientes enzimas de PCR activadas con Mg2+. Las polimerasas quiméricas CS5 y CS6 se describen adicionalmente en, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2004/0005599.
En algunas modalidades, la polimerasa de la invención comprende las SEC ID NO: 8, 9, 10 u 11 y comprende además uno o más cambios adicionales de aminoácidos (por ejemplo, mediante la sustitución, adición o supresión de aminoácidos) en comparación con una polimerasa nativa. En algunas modalidades, estas polimerasas retienen la porción de aminoácidos de la SEC ID NO: 8 (o una porción de la SEC ID NO : 9 , 10 u 11) y comprenden además la porción de aminoácidos de la SEC ID NO:27 (que corresponde a la mutación D580X de Z05 (SEC ID NO:l)) de la siguiente manera: T-G-R-L-S-S-X7-X8-P-N-L-Q-N; en donde X7 es Ser (S) o Thr (T) ; y X8 es cualquier aminoácido diferente de D o E (SEC ID NO: 27) La mutación caracterizada por la SEC ID NO: 27 se plantea con mayor detalle en, por ejemplo, la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2009/0148891. En algunas modalidades, estas polimerasas variantes, funcionales tendrán típicamente una identidad o similitud de secuencias sustancial con la polimerasa de tipo silvestre o de origen natural (por ejemplo, las SEC ID N0:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 39, 40, 41, 42, 43 o 44) , típicamente por lo menos 80% de identidad de secuencias y más típicamente por lo menos 90%, mucho más típicamente por lo menos 95% de identidad de secuencias.
En algunas modalidades, el aminoácido en la posición Xio es sustituido por un aminoácido como se expone en las SEC ID NO: 8, 9, 10 u 11 y el aminoácido en la posición X8 es sustituido por un aminoácido como se expone en la SEC ID NO: 27. De esta manera, en algunas modalidades, el aminoácido en la posición Xi0 es cualquier aminoácido diferente de Glu (E) , Ser (S) , Ala (A) o Gly (G) , y el aminoácido en la posición X8 es cualquier aminoácido diferente de Asp (D) o Glu (E) . En algunas modalidades, las sustituciones de aminoácidos incluyen Leucina (L) , Glicina (G) , Treonina (T) , Glutamina (Q) , Alanina (A) , Serina (S) , Asparagina (N) , Arginina (R) y Lisina (K) en la posición X8 de la SEC ID NO: 27. En ciertas modalidades, donde la ADN polimerasa de la invención se deriva de Thermus sp . , las sustituciones de aminoácidos incluyen independientemente Alanina (A) , Glicina (G) , Lisina (K) o Arginina (R) en la posición X10 y Glicina (G) en la posición X8. En ciertas modalidades, las sustituciones de aminoácidos incluyen independientemente Lisina (K) en la posición Xi0 y Glicina (G) en la posición X8. Otra(s) sustitución (es) de aminoácido adecuada (s) en uno o más de los sitios identificados se puede (n) determinar utilizando, por ejemplo, métodos conocidos de mutagénesis dirigida a un sitio y determinación de desempeño de extensión de polinucleótidos en ensayos descritos adicionalmente en este documento o conocidos de otra manera para las personas expertas en el campo.
Debido a que la longitud precisa de las ADN polimerasas varía, las posiciones precisas de aminoácidos que corresponden a cada uno de Xi0 y Xe pueden variar dependiendo de la polimerasa particular utilizada. Los programas de alineamiento de secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos están disponibles fácilmente (véase, por ejemplo, aquellos referidos supra) y, dadas las configuraciones particulares identificadas en este documento, sirven para auxiliar en la identificación de los aminoácidos exactos (y codones correspondientes) para la modificación de acuerdo con la presente invención. Las posiciones que corresponden a cada una de X6 , Xio 13 y Xe se muestran en la Tabla 1 para las ADN polimerasas termoestables , quiméricas, representativas y las ADN polimerasas termoestables de especies termófilas ej emplares .
Tabla 1. Posiciones de Aminoácidos que Corresponden a las Posiciones de Porción X6, Xi0, Xi3 (por ejemplo, de las SEC ID NO: 8, 9, 10 y 11) y X8 (de la SEC ID NO: 27) en Polimerasas Ejemplares En algunas modalidades, la ADN polimerasa mutante de la presente invención se deriva de la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. (SEC ID NO:l) o una variante de la misma {por ejemplo, D580G o similares) . Como se refiriera anteriormente, en la ADN polimerasa nativa Z05 de Thermus sp, la posición Xxo corresponde a Acido glutámico (E) en la posición 493; la posición X6 corresponde a Serina (S) en la posición 488; la posición Xi3 corresponde a Fenilalanina (F) en la posición 497 de la SEC ID N0:1; y la posición X8 de la SEC ID NO: 27 corresponde a Aspartato (D) en la posición 580 de la SEC ID NO:l. De esta manera, en ciertas variaciones de la invención, la polimerasa mutante comprende por lo menos una sustitución de aminoácido, en relación con una ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. , en E493, S488, F497 y D580. De esta manera, en algunas modalidades, el aminoácido en la posición E493, no es E. En algunas modalidades, el aminoácido en la posición 493 se selecciona de G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, K, R o H. En ciertas modalidades, el residuo de aminoácido en la posición E493 es S, A, Q, G, K o R. En ciertas modalidades, el residuo de aminoácido en la posición E493 es A, G, K o R. Típicamente, el aminoácido en la posición S488, si es sustituido, no es S. En algunas modalidades, el aminoácido en la posición 488 de la SEC ID NO:l se selecciona de G, A, V, L, I, M, F, W, P, E, T, C, N, Q, D, Y, K, R o H. En ciertas modalidades, el residuo de aminoácido en la posición S488 puede ser sustituido o no sustituido y es S, G, A, D, F, K, C, T o Y. Típicamente, el aminoácido en la posición F497, si es sustituido, no es F. En algunas modalidades, el aminoácido en la posición 497 se selecciona de G, A, V, L, I, M, S, W, P, E, T, C, Y, N, Q, D, K, R o H. En ciertas modalidades, el residuo de aminoácido en la posición F497 puede ser sustituido o no sustituido y es F, A, G, S, T, Y, D o K. En ciertas modalidades, los residuos de aminoácidos en la posición D580 se pueden seleccionar de Leucina (L) , Glicina (G) , Treonina (T) , Glutamina (Q) , Alanina (A) , Serina (S) , Asparagina (N) , Arginina (R) y Lisina (K) . Los mutantes ejemplares de ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. incluyen aquellos que comprenden la(s) sustitución (es) de aminoácido (s) E493K y D580G.
Los mutantes ejemplares de ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. incluyen aquellos que comprenden la(s) sustitución (es) de aminoácido (s) E493S, E493A, E493Q, E493G, E493K, E493R, S488F, S488T, S488Y, S488G, S488A, S488D, S488K, S488C, F497Y, F497S, F497T, F497A, F497G, F497D, F497K y/o D580G. En algunas modalidades, la ADN polimerasa mutante Z05 de Thermus sp. comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos de aminoácidos E493K (o E493A, E493Q, E493G, E493S, E493R) y D580G. En algunas modalidades, la ADN polimerasa mutante Z05 de Thermus sp. comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos de aminoácidos E493K (o E493A, E493Q, E493G, E493S, E493R) y S488F (o S488T, S488Y, S488G, S488A, S488D, S488K, S488C) . En algunas modalidades, la ADN polimerasa mutante Z05 de Thermus sp. comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos de aminoácidos E493K (o E493A, E493Q, E493G, E493S, E493R) y F497S (o F497Y, F497T, F497A, F497G, F497D, F497K) . En algunas modalidades, la ADN polimerasa mutante Z05 de Thermus sp. comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos de aminoácidos E493K (o E493A, E493Q, E493G, E493S, E493R) , F497S (o F497Y, F497T, F497A, F497G, F497D, F497K) y S488F (o S488T, S488Y, S488G, S488A, S488D, S488K, S488C) . En ciertas modalidades, la ADN polimerasa mutante Z05 de Thermus sp. comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos de aminoácidos seleccionadas independientemente de E493K (o E493A, E493Q, E493G, E493S, E493R) , F497S (o F497Y, F497T, F497A, F497G, F497D, F497 ) , S488F (o S488T, S488Y, S488G, S488A, S488D, S488K, S488C) y/o D580G.
En algunas modalidades, la ADN polimerasa de la invención se deriva de una especie Thermus y el aminoácido correspondiente a la posición 493 de la SEC ID NO:l es un aminoácido que no tiene una cadena lateral con carga negativa, polar en pH neutro (por ejemplo, E) . De esta manera, en algunas modalidades, la ADN polimerasa de la invención se deriva de una especie Thermus y el aminoácido correspondiente a la posición 493 de la SEC ID NO:l tiene una cadena lateral sin carga, polar (por ejemplo, S, Q) , una cadena lateral sin carga, no polar, (por ejemplo, A, G) o una cadena lateral con carga positiva, polar (por ejemplo, R o K) en pH neutro (por ejemplo, aproximadamente pH 7.4). En algunas modalidades, el aminoácido correspondiente a la posición 493 de la SEC ID NO:l tiene una cadena lateral sin carga, no polar (por ejemplo, A, G) o una cadena lateral con carga positiva, polar (por ejemplo, R o K) . En algunas modalidades, el aminoácido correspondiente a la posición 493 de la SEC ID NO:l que tiene una cadena lateral con carga positiva, polar es R o K. En algunas modalidades, el aminoácido correspondiente a la posición 493 de la SEC ID NO:l que tiene una cadena lateral con carga positiva, polar es K.
En algunas modalidades, las ADN polimerasas de la presente invención también pueden incluir otra(s) modificación (es) no sustitutiva (s) . Estas modificaciones pueden incluir, por ejemplo, modificaciones covalentes que se sabe en el campo que confieren una ventaja adicional en aplicaciones que comprenden la extensión de polinucleótidos . Por ejemplo, en ciertas modalidades, la ADN polimerasa mutante incluye además una modificación covalente térmicamente reversible. Las ADN polimerasas que comprenden estas modificaciones térmicamente reversibles son particularmente adecuadas para aplicaciones de arranque en caliente, tales como, por ejemplo, varias técnicas de PCR de arranque en caliente. Los reactivos modificadores térmicamente reversibles factibles para el uso de acuerdo con las ADN polimerasas mutantes de la presente invención se describen en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,773,258.
Por ejemplo, las polimerasas particularmente adecuadas que comprenden una modificación covalente térmicamente reversible se producen por medio de una reacción, llevada a cabo en pH alcalino a una temperatura la cual es menor que aproximadamente 25 °C, de una mezcla de una enzima termoestable y un anhídrido de ácido dicarboxílico que tiene una fórmula general como se expone en la siguiente fórmula I: en donde Ri y R2 son hidrógeno o radicales orgánicos, los cuales pueden ser unidos; o que tiene la siguiente fórmula II : en donde Ri y R2 son radicales orgánicos, los cuales se pueden unir y los átomos de hidrógeno son cis, esencialmente como se describe en Birch y colaboradores, supra.
Las ADN polimerasas de la presente invención se pueden construir por medio de la mutación de las secuencias de ADN que codifican la polimerasa no modificada, correspondiente (por ejemplo, una polimerasa de tipo silvestre una variante correspondiente de la cual se deriva la polimerasa de la invención) , tal como mediante el uso de técnicas referidas comúnmente como mutagénesis dirigida a un sitio. Las moléculas de ácido nucleico que codifican la forma no modificada de la polimerasa pueden ser mutadas por medio de una variedad de técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocidas para una persona de experiencia ordinaria en el campo. (Véase, por ejemplo, PCR Strategies (M. A. Innis, D. H. Gelfand y J. J. Sninsky eds . , 1995, Academic Press, San Diego, CA) en el Capítulo 14; PCR Protocole: A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky y T. J. White eds., Academic Press, NY, 1990) .
A manera de ejemplo no limitante, el sistema de dos cebadores, utilizado en el kit de Mutagénesis Transformadora Dirigida a un Sitio de Clontech, se puede emplear para introducir mutantes dirigidos a un sitio en un polinucleótido que codifica una forma no modificada de la polimerasa. Después de la desnaturalización del plásmido objetivo en este sistema, dos cebadores son hibridizados simultáneamente al plásmido; uno de estos cebadores contiene la mutación dirigida a un sitio deseada, el otro contiene una mutación en otro punto en el plásmido que da por resultado la eliminación de un sitio de restricción.
La segunda síntesis de cadena entonces se lleva a cabo, uniendo estrechamente estas dos mutaciones, y los plásmidos resultantes se transforman en una cepa mutS de E. coli. El ADN plasmídico se aisla de las bacterias transformadas, se restringe con la enzima de restricción relevante (linealizando de ese modo los plásmidos no mutados) y luego se transforma en E. coli. Este sistema permite la generación de mutaciones directamente en un plásmido de expresión, sin la necesidad de subclonación o generación de fagómidos de hebra simple. La unión estrecha de dos mutaciones y la linealización subsecuente de plásmidos no mutados dan por resultado una alta eficiencia de mutación y permiten un examen mínimo. Después de la síntesis del cebador de sitio de restricción inicial, este método requiere el uso de solo un nuevo tipo de cebador por sitio de mutación. En lugar de preparar cada mutante posicional por separado, un conjunto de cebadores de oligonucleótidos "degenerados, diseñados" se pueden sintetizar con el propósito de introducir todas las mutaciones deseadas en un sitio determinado simultáneamente. Los transformantes se pueden examinar al secuenciar el ADN plasmídico a través de la región mutagenizada para identificar y clasificar clones mutantes. Cada ADN mutante entonces se puede restringir y analizar por medio de la electroforesis , tal como, por ejemplo, en un gel Potenciador de la Detección de Mutaciones (Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) para confirmar que no han ocurrido otras alteraciones en la secuencia (por medio de la comparación por desplazamiento de bandas con el control no mutagenizado) . Alternativamente, la región completa de ADN se puede secuenciar para confirmar que no han ocurrido eventos de mutación adicionales fuera de la región fijada como objetivo.
Las estructuras dúplex imitantes, verificadas en los vectores de sobre-expresión de pET (u otros) se pueden emplear para transformar E. coli tal como, por ejemplo, la cepa BL21 (DE3) pLysS de JE?, coli, para la producción a alto nivel de la proteína mutante y la purificación por medio de protocolos estándar. El método de cartografía de FAB-MS, por ejemplo, se puede emplear para verificar rápidamente la fidelidad de la expresión de mutantes . Esta técnica proporciona la secuenciación de segmentos por toda la proteína completa y proporciona la confianza necesaria en la asignación de secuencias. En un experimento de cartografía de este tipo, la proteína se digiere con una proteasa (la elección dependerá de la región específica a ser modificada puesto que este segmento es de interés fundamental y el mapa restante debe ser idéntico al mapa de una proteína no mutagenizada) . El conjunto de fragmentos de escisión se fracciona por medio de, por ejemplo, la HPLC Microbore (fase inversa o intercambio iónico, nuevamente dependiendo de la región específica a ser modificada) para proporcionar varios péptidos en cada fracción y los pesos moleculares de los péptidos se determinan por medio de métodos estándar, tal como FAB-MS. La masa determinada de cada fragmento entonces se compara con los pesos moleculares de péptidos esperados de la digestión de la secuencia pronosticada y la corrección de la secuencia se determina rápidamente. Puesto que este planteamiento de mutagénesis para la modificación de proteínas se dirige, la secuenciación del péptido alterado no debe ser necesaria si los datos de MS están de acuerdo con la predicción. Si es necesario verificar un residuo cambiado, la MS/MS con CAD-tándem se puede emplear para secuenciar los péptidos de la mezcla en cuestión o el péptido objetivo se puede purificar para la degradación sustractiva de Edman o la digestión con carboxipeptidasa Y dependiendo de la ubicación de la modificación.
Las ADN polimerasas mutantes con más de un aminoácido sustituido se pueden generar de varias maneras. En el caso de aminoácidos localizados próximos en' la cadena de polipéptido, pueden ser mutados simultáneamente utilizando un oligonucleótido que codifica todas las sustituciones de aminoácidos deseadas. Sin embargo, si los aminoácidos están localizados a alguna distancia entre sí (separados por más de diez aminoácidos, por ejemplo) es más difícil generar un oligonucleótido individual que codifique todos los cambios deseados. En cambio, se puede utilizar uno de dos métodos alternativos. En el primer método, un oligonucleótido separado se genera para cada aminoácido a ser sustituido. Los oligonucleótidos luego son hibridizados al ADN de plantilla de hebra simple simultáneamente y la segunda cadena de ADN que es sintetizada de la plantilla codificará todas las sustituciones de aminoácidos deseadas. Un método alternativo involucra dos o más periodos de mutagénesis para producir el mutante deseado. El primer periodo es como se describiera para los mutantes individuales: el ADN que codifica la polimerasa no modificada se utiliza para la plantilla, un oligonucleótido que codifica la(s) primera (s) sustitución (es) de aminoácido deseada (s) se hibridiza a esta plantilla y la molécula de ADN heterodúplex luego se genera. El segundo periodo de mutagénesis utiliza el ADN mutado que fue producido en el primer periodo de mutagénesis como la plantilla. De esta manera, esta plantilla ya contiene una o más mutaciones. El oligonucleótido que codifica la(s) sustitución (es) de aminoácido deseada (s) adicional (es) luego se hibridiza a esta plantilla y la cadena resultante de ADN ahora codifica mutaciones de tanto el primer periodo como el segundo periodo de mutagénesis. Este ADN resultante se puede utilizar como una plantilla en un tercer periodo de mutagénesis y así sucesivamente. Alternativamente, el método de mutagénesis de múltiples sitios de Seyfang & Jin (Anal. Biochem. 324:285-291. 2004) se puede utilizar.
Por consiguiente, también se proporcionan ácidos nucleicos recombinantes que codifican cualquiera de las ADN polimerasas de la presente invención (por ejemplo, polimerasas que comprenden cualquiera de las SEC ID NO: 8, 9, 10 u 11) . Utilizando un ácido nucleico de la presente invención, que codifica una ADN polimerasa de la invención, se puede hacer una variedad de vectores. Cualquier vector que contiene secuencias de replicón y de control que se derivan de una especie compatible con la célula hospedante se puede utilizar en la práctica de la invención. Generalmente, los vectores de expresión incluyen regiones de ácidos nucleicos reguladoras de transcripción y traducción unidas de manera operable al ácido nucleico que codifica la ADN polimerasa mutante. El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación unida de manera operable en un organismo hospedante particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen una secuencia promotora, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de enlace de ribosoma. Además, el vector puede contener un Elemento Retrorregulador Positivo (PRE, por sus siglas en inglés) para aumentar la vida media del ARNm transcrito (véase Gelfand y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 4,666,848). Las regiones de ácidos nucleicos reguladoras de transcripción y traducción serán apropiadas generalmente para la célula hospedante utilizada para expresar la polimerasa. Numerosos tipos de vectores de expresión apropiados y secuencias reguladoras adecuadas se conocen en el campo para una variedad de células hospedantes. En general, las secuencias reguladoras de transcripción y traducción pueden incluir, por ejemplo, secuencias promotoras, sitios de enlace de ribosoma, secuencias de inicio y detención de transcripción, secuencias de inicio y detención de traducción y secuencias potenciadoras o activadoras. En modalidades típicas, las secuencias reguladoras incluyen secuencias promotoras y de inicio y detención de transcripción. Los vectores también incluyen típicamente una región policonectora que contiene varios sitios de restricción para la inserción de ADN extraño. En ciertas modalidades, las "banderas de fusión" se utilizan para facilitar la purificación y, si se desea, la remoción subsecuente de la secuencia de etiqueta/bandera, por ejemplo, la "His-Etiqueta" . Sin embargo, éstas son innecesarias generalmente cuando se purifica una proteína termoactiva y/o termoestable de un hospedante mesófilo (por ejemplo, E. coli) donde se puede utilizar un "paso de calor" . La construcción de vectores adecuados que contienen ADN que codifica secuencias de replicación, secuencias reguladoras, genes de selección fenotípicos y la polimerasa mutante de interés se preparan utilizando procedimientos de ADN recombinante estándar. Los plásmidos aislados, vectores virales y fragmentos de ADN son escindidos, adaptados y ligados juntos en un orden específico para generar los vectores deseados, como es bien sabido en el campo (véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, Molecular Clonlng: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, NY, 2a ed. 1989) ) .
En ciertas modalidades, el vector de expresión contiene un gen marcador seleccionable para permitir la selección de células hospedantes transformadas. Los genes de selección son bien conocidos en el campo y variarán con la célula hospedante utilizada. Los genes de selección adecuados pueden incluir, por ejemplo, genes que codifican la resistencia a ampicilina y/o tetraciclina, lo cual hace posible que las células transformadas con estos vectores se desarrollen en presencia de estos antibióticos.
En un aspecto de la presente invención, un ácido nucleico que codifica una ADN polimerasa de la invención se introduce en una célula, ya sea solo o en combinación con un vector. Por "introducido en" o equivalentes gramáticos en este documento se da a entender que los ácidos nucleicos entran a las células de una manera adecuada para la integración, amplificación y/o expresión subsecuente del ácido nucleico. El método de introducción es dictado en gran medida por el tipo de célula fijada como objetivo. Los métodos ejemplares incluyen la precipitación de CaP04, fusión de liposoma, LIPOFECT NMR, electroporación, infección viral, y similares .
En algunas modalidades, las procariotas se utilizan como células hospedantes para los pasos de clonación iniciales de la presente invención. Son particularmente útiles para la producción rápida de grandes cantidades de ADN, para la producción de plantillas de ADN de hebra simple utilizadas para la mutagénesis dirigida a un sitio, para el examen de muchos mutantes simultáneamente y para la secuenciación de ADN de los mutantes generados. Las células hospedantes procarióticas , adecuadas incluyen la cepa 94 de E. coli K12 (ATCC No. 31,446) , la cepa W3110 de E. coli (ATCC No. 27,325), la cepa DG116 de E. coli K12 (ATCC No. 53,606), X1776 de E. coli (ATCC No. 31,537) y E. coli B; sin embargo, muchas otras cepas de E. coli, tales como HB101, JM101, NM522, NM538, NM539 y muchas otras especies y géneros de procariotas que incluyen bacilos tales como Bacillus subtilis, otras entérobacterias tales como Salmonella typhimurium o Serratia arcesans y varias especies de Pseudomonas se pueden utilizar en su totalidad como hospedantes. Las células hospedantes procarióticas u otras células hospedantes con paredes celulares rígidas se transforman típicamente utilizando el método de cloruro de calcio descrito en la sección 1.82 de Sambrook y colaboradores, Supra. Alternativamente, la electroporación se puede utilizar para la transformación de estas células. Las técnicas de transformación de procariot'as se exponen en, por ejemplo Dower en Genetic Engineering, Principies and Methods 12:275-296 (Plenum Publishing Corp., 1990); Hanahan y colaboradores, Meth. Enzymol, 204:63, 1991. Los plásmidos utilizados típicamente para la transformación de E. coli incluyen pBR322, pUCI8, pUCI9, pUCI18, pUC119 y Bluescript M13, todos los cuales se describen en las secciones 1.12-1.20 de Sambrook y colaboradores, Supra. Sin embargo, también están disponibles muchos otros vectores adecuados .
En algunas modalidades, las ADN polimerasas de la presente invención se producen al cultivar una célula hospedante transformada con un vector' de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica la ADN polimerasa, bajo las condiciones apropiadas para inducir o causar la expresión de la ADN polimerasa. Los métodos para cultivar las células hospedantes transformadas bajo condiciones adecuadas para la expresión de proteínas son bien conocidos en el campo (véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, supra) . Las células hospedantes adecuadas para la producción de las polimerasas a partir de los vectores plasmídicos que contienen el promotor lambda pL incluyen la cepa de DG116 de E. coli (ATCC No. 53606) (véase la Patente de los Estados Unidos No. 5,079,352 y Lawyer, F.C. y colaboradores, PCR Methods and Applications 2:275-87, 1993). Después de la expresión, la polimerasa puede ser recolectada y aislada. Los métodos para purificar la ADN polimerasa termoestable se describen en, por ejemplo, Lawyer y colaboradores, supra.
Una vez purificada, la discriminación de apareamiento erróneo en el extremo 3' de una ADN polimerasa se puede someter a ensayo. Por ejemplo, en algunas modalidades, la actividad de discriminación de apareamiento erróneo en el extremo 3 ' se determina al comparar la amplificación de una secuencia objetivo apareada perfectamente con el cebador para la amplificación de un objetivo que tiene un apareamiento erróneo individual de bases en el extremo 3' del cebador. La amplificación se puede detectar, por ejemplo, en tiempo real mediante el uso de sondas TaqManR. La capacidad de una polimerasa para distinguir entre las dos secuencias objetivo se puede calcular al comparar los valores Cps de las dos reacciones. Opcionalmente , la amplificación simultánea de un segundo gen objetivo en cada pocilio se puede realizar y detectar en un segundo canal óptico como un control. Los "valores Cp delta" se refieren a la diferencia en el valor entre el valor Cp asociado con la plantilla con apareamiento erróneo menos el valor Cp del objetivo apareado (véase, por ejemplo, los Ejemplos) . En algunas modalidades, las polimerasas mejoradas de la invención tienen un valor Cp delta de por lo menos 1, 2, 3, 4, 5 o más en comparación con una polimerasa de control de otra manera idéntica que tiene un aminoácido nativo (por ejemplo, E) en la posición Xi0 de la SEC ID NO: 8. En algunas modalidades, esta determinación se hace con las condiciones y materiales precisos que se exponen en los Ejemplos.
Métodos de la invención Las ADN polimerasas mejoradas de la presente invención se pueden utilizar para cualquier propósito en el cual es necesaria o se desea esta actividad enzimática. La ADN polimerasa mejorada puede ser una ADN polimerasa termoactiva o termoestable, como se describe en este documento. Por consiguiente, en un aspecto de la invención, se proporcionan métodos de extensión de polinucleótidos , que incluyen la PCR, utilizando las polimerasas de la invención. En algunas modalidades, la invención proporciona una ADN polimerasa termoactiva que es útil para extender una plantilla de ARN o ADN cuando no se requiere la amplificación del ácido nucleico de plantilla, por ejemplo, cuando se desea detectar inmediatamente la presencia de un ácido nucleico objetivo. En algunas modalidades, la invención proporciona una ADN polimerasa termoestable que es útil cuando se desea extender y/o amplificar un ácido nucleico objetivo. Las condiciones adecuadas para la extensión de polinucleótidos son conocidas en el campo. {Véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, supra. Véase también Ausubel y colaboradores, Short Protocols in Molecular Biology (4a ed. , John Wiley & Sons 1999) . Generalmente, un cebador se hibridiza, es decir, es hibridizado, a un ácido nucleico objetivo para formar un complejo de cebador-plantilla. El complejo de cebador-plantilla se pone en contacto con la ADN polimerasa mutante y trifosfatos de nucleósidos en un ambiente adecuado para permitir la adición de uno o más nucleótidos al extremo 3' del cebador, produciendo de ese modo una complementariedad de cebador extendida para el ácido nucleico objetivo. El cebador puede incluir, por ejemplo, uno o más análogos de nucleótidos. Además, los trifosfatos de nucleósidos pueden ser nucleótidos convencionales, nucleótidos no convencionales (por ejemplo, ribonucleótidos o nucleótidos etiquetados) o una mezcla de los mismos. En algunas variaciones, la reacción de extensión de polinucleótidos comprende la amplificación de un ácido nucleico objetivo. Las condiciones adecuadas para la amplificación de ácido nucleico utilizando un par de ADN polimerasa y cebador también son conocidos en el campo (por ejemplo, métodos de amplificación mediante la PCR) . (Véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, supra; Ausubel y colaboradores, supra; PCR Applications : Protocols for Functional Geno ics (Innis y colaboradores, eds . , Academic Press 1999) .
En algunas modalidades, el uso de las presentes polimerasas, las cuales proporcionan una discriminación incrementada de apareamiento erróneo en el extremo 3 ' , permite, por ejemplo, la detección de alelos raros. Por ejemplo, la fidelidad de la discriminación de apareamiento erróneo en el extremo 3' de una polimerasa particular establece su sensibilidad (capacidad para detectar de manera exacta pequeñas cantidades de una secuencia objetivo en presencia de cantidades más grandes de una secuencia no objetivo diferente pero relacionada) . De esta manera, la discriminación incrementada de apareamiento erróneo en el extremo 3' da por resultado una mayor sensibilidad para la detección de alelos raros. La detección de alelos raros es útil, por ejemplo, cuando se examinan biopsias u otras muestras por cambios genéticos raros, por ejemplo, una célula que lleva un alelo de cáncer en una masa de células normales.
En algunas modalidades, las polimerasas mejoradas se utilizan para la extensión de polinucleótidos en el contexto de una PCR específica para alelos o la detección de polimorfismos de nucleótidos individuales (SNP, por sus siglas en inglés) . Los métodos de detección de SNP ejemplares se describen en Chen y colaboradores, "Single nucleotide polymorphism genotyping: biochemistry, protocol, cost and throughput" Pharmacogenomics J. 3(2):77-96 (2003); Kwok y colaboradores, "Detection of single nucleotide polymorphisms" Curr. Issues Mol. Biol . 5 (2) -.43-60 (Abril de 2003); Shi, "Technologies for individual genotyping: detection of genetic polymorphisms in drug targets and disease genes" Am. J. Pharmacogenomics 2(3): 197-205 (2002); y Kwok, "Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms" Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:235-58 (2001). Las técnicas ejemplares para la detección de SNP de alto rendimiento se describen en Marnellos, "High-throughput SNP analysis for genetic association studies" Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 6(3):317-21 (Mayo de 2003). Los métodos de detección de SNP comunes incluyen, pero no están limitados a, ensayos TaqManMR, ensayos de baliza molecular, matrices de ácido nucleico, extensión de cebadores especifica para alelos, PCR específica para alelos, extensión de cebadores ordenados, ensayos de extensión de cebadores homogéneos, extensión de cebadores con detección por medio de la espectrometría de masas, pirosecuenciación, extensión de cebadores múltiples clasificada en matrices genéticas, ligadura con amplificación de círculos rodadores, ligadura homogénea, OLA (Patente de los Estados Unidos No. 4,988,167), reacción de ligadura múltiple clasificada en matrices genéticas, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción, ensayos de etiquetas de extensión de bases individuales y el ensayo Invader. Estos métodos se pueden utilizar en combinación con mecanismos de detección tales como, por ejemplo, detección de luminiscencia o quimioluminiscencia, detección de fluorescencia, detección de fluorescencia con resolución de tiempo, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, polarización de fluorescencia, espectrometría de masas y detección eléctrica.
La detección de múltiples alelos diferentes también se puede realizar utilizando reacciones múltiples, las cuales permiten la detección de múltiples alelos diferentes en una reacción individual. En las reacciones múltiples, dos o más cebadores específicos para alelos se utilizan para extender y amplificar SNPs o múltiples polimorfismos de nucleótidos o alelos. Los métodos ejemplares para la detección múltiple de polimorfismos de nucleótidos individuales y múltiples se describen en la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2006/0172324.
Otros métodos para detectar productos de extensión o productos de amplificación utilizando las polimerasas mejoradas descritas en este documento incluyen el uso de tintes fluorescentes de enlace a nucleótidos de hebra doble o tintes fluorescentes de intercalación de nucleótidos de hebra doble. Los ejemplos de los tintes fluorescentes de enlace a ADN de hebra doble incluyen SYBR-greenMR (Molecular Probes) . Los ejemplos de tintes fluorescentes de intercalación de hebra doble incluyen bromuro de etidio. Los tintes de enlace de ADN de hebra doble se pueden utilizar en conjunto con el análisis de curvas de fusión para medir los productos de extensión de cebadores y/o productos de amplificación. El análisis de curvas de fusión se puede realizar en un instrumento de PCR en tiempo real, tal como el instrumento ABI 5700/7000 (formato de 96 pocilios) o ABI 7900 (formato de 384 pocilios) con el software integrado (SDS 2.1). Alternativamente, el análisis de curvas de fusión se puede realizar como un análisis de criterio de evaluación. Los métodos ejemplares del análisis de punto de fusión se describen en la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2006/0172324.
En todavía otras modalidades, las polimerasas de la invención se utilizan para la extensión de cebadores en el contexto de la secuenciación de ADN, etiquetado de ADN o etiquetado de productos de extensión de cebadores. Por ejemplo, la secuenciación de ADN por medio del método de didesoxinucleótidos de Sanger (Sanger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 74:5463, 1977) se mejora por medio de la presente invención para las polimerasas capaces de incorporar nucleótidos de terminación de cadena, no convencionales. Los avances en el método básico de Sanger y colaboradores han proporcionado vectores. novedosos (Yanisch-Perron y colaboradores, Gene 33:103-119, 1985) y análogos de bases (Mills y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 76:2232-2235, 1979; y Barr y colaboradores, Biotechniques 4:428-432, 1986) . En general, la secuenciación de ADN requiere una extensión de cebadores dependiente de plantillas en presencia de análogos de bases terminadores de cadena, dando por resultado una distribución de fragmentos parciales que son separados subsecuentemente de acuerdo con el tamaño. El procedimiento de secuenciación de didesoxi básico involucra (i) la hibridación de un cebador de oligonucleótido, etiquetado opcionalmente, a una plantilla; (ii) la extensión del cebador con ADN polimerasa en cuatro reacciones separadas, cada una que contiene una mezcla de dNTPs no etiquetados y una cantidad limitante de un agente terminador de cadena tal como un ddNTP, etiquetado opcionalmente; y (iii) la resolución de los cuatro conjuntos de productos de reacción en un gel de poliacrilamida/urea desnaturalizante de alta resolución. Los productos de reacción se pueden detectar en el gel por medio de la autorradiografía o por medio de la detección de fluorescencia, dependiendo de la etiqueta utilizada y la imagen se puede examinar para inferir la secuencia de nucleótidos . Estos métodos utilizan la ADN polimerasa tal como el fragmento Klenow de Pol I de E. coli o una ADN polimerasa T7 modificada.
La disponibilidad de polimerasas termoestables, tal como la ADN polimerasa Taq, dio por resultado métodos mejorados para la secuenciación con ADN polimerasa termoestable (véase Innis y colaboradores, Proc. Nati. Acad.
Sci. EUA 85:9436, 1988) y modificaciones de los mismos referidos como "secuenciación por ciclado" (Murray, Nuc Acids Res. 17:8889, 1989). Por consiguiente, las polimerasas termoestables de la presente invención se pueden utilizar en conjunto con estos métodos. Como una alternativa para la secuenciación básica de didesoxi, la secuenciación por ciclado es una amplificación asimétrica, lineal de secuencias objetivo complementarias para la secuencia plantilla en presencia de terminadores de cadena. Un ciclo individual produce una familia de productos de extensión de todas las longitudes posibles. Después de la desnaturalización del producto de reacción de extensión de la plantilla de ADN, múltiples ciclos de hibridación de cebadores, extensión de cebadores ocurren en presencia de terminadores tales como ddNTPs . La secuenciación por ciclado requiere menos ADN plantilla que la secuenciación de terminación de cadena convencional . Las ADN polimerasas termoestables tienen varias ventajas en la secuenciación por ciclado, éstas toleran las temperaturas rigurosas de hibridación las cuales se requieren para una hibridación específica del cebador a objetivos de ácido nucleico así como también la tolerancia de los múltiples ciclos de desnaturalización a alta temperatura que ocurren en cada ciclo, por ejemplo, 90-95°C. Por esta razón, la ADN Polimerasa AMPLITAQMR y sus derivados y descendientes, por ejemplo, la ADN Polimerasa AmpliTaq CSMR y la ADN Polimerasa AmpliTaq FS han sido incluidas en los kits de secuenciación por ciclado de Taq comercializados por compañías tales como Perkin-Elmer (Norwalk, CT) y Applied Biosystems (Foster City, CA) .
Las polimerasas mejoradas encuentran uso en 454 sequencingMR (Roche) (Margulies, M y colaboradores 2005, Nature, 437, 376-380). 454 sequencingMR involucra dos pasos. En el primer paso, el ADN se corta en fragmentos de aproximadamente 300-800 pares de bases y los fragmentos se dejan con extremos romos. Los adaptadores de oligonucleotidos luego se ligan a los extremos de los fragmentos. Los adaptadores sirven como cebadores para la amplificación y secuenciación de los fragmentos. Los fragmentos se pueden unir a perlas de captura de ADN, por ejemplo, perlas revestidas con estreptavidina utilizando, por ejemplo, el Adaptador B, el cual contiene una etiqueta de 5'-biotina. Los fragmentos unidos a las perlas son amplificados mediante la PCR dentro de gotitas de una emulsión de aceite-agua. El resultado es múltiples copias de fragmentos de ADN amplificados clonalmente en cada perla. En el segundo paso, las perlas son capturadas en pocilios (con dimensiones de picolitros) . La pirosecuenciación se realiza en cada fragmento de ADN en paralelo. La adición de uno o más nucleótidos genera una señal luminosa que es registrada por una cámara de CCD en un instrumento de secuenciación. La intensidad de la señal es proporcional al número de nucleótidos incorporados.
La pirosecuenciación hace uso de pirofosfato (PPi) el cual está relacionado con la adición de nucleótidos. El PPi se convierte a ATP por medio de ATP sulfurilasa en presencia de 5 ' -fosfosulfato de adenosina. La luciferasa utiliza ATP para convertir luciferina a oxiluciferina y esta reacción genera luz que es detectada y analizada.
Las variaciones de los métodos de secuenciación de terminación de cadena incluyen la secuenciación de tinte-cebador y la secuenciación de tinte-terminador. En la secuenciación de tinte-cebador, los terminadores de dd TP no son etiquetados y un cebador etiquetado se utiliza para detectar los productos de extensión (Smith y colaboradores, Nature, 32:674-679, 1986). En la secuenciación de ADN de tinte-terminador, la ADN polimerasa se utiliza para incorporar dNTPs y ddNTPs etiquetados de manera fluorescente sobre el extremo de un cebador de ADN (Lee y colaboradores, Nuc. Acids. Res. 20:2471, 1992). Este proceso ofrece la ventaja de no tener que sintetizar cebadores etiquetados con tinte. Adicionalmente, las reacciones de tinte-terminador son más convenientes debido a que las cuatro reacciones se pueden realizar en el mismo tubo.
Los métodos tanto de tinte-cebador como de tinte-terminador pueden ser automatizados utilizando un instrumento de secuenciación automatizado que es producido por Applied Biosystems (Foster City, CA) (Patente de los Estados unidos No. 5,171,534). Cuando se utiliza el instrumento, la mezcla completada de la reacción de secuenciación es fraccionada en un gel de poliacrilamida desnaturalizante o tubos capilares montados en el instrumento. Un rayo láser en el fondo del instrumento detecta los productos fluorescentes conforme son separados electroforáticamente de acuerdo con el tamaño a través de gel.
Dos tipos de tintes fluorescentes se utilizan comúnmente para etiquetar los terminadores utilizados para los tintes fluorescentes con carga negativa y zwitteriónicos de secuenciación de tinte-terminador . Los tintes fluorescentes con carga negativa incluyen aquellos de las familias de fluoresceína y BODIPY. Los tintes BODIPY (4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s- indaceno) se describen en la Publicación de Patente Internacional WO 97/00967. Los tintes fluorescentes, zwitteriónicos incluyen aquellos de la familia de rodamina. Los kits de secuenciación por ciclado comercialmente disponibles utilizan terminadores etiquetados con derivados de rodamina. Sin embargo, los terminadores etiquetados con rodamina son bastante costosos y el producto debe ser separado del tinte no incorporado-ddNTPs antes de la carga en el gel puesto que co-emigran con los productos de secuenciación. Los terminadores de la familia de tinte de rodamina parecen estabilizar las estructuras de horquilla en regiones ricas en GC, lo cual causa que los productos emigren de manera anormal. Esto puede involucrar el uso de dITP, el cual relaja la estructura secundaria pero también afecta la eficiencia de incorporación del terminador.
En contraste, los terminadores etiquetados con fluoresceína eliminan el paso de separación antes de la carga en gel puesto que tienen una mayor carga negativa neta y emigran más rápido que los productos de secuenciación. Además, los productos de secuenciación etiquetados con fluoresceína tienen una mejor migración electroforética que los productos de secuenciación etiquetados con rodamina. Aunque la ADN polimerasa Taq de tipo silvestre no incorpora eficientemente terminadores etiquetados con tintes de la familia de fluoresceína, esto ahora se puede realizar eficientemente por medio del uso de las enzimas modificadas como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2002/0142333. Por consiguiente, las modificaciones descritas en el documento US 2002/0142333 se pueden utilizar en el contexto de la presente invención para producir polimerasas termoestables que se incorporan en tinte de la familia de fluoresceína que tienen tasas mejoradas de extensión de cebadores. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la ADN polimerasa no modificada de acuerdo con la presente invención es una polimerasa termoestable, modificada como se describe en el documento US 2002/0142333 y que tiene la porción expuesta en la SEC ID NO: 8 (o una porción de la SEC. ID NO: 9, 10 u 11) y opcionalmente la porción de la SEC ID NO: 27.
Otros formatos ejemplares se secuenciación de ácido nucleico en los cuales se pueden utilizar las ADN polimerasas mutantes de la invención incluyen aquellos que involucran compuestos terminadores que incluyen análogos de 2'-P04 de ribonucleótidos {véase, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitud de los Estados Unidos Nos. 2005/0037991 y 2005/0037398 y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos NO. 12/174,488).
Kits En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan kits para el uso en los métodos de extensión de cebadores descritos en este documento. En algunas modalidades, el kit está dividido en compartimientos para hacer más fácil su uso y contiene por lo menos un envase que proporciona una ADN polimerasa de la invención que tiene una discriminación incrementada de apareamiento erróneo en el extremo 3' de acuerdo con la presente invención. Uno o más envases adicionales que proporcionan reactivo (s) adicional (es) también se pueden incluir. Estos envases adicionales pueden incluir cualquier reactivo u otros elementos reconocidos por el artífice experto para el uso en procedimientos de extensión de cebadores de acuerdo con los métodos descritos anteriormente, que incluyen reactivos para el uso en, por ejemplo, procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR, RT-PCR) , procedimientos de secuenciación de ADN o procedimientos de etiquetado de ADN. Por ejemplo, en ciertas modalidades, el kit incluye además un envase que proporciona un cebador homosentido 5' hibridizable, bajo condiciones de extensión de cebadores, a una plantilla de polinucleotido predeterminada, o un par de cebadores que comprende el cebador homosentido 5' y un cebador antisentido 3' correspondiente. En algunas modalidades, el kit incluye uno o más envases que contienen uno o más cebadores que son totalmente complementarios para los polimorfismos de nucleótidos individuales o polimorfismos de nucleótidos múltiples, en donde los cebadores son útiles para las reacciones múltiples, como se describiera anteriormente. En otras variaciones no mutuamente exclusivas, el kit incluye uno o más envases que proporcionan trifosfatos de nucleósidos (convencionales y/o no convencionales) . En modalidades específicas, el kit incluye alfa-fosforotioato dNTPs , dUTP, dITP y/o dNTPs etiquetados tales como, por ejemplo, dNTPs de la familia de fluoresceína o cianina-tinte . En aún otras modalidades no mutuamente exclusivas, el kit incluye uno o más envases que proporcionan un amortiguador adecuado para una reacción de extensión de cebadores. En algunas modalidades, el kit incluye una o más sondas etiquetadas o no etiquetadas. Los ejemplos de sondas incluyen sondas de FRET (transferencia de energía por resonancia fluorescente) con doble etiqueta y sondas de baliza molecular. En otra modalidad, el kit contiene un aptámero, por ejemplo, para ensayos de PCR de inicio en caliente.
Mezclas de Reacción En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan mezclas de reacción que comprenden las polimerasas con actividad incrementada de discriminación de apareamiento erróneo en el extremo 3', como se describe en este documento. Las mezclas de reacción pueden comprender además reactivos para el uso en, por ejemplo, procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR, RT-PCR) , procedimientos de secuenciación de ADN o procedimientos de etiquetado de ADN. Por ejemplo, en ciertas, modalidades, las mezclas de reacción comprenden un amortiguador adecuado para una reacción de extensión de cebadores. Las mezclas de reacción también pueden contener un ácido nucleico de plantilla (ADN y/o ARN) , uno o más polinucleótidos de cebador o sonda, trifosfatos de nucleósido (que incluyen, por ejemplo, desoxirribonucleótidos , ribonucleótidos , nucleótidos etiquetados, nucleótidos no convencionales) , sales (por ejemplo, Mn2+, Mg2+) y etiquetas (por ejemplo, fluoróforos) . En algunas modalidades, la mezcla de reacción comprende además tintes de enlace a ADN de hebra doble, tal como SYBR greenM o tintes de intercalación de ADN de hebra doble, tal como bromuro de etidio. En algunas modalidades, la mezcla de reacción contiene un cebador homosentido 5' hibridizable, bajo condiciones de extensión de cebadores, a una plantilla de polinucleótido predeterminada, o un par de cebadores que comprenden el cebador homosentido 5' y un cebador antisentido 3' correspondiente. En ciertas modalidades, la mezcla de reacción comprende además una sonda de hidrólisis de FRET fluorogénica para la detección de ácidos nucleicos de plantilla amplificados, por ejemplo una sonda TaqManMR. En algunas modalidades, la mezcla de reacción contiene dos o más cebadores que son totalmente complementarios para polimorfismos de nucleótidos individuales o polimorfismos de nucleótidos múltiples. En algunas modalidades, las mezclas de reacción contienen alfa-fosforotioato dNTPs , dUTP, dITP y/o dNTPs etiquetado tal como, por ejemplo, dNTPs de familia de fluoresceína o cianina.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invención reclamada.
Ejemplo 1: Identificación de ADN polimerasas mutantes con discriminación incrementada de apareamiento erróneo en el extremo 3 ' Se identificó que las mutaciones en la polimerasa Z05 D580G proporcionan una capacidad reducida para extender un cebador de oligonucleótido con un apareamiento erróneo en el extremo 3' a una plantilla. En resumen, los pasos en este proceso de examen incluyeron la generación de colecciones, expresión y purificación parcial de las enzimas mutantes, el examen de las enzimas por la propiedad deseada, secuenciación de ADN, purificación clonal y caracterización adicional de mutantes candidatos, seleccionados. Cada uno de estos pasos se describe adicionalmente a continuación.
Generación de Colonias Clónales : Un ácido nucleico que codificaba el dominio de polimerasa de la ADN polimerasa Z05 D580G se sujetó a la PC propensa a errores (mutagénica) entre los sitios de restricción Blp I y Bgl II de un plásmido que incluía esta secuencia de ácidos nucleicos . La secuencia amplificada se proporciona como la SEC ID NO:33. Los cebadores utilizados para ésta se proporcionan a continuación : Cebador Directo: 5 ' -CTACCTCCTGGACCCCTCCAA-3 ' (SEC ID NO: 31) ; y Cebador Inverso : 5 ' -ATAACCAACTGGTAGTGGCGTGTAA- 3 ' (SEC ID NO: 32) .
La PCR se realizó utilizando una variedad de concentraciones de Mg2+ de 1.8-3.6 mM, con el propósito de generar colecciones con una gama de tasas de mutación. Las condiciones de amortiguador fueron Bicina 50 mM pH 8.2, KOAc 115 mM, glicerol 8% en p/v y 0.2 mM de cada dNTPs . Una enzima de PCR de Inicio en Caliente GeneAmp AccuRTMR se utilizó a 0.15 ?/µ?,. Iniciando con 5 x 105 copias de ADN plasmídico Z05 D580G linealizado por volumen de reacción de 50 µ?>, las reacciones se desnaturalizaron utilizando una temperatura de 94 °C durante 60 segundos, luego se realizaron 30 ciclos de amplificación, utilizando una temperatura de desnaturalización de 9 °C durante 15 segundos, una temperatura de hibridación de 60 °C durante 15 segundos, una temperatura de extensión de 72°C durante 120 segundos seguido por una extensión final a una temperatura de 72 °C durante 5 minutos .
El amplicón resultante se purificó con un Kit de Purificación de PCR QIAquickMR (Qiagen, Inc., Valencia, CA, EUA) y se cortó con Blp I y Bgl II y luego se purificó de nuevo con un Kit de Purificación de PCR QIAquickMR. Un plásmido de vector Z05 D580G se preparó mediante el corte con las mismas dos enzimas de restricción y el tratamiento con fosfatasa alcalina, recombinante (RAS, # de cat . 03359123001) y se purificaron con un Kit de Purificación de PCR QIAquickMR. El vector cortado y el inserto mutado se mezclaron en una relación 1:3 y se trataron con ADN ligasa T4 durante 5 minutos a temperatura ambiente (Kit NEB Quick Ligation R) . Las ligaduras se purificaron con un Kit de Purificación de PCR QIAquickMR y se transformaron en una cepa hospedante de E. coli por medio de la electroporación .
Las alícuotas de los cultivos expresados se colocaron en placas sobre un medio selectivo de ampicilina con el propósito de determinar el número de transformantes únicos en cada transformación. Las transformaciones se almacenaron de -70 °C a -80°C en presencia de glicerol como un crio-protector.
Cada colección luego se esparció sobre placas de agar selectivas de ampicilina de formato grande. Las colonias individuales se transfirieron a placas de 384 pocilios que contenían caldo Luria 2X con ampicilina y glicerol al 10% en p/v utilizando un recolector de colonias automatizado (QPix2, Genetix Ltd) . Estas placas se incubaron durante toda la noche a 30 °C para permitir que los cultivos se desarrollaran y luego se almacenaron de -70 °C a -80°C. El glicerol agregado al caldo Luria 2X fue suficientemente bajo para permitir el desarrollo del cultivo y todavía suficientemente alto para proporcionar la crio-protección. Varios miles de colonias a varios niveles de mutagénesis (Mg2+) se prepararon de esta manera para el uso posterior.
Preparación de colecciones de extracto Parte 1 — Fermentación: De las colecciones clónales descritas anteriormente, se preparó una colección correspondiente de extractos parcialmente purificados que son adecuados para propósitos de examen. El primer paso de este proceso fue hacer cultivos de expresión a pequeña escala de cada clon. Estos cultivos se desarrollaron en un formato de 96 pocilios; por lo tanto, hubo 4 placas de cultivo de expresión para cada placa de colección de 384 pocilios. 0.5 µ?> se transfirieron de cada pocilio de la placa de colección clonal a un pocilio de una placa de semillas de 96 pocilios, que contenía 150 µ?? del Medio A (véase la Tabla 3 posterior) . Esta placa de semillas se agitó durante toda la noche a 1150 rpm a 30 °C, en un incubador/agitador de placas iEMS (ThermoElectron) . Estos cultivos de semillas luego se utilizaron para inocular el mismo medio, esta vez inoculando 20 µL· en 250 µ?· del Medio A en placas de 96 pocilios de formato grande (Nunc # 267334) . Estas placas se incubaron durante toda la noche a 37°C con agitación. El plásmido de expresión contenía elementos de control transcripcional , los cuales permiten la expresión a 37°C pero no a 30°C. Después de la incubación durante toda la noche, los cultivos expresaron la proteína de clon a típicamente 1-10% de la proteína celular total. Las células de esos cultivos se recolectaron mediante la centrifugación. Estas células ya sea se congelaron (-20°C) o se procesaron inmediatamente, como se describe posteriormente.
Medio A (Esterilizada a través de un Filtro antes Preparación de colecciones de extracto Parte 2 — Extracción: Las pelotillas de células del paso de fermentación se resuspendieron en 25 µ?· de amortiguador de Lisis (Tabla 3 posterior) y se transfirieron a placas de termociclador de 384 pocilios y se sellaron. Se debe advertir que el amortiguador contenía lisozima para ayudar en la lisis de células y ADNasa para retirar el ADN del extracto. Para lisar las células, las placas se incubaron a 37 °C durante 15 minutos, se congelaron durante toda la noche a -20°C y se incubaron nuevamente a 37 °C durante 15 minutos. Se agregó sulfato de amonio (1.5 µ?? de una solución 2 M) y las placas se incubaron a 75 "C durante 15 minutos con el propósito de precipitar e inactivar proteínas contaminantes, que incluían las nucleasas agregadas de manera exógena. Las placas se centrifugaron a 3000 x g durante 15 minutos a 4°C y los sobrenadantes se transfirieron a una placa nueva de termociclador de 384 pocilios. Estas placas de extracto se congelaron a -20 °C para el uso posterior en exámenes. Cada pocilio contenía aproximadamente 0.5-3 µ? de la enzima polimerasa de colección mutante .
Tabla 3. Amortiguador de Lisis Examen de colecciones de extracto para la tasa de extensión de apareamiento erróneo de cebador en el extremo 3' reducida: La colección de extracto se examinó aí comparar la tasa de extensión de un cebador apareado perfectamente a una plantilla de oligonucleótido contra la tasa de extensión de un cebador con un apareamiento erróneo G:T en el extremo 3' .
Los extractos de enzima anteriores se diluyeron 10 veces para las reacciones de extensión de cebador al combinar 2.5 µ? de extracto con 22.5 µ? de un amortiguador que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8, KC1 100 mM, EDTA 0.1 mM y Tween-20 al 0.2% en una placa de termociclador de 384 pocilios, que cubría y calentaba durante 10 minutos a 90 °C. Las reacciones de control con un cebador apareado perfectamente combinado con 0.5 µ? del extracto diluido con 15 µ? de mezcla maestra en placas de PCR de 384 pocilios. La Extensión de la plantilla cebada se supervisó cada 10 segundos en un ciclador térmico, cinético, modificado utilizando una cámara de CCD (véase, atson, supra) . La mezcla maestra contenía plantilla de cebador cebada 50 nM, Tricina 25 mM, pH 8.3, KOAc 100 mM, SYBR Green IMR 0.6x, 200 µ? de cada dNTP, aptámero 100 mM y Acetato de Magnesio 2.5 mM. Con el propósito de distinguir la fluorescencia derivada de la extensión de la fluorescencia de fondo, se incluyeron pocilios paralelos en el experimento en el cual la extensión de cadena de cebador se impidió al excluir los nucleótidos de la mezcla maestra de reacción. Las. reacciones con el cebador apareado erróneamente en el extremo 3' se realizaron como antes excepto que 1.5 µ? del extracto diluido se agregaron a cada reacción y el Acetato de Manganeso 1.5 mM se sustituyó por el Acetato de Magnesio. El incremento tres veces de la cantidad de extracto y el uso de Manganeso como el activador de metal hacen que sea más probable la extensión de apareamiento erróneo y por lo tanto mejoran la selectividad del examen para aquellas enzimas con la capacidad más grande de discriminación contra la extensión de apareamiento erróneo en el extremo 3 ' .
Aproximadamente 5,000 extractos mutantes se examinaron utilizando el protocolo anterior. Aproximadamente 7% de la reserva original se seleccionó para el examen de nuevo con base en un valor de extensión de cebador de apareamiento perfecto por encima de un corte arbitrario y una relación baja de extensión de apareamiento erróneo con respecto a apareamiento perfecto. Se tomaron muestras de pocilios de cultivo que correspondían a los extractos superiores para refrescar el medio de desarrollo y se desarrollaron de nuevo para producir nuevas placas de cultivo que contenían los mejores mutantes, así como también una variedad de cultivos parentales a utilizarse para comparación. Estas placas de cultivo luego se utilizaron para hacer extractos frescos los cuales se examinaron de nuevo para confirmar el fenotipo de examen original. Las tasas de extensión de cebador para las reacciones con los cebadores apareados perfectamente en el extremo 3' y los cebadores apareados erróneamente en el extremo 3 ' se calcularon como la pendiente del ascenso en la fluorescencia a través del tiempo para la porción lineal de la curva. La relación de la pendiente de extensión apareada erróneamente dividida por la pendiente de extensión apareada perfectamente se utilizó para clasificar y seleccionar los mejores candidatos. Los clones seleccionados del examen de nuevo, además de la comparación del clon parental Z05 D580G, con sus genotipos y fenotipos respectivos se incluyen en la siguiente tabla.
Tabla 4 Varias Sustituciones de Aminoácidos en la posición E493 de Z05: El efecto de varias sustituciones en la posición E493 de la ADN polimerasa Z05 sobre la discriminación del apareamiento erróneo en la PCR específica para alelos se examinó. Estas sustituciones se crearon en tanto la ADN polimerasa Z05 como la ADN polimerasa Z05 D580G por medio de la mutagénesis dirigida a un sitio basada en PCR o por medio de la clonación de fragmentos de genes sintéticos en vectores para una o ambas enzimas y las enzimas mutantes expresadas se purificaron y se cuantificaron. Los mutantes de E493 de Z05 G (Glicina) , K (Lisina) y R (Arginina) ; y los mutantes de D580G de Z05 A (Alanina) , G (Glicina) , K (Lisina) y R (Arginina) se compararon con su enzima parental respectiva en un ensayo de PCR específico para alelos.
Las ADN polimerasas de control de este ejemplo son la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. de la SEC ID N0:1 o una ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. de la SEC IN NO:l excepto que el aminoácido en la posición 580 es Glicina (por ejemplo, una sustitución D580G) (en lo sucesivo, polimerasa Z05 D580G) .
Se utilizaron cebadores que amplifican una región del gen BRAF humano y se aparearon perfectamente con el objetivo cuando el objetivo lleva una mutación en el codón 600 de BRAF, V600K. Contra el objetivo de BRAF de tipo silvestre, presente en el ADN genómico humano, el cebador selectivo de alelos da por resultado un apareamiento erróneo A:C individual en el extremo 3'. El cebador común se aparea perfectamente con el gen BRAF, ya que es la secuencia de sonda, la cual permite la detección de amplificación TaqManMR en tiempo real. Cada reacción tuvo 10,000 copias (33 ng) del ADN de la línea de células Genómicas Humanas de tipo silvestre o ya sea 10,000 o 100 copias de un plásmido linealizado que contenía la secuencia mutante BRAF V600R en un volumen final de 16 µ? . Para permitir los diferentes óptimos de sal de las enzimas, las amplificaciones se realizaron utilizando un rango de concentraciones de KCl de 25 a 130 mM. Las condiciones de amortiguador fueron Tris-HCl 50 mM pH 8.0, MgCl2 2.5 mM, 0.2 mM de cada dNTP, 0.02 U/µ? de UNG y aptámero 200 nM. Los cebadores Directos e Inversos estuvieron a 100 nM y la sonda estuvo a 25 nM. Todas las ADN polimerasas se sometieron a ensayo a 20 nM y se agregó amortiguador de almacenamiento de enzima al 2% (v/v) (glicerol al 50% en v/v, KC1 100 m , Tris 20 mM pH 8.0, EDTA 0.1 mM, DTT 1 mM, Tween 20 al 0.5%) a las reacciones. Las reacciones se realizaron en un Ciclador Térmico Roche LightCycler 480R y se desnaturalizaron utilizando una temperatura de 95°C durante 60 segundos, luego se realizaron 99 ciclos de amplificación, utilizando una temperatura de desnaturalización de 92 °C durante 10 segundos y una temperatura de hibridación de 62°C durante 30 segundos.
Las reacciones fueron por duplicado, los puntos de cruce ("Cps") se calcularon por medio del método "Abs Quant/2nd Derivative Max" y los valores Cps se promediaron. La eficiencia de PCR se calculó a partir de la pendiente de las reacciones de plásmido con apareamiento perfecto de 100 y 10,000 copias a la concentración de KCl la cual dio por resultado el primer Cp de plásmido con apareamiento perfecto de 10,000 copias. El valor Cp delta con Alta Cantidad de Copias es igual a la diferencia entre los valores Cp de las reacciones con 10,000 copias del objetivo genómico de tipo silvestre apareado erróneamente en el extremo 3' y los valores Cp de las reacciones con 10,000 copias del objetivo de plásmido con apareamiento perfecto .
La siguiente tabla contiene los valores Cp promediados a la concentración de KCl para cada enzima la cual dio por resultado el primer Cp de plásmido con alta cantidad de copias y la eficiencia de PCR calculada y el valor Cp delta con alta cantidad de copias . Los datos indican que varias sustituciones de aminoácidos en la posición E493 de la ADN polimerasa Z05 da por resultado una discriminación mejorada de apareamientos erróneos de cebador en la PCR selectiva para alelos .
Tabla 5. Valores Cps de amplificación del plásmido mutante BRAF V600K contra ADN genómico Humano utilizando enzimas Z05 mutantes E493 Promedio de 4 experimentos Este ejemplo demuestra que las enzimas mutantes E493A, E493G, E493K y E493R tienen una detección mejorada de alelos raros en relación con ambas polimerasas de control, ZQ5 y Z05 D580G.
Ejemplo 2: ADN Polimerasa Taq con la mutación E491K Este ejemplo muestra que una mutación en la posición E491 de la ADN polimerasa Taq da por resultado una discriminación incrementada de apareamiento erróneo en el extremo 3 ' .
La posición de aminoácido homologa a E493 en la ADN polimerasa Z05 es E491 en la ADN polimerasa Taq. El fragmento de ADN sintético que contiene una mutación E491K (Lisina) se clonó en ADN polimerasa Taq y la proteína expresada se purificó y se cuantificó. La ADN polimerasa Taq E491K luego se comparó con la ADN polimerasa Taq parental en un ensayo de PCR selectivo para alelos.
La ADN polimerasa de control de este ejemplo es una ADN polimerasa Taq de Thermus sp. de la SEC ID NO: 2.
Se utilizaron cebadores que amplifican una región del gen BRAF humano y se aparearon perfectamente con el objetivo cuando el objetivo lleva una mutación en el codón 600 de BRAF, V600K. Contra el objetivo de BRAF de tipo silvestre, presente en el ADN genómico humano, el cebador selectivo de alelos da por resultado un apareamiento erróneo A:C individual en el extremo 3'. El cebador común se aparea perfectamente con el gen BRAF, ya que es la secuencia de sonda, la cual permite la detección de amplificación TaqManMR en tiempo real. Cada reacción tuvo 10,000 copias (33 ng) del ADN de la línea de células Genómicas humanas de tipo silvestre o ya sea 10,000 o 100 copias de un plásmido linealizado que contenía la secuencia mutante BRAF V600R en un volumen final de 16 µ? . Para permitir los diferentes óptimos de sal de las enzimas, las amplificaciones se realizaron utilizando un rango de concentraciones de KC1 de 25 a 130 mM. Las condiciones de amortiguador fueron Tris-HCl 50 mM pH 8.0, MgCl2 2.5 mM, dATP 0.2 mM, dCTP 0.2 mM, dGTP 0.2 mM, dUTP 0.4 mM, aptámero 2.0 µ? y UNG 0.02 U/µ?. Los cebadores Directos e Inversos estuvieron a 100 nM y la sonda estuvo a 25 nM. Todas las ADN polimerasas se sometieron a ensayo a 20 nM y se agregó amortiguador de almacenamiento de enzima al 2% (v/v) (glicerol al 50% en v/v, KC1 100 mM, Tris 20 mM pH 8.0, EDTA 0.1 mM, DTT 1 mM, Tween 20 al 0.5%) a las reacciones. Las reacciones se realizaron en un ciclador térmico Roche LightCycler 480MR y se desnaturalizaron utilizando una temperatura de 95 °C durante 60 segundos, luego se realizaron 99 ciclos de amplificación, utilizando una temperatura de desnaturalización de 92 °C durante 10 segundos y una temperatura de hibridación de 62 °C durante 30 segundos.
Las reacciones fueron por duplicado, los puntos de cruce ("Cps") se calcularon por medio del método "Abs Quant/2nd Derivative Max" y los valores Cps se promediaron. La eficiencia de PCR se calculó a partir de la pendiente de las reacciones de plásmido con apareamiento perfecto de 100 y 10,000 copias a la concentración de Cl la cual dio por resultado el primer Cp de plásmido con apareamiento perfecto de 10,000 copias. El valor Cp delta con Alta Cantidad de Copias es igual a la diferencia entre los valores Cp de las reacciones con 10,000 copias del objetivo genómico de tipo silvestre apareado erróneamente en el extremo 3' y los valores Cp de las reacciones con 10,000 copias del objetivo de plásmido con apareamiento perfecto.
La Tabla 6 muestra los valores Cp promediados a la concentración de KCl para cada enzima la cual dio por resultado el primer Cp de plásmido con alta cantidad de copias y la eficiencia de PCR calculada y el valor Cp delta con alta cantidad de copias. Los datos indican que una sustitución de aminoácidos en la posición E491 de la ADN polimerasa Taq da por resultado una discriminación mejorada de apareamientos erróneos de cebador en la PCR selectiva para alelos.
Tabla 6. Valores Cps de Amplificación del plásmido mutante BRAF V600K contra ADN genómico humano utilizando enzimas Taq mutantes E491 Este ejemplo demuestra que la enzima mutante E491K tiene una detección mejorada de alelos raros en relación con la enzima de control parental Taq.
Ejemplo 3: Identificación de polimerasas mutantes adicionales con discriminación incrementada de apareamiento erróneo en el extremo 3' Este ejemplo muestra que las polimerasas que tienen una mutación en la posición S488 de una ADN polimerasa Z05 de The mus sp. tienen una discriminación incrementada de apareamiento erróneo en el extremo 3' .
Las ADN polimerasas de control de este ejemplo son una ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. de la SEC ID NO:l y una ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. de la SEC ID NO : 1 excepto que el aminoácido en la posición 580 es glicina (por ejemplo, una sustitución D580G) (en lo sucesivo, la polimerasa Z05 D580G) .
Las reacciones fueron por duplicado, los puntos de cruce ("Cps") se calcularon por medio del método "Abs Quant/2nd Derivative Max" y los valores Cps se promediaron. La eficiencia de PCR se calculó a partir de la pendiente de las reacciones de plásmido con apareamiento perfecto de 100 y 10,000 a la concentración de KC1 la cual dio por resultado el primer Cp de plásmido con apareamiento perfecto de 10,000 copias. El valor Cp delta con Alta Cantidad de Copias es igual a la diferencia entre los valores Cp de las reacciones con 10,000 copias del objetivo genómico de tipo silvestre apareado erróneamente en el extremo 3 ' y los valores Cp de las reacciones con 10,000 copias del objetivo de plásmido con apareamiento perfecto.
Las condiciones de reacción se describieron en el Ejemplo 1. La Tabla 7 muestra los valores Cp promediados a la concentración de KC1 para cada enzima la cual dio por resultado el primer Cp de plásmido con alta cantidad de copias y la eficiencia de PCR calculada y el valor Cp delta con alta cantidad de copias. Los datos en la Tabla 7 indican que varias sustituciones de aminoácidos en la posición S488 de la ADN polimerasa Z05 dan por resultado una discriminación mejorada de apareamientos erróneos de cebador en la PCR selectiva para alelos.
Tabla 7. Valores Cps de Amplificación del plásmido mutante BRAF V600K contra ADN genómico Humano * Promedio de 4 experimentos Este ejemplo demuestra que las enzimas mutantes S488C, S448F, S488G, S488T, S488Y, S488A, S488D "y S488K tienen una detección mejorada de alelos raros en relación con las enzimas de control parentales, Z05 y Z05 D580G.
Ejemplo 4: Identificación de polimerasas mutantes adicionales con discriminación incrementada de apareamiento erróneo en el extremo 3 ' Este ejemplo muestra que polimerasas que tienen varias sustituciones en la posición F497 de una ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. tienen una discriminación incrementada de apareamiento erróneo en el extremo 3' . Estas sustituciones se crearon tanto en la ADN polimerasa Z05 como en la ADN polimerasa Z05 D580G mediante la clonación de fragmentos de genes sintéticos en vectores para una o ambas enzimas y las enzimas mutantes expresadas se purificaron y se cuantificaron . Los mutantes Z05 F497 A (Alanina) , G (Glicina) , S (Serina) , T (Treonina) e Y (Tirosina) ;. y los mutantes Z05 D580G D (Acido Aspártico) , K (Lisina) y S (Serina) se compararon con su enzima parental, respectiva en un ensayo de PCR específico para alelos.
Las ADN polimerasas de control de este ejemplo son una ADN polimerasa Z05 de Ther us sp. de la SEC ID N0:1 o una ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. de la SEC ID N0:1 excepto que el aminoácido en la posición 580 es glicina (por ejemplo, una sustitución D580G) (en lo sucesivo la polimerasa Z05 D580G) .
Las condiciones de reacción fueron como se describen en el Ejemplo 1. La Tabla 8 muestra los valores Cp promedio a la concentración de KCl para cada enzima la cual dio por resultado el primer Cp de plásmido con alta cantidad de copias y la eficiencia de PCR calculada y el valor Cp delta con alta cantidad de copias . Los datos indican que varias sustituciones de aminoácidos en la posición F497 de la ADN polimerasa Z05 dan por resultado una discriminación mejorada de apareamientos erróneos de cebadores en la PCR selectiva para alelos.
Tabla 8. Valores Cps de Amplificación del plásmido imitante BRAF V600K en presencia de ADN genómico humano utilizando enzimas Z05 mutantes F497 * Promedio de 4 experimentos Este ejemplo demuestra que las enzimas mutantes F497A, F497G, F497S, F497T, F497Y, F497D y F497K tienen una detección mejorada de alelos raros en relación con las enzimas de control parentales, Z05 y Z05 D580G.
Se entiende que los ejemplos y las modalidades descritas en este documento son para fines ilustrativos únicamente y que varias modificaciones o cambios en vista de los mismos serán sugeridos a las personas expertas en el campo.
LISTADO DE AMINOÁCIDOS Y NUCLEÓTIDOS INFORMAL SEC ID NO:l ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. (Z05) MKAMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGYKAV FWFDAKAPSFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGFTRLEVPGFEADDVLATL AKKAEREGYEVRILTADRDLYQLVSDRVAVLHPEGHLITPEWLWEKYGLKPEQWVDFRALVGD PSDNLPGV GIGEKTALKLL E GSLENILKNLDRVKPESVRERIKAHLEDLKLSLELSRVRS DLPLEVDFARRREPDREGLRAFLERLEFGSLLHEFGLLEAPAPLEEAP PPPEGAFVGFVLSR PEPMWAELKALAACKEGRVHRAKDPLAGLKDLKEVRGLLAKDLAVLALREGLDLAPSDDPMLL AYLLDPSNTTPEGVARRYGGE TEDAAHRALLAERLQQNLLERL GEEKLLWLYQEVEKPLSR VLAHMEATGVRLDVAYL-^SLEIAEEIRRLEEEWRLAG LGKTQKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQHRELTKLKNTYVDPLPGLVHPRTGRLHTRFN QTATATGRLSSSDPNLQNIPIRTPLGQRIRRAFVAEAGWALVALDYSQIELRVLAHLSGDENL IRWQEGKDIHTQTASWMFGVSPEAVDPLMRRAAKT NFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAVA FIERYFQSFPKVRA IEKTLEEGRKRGYVETLFGRRRYVPDLNARVKSVREAAERMAFNMPVQ GTAADLM LAMVKLFPHLREMGARMLLQVHDELLLEAPQARAEEVAALA EAMEKAYPLAVPL EVEVGIGEDWLSAKG SEC ID NO:2 ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVI WFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLA KKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPA LWEKYGLRPDQWADYRALTGDE SDNLPGVKGIGEKTARKLLEE GSLEALLKNLDRL PAIREKILAH DDLKLSWDLAKVRTDL PLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKE PMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAY LLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLL LYREVERPLSAVL AHMEATGVl^DVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIG KTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQT ATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIR VFQEGRDIHTETAS MFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFI ERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGT AADLMKLAMV LFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEV EVGIGEDWLSAKE SEC ID NO:3 ADN polimerasa de Thermus filiformis (Tfi) MLPLLEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGEVAIWF DAKAPSFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLVRLEVPGFEADDVLATLARKA EREGYEVRILSADRDLYQLLSDRIHLLHPEGEVLTPGWLQERYGLSPERWVEYRALVGDPSDN LPGVPGIGEKTALKLLKEWGSLEAILKNLDQV PERVWEAIRNNLDKLQMSLELSRLRTDL L EVDFAKRREPTGKGLKAFLERLEFGSLLHEFGLLEAPKEAEEAPWPPPGGAFLGFLLSRPEPM WAELLALAGAKEGRVHRAEDPVGALKDLKEIRGLLAKDLSVLALREGREIPPGDDPMLLAYLL DPGNTNPEGVARRYGGEWKEDAAARALLSERLWQALYPRVAEEERLLWLYREVERPLAQVLAH MEATGVRLDVPYLEALSQEVAFELERLEAEVHRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPPIGKT EKTGKRSTSAAA/LELLREAHPIVGRILEYRELMKLKSTYIDPLPRLVHPKTGRLHTRFNQTAT ATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRKAFIAEEGHLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVF REGKDIHTETAA MFGVPPEGVDGAMRRAAKTVNFGVLYGMSAHRLSQELSIPYEEAAAFIER YFQSFPKVRAWIAKTLEEGR KGYVETLFGRRRYVPDLNARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAA DILMKLAMVKLFPRLRPLGVRILLQVHDELVLEAPKARAEEAAQLAKE™EGVYPLSVPLEVEV GMGED LSA E SEC ID NO:4 ADN polimerasa de Thermtis fl vus (Tfl) MAMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDVVW VFDAKAPSFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLVRLEVPGFEADDVLATLAK RAEKEGYEVRILTADRDLYQLLSERIAILHPEGYLI PAWLYE YGLRPEQWVDYRALAGDPS DNIPGV GIGEKTAQRLIREWGSLE LFQHLDQYKPSLREKLQAGMEALALSRKLSQVHTDLP LEVDFGRRRTP LEGLRAFLERLEFGSLLHEFGLLEGPKAAEEAPWPPPEGAFLGFSFSRPEP MWAELLALAGAWEGRLHRAQDPLRGLRDLKGVRGILAKDLAVLALREGLDLFPEDDPMLLAYL LDPSNOTPEGVARRYGGE TEDAGERALLAERLFQTLKERL GEERLLWLYEEVEKPLSRVLA KMEATGVRLDVAYLQALSLEVEAEVRQLEEEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGK TE TGKRSTSAAVLEALREAHPIVDRILQYRELTKLK TYIDPLPALVHP TGRLHTRFNQTA TATGRIiSSSDPNLQNIPWTPLGQRIRRAFVAEEG VLWLDYSQIELRVLAHLSGDENLIRV FQEGRDIHTQTASWMFGVSPEGVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSGELSIPYEEAVAFIE RYFQSYPKVRAWIEGTLEEGIURGYVETLFGRRRWPDLNARVKSVREAAERMAFN PVQGTA ADLI^LAIWRLFPRLQELGAR LLQVHDELVLEAPKDRAERVAALAKEVMEGVWPLQVPLEVE VGLGEDWLSAKE SEC ID NO:5 ADN polimerasa Spsl7 de Thermus sp. (Spsl7) LPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGEVAIWF DAKAPSFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLVRLEVPGFEADDVLATLA KA EREGYEVRILSADRDLYQLLSDRIHLLHPEGEVLTPGWLQERYGLSPERWVEYRALVGDPSDN LPGVPGIGEKTALKLLKEWGSLEAILKNLDQVKPERVREAIRN LDKLQMSLELSRLRTDLPL EVDFAKRREPDWEGLKAFLERLEFGSLLHEFGLLEAPKEAEEAPWPPPGGAFLGFLLSRPEPM WAELLALAGAKEGRVHRAEDPVGALKDLKEIRGLLAKDLSVLALREGREIPPGDDPMLLAYLL DPGNT PEGVARRYGGE KEDAAARALLSERLWQALYPRVAEEERLLWLYREVERPLAQVLAH MEATGVRLDVPYLEALSQEVAFELERLEAEVHRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPPIGKT EKTGKRSTSAAVLELLREAHPIVGRILEYRELMKLKS YIDPLPRLVHPKTGRLHTRFNQ AT ATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRKAFIAEEGHLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVF REGKDIHTETAA MFGVPPEGVDGAMRRAAKWNFGVLYGMSAHRLSQELSIPYEEAAAFIER YFQSFPKVRA IAKTLEEG KKGYVETLFGRRRYVPDLNARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAA DLMKLAMVKLFPRLRPLGWILLQVHDELVLEAPKARAEEAAQLAKETI^GVYPLSVPLEVEV GMGEDWLSAKA SEC ID NO:6 ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth) MEAMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGYKAV FWFDAKAPSFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGFTRLEVPGYEADDVLATL AKKAEKEGYEVRILTADRDLYQLVSDRVAVLHPEGHLITPEWLWEKYGLRPEQWVDFRALVGD PSDNLPGV GIGE TALKLLKEWGSLENLLK LDRVKPE VREKIKAHLEDLRLSLELSRVRT DLPLEVDLAQGREPDREGLRAFLERLEFGSLLHEFGLLEAPAPLEEAP PPPEGAFVGFVLSR PEP1^AELKMJAACRIX5RVHRAADPLAGLKDLKEVRGLLAKDLAVLASREGLDLVPGDDPMLL AYLLDPSNTTPEGVARRYGGE TEDAAHRALLSERLHR LLKRLEGEEKLLWLYHEVEKPLSR VLAH^ATGVRRDVAYLQALSI^ELAEEIRRLEEEVFRLAGH^ LG TQKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQHRELTKLKNTYVDPLPSLVHPRTGRLHTRFN QTATATCRLSSSDPNLQNIPWTPLGQRIRRAFVAELAGWALVALDYSQIELRVLAHLSGPENL IRVFQEGKDIHTQTASWMFGVPPEAVDPLMRRAAK VNFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAVA FIERYFQSFPKVRA IEKTLEEGRKRGYVETLFGRRRWPDLNARVKSVREAAERl^F MPVQ GTAADLIXKLA-WKLFPRLREMGARMLLQVHDELLLEAPQARAEEVAALA EAMEKAYPLAVPL EVEVGMGED I,SAKG SEC ID N0:7 ADN polimerasa de Thermus caldophilus (Tca) ME3AMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKA,KEDGYKAV FWFDAKAPSFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGFTRLEVPGYEAjDDVLATL AJ^PEKEGYEWILTADRDLDQLVSDRVAVLHPEGHLITPEWL QKYGLKPEQ VDFRALVGD PSDISnjPGVKGIGEKTALKLLKEWGSLENLLKNLDRV PE VREKIKAHLEDLRLSLELSRVRT DLPLEVDLAQGREPDREGLRAFLERLEFGSLLHEFGLLEAPAPLEEAP PPPEGAFVGFVLSR PEPMWAELKALAACRDGRVHRAADPLAGLKDLKEVRGLLAKDLAVLASREGLDLVPGDDP LL AYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEDAAHRALLSERLHRNLLKRLQGEEKLLWLYHEVEKPLSR VLAHMEATGVRLDVAYLQALSLELAEEIRRLEEEVFRLAGHPF LNSRDQLERVLFDELRLPA LGKTQKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQHRELTKLKNTYVDPLPSLVHPNTGRLHTRFN QTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFVAEAG ALVALDYSQIELRVLAHLSGDENL I VFQEGKDIHTQTASWMFGVPPEAVDPLMRRAAKTVNFGVLYGMSAHRLSQEDAIPYEEAVA FIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRKRGYVETLFGRRRWPDLNARVKSVREAAERMAF MPVQ GTAADLMKLAMVKLFPRLREMGAR^LQVHDELLLEAPQAGAEF^/^AALAKEAMEKAYPLAVPL EVEVGMGEDWLSAKG SEC ID NO:8 A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L, en donde X6 es S, G, A, D, F, K, C, T o Y; X10 es un aminoácido diferente de E; y X13 es F, A, G, S, T, Y, D o K .
SEC ID NO: 9 A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-X10-R-V-L-F-D-E-L, en donde X10 es un aminoácido diferente de E.
SEC ID NO: 10 A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-X10-R-V-L-F-D-E-L, en donde X10 es A, G, K o R.
SEC ID NO: 11 A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-X10-R-V-L-F-D-E-L, en donde: X10 es K.
SEC ID NO: 12 Z05 EEEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELRLPALGKT SEC ID NO: 13 Taq EAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKT SEC ID NO: 14 Tfi EAEVHRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPPIGKT SEC ID NO: 15 Tfl EEEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKT SEC ID NO: 16 Spsl7 EAEVHRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPPIGKT SEC ID NO: 17 Tth EEEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELRLPALGKT SEC ID NO: 18 Tea EEEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELRLPALGKT SEC ID NO: 19 Tma AEEIYRIAGEPFNINSPKQVSRILFEKLGIKPRGKT SEC ID NO: 20 Tne AEKIYQIAGEPFNINSP QVSNILFEKLGIKPRGKT SEC ID NO:21 Taf KEKVFEIAGETFNLNSSTQVAYILFEKLNIAPY-KK SEC ID NO: 23 Dra ESQIHEYAGEEFHIRSPKQLETVLYDKLELASSKKT SEC ID NO: 24 Bst ERRIYELAGQEFNINSPKQLGTVLFDKLQLPVLKKT SEC ID NO: 25 Bca EQRIYELAGQEFNINSPKQLGVILFEKLQLPVLKKS SEC ID NO: 26 configuración consensual nativa A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Q-X9-X10-X11-X12-L-X13-X14-X15-L, en donde XI es H, E o Q; X2 es P, T o E; X3 es N o H; X4 es L o I; X5 es N o R; X6 es S; X7 es R, P o S; X8 es D, K o T; X9 es L o V; X10 es E, S, A o G; Xll es R, N, Y, T O V; X12 es V o I; X13 es F o Y; X14 es D o E; y X15 es E o K.
SEC ID NO: 27 configuración de Z05 D580 modificada T-G-R-L-S-S-X7-X8-P-N-L-Q-N en donde X7 es Ser (S) o Thr (T) ; y X8 es cualquier aminoácido diferente de Asp (D) o Glu (E) .
SEC ID NO: 28 Sitio activo conservado de ADN polimerasa DYSQIELR SEC ID NO:29 ADN polimerasa CS5 MKAMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGYKAV FWFDAKAPSFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGFTRLEVPGFEADDVLATL AKKAEREGYEVlILTADRDLYQLVSDRVAvLHPEGHLITPEWLWEKYGLKPEQWVDFRALVGD PSDNLPGVKGIGEKTALKLLKEWGSLENILKNLDRVKPESVRERIKAHLEDLKLSLELSRVRS DLPLEVDFARRREPDREGLRAFLERLEFGSLLHEFGLLEESEPVGYRIVKDLVEFEKLIEKLR ESPSFAIDLETSSLDPFDCDIVGISVSFKPKEAYYIPLHHRNAQNLDEKEVLKKLKEILEDPG AKIVGQNLKFDYKVLMVKGVEPVPPYFD MIAAYLLEPNEKKFNLDDLALKFLGYKMTSYQEL SFSFPLFGFSFADVP EKAA YSCEDADITYRLYKTLSLKLHEADLENVFYKIEMPLVNVLA R ELNGVYVDTEFLKKLSEEYGKKLEELAEEIYRIAGEPFNINSPKQVSRILFEKLGIKPRGK TTKTGDYSTRIEVLEELAGEHEIIPLILEYRKIQKLKS YIDALP VNPKTGRIHASFNQTG TATGRLSSSDPNLQNLPTKSEEGKEIRKAIVPQDPNWWIVSADYSQIELRILAHLSGDENLLR AFEEGIDVHTLTASRIFNYKPEEVTEEMRIIAGK-WNFSIIYGVTPYGLSVRLGVPVKEAEKMI VNYFVLYPKVRDYIQRWSEAKEKGYVRTLFGRKRDIPQLMARDRNTQAEGERIAINTPIQGT AAD11KLAMIEIDRELKERKMRSKMIIQVHDELVFEVPNEEKDALVELVKDRMTNWKLSVPL EVDVTIGKTWS SEC ID NO:30 ADN poliraerasa CS6 MKAMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGYKAV FWFDAKAPSFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGFTRLEVPGFEADDVLATL AKKAEREGYE VRI LTADRDL YQLVSDRVAVLHPEGHL I PEWLWEKYGLKPEQWVDFRALVGD PSDNLPGVKGIGEKTALKLLKEWGSLENILK LDRVKPESVRERIKAHLEDL LSLELSRVRS DLPLEVDFARRREPDREGLRAFLERLEFGSLLHEFGLLEESEPVGYRIVKDLVEFEKLIEKLR ESPSFAIALATSSLDPFDCDIVGISVSF PKEAYYIPLHHRNAQNLDEKEVL KLKEILEDPG AKIVGQNLKFDYKVLIWKGVEPVPPYFDTMIAAYLLEPNEKKFNLDDLALKFLGYKMTSYQEL MSFSFPLFGFSFADVPVEKAANYSCEDADITYRLY TLSLKLHEADLE YKIE PLVm^LA R ELNGVYVDTEFLKKLSEEYGKKLEELAEEIYRIAGEPFNINSPKQVSRILFEKLGI PRGK TTKTGDYSTR I EVLEEL AGEHE IIPLILEYRKI QKLKSTY I DAL PKMV PKTGRI HAS FNQTG TATGRLSSSDPNLQNLPTKSEEGKEIRKAIVPQDP WIVSADYSQIELRILAHLSGDENLLR AFEEGIDVHTLTASRIFIWKPEEVTEEMRRAGKMV^ V YFVLYPKVRDYIQRWSEAKEKGY TLFGRKRDIPQL ARDRNTQAEGERIAINTPIQGT AADIIKLAMIEIDRELKERKMRSKMIIQVHDELVFEVPNEEKDALVELVKDRM NVVKLSVPL EVDVTIGK WS SEC ID NO:31 Cebador Directo 5'- CTACCTCCTGGACCCCTCCAA-3' SEC ID NO:32 Cebador Inverso 5'- ATAACCAACTGGTAGTGGCGTGTAA-3 * SEC ID NO:33 Dominio de polimerasa de la ADN polimerasa Z05 D580G CTACCTCCTGGACCCCTCCAACACCACCCCCGAGGGGGTGGCCCGGCGCTACGGGGGGGAGTG GACGGAGGACGCCGCCCACCGGGCCCTCCTCGCTGAGCGGCTCCAGCAAAACCTCTTGGAACG CCTCAAGGGAGAGGAAAAGCTCCTTTGGCTCTACCAAGAGGTGGAAAAGCCCCTCTCCCGGGT CCTGGCCCACATGGAGGCCACCGGGGTAAGGCTGGACGTGGCCTATCTAAAGGCCCTTTCCCT GGAGCTTGCGGAGGAGATTCGCCGCCTCGAGGAGGAGGTCTTCCGCCTGGCGGGCCACCCCTT CAACCTGAACTCCCGTGACCAGCTAGAGCGGGTGCTCTTTGACGAGCTTAGGCTTCCCGCCCT GGGCAAGACGCAAAAGACGGGGAAGCGCTCCACCAGCGCCGCGGTGCTGGAGGCCCTCAGGGA GGCCCACCCCATCGTGGAGAAGATCCTCCAGCACCGGGAGCTCACCAAGCTCAAGAACACCTA CGTAGACCCCCTCCCGGGCCTCGTCCACCCGAGGACGGGCCGCCTCCACACCCGCTTCAACCA GACAGCCACGGCCACGGGAAGGCTCTCTAGCTCCGGGCCCAACCTGCAGAACATCCCCATCCG CACCCCCTTGGGCCAGAGGATCCGCCGGGCCTTCGTGGCCGAGGCGGGATGGGCGTTGGTGGC CCTGGACTATAGCCAGATAGAGCTCCGGGTCCTCGCCCACCTCTCCGGGGACGAGAACCTGAT CAGGGTCTTCCAGGAGGGGAAGGACATCCACACCCAGACCGCAAGCTGGATGTTCGGCGTCTC CCCGGAGGCCGTGGACCCCCTGATGCGCCGGGCGGCCAAGACGGTGAACT CGGCGTCCTCTA CGGCATGTCCGCCCATAGGCTCTCCCAGGAGCTTGCCATCCCCTACGAGGAGGCGGTGGCCTT TATAGAGCGCTACTTCCAAAGCTTCCCCAAGGTGCGGGCCTGGATAGAAAAGACCCTGGAGGA GGGGAGGAAGCGGGGCTACGTGGAAACCCTCTTCGGAAGAAGGCGCTACGTGCCCGACCTCAA CGCCCGGGTGAAGAGCGTCAGGGAGGCCGCGGAGCGCATGGCCTTCAACA GCCCGTCCAGGG CACCGCCGCCGACCTCATGAAGCTCGCCATGGTGAAGCTCTTCCCCCACCTCCGGGAGATGGG GGCCCGCATGCTCCTCCAGGTCCACGACGAGCTCCTCCTGGAGGCCCCCCAAGCGCGGGCCGA GGAGGTGGCGGCTTTGGCCAAGGAGGCCATGGAGAAGGCCTATCCCCTCGCCG GCCCCTGGA GGTGGAGGTGGGGATCGGGGAGGACTGGCTTTCCGCCAAGGGCTGATATCAGATCTCCCTGAT TATGCGTCAGTCTATGAAGAAAAATCGTATACAGATGGACGAAGAGAGAATCCTTGTGAATTT AACAGAGGGTATAGGGATTACACGCCACTACCAGTTGGTTAT SEC ID NO:34 - secuencia de BRAF de tipo silvestre AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTT TGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGTAAGAATTGAGGCTA SEC ID NO:35 - secuencia de BRAF V600R muíante AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAAGGAAATCTCGA GGAGTGGGTCCCATCAGTT TGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGTAAGAATTGAGGCTA SEC ID NO:36 ADN polimerasa de Deinococcus radioduratts (Dra) MADASPDPSKPDALVLIIXSHALAFRSYFALPPL NSKGEOTDAIVGFmLLLRLARQKSNQVI WFDPPVKTLRHEQYEGYKSGRAQTPEDLRGQI RIRALVDALGFPRLEEPGYEADDVIASLT RMAEGKGYEVRIVTSDRDAYQLLDEHVKVIA1TOFSLIGPAQVEEKYGV1VRQWVDYRALTGDA SDNIPGAKGIGPKTAAKLLQEYGTLEKVYEAAHAGTLKPDGTRKKLLDSEE VKFSHDLSCMV TDLPLDIEFGVRRLPDNPLVTEDLLTELELHSLRPMILGLNGPEQDGHAPDDLLEREHAQTPE EDEAAALPAFSAPELAEWQTPAEGAWGYVLSREDDLTAALLAAATFEDGVARPARVSEPDE AQAEAPENLFGELLPSDKPLTKKEQKALEKAQKDAEKARAKLREQFPATVDEAEFVGQRTVTA AAAlUU-iAAHLSVRGTWEPGDDPLLYAYLLDPAWTl^PWAKRYLDREWPADAPTRAAITGHL VRELPPLLDDARRKMYDE1^KPLSGVLGR¾IEVRGVQVDSDFLQTLSIQAGVRLADLESQIHEY AGEEFHIRSPKQLETVLYDKLELASSKKTKLTGQRSTAVSALEPLRDAHPIIPLVLEFRELDK LRG YLDPIPNLV PHTGRLHTTFAQTAVATGRLSSLNPNLQNIPIRSELGREIRKGFIAEDG FTLIAADYSQIELRLLAHIADDPLMQQAFVEGADIHRRTAAQVLGLDEATVDA QRRAAKTVN FGVLYG SAHRLSNDLGI YAEAATFIEIYFATYPGIRRYINHTLDFG THGYVETL GRRRY VPGLSSR RVQREAEERLAYimPIQGTAADIMKLA!WQLDPQLDAIGARiiLLQVHDELLIFJVP LDKAEQVAALTKKVMENWQL VPLAVEVGTGPNWFDTK SEC ID NO:37 ADN polimerasa de Thermosipho africanas (Taf) MGKMFLFDGTGLVYRAFYAIDQSLQTSSGLHTNAVYGLTK LIKFLKEHISIGKDACVFVLDS KGGSKKRKDILETYKANRPSTPDLLLEQIPYVEELVDALGIKVLKIEGFEADDIIATLSKKFE SDFEKV IITGDKDLLQLVSDKVFVWRVERGITDLVLYDR KVIEKYGIYPEQFKDYLSLVGD QIDNIPGVKGIG KTAVSLLKKYNSLE VLKNINLLTEKLRRLLEDSKEDLQKSIELVELIYD VPMDVEKDEIIYRGY PDKLLKVLKKYEFSSIIKELNLQEKLEKEYILVDNEDKLKKLAEEIE Y TFSIDTETTSLDPFEAKLVGISISTMEGKAYYIPVSHFGAK ISKSLIDKFLKQILQEKD Y IVGQNLKFDYEIF SMGFSPNVPHFDTMIAAYLLNPDEKRFNLEELSLKYLGYKMISFDEL V E VPLFGNDFSYVPLERAVEYSCEDADV YRIFRKLGRKIYENEMEKLFYEIEMPLIDVLS EMELNGVYFDEEYLKELSKKYQE MDGIKE VFEIAGETFNLNSSTQVAYILFEKLNIAPYKK TATGKFSTNAEVLEELSKEHEIAKLLLEYRKYQKLKSTYIDSIPLSINRKT RVHTTFHQTGT STGRLSSSNPNLQNLPTRSEEGKEIR AVRPQRQDWWILGADYSQIELRVIiAHVSKDENLLKA FKEDLDIHTITAAKIFGVSEMFVSEQMRRVGKMVNFAIIYGVSPYGLSKRIGLSVSETKK11D NYFRYYKG EYLKRMKDEARKKGYVTTLFGRRRYIPQLRSKNGNRVQEGERIAV TPIQGTA ADIIKIAMINIHNRLKKENLRSKMILQVHDELVFEVPDNELEIVKDLVRDEMENAVKLDVPLK VDVYYGKEWE SEC ID NO:38 ADN polimerasa de Thermotoga marítima (Tma) MARLFLFDGTALAYRAYYALDRSLSTSTGIPTNATYGVARMLVRFIKDHIIVGKDYVAVAFDK -^ F HKLLE YKAQRPK PDLLIQQLPYIKKLVFJ^G!KVLEVEGYEADDIIA LAVKGLP LFDEIFIVTGPKDM^QLVWEKIKVWRIVKGISDLELYDAQKV EKYGVEPQQIPDLLALTGDE IONIPGVTGIGEKTAVQLLEKYKDLEDILNHVRELPQKVRKALLRDRENAILSKKLAILET V PIEI WEELRYQGYDREKLLPLLKELEFASIMKELQLYEESEPVGYRIVKDLVEFEKLIEKLR ESPSFAIDLETSSLDPFDCDIVGISVSFKP EAYYIPLHHRAQNLDEKEVLKKLKEILEDPG AKIVGQ-^KFDYKVLMVKGVEPVPPYFDTMIAAYLLEPNE KFNLDDLALKFLGYKMTSYQEL MSFSFPLFGFSFADVPVEKAAYSCEDADITYRLYKTLSLKLHEADLE VFYKIEMPLV VLA RMELNGVYVDTEFLKKLSEEYGKKLEELAEEIYRIAGEPFNINSPKQVSRILFEKLGIKPRGK TTKTGDYSTRIEVLEELAGEHEIIPLILEYRKIQKLKSTYIDALPKMVNPKTGRIHASFNQTG TATGRLSSSDPNLQNLPTKSEEGKEIR AIVPQDPNWWIVSADYSQIELRILAHLSGDENH.R AFEEGIDVHTLTASRIFIWKPEEV EEMRRAGKMV FSIIYGVTPYGLSVR^GVPVKEAEKMI VNYFVLYPKVRDYIQRWSEAKEKGYVRTLFGRKRDIPQLMARDR TQAEGERIAINTPIQGT AAD11KLAMIE1DRELKERKMRSKM11QVHDELVFEVPNEEKDALVELVKDRMT WKLSVPL EVDVTIGKTWS SEC ID NO:39 ADN polimerasa de Thermotoga neopolitana (Tne) MARLFLFDG ALAYRAYYALDRSLSTSTGIPTNAVYGVARMLVKFIKEHIIPEK YAAVAFDK KAATFRHKLLVSDKAQRPKTPALLVQQLPYI RLIEALGFKVLELEGYEADDIIATLAVRAAR FI^FSLITGDKDMLQLV EKIKV RIVKGISDLELYDSKKVKERYGVEPHQIPDLLALTGDD IDNIPGV GIGEKTAVQLLGKYR LEYILEHARELPQRVR MJLRDREVAILSKKLATLVT A PVEVD EEMKYRGYDKRKLLPILKELEFASIMKELQLYEEAEPTGYEIV DHKTFEDLIEKLK EVPSFALDLETSSLDPFNCEIVGISVSFKPKTAYYIPLHHRNAHNLDETLVLSKLKEILEDPS SKIVGQ LKYDYKVLMVKGISPVYPHFDTMIAAYLLEPNEKKFNLEDLSLKFLGYKMTSYQEL MSFSSPLFGFSFADVPVDKAAEYSCEDADITYRLYKILSMKLHEAELENVFYRIEMPLV VLA RMEF WVYVDTEFLKKLSEEYGKKLEELAEKIYQIAGEPFNINSPKQVSNILFEKLGIKPRGK TT TGDYSTRIEVLEEIANEHEIVPLILEFRKILKLKSTYIDTLPKLV PKTGRFHASFHQTG TATGRLSSSDPNLQNLPTKSEEGKEIRKAIVPQDPDW IVSADYSQIELRILAHLSGDENLVK AFEEGIDVHTLTASRIYNVKPEEWEFjtRRVGKlW FSIIYGVTPYGLSVRLGIPVKEAEKMI ISYFTLYPKVRSYIQQWAEAKEKGYVRTLFGRKRDIPQLMARDKNTQSEGERIAINTPIQGT AADIIKLAMIDIDEELRKRMKSEMIIQVHDELVFEVPDEEK^ EVDISIGKS S SEC ID NO:40 ADN polimerasa de Bacillus stearothermophüus (Bst) MK KLVLIDGNSVAYRAFFALPLLH DKGIHTNAVYGFTMMLNKILAEEQPTHILVAFDAGKT TFRHETFQDYKGGRQQTPPELSEQFPLLRELLKAYRIPAYELDHYEADDIIGTMAARAEREGF AVKVISGDRDLTQLASPQVTVEITKKGITDIESYTPETWEKYGLTPEQIVDLKGLMGDKSDN IPGVPGIGEKTAVKLLKQFGTVE VLASIDEIKGE LKENLRQYRDLALLSKQLAAICRDAPV ELTLDDIVYKGEDREKWALFQELGFQSFLDKMAVQTDEGEKPLAGMDFAIADSVTDEMLADK AALVVEWGDNYHHAPIVGIALANERGRFFLRPETALADPKFLAWLGDETKKK MFDSKRAAV ALKWKGIELRGWFDLLLAAYLLDPAQAAGDVAAVAKMHQYEAVRSDEAVYGKGAKRTVPDEP TLAEHLARKAAAIWALEEPLMDELRRNEQDRLLTELEQPLAGILA MEFTGVKVDTKRLEQMG AELTEQLQAVERRIYELAGQEFNINSPKQLGTVLFDKLQLPVLKKTKTGYSTSADVLEKLAPH HEIVEHILHYRQLGKLQSTYIEGLLKWHPVTGKVHTMFNQALTQTGRLSSVEPNLQNIPIRL EEGRKIRQAFVPSEPDWLIFAADYSQIELRVLAHIAEDDNLIEAFRRGLDIHTKTAMDIFHVS EEDWANMRRQAKAVNFGIVYGISDYGLAQNLNITRKEAAEFIERYFASFPGV QYMDNIVQE AKQKGYVTTLLHRRRYLPDITSRNFNVRSFAERTAMNTPIQGSAADIIKKAMIDLSVRLREER LQARLLLQVHDELILEAPKEEIERLCRLVPEVMEQAVALRVPLKVDYHYGPT YDAK SEC ID N0:41 ADN polimerasa de Racillus caldotenax (Bca) MKKKLVLIDGSSVAYRAFFALPLLHNDKGIHTNAVYGFT ML KILAEEEPTHMLVAFDAGKT TFRHEAFQEYKGGRQQTPPELSEQFPLLRELLRAYRIPAYELENYEADDI IGTLAARAEQEGF EVKVISGDRDLTQLASPHVTVDITKKGITDIEPYTPEAVREKYGLTPEQIVDLKGLMGDKSDN IPGVPGIGEKTAVKLLRQFGTVENVLASIDEIKGEKLKETLRQHREMALLSKKLAAIRRDAPV ELSLDDIAYQGEDREKWALFKELGFQSFLEKMÉSPSSEEEKPLAKMAFTLADRV EEMLADK AALWEWEE YHDAPIVGIAW EHGRFFLRPETALADPQFVAWLGDETKKKSMFDSKRAAV ALKWKGIELCGVSFDLLLAAYLLDPAQGVDDVAAAAKMKQYEAVRPDEAVYGKGAKRAVPDEP VLAEHLWKAAAIWALERPFLDELRR EQDRLLVELEQPLSSILAEMEFAGVKVDTKRLEQMG EELAEQLRTVEQRIYELAGQEFNINSPKQLGVILFEKLQLPVLKKSKTGYSTSADVLEKLAPY HEIVENILQHYRQLGKLQSTYIEGLLKWRPDTKKVHTIFNQALTQTGRLSSTEPNLQNIPIR LEEGRKIRQAFVPSESDWLIFAADYSQIELRVLAHIAEDDNLMEAFRRDLDIHTKTAMDIFQV SEDEVTPN RRQAKAVNFGIVYGISDYGLAQNLNISRKEAAEFIERYFESFPGVKRYMENIVQ EAKQKGWTTLLHRRRYLPDITSRNFNVRSFAERMAMNTPIQGSAADIIKKAMIDLNARLKEE RLQARLLLQVHDELILEAPKEEMERLCRLVPEVMEQAV LRVPLKVDYHYGSTWYDAK SEC ID NO:42 A-G-Xl -X2 - F-X3 -X4 -X5 -?ß -X7 -Xa - Q~ 9 - XlO -Xll-Xl2 -L-Xl3_ l4-Xl5-I-' i 611 donde Xx es H, E o Q; X2 es P, T o E; X3 es N o H; X es L o I; X5 es N o R; X6 es cualquier aminoácido; X7 es R, P o S; X8 es D, K o T; X9 es L o V; ??0 es cualquier aminoácido diferente de E, S, A o G; XX1 es R, N, Y, T o V; X12 es V o I; X13 es cualquier aminoácido; X14 D o E; Xi5 es E o K.
SEC ID NO: 3 A-G-X1-P-F-N-X4-N-X6-X7-X8-Q-X9-X1o-X11-X12-L-X13-Xi4-Xi5-L, en donde Xx es H o E; X4 es L o I; X6 es cualquier aminoácido; X7 es R o P; X8 es D o K; X9 es L o V; Xi0 es cualquier aminoácido diferente de E o S; Xn es R o N; X12 es V o I; X13 es cualquier aminoácido; Xi4 es D o E; y X15 es E o K.
SEC ID NO: 44 A-G- i-P-F-N-Xí-N-S-Xv-Xe-Q- g-Xio-R- ia-L-F- ií-XiB-L, en donde Xx es H O E; X4 es L o I; X7 es R o P; X8 es D o K; X9 es L o V; ??? es cualquier aminoácido diferente de E o S; X12 es V o I; Xi4 es D o E; y X1S es E o K.
SEC ID NO: 45 A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-Xi3-D-E-L en donde X6 es cualquier aminoácido; Xi0 es cualquier aminoácido diferente de E; y X13 es cualquier aminoácido.
SEC ID NO:46 A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-Xi0-R-V-L-X13-D-E-L en donde Xs es cualquier aminoácido diferente de S; X10 es cualquier aminoácido diferente de E; y X13 es cualquier aminoácido diferente de F.
SEC ID NO: 47 A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L en donde X6 es S, G, A, D, F, K, C, T o Y; ??0 es S, Q, A, G, K o R; y Xi3 es F, A, G, S, T, Y, D o K.
SEC ID NO: 48 A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-Xio-R-V-L-Xi3-D-E-L en donde X6 es S, G, A, D, F, K, C, T o Y; Xi0 es K; y X13 es F, A, G, S, T, Y, D o K.
SEC ID NO:49 A-G-H-P-F-N-L-N-Xe-R-D-Q-L-X10-R-V-L-Xi3-D-E-L en donde X6 es S, G, A, D, F, K, C, T o Y; Xxo es R, K, A o G; y Xi3 es F, A, G, S, T, Y, D o K.
SEC ID NO: 50 A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L en donde X6 es S; Xi0 es R, K, A o G; y Xi3 es F.
SEC ID NO: 51 T-G-R-L-S-S-X7-X8-P-N-L-Q-N en donde X7 es S o T; y X8 es L, G, T, Q, A, S, N, R o K.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una ADN polimerasa que tiene actividad incrementada de discriminación de apareamiento erróneo en el extremo 3' en comparación con una ADN polimerasa de control, caracterizada porque la ADN polimerasa comprende una oporción en el dominio de polimerasa que comprende A-G-H-P-F-N-L-N-Xs-R-D-Q-L-Xio-R-V-L-Xi3-D-E-L, en donde: X6 es S, G, A, D, F, K, C, T o Y; X10 es cualquier aminoácido diferente de E; y Xi3 es F, A, G, S, T, Y, D o K (SEC ID NO:8).
2. La ADN polimerasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque Xi0 se selecciona de R, K, A o G (SEC ID NO:49) .
3. La ADN polimerasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una oporción en el dominio de polimerasa que comprende A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-Xio-R-V-L-F-D-E-L, en donde: Xio es cualquier aminoácido diferente de E (SEC ID NO: 9) .
4. La ADN polimerasa de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque Xi0 es A, G, K o R (SEC ID NO: 10) .
5. La ADN polimerasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque comprende además una porción que comprende T-G-R-L-S-S-X7-X8-P-N-L-Q-N; en donde X7 es Ser (S) o Thr (T) ; y X8 es cualquier aminoácido diferente de D o E (SEC ID NO: 27) .
6. La ADN polimerasa de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el aminoácido que corresponde a la posición X8 se selecciona del grupo que consiste de L, G, T, Q, A, S, N, R y K (SEC ID NO:51).
7. La ADN polimerasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque la ADN polimerasa comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos 80%, preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95% de identidad de secuencias con las SEC ID O:l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 36, 37, 38, 39, 40 o 41.
8. La ADN polimerasa de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la polimerasa tiene por lo menos 80%, preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95% de identidad de secuencias con la SEC ID NO:l.
9. La ADN polimerasa de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la ADN polimerasa es una ADN polimerasa Z05 y el aminoácido en la posición 580 de la SEC ID N0:1 se selecciona del grupo que consiste de L, G, T, Q, A, S , N, R y K.
10. Un ácido nucleico recombinante , caracterizado porque codifica la ADN polimerasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ácido nucleico recombinante de conformidad con la reivindicación 10.
12. Un método para conducir la extensión de un cebador, caracterizado porque comprende: poner en contacto una ADN polimerasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 con un cebador, una plantilla de polinucleótido y trifosfatos de nucleósido bajo condiciones que son adecuadas para la extensión del cebador, produciendo de ese modo un cebador extendido.
13. Un kit para producir un cebador extendido, caracterizado porque comprende: por lo menos un envase que proporciona una ADN polimerasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
14. El kit de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque comprende además uno o más envases adicionales seleccionados del grupo que consiste de: (a) un envase que proporciona un cebador hibridizable, bajo condiciones de extensión de cebadores, a una plantilla de polinucleótido predeterminada; (b) un envase que proporciona trifosfatos de nucleósido; y (c) un envase que proporciona un amortiguador que es adecuado para la extensión de cebadores.
15. Una mezcla de reacción, caracterizada porque comprende una ADN polimerasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, por lo menos un cebador, una plantilla de polinucleótido y trifosfatos de nucleósido.
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