CN111868238A - 用于甲基化-dNTPs的效率高的和有效参入的DNA聚合酶 - Google Patents

Abstract

公开了相对于相应的未修饰的聚合酶具有改善的参入甲基化‑dNTPs的能力的DNA聚合酶。所述聚合酶可用于多种公开的引物延伸方法中。还公开了相关的组合物，包括重组核酸、载体和宿主细胞，其可用于例如DNA聚合酶的生产。进一步公开了包含所述改进的DNA聚合酶的试剂盒和反应混合物，以及使用所述改进的DNA聚合酶的引物延伸方法。

Description

用于甲基化-dNTPs的效率高的和有效参入的DNA聚合酶

发明领域

本发明提供了具有改善的活性的DNA聚合酶，包括甲基化核苷酸（例如，脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs））的效率高的和有效的参入，以及在各种应用中使用这种聚合酶的方法，包括核酸多核苷酸的延伸和扩增。还提供了试剂盒，其包括具有改善的活性的DNA聚合酶，包括甲基化核苷酸（例如，dNTPs）的效率高的和有效的参入，及其反应混合物，以及编码DNA聚合酶的核酸。

发明背景

DNA聚合酶决定着基因组的复制和维持，对于准确地一个世代一个世代地传递遗传信息重要的作用。DNA聚合酶在细胞中起决定着DNA合成的酶的作用。它们在有金属激活剂例如Mg²⁺的情况下，按照由复制的DNA模板或多核苷酸模板确定的顺序聚合脱氧核糖核苷三磷酸。在体内，DNA聚合酶参与一系列DNA合成过程，包括DNA复制、DNA修复、重组和基因扩增。在每个DNA合成过程中，DNA模板都会复制一次或最多复制几次，以产生相同的复制物。比较起来，在体外，DNA复制可以重复许多次，如例如在聚合酶链反应期间（参见，例如，美国专利No. 4,683,202）。

在用聚合酶链反应（PCR）进行的最初研究中，在每轮DNA复制开始时添加DNA聚合酶（参见，美国专利No. 4,683,202，上文）。接着，确定可以从在升高的温度生长的细菌获得热稳定的DNA聚合酶，并且这些酶仅需要添加一次（参见，美国专利Nos. 4,889,818和4,965,188）。在PCR期间使用的升高的温度，这些酶不被不可逆地灭活。结果，人们可以在没有在每个合成添加过程的开始时添加新鲜的酶的情况下进行重复的聚合酶链反应循环。DNA聚合酶，特别是热稳定的聚合酶，是重组DNA研究和疾病医学诊断中众多技术的关键。特别是对于诊断应用，靶核酸序列可能只是所研究的DNA或RNA的一小部分，因此可能难以在没有扩增的情况下检测靶核酸序列的存在。

DNA聚合酶的总折叠模式类似人的右手，并含有掌、手指和拇指的三个有差别的亚结构域。（参见Beese等人，Science 260:352-355, 1993）；Patel等人, Biochemistry 34:5351-5363, 1995）。尽管在大小和细胞功能方面不同的聚合酶之间，手指和拇指亚结构域的结构变化很大，但催化性掌亚结构域都是可重叠的。例如，与进来的dNTP相互作用并在化学催化过程中稳定过渡态的基序A在哺乳动物pol α和原核pol I家族DNA聚合酶之间可重叠，而平均偏差为约一Å（Wang等人，Cell 89:1087-1099, 1997）。基序A在结构上开始于主要含有疏水性残基的反平行β链，并延伸到α螺旋。DNA聚合酶活性位点的一级氨基酸序列特别保守。例如，在基序A的情况下，序列DYSQIELR（SEQ ID NO：6）被保留在聚合酶中，所述聚合酶来自通过数百万年的进化而分离的生物，包括，例如，水生栖热菌（Thermus aquaticus）、砂眼衣原体（Chlamydia trachomatis）和大肠杆菌（Escherichia coli）。

除了充分保守之外，DNA聚合酶的活性位点还已显示是相对可突变的，能够在不显著降低DNA聚合酶活性的情况下容纳某些氨基酸取代。（参见，例如，美国专利No. 6,602,695）。这种突变体DNA聚合酶可以在例如包含核酸合成反应的诊断和研究应用中提供各种选择性优点。

DNA聚合的酶促过程至少有两个步骤：（1）进来的核苷酸的参入，和（2）新参入的核苷酸的延伸。通常认为DNA聚合酶的总精确性或“保真性”是这两种酶促活性的集成物（conglomerate），但是步骤是有差别的。DNA聚合酶可能错参进来的核苷酸，但如果其不有效地延伸，则延伸速率将严重降低，并且总产物形成将是最小限度的。另一方面，有可能使DNA聚合酶错参进来的核苷酸并容易错误延伸（misextend）新形成的错配。在这种情况下，总延伸速率将是高的，但总保真性将是低的。当使用Mn²⁺作为二价金属离子激活剂时，这种类型的酶的例子将是ES112 DNA聚合酶（E683R Z05 DNA聚合酶；参见US 7,179,590）。所述酶具有非常高的效率，这是因为与当遇到错配时倾向于暂停/停住的典型的DNA聚合酶不同，ES112 DNA聚合酶容易延伸错配。ES112中显示的表型在RT步骤中更为明显，大概是因为RNA/DNA异源双链体与DNA/DNA同源双链体比较的结构效应。第二个例子将是若DNA聚合酶不容易错参（可能甚至不太可能错参），但的确具有增加的错误延伸错配的能力。在这种情况下，对于总的产物，保真性不显著改变。通常，这种类型的酶比Mn²⁺中的ES112的特征对延伸反应更有利，这是因为提高了产物的保真性。然而，所述属性可用于允许错配的寡核苷酸引物的错误延伸，例如当单个序列的寡核苷酸引物与具有序列异质性的靶（例如，病毒靶）杂交时，但正常或更低的错参率便于完成除原始寡核苷酸引物以外的DNA合成。这种类型的DNA聚合酶的例子是Z05 D580G DNA聚合酶（参见美国专利公开No. 2009/0148891）。这种类型的活性被称为“错配耐受性的”，这是因为它对寡核苷酸引物中的错配更耐受。尽管以上实例已讨论了引物延伸类型反应，但在频繁地重新发生引物延伸的诸如RT-PCR和PCR的反应中，活性可能更有意义。数据提示，尽管诸如Z05 D580G的酶对错配更“耐受”，但它们也具有延伸含有修饰的碱基（例如，叔丁基苄基修饰的碱基）或在有DNA结合染料如SYBR GreenI的情况下的寡核苷酸引物的增强的能力（参见美国专利公开No. 2009/028053）。

反转录聚合酶链反应（RT-PCR）是在许多应用中用于通过扩增检测/和或定量RNA靶的技术。为了通过PCR扩增RNA靶，必须首先将RNA模板反转录成cDNA。一般，RT-PCR测定依赖于衍生自嗜温生物的非热稳定的反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）用于初始cDNA合成步骤（RT）。需要额外的热稳定DNA聚合酶用于扩增cDNA，以耐受PCR中核酸变性所需的升高的温度。使用人工改造以进行对于RT-PCR测定效率更高的反转录的热活性（thermoactive）或热稳定的DNA聚合酶有几个潜在的益处。增加的反转录酶活性连同使用便于松弛RNA模板二级结构的较高的反转录温育温度的能力可以导致总的更高cDNA合成效率和测定灵敏度。较高温度温育还可以通过减少反转录步骤中的错误引发来提高特异性。具有提高的反转录效率的酶可通过允许降低的RT温育时间和/或酶浓度来简化测定设计。当使用dUTP和UNG时，在非严格配置条件期间形成的含有dUMP的非特异性延伸产物被UNG降解，且不能用作引物或模板。当使用衍生自嗜温生物的非热稳定的反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）时，不可能利用dUTP和UNG方法。（Myers, T.W.等人, Amplification of RNA: HighTemperature Reverse Transcription and DNA Amplification with Thermus thermophilus DNA Polymerase, 在PCR Strategies, Innis, M.A., Gelfand, D.H.和Sninsky, J.J., 编, Academic Press, San Diego, CA, 58-68,（1995）中）。然而，将本发明的热活性或热稳定的DNA聚合酶用于反转录步骤使得反应能够与dUTP/尿嘧啶N-糖基化酶（UNG）遗留预防系统的使用完全相容(Longo等人, Use of Uracil DNA Glycosylase toControl Carry-over Contamination in Polymerase Chain Reactions. Gene 93:125-128,（1990）。除了提供遗留污染控制外，使用dUTP和UNG提供了“热启动”以减少非特异性扩增（Innis和Gelfand，1999）。

核酸扩增方法，例如PCR，一般于高温进行。已知在PCR中，于高温重复的变性、退火和延伸的循环引起dNTPs的显著分解，主要是通过将dNTPs水解成二磷酸且然后单磷酸。研究表明，具有γ-磷酸（即，末端磷酸）修饰的dNTPs在高温显示出改进的稳定性（美国专利No. 7,452,698）。也就是说，诸如添加甲基（即，甲基化-dNTP（me-dNTP））的修饰防止水解反应发生（美国专利No. 7,452,698）。因此，从在室温和升高的温度的稳定性的观点来看，甲基化核苷酸（即，甲基化-dNTPs）的使用比起常规核苷酸（即，dNTPs）来有利。因此，稳定的dNTPs将是本领域的巨大优点和改进。然而，在常规PCR反应中，常规聚合酶不效率高地和有效地参入甲基化-dNTPs。因此，在本领域中仍然需要使用更稳定的甲基化-dNTPs进行扩增反应的组合物和方法。

发明概述

本文提供了相对于相应的未修饰的对照聚合酶（即，亲本聚合酶）具有改善的活性（包括效率高地和有效地参入甲基化-dNTPs的能力）的DNA聚合酶，制备这种DNA聚合酶的方法和使用这种DNA聚合酶的方法。与对照DNA聚合酶相比，改进的DNA聚合酶具有提高的效率高地和有效地参入甲基化-dNTPs的能力。在本文中，改进的DNA聚合酶包含与SEQ ID NOs：1-5基本相同（例如，至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%相同）的氨基酸序列。

在一个方面，提供了DNA聚合酶，其与对照DNA聚合酶相比，具有提高的参入甲基化脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）的效率，其中所述DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置640的氨基酸是除I以外的任何氨基酸，和/或其中所述DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置705的氨基酸是除V以外的任何氨基酸，并且其中所述对照DNA聚合酶具有与所述DNA聚合酶相同的氨基酸序列，只是所述对照DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置640的氨基酸是I和/或所述对照DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置705的氨基酸是V。在一个实施方案中，DNA聚合酶包含与SEQ ID NO：2至少90％、特别是至少95％、更特别是至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，DNA聚合酶和对照DNA聚合酶包含与SEQ ID NO：2至少90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，DNA聚合酶和对照DNA聚合酶包含与SEQ ID NO：2至少95％、特别是至少98％相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，对应于SEQ ID NO：2的位置640的氨基酸是M。在另一个实施方案中，DNA聚合酶包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在再另一个实施方案中，对应于SEQ ID NO：2的位置705的氨基酸是L。在另一个实施方案中，DNA聚合酶包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在另一个实施方案中，DNA聚合酶包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。在一个实施方案中，DNA聚合酶包含与SEQ ID NO：2至少90％、特别是至少95％、更特别是至少98％相同的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO：2的位置640的氨基酸是M。在另一个实施方案中，DNA聚合酶包含与SEQ ID NO：2至少90％、特别是至少95％、更特别是至少98％相同的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO：2的位置705的氨基酸是L。在另一个实施方案中，DNA聚合酶包含与SEQ ID NO：2至少90％、特别是至少95％、更特别是至少98％相同的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO：2的位置640的氨基酸是M，且其中对应于SEQ ID NO：2的位置705的氨基酸是L。

在另一个方面，提供了编码DNA聚合酶的重组核酸，所述DNA聚合酶与对照DNA聚合酶相比，具有提高的参入甲基化脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）的效率，其中所述DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置640的氨基酸是除I以外的任何氨基酸，和/或其中所述DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置705的氨基酸是除V以外的任何氨基酸，并且其中所述对照DNA聚合酶具有与所述DNA聚合酶相同的氨基酸序列，只是所述对照DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置640的氨基酸是I和/或所述对照DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置705的氨基酸是V。在某些实施方案中，重组核酸编码上述DNA聚合酶。

在另一个相关方面，提供了表达载体，其包含编码DNA聚合酶的重组核酸，所述DNA聚合酶与对照DNA聚合酶相比，具有提高的参入甲基化脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）的效率，其中所述DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置640的氨基酸是除I以外的任何氨基酸，和/或其中所述DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置705的氨基酸是除V以外的任何氨基酸，并且其中所述对照DNA聚合酶具有与所述DNA聚合酶相同的氨基酸序列，只是所述对照DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置640的氨基酸是I和/或所述对照DNA聚合酶对应于SEQ IDNO：2的位置705的氨基酸是V。在某些实施方案中，表达载体包含编码上述DNA聚合酶的重组核酸。

在额外的方面，提供了用于生产延伸的引物的试剂盒，其包括至少一个容器，所述容器提供DNA聚合酶，所述DNA聚合酶与对照DNA聚合酶相比，具有提高的参入甲基化脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）的效率，其中所述DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置640的氨基酸是除I以外的任何氨基酸，和/或其中所述DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置705的氨基酸是除V以外的任何氨基酸，并且其中所述对照DNA聚合酶具有与所述DNA聚合酶相同的氨基酸序列，只是所述对照DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置640的氨基酸是I和/或所述对照DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置705的氨基酸是V。在另一个实施方案中，试剂盒进一步包括一个或多个选自以下的额外容器：（a）提供在引物延伸条件下可与预定的多核苷酸模板杂交的引物的容器；（b）提供dNTPs的容器；和（c）提供适合于引物延伸的缓冲液的容器。在另一个实施方案中，dNTPs是甲基化dNTP。在某些实施方案中，DNA聚合酶是上述DNA聚合酶。

在另一个方面，提供了反应混合物，其包含DNA聚合酶，所述DNA聚合酶与对照DNA聚合酶相比，具有提高的参入甲基化脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）的效率，其中所述DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置640的氨基酸是除I以外的任何氨基酸，和/或其中所述DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置705的氨基酸是除V以外的任何氨基酸，并且其中所述对照DNA聚合酶具有与所述DNA聚合酶相同的氨基酸序列，只是所述对照DNA聚合酶对应于SEQID NO：2的位置640的氨基酸是I和/或所述对照DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置705的氨基酸是V，至少一种引物，多核苷酸模板和dNTPs。在相关的实施方案中，多核苷酸模板是RNA。在另一个实施方案中，多核苷酸模板是DNA。在另一个实施方案中，反应混合物进一步包含Mg²⁺。在某些实施方案中，DNA聚合酶是上述DNA聚合酶。在另一个实施方案中，反应混合物进一步包含第二热稳定的DNA聚合酶。

在另一个方面，提供了用于进行引物延伸的方法，包括：在适合于引物延伸的条件下，使DNA聚合酶与引物、多核苷酸模板和dNTPs接触，从而产生延伸的引物，其中所述DNA聚合酶与对照DNA聚合酶相比，以提高的效率参入甲基化dNTPs，其中所述DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置640的氨基酸是除I以外的任何氨基酸，和/或其中所述DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置705的氨基酸是除V以外的任何氨基酸，并且其中所述对照DNA聚合酶具有与所述DNA聚合酶相同的氨基酸序列，只是所述对照DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置640的氨基酸是I和/或所述对照DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置705的氨基酸是V。在一个实施方案中，DNA聚合酶包含与SEQ ID NO：2至少90％、特别是至少95％、更特别是至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，DNA聚合酶和对照DNA聚合酶包含与SEQID NO：2至少90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，DNA聚合酶和对照DNA聚合酶包含与SEQ ID NO：2至少95％、特别是至少98％相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，对应于SEQ ID NO：2的位置640的氨基酸是M。在另一个实施方案中，DNA聚合酶包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在再另一个实施方案中，对应于SEQ ID NO：2的位置705的氨基酸是L。在另一个实施方案中，DNA聚合酶包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在另一个实施方案中，DNA聚合酶包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。在某些实施方案中，DNA聚合酶是上述DNA聚合酶。

如上所述的，各种DNA聚合酶都适合于突变。特别合适的是热稳定的聚合酶，包括来自各种嗜热细菌物种的野生型或天然存在的热稳定聚合酶，以及通过氨基酸取代、插入或缺失或其他修饰衍生自这种野生型或天然存在的酶的合成的热稳定聚合酶。因此，在一些实施方案中，聚合酶是热稳定的DNA聚合酶。聚合酶的示例性未修饰形式包括，例如，CS5、CS6、Z05或Z05D DNA聚合酶，或与其具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性的功能性DNA聚合酶。其他未修饰的聚合酶包括，例如，来自以下嗜热细菌物种的任何一种的DNA聚合酶（或与这种聚合酶具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性的功能性DNA聚合酶）：海栖热袍菌（Thermotoga maritima）；水生栖热菌；嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）；黄栖热菌（Thermus flavus）；丝状栖热菌（Thermus filiformis）；栖热菌属物种（Thermus sp.）sps17；栖热菌属物种Z05；那不勒斯栖热袍菌（Thermotoga neopolitana）；非洲栖热腔菌（Thermosipho africanus）；Thermus caldophilus；耐放射异常球菌（Deinococcus radiodurans）；嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）或热坚芽孢杆菌（Bacillus caldotenax）。合适的聚合酶还包括具有反转录酶（RT）活性和/或参入非常规核苷酸如核糖核苷酸或其他2'-修饰的核苷酸的能力的那些。

在一些实施方案中，DNA聚合酶是热活性DNA聚合酶。尽管具有效率高的反转录活性的热稳定DNA聚合酶特别适合于进行RT-PCR，尤其是单酶RT-PCR，但是具有效率高的反转录活性的热活性的但不是热稳定的DNA聚合酶也适合于根据本发明的突变。例如，效率高地和有效地参入的甲基化-dNTPs的属性可用于RT-PCR中的RT步骤，并且所述步骤不需要在将灭活热活性的但不是热稳定的DNA聚合酶的温度进行。在RT步骤之后，可以添加热稳定的DNA聚合酶，或者其可以已经包含在反应混合物中以执行PCR扩增步骤。例如，如实施例中所述的，在RT步骤之前，可以在适合于RNA和DNA模板的延伸和扩增的缓冲液中，将本文所述的改进的DNA聚合酶与第二热稳定的DNA聚合酶组合。合适的热稳定DNA聚合酶的实例在美国专利Nos. 4,889,818、5,773,258和5,677,152中描述。在一些实施方案中，第二热稳定DNA聚合酶是AmpliTaq® DNA聚合酶（脱氧核苷三磷酸：DNA脱氧核苷酸转移酶，E.C.2.7.7.7）。在一些实施方案中，第二热稳定DNA聚合酶是可逆地灭活的热稳定聚合酶，如下文所述的。在一个实施方案中，可逆地灭活的热稳定聚合酶是AmpliTaq Gold® DNA聚合酶（RocheApplied Science, Indianapolis, IN, USA）。通过使用化学修饰的热稳定的DNA聚合酶（或其他HotStart技术以灭活热稳定的DNA聚合酶），以致于其在RT步骤期间将不完全是活性的，所述第二种方法将尤其受益。具有效率高的反转录活性的热活性但不是热稳定的DNA聚合酶的例子是来自生氢氧化碳嗜热菌（Carboxydothermus hydrogenoformans）（Chy）的DNA聚合酶。参见，例如，美国专利Nos. 6,468,775、6,399,320、8,945,882、9,441,269和美国专利公开No. 2017/0029792。

在一些实施方案中，DNA聚合酶衍生自栖热菌属（Thermus）物种。因此，在一些实施方案中，DNA聚合酶与选自下述的聚合酶具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的氨基酸序列同一性：

（a）栖热菌属物种Z05 DNA聚合酶（Z05）（SEQ ID NO：1）；

（b）水生栖热菌DNA聚合酶（Taq）；

（c）丝状栖热菌DNA聚合酶（Tfi）；

（d）黄栖热菌DNA聚合酶（Tfl）；

（e）栖热菌属物种sps17 DNA聚合酶（Sps17）；

（f）嗜热栖热菌DNA聚合酶（Tth）；和

（g）Thermus caldophilus DNA聚合酶（Tca）。

突变体或改进的聚合酶可包括其他非取代修饰。一种这种修饰是热可逆共价修饰，其灭活酶，但是于升高的温度（例如一般用于多核苷酸延伸的温度）温育时被逆转以激活酶。在美国专利Nos. 5,773,258和5,677,152中描述了用于这种热可逆修饰的示例性试剂。

在一些实施方案中，反转录酶活性通过进行实时RT-PCR扩增和检测从pSP64 poly(A)（Promega）中HCV基因型Ib 5'LTR的前800个碱基产生的丙型肝炎病毒（HCV）转录物来确定。两种或更多种反应混合物可具有滴定数量的丙型肝炎病毒（HCV）转录物拷贝（在几种反应混合物中，例如，1:5滴定，1:10滴定，例如，10,000拷贝，1000拷贝，100拷贝，10拷贝，1拷贝，0拷贝）。可以将本发明的聚合酶的反转录酶能力与参考聚合酶（例如，天然存在的、未修饰的或对照聚合酶）的反转录酶能力在预先选择的时间单位内进行比较，如本文所述的。与天然存在的或未修饰的聚合酶相比，具有改善的反转录酶能力的聚合酶将以更高的效率扩增转录物，或将需要较低数目的PCR循环来扩增转录物（即，如本文所计算的，显示较低的Cp值）。此外，在一些实施方案中，具有改善的RT功能的聚合酶还具有改善的长RNA（例如，至少500或1000或2000或5000或更多个核苷酸长）模板的复制。在一些实施方案中，与对照聚合酶相比，改善的反转录酶效率包括较短的反转录时间。因此，在一些实施方案中，具有增加的反转录酶效率的聚合酶将比对照或参考聚合酶更快地反转录RNA模板。

在各个其他方面，本发明提供了编码如本文所述的突变体或改进的DNA聚合酶的重组核酸，包含所述重组核酸的载体以及用所述载体转化的宿主细胞。在某些实施方案中，载体是表达载体。包含这种表达载体的宿主细胞可用于本发明的方法中，所述方法用于通过在适合于表达重组核酸的条件下培养宿主细胞来产生突变体或改进的聚合酶。本发明的聚合酶可以包含在反应混合物和/或试剂盒中。重组核酸、宿主细胞、载体、表达载体、反应混合物和试剂盒的实施方案如上文和本文所述。

在再另一个方面，提供了进行多核苷酸延伸的方法。所述方法通常包括在适合于引物延伸的条件下，使具有提高的效率高地和有效地参入甲基化-dNTPs的能力的DNA聚合酶与引物、多核苷酸模板和核苷三磷酸（即，甲基化-dNTPs）接触，从而产生延伸的引物。多核苷酸模板可以是例如RNA或DNA模板。核苷三磷酸可包括非常规核苷酸，如例如，核糖核苷酸和/或标记的核苷酸，以及当然甲基化-dNTPs。核苷三磷酸可以包括dATP（2'-脱氧腺苷5'-三磷酸）、dCTP（2'-脱氧胞苷5'-三磷酸）、dGTP（2'-脱氧鸟苷5'-三磷酸）、dTTP（2'-脱氧胸苷5'-三磷酸）、dITP（2-脱氧肌苷5'-三磷酸）和/或dUTP（2'-脱氧尿苷5'-三磷酸）。甲基化dNTPs可以包括甲基化-dATP、甲基化-dCTP、甲基化-dGTP、甲基化-dTTP、甲基化-ITP和/或甲基化-dUTP。进一步地，引物和/或模板可包含一种或多种核苷酸类似物。在一些变化形式中，多核苷酸延伸方法是用于多核苷酸扩增的方法，其包括使突变体或改进的DNA聚合酶与引物对、多核苷酸模板和核苷三磷酸在适合于多核苷酸扩增的条件下接触。多核苷酸延伸反应可以是，例如，PCR、等温延伸或测序（例如，454测序反应）。多核苷酸模板可以来自任何类型的生物样品。

本发明还提供了用于这种多核苷酸延伸方法的试剂盒。通常，试剂盒包括至少一个提供如本文所述的突变体或改进的DNA聚合酶的容器。在某些实施方案中，试剂盒进一步包括一个或多个额外的提供一种或多种额外的试剂的容器。例如，在特定的变化形式中，一个或多个额外的容器提供核苷三磷酸；适合于多核苷酸延伸的缓冲液；和/或在多核苷酸延伸条件下可与预定的多核苷酸模板杂交的一种或多种引物或探针多核苷酸。多核苷酸模板可以来自任何类型的生物样品。

进一步提供了包含本发明的聚合酶的反应混合物。反应混合物还可含有模板核酸（DNA和/或RNA）、一种或多种引物或探针多核苷酸、核苷三磷酸（包括，例如，脱氧核糖核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸、标记的核苷三磷酸、非常规核苷三磷酸）、缓冲液、盐、标记（例如，荧光团）。在一些实施方案中，反应混合物包含铁螯合剂或紫色染料。在某些实施方案中，反应混合物包含血红蛋白或血红蛋白的降解产物。例如，在某些实施方案中，血红蛋白的降解产物包括血红素分解产物，例如氯高铁血红素、羟高铁血红素、血卟啉（hematophoryn）和胆红素。在其他实施方案中，反应混合物包含肝素或其盐。任选地，反应混合物包含嵌入染料（包括但不限于上文或本文其他地方所述的那些）。在某些实施方案中，反应混合物含有从血液分离的模板核酸。在其他实施方案中，模板核酸是RNA，并且反应混合物包含肝素或其盐。

在一些实施方案中，反应混合物包含两种或更多种聚合酶。例如，在一些实施方案中，反应混合物包含如本文所述的具有提高的反转录效率（例如，增加的延伸RNA模板的活性）的改进的DNA聚合酶，以及具有依赖DNA的聚合酶活性的另一种聚合酶。在一个实施方案中，反应混合物包含本文所述的具有提高的反转录效率的改进的DNA聚合酶和第二热稳定的依赖DNA的聚合酶的掺合物。第二热稳定的依赖DNA的聚合酶可以是如上所述的可逆修饰的聚合酶，从而使得所述酶在适合于反转录步骤的温度是无活性的，但是在合适的条件下被活化，例如在约90℃至约100℃的升高的温度达最多到约12分钟的时间段。如实施例中所述的，例如在热启动PCR反应中提供了激活可逆灭活的热稳定聚合酶的合适条件。合适的第二热稳定的依赖DNA的聚合酶的实例描述于美国专利Nos. 5,773,258和5,677,152中。

本文描述了本发明的进一步的实施方案。

定义

除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。尽管基本上与本文描述的那些相似的任何方法和材料都可以用在本发明的实践或试验中，但是仅仅描述了示例性的方法和材料。对本发明来说，下列术语定义如下。

术语“一个（a）”、“一种（an）”和“所述（the）”包括复数对像，除非上下文另外清楚地指出。

“氨基酸”是指可以并入肽、多肽或蛋白的任何单体单元。如本文所用的，术语“氨基酸”包括以下二十种天然或遗传编码的α-氨基酸：丙氨酸（Ala或A）、精氨酸（Arg或R）、天冬酰胺（Asn或N）、天冬氨酸（Asp或D）、半胱氨酸（Cys或C）、谷氨酰胺（Gln或Q）、谷氨酸（Glu或E）、甘氨酸（Gly或G）、组氨酸（His或H）、异亮氨酸（Ile或I），亮氨酸（Leu或L）、赖氨酸（Lys或K）、甲硫氨酸（Met或M）、苯丙氨酸（Phe或F）、脯氨酸（Pro或P）、丝氨酸（Ser或S）、苏氨酸（Thr或T）、色氨酸（Trp或W）、酪氨酸（Tyr或Y）和缬氨酸（Val或V）。在未定义“X”残基的情况下，这些应被定义为“任何氨基酸”。这二十种天然氨基酸的结构显示在，例如，Stryer等人,Biochemistry, 第5版, Freeman and Company（2002）中。额外的氨基酸，例如硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸，也可以被基因编码（Stadtman (1996) “Selenocysteine,” Annu Rev Biochem 65:83-100和Ibba等人 (2002) “Genetic code: introducing pyrrolysine,”Curr Biol. 12(13):R464-R466）。术语“氨基酸”还包括非天然氨基酸、修饰的氨基酸（例如，具有修饰的侧链和/或主链）和氨基酸类似物。参见，例如，Zhang等人 (2004)“Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammaliancells,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887，Anderson等人 (2004)“An expanded genetic code with a functional quadruplet codon” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20):7566-7571，Ikeda等人 (2003) “Synthesis of a novelhistidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo,”Protein Eng. Des. Sel. 16(9):699-706，Chin等人 (2003) “An Expanded EukaryoticGenetic Code,” Science 301(5635):964-967，James等人 (2001) “Kineticcharacterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizablephenylazophenylalanine residues,” Protein Eng. Des. Sel. 14(12):983-991，Kohrer等人 (2001) “Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammaliancells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analoguesinto proteins,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25):14310-14315，Bacher等人(2001) “Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capableof Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue,” J. Bacteriol. 183(18):5414-5425，Hamano-Takaku等人 (2000) “A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNASynthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficientlythan Tyrosine,” J. Biol. Chem. 275(51):40324-40328，和Budisa等人 (2001)“Proteins with {beta}-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophoresand pharmaceutically active amino acids,” Protein Sci. 10(7):1281-1292。

为了进一步举例说明，氨基酸一般是包括取代或未取代的氨基、取代或未取代的羧基和一个或多个侧链或基团或这些基团中的任一个的类似物的有机酸。示例性的侧链包括，例如，硫醇、硒代、磺酰基、烷基、芳基、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼、氰基、卤、酰肼、链烯基、炔基、醚、硼酸盐（borate）、硼酸酯（boronate）、磷酸基、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸（thioacid）、羟胺或这些基团的任何组合。其他代表性氨基酸包括，但不限于，包含可光活化的交联剂的氨基酸、金属结合性氨基酸、自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、含金属氨基酸、具有新官能团的氨基酸、与其他分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光笼化（photocaged）和/或可光异构化的氨基酸、放射性氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸、其他碳水化合物修饰的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、可化学裂解的和/或可光裂解的氨基酸、含碳连接的糖的氨基酸、氧还活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸以及包含一个或多个毒性部分的氨基酸。

术语“生物样品”包括从生物获得的多种样品类型，并且可以用于诊断或监控测定。所述术语包括尿，尿沉渣，血液，唾液和生物来源的其他液体样品，固体组织样品，例如活组织检查样品或组织培养物或由其衍生的细胞及其后代。所述术语包括已在其取得后以任何方式操作的样品，例如通过用试剂处理、增溶、沉降或对于某些组分进行富集。所述术语包括临床样品，且还包括细胞培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体和组织样品。

在本发明的DNA聚合酶的上下文中，术语“突变体”是指一般为重组体的多肽，其相对于相应的功能性DNA聚合酶包含一个或多个氨基酸取代。

在突变体聚合酶的上下文中，术语“未修饰的形式”是本文中为了定义本发明的突变体DNA聚合酶起见使用的术语：术语“未修饰的形式”或“亲本形式”是指除了在指定为表征突变体聚合酶的一个或多个氨基酸位置之外具有突变体聚合酶的氨基酸序列的功能性DNA聚合酶。因此，就（a）其未修饰的形式和（b）一个或多个指定的氨基酸取代而论，提及突变体DNA聚合酶意指除一个或多个指定的氨基酸取代外，所述突变体聚合酶否则具有与指定基序中未修饰的形式相同的氨基酸序列。“未修饰的聚合酶”（以及因此同样具有改善的参入甲基化-dNTPs的能力的修饰的形式）可以含有额外的突变以提供所期望的功能性，例如，改善的转录酶效率，错配耐受性，延伸速率；改善的RT和聚合酶抑制剂的耐受性；和/或改进的双脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、核糖核苷酸类似物、染料标记的核苷酸的参入，调节5'-核酸酶活性，调节3'-核酸酶（或校正）活性等。因此，在进行如本文所述的本发明时，DNA聚合酶的未修饰的形式是预定的。DNA聚合酶的未修饰的形式可以是，例如，野生型和/或天然存在的DNA聚合酶，或者已经被有意修饰的DNA聚合酶。未修饰的形式的聚合酶优选是热稳定的DNA聚合酶，例如来自各种嗜热细菌的DNA聚合酶，以及其与野生型或天然存在的热稳定的聚合酶具有显著序列同一性的功能变体。这种变体可以包括，例如，嵌合DNA聚合酶，如例如在美国专利Nos. 6,228,628和7,148,049中描述的嵌合DNA聚合酶。在某些实施方案中，聚合酶的未修饰的形式具有反转录酶（RT）活性。

术语“热稳定的聚合酶”是指对热稳定、耐热并且当经受升高的温度达实现双链核酸变性所必需的时间时保留足够的活性以实现后来的多核苷酸延伸反应并且不变得不可逆地变性（失活）的酶。核酸变性所必需的加热条件在本领域中是众所周知的，并且在，例如，美国专利Nos. 4,683,202、4,683,195和4,965,188中得到了示例。如本文所用的，热稳定的聚合酶适合于用于温度循环反应，例如聚合酶链反应（“PCR”）。用于本文目的的不可逆变性是指永久和完全丧失酶促活性。对于热稳定的聚合酶，酶促活性是指以正确方式催化核苷酸的组合以形成与模板核酸链互补的多核苷酸延伸产物。来自嗜热细菌的热稳定的DNA聚合酶包括，例如，来自海栖热袍菌、水生栖热菌、嗜热栖热菌、黄栖热菌、丝状栖热菌、栖热菌属物种sps17、栖热菌属物种Z05（例如，Z05D聚合酶）、Thermus caldophilus、热坚芽孢杆菌、那不勒斯栖热袍菌和非洲栖热腔菌的DNA聚合酶。

术语“热活性的”是指在通常用于RT-PCR和/或PCR反应中的反转录或退火/延伸步骤的温度（即，45-80℃）保持催化性质的酶。热稳定的酶是当经受核酸变性所必需的升高的温度时不不可逆地灭活或变性的酶。热活性的酶可能是或可能不是热稳定的。热活性的DNA聚合酶可以是依赖于DNA或RNA的，来自嗜热物种或来自嗜温物种，包括，但不限于，大肠杆菌、莫洛尼鼠白血病病毒和禽类成髓细胞性白血病病毒（Avian myoblastosis virus）。

如本文所用的，“嵌合”蛋白是指其氨基酸序列代表来自至少两种不同蛋白的氨基酸序列的子序列的融合产物的蛋白。嵌合蛋白一般不是通过直接操作氨基酸序列来产生的，而是由编码嵌合氨基酸序列的“嵌合”基因表达的。在某些实施方案中，例如，本发明的突变体DNA聚合酶的未修饰的形式是嵌合蛋白，其由衍生自栖热菌属物种DNA聚合酶的氨基末端（N-末端）区域和衍生自Tma DNA聚合酶的羧基末端（C-末端）区域组成。N-末端区域是指从N-末端（氨基酸位置1）延伸至内部氨基酸的区域。类似地，C-末端区域是指从内部氨基酸延伸至C-末端的区域。

术语“适配体”是指识别并结合DNA聚合酶并有效抑制聚合酶活性的单链DNA，如美国专利No. 5,693,502中所述的。适配体和dUTP/UNG在RT-PCR中的应用也例如在Smith,E.S.等人（Amplification of RNA: High-temperature Reverse Transcription and DNAAmplification with a Magnesium-activated Thermostable DNA Polymerase, 在PCRPrimer: A Laboratory Manual, 第2版, Dieffenbach, C.W.和Dveksler, G.S., 编,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 211-219,（2003）中）中进行了讨论。

在突变体DNA聚合酶的背景中，与另一序列（例如，区域、片段、核苷酸或氨基酸位置等）的“对应”基于根据核苷酸或氨基酸位置编号进行编号且然后以使序列同一性百分比达到最大的方式比对序列的惯例。“对应于[特定序列]的位置[X]”的氨基酸是指感兴趣的多肽中与指定序列的等同氨基酸比对的氨基酸。通常，如本文所述的，可以使用比对算法，例如如下所述的BLAST，来确定对应于聚合酶的位置的氨基酸。因为并非在给定的“对应区域”内的所有位置都需要相同，所以在对应区域内的不匹配位置可以被认为是“对应位置”。因此，如本文所用的，提及“对应于”指定DNA聚合酶的“氨基酸位置[X]的氨基酸位置”是指基于比对，在其他DNA聚合酶和结构同源物及家族中的等同位置。在本发明的一些实施方案中，相对于包含一个或多个基序的聚合酶区域确定氨基酸位置的“对应”。

如本文所使用的“重组体”是指已经通过重组方法有意地修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。所谓术语“重组核酸”在本文中指的是最初在体外一般通过限制性内切核酸酶对核酸的操作形成的核酸，其呈在自然界中通常不存在的形式。因此，呈线性形式的分离的突变体DNA聚合酶核酸或通过连接通常不连接的DNA分子在体外形成的表达载体都被认为是对本发明来说的重组体。应当理解，一旦重组核酸被制备并重新引入宿主细胞，它就将非重组地复制，即，使用宿主细胞的体内细胞机构而不是体外操作；然而，这种核酸一旦重组地产生，尽管其后非重组地复制，但仍然被认为是对本发明来说的重组体。“重组蛋白”是使用重组技术（即，通过如上所述重组核酸的表达）制备的蛋白。

当核酸放置成与另一个核酸序列在功能上关联时，所述核酸“可操作地连接”。例如，启动子或增强子与编码序列可操作地连接，如果其影响所述序列的转录的话；或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，如果其被定位以便促进翻译的话。

术语“宿主细胞”是指单细胞的原核生物和真核生物(例如，细菌、酵母和放线菌)以及当在细胞培养物中培养时来自高等植物或动物的单个细胞两者。

术语“载体”是指一段DNA，一般是双链的，其可以已经向其中插入一段外源DNA。载体可以是例如质粒起源的。载体含有促进载体在宿主细胞中的自主复制的“复制子”多核苷酸序列。外源DNA被定义为异源DNA，其是在宿主细胞中天然不存在的DNA，其例如，复制载体分子，编码选择性或筛选性标记，或者编码转基因。载体用于将外源的或异源的DNA运输进合适的宿主细胞中。一旦在宿主细胞中，载体就可以独立于宿主染色体DNA复制或与宿主染色体DNA同时复制，并且可以产生载体和它的插入的DNA的几个拷贝。另外，载体还可以含有允许插入的DNA转录为mRNA分子或者以其它方式使插入的DNA复制为RNA的多个拷贝的必需元件。一些表达载体另外含有在插入的DNA附近的序列元件，其增加表达的mRNA的半衰期和/或允许所述mRNA翻译为蛋白分子。因此，可以迅速地合成由插入的DNA编码的mRNA和多肽的许多分子。

术语“核苷酸”除指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体外，在本文中应被理解为指其相关的结构变体，包括衍生物和类似物，其就使用核苷酸的特定背景而论在功能上是等同的（例如，与互补碱基的杂交），除非上下文另外明确指出。

术语“核酸”或“多核苷酸”是指可以对应于核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸（DNA）聚合物或其类似物的聚合物。这包括核苷酸的聚合物，例如RNA和DNA，以及其合成形式，修饰的（例如，化学或生物化学修饰的）形式，以及混合的聚合物（例如，包括RNA和DNA亚单位两者）。示例性修饰包括甲基化，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰，例如非荷电的键（例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯（phosphoamidates）、氨基甲酸酯等），侧基（pendent moieties）（例如，多肽），嵌入剂（例如，吖啶、补骨脂素等），螯合剂，烷基化剂（alkylators）和修饰的键（例如，α异头核酸等）。还包括合成分子，它们通过氢键合和其他化学相互作用在其与指定序列结合的能力中模拟多核苷酸。一般，核苷酸单体通过磷酸二酯键连接，尽管核酸的合成形式可以包含其他键（例如，如Nielsen等人（Science 254:1497-1500, 1991）所述的肽核酸。核酸可以是或可以包括，例如，染色体或染色体区段、载体（例如，表达载体）、表达盒、裸DNA或RNA聚合物、聚合酶链反应（PCR）的产物、寡核苷酸、探针和引物。核酸可以是，例如，单链、双链或三链的，并且不限于任何特定的长度。除非另外指出，否则除明确指出的任何序列外，特定的核酸序列任选地包含或编码互补序列。

术语“寡核苷酸”是指包含至少两个核酸单体单元（例如，核苷酸）的核酸。寡核苷酸一般包含约6个至约175个核酸单体单元，更一般约8个至约100个核酸单体单元，且再更一般约10个至约50个核酸单体单元（例如，约15个、约20个、约25个、约30个、约35个或更多个核酸单体单元）。寡核苷酸的确切大小将取决于许多因素，包括寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸任选地通过任何合适的方法制备，包括，但不限于，分离现有或天然序列，DNA复制或扩增，反转录，适当序列的克隆和限制酶切消化，或通过诸如Narang等的磷酸三酯法（Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979）；Brown等人的磷酸二酯法（Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979）；Beaucage等人的二乙基亚磷酰胺法（Tetrahedron Lett. 22:1859-1862,1981）；Matteucci等人的三酯法（J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981）；自动合成方法；或美国专利No. 4,458,066的固相支持体法，或本领域技术人员已知的其他方法的方法直接化学合成。

如本文所用的，术语“引物”是指当放置于起始多核苷酸延伸的条件下（例如，在包括在适当的缓冲液中存在必需的核苷三磷酸（如由所复制的模板所决定的）和聚合酶以及在适当的温度或一个或多个温度循环下（例如，如在聚合酶链反应中）的条件下）时能够充当模板指导的核酸合成的起始点的多核苷酸。为了进一步举例说明，引物也可用于多种其他寡核苷酸介导的合成过程中，包括作为从头RNA合成和体外转录相关过程（例如，基于核酸序列的扩增（NASBA），转录介导的扩增（TMA）等）的起始剂。引物一般是单链寡核苷酸（例如，寡脱氧核糖核苷酸）。引物的合适长度取决于引物的预期用途，但是一般从6一直到40个核苷酸，更一般从15一直到35个核苷酸。短的引物分子通常需要较冷的温度以与模板形成足够稳定的杂合复合体。引物不需要反映模板的确切序列，但必须足够互补以与模板杂交用于发生引物延伸。在某些实施方案中，术语“引物对”意指包括与待扩增的核酸序列的5'端的互补序列（complement）杂交的5'有义引物（有时称为“正向”）和与待扩增的序列的3'端杂交的3'反义引物（有时称为“反向”）的一组引物（例如，如果靶序列表达为RNA或为RNA）。如果期望，可以通过并入可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测的标记来标记引物。例如，有用的标记包括³²P、荧光染料、电子致密试剂、酶（如通常用于ELISA测定中的）、生物素或半抗原以及可获得抗血清或单克隆抗体的蛋白。

当提及核酸碱基、核苷三磷酸或核苷酸时，术语“常规的”或“天然的”是指天然存在于所描述的多核苷酸中的那些（即，对于DNA，这些是dATP、dGTP、dCTP和dTTP）。另外，在体外DNA合成反应例如测序中，经常使用dITP和7-脱氮-dGTP代替dGTP，并且可以使用7-脱氮-dATP代替dATP。总起来说，这些可以称为dNTPs。

当提及核酸碱基、核苷或核苷酸时，术语“非常规的”或“修饰的”包括天然存在于特定多核苷酸中的常规碱基、核苷或核苷酸的修饰、衍生或类似物。非常规或修饰的核酸碱基的一个实例包括甲基化-dNTPs，其中甲基附着至dNTP。α-、β-或γ-磷酸基团中的任何一个或多个可被一个或多个甲基基团修饰。在优选的实施方案中，甲基化-dNTP具有附着到γ-磷酸基团上的一个甲基。与常规dNTPs相比，某些非常规核苷酸在核糖糖的2'位置被修饰。因此，尽管对于RNA，天然存在的核苷酸是核糖核苷酸（即，ATP、GTP、CTP、UTP，总起来说rNTPs），但是因为这些核苷酸在糖的2'位置具有羟基，其比较起来在如本文所用的dNTPs中不存在，所以核糖核苷酸作为DNA聚合酶的底物是非常规核苷酸。如本文所用的，非常规核苷酸包括，但不限于，用作核酸测序终止剂的化合物。示例性终止剂化合物包括，但不限于，具有2',3'双脱氧结构并且被称为双脱氧核苷三磷酸的那些化合物。双脱氧核苷三磷酸ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP总起来说被称为ddNTPs。终止剂化合物的额外实例包括核糖核苷酸的2'-PO₄类似物（参见，例如，美国专利申请公开Nos. 2005/0037991和2005/0037398）。其他非常规核苷酸包括硫代磷酸酯dNTPs（[α-S]dNTPs）、5'-[α-硼烷]-dNTPs、[α]-甲基膦酸酯dNTPs和核糖核苷三磷酸（rNTPs）。非常规碱基可以用放射性同位素如³²P、³³P或³⁵S；荧光标记；化学发光标记；生物发光标记；半抗原标记，例如生物素；或酶标记，例如链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白进行标记。荧光标记可以包括带阴电的染料，例如荧光素家族的染料，或电荷中性的染料，例如罗丹明家族的染料，或带阳电的染料，例如花菁家族的染料。荧光素家族的染料包括，例如，FAM、HEX、TET、JOE、NAN和ZOE。罗丹明家族的染料包括德克萨斯红、ROX、R110、R6G和TAMRA。各种染料或用FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G、德克萨斯红和TAMRA标记的核苷酸由Perkin-Elmer（Boston, MA）、AppliedBiosystems（Foster City, CA）或Invitrogen/Molecular Probes（Eugene, OR）销售。花菁家族的染料包括Cy2、Cy3、Cy5和Cy7，且由GE Healthcare UK Limited（Amersham Place,Little Chalfont, Buckinghamshire, England）销售。

如本文所用的，“序列同一性的百分比”是通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定的，其中对于两个序列的最佳比对，与参考序列相比（其不包含添加或缺失），比较窗口中序列的部分可以包含添加或缺失（即，缺口）。通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以得出匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的总位置数，并将结果乘以100来计算百分比，以得出序列同一性的百分比。

在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或百分比“同一性”是指相同的两个或更多个序列或子序列。当在比较窗口或指定区域上关于最大对应进行比较和比对时，如使用以下序列比较算法之一或通过手工比对和目测所测量的，如果序列具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基（例如，在指定区域上至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性）），则所述序列彼此“基本相同”。这些定义也指测试序列的互补序列。任选地，同一性存在于长度至少约50个核苷酸的区域上，或更一般存在于长度为100至500或1,000或更多个核苷酸的区域上。

在两个或更多个多肽序列的上下文中，术语“相似性”或“百分比相似性”是指，当在比较窗口或指定区域上关于最大对应进行比较和比对时，如使用以下序列比较算法之一或通过手工比对和目测所测量的，具有指定百分比的相同或如通过保守氨基酸取代所定义的相似的氨基酸残基（例如，在指定区域上60％的相似性，任选65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的相似性）的两个或更多个序列或子序列。如果序列彼此至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％相似，则它们也彼此“基本相似”。任选地，所述相似性存在于长度至少约50个氨基酸的区域上，或更一般存在于长度为至少约100至500或1,000或更多个氨基酸的区域上。

对于序列比较，一般一个序列充当参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。通常使用默认程序参数，或者可以指定备择参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性或相似性。

如本文所用的，“比较窗口”包括对选自20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150的邻接位置数目的任一个的区段的参考，其中在两个序列最佳比对后，可以将一个序列与相同数目的邻接位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith和Waterman的局部同源性算法（Adv. Appl. Math. 2:482, 1970）、通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法（J. Mol. Biol. 48:443, 1970）、通过Pearson和Lipman的搜索相似性（search for similarity）方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988）、通过这些算法的计算机化实现（例如，Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 ScienceDr., Madison, Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA）或通过手工比对和目测（参见，例如，Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology（1995附录））进行。

适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的示例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别在Altschul等人（Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977）和Altschul等人（J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990）中描述。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）公开获得。所述算法包括首先通过识别查询序列（querysequence）中长度为W的短字码（words）来识别高评分序列对（HSPs），其当与数据库序列中相同长度的字码比对时匹配或满足某一正值阈值分数T。T被称为相邻字码分数阈值（neighborhood word score threshold）（Altschul等人，上文）。这些最初的相邻字码命中充当起始搜索以寻找包含它们的更长HSPs的种子。字码命中沿着每个序列在两个方向上延伸，直到可以增加累积比对分数的程度。对于核苷酸序列，使用参数M（对一对匹配残基的奖励分数；始终> 0）和N（对错配残基的惩罚分数；始终<0）来计算累积分数。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积分数。字码命中在每个方向上的延伸当下述情况时停止：累积比对分数从其最大实现值下降量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积分数达到零或更低；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序（对于核苷酸序列）作为默认值使用11的字长（W），10的期望（E），M=5，N=-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序作为默认值使用3的字长和10的期望（E）以及BLOSUM62评分矩阵（参见Henikoff和Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915,1989）50的比对（B），10的期望（E），M=5，N=-4以及两条链的比较。

BLAST算法还进行了两个序列之间的相似性的统计分析（参见，例如，Karlin和Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993）。BLAST算法提供的一种相似性量度是最小总和概率（smallest sum probability）（P(N)），其提供了将偶然发生两个核苷酸或氨基酸序列之间匹配的概率的指标。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2，一般小于约0.01，并且更一般小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。

术语“Cp值”或“交叉点（crossing point）”值是指允许输入靶核酸的定量的值。可以根据二阶导数最大值法确定Cp值(Van Luu-The, 等人, “Improved real-time RT-PCRmethod for high-throughput measurements using second derivative calculationand double correction,”BioTechniques, 第38卷, 第2期, 2005年2月, 第287-293页)。在二阶导数方法中，Cp对应于二阶导数曲线的第一个峰。这个峰对应于对数线性阶段（log-linear phase）的开始。二阶导数方法计算实时荧光强度曲线的二阶导数值，且仅获得一个值。原始Cp方法基于强度值的局部地定义的可微分的近似，例如，通过多项式函数。然后计算三阶导数。Cp值是三阶导数的最小根。还可以使用拟合点（fit point）法确定Cp，其中通过在对数线性区域中平行线与阈值线的交叉点确定Cp (Van Luu-The, 等人,BioTechniques, 第38卷, 第2期, 2005年2月, 第287-293页)。根据二阶导数最大值法通过计算由Roche提供的LightCycler仪器所提供的Cp值。

术语“PCR效率”是指循环至循环扩增效率的指标。使用以下方程式计算每种条件的PCR效率：%PCR效率= (10^(-斜率)-1) x 100，其中斜率通过用y-轴上绘制的对数拷贝数（logcopy number）和x-轴上绘制的Cp的线性回归进行计算。可以使用完美匹配的或错配的引物模板测量PCR效率。

术语“核酸延伸速率”是指生物催化剂（例如，酶，例如聚合酶、连接酶等）以依赖于模板或不依赖于模板的方式通过将一个或多个核苷酸附着（例如，共价地）到核酸上来延伸核酸（例如，引物或其他寡核苷酸）的速率。为了举例说明，相对于这些DNA聚合酶的未修饰的形式，本文所述的某些突变体DNA聚合酶具有改进的核酸延伸速率，从而使得它们可以在给定的一组反应条件下以比这些未修饰的形式更高的速率延伸引物。

术语“RT和聚合酶抑制剂的耐受性”是指在有一定量的抑制剂的情况下，聚合酶维持活性（聚合酶或反转录活性）的能力，所述抑制剂将抑制对照聚合酶的聚合酶活性或反转录活性。在一些实施方案中，在有一定量的抑制剂的情况下，改进的聚合酶能够具有聚合酶或反转录活性，所述抑制剂将基本上消除对照聚合酶活性。

术语“脱氧核糖核苷三磷酸”或“dNTP”是表示脱氧核糖核苷酸dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP和/或dUTP的通用术语。含有脱氧核糖的核苷三磷酸称为dNTPs，且在其名称中带前缀脱氧和在其缩写中带小写d-：脱氧腺苷三磷酸（dATP）、脱氧鸟苷三磷酸（dGTP）、脱氧胞苷三磷酸（dCTP）、脱氧胸苷三磷酸（dTTP）、脱氧肌苷三磷酸（dITP）和脱氧尿苷三磷酸（dUTP）。dNTPs是DNA复制的结构单元（它们在参入过程中失去了两个磷酸基团）。每个dNTP由磷酸基团、脱氧核糖糖和含氮碱基组成。DNA的双螺旋结构由dNTPs构成，非常类似于聚合物中的单体单元。

术语“烷基化的引物”是指其中一个或多个碱基已通过添加烷基基团被修饰的寡核苷酸。相对于用未修饰的引物进行的扩增，本发明的修饰的引物的使用导致非特异性扩增的减少，尤其是引物二聚体的形成，和/或预期靶的得率的伴随增加（参见，美国专利No.6,001,611）。

术语“甲基化dNTP、“甲基化-dNTP”或“me-dNTP”是指具有一个或多个添加的甲基基团的任何脱氧核糖核苷三磷酸或dNTP。实例包括甲基化-dATP、甲基化-dCTP，甲基化-dGTP和甲基化-dTTP。可以将一个或多个甲基基团添加到一个或多个在dNTPs中发现的α-、β-或γ-磷酸基团的任一个。在特定的实例中，甲基化-dNTPs是这样的，以致每个dNTP的末端γ-磷酸基团都被甲基基团修饰，与常规的未甲基化的dNTPs相比，其产生了供扩增反应例如PCR之用的更稳定的dNTP组分。在这种使用在γ-磷酸基团上具有一个甲基基团的甲基化-dNTP的情况下，因为甲基基团是在γ-磷酸基团上的，所以在PCR的延伸阶段甲基基团不并入扩增子中，这是因为γ-磷酸基团被作为焦磷酸切割掉。这样，在不与PCR反应相干扰的同时使用了更稳定的组分。

术语“氟化-dNTP、“氟-dNTP”、“F-dNTP”或“f-dNTP”是指在磷酸基团之一处氟化的任何脱氧核糖核苷三磷酸或dNTP。实例包括氟-dATP、氟-dCTP、氟-dGTP、氟-dTTP和氟-dUTP。氟原子可以在dNTPs中发现的α-、β-或γ-磷酸基团的任一个之一处置换一个氧。在特定的实例中，氟-dNTPs是这样的，以致每个dNTP的末端γ-磷酸基团都被氟化，与常规的未修饰的dNTPs相比，其产生了供扩增反应例如PCR之用的更稳定的dNTP组分。

术语“5'-核酸酶探针”是指包含至少一个光发射标记部分并且用于5'-核酸酶反应以实现靶核酸检测的寡核苷酸。在一些实施方案中，例如，5'-核酸酶探针仅包含单个光发射部分（例如，荧光染料等）。在某些实施方案中，5'-核酸酶探针包含自身互补性的区域，从而使得所述探针能够在选择的条件下形成发夹结构。为了进一步举例说明，在一些实施方案中，5'-核酸酶探针包含至少两个标记部分，并且在从寡核苷酸切割或以其他方式分离两个标记之一之后发射增加的强度的辐射。在某些实施方案中，5'-核酸酶探针用两种不同的荧光染料标记，例如，5'末端报道染料和3'末端猝灭剂染料或部分。在一些实施方案中，在除末端位置以外或除末端位置还有的一个或多个位置标记5'-核酸酶探针。当探针完整时，一般在两个荧光团之间发生能量转移，从而使得来自报道染料的荧光发射至少部分被猝灭。在聚合酶链反应的延伸步骤期间，例如，结合至模板核酸的5'-核酸酶探针被例如Taq聚合酶或具有所述活性的另一种聚合酶的5'至3'核酸酶活性切割，从而使得报道染料的荧光发射不再被猝灭。示例性的5'-核酸酶探针也描述在例如美国专利Nos. 5,210,015、5,994,056和6,171,785中。在其他实施方案中，可以用两种或更多种不同的报道染料和3'末端猝灭剂染料或部分标记5'核酸酶探针。

术语“FRET”或“荧光共振能量转移”或“Foerster共振能量转移”是指至少两个生色团，供体生色团和接纳体生色团（被称作猝灭剂）之间的能量转移。当供体被具有适当波长的光辐射激发时，供体一般向接纳体转移能量。接纳体一般将转移的能量以具有不同波长的光辐射的形式再发射。当接纳体是“暗”猝灭剂时，它以除光以外的形式耗散转移的能量。特定的荧光团是充当供体还是接纳体取决于FRET对的另一个成员的性质。常用的供体-接纳体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的暗猝灭剂包括BlackHole Quenchers™（BHQ）（Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.）、IowaBlack™（Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa）和BlackBerry™Quencher650（BBQ-650）（Berry & Assoc., Dexter, Mich.）。

附图简述

图1显示了实时PCR数据，其证明了在甲基化-dNTPs或氟化-dNTPS的情况下Z05D-F2的改进的性能。

图2显示了实时PCR数据，其比较了不同浓度的甲基化-dNTPs的参入。由亲本Z05D参入1 mM常规dNTPs被显示为基准点以及用于比较的基础。

图3显示了带有模板和ddCTP的三元复合体中Taq DNA聚合酶的克列诺片段的晶体结构（PDB检索代码（Accession Code）4N5S）。Taq DNA聚合酶用作Z05D的模型。标记了相应的残基I638和V703（I640和V705）。

图4显示了实时PCR数据，其比较了由亲本Z05D（SEQ ID NO：2）、Z05D-F2（SEQ IDNO：3）和单突变体Z05D-I640M（SEQ ID NO：4）和Z05D-V705L（SEQ ID NO：5）对常规的未修饰的dNTPs或甲基化-dNTPs的参入。

图5显示了RT-PCR数据，其比较了由亲本Z05D（SEQ ID NO：2）、Z05D-F2（SEQ IDNO：3）和单突变体Z05D-I640M（SEQ ID NO：4）和Z05D-V705L（SEQ ID NO：5）对甲基化-dNTPs的参入。使用β-联蛋白转录物作为在烷基化引物和甲基化-dNTPs（1 mM或2 mM）的情况下的RNA模板。在常规（未修饰的）dNTPs的情况下的Z05D数据显示为基准点。

详述

本发明提供了改进的DNA聚合酶，其中相对于未修饰的DNA聚合酶，所述聚合酶结构域中的一个或多个氨基酸已经突变。相对于未修饰的形式的聚合酶，本发明的DNA聚合酶是具有效率高地和有效地参入甲基化-dNTPs的改进的能力的活性酶。

例如，在涉及使用RT-PCR以检测和/或定量RNA靶的测定的多种应用中，效率更高地和有效地参入甲基化-dNTPs的DNA聚合酶是有帮助的。因此，DNA聚合酶可用于涉及多核苷酸延伸以及多核苷酸模板的反转录或扩增的多种应用，包括例如在重组DNA研究和疾病的医学诊断中的应用。

在一些实施方案中，本发明的聚合酶是嵌合聚合酶，即，包含来自两种或更多种酶的多肽区域。这种嵌合DNA聚合酶的实例描述于，例如，美国专利No. 6,228,628中。嵌合CS-家族DNA聚合酶是特别合适的，其包括CS5和CS6聚合酶及其具有显著氨基酸序列同一性或相似性的变体（一般至少80％的氨基酸序列同一性，且更一般至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性）。CS5和CS6 DNA聚合酶是衍生自栖热菌属物种Z05和海栖热袍菌（Tma）DNA聚合酶的嵌合酶。它们包含栖热菌属酶的N-末端5'-核酸酶结构域和Tma酶的C-末端3'-5'外切核酸酶和聚合酶结构域。这些酶具有有效的反转录酶活性，可以延伸含核苷酸类似物的引物，并且可以参入α-硫代磷酸酯dNTPs，dUTP，dITP以及也可以参入荧光素和花菁染料家族标记的dNTPs。CS5和CS6聚合酶也是有效的Mg²⁺-激活的PCR酶。CS5和CS6嵌合聚合酶进一步描述于，例如，美国专利No. 7,148,049中。

在一些实施方案中，氨基酸取代是单氨基酸取代。相对于未修饰的聚合酶，本文提供的DNA聚合酶可在活性位点包含一个或多个氨基酸取代。在这些位置处的氨基酸取代赋予了参入甲基化-dNTPs的改进的能力，从而产生了相对于未修饰的聚合酶具有参入甲基化-dNTPs的改进的能力的突变体DNA聚合酶。在一些实施方案中，Z05D的位置640和/或705处的氨基酸被不对应于Z05D的天然序列的氨基酸取代。在某些实施方案中，Z05D的位置640的氨基酸被甲硫氨酸（Met或M）取代和/或Z05D的位置705的氨基酸被亮氨酸（Leu或L）取代。可以使用，例如，位点定向诱变和在本文进一步描述的或否则本领域技术人员已知的测定中测定多核苷酸延伸性能的已知方法，确定一个或多个鉴定的位点的一种或多种其他合适的氨基酸取代。

在一些实施方案中，与天然聚合酶相比，本发明的聚合酶包含SEQ ID NO：3，并且进一步包含一种或多种额外的氨基酸变化（例如，通过氨基酸取代、添加或缺失）。

在一些实施方案中，这种功能性变体聚合酶一般将与野生型或天然存在的聚合酶具有显著的序列同一性或相似性，一般至少80％的氨基酸序列同一性，且更一般至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。

可以使用，例如，位点定向诱变和在本文进一步描述的或否则本领域技术人员已知的测定中测定多核苷酸延伸性能的已知方法，确定一个或多个鉴定的位点的一种或多种其他合适的氨基酸取代，例如，在美国专利公开Nos. 2009/0148891和2009/0280539中描述的氨基酸取代。

在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶衍生自栖热菌属物种Z05 DNA聚合酶（SEQID NO：1）或其变体（例如，带有D580G突变，例如Z05D（SEQ ID NO：2）等）。因此，在本发明的某些变化形式中，在位置640和/或位置705，相对于栖热菌属物种Z05D DNA聚合酶（或与SEQID NO：2基本相同，例如至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%相同的DNA聚合酶），突变体聚合酶包含至少一个氨基酸取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：2的位置640的氨基酸是甲硫氨酸（Met或M）（即，SEQ ID NOs：3或4）。在某些实施方案中，SEQ ID NO：2的位置705的氨基酸残基是亮氨酸（Leu或L）（即，SEQ ID NOs：3或5）。示例性的栖热菌属物种Z05DNA聚合酶突变体包括包含一个或多个氨基酸取代D580G的那些（即，Z05D（SEQ ID NO：2））。在一些实施方案中，突变体栖热菌属物种Z05 DNA聚合酶包含，例如，氨基酸残基取代D580G和I640M（SEQ ID NO：4）。在一些实施方案中，突变体栖热菌属物种Z05 DNA聚合酶包含，例如，氨基酸残基取代D580G和V705L（SEQ ID NO：5）。在一些实施方案中，突变体栖热菌属物种Z05 DNA聚合酶包含，例如，氨基酸残基取代D580G、I640M和V705L（SEQ ID NO：3）。在某些实施方案中，突变体栖热菌属物种Z05 DNA聚合酶包含，例如，一个或多个独立地选自D580G、I640M和/或V705L的氨基酸残基取代（SEQ ID NOs：3-5）。

以前已显示，在对应于SEQ ID NO：1（Z05）的位置580的氨基酸处的取代（其被称为Z05D（SEQ ID NO：2））可导致具有改进的聚合酶活性的DNA聚合酶，包括，例如，改进的延伸速率、反转录效率和/或扩增能力（参见，美国专利Nos. 8,962,293和9,102,924；和美国专利公开No. US 2016-0024548）。因此，预期本文所述的在与SEQ ID NO：1（Z05）的位置580位对应的氨基酸处包含取代的改进的聚合酶也将具有上述改进的性质。

除本文所述的突变和取代以外，本发明的DNA聚合酶还可包括一种或多种其他非取代修饰。这种修饰可以包括，例如，本领域已知的共价修饰，以在包含多核苷酸延伸的应用中赋予额外的优点。例如，一种这种修饰是热可逆共价修饰，其灭活酶，但是于升高的温度（例如一般用于多核苷酸延伸的温度）温育时被逆转以激活酶。在美国专利Nos. 5,773,258和5,677,152中描述了用于这种热可逆修饰的示例性试剂。

本发明的DNA聚合酶可以通过例如使用通常称为位点定向诱变的技术使编码相应的未修饰的聚合酶（例如，由其衍生本发明的聚合酶的野生型聚合酶或相应变体）的DNA序列突变而构建。编码未修饰的形式的聚合酶的核酸分子可以通过本领域普通技术人员众所周知的多种聚合酶链反应（PCR）技术进行突变。（参见，例如，PCR Strategies（M. A.Innis, D. H. Gelfand和J. J. Sninsky编, 1995, Academic Press, San Diego, CA）第14章；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications（M. A. Innis, D. H.Gelfand, J. J. Sninsky和T. J. White编, Academic Press, NY, 1990）。

作为非限制性实例，在来自Clontech的Transformer位点定向诱变（TransformerSite-Directed Mutagenesis）试剂盒中使用的两引物系统可用于将位点定向突变体引入编码未修饰的形式的聚合酶的多核苷酸。在所述系统中靶质粒变性后，将两个引物同时退火至质粒上；这些引物中的一个含有所期望的位点定向突变，另一个含有导致消除限制位点的质粒中另一点的突变。然后进行第二链合成，从而将这两个突变紧密连锁，并将所得到的质粒转化到大肠杆菌的mutS菌株中。从转化的细菌分离质粒DNA，用相关的限制酶进行限制酶切（从而线性化未突变的质粒），并然后再转化到大肠杆菌中。所述系统允许直接在表达质粒中产生突变，而不需要亚克隆或产生单链噬菌粒。两个突变的紧密连锁以及后来未突变的质粒的线性化导致了高突变效率，并允许最小限度的筛选。在合成初始限制位点引物之后，所述方法要求每个突变位点仅使用一种新的引物类型。可以合成一组“设计的简并”寡核苷酸引物，而不是分别准备每个位置突变体，以在给定位点同时引入所有所期望的突变。可以通过贯穿诱变的区域对质粒DNA进行测序以鉴定和分选突变体克隆来筛选转化体。然后可以限制酶切每种突变体DNA并通过电泳进行分析，如例如在突变检测增强凝胶（Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ）上，以确认序列中没有发生其他改变（通过与未诱变的对照的条带移位比较）。另一方面，可以对整个DNA区域进行测序，以确认在靶向的区域之外没有发生额外的突变事件。

可以以各种方式产生具有不止一个取代的氨基酸的DNA聚合酶。在氨基酸在多肽链中靠近放置的情况下，可以使用一种编码所有所期望的氨基酸取代的寡核苷酸同时对其进行突变。然而，如果氨基酸彼此相距一段距离放置（例如，被不止十个氨基酸隔开），则更难产生编码所有所期望的变化的单个寡核苷酸。相反，可以采用两种备择方法之一。在第一种方法中，对于每个要取代的氨基酸产生单独的寡核苷酸。然后将寡核苷酸同时退火至单链模板DNA，且从模板合成的第二链DNA将编码所有所期望的氨基酸取代。备择方法包括两轮或更多轮诱变以产生所期望的突变体。第一轮如对于单突变体所述的：将编码未修饰的聚合酶的DNA用来作模板，将编码一种或多种第一所期望的氨基酸取代的寡核苷酸退火至所述模板，且然后产生异源双链体DNA分子。第二轮诱变利用在第一轮诱变中产生的突变的DNA作为模板。因此，所述模板已经含有一个或多个突变。然后将编码一种或多种额外的所期望的氨基酸取代的寡核苷酸退火至所述模板，并且所得到的DNA链现在编码来自第一轮和第二轮诱变两者的突变。所述作为结果而产生的DNA可以在第三轮诱变中用作模板，依此类推。另一方面，可以利用Seyfang & Jin（Anal. Biochem. 324:285-291. 2004）的多位点诱变方法。

因此，还提供了编码任一种本发明的DNA聚合酶的重组核酸。使用编码DNA聚合酶的本发明的核酸，可以制备多种载体。包含衍生自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的任何载体都可以用于本发明的实践中。通常，表达载体包含与编码DNA聚合酶的核酸可操作连接的转录和翻译调节核酸区域。术语“控制序列”是指在特定宿主生物中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子，任选的操纵基因序列和核糖体结合位点。此外，载体可含有正反向调控元件（PositiveRetroregulatory Element）（PRE），以增加转录的mRNA的半衰期（参见Geffand等人，美国专利No. 4,666,848）。转录和翻译调节核酸区域通常将适于用于表达聚合酶的宿主细胞。对于多种宿主细胞，多种类型的合适的表达载体和合适的调节序列是本领域已知的。通常，转录和翻译调节序列可包括，例如，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。在典型的实施方案中，调节序列包括启动子以及转录起始和终止序列。载体也一般包括含有几个用于插入外源DNA的限制位点的多接头区域。在某些实施方案中，“融合标记（fusion flags）”用于促进纯化，以及如果期望的话，后来标签/标记序列例如“组氨酸标签（His-Tag）”的去除。然而，当从可能使用“加热步骤”的嗜温宿主（例如，大肠杆菌）纯化热活性和/或热稳定的蛋白时，这些通常是不必要的。使用标准重组DNA程序制备含有编码复制序列、调节序列、表型选择基因和感兴趣的聚合酶的DNA的合适载体的构建。如本领域众所周知的，将分离的质粒、病毒载体和DNA片段以特定顺序切割、裁剪并连接在一起，以产生所期望的载体（参见，例如，Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York,NY, 第2版1989））。

在某些实施方案中，表达载体含有选择标记基因以允许选择转化的宿主细胞。选择基因是本领域众所周知的，并且将随所用宿主细胞而变化。合适的选择基因可以包括，例如，编码氨苄青霉素和/或四环素抗性的基因，其使得用这些载体转化的细胞能够在有这些抗生素的情况下生长。

在本发明的一方面，将编码DNA聚合酶的核酸单独或与载体组合引入细胞。本文中所谓“引入”或语法上的同等物指的是核酸以适合于核酸的后来整合、扩增和/或表达的方式进入细胞。引入方法主要取决于靶向的细胞的类型。示例性的方法包括CaPO₄沉淀、脂质体融合、LIPOFECTIN®、电穿孔、病毒感染等。

在一些实施方案中，原核生物一般用作宿主细胞用于本发明的初始克隆步骤。它们对于快速生产大量DNA、对于生产用于位点定向诱变的单链DNA模板、对于同时筛选许多突变体以及对于产生的突变体的DNA测序特别有用。合适的原核宿主细胞包括大肠杆菌K12菌株94（ATCC No. 31,446）、大肠杆菌菌株W3110（ATCC No. 27,325）、大肠杆菌K12菌株DG116（ATCC No. 53,606）、大肠杆菌X1776（ATCC No. 31,537）和大肠杆菌B；然而，许多其他大肠杆菌菌株，例如HB101，JM101，NM522，NM538，NM539，以及许多其他原核生物物种和属，包括杆菌，例如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），其他肠杆菌科（enterobacteriaceae），例如鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）或粘质沙雷氏菌（Serratia marcesans），以及各种假单胞菌属（Pseudomonas）物种都可以用作宿主。一般使用如上文Sambrook等人的第1.82节中所述的氯化钙方法来转化原核宿主细胞或具有刚性细胞壁的其他宿主细胞。另一方面，电穿孔可用于这些细胞的转化。原核生物转化技术在例如Dower, Genetic Engineering, Principles and Methods 12:275-296 (PlenumPublishing Corp., 1990)；Hanahan等人, Meth. Enzymol., 204:63, 1991中陈述。一般用于转化大肠杆菌的质粒包括pBR322、pUCI8、pUCI9、pUCIl8、pUC119和Bluescript M13，所有这些均在上文Sambrook等人的第1.12-1.20节中描述。然而，许多其他合适的载体也是可用的。

本发明的DNA聚合酶一般通过在合适的条件下培养宿主细胞以诱导或引起DNA聚合酶的表达来产生，所述宿主细胞用含有编码DNA聚合酶的核酸的表达载体转化。在适于蛋白表达的条件下培养转化的宿主细胞的方法是本领域众所周知的（参见，例如，Sambrook等人，上文）。用于从含λpL启动子的质粒载体生产聚合酶的合适宿主细胞包括大肠杆菌菌株DG116（ATCC No. 53606）（参见美国专利No. 5,079,352和Lawyer, F.C.等人, PCR Methods and Applications 2:275-87, 1993）。表达后，可收获并分离聚合酶。用于纯化热稳定的DNA聚合酶的方法描述于，例如，Lawyer等人，上文。一旦纯化，就可以测试DNA聚合酶具有提高的RT效率、增加的错配耐受性、延伸速率和/或RT和聚合酶抑制剂的耐受性的能力（例如，如实施例中所述的）。

本发明的改进的DNA聚合酶可用于其中必需或期望这种酶活性的任何目的。因此，在本发明的另一方面，提供了使用聚合酶的多核苷酸延伸方法（例如，PCR）。适合于多核苷酸延伸的条件是本领域已知的。（参见，例如，Sambrook等人，上文。还参见Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology（第4版, John Wiley & Sons 1999）。通常，将引物与靶核酸退火，即杂交，以形成引物-模板复合体。使引物-模板复合体在合适的环境中与DNA聚合酶和核苷三磷酸接触，以允许在引物的3'端添加一个或多个核苷酸，从而产生与靶核酸互补的延伸的引物。引物可以包括，例如，一种或多种核苷酸类似物。此外，核苷三磷酸可以是常规核苷酸、非常规核苷酸（例如，核糖核苷酸或标记的核苷酸）或其混合物。在一些变化形式中，多核苷酸延伸反应包括靶核酸的扩增。适合于使用DNA聚合酶和引物对进行核酸扩增的条件在本领域中也是已知的（例如，PCR扩增方法）。（参见，例如，Sambrook等人，上文；Ausubel等人，上文；PCR Applications: Protocols for Functional Genomics（Innis等人编, Academic Press 1999）。在其他非互斥的实施方案中，多核苷酸延伸反应包括RNA模板的反转录（例如，RT-PCR）。在一些实施方案中，改进的聚合酶应用于454测序（Margulies, M等人 2005, Nature, 437, 376-380）。

任选地，引物延伸反应包括参考或未修饰的聚合酶的实际或潜在抑制剂。抑制剂可以抑制例如参考或未修饰的（对照）聚合酶的核酸延伸速率和/或反转录效率。在一些实施方案中，抑制剂是血红蛋白或其降解产物。例如，在一些实施方案中，血红蛋白降解产物是血红素分解产物，例如氯高铁血红素、血卟啉和胆红素。在一些实施方案中，抑制剂是铁螯合剂或紫色颜料。在其他实施方案中，抑制剂是肝素。在某些实施方案中，抑制剂是嵌入染料。在某些实施方案中，抑制剂是黑色素，其已被描述为聚合酶抑制剂。参见，例如，Ekhardt等人, Biochem Biophys Res Commun. 271(3):726-30（2000）。

本发明的DNA聚合酶可用于在有从包含聚合酶抑制剂的样品如例如血液中分离的多核苷酸模板的情况下延伸模板。例如，本发明的DNA聚合酶可用于在有血红蛋白（血液的主要组分）的情况下或在有血红蛋白降解产物的情况下延伸模板。血红蛋白可以降解为各种血红素分解产物，例如氯高铁血红素、羟高铁血红素、血卟啉和胆红素。因此，在某些实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在有包括但不限于氯高铁血红素、羟高铁血红素、血卟啉和胆红素的血红蛋白降解产物的情况下延伸模板。在某些实施方案中，血红蛋白降解产物是氯高铁血红素。在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在有约0.5至20.0 µM、约0.5至10.0 µM、约0.5至5.0 µM、约1.0至10.0 µM、约1.0至5.0 µM、约2.0至5.0 µM或约2.0至3.0 µM氯高铁血红素的情况下延伸模板。在其他实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在有至少约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、10.0、20.0或大于20 µM氯高铁血红素的情况下延伸模板。血红蛋白的分解产物包括铁螯合剂和紫色颜料。因此，在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在有铁螯合剂和/或紫色颜料的情况下延伸模板。在其他实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在有将抑制参考或对照DNA聚合酶对相同模板的延伸的一定量的血红蛋白降解产物的情况下延伸模板。

本发明的DNA聚合酶可用于在有肝素的情况下延伸模板。肝素通常作为抗凝剂存在于从血液分离的样品中。在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶可以用于在有约1.0至400 ng/µl、1.0至300 ng/µl、1.0至200 ng/µl、5.0至400 ng/µl、5.0至300 ng/µl、5.0至200 ng/µl、10.0至400 ng/µl、10.0至300 ng/µl或10.0至200 ng/µl肝素的情况下延伸模板。在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶可以用于在有至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400 ng/µl或大于400 ng/µl肝素的情况下延伸模板。在其他实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在有将抑制参考或对照DNA聚合酶对相同模板的延伸的一定量的肝素的情况下延伸模板。

在一些实施方案中，本发明的改进的聚合酶用于反转录反应中。在一些实施方案中，反转录反应在包含RNA模板、一种或多种引物和本发明的热稳定的DNA聚合酶的混合物中进行。反应混合物一般含有所有四种标准的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）（或dNTPs的甲基化形式）和含有二价阳离子和一价阳离子的缓冲液。示例性的阳离子包括，例如，Mg²⁺，尽管其他阳离子如Mn²⁺或Co²⁺可以激活DNA聚合酶。在其他实施方案中，反转录反应用本发明的热活性DNA聚合酶进行。在特定的实施方案中，如实施例中所述的，在有Mn²⁺或Mg²⁺的情况下，本发明的改进的聚合酶允许在不损害DNA模板的有效扩增的情况下的RNA模板的更有效扩增。

在一些实施方案中，与对照聚合酶相比，改进的聚合酶具有参入更稳定的甲基化-dNTPs的改进的能力。以前未意识到，在对应于Z05D（SEQ ID NO：2）的位置640和/或705的氨基酸处的取代可导致参入甲基化-dNTPs的能力。因此，在一些实施方案中，在对应于SEQ IDNO：2的位置640的氨基酸处具有Ile（I）至Met（M）取代和/或在对应于SEQ ID NO：2的位置705的氨基酸处具有Val（V）至亮氨酸（L）取代的DNA聚合酶可以导致改进的参入甲基化-dNTPs的能力。在一些实施方案中，与对照聚合酶相比，具有参入更稳定的甲基化-dNTPs的改进的能力的DNA聚合酶包含在对应于SEQ ID NO：2的位置640的氨基酸处Ile（I）至Met（M）取代和/或在对应于SEQ ID NO：2的位置705的氨基酸处Val（V）至Leu（L）的取代，且与SEQID NOs：1-5具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的氨基酸序列同一性。

靶核酸可以来自生物或合成来源。靶可以是例如DNA或RNA。通常，在产生扩增子的场合，扩增子将由DNA组成，尽管核糖核苷酸或合成核苷酸也可以参入扩增子中。在人们希望检测RNA的场合，扩增过程一般将包括反转录的使用，包括例如反转录PCR（RT-PCR）。

具体的靶序列可以包括，例如，病毒核酸（例如，人免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、巨细胞病毒（CMV）、细小B19病毒、EB病毒、丙型肝炎病毒（HCV）、人乳头瘤病毒（HPV）、日本脑炎病毒（JEV）、西尼罗病毒（WNV）、圣路易脑炎病毒（SLEV）、澳大利亚X病病毒和昆津病毒（Kunjin virus））、细菌核酸（例如，金黄色葡萄球菌（S. aureus）、脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitidis）、恶性疟虫（Plasmodium falciparum）、鼠衣原体（Chlamydia muridarum）、砂眼衣原体）、分枝杆菌、真菌核酸或来自动物或植物的核酸。在一些实施方案中，靶核酸是动物（例如，人）核酸或衍生自动物（例如，人）样品（即，病毒或其他病原生物核酸可以存在于来自动物活组织检查的样品、血液样品、尿样品、粪便样品、唾液等中）。在一些实施方案中，靶核酸是，例如，人遗传区，其可以包括与疾病（例如，癌症、糖尿病等）有关的变体。因为在一些实施方案中，本发明的聚合酶具有错配耐受性，所以这种酶特别有用，例如，在靶序列中可以有相关序列的多样性的场合。例如，本发明可用于检测病毒病原体，其中病毒病原体在其基因组中具有足够的变异，以使得难以或不可能设计将扩增大部分或全部可能的病毒基因组的单个或少量引物组，或在已知或可能发生序列变异的癌症或其他疾病的遗传标记中。

用于使用本文所述的改进的聚合酶来检测延伸产物或扩增产物的其他方法包括使用荧光双链核苷酸结合染料或荧光双链核苷酸嵌入染料。荧光双链DNA结合染料的实例包括SYBR-绿（Molecular Probes）。双链DNA结合染料可以与解链曲线分析一起使用，以测量引物延伸产物和/或扩增产物。解链曲线分析可以在实时PCR仪器上进行，例如带有机载软件（SDS 2.1）的ABI 5700/7000（96孔格式）或ABI 7900（384孔格式）仪器。另一方面，可以作为终点分析进行解链曲线分析。解链温度分析的示例性方法描述于美国专利公开No.2006/0172324中。

在本发明的另一个方面，提供了用于本文所述的引物延伸方法的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒为了便于使用而隔开，并含有至少一个提供根据本发明的改进的DNA聚合酶的容器。也可以包括提供一种或多种额外的试剂的一个或多个额外的容器。在一些实施方案中，试剂盒还可包括包含肝素或其盐或将肝素释放到溶液中的血液收集管、容器或单元。血液收集单元可以是肝素化的（heparinized）管。这种额外的容器可以包括技术人员公认的供根据上述方法的引物延伸程序之用的任何试剂或其他元件，包括供例如核酸扩增程序（例如，PCR、RT-PCR）、DNA测序程序或DNA标记程序之用的试剂。例如，在某些实施方案中，试剂盒进一步包括提供在引物延伸条件下可与预定的多核苷酸模板杂交的5'有义引物或包含5'有义引物和相应的3'反义引物的引物对的容器。在其他非互斥变化形式中，试剂盒包括一个或多个提供核苷三磷酸（常规和/或非常规）的容器。在特定的实施方案中，试剂盒包括α-硫代磷酸酯dNTPs，dUTP，dITP，和/或标记的dNTPs，如例如荧光素或花菁染料家族dNTPs，或甲基化-dNTPs。在再其他非互斥的实施方案中，试剂盒包括一个或多个提供适合于引物延伸反应的缓冲液的容器。

在本发明的另一个方面，提供了反应混合物，其包含具有改进的参入甲基化-dNTPs的能力的聚合酶，如本文所述的。反应混合物可进一步包含供例如核酸扩增程序（例如，PCR、RT-PCR）、DNA测序程序或DNA标记程序之用的试剂。例如，在某些实施方案中，反应混合物包含适合于引物延伸反应的缓冲液。反应混合物还可以含有模板核酸（DNA和/或RNA）、一种或多种引物或探针多核苷酸、核苷三磷酸（包括，例如，脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、标记的核苷酸、非常规核苷酸、甲基化-dNTPs）、盐（例如，Mn²⁺、Mg²⁺）、标记（例如，荧光团）。在一些实施方案中，反应混合物含有在引物延伸条件下可与预定的多核苷酸模板杂交的5'-有义引物或包含5'-有义引物和相应的3'反义引物的引物对。在一些实施方案中，反应混合物含有α-硫代磷酸酯dNTPs，dUTP，dITP，和/或标记的dNTPs，如例如荧光素或花菁染料家族dNTPs，和/或甲基化-dNTPs。在一些实施方案中，反应混合物包含铁螯合剂或紫色染料。在某些实施方案中，反应混合物包含血红蛋白或血红蛋白的降解产物。例如，在某些实施方案中，血红蛋白的降解产物包括血红素分解产物，例如氯高铁血红素、羟高铁血红素、血卟啉（hematophoryn）和胆红素。在其他实施方案中，反应混合物包含肝素或其盐。在某些实施方案中，反应混合物含有从血液分离的模板核酸。在其他实施方案中，模板核酸是RNA，并且反应混合物包含肝素或其盐。

在一些实施方案中，反应混合物包含两种或更多种聚合酶。例如，在一些实施方案中，反应混合物包含与对照聚合酶相比具有增加的反转录酶效率的第一DNA聚合酶，和具有依赖于DNA的聚合酶活性的第二DNA聚合酶。第二DNA聚合酶可以是野生型或未修饰的聚合酶，或者可以是具有增加的依赖于DNA的聚合酶活性的改进的聚合酶。通过提供具有增加的反转录酶活性的聚合酶和具有依赖于DNA的聚合酶活性的聚合酶两者，这种反应混合物可用于扩增RNA模板（例如，RT-PCR）。

实施例

提供以下实施例以举例说明，但不限制请求保护的发明。

实施例1：修饰的聚合酶的鉴定

修饰的聚合酶基于野生型Z05聚合酶（SEQ ID NO：1）的已知突变体，称为Z05D（SEQ IDNO：2，在美国专利No. 8,962,293中描述）。Z05D突变体具有在位置580用氨基酸甘氨酸（G）置换的氨基酸天冬氨酸（D）（即，Z05D是具有D580G突变的Z05D聚合酶）（SEQ ID NO：2）。本发明的修饰的聚合酶被称为“Z05突变体F2”或（“Z05D-F2”）（SEQ ID NO：3）。Z05D突变体F2使用利用甲基化-dNTPs和烷基化引物的基于PCR的筛选在由易错PCR产生的文库中发现。Z05D-F2被大规模表达和纯化（500 ml），并证实了在PCR测定中由Z05D-F2参入甲基化-dNTPs，如图1所示的。下表1中描述了所使用的各种聚合酶的序列。

表1

对于这些实施例中描述的所有PCR实验，所用引物均具有SEQ ID NOs：7和8的核酸序列，所用探针均具有SEQ ID NO：9的核酸序列，并且所用模板均具有SEQ ID NO：10的核酸序列，如下表2所示的。

表2

虽然亲本Z05D（SEQ ID NO：2）不参入甲基化-dNTPs，但Z05D-F2（SEQ ID NO：3）在标准cobas 6800/8800条件下成功使用1 mM dNTPs执行了PCR。条件在下面的表3中示出。

表3

然而，与使用亲本Z05D和常规dNTPs（即，未甲基化的dNTPs）的参考相比，当使用Z05D-F2和甲基化-dNTPs时观察到大约6个循环的延迟。除甲基化-dNTPs外，还测试了氟化-dNTPs（F-dNTPs）作为另一种候选稳定替换物，其也将可能避免核苷酸的水解。然而，Z05D-F2以非常低的效率（Cp> 40）参入F-dNTPs。即使增加F-dNTPs的浓度也不导致PCR性能的显著改善。对比起来，将主混合物（mastermix）中的甲基化-dNTPs浓度提高至2 mM改进PCR效率，并且测定的Cp-值与标准条件下亲本Z05D和未修饰核苷酸的Cp-值相同，如图2所示的。

实施例2：参入修饰的dNTPs的修饰的聚合酶

Z05D-F2变体具有两个氨基酸取代：I640M和V705L（SEQ ID NO：3），如图3所示的。进行两个氨基酸取代的去褶合，并关于其参入甲基化-dNTPs评价单氨基酸变体。因此，通过位点定向诱变产生、表达和纯化单氨基酸变体Z05D-I640M（SEQ ID NO：4）和Z05D-V705L（SEQ IDNO：5）。使用常规的未修饰的dNTPs、甲基化-dNTPs和F-dNTPs关于其PCR性能对单氨基酸变体、双重突变体F2（SEQ ID NO：3）和亲本Z05D蛋白（SEQ ID NO：2）进行了评估，如图4A和4B所示的。使用在主混合物中带有烷基化引物的DNA模板，测试了相等浓度的Z05D变体（示于上表3中）。在用常规dNTPs的情况下，单突变体Z05D-V705L（SEQ ID NO：5）显示与亲本Z05D（SEQ ID NO：2）相同的性能，而双重突变体Z05D-F2（SEQ ID NO：3）和单突变体Z05D-I640M（SEQ ID NO：4）两者显示延迟的Cp-值和较低的荧光信号。另一方面，Z05D-F2（SEQ ID NO：3）和Z05D-I640M（SEQ ID NO：4）是仅有的支持使用甲基化dNTPs的PCR的变体。合起来看，这些数据提示I640M是甲基化-dNTP参入的关键氨基酸取代。有趣的是，与双重突变体Z05D（Z05D-F2，SEQ ID NO：3）相比，Z05D-I640M（SEQ ID NO：4）显示出5个循环的延迟。这提示虽然单独氨基酸取代V705L不促进使用甲基化-dNTPs的PCR，但氨基酸取代V705L的确导致Z05D-F2双重突变体（SEQ ID NO：3）中使用修饰的核苷酸的PCR效率增加。不同蛋白根本不参入或者仅以非常低的效率参入氟化-dNTPs（F-dNTPs）（数据未显示）。

实施例3：在HIV测定中通过修饰的聚合酶参入甲基化d-NTPs

为了在测定中使用甲基化-dNTPs作为稳定的核苷酸替换物，例如用于Cobas® Liat®系统的HIV-测定，甲基化-dNTPs和Z05D-F2（SEQ ID NO：3）需要支持RT-PCR。因此，为了测试这一点，使用β-联蛋白转录物作为RNA模板用烷基化引物和1mM或2 mM甲基化-dNTPs进行RT-PCR。比较起来，平行进行使用亲本Z05D（SEQ ID NO：2）和未修饰的核苷酸的反应。结果在图5中给出。如所预期的，单突变体Z05D-V705L（SEQ ID NO：5）不显示任何生长曲线，并且单突变体Z05D-I640M（SEQ ID NO：4）仅支持具有增加的甲基化-dNTPs浓度的RT-PCR。双突变体Z05D-F2（SEQ ID NO：3）在1 mM和2 mM的甲基化-dNTPs浓度成功进行了RT-PCR，但在这些主混合物条件下Cp-值分别延迟了~9和~4个循环。为了最优化RT-PCR性能，可能需要调节主混合物的其他组分（例如，金属离子、盐浓度）。

序列表

<110> Roche Diagnostics GmbH

F. Hoffmann-La Roche AG

Roche Molecular Systems, Inc.

<120> 用于甲基化-dNTPs的效率高的和有效参入的DNA聚合酶

<130> P34516-WO-HS

<150> 62/645,935

<151> 2018-03-21

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 834

<212> PRT

<213> 栖热菌属物种（Thermus sp.）

<400> 1

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe

50 55 60

Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu

65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln

85 90 95

Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu

100 105 110

Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys

115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg

130 135 140

Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu

145 150 155 160

Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys

165 170 175

Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp

180 185 190

Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu

195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg

210 215 220

Val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu Asp

225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu

245 250 255

Glu Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg

260 265 270

Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly

275 280 285

Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro

290 295 300

Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp

305 310 315 320

Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Lys Glu Gly Arg Val His Arg

325 330 335

Ala Lys Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly

340 345 350

Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Asp

355 360 365

Leu Ala Pro Ser Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro

370 375 380

Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp

385 390 395 400

Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ala Glu Arg Leu Gln Gln

405 410 415

Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr

420 425 430

Gln Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala

435 440 445

Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu

450 455 460

Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala

465 470 475 480

Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu

485 490 495

Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly

500 505 510

Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His

515 520 525

Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys

530 535 540

Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly

545 550 555 560

Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu

565 570 575

Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu

580 585 590

Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu

595 600 605

Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu

610 615 620

Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile

625 630 635 640

His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Ser Pro Glu Ala Val

645 650 655

Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu

660 665 670

Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr

675 680 685

Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys

690 695 700

Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly

705 710 715 720

Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn

725 730 735

Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn

740 745 750

Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val

755 760 765

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770 775 780

Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu

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Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala

805 810 815

Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala

820 825 830

Lys Gly

<210> 2

<211> 834

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Z05D聚合酶

<400> 2

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe

50 55 60

Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu

65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln

85 90 95

Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu

100 105 110

Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys

115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg

130 135 140

Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu

145 150 155 160

Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys

165 170 175

Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp

180 185 190

Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu

195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg

210 215 220

Val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu Asp

225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu

245 250 255

Glu Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg

260 265 270

Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly

275 280 285

Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro

290 295 300

Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp

305 310 315 320

Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Lys Glu Gly Arg Val His Arg

325 330 335

Ala Lys Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly

340 345 350

Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Asp

355 360 365

Leu Ala Pro Ser Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro

370 375 380

Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp

385 390 395 400

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405 410 415

Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr

420 425 430

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435 440 445

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Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala

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Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu

485 490 495

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515 520 525

Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys

530 535 540

Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly

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Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu

565 570 575

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Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu

660 665 670

Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr

675 680 685

Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys

690 695 700

Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly

705 710 715 720

Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn

725 730 735

Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn

740 745 750

Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val

755 760 765

Lys Leu Phe Pro His Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln

770 775 780

Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu

785 790 795 800

Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala

805 810 815

Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala

820 825 830

Lys Gly

<210> 3

<211> 834

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的Z05D聚合酶

<400> 3

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe

50 55 60

Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu

65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln

85 90 95

Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu

100 105 110

Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys

115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg

130 135 140

Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu

145 150 155 160

Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys

165 170 175

Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp

180 185 190

Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu

195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg

210 215 220

Val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu Asp

225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu

245 250 255

Glu Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg

260 265 270

Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly

275 280 285

Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro

290 295 300

Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp

305 310 315 320

Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Lys Glu Gly Arg Val His Arg

325 330 335

Ala Lys Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly

340 345 350

Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Asp

355 360 365

Leu Ala Pro Ser Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro

370 375 380

Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp

385 390 395 400

Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ala Glu Arg Leu Gln Gln

405 410 415

Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr

420 425 430

Gln Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala

435 440 445

Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu

450 455 460

Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala

465 470 475 480

Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu

485 490 495

Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly

500 505 510

Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His

515 520 525

Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys

530 535 540

Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly

545 550 555 560

Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu

565 570 575

Ser Ser Ser Gly Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu

580 585 590

Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu

595 600 605

Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu

610 615 620

Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Met

625 630 635 640

His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Ser Pro Glu Ala Val

645 650 655

Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu

660 665 670

Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr

675 680 685

Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys

690 695 700

Leu Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly

705 710 715 720

Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn

725 730 735

Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn

740 745 750

Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val

755 760 765

Lys Leu Phe Pro His Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln

770 775 780

Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu

785 790 795 800

Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala

805 810 815

Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala

820 825 830

Lys Gly

<210> 4

<211> 834

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的Z05D聚合酶

<400> 4

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe

50 55 60

Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu

65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln

85 90 95

Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu

100 105 110

Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys

115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg

130 135 140

Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu

145 150 155 160

Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys

165 170 175

Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp

180 185 190

Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu

195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg

210 215 220

Val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu Asp

225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu

245 250 255

Glu Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg

260 265 270

Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly

275 280 285

Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro

290 295 300

Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp

305 310 315 320

Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Lys Glu Gly Arg Val His Arg

325 330 335

Ala Lys Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly

340 345 350

Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Asp

355 360 365

Leu Ala Pro Ser Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro

370 375 380

Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp

385 390 395 400

Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ala Glu Arg Leu Gln Gln

405 410 415

Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr

420 425 430

Gln Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala

435 440 445

Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu

450 455 460

Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala

465 470 475 480

Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu

485 490 495

Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly

500 505 510

Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His

515 520 525

Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys

530 535 540

Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly

545 550 555 560

Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu

565 570 575

Ser Ser Ser Gly Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu

580 585 590

Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu

595 600 605

Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu

610 615 620

Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Met

625 630 635 640

His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Ser Pro Glu Ala Val

645 650 655

Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu

660 665 670

Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr

675 680 685

Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys

690 695 700

Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly

705 710 715 720

Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn

725 730 735

Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn

740 745 750

Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val

755 760 765

Lys Leu Phe Pro His Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln

770 775 780

Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu

785 790 795 800

Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala

805 810 815

Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala

820 825 830

Lys Gly

<210> 5

<211> 834

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的Z05D聚合酶

<400> 5

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe

50 55 60

Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu

65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln

85 90 95

Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu

100 105 110

Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys

115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg

130 135 140

Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu

145 150 155 160

Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys

165 170 175

Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp

180 185 190

Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu

195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg

210 215 220

Val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu Asp

225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu

245 250 255

Glu Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg

260 265 270

Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly

275 280 285

Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro

290 295 300

Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp

305 310 315 320

Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Lys Glu Gly Arg Val His Arg

325 330 335

Ala Lys Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly

340 345 350

Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Asp

355 360 365

Leu Ala Pro Ser Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro

370 375 380

Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp

385 390 395 400

Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ala Glu Arg Leu Gln Gln

405 410 415

Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr

420 425 430

Gln Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala

435 440 445

Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu

450 455 460

Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala

465 470 475 480

Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu

485 490 495

Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly

500 505 510

Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His

515 520 525

Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys

530 535 540

Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly

545 550 555 560

Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu

565 570 575

Ser Ser Ser Gly Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu

580 585 590

Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu

595 600 605

Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu

610 615 620

Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile

625 630 635 640

His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Ser Pro Glu Ala Val

645 650 655

Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu

660 665 670

Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr

675 680 685

Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys

690 695 700

Leu Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly

705 710 715 720

Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn

725 730 735

Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn

740 745 750

Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val

755 760 765

Lys Leu Phe Pro His Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln

770 775 780

Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu

785 790 795 800

Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala

805 810 815

Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala

820 825 830

Lys Gly

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基序A

<400> 6

Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg

1 5

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (25)..(25)

<223> 叔丁基苄基-dA

<400> 7

acaaccgcgc catacatgtc aagaa 25

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (24)..(24)

<223> 叔丁基苄基-dA

<400> 8

gtcgggccgc ttatacagta ccaa 24

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<220>

<221> misc_feature

<222> (0)..(1)

<223> CY5.5

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(12)

<223> BHQ-2

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> 磷酸

<400> 9

tgcgcgtccc gttttgatac ttcgtaacgg tgc 33

<210> 10

<211> 722

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 模板

<400> 10

gatctagctt tgcctgcttg atagcaatcg gctatcgact aatgactgtc ctggcggtct 60

ctcgccatct cctaccgcat tggctcatag gtaagctcgc tgtcacccag tacggaggtg 120

ccagtagatt attagagaca gtcgccaatc gatcgttata ccgagatgac tgagtatcga 180

agctacattg tagccgcaca taggaccacc catcttcatg ttgaaacatg aggattaccc 240

atgtggatct aactgggtag taactgcggg ggcgaatgat gcaggcttca gaaattaaac 300

tcaatagtat ccggtgtctc aatctttttc gggccaggcg gcggtggacg acagacaatt 360

ttacgatttt ggttccggtc acaaccgcgc catacatgtc aagaatgaag tgggcgaacg 420

ctagaaaact gacgccagca attaagtgag tcggggcgag gtgactccca cgtaaaaagc 480

ccctaccccg caccgttacg aagtatcaaa acgggacgcg cacgaaccga cgattggtac 540

tgtataagcg gcccgacgaa ctcaaaatcc caagtgaatc tatgaaatct acatcgcgtt 600

tataatctac ggggtgtaaa cggatgagaa ttggccaaac ggaggcacac acgcgtgcaa 660

tgcgccgacc ctgagaaaag tatcatgtgc gtcggccaca aaacatgagg attacccatg 720

ta 722

Claims (18)

1.DNA聚合酶，其与对照DNA聚合酶相比，具有提高的参入甲基化脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）的效率，其中所述DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置640的氨基酸是除I以外的任何氨基酸，和/或其中所述DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置705的氨基酸是除V以外的任何氨基酸，并且其中所述对照DNA聚合酶具有与所述DNA聚合酶相同的氨基酸序列，只是所述对照DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置640的氨基酸是I和/或所述对照DNA聚合酶对应于SEQ ID NO：2的位置705的氨基酸是V。

2.权利要求1的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶和所述对照DNA聚合酶包含与SEQ IDNO：2至少90％相同的氨基酸序列。

3.权利要求1-2任一项的DNA聚合酶，其中对应于SEQ ID NO：2的位置640的氨基酸是M。

4.权利要求1-3任一项的DNA聚合酶，其中对应于SEQ ID NO：2的位置705的氨基酸是L。

5.权利要求3的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

6.权利要求4的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。

7.权利要求1-4任一项的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

8.编码根据权利要求1-7任一项的DNA聚合酶的重组核酸。

9.包含权利要求8的重组核酸的表达载体。

10.用于生产延伸的引物的试剂盒，其包括至少一个容器，所述容器提供根据权利要求1-7任一项的DNA聚合酶。

11.权利要求10的试剂盒，其进一步包括一个或多个选自以下的额外容器：

（a）提供在引物延伸条件下可与预定的多核苷酸模板杂交的引物的容器；

（b）提供dNTPs的容器；和

（c）提供适合于引物延伸的缓冲液的容器。

12.权利要求11的试剂盒，其中所述dNTPs是甲基化dNTP。

13.反应混合物，其包含根据权利要求1-7任一项的DNA聚合酶、至少一种引物、多核苷酸模板和dNTPs。

14.权利要求13的反应混合物，其中所述多核苷酸模板是RNA。

15.权利要求13的反应混合物，其中所述多核苷酸模板是DNA。

16.权利要求13-15任一项的反应混合物，其进一步包含Mg²⁺。

17.权利要求13-16任一项的反应混合物，其进一步包含第二热稳定的DNA聚合酶。

18.用于进行引物延伸的方法，包括：

在适合于引物延伸的条件下，使根据权利要求1-7任一项的DNA聚合酶与引物、多核苷酸模板和核苷三磷酸接触，从而产生延伸的引物。

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