KR101622442B1 - ３’―미스매치 구별이 증가된 ｄｎａ 중합효소 - Google Patents

３’―미스매치 구별이 증가된 ｄｎａ 중합효소 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는, 상응하는 변형되지 않은 중합효소에 비해 3'-미스매치 구별이 증가된 돌연변이체 DNA 중합효소가 개시된다. 돌연변이체 중합효소는 개시되어 있는 다양한 프라이머 신장 방법에 유용하다. 또한, 예를 들어 돌연변이체 DNA 중합효소의 제조에 유용한, 재조합 핵산, 벡터, 및 숙주 세포를 포함하는 관련 조성물이 본원에 개시된다.

Description

３’―미스매치 구별이 증가된 ＤＮＡ 중합효소 {DNA POLYMERASES WITH INCREASED 3'-MISMATCH DISCRIMINATION}
본 발명은, 3'-미스매치 구별이 증가된 DNA 중합효소, 및 핵산 폴리뉴클레오티드 신장 및 증폭을 포함하는 다양한 적용에서의 이의 용도를 제공한다.
DNA 중합효소는 세대간 유전 정보를 정확하게 전송하기 위한 핵심적인 역할을 하는 게놈의 복제 및 유지를 책임지고 있다. 세포에서 효소로서의 DNA 중합효소 기능은 DNA 합성을 책임지고 있다. 이들은 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트를 Mg2 + 와 같은 금속 활성화제의 존재 하에서 복사되는 DNA 주형 또는 폴리뉴클레오티드 주형에 의해 지시되는 순서로 중합한다. 생체 내에서, DNA 중합효소는 DNA 복제, DNA 수선, 재조합, 및 유전자 증폭을 포함하는 DNA 합성 공정의 스펙트럼에 참여한다. 각각의 DNA 합성 공정 동안, DNA 주형은 한번 복사되고 동일한 복제품을 제조하기 위해 수회 이하로 복사된다. 대조적으로, 시험관내에서, DNA 복제는 예를 들어 중합 효소 사슬 반응 동안 수 회 반복될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제 4,683,202 호 참조).
중합효소 사슬 반응 (PCR) 을 이용한 초기 연구에서, DNA 중합효소는 DNA 복제의 각 라운드 초기에 첨가되었다 (미국 특허 제 4,683,202 호 (supra) 참조). 이어서, 열안정성의 DNA 중합효소가 승온에서 자라는 박테리아로부터 수득될 수 있는지를 결정하고, 이들 효소가 오직 한번만 첨가될 필요가 있는지를 결정하였다 (미국 특허 제 4,889,818 호 및 미국 특허 제 4,965,188 호). PCR 동안 사용되는 승온에서, 이들 효소는 비가역적으로 불활성화되지 않는다. 결과적으로, 각 합성 첨가 공정의 출발시 신선한 효소를 첨가하지 않고 중합효소 사슬 반응의 반복적 사이클을 수행할 수 있다. DNA 중합효소, 특히 열안정성의 중합효소는 재조합 DNA 연구에서 다양한 기술에 대해 핵심요소이고 질병의 의학적 진단에서 핵심요소이다. 특히, 진단 적용에 대해, 표적 핵산 서열은 DNA 또는 RNA 의 오직 적은 부분일 수 있어, 증폭 없이 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 것이 어려울 수 있다.
DNA 중합효소의 전체적인 접힘 패턴은 인간의 오른손과 비슷하고 손바닥, 손가락 및 엄지의 3 개의 구분되는 서브도메인을 포함한다 (문헌 [Beese et al., Science 260:352-355, 1993]; [Patel et al., Biochemistry 34:5351-5363, 1995] 참조). 손가락 및 엄지 서브도메인의 구조가 크기 및 세포 기능이 상이한 중합효소 사이에서 매우 다양하고, 촉매적 손바닥 서브도메인이 모두 포개어질 수 있다. 예를 들어, 모티프 A (이는 후임 dNTP 와 상호작용하고 화학적 촉매작용 동안 전이 상태를 안정화함) 는 포유동물 pol α 및 원핵세포의 pol I 패밀리 DNA 중합효소 중에서 약 1 Å 의 평균 편차로 포개질 수 있다 (Wang et al., Cell 89:1087-1099, 1997). 모티프 A 는 주로 소수성 잔기를 포함하고 α-나선으로 연장되는 역평행 β-가닥에서 구조적으로 시작된다. DNA 중합효소 활성 부위의 1차 아미노산 서열은 예외적으로 보존된다. 모티프 A 의 경우, 예를 들어, 서열 DYSQIELR (SEQ ID NO:28) 은 예를 들어, 써무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 및 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli) 를 포함하는, 수백만년 진화로 인해 유기체로부터 분리된 중합효소에서 보유된다.
잘 보존된다는 것 외에도, DNA 중합효소의 활성 부위는 또한 상대적으로 돌연변이가 일어나기 쉬워, DNA 중합효소 활성의 현저한 감소 없이 특정 아미노산 치환을 다루기 쉽다 (참조, 예를 들어, 미국 특허 제 6,602,695 호). 그러한 돌연변이체 DNA 중합효소는 예를 들어 핵산 합성 반응을 포함하는 진단 및 연구 적용에서 다양한 선택적인 이점을 제공할 수 있다. 따라서, 중합효소 활성을 개선시키기 위해 돌연변이될 수 있는 아미노산 위치를 확인할 필요성이 있다. 본 발명은 본원에서 이러한 필요성 및 다른 필요성을 충족시킨다.
발명의 개요
본원에서는, 상응하는 변형되지 않은 대조군 중합효소에 대한 3'-미스매치 구별이 증가된 DNA 중합효소이고, 그러한 DNA 중합효소를 제조하는 방법 및 이용하는 방법이 제공된다. 몇몇 구현예에서, 중합효소는 열안정성의 DNA 중합효소이다. 몇몇 구현예에서, DNA 중합효소는 열활성 DNA 중합효소이다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소는 써무스 (Thermus) 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, DNA 중합효소는 써모토가 (Thermotoga) 종으로부터 유래한다.
본 발명에 따르면, SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 DNA 중합효소의 아미노산이 상응하는 변형되지 않은 대조군 중합효소에 비해 3'-미스매치 구별이 증가된 효소를 제조하기 위한 위치에서 천연 아미노산으로부터 돌연변이화될 수 있다. 써무스 종으로부터 유래되는 DNA 중합효소에서, SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 천연 아미노산은 E 이다. 써모토가 종으로부터 유래하는 DNA 중합효소에서, SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 천연 아미노산은 S 이다. 다른 비-써무스, 비-써모토가 종으로부터 유래하는 DNA 중합효소에서, SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 아미노산은 E 또는 S 이외의 아미노산이며, 예를 들어, A 또는 G 이다. 도 1 을 참조한다.
몇몇 구현예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 DNA 중합효소의 아미노산은 E, S, A 또는 G 이외의 임의의 아미노산이고, 대조군 DNA 중합효소는 SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 대조군 DNA 중합효소의 아미노산이 E, S, A 또는 G 인 것을 제외하고는 DNA 중합효소와 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 예를 들어, 몇몇 구현예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 위치에서 아미노산은 V, L, I, M, F, W, P, T, C, Y, N, Q, D, K, R 또는 H 로부터 선택된다.
그러나, 위치 493 에서 E 대신 A 또는 G 가 삽입되는 것이 (몇몇 비-써무스, 비-써모토가 종에서 천연 아미노산), 3'-미스매치 구별을 증가시키는 것으로 추가로 밝혀졌다. 따라서, 몇몇 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소는 써무스 종으로부터 유래하고, SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 DNA 중합효소의 아미노산은 E 이외의 임의의 아미노산이고, 대조군 DNA 중합효소는 SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 대조군 DNA 중합효소의 아미노산이 E 인 것을 제외하고는 DNA 중합효소와 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 예를 들어, DNA 중합효소가 써무스 종으로부터 유래하는 곳에서, SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 위치에서의 아미노산은 S, A, G, V, L, I, M, F, W, P, T, C, Y, N, Q, D, K, R 또는 H 으로부터 선택될 수 있다. 몇몇 구현예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 위치에서 아미노산은 S, A, Q, G, K, 또는 R 로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서 SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 위치에서 아미노산은 A, G, K, 또는 R 으로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서 SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 위치에서 아미노산은 K 이다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소는 써무스 종으로부터 유래하고, SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 아미노산은, 극성의 하전되지 않은 측-사슬 (예를 들어, N, Q, H, S, T, 또는 Y), 비극성의 하전되지 않은 측-사슬 (예를 들어, G, A, L, M, W, P, F, C, V, 또는 I), 또는 극성의 양성으로 하전된 측-사슬 (예를 들어, R 또는 K) (중성 pH 에서) 을 갖는 아미노산이다. 몇몇 구현예에서, 비극성의 하전되지 않은 측-사슬을 갖는 SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 아미노산은 A 또는 G 이다. 몇몇 구현예에서, 극성의 양성으로 하전된 측-사슬을 갖는 SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 아미노산은 R 또는 K 이다. 몇몇 구현예에서, 극성의 양성으로 하전된 측-사슬을 갖는 SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 아미노산은 K 이다.
또한, 본 발명에 따르면, SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 아미노산 근처에 위치하는 다른 아미노산은 상응하는 변형되지 않은 대조군 중합효소에 비해 3'-미스매치 구별이 증가되는 효소를 제조하기 위해 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO:1 의 위치 488 및/또는 497 에 상응하는 아미노산에서 돌연변이는 상응하는 변형되지 않은 대조군 중합효소이 비해 3'-미스매치 구별이 증가되는 효소를 제조한다.
몇몇 구현예에서, 3'-미스매치 구별이 개선된 DNA 중합효소는, 중합효소 도메인에서 하기를 포함하는 모티프를 포함한다:
A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L,
[이때:
X6 은 S, G, A, D, F, K, C, T, 또는 Y 이고;
X10 은 E 이외의 임의의 아미노산이고;
X13 은 F, A, G, S, T, Y, D 또는 K (SEQ ID NO:8) 임].
몇몇 구현예에서, X10 은 L, M, W, P, T, F, Y, C, N, D, V, I, R, K, Q, H, S, A, 또는 G 로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, X10 은 R, K, A, 또는 G (SEQ ID NO:49) 로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, 3'-미스매치 구별이 개선된 DNA 중합효소는, 중합효소 도메인에서 하기를 포함하는 모티프를 포함한다:
A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-X10-R-V-L-F-D-E-L,
[이때:
X10 은 E 이외의 임의의 아미노산 (SEQ ID NO:9) 임].
몇몇 구현예에서, X10 은 L, M, W, P, T, F, Y, C, N, D, V, I, R, K, Q, H, S, A, 또는 G 으로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, X10 은 R, K, A, 또는 G (SEQ ID NO:50) 으로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, 3'-미스매치 구별이 개선된 DNA 중합효소는, 중합효소 도메인에서 하기를 포함하는 모티프를 포함한다:
A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-X10-R-V-L-F-D-E-L,
[이때:
X10 은 A, G, K 또는 R (SEQ ID NO:10) 임].
몇몇 구현예에서, 상기 DNA 중합효소X10 은 L, M, W, P, T, F, Y, C, N, D, V, I, R, K, Q, H, S, A, 또는 G 로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, 상기 DNA 중합효소는 A, G, K 또는 R (SEQ ID NO:50) 로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, 상기 DNA 중합효소는 A 또는 G 로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, 3'-미스매치 구별이 개선된 DNA 중합효소는, 중합효소 도메인에서 하기를 포함하는 모티프를 포함한다:
A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-X10-R-V-L-F-D-E-L,
[이때:
X10 은 K (SEQ ID NO:11) 임].
몇몇 구현예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 580 에 상응하는 DNA 중합효소의 아미노산은, D 또는 E 이외의 임의의 아미노산이다. 몇몇 구현예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 580 에 상응하는 DNA 중합효소의 아미노산은 D 이외의 임의의 아미노산이다. 몇몇 구현예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 580 에 상응하는 DNA 중합효소의 아미노산은 L, G, T, Q, A, S, N, R 및 K 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 580 에 상응하는 DNA 중합효소의 아미노산은 G 이다.
몇몇 구현예에서, 본 발명에 따른 DNA 중합효소는 하기를 포함하는 모티프를 추가로 포함한다:
T-G-R-L-S-S-X7-X8-P-N-L-Q-N;
[이때:
X7 은 Ser (S) 또는 Thr (T) 이고;
X8 은 D 또는 E 이외의 임의의 아미노산 (SEQ ID NO:27) 임].
몇몇 구현예에서, 위치 X8 에 상응하는 아미노산은 L, G, T, Q, A, S, N, R, 및 K (SEQ ID NO:51) 으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, DNA 중합효소는 SEQ ID NO:1 의 488 및/또는 497 으로부터 선택되는 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산에서 돌연변이를 추가로 포함한다. 몇몇 구현예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 488 에 상응하는 DNA 중합효소의 아미노산은 S 이외의 임의의 아미노산이다. 몇몇 구현예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 488 에 상응하는 DNA 중합효소의 아미노산은 G, A, V, L, I, M, F, W, P, E, T, C, N, Q, D, Y, K, R 또는 H 으로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 488 에 상응하는 DNA 중합효소의 아미노산은 G, A, D, F, K, C, T, 또는 Y 이다. 몇몇 구현예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 497 에 상응하는 DNA 중합효소의 아미노산은 F 또는 Y 이외의 임의의 아미노산이다. 몇몇 구현예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 497 에 상응하는 DNA 중합효소의 아미노산은 R, V, L, I, M, W, P, T, C, N, D, E, S, A, G, K, E 또는 H 으로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, 써무스 종으로부터 유래하는 DNA 중합효소, 및 SEQ ID NO:1 의 위치 497 에 상응하는 DNA 중합효소의 아미노산은, F 이외의 임의의 아미노산이다. 따라서, 몇몇 구현예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 497 에 상응하는 DNA 중합효소의 아미노산은 A, G, S, T, Y, D, 또는 K 이다.
다양한 DNA 중합효소는 본 발명에 따라 돌연변이될 수 있다. 특히 적합한 것은 열안정성의 중합효소이며 하기를 포함한다: 다양한 종의 호열성 박테리아로부터의 야생형 또는 자연 발생 열안정성의 중합효소, 및 아미노산 치환, 삽입, 또는 결손, 또는 다른 변형에 의한 그러한 야생형 또는 자연 발생 효소료부터 유래되는 합성 열안정성의 중합효소. 예시적인 변형되지 않은 형태의 중합효소는 하기를 포함한다: 예를 들어, CS5 (SEQ ID NO:29), CS6 (SEQ ID NO:30) 또는 Z05 DNA 중합효소 (SEQ ID NO:1), 또는 이에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 서열 일치성을 갖는 기능적 DNA 중합효소. 기타 변형되지 않은 중합효소는 예를 들어 하기를 포함한다: 임의의 하기 종의 호열성 박테리아로부터의 DNA 중합효소 (또는 그러한 중합효소에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 서열 일치성을 갖는 기능적 DNA 중합효소): 써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima) (SEQ ID NO:38); 써무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus) (SEQ ID NO:2); 써무스 써모필루스 (Thermus thermophilus) (SEQ ID NO:6); 써무스 플라부스 (Thermus flavus) (SEQ ID NO:4); 써모드 필리포르미스 (Thermus filiformis) (SEQ ID NO:3); 써무스 종 (Thermus sp.) Sps17 (SEQ ID NO:5); 써무스 종 (Thermus sp.) Z05 (SEQ ID NO:1); 써모토가 네오폴리타나 (Thermotoga neopolitana) (SEQ ID NO:39); 써모시포 아프리카누스 (Thermosipho africanus) (SEQ ID NO:37); 써무스 칼도필루스 (Thermus caldophilus) (SEQ ID NO:7), 데이노코쿠스 라디오두란스 (Deinococcus radiodurans) (SEQ ID NO:36), 바실러스 스테아로써모필루스 (Bacillus stearothermophilus) (SEQ ID NO:40) 또는 바실러스 칼도테낙스 (Bacillus caldotenax) (SEQ ID NO:41). 또한, 적합한 중합효소는 역전사효소 (RT) 활성을 및/또는 통상적이지 않은 뉴클레오티드, 예컨대 리보뉴클레오티드 또는 다른 2'-변형된 뉴클레오티드를 혼입하는 능력을 갖는 것을 포함한다.
효율적인 3'-미스매치 구별 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소가 PCR 을 수행하는데 특히 적합하나, 효율적인 3'-미스매치 구별 활성을 갖는 열안정성이 없는 DNA 중합효소가 본 발명에 따라 돌연변이된다.
몇몇 구현예에서, DNA 중합효소는 써무스 (Thermus) DNA 중합효소이다. 예를 들어, 몇몇 구현예에서, DNA 중합효소는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 중합효소에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 서열 일치성을 갖는다:
(a) 써무스 종 (Thermus sp.) Z05 DNA 중합효소 (Z05) (SEQ ID NO:1);
(b) 써무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus) DNA 중합효소 (Taq) (SEQ ID NO:2);
(c) 써모드 필리포르미스 (Thermus filiformis) DNA 중합효소 (Tfi) (SEQ ID NO:3);
(d) 써무스 플라부스 (Thermus flavus) DNA 중합효소 (Tfl) (SEQ ID NO:4);
(e) 써무스 종 (Thermus sp.) Sps17 DNA 중합효소 (Sps17) (SEQ ID NO:5);
(f) 써무스 써모필루스 (Thermus thermophilus) DNA 중합효소 (Tth) (SEQ ID NO:6); 및
(g) 써무스 칼도필루스 (Thermus caldophilus) DNA 중합효소 (Tca) (SEQ ID NO:7).
몇몇 구현예에서, DNA 중합효소는 써모토가 DNA 중합효소이다. 예를 들어, 몇몇 구현예에서, DNA 중합효소는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 중합효소에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 서열 일치성을 갖는다:
(a) 써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima) DNA 중합효소 (Tma) (SEQ ID NO:38);
(b) 써모토가 네오폴리타나 (Thermotoga neopolitana) DNA 중합효소 (Tne) (SEQ ID NO:39);
특정 구현예에서, DNA 중합효소는 SEQ ID NO:1 에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 서열 일치성을 갖는다. 몇몇 구현예에서, DNA 중합효소는 위치 493 에서 아미노산이 E 또는 S 이외의 임의의 아미노산인 것을 제외하고는 써무스 종 Z05 DNA 중합효소 (Z05) DNA 중합효소 (즉, SEQ ID NO:1) 이다. 몇몇 구현예에서, DNA 중합효소는 Z05 DNA 중합효소 이고, 위치 493 에서 아미노산은 E 이외의 임의의 아미노산이다. 예를 들어, 몇몇 구현예에서, 위치 493 에서 아미노산은 V, L, I, M, F, W, P, T, C, Y, N, Q, D, K, R, S, A, G 또는 H 으로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, DNA 중합효소는 Z05 DNA 중합효소이고, 위치 493 에서 아미노산은 G, A, K, 또는 R 이다. 몇몇 구현예에서, DNA 중합효소는 Z05 DNA 중합효소이고, 위치 493 에서 아미노산은 K 이다. 몇몇 구현예에서, DNA 중합효소는 Z05 DNA 중합효소이고 위치 580 에서의 치환을 추가로 포함하고, 위치 580 에서 아미노산은 D 또는 E 이외의 임의의 아미노산이다. 몇몇 구현예에서, DNA 중합효소는 Z05 DNA 중합효소이고, 위치 580 에서 아미노산은 D 이외의 임의의 아미노산이다. 몇몇 구현예에서, DNA 중합효소는 Z05 DNA 중합효소이고, 및 위치 580 에서의 아미노산은 L, G, T, Q, A, S, N, R 및 K 으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, DNA 중합효소는 Z05 DNA 중합효소이고, 위치 580 에서 아미노산은 G 이다.
돌연변이체 또는 개선된 중합효소는 다른 비-치환성 변형을 포함할 수 있다. 하나의 그러한 변형은 효소를 불활성화시키는 열적으로 가역성인 공유 변형이나, 이는 폴리뉴클레오티드 신장을 위해 전형적으로 사용되는 온도와 같은 상승된 온도에서 인큐베이션시 효소를 활성화시키기 위해 역전된다. 그러한 열적으로 가역성인 가역성 변형을 위한 예시적인 시약은 미국 특허 제 5,773, 258 호 및 제 5,677,152 호에 기술되어 있다.
몇몇 구현예에서, 3'-미스매치 활성은, 돌연변이체 서열에 대해 완벽히 매칭되는 진행방향 프라이머의 존재 하에 SEQ ID NO:35 (야생형 BRAF = SEQ ID NO:34) 의 핵산 서열을 갖는 돌연변이체 BRAF V600R 표적 폴리뉴클레오티드를 사용하여 측정되고, 야생형 표적의 복사본 수보다 동일한 수 또는 더 적은 수 (예를 들어, 10,000 또는 더 적은 복사본) 의 돌연변이체 BRAF V600R 표적 폴리뉴클레오티드 복사본의 소정의 수 및 야생형 BRAF V600 표적 폴리뉴클레오티드의 복사본의 소정의 수를 갖는 하나 이상의 혼합물에서 야생형 서열에 대해 단일 3' A:C 미스매치를 갖는다. 둘 이상의 반응 혼합물은 적정된 수의 돌연변이체 BRAF V600R 표적 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 1:5 적정, 1:10 적정, 예를 들어, 수 개의 반응 혼합물에서 10,000 복사본, 1000 복사본, 100 복사본, 10 복사본, 1 복사본, 0 복사본) 를 가질 수 있다. 본 발명의 중합효소의 3'-미스매치 구별능은 본원에 기술된 바와 같이 미리 선택된 시간 단위에서 참조 중합효소 (예를 들어, 자연 발생 또는 변형되지 않은 중합효소) 의 3'-미스매치 구별능과 비교될 수 있다. 3'-미스매치 구별능이 증가된 중합효소는, 돌연변이체 대립형질에 대해 완벽히 매칭되는 프라이머와 비교할 때 야생형 서열이 증폭되지 않을 것이고, 자연 발생 또는 변형되지 않은 중합효소에 비해, 돌연변이체 대립형질-특이적 프라이머 (즉, 더 높은 Cp 값을 나타냄) 를 사용하는 야생형 서열을 증폭하기 위해 PCR 사이클의 더 큰 수를 요구할 것이다.
다양한 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 개선된 DNA 중합효소 또는 돌연변이를 인코딩하는 재조합 핵산을 제공하고, 벡터는 재조합 핵산을 포함하고/하거나 숙주 세포는 벡터로 형질전환된다. 특정 구현예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 그러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포는, 재조합 핵산의 발현에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양함으로써 개선된 중합효소 또는 돌연변이체를 제조하기 위한 본 발명의 방법에 유용하다. 본 발명의 중합효소는 반응 혼합물 및/또는 키트에 함유될 수 있다. 재조합 핵산, 숙주 세포, 벡터, 발현 벡터, 반응 혼합물 및 키트의 구현예는 본원에서 기술된다.
또다른 양태에서, 폴리뉴클레오티드 신장을 수행하기 위한 방법이 제공된다. 방법은, 프라이머의 신장에 적합한 조건 하에서, 3'-미스매치 구별이 증가된 DNA 중합효소를, 프라이머, 폴리뉴클레오티드 주형, 및 뉴클레오시드 트리포스페이트와 접촉시키는 것을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 주형은 예를 들어, RNA 또는 DNA 주형일 수 있다. 뉴클레오시드 트리포스페이트는 통상적이지 않은 뉴클레오티드 예컨대, 예를 들어, 리보뉴클레오티드 및/또는 라벨링된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머 및/또는 주형은 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 몇몇 변형에서, 폴리뉴클레오티드 신장 방법은, 폴리뉴클레오티드의 증폭에 적합한 조건 하에서, 돌연변이체 또는 개선된 DNA 중합효소를 프라이머 쌍, 폴리뉴클레오티드 주형, 및 뉴클레오시드 트리포스페이트와 접촉시키는 것을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 신장 반응은 예를 들어, PCR, 등온선 신장, 또는 서열화 (예를 들어, 454 서열화 반응) 일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 프라이머 신장 방법은 중합효소 사슬 반응 (PCR) 을 수행하기 위한 방법이다.
또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 신장 방법에서 유용한 키트를 제공한다. 일반적으로, 키트는 본원에 기술된 바와 같이 개선된 DNA 중합효소 또는 돌연변이체를 제공하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 특정 구현예에서, 키트는 또한 하나 이상의 추가의 시약을 제공하는 하나 이상의 추가의 용기를 포함한다. 예를 들어, 특정 변형에서, 하나 이상의 추가의 용기는 폴리뉴클레오티드 신장 조건 하에서, 뉴클레오시드 트리포스페이트를 제공하고; 폴리뉴클레오티드 신장에 적합한 완충제; 및/또는 소정의 폴리뉴클레오티드 주형에 대해 하이브리드 가능한 프라이머를 제공한다.
또한 제공되는 것은, 본 발명의 중합효소를 포함하는 반응 혼합물이다. 반응 혼합물은 또한 주형 핵산 (DNA 및/또는 RNA), 하나 이상의 프라이머 또는 탐침 폴리뉴클레오티드, 뉴클레오시드 트리포스페이트 (예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 라벨링된 뉴클레오티드, 통상적이지 않은 뉴클레오티드 포함), 완충제, 염, 라벨 (예를 들어, 형광물질) 을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 구현예는 본원에 기술된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술되는 본질적인 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있으나, 이는 오직 예시적인 방법 및 재료로서 기술되는 것이다. 본 발명의 목ㅈ거을 위해, 하기 용어는 하기 정의된다.
단수형은 달리 명백히 지시되지 않는 한 복수형을 포함한다.
"아미노산" 은 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질에 혼입도리 수 있는 임의의 단량체 단위를 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산" 은 하기 20 개의 천연 또는 유전적으로 인코딩된 알파-아미노산을 포함한다: 알라닌 (Ala 또는 A), 아르기닌 (Arg 또는 R), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 아스파르트산 (Asp 또는 D), 시스테인 (Cys 또는 C), 글루타민 (Gln 또는 Q), 글루탐산 (Glu 또는 E), 글리신 (Gly 또는 G), 히스티딘 (His 또는 H), 이소류신 (Ile 또는 I), 류신 (Leu 또는 L), 라이신 (Lys 또는 K), 메티오닌 (Met 또는 M), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 프롤린 (Pro 또는 P), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 트립토판 (Trp 또는 W), 티로신 (Tyr 또는 Y), 및 발린 (Val 또는 V). "X" 잔기가 정의되지 않은 경우, 이들은 임의의 아미노산으로서 정의되어야만 한다. 이들 20 개의 천연 아미노산의 구조는 예를 들어 문헌 [Stryer et al., Biochemistry, 5th ed., Freeman and Company (2002)] 에 나타나 있다. 셀레노시스테인 및 피로라이신과 같은 추가의 아미노산은 문헌 [Stadtman (1996), Selenosystein, Annu Rev Biochem. 65:83-100 및 Ibba et al. (2002) Genetic code: introducing pyrrolysin, Curr Biol. 12(13):R464-R466] 에 대해 유전적으로 코딩될 수 있다. 또한, 용어 "아미노산" 은 비천연 아미노산, 변형된 아미노산 (예를 들어, 변형된 측 사슬 및/또는 골격 가짐), 및 아미노산 유사체를 포함한다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다:
[Zhang et al. (2004) "Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887], [Anderson et al. (2004) "An expanded genetic code with a functional quadruplet codon" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20):7566-7571], [Ikeda et al. (2003) "Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo," Protein Eng. Pes. Sel. 16(9):699-706], [Chin et al. (2003) "An Expanded Eukaryotic Genetic Code," Science 301(5635):964-967], [James et al. (2001) "Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues," Protein Eng. Pes. Sel. 14(12):983-991], [Kohrer et al. (2001) "Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25): 14310-14315], [Bacher et al. (2001) "Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue," J. Bacteriol. 183(18):5414-5425], [Hamano-Takaku et al. (2000) "A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine," J. Biol. Chem. 275(51):40324-40328], 및 [Budisa et al. (2001) "Proteins with {beta}-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids," Protein Sci. 10(7): 1281-1292].
추가의 설명을 위해, 아미노산은 전형적으로 유기 산이며, 이는 치환되거나 치환되지 않은 아미노 기, 치환되거나 치환되지 않은 카르복시 기, 및 하나 이상의 측 사슬 또는 기, 또는 이들 기의 임의의 유사체를 포함한다. 예시적인 측 사슬은, 예를 들어, 티올, 셀레노, 술포닐, 알킬, 아릴, 아실, 케토, 아지도, 히드록실, 히드라진, 시아노, 할로, 히드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포시핀, 헤테로시클릭, 에논, 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 히드록실아민, 또는 이들 기의 임의의 조합을 포함한다.
다른 예시적인 아미노산은 하기를 포함하나 이에 한정되지 않는다: 광활성화 가능한 가교제를 포함하는 아미노산, 금속 결합 아미노산, 스핀-라벨링된 아미노산, 형광 아미노산, 금속-함유 아미노산, 신규 관능기를 갖는 아미노산, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 아미노산, 광케이지화된 및/또는 광이성질체화 가능한 아미노산, 방사성 아미노산, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화 아미노산, 다른 카르보히드레이트 변형된 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중원자 치환된 아미노산, 화학분해성 및/또는 광분해성 아미노산, 탄소-링크된 당-함유 아미노산, 산화환원-활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산, 및 하나 이상의 독성 부분을 포함하는 아미노산.
용어 "앱타머" 는 DNA 중합효소를 인식하고 이에 결합하는 단일-가닥 DNA 를 지칭하며, 미국 특허 제 5,693,502 에 기술된 바와 같이 중합효소 활성을 효율적으로 저해한다.
본 발명의 DNA 중합효소에서, 용어 "돌연변이체" 는 상응하는 자연-발생 또는 변형되지 않은 DNA 중합효소에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드, 전형적으로는 재조합을 의미한다.
돌연변이체 중합효소에서, 본원에 사용되는 용어 "변형되지 않은 형태" 는 본 발명의 DNA 중합효소 돌연변이체를 규정하기 위해 사용된다:
용어 "변형되지 않은 형태" 는 돌연변이체 중합효소를 특징화하는 것으로 서술되는 아미노산 서열을 갖는 기능적 DNA 중합효소를 지칭한다. 따라서, 하기의 돌연변이체 DNA 중합효소를 언급할 수 있다: (a) 이의 변형되지 않은 형태 및 (b) 하나 이상의 명시되는 아미노산 치환은, 명시되는 아미노산 치환(들)을 예외로 하는, 명시되는 모티르에서 변형되지 않은 형태와 동일한 아미노산 서열을 갖는 돌연변이체 중합효소를 의미함.
"변형되지 않은 중합효소" (및 또한, 3'-미스매치 구별이 증가된 변형된 형태) 는 원하는 기능성을 제공하기 위해 추가의 돌연변이를 함유할 수 있고, 예를 들어 하기가 개선되어 혼입될 수 있다: 디데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 유사체, 염료-라벨링된 뉴클레오티드, 5'-뉴클레아제 활성을 조절하는 것, 3'-뉴클레아제 (또는 교정) 활성 조절하는 것 등. 따라서, 본원에 기술된 바와 같이 본 발명을 수행하는데 있어서, DNA 중합효소의 변형되지 않은 형태는 미리결정된다. DNA 중합효소의 변형되지 않은 형태는 예를 들어 야생형 및/또는 자연 발생 DNA 중합효소, 또는 의도적으로 이미 변형되어 있는 DNA 중합효소일 수 있다. 중합효소의 변형되지 않은 형태는 바람직하게는 열안정성의 DNA 중합효소, 예컨대 다양한 호열성 박테리아로부터의 DNA 중합효소이고, 이의 기능적 변이체는 야생형 또는 자연 발생 열안정성의 중합효소에 대해 상당한 서열 일치성을 갖는다. 그러한 변이체는, 예를 들어, 미국 특허 제 6,228,628 호 및 미국 출원 공보 제 2004/0005599 호에 기술되는 키메라 DNA 중합효소와 같은 키메라 DNA 중합효소를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 중합효소의 변형되지 않은 형태는 역전사효소 (RT) 활성을 갖는다.
용어 "열안정성 중합효소" (열에 안정한 효소를 지칭함) 는 열 저항성이 있으며, 후속 폴리뉴클레오티드 신장 반응을 달성하기에 충분한 활성을 보유하고 이중-가닥 핵산의 변성을 달성하기 위해 요구되는 시간 동안 승온으로 처리될 때 비가역적으로 변성 (불활성화) 되지 않는다. 핵산 변성을 위해 요구되는 가열 조건은 당업계에 익히 공지되어 있고 예를 들어 예를 들어, 미국 특허 제 4,683,202 호, 제 4,683,195 호, 및 제 4,965,188 호에 기술되어 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 중합효소 사슬 반응 ("PCR") 과 같은 반응을 사이클링하는 온도에 사용되기에 적합하다. 본원에서 비가역성 변성은 영구하고 효소 활성의 완전한 손실을 지칭한다. 열안정성의 중합효소에 대해, 효소 활성은 주형 핵산 가닥에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드 신장 생성물을 형성하기 위한 적절한 방식으로 뉴클레오티드의 조합을 촉매작용하는 것을 지칭한다. 호열성 박테리아로부터의 열안정성의 DNA 중합효소는 예를 들어 하기를 포함한다: 써모토가 마리티마, 써무스 아쿠아티쿠스, 써무스 써모필루스, 써무스 플라부스, 써모드 필리포르미스, 써무스 종 Sps17, 써무스 종 Z05, 써무스 칼도필루스, 바실러스 칼도테낙스, 써모토가 네오폴리타나, 및 써모시포 아프리카누스로부터의 DNA 중합효소.
용어 "열활성" 은 RT-PCR 및/또는 PCR 반응에서 역전사 또는 어닐링/신장 단계에 통상적으로 사용되는 온도 (즉, 45-80 ℃) 에서 촉매 특성을 유지하는 효소를 지칭한다. 열안정성 효소는 핵산 변성에 요구되는 상승된 온도로 처리될 때 비가역적으로 불활성화되거나 변성되지 않는 것이다. 열활성 효소는 열안정성일 수 있거나 열안정성일 수 없다. 열활성 DNA 중합효소는 하기를 포함하나 이에 한정되지 않는 호열성 종 또는 중온성 종으로부터 의존적인 DNA 또는 RNA 일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "키메라" 단백질은 2 개 이상의 별개의 단백질로부터 아미노산 서열의 하위서열의 융합 생성물을 나타내는 단백질을 지칭한다. 키메라 단백질은 전형적으로는, 키메라 아미노산 서열을 인코딩하는 "키메라" 유전자로부터 다소 발현되는 아미노산 서열의 직접적인 조작에 의해 생성되지 않는다. 특정 구현예에서, 예를 들어, 본 발명의 DNA 중합효소 돌연변이체의 변형되지 않은 형태는, 써무스 종 DNA 중합효소로부터 유래하는 아미노-말단 (N-말단) 영역 및 Tma DNA 중합효소로부터 유래하는 카르복시-말단 (C-말단) 영역으로 이루어지는 키메라 단백질이다. N-말단 영역은 N-말단 (아미노산 위치 1) 에서 내부 아미노산까지 확장되는 영역을 지칭한다. 유사하게, C-말단 영역은 내부 아미노산에서 C-말단까지 확장되는 영역을 지칭한다.
DNA 중합효소에서, 다른 서열 (예를 들어, 영역, 단편, 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치, 등) 에 "상응함" 은, 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치 넘버에 따른 통상적인 넘버링 및 이어서 서열 일치성의 백분율을 최대화하는 방식으로 서열을 정렬하는 것을 기초로 한다. 주어진 "상응하는 영역" 내의 모든 위치가 동일할 필요가 없기 때문에, 상응하는 영역 내의 비-매칭 위치는 "상응하는 위치" 로서 간주될 수 있다. 따라서, 본원에 사용되는 바와 같이, 명시되는 DNA 중합효소의 "아미노산 위치 [X] 에 상응하는 아미노산 위치" 는, 정렬을 기초로 하여, 다른 DNA 중합효소 및 구조 유사체 및 패밀리에서 등가의 위치를 지칭한다. 본 발명의 몇몇 구현예에서, 아미노산 위치의 "상응함" 은 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 36, 37, 38, 39, 40, 또는 41 의 하나 이상의 모티프를 포함하는 중합효소의 영역에 대해 측정된다. 중합효소 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NOS:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 36, 37, 38, 39, 40, 또는 41 과 상이한 경우 (예를 들어, 아미노산에서의 변화 또는 아미노산의 추가 또는 결손), 본원에서 논의되는 개선된 활성과 연계된 특정 돌연변이는 SEQ ID NOS:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 36, 37, 38, 39, 40, 또는 41 에서 그 자체로서 동일한 위치 넘버가 아닐 것이다. 이는 예를 들어 표 1 에서 기술된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "재조합" 은 재조합 방법에 의해 의도적으로 변형되어 있는 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본원에서 용어 "재조합 핵산" 이란, 자연에서 정상적으로 발견되는 형태가 아닌, 일반적으로, 엔도뉴클레아제에 의한 핵산의 조작에 의해, 시험관내에서 최초 형성되는 핵산을 의미한다. 따라서, 단리된 돌연변이체 DNA 중합효소 핵산 (선형 형태) 또는 정상적으로 합류되지 않은 DNA 분자를 결찰함으로써 시험관내 형성되는 발현벡터는, 본 발명의 목적을 위해 둘 모두 고려된다. 일단 재조합 핵산이 제조되고 숙주 세포로 재도입되면, 비-재조합적으로 복제될 것이고, 즉 시험관내 조작 보다는 숙주 세포의 생체 내 세포성 기관을 사용함으로써 비-재조합적으로 복제될 것이나; 일단 재조합적으로 제조된 그러한 핵산은, 후속 복제가 비-재조합적이더라도, 본 발명의 목적을 위한 재조합이 여전히 고려된다. "재조합 단백질" 은 재조합 기술, 즉 상기 설명되는 바와 같은 재조합 핵산의 발현을 통해, 제조되는 단백질이다.
핵산은, 다른 핵산 서열과 기능적 상관관계에 놓일 때 "작동가능하게 연결" 된다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 서열에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하기 위해 위치하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
용어 "숙주 세포" 는 세포 배양액에서 배양할 때 고등 식물 또는 동물로부터 둘 모두의 단일-세포성 원핵생물 및 진핵생물 유기체 (예를 들어, 박테리아, 효모, 및 방선균) 및 단일 세포를 지칭한다.
용어 "벡터" 는, 외래 DNA 의 조각으로 삽입될 수 있는 전형적으로는 이중 가닥의 DNA 조각을 지칭한다. 또는, 벡터는 예를 들어 플라스미드 기원일 수 있다. 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 자가 복제를 촉진하는 "레플리콘" 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 외래 DNA 는 비상동 DNA 로서 정의되고, 이는 숙주 세포에서 자연적으로 발견되지 않는 DNA 이고, 이는 예를 들어, 선택가능한 또는 선별가능한 마커를 인코딩하는 벡터 분자, 또는 트랜스진을 인코딩하는 벡터 분자를 복제한다. 벡터는 외래 또는 비상동 DNA 를 적합한 숙주 세포로 이동시키는데 사용된다. 일단 숙주 세포에서, 벡터는 숙주 염색체 DNA 와 동시에 또는 독립적으로 복제할 수 있으며, 벡터의 수 개의 복사본 및 이의 삽입된 DNA 가 생성될 수 있다. 또한, 벡터는 삽입되는 DNA 의 mRNA 분자로의 전사를 허용하는 필요 요소를 함유할 수 있거나, 삽입되는 DNA 의 RNA 의 다중 복사본으로 복제를 야기한다. 몇몇 발현 벡터는 발현 mRNA 의 반감기를 증가시키는 삽입된 DNA 에 인접한 서열 요소를 추가로 함유하고/하거나 mRNA 의 단백질 분자로의 번역을 허용한다. 따라서, 삽입된 DNA 에 의해 인코딩되는 mRNA 및 폴리펩티드의 많은 분자는 신속하게 합성될 수 있다.
자연 발생 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 단량체를 지칭하는 것 외에도, 용어 "뉴클레오티드" 는, 문맥에서 달리 지시되지 않는 한, 뉴클레오티느가 사용되는 특정 문맥에서 기능적으로 등가인 유도체 및 유사체를 포함하는 관련 구조적 변이체를 지칭하는 것으로 이해된다 (예를 들어, 상보적 염기에 대해 하이브리드화).
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 는 리보오스 핵산 (RNA) 또는 데옥시리보오스 핵산 (DNA) 중합체, 또는 이의 유사체에 상응할 수 있는 중합체를 지칭한다. 이는, 뉴클레오티드의 중합체, 예컨대 RNA 및 DNA, 및 합성 형태, 이의 변형 형태 (예를 들어, 화학적으로 또는 생물학적으로 변형된), 및 혼합 중합체 (예를 들어, RNA 및 DNA 하위단위 둘 모두 포함) 를 포함한다. 예시적인 변형에는, 메틸화, 유사체와 자연 발생 뉴클레오티드의 하나 이상의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 하전되지 않은 결합 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트, 등), 펜던트 부분 (예를 들어, 폴리펩티드), 인터칼레이터 (예를 들어, 아크리딘, 프소라렌, 등), 킬레이트화제, 알킬화제, 및 변형된 결합 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등) 을 포함한다. 또한, 수소 결합 및 다른 화학적 상호작용을 통해 지정된 서열에 결합하는 이의 능력에서 폴리뉴클레오티드를 모방하는 합성 분자가 포함된다. 전형적으로는, 뉴클레오티드 단량체는, 핵산의 합성 형태가 다른 연결을 포함할 수 있음에도 불구하고 포스포디에스테르 결합을 통해 연결된다 (예를 들어, 문헌 [Nielsen et al. (Science 254:1497-1500, 1991] 에 기술된 바와 같은 펩티드 핵산). 핵산은, 예를 들어, 염색체 또는 염색체 분절, 벡터 (예를 들어, 발현 벡터), 발현 카세트, 네이키드 DNA 또는 RNA 중합체, 중합효소 사슬 반응 (PCR) 의 생성물, 올리고뉴클레오티드, 탐침, 및 프라이머일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 핵산은 예를 들어, 단일-가닥, 이중-가닥, 또는 삼중-가닥일 수 있으나 임의의 특정 길이에 한정되지 않는다. 달리 언급되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 명시되는 임의의 서열 외에도 상보 서열을 포함하거나 이를 인코딩한다.
용어 "올리고뉴클레오티드" 는 2 개 이상의 핵산 단량체 단위를 포함하는 핵산을 지칭한다 (예를 들어, 뉴클레오티드). 올리고뉴클레오티드 전형적으로는 약 6 개 내지 약 175 개의 핵산 단량체 단위, 보다 전형적으로는 약 8 개 내지 약 100 개의 핵산 단량체 단위, 여전히 보다 전형적으로는 약 10 개 내지 약 50 개의 핵산 단량체 단위 (예를 들어, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 또는 그 이상의 핵산 단량체 단위) 를 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 정확한 크기는, 올리고뉴클레오티드의 최종 기능 또는 사용을 포함하는 많은 요소에 의존적일 것이다. 올리고뉴클레오티드는 하기를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 방법에 의해 임의적으로 제조된다: 기존 또는 천연 서열의 단리, DNA 복제 또는 증폭, 역전사, 클로닝 및 적절한 서열의 제한 소화, 또는 하기와 같은 방법에 의한 직접적인 화학적 합성: 문헌 [Narang et al. (Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979)] 의 포스포트리에스테르 방법; 문헌 [Brown et al. (Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979)] 의 포스포디에스테르 방법; 문헌 [Beaucage et al. (Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981)] 의 디에틸포스포르아미디트 방법; 문헌 [Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981)] 의 트리에스테르 방법; 자동 합성 방법; 또는 미국 특허 제 4,458,066 호의 고체 지지체 방법, 또는 당업자에게 공지되어 있는 방법.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "프라이머" 는 폴리뉴클레오티드 신장이 개시되는 조건 하에 놓일 때 주형-방향으로 핵산 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다 (예를 들어, 필요조건인 뉴클레오시드 트리포스페이트 (복사되는 주형에 의해 기술되는 바와 같음) 및 적합한 온도 또는 온도 사이클(들)에서 적절한 완충제에서의 중합효소 (예를 들어, 중합효소 사슬 반응에서 나타낸 바와 같음) 의 존재를 포함하는 조건 하에서). 또한 설명을 위해, 프라이머는 또한 데노보 (de novo) RNA 합성 및 시험관내 전사-관련 공정 (예를 들어, 핵산 서열-기재 증폭 (NASBA), 전사 중재된 증폭 (TMA) 등) 의 개시제로서 포함되는, 다양한 기타 올리고뉴클레오티드-중재 합성 공정에서 사용될 수 있다. 프라이머는 전형적으로는, 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고데옥시리보뉴클레오티드) 이다. 프라이머의 적절한 길이는 전형적으로는 6 내지 40 개의 뉴클레오티드 범위, 보다 전형적으로는 15 내지 35 개의 뉴클레오티드 범위의 의도되는 사용에 의존적이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 충분히 안정적인 하이브리드 착물을 형성하기 위해 보다 저온의 온도를 요구한다. 프라이머는 주형의 정확한 서열을 반영하는데 요구되지 않으나, 프라이머가 신장되기 위한 주형과 하이브리드되기 위해 충분히 상보적이어야만 한다. 특정 구현예에서, 용어 "프라이머 쌍" 은 증폭되는 핵산 서열의 5'-말단에 상보적으로 하이브리드하는 5'-센스 프라이머 (또한 "진행방향"으로 지칭됨) 를 포함하고, 증폭되는 서열의 3' 말단에 하이브리드하는 3-안티센스 프라이머 (또한 "역방향" 으로도 지칭됨) 를 포함하는 프라이머의 세트를 의미한다. 프라이머는, 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 검출될 수 있는 라벨을 혼입함으로써 라벨링될 수 있다. 예를 들어, 유용한 라벨은 하기를 포함한다: 32P, 형광 염료, 전자-덴스 시약, 효소 (ELISA 분석에서 통상적으로 사용됨), 비오틴, 또는 합텐 및 항혈청 또는 모노클로날 항체가 이용될 수 있는 단백질.
용어 "5'-뉴클레아제 탐침" 은 핵산 검출을 표적화하기 위해 5'-뉴클레아제 반응에서 사용되는 하나 이상의 발광 라벨링 부분을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 몇몇 구현예에서, 예를 들어, 5'-뉴클레아제 탐침은 오직 단일 발광 부분 (예를 들어, 형광 염료, 등) 을 포함한다. 특정 구현예에서, 5'-뉴클레아제 탐침은, 탐침이 선택 조건 하에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있도록 자가-상보적 영역을 포함한다. 추가의 설명을 위해, 몇몇 구현예에서, 5'-뉴클레아제 탐침은, 2 개 이상의 라벨링 부분을 포함하고, 2 개 중 하나의 라벨이 올리고뉴클레오티드로부터 분리되거나 분해된 후 방사 강도가 증가하여 방출된다. 특정 구현예에서, 5'-뉴클레아제 탐침은 2 개의 상이한 형광 염료, 예를 들어 5'-말단 리포터 염료 및 3'-말단 소광제 염료 또는 부분과 라벨링된다. 몇몇 구현예에서, 5'-뉴클레아제 탐침은, 말단 위에 더하여, 또는 말단 위치 이외의 하나 이상의 위치에서 라벨링된다. 탐침이 원래대로인 경우, 전형적으로, 리포터 염료로부터 형광 방출이 부분 이상 소광되도록 2 개의 형광물질 사이에서 에너지 이동이 발생한다. 중합효소 사슬 반응의 신장 단계 동안, 예를 들어 주형 핵산에 결합되는 5'-뉴클레아제 탐침이 리포터 염료의 형광 발광이 더 이상 소광되지 않도록 하는 활성을 갖는 예를 들어, Taq 중합효소 또는 다른 중합효소의 5' 내지 3-뉴클레아제 활성에 의해 분해된다. 예시적인 5'-뉴클레아제 탐침이 또한 예를 들어 미국 특허 제 5,210,015 호; 미국 특허 제 5,994,056 호; 및 미국 특허 제 6,171,785 호에서 기술되어 있다. 몇몇 구현예에서, 5'-뉴클레아제 탐침이 둘 이상의 상이한 리포터 염료 및 3'-말단 소광제 염료 또는 부분과 라벨링될 수 있다.
용어 "FRET" 또는 "형광 공명 에너지 이동" 또는 "포에스터 공명 에너지 이동" 은 둘 이상의 발색단, 공여체 발색단 및 수용체 발색단 (소광제로서 지칭됨) 사이의 에너지의 이동을 지칭한다. 공여체는 전형적으로는, 공여체가 적합한 파장의 빛이 방사됨으로써 여기될 때 에너지를 수용체에 이동시킨다. 수용체는 전형적으로는 상이한 파장으로 방사되는 빛의 형태로 이동된 에너지를 재방사한다. 수용체가 "암" 소광제인 경우, 이는 빛 이외의 형태로 이동된 에너지를 분산시킨다. 특정 형광물질이 공여체 또는 수용체로서 작용하는지 여부는 FRET 쌍의 다른 멤버의 특성에 의존적이다. 통상적으로 사용되는 공여체-수용체 쌍은 FAM-TAMRA 쌍을 포함한다. 통상적으로 사용되는 소광제는 DABCYL 및 TAMRA 이다. 통상적으로 사용되는 암 소광제는 하기를 포함한다: BlackHole Quenchers™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa Black™ (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa), 및 BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).
핵산 염기, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 또는 뉴클레오티드를 지칭할 때 용어 "통상적인" 또는 "천연" 은, 기술되는 폴리뉴클레오티드에서 천연 발생하는 것을 지칭한다 (즉, DNA 에 대해 이들은 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 임). 또한, dITP, 및 7-데아자-dGTP 는 dGTP 대신 빈번히 이용되며 서열화와 같은 시험관내 DNA 합성 반응에서 dATP 대신 이용될 수 있다.
핵산 염기, 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오티드를 지칭할 때 용어 "통상적이지 않은" 또는 "변형된" 은, 특정 폴리뉴클레오티드에서 천연적으로 발생하는 통상적인 염기, 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오티드의 변형, 유도체 또는 유사체를 포함한다. 특정한 통상적이지 않은 뉴클레오티드는 통상적인 dNTP 와 비교하여 리보오스 당의 2' 위치에서 변형된다. 따라서, RNA 에 대해 자연 발생 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드 (즉, ATP, GTP, CTP, UTP, 집합적 rNTP) 이더라도, 뉴클레오티드가 당의 2' 위치에서 히드록실 기를 갖기 때문에, 이는 비교하여 dNTP 가 부재하고, 본원에 사용되는 바와 같이, 리보뉴클레오티드는 DNA 중합효소에 대한 기질으로서 통상적이지 않은 뉴클레오티드이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 통상적이지 않은 뉴클레오티드는 핵산 서열화에 대한 종결자로서 사용되는 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적인 종결자 화합물은 2',3'-디데옥시 구조를 갖는 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이는 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트로서 지칭된다. 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 ddATP, ddTTP, ddCTP 및 ddGTP 는 ddNTP 로서 집합적으로 지칭된다. 종결자 화합물의 추가의 예는 리보뉴클레오티드 (참조, 예를 들어, 미국 출원 공보 제 2005/0037991 호 및 제 2005/0037398 호) 의 2'-PO4 유사체를 포함한다. 다른 통상적이지 않은 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 dNTP ([[α]-S]dNTP), 5'-[α]-보라노-dNTP, [α]-메틸-포스포네이트 dNTP, 및 리보뉴클레오시드 트리포스페이트 (rNTP) 를 포함한다. 통상적이지 않은 염기는 방사성 동위원소, 예컨대 32P, 33P, 또는 35S; 형광 라벨; 화학발광의 라벨; 생물발광의 라벨; 합텐 라벨 예컨대 비오틴; 또는 효소 라벨 예컨대 스트렙타비딘 또는 아비딘으로 라벨링될 수 있다. 형광 라벨은, 음성으로 하전된 염료, 예컨대 플루오세인 패밀리의 염료, 또는 중성으로 하전된 염료, 예컨대 로다민 패밀리의 염료, 또는 양성으로 하전된 염료, 예컨대 시아닌 패밀리의 염료를 포함할 수 있다. 플루오세인 패밀리의 염료는, 예를 들어, FAM, HEX, TET, JOE, NAN 및 ZOE 를 포함한다. 로다민 패밀리의 염료는 Texas Red, ROX, R110, R6G, 및 TAMRA 를 포함한다. FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G, Texas Red 및 TAMRA 로 라벨링된 다양한 염료 또는 뉴클레오티드는 Perkin-Elmer (Boston, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA), 또는 Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR) 에 의해 시판된다. 시아닌 패밀리의 염료는 Cy2, Cy3, Cy5, 및 Cy7 을 포함하고, GE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England) 에 의해 시판된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "서열 일치성의 백분율" 은 비교 윈도우에 걸쳐 최적으로 정렬된 서열 2 개를 비교함으로써 측정되며, 이때 비교 윈도우에서 서열의 부분은, 2 개의 서열의 최적 정렬에 대해 참조 서열 (이는 첨가 또는 결손을 포함하지 않음) 에 비해 첨가 또는 결손 (즉, 갭) 을 포함할 수 있다. 백분율은, 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 둘 모두의 서열에서 발생하는 위치의 수를 측정하고 매칭된 위치의 수를 산출하고, 비교 윈도우에서 총 위치의 수에 의해 매칭된 위치의 수를 나누고, 결과치에 100 을 곱하여 서열 일치성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열에서, 용어 "동일한" 또는 "일치성" 은, 동일한 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 서열은, 하기 서열 비교 알고리즘 또는 수동 정렬 및 가시적 검사에 의해 측정되는 바와 같은 지정 영역 또는 비교 윈도우와 비교하고 비교 윈도우에 대해 최대 상응하게 정렬될 때, 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 명시되는 % 로 동일한 경우 서로 "상당히 동일한" 것이다 (예를 들어, 명시되는 영역에 걸쳐 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 일치성). 또한, 이들 정의는 시험 서열의 상보성을 참조한다. 임의적으로는, 길이가 약 50 개 이상의 뉴클레오티드인 영역, 또는 그 이상, 전형적으로는, 길이가 100 내지 500 개 또는 1000 개 이상의 뉴클레오티드인 영역에 대해 일치성이 존재한다.
둘 이상의 폴리펩티드 서열에서, 용어 "유사성" 또는 "%유사성" 은, 하기 서열 비교 알고리즘 또는 수동 정렬 및 가시적 검사에 의한 것 중 하나를 사용하여 측정되는 바와 같이 지정된 영역 또는 비교 윈도우와 비교하고 이에 대한 최대 상응으로 정렬될 때, 보존적 아미노산 치환에 의해 정의되는 바와 동일하거나 유사한 아미노산 잔기의 명시되는 % (예를 들어, 명시되는 영역에 대해 60% 유사성, 임의적으로는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 유사함) 를 갖는 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 임의적으로는, 길이가 약 50 개 이상의 아미노산인 영역, 또는 그 이상, 전형적으로는 길이가 약 100 내지 500 또는 1000 개 이상의 아미노산인 영역에 대해 이러한 유사성이 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로는 하나의 서열이 참조 서열로서 작용하고, 이에 대해 시험 서열이 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 참조 서열은 컴퓨터, 하위서열 좌표를 지정하고, 필요한 경우, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. 디폴트 프로그램 매개변수가 통상적으로 사용되거나, 대안적인 매개변수가 지정될 수 있다. 이후, 프로그램 매개변수를 기초로 하여, 서열 비교 알고리즘으로 참조 서열에 비해 시험 서열에 대한 % 서열 일치성 또는 유사성을 계산한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "비교 윈도우" 는, 20 내지 600 개, 통상적으로는 약 50 내지 약 200 개, 보다 통상적으로는 약 100 개 내지 약 150 개로 이루어지는 군으로부터 선택되는 근접한 위치의 수 중 임의의 하나의 분절을 참조하는 것을 포함하며, 이때 서열은 둘 이상의 서열이 최적으로 정렬된 후 근접한 위치의 동일한 수의 참조 서열에 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 하기에 의해 수행될 수 있다: Smith 및 Waterman 의 국소적 상동관계 알고리즘 (Adv. Appl. Math. 2:482, 1970), Needleman 및 Wunsch 의 상동관계 정렬 알고리즘 (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), Pearson 및 Lipman 의 유사성 방법을 위한 연구 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988), 이들 알고리즘의 컴퓨터화 (예를 들어, GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA [Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer 기, 575 Science Dr., Madison, Wis.], 또는 수동 정렬 및 가시적 검사 (참조, 예를 들어, [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)]).
% 서열 일치성 및 서열 유사성을 측정하는데 적합한 알고리즘은 각각 문헌 [Altschul et al. (Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977)] 및 문헌 [Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)] 에 기술되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 하기 위한 소프트웨어는 "National Center for Biotechnology Information" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 을 통해 공개적으로 입수가능하다. 이러한 알고리즘은, 데이타베이스 서열에서 동일한 길이의 단어로 정렬될 때 몇몇 양성 값의 역치 스코어 T 에 매칭되거나 이를 충족시키는, 쿼리 서열에서 길이 W 를 확인함으로써 고스코어의 서열 쌍 (HSP) 을 우선 확인하는 것을 포함한다. T 는 네이버후드 워드 스코어 역치로서 지칭된다 (Altschul et al., supra). 이들 초기 네이버후드 워드 히트는, 이를 함유하는 보다 긴 HSP 를 찾기 위한 서치를 개시하기 위한 시드로서 작용한다. 워드 히트는 누적 정렬 스코어이 증가될 수 있는 만큼 각 서열에 따른 둘 모두의 방향으로 확장된다. 뉴클레오티드 서열에 대해, 매개변수 M (매칭 잔기의 쌍에 대해 보수 스코어; 항상 >0) 및 N (미스매칭 잔기에 대한 패널티 스코어; 항상 <0) 을 사용함으로써 누적 스코어을 계산한다. 아미노산 서열을 위해, 스코어 매트릭스는 누적 스코어를 계산하는데 사용된다. 각 방향으로 워드 히트의 신장을 멈추고 이때: 이의 최대 달성되는 값으로부터 양 X 를 떨어뜨리고; 하나 이상의 음성-스코어 잔기 정렬의 축적으로 인해누적 스코어는 0 이하로 되거나; 서열 중 하나의 말단이 도달된다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T, 및 X 는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열에 대해) 은 11 의 워드길이 (W), 기대치 (E) 또는 10, M=5, N=-4 및 둘 모두의 비교를 디폴트로서 사용한다. 아미노산 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 3 의 워드길이, 및 10 의 기대치 (E), BLOSUM62 스코어 매트릭스 (문헌 [Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989] 참조) 50 의 정렬 (B), 10 의 기대치 (E), M=5, N=-4, 및 둘 모두의 가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다.
또한, BLAST 알고리즘으로, 2 개의 서열 사이의 유사성의 통계학적 분석을 수행한다 (참조, 예를 들어, 문헌 [Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993]). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 하나의 척도는, 2 개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연히 발생할 수 있다는 가능성의 지표를 제공하는 최소합 가능성 (P(N)) 이다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소합 가능성이 약 0.2 미만, 전형적으로는 약 0.01 미만, 보다 전형적으로는 약 0.001 미만인 경우 참조 서열에 대해 유사한 것으로 고려된다.
용어 "미스매치 구별" 은, 핵산에 대해 하나 이상의 뉴클레오티드를 부착함으로써 (예를 들어, 공유적으로), 주형-의존적 방식으로, 핵산 (예를 들어, 프라이머 또는 다른 올리고뉴클레오티드) 을 확장할 때 미스매치-함유 서열로부터 완전히 상보적인 서열을 구별하기 위한, 생체촉매 (예를 들어, 효소, 예컨대 중합효소, 리가아제, 등) 의 능력을 지칭한다. 용어 "미스매치 구별" 은, 확장되는 핵산 (예를 들어, 프라이머 또는 다른 올리고뉴클레오티드) 이 핵산이 하이브리드하는 주형에 비해 3'-말단 핵산에서 미스매치를 갖는, 미스매치-함유 (대략 상보적) 서열부터 완전히 상보적인 서열을 구별하기 위한 생체촉매의 능력을 지칭한다. 몇몇 구현예에서, 확정되는 핵산은 완전히 상보적인 서열에 대해 3'-말단에서 미스매치를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 확장되는 핵산은, 완전히 상보적인 서열에 대해 말단에서 두번째 (N-1) 3'-위치 및/또는 N-2 위치에서 미스매치를 포함한다.
용어 "Cp 값" 또는 "교차점 값" 은, 입력 표적 핵산을 정량화하는 값을 지칭한다. Cp 값은 제 2-파생 최대 방법에 따라 측정될 수 있다 (문헌 [Van Luu-The, et al., "Improved real-time RT-PCR methods for high-throughput measurements using second derivative calculation and double correction, BioTechniques, Vol. 38, No. 2, February 2005, pp. 287, 93]). 제 2 파생 유도 방법에서, Cp 는 제 2 파생 곡선의 제 1 피크에 상응한다. 이러한 피크는 로그-선형 상의 시작에 상응한다. 제 2 유도 방법은 실시간 형광 강도 곡선의 제 2 유도 값을 계산하고 오직 하나의 값이 수득된다. 기원적인 Cp 방법은 예를 들어, 다항식 기능에 의해 강도 값의 국소적으로 정의되는 구별가능한 대략치를 기초로 한다. 이후, 제 3 파생을 컴퓨터화한다. Cp 값은 제 3 파생값의 최소 루트이다. 또한, Cp 는 피트 포인트 방법을 사용하여 측정될 수 있고, 이때 Cp 는 로그-선형 영역에서 역치선에 평행한 교차점에 의해 측정된다 (Van Luu-The, et al., BioTechniques, Vol. 38, No. 2, February 2005, pp. 287, 93). 이들 계산은 당업자에 의해 용이하게 수행된다.
용어 "PCR 효율" 은, 완벽하게 매칭되는 프라이머 주형에 대한 효율적인 증폭을 순환시키는 사이클의 지표를 지칭한다. PCR 효율은 하기 방정식을 이용하는 각 조건에 대해 계산된다:
% PCR 효율 = (10(-기울기)-1) x 100 ,
이때, Cp 를 x-축에 플롯팅하고 로그 복사본 수를 y-축에 플롯팅하는 선형 회귀에 의해 기울기를 계산한다.
용어 "다중" 은, 프라이머의 하나 이상의 세트를 갖는 증폭, 또는 단일 반응에서 하나 이상의 다형성의 증폭을 지칭한다.
도 1 은 하기 다양한 종의 박테리아로부터의 예시적인 DNA 중합효소의 중합효소 도메인 영역의 아미노산 정렬을 나타낸다: 써무스 종 Z05 (Z05) (SEQ ID NO:12), 써무스 아쿠아티쿠스 (Taq) (SEQ ID NO:13), 써무스 필리포르무스 (Thermus filiformus) (Tfi) (SEQ ID NO:14), 써무스 플라부스 (Tfl) (SEQ ID NO:15), 써무스 종 Sps17 (Sps17) (SEQ ID NO:16), 써무스 써모필루스 (Tth) (SEQ ID NO:17), 써무스 칼도필루스 (Tca) (SEQ ID NO:18), 써모토가 마리티마 (Tma) (SEQ ID NO:19), 써모토가 네오폴리타나 (Tne) (SEQ ID NO:20), 써모시포 아프리카누스 (Taf) (SEQ ID NO:21), 데이노코쿠스 라디오두란스 (Dra) (SEQ ID NO:23), 바실러스 스테아로써모필루스 (Bst) (SEQ ID NO:24), 및 바실러스 칼도테낙스 (Bca) (SEQ ID NO:25). 또한, 나타낸 폴리펩티드 영역은 아미노산 모티프 A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Q-X9-X10-X11-X12-L-X13-X14-X15-L (SEQ ID NO:26) 을 포함하고, 이의 가변 위치는 또한 본원에서 정의된다. 이러한 모티프는 각각의 중합효소 서열에 대해 볼드체로 강조한다. 본 발명에 따른 돌연변이에 따르는 아미노산 위치는 별표 (*) 로 표시한다.
도 2 는 하기의 DNA 중합효소 I 효소 중에서 서열 일치성을 제공한다: 써무스 종 Z05 DNA 중합효소 (Z05); 써무스 아쿠아티쿠스 DNA 중합효소 (Taq); 써모드 필리포르미스 DNA 중합효소 (Tfi); 써무스 플라부스 DNA 중합효소 (Tfl); 써무스 종 Sps17 DNA 중합효소 (Sps17); 써무스 써모필루스 DNA 중합효소 (Tth); 써무스 칼도필루스 DNA 중합효소 (Tca); 데이노코쿠스 라디오두란스 DNA 중합효소 (Dra); 써모토가 마리티마 DNA 중합효소 (Tma); 써모토가 네오폴리타나 DNA 중합효소 (Tne); 써모시포 아프리카누스 DNA 중합효소 (Taf); 바실러스 스테아로써모필루스 DNA 중합효소 (Bst); 및 바실러스 칼도테낙스 DNA 중합효소 (Bca). (A) 전체 중합효소 I 효소 (Z05 의 아미노산 1-834 에 상응) 에 대한 서열 일치성; 및 (B) Z05 의 아미노산 420-834 에 상응하는 중합효소 하위도메인에 대한 서열 일치성.
본 발명은, 중합효소 도메인에서 하나 이상의 아미노산이 하나 이상의 중합효소 활성 또는 특성을 개선시키는 것으로 확인된 개선된 DNA 중합효소를 제공한다. 본 발명의 DNA 중합효소는, 본원에 나타낸 아미노산 차이를 예외로 하여 중합효소의 변형되지 않은 형태에 비해, 3'-미스매치 구별 활성이 증가된 활성 효소이고 (즉, 본원에 기술되는 본 발명의 중합효소는 프라이머의 3'-말단에서 또는 3'-말단 근처에서 주형에 대해 미스매칭되는 프라이머가 확장되지 않기 쉽다. DNA 중합효소는 질병의 의학적 진단 및 재조합 DNA 연구에서 적용되는 것이 포함되는, 폴리뉴클레오티드 주형의 폴리뉴클레오티드 신장 또는 증폭을 포함하는 다양한 적용에 유용하다.
본 발명의 중합효소
몇몇 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소는 하기 모티프를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다:
Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-X6-Arg-Asp-Gln-Leu-X10-Arg-Val-Leu-X13-Asp-Glu-Leu (또한, 한 문자 코드로는 A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L 로서도 지칭됨);
[이때,
X6 은 Ser (S), Gly (G), Ala (A), Asp (D), Phe (F), Lys (K), Cys (C), Thr (T) 또는 Tyr (Y) 이고;
X10 은 Glu (E) 이외의 임의의 아미노산이고;
X13 은 Phe (F), Ala (A), Gly (G), Ser (S), Thr (T), Tyr (Y), Asp (D) 또는 Lys (K) (SEQ ID NO:8) 임].
몇몇 구현예에서, X10 은 L, M, W, P, T, F, Y, C, N, D, V, I, R, K, Q, H, S, A, 또는 G 로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서 X10 은 R, K, A 또는 G (SEQ ID NO:49) 으로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소는, 하기 모티프를 갖는 것을 특징으로 할 수 있는 써무스 속 (Thermus genus) 종으로부터 유래된다:
Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-Ser-Arg-Asp-Gln-Leu-X10-Arg-Val-Leu-Phe-Asp-Glu-Leu (또한 한 문자 코드로는 A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-X10-R-V-L-F-D-E-L 로서도 지칭됨);
[이때,
X10 은 Glu (E) 이외의 임의의 아미노산 (SEQ ID NO:9) 임].
몇몇 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소는, 하기 모티프를 갖는 것을 특징으로 할 수 있는 써무스 속 종으로부터 유래된다:
Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-Ser-Arg-Asp-Gln-Leu-X10-Arg-Val-Leu-Phe-Asp-Glu-Leu (또한 한 문자 코드로는 A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-X10-R-V-L-F-D-E-L 으로서도 지칭됨);
[이때,
X10 은 Ala (A), Gly (G), Lys (K) 또는 Arg (R) (SEQ ID NO:10) 임].
몇몇 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소는 하기 모티프를 갖는 것을 특징으로 할 수 있는 써무스 속 종으로부터 유래된다:
Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-Ser-Arg-Asp-Gln-Leu-X10-Arg-Val-Leu-Phe-Asp-Glu-Leu (또한 한 문자 코드로는 A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-X10-R-V-L-F-D-E-L 으로서도 지칭됨);
[이때,
X10 은 Lys (K) (SEQ ID NO:11) 임].
또한, 몇몇 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소는, 천연 모티프의 위치 X6 및 X13 에서 추가의 아미노산 치환을 포함할 수 있다 (SEQ ID NO:26). 위치 X6 및 X13 에서 추가의 치환은 또한 3'-미스매치 구별을 증가시킬 수 있다. 따라서, 몇몇 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소는 하기 모티프를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다:
Ala-Gly-X1-X2-Phe-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Gln-X9-X10-X11-X12-Leu-X13-X14-X15-Leu (또한 한 문자 코드로는 A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Q-X9-X10-X11-X12-L-X13-X14-X15-L 으로서도 지칭됨);
[이때,
X1 은 His (H), Glu (E) 또는 Gln (Q) 이고;
X2 은 Pro (P), Thr (T) 또는 Glu (E) 이고;
X3 은 Asn (N) 또는 His (H) 이고;
X4 은 Leu (L) 또는 Ile (I) 이고;
X5 은 Asn (N) 또는 Arg (R) 이고;
X6 은 임의의 아미노산이고;
X7 은 Arg (R), Pro (P), 또는 Ser (S) 이고;
X8 은 Asp (D), Lys (K) 또는 Thr (T) 이고;
X9 은 Leu (L) 또는 Val (V) 이고;
X10 은 Glu (E), Ser (S), Ala (A) 또는 Gly (G) 이외의 임의의 아미노산이고;
X11 은 Arg (R), Asn (N), Tyr (Y), Thr (T) 또는 Val (V) 이고;
X12 은 Val (V) 또는 Ile (I) 이고;
X13 은 임의의 아미노산이고;
X14 은 Asp (D) 또는 Glu (E) 이고;
X15 은 Glu (E) 또는 Lys (K) (SEQ ID NO:42) 임].
몇몇 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소는 하기 모티프를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다:
Ala-Gly-X1-Pro-Phe-Asn-X4-Asn-X6-X7-X8-Gln-X9-X10-X11-X12-Leu-X13-X14-X15-Leu (또한 한 문자 코드로는 A-G-X1-P-F-N-X4-N-X6-X7-X8-Q-X9-X10-X11-X12-L-X13-X14-X15-L 으로서도 지칭됨);
[이때,
X1 은 His (H) 또는 Glu (E) 이고;
X4 은 Leu (L) 또는 Ile (I) 이고;
X6 은 임의의 아미노산이고;
X7 은 Arg (R) 또는 Pro (P) 이고;
X8 은 Asp (D) 또는 Lys (K) 이고;
X9 은 Leu (L) 또는 Val (V) 이고;
X10 은 Glu (E) 또는 Ser (S) 이외의 임의의 아미노산이고;
X11 은 Arg (R) 또는 Asn (N) 이고;
X12 은 Val (V) 또는 Ile (I) 이고;
X13 은 임의의 아미노산이고;
X14 은 Asp (D) 또는 Glu (E) 이고;
X15 은 Glu (E) 또는 Lys (K) (SEQ ID NO:43) 임].
몇몇 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소는 하기 모티프를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다 (써무스 및 써모토가로부터 유래된 DNA 중합효소에 상응):
Ala-Gly-X1-Pro-Phe-Asn-X4-Asn-Ser-X7-X8-Gln-X9-X10-Arg-X12-Leu-Phe-X14-X15-Leu (또한 한 문자 코드로는 A-G-X1-P-F-N-X4-N-S-X7-X8-Q-X9-X10-R-X12-L-F-X14-X15-L 으로서도 지칭됨);
[이때:
X1 은 His (H) 또는 Glu (E) 이고;
X4 은 Leu (L) 또는 Ile (I) 이고;
X7 은 Arg (R) 또는 Pro (P) 이고;
X8 은 Asp (D) 또는 Lys (K) 이고;
X9 은 Leu (L) 또는 Val (V) 이고;
X10 은 Glu (E) 또는 Ser (S) 이외의 임의의 아미노산이고;
X12 은 Val (V) 또는 Ile (I) 이고;
X14 은 Asp (D) 또는 Glu (E) 이고;
X15 은 Glu (E) 또는 Lys (K) (SEQ ID NO:44) 임].
몇몇 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소는 하기 모티프를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다:
Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-X6-Arg-Asp-Gln-Leu-X10-Arg-Val-Leu-X13-Asp-Glu-Leu (또한 한 문자 코드로는 A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L 으로서도 지칭됨);
[이때,
X6 은 임의의 아미노산이고;
X10 은 Glu (E) 이외의 임의의 아미노산이고;
X13 은 임의의 아미노산 (SEQ ID NO:45) 임].
몇몇 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소는 하기 모티프를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다:
Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-X6-Arg-Asp-Gln-Leu-X10-Arg-Val-Leu-X13-Asp-Glu-Leu (또한 한 문자 코드로는 A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L 으로서도 지칭됨);
[이때,
X6 은 Ser (S) 이외의 임의의 아미노산이고;
X10 은 Glu (E) 이외의 임의의 아미노산이고;
X13 은 Phe (F) 이외의 임의의 아미노산 (SEQ ID NO:46) 임].
몇몇 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소 하기 모티프를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다:
Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-X6-Arg-Asp-Gln-Leu-X10-Arg-Val-Leu-X13-Asp-Glu-Leu (또한 한 문자 코드로는 A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L 으로서도 지칭됨);
[이때,
X6 은 Ser (S), Gly (G), Ala (A), Asp (D), Phe (F), Lys (K), Cys (C), Thr (T) 또는 Tyr (Y) 이고;
X10 은 Ser (S), Gln (Q), Ala (A), Gly (G), Lys (K) 또는 Arg (R) 이고;
X13 은 Phe (F), Ala (A), Gly (G), Ser (S), Thr (T), Tyr (Y), Asp (D) 또는 Lys (K) (SEQ ID NO:47) 임].
몇몇 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소 하기 모티프를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다:
Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-X6-Arg-Asp-Gln-Leu-X10-Arg-Val-Leu-X13-Asp-Glu-Leu (또한 한 문자 코드로는 A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L) 으로서도 지칭됨);
[이때,
X6 은 Ser (S), Gly (G), Ala (A), Asp (D), Phe (F), Lys (K), Cys (C), Thr (T) 또는 Tyr (Y) 이고;
X10 은 Lys (K) 이고;
X13 은 Phe (F), Ala (A), Gly (G), Ser (S), Thr (T), Tyr (Y), Asp (D) 또는 Lys (K) (SEQ ID NO:48) 임].
이러한 모티프는 패밀리 A 유형의 많은 DNA-의존적 DNA 중합효소, 특히 호열성 박테리아로부터의 열안정성 DNA 중합효소 내에 존재한다 (Li et al., EMBO J. 17:7514-7525, 1998). 예를 들어, 도 1 은 하기의 수 개의 종의 박테리아로부터의 DNA 중합효소에서 상기 모티프에 상응하는 천연 서열을 포함하는 아미노산 서열 정렬을 나타낸다: 에스케리챠 콜라이, 바실러스 칼도테낙스, 바실러스 스테아로써모필루스, 데이노코쿠스 라디오두란스, 써모시포 아프리카누스, 써모토가 마리티마, 써모토가 네오폴리타나, 써무스 아쿠아티쿠스, 써무스 칼도필루스, 써무스 필리포르무스, 써무스 플라부스, 써무스 종 Sps17, 써무스 종 Z05, 및 써무스 써모필루스. 나타낸 바와 같이, SEQ ID NO:8 의 모티프 (X10 이 E, S, A, 또는 G 인 것은 제외) 는, 중합효소의 이러한 영역에 대해 보존 기능을 나타내는, 이들 중합효소 각각에서 존재한다. 도 2 는 이들 DNA 중합효소 중에서 서열 일치성을 제공한다.
따라서, 몇몇 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술되는 개선된 활성 및/또는 특성을 갖는 SEQ ID NO:8, 9, 10, 또는 11 (예를 들어, 이때 X10 은 공통 서열에서 적절한 바와 같이 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, K, R 또는 H 로부터 선택됨) 을 포함하는 중합효소에 대해 제공되며, 이때 DNA 중합효소는 야생형이거나, 또는 자연 발생 DNA 중합효소, 예컨대, 예를 들어, 상기 기술된 임의의 종의 호열성 박테리아로부터의 중합효소이거나, 또는 그러한 야생형 또는 자연 발생 DNA 중합효소에 상당히 동일한 것이다. 예를 들어, 몇몇 구현예에서, 본 발명의 중합효소는 SEQ ID NO:8, 9, 10, 또는 11 을 포함하고, SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 36, 37, 38, 39, 40, 또는 41 에 대해 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일하다. 하나의 변형에서, 중합효소의 변형되지 않은 형태는 써무스 속 종으로부터이다. 본 발명의 몇몇 구현예에서, 변형되지 않은 중합효소는 써무스, 예를 들어, 써모토가 이외의 호열성 종으로부터이다.
수많은 열안정성 DNA 중합효소에 대한 완전한 핵산 및 아미노산 서열이 이용가능하다. 써무스 아쿠아티쿠스 (Taq) (SEQ ID NO:2), 써무스 써모필루스 (Tth) (SEQ ID NO:6), 써무스 종 Z05 (SEQ ID NO:1), 써무스 종 Sps17 (SEQ ID NO:5), 써모토가 마리티마 (Tma) (SEQ ID NO:38), 및 써모시포 아프리카누스 (Taf) (SEQ ID NO:37) 중합효소의 각각의 서열이 PCT 국제 출원 공보 제 WO 92/06200 호에 공개되어 있다. 써무스 플라부스 (SEQ ID NO:4) 로부터의 DNA 중합효소에 대한 서열이 문헌 [Akhmetzjanov and Vakhitov (핵산 Research 20:5839, 1992] 에 공개되어 있다. 써무스 칼도필루스 (Thermus caldophilus) (SEQ ID NO:7) 로부터의 열안정성의 DNA 중합효소의 서열이 EMBL/GenBank Accession No. U62584 에서 발견된다. 써모드 필리포르미스 (Thermus filiformis) 로부터의 열안정성 DNA 중합효소의 서열이 표 1 에서 제공되는 서열 정보 및 미국 특허 제 4,889,818 호에 제공되는 방법을 사용하여 ATCC 수탁 번호 42380 으로부터 회수될 수 있다. 써모토가 네아폴리타나 (Thermotoga neapolitana) DNA 중합효소 (SEQ ID NO:39) 의 서열은 "GeneSeq Patent Database Accession No. R98144" 및 PCT WO 97/09451 로부터이다. 바실러스 칼도테낙스 (Bacillus caldotenax) (SEQ ID NO:41) 으로부터의 열안정성 DNA 중합효소의 서열은 예를 들어 문헌 [Uemori et al. (J Biochem (Tokyo) 113(3):401-410, 1993] 에 기술되어 있으며; 또한 "Swiss-Prot Database Accession No. Q04957" 및 "GenBank Accession Nos. D12982 및 BAA02361" 을 참조한다. 본원에 기술되는 바와 같이 변형될 수 있는 DNA 중합효소의 변형되지 않은 형태의 예는 예를 들어 미국 특허 제 6,228,628 호; 제 6,346,379 호; 제 7,030,220 호; 제 6,881,559 호; 제 6,794,177 호; 제 6,468,775 호; 및 특허 출원 제 20040005599 호; 제 20020012970 호; 제 20060078928 호; 제 20040115639 호에 기술되어 있다. 예시적인 전체 길이의 중합효소 서열은 또한 서열 목록에서 제공된다.
몇몇 구현예에서, SEQ ID NOS:8, 9, 10, 또는 11 를 포함하는 중합효소 도메인을 갖는 본 발명의 중합효소는 또한 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, Z05 의 위치 1 내지 291 에 상응함) 을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 중합효소는 키메라 중합효소이고, 즉, 둘 이상의 효소로부터 폴리펩티드 영역을 포함한다. 그러한 키메라 DNA 중합효소의 예는 예를 들어, 미국 특허 제 6,228,628 호에 기술되어 있다. 특히 적합한 것은 키메라 CS-패밀리 DNA 중합효소이고, 이는 SEQ ID NO:29 또는 SEQ ID NO:30 (전형적으로는 80% 이상의 서열 일치성, 보다 전형적으로는 90% 이상, 가장 전형적으로는 95% 이상의 서열 일치성) 에 대해 상당한 서열 일치성 또는 유사성을 갖는 CS5 (SEQ ID NO:29) 및 CS6 (SEQ ID NO:30) 중합효소 및 이의 변이체를 포함하고, 따라서 SEQ ID NO:8 를 함유하도록 변형될 수 있다. CS5 및 CS6 DNA 중합효소는 써무스 종 Z05 및 써모토가 마리티마 (Tma) DNA 중합효소로부터 유래된다. 이들은, 써무스 효소의 N-말단 5'-뉴클레아제 도메인을 포함하고 C-말단 3'-5' 엑소뉴클레아제 및 Tma 효소의 중합효소 도메인을 포함한다. 효율적인 역전사효소 활성을 갖는 이들 효소는 뉴클레오티드 유사체-함유 프라이머를 확장할 수 있으며, 알파-포스포로티오에이트 dNTP, dUTP, dITP, 및 또한 플루오세인- 및 시아닌-염료 패밀리 라벨링된 dNTP 을 이용할 수 있다. CS5 및 CS6 중합효소는 또한 효율적인 Mg2 +-활성화되는 PCR 효소이다. CS5 및 CS6 키메라 중합효소는 또한 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제 2004/0005599 호에 기술되어 있다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 중합효소는 SEQ ID NO:8, 9, 10, 또는 11 을 포함하고, 또한 천연 중합효소에 비해 하나 이상의 추가의 아미노산 변화 (예를 들어, 아미노산 치환, 첨가 또는 결손) 를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 그러한 중합효소는, SEQ ID NO:8 (또는 SEQ ID NO:9, 10 또는 11 의 모티프) 의 아미노산 모티프를 보유하고, 및 하기와 같은 SEQ ID NO:27 (Z05 의 D580X 돌연변이에 상응 (SEQ ID NO:1)) 의 아미노산 모티프를 포함한다:
T-G-R-L-S-S-X7-X8-P-N-L-Q-N;
[이때,
X7 은 Ser (S) 또는 Thr (T) 이고;
X8 은 D 또는 E 이외의 임의의 아미노산 (SEQ ID NO:27) 임].
돌연변이는 예를 들어, US 특허 공보 제 2009/0148891 호에 보다 상세히 논의되는 SEQ ID NO:27 을 특징으로 한다. 몇몇 구현예에서, 그러한 기능적 변이체 중합효소 전형적으로는 야생형 또는 자연 발생 중합효소 (예를 들어, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 39, 40, 41, 42, 43, 또는 44) 에 대해, 전형적으로는 80% 이상의 서열 일치성, 보다 전형적으로는 90% 이상, 가장 전형적으로는 95% 이상의 상당한 서열 일치성을 가질 것이다.
몇몇 구현예에서, 위치 X10 에서 아미노산은, SEQ ID NO:8, 9, 10 또는 11 에서 제시된 아미노산으로 치환되고, 위치 X8 에서 아미노산은 SEQ ID NO:27 에서 제시된 바와 같은 아미노산으로 치환된다. 따라서, 몇몇 구현예에서, 위치 X10 에서 아미노산은 Glu (E), Ser (S), Ala (A),또는 Gly (G) 이외의 임의의 아미노산이고, 위치 X8 에서 아미노산은 Asp (D) 또는 Glu (E) 이외의 임의의 아미노산이다. 몇몇 구현예에서, 아미노산 치환은 SEQ ID NO:27 에서 위치 X8 에서 류신 (L), 글리신 (G), 트레오닌 (T), 글루타민 (Q), 알라닌 (A), 세린 (S), 아스파라긴 (N), 아르기닌 (R), 및 라이신 (K) 을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소는 써무스 종으로부터 유래되고, 아미노산 치환은 독립적으로 위치 X8 에서 글리신 (G) 및 위치 X10 에서 알라닌 (A), 글리신 (G), 라이신 (K), 또는 아르기닌 (R) 을 포함한다.
특정 구현예에서, 아미노산 치환은 독립적으로 위치 X10 에서 라이신 (K) 및 위치 X8 에서 글리신 (G) 을 포함한다. 확인되는 부위 중 하나 이상에서 다른 적합한 아미노산 치환(들)은 예를 들어, 당업자에게 공지되거나 또한 본원에 기술되는 검정에서 폴리뉴클레오티드 신장 성능의 결정 및 부위-지향적 돌연변이생성의 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
DNA 중합효소의 정확한 길이가 다양할 수 있기 때문에, X10 및 X8 각각에 상응하는 아미노산 위치가 사용되는 특정 중합효소에 따라 다양할 수 있다. 아미노산 및 핵산 서열 정렬 프로그램이 용이하게 입수가능하며 (예를 들어, supra 에 지칭된 것 참조), 본원에서 확인되는 주어진 특정 모티프는 본 발명에 따른 변형에 대한 정확한 아미노산 (및 상응하는 코돈) 의 확인을 보조하기 위해 제공된다. 표 1 에 X6, X10, X13 및 X8 각각에 상응하는 위치는 예시적 호열성 종으로부터의 열안정성의 DNA 중합효소 및 키메라 열안정성의 DNA 중합효소에 대해 예시적인 것을 표 1 에 나타낸다.
[표 1] 예시적인 중합효소에서 모티프 위치 X6, X10, X13 (예를 들어, SEQ ID NOS:8, 9, 10, 및 11) 및 X8 (SEQ ID NO:27) 에 상응하는 아미노산 위치.
Figure 112012104951131-pct00001
몇몇 구현예에서, 본 발명의 돌연변이체 DNA 중합효소는 써무스 종 Z05 DNA 중합효소 (SEQ ID NO:1) 또는 이의 변이체 (예를 들어, D580G 등) 으로부터 유래된다. 상기 지칭되는 바와 같이, 천연 써무스 종 Z05 DNA 중합효소에서, 위치 X10 는 위치 493 에서 글루탐산(E) 에 상응하고; 위치 X6 는 위치 488 에서 세린 (S) 에 상응하고; 위치 X13 는 SEQ ID NO:1 의 위치 497 에서 페닐알라닌 (F) 에 상응하고; SEQ ID NO:27 의 위치 X8 은 SEQ ID NO:1 의 위치 580 에서 Aspartate (D) 에 상응한다. 따라서, 본 발명의 특정 변형에서, 돌연변이체 중합효소는, 써무스 종 Z05 DNA 중합효소, E493, S488, F497, 및 D580 에서 써무스 종 Z05 DNA 중합효소에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 따라서, 몇몇 구현예에서, 위치 E493 에서 아미노산은 E 가 아니다. 몇몇 구현예에서, 위치 493 에서 아미노산은, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, K, R 또는 H 로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 위치 E493 에서 아미노산 잔기는 S, A, Q, G, K 또는 R 이다. 특정 구현예에서, 위치 E493 에서 아미노산 잔기는 A, G, K, 또는 R 이다. 전형적으로는, 위치 S488 에서 아미노산은 (치환된 경우) S 가 아니다. 몇몇 구현예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 488 에서 아미노산은, G, A, V, L, I, M, F, W, P, E, T, C, N, Q, D, Y, K, R 또는 H 으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 위치 S488 에서 아미노산 잔기는 치환되거나 치환되지 않을 수 있고, S, G, A, D, F, K, C, T, 또는 Y 이다. 전형적으로는, 위치 F497 (치환된 경우) 에서 아미노산은 F 가 아니다. 몇몇 구현예에서, 위치 497 에서 아미노산은, G, A, V, L, I, M, E, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, K, R 또는 H 으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 위치 F497 에서 아미노산 잔기는 치환되거나 치환되지 않을 수 있고, F, A, G, S, T, Y, D, 또는 K 이다. 특정 구현예에서, 위치 D580 에서 아미노산 잔기는 류신 (L), 글리신 (G), 트레오닌 (T), 글루타민 (Q), 알라닌 (A), 세린 (S), 아스파라긴 (N), 아르기닌 (R), 및 라이신 (K) 으로부터 선택될 수 있다. 예시적인 써무스 종 Z05 DNA 중합효소 돌연변이체는, 아미노산 치환(들) E493K 및 D580G 를 포함하는 것들을 포함한다.
예시적인 써무스 종 Z05 DNA 중합효소 돌연변이체는 아미노산 치환(들) E493S, E493A, E493Q, E493G, E493K, E493R, S488F, S488T, S488Y, S488G, S488A, S488D, S488K, S488C, F497Y, F497S, F497T, F497A, F497G, F497D, F497K, 및/또는 D580G 을 포함하는 것을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 돌연변이체 써무스 종 (Thermus sp.) Z05 DNA 중합효소는 예를 들어, 아미노산 잔기 치환 E493K (또는 E493A, E493Q, E493G, E493S, E493R) 및 D580G 를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 돌연변이체 써무스 종 (Thermus sp.) Z05 DNA 중합효소는 예를 들어, 아미노산 잔기 치환 E493K (또는 E493A, E493Q, E493G, E493S, E493R) 및 S488F (또는 S488T, S488Y, S488G, S488A, S488D, S488K, S488C) 를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 돌연변이체 써무스 종 Z05 DNA 중합효소는 예를 들어, 아미노산 잔기 치환 E493K (또는 E493A, E493Q, E493G, E493S, E493R) 및 F497S (또는 F497Y, F497T, F497A, F497G, F497D, F497K) 를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 돌연변이체 써무스 종 Z05 DNA 중합효소는, 예를 들어, 아미노산 잔기 치환 E493K (또는 E493A, E493Q, E493G, E493S, E493R), F497S (또는 F497Y, F497T, F497A, F497G, F497D, F497K), 및 S488F (또는 S488T, S488Y, S488G, S488A, S488D, S488K, S488C) 를 포함한다. 특정 구현예에서, 돌연변이체 써무스 종 Z05 DNA 중합효소는 예를 들어, 아미노산 잔기 치환은 E493K (또는 E493A, E493Q, E493G, E493S, E493R), F497S (또는 F497Y, F497T, F497A, F497G, F497D, F497K), S488F (또는 S488T, S488Y, S488G, S488A, S488D, S488K, S488C), 및/또는 D580G 으로부터 독립적으로 선택된다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소는, 써무스 종으로부터 유래하고, SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 아미노산은 극성의, 중성 pH 에서 음성으로 하전된 측-사슬을 갖지 않는 아미노산 (예를 들어, E) 이다. 따라서, 몇몇 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소는 써무스 종으로부터 유래하고, SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 아미노산은 중성 pH (예를 들어, 약 pH 7.4) 에서 극성의 하전되지 않은 측-사슬 (예를 들어, S, Q), 비극성의 하전되지 않은 측-사슬 (예를 들어, A, G), 또는 극성의 양성으로 하전된 측-사슬 (예를 들어, R 또는 K) 을 갖는다. 몇몇 구현예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 아미노산은 비극성의 하전되지 않은 측-사슬 (예를 들어, A, G), 또는 극성의 양성으로 하전된 측-사슬 (예를 들어, R 또는 K) 을 갖는다. 몇몇 구현예에서, 극성의 양성으로 하전된 측-사슬을 갖는 SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 아미노산은 R 또는 K 이다. 몇몇 구현예에서, 극성의 양성으로 하전된 측-사슬을 갖는 SEQ ID NO:1 의 위치 493 에 상응하는 아미노산은 K 이다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소는 또한 다른, 비-치환되는 변형(들)을 포함할 수 있다. 그러한 변형은, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 신장을 포함하는 적용에 추가의 이점을 부여하기 위해 당업계에 공지된 공유 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 돌연변이체 DNA 중합효소는 또한 열적으로 가역성 공유 변형을 포함한다. 그러한 열적으로 가역성 변형을 포함하는 DNA 중합효소는 예를 들어, 다양한 고온-출발 PCR 기술과 같은 고온-출발 적용에 특히 적합하다. 본 발명의 돌연변이체 DNA 중합효소에 따라 사용될 수 있는 열적으로 가역성인 개질제 시약은 예를 들어, 미국 특허 제 5,773,258 호에 기술된다.
예를 들어, 반응에 의해 수행되는 열적으로 가역성인 공유 변형을 포함하는 특히 적합한 중합효소는, 하기 화학식 I 에 제시된 일반식을 갖는 디카르복실산 무수물 및 열안정성 효소의 혼합물이 약 25 ℃ 미만인 온도에서 알칼리성 pH 에서 수행된다:
Figure 112012104951131-pct00002
[식 중, R1 및 R2 는 수소 또는 유기 라디칼이고, 이는 연결될 수 있거나; 하기 화학식 II 을 갖는다:
Figure 112012104951131-pct00003
[식 중,
R1 및 R2 는 유기 라디칼이고, 이는 연결될 수 있고, 수소는 본질적으로 문헌 [Birch et al, supra] 에 기술된 바와 같이 시스 (cis) 이다.
본 발명의 DNA 중합효소는 예컨대 부위-지향 돌연변이생성으로서 통상 지칭되는 기술을 사용함으로써, 상응하는 변형되지 않은 중합효소 (예를 들어, 본 발명의 중합효소가 유래되는 야생형 중합효소 또는 상응하는 변이체) 를 인코딩하는 DNA 서열을 돌연변이화함으로써 구성될 수 있다. 중합효소의 변형되지 않은 형태를 인코딩하는 핵산 분자는 당업자에게 익히 공지된 중합효소 사슬 반응 (PCR) 기술을 변형함으로써 돌연변이화될 수 있다 (예를 들어 하기 문헌을 참조한다: [PCR Strategies (M. A. Innis, D. H. Gelfand, and J. J. Sninsky eds., 1995, Academic Press, San Diego, CA) at Chapter 14]; [PCR Protocols : A Guide to Methods and Appplications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, 및 T. J. White eds., Academic Press, NY, 1990]).
비제한적 예로서, "Transformer Site-Directed Mutageneis kit" (Clontech) 에서 이용되는 2 개의 프라이머 시스템은 부위-지향 돌연변이체를 중합효소의 변형되지 않은 형태를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 도입하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 시스템에서 표적 플라스미드의 변성에 따르면, 2 개의 프라이머는 플라스미드에 동시에 어닐링되고; 이들 프라이머 중 하나는 원하는 부위-지향 돌연변이를 함유하고, 다른 것은 제한 부위의 제거를 생성하는 플라스미드에서 다른 지점에서 돌연변이를 함유한다. 제 2 가닥 합성은 이들 2 개의 돌연변이를 단단히 연결하여 수행되고, 생성되는 플라스미드는 E. coli 의 mutS 균주로 변형된다. 플라스미드 DNA 는 형질전환된 박테리아로부터 단리되고, 관련 제한 효소로 제한되고 (이로써 돌연변이화된 플라스미드를 선형화함), 이어서 E. coli 로 재형질전환된다. 이러한 시스템은, 발현 플라스미드에서 직접 돌연변이 생성을 허용하고, 단일-가닥 파게미드의 하위클로닝 또는 생성이 요구되지 않는다. 2 개의 돌연변이 및 후속 돌연변이된 선형화의 밀접한 연결은, 높은 돌연변이 효율을 생성하고 최소 스크리닝을 허용한다. 초기 제한 부위 프라이머의 합성에 따르면, 이러한 방법은 돌연변이 부위 당 오직 하나의 새로운 프라이머 유형의 사용을 요구한다. 각 위치의 돌연변이체를 별도로 제조하기 보다는, "설계된 분해" 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트는 동시에 주어지는 부위에서 원하는 돌연변이 모두를 도입하기 위해 합성될 수 있다. 형질전환체는, 돌연변이를 일으키는 영역을 통해 플라스미드 DNA 를 서열화하여 돌연변이체 클론을 확인하고 분류함으로써 스크리닝될 수 있다. 각각의 돌연변이체 DNA 는 제한될 수 있고 예를 들어 돌연변이 검출 증강 겔 (Mutation Detection Enhancement Gel) (Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) 상에서 전기영동으로 분석되어, 서열에서 다른 변경이 발생하지 않음을 확인하였다 (돌연변이 생성되지 않은 대조군에 비해 밴드 시프트). 대안적으로는, 전체 DNA 영역은 서열화되어 표적화되는 영역의 외부에 발생한 추가의 돌연변이 경우가 없음을 확인하였다.
입증된 돌연변이체 2중 pET (또는 기타) 과다발현 벡터는, 돌연변이체 단백질의 고수준의 제조 및 표준 프로토콜에 의한 고수준 정제에 대해 예를 들어, 균주 E. coli BL21 (DE3) pLysS 와 같은 E. coli 를 형질전환하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, FAB-MS 맵핑 방법은, 돌연변이체 발현 분야를 신속하게 확인하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술은 서열화 분절이 전체 단백질을 통해 제공되고 서열 할당에서 요구되는 신뢰를 제공한다. 이러한 유형의 맵핑 실험에서, 단백질은 프로테아제로 소화되고 (이러한 분절이 우선 관심사항이고 남아 있는 맵이 돌연변이생성된 단백질의 맵과 동일하기 때문에 변형되어야만 하는 특이적 영역에 의존적일 것이다). 분할 단편의 세트는, 예를 들어, 마이크로보어 HPLC 에 의해 단편화되어 (역방향 상 또는 이온 교환, 변형되는 특이적 영역에 다시 의존적임), 각 기능에서 수 개의 펩티드를 제공하고, 펩티드의 분자량이 FAB-MS 와 같은 표준 방법에 의해 측정된다. 이어서, 각 단편의 측정된 질량을 예측되는 서열의 소화로부터 예상되는 펩티드의 분자량과 비교하고, 서열의 정확도를 신속하게 확인한다. 단백질 변형에 대한 이러한 돌연변이생성 접근법이 지향되기 때문에, 변경된 펩티드의 서열화가 반드시 필요한 것은 아니다 (MS 데이타가 예측과 동일한 경우). 변화된 잔기를 증명하기 위해 필요한 경우, CAD-직렬식 MS/MS 는, 의문 혼합물의 펩티드를 서열화하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 표적 펩티드는 Edman 분해를 차감하기 위해 정제될 수 있거나 카르복시펩티다아제 Y 소화는 변형의 위치에 의존적이다.
하나 초과의 아미노산이 치환된 돌연변이체 DNA 중합효소는 다양한 방식으로 생성될 수 있다. 폴리펩티드 사슬에서 함께 근접하게 위치하는 아미노산의 경우, 이들은 원하는 아미노산 치환 전부를 코딩하는 하나의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 동시에 돌연변이될 수 있다. 그러나, 아미노산이 서로 어느정도 거리에서 위치하는 경우 (예를 들어 10 개 초과의 아미노산에 의해 분리됨), 이는 원하는 변화 모두를 인코딩하는 단일 올리고뉴클레오티드를 생성하는데 더욱 어렵다. 실제로, 2 개의 대안적인 방법 중 하나가 사용될 수 있다. 제 1 방법에서, 분리된 올리고뉴클레오티드는 치환되는 각 아미노산에 대해 생성된다. 이후, 올리고뉴클레오티드는 어닐링되어 단일-가닥 주형 DNA 가 동시에 사용되고, 주형으로부터 합성되는 DNA 의 제 2 가닥은 원하는 아미노산 치환의 전부를 인코딩할 것이다. 대안적인 방법은, 원하는 돌연변이체를 제조하기 위해 돌연변이생성의 둘 이상의 라운드를 포함한다. 제 1 라운드는 단일 돌연변이체에 대해 기술되는 바와 같고; 변형되지 않은 중합효소를 인코딩하는 DNA 는 주형에 대해 사용되고, 제 1 의 원하는 아미노산 치환(들)을 인코딩하는 DNA 는 이러한 주형에 어닐링되고, 이어서 이형이중가닥 DNA 분자가 생성된다. 돌연변이생성의 제 2 라운드는 주형으로서 돌연변이생성의 제 1 라운드에서 제조되는 돌연변이된 DNA 를 이용한다. 따라서, 이러한 주형은 이미 하나 이상의 돌연변이를 함유한다. 이후, 추가의 원하는 아미노산 치환(들)을 인코딩하는 올리고뉴클레오티드는 이러한 주형에 어닐링되고, DNA 의 생성되는 가닥은 돌연변이생성의 제 1 및 제 2 라운드 둘 모두로부터 돌연변이를 인코딩한다. 이러한 생성되는 DNA 는 돌연변이생성 등의 제 3 라운드에서 주형으로서 사용될 수 있다. 대안적으로는, 문헌 [Seyfang & Jin (Anal. Biochem. 324:285-291. 2004)] 의 다중-부위 돌연변이생성 방법이 이용될 수 있다.
따라서, 또한 제공되는 것은, 본 발명의 DNA 중합효소 (예를 들어, SEQ ID NO:8, 9, 10, 또는 11 중 임의의 것을 포함하는 중합효소) 중 임의의 것을 인코딩하는 재조합 핵산이다. 본 발명의 DNA 중합효소를 인코딩하는 본 발명의 핵산을 이용하여, 다양한 벡터가 제조될 수 있다. 숙주 세포와 호환되는 종으로부터 유래되는 레플리콘 및 대조군 서열을 함유하는 임의의 벡터가 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 일반적으로, 발현 벡터는 돌연변이체 DNA 중합효소를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되는 전사 및 번역을 조절하는 핵산 영역을 포함한다. 용어 "대조군 서열" 은, 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결되는 코딩 서열의 발현에 요구되는 DNA 서열을 지칭한다. 예를 들어, 원핵생물에 적합한 대조군 서열은 프로모터, 임의적으로는 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 또한, 벡터는 전사되는 mRNA 의 반감기를 증강시키기 위해 "Positive Retroregulatory Element" (PRE) 를 함유할 수 있다 (Gelfand 등의 미국 특허 제 4,666,848 호 참조). 전사 및 번역 조절 핵산 영역은 일반적으로 중합효소를 발현하기 위해 사용되는 숙주 세포에 대해 적절할 것이다. 다양한 유형의 적절한 발현 벡터, 및 적합한 조절 서열은, 다양한 숙주 세포에 대해 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 전사 및 번역 조절 서열은 에를 들어, 프로모터 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 출발 및 정지 서열, 번역 출발 및 정지 서열, 및 인핸서 또는 활성화 서열을 포함할 수 있다. 전형적인 구현예에서, 조절 서열은 프로모터 및 전사 출발 및 정지 서열을 포함한다. 벡터 또한 전형적으로는 외래 DNA 의 삽입을 위한 수 개의 제합 부위를 함유하는 폴리링커 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, "융합 플래그" 는 정제를 촉진하기 위해 사용되고, 필요에 따라, 태그/플래그가 후속 제거된다 (예를 들어, "His-Tag"). 그러나, "가열-단계" 가 사용되는 중온성 숙주 (예를 들어, E. coli) 로부터 열활성 및/또는 열안정성 단백질을 정제할 때 이들은 일반적으로 불필요하다. DNA 인코딩 복제 서열, 조절 서열, 표현형 선택 유전자를 함유하는 적합한 벡터의 구축, 및 관심 돌연변이체 중합효소가 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조된다. 단리된 플라스미드, 바이러스 벡터, 및 DNA 단편이 분해되고, 재단되고, 당업계에 익히 공지되어 있는 바와 같이 원하는 벡터를 생성하기 위해 특정 순서로 함께 라이게이션된다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, 2nd ed. 1989)] 참조).
특정 구현예에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선택을 허용하기 위해 선택가능한 마커 유전자를 함유한다. 선택 유전자는 당업계에 익히 공지되어 있고 사용되는 숙주 세포를 갖고 다양할 것이다. 적합한 선택 유전자는 암피실린 및/또는 테트라시클린 저항성에 대한 유전자 코딩을 포함할 수 있고, 이는 이들 항생제의 존재 하에 이들 벡터를 배양하는 세포를 형질전환시킬 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명의 DNA 중합효소를 인코딩하는 핵산은, 세포에 단독으로 또는 벡터와 조합되어 도입된다. 본원에서 "도입함" 또는 이의 등가적인 표현은, 핵산이 핵산의 후속 통합, 증폭 및/또는 발현에 적합한 방식으로 세포로 들어가는 것을 의미한다. 도입 방법은, 세포 유형을 표적화함으로써 대개 지시된다. 예시적인 방법은 CaPO4 침전, 리포좀 융합, LIPOFECTIN® 전기영동, 바이러스 감염 등을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 원핵생물은 본 발명의 초기 클로닝 단계에 대해 숙주 세포로서 사용된다. 다량의 DNA 를 신속하게 제조하기 위해, 부위-지향 돌연변이생성에 사용되는 단일-가닥 DNA 주형을 제조하기 위해, 많은 돌연변이체를 동시에 스크리닝하기 위해, 생성되는 돌연변이체의 DNA 서열화를 위해, 이들이 특히 유용하다. 적합한 원핵세포의 숙주 세포는 E. coli K12 균주 94 (ATCC No. 31,446), E. coli 균주 W3110 (ATCC No. 27,325), E. coli K12 균주 DG116 (ATCC No. 53,606), E. coli X1776 (ATCC No. 31,537), 및 E. coli B; E. coli 의 많은 다른 균주, 예컨대 HB101, JM101, NM522, NM538, NM539, 및 기타 다른 종들을 포함하고, 바실리 예컨대 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 다른 엔테로박테리아 세아, 예컨대 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르세산스 (Serratia marcesans), 및 다양한 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.) 을 포함하는 원핵생물 속이 호스트로서 사용될 수 있다. 강성 세포벽을 갖는 원핵세포의 숙주 세포 또는 다른 숙주 세포는 전형적으로 문헌 [Sambrook et al., supra] 의 구획 1.82 에 기술된 바와 같은 염화 칼슘을 이용하여 전형적으로 형질전환된다. 대안적으로는, 전기영동은, 이들 세포의 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 원핵생물 형질전환 기술은, 예를 들어 문헌 [Dower, in Genetic Engineering, Principles and Methods 12:275-296 (Plenum Publishing Corp., 1990)]; [Hanahan et al., Meth. Enzymol., 204:63, 1991] 에 제시된다. 전형적으로 E. coli 의 형질전환에 사용되는 플라스미드는 pBR322, pUCI8, pUCI9, pUCIl8, pUC119 및 Bluescript M13 을 포함하고, 이의 전부는 문헌 [Sambrook et al., supra] 의 구획 1.12-1.20 에서 기술되어 있다. 그러나, 많은 다른 적합한 벡터가 또한 이용될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소는 DNA 중합효소의 발현을 유도하거나 야기하는 적절한 조건 하에서, DNA 중합효소를 인코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터로 형질전환되는 숙주 세포를 배양함으로써 제조된다. 단백질 발현에 적합한 조건 하에서 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., supra] 참조). 람다 pL 프로모터-함유 플라스미드 벡터로부터 중합효소의 제조에 적합한 숙주 세포는 E. coli 균주 DG116 (ATCC No. 53606) (미국 특허 제 5,079,352 호 및 문헌 [Lawyer, F.C. et al., PCR Methods and applications 2:275-87, 1993] 참조) 을 포함한다. 발현에 따르면, 중합효소는 수확되고 단리될 수 있다. 열안정성 DNA 중합효소를 정제하기 위한 방법이 예를 들어, 문헌 [Lawyer et al., supra] 에 기술되어 있다.
일단 정제되면, DNA 중합효소의 3'-미스매치 구별이 검정될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 구현예에서, 3'-미스매치 구별 활성은, 프라이머의 3-말단에서 단일 염기 미스매치를 갖는 표적의 증폭에 대해 프라이머로 완벽히 매칭되는 표적 서열의 증폭을 비교함으로써 측정된다. 증폭은, 예를 들어, TaqManTM 탐침의 사용에 의해 실시간 검출될 수 있다. 2 개의 표적 서열 사이를 구분하기 위한 중합효소의 능력은 2 개 반응의 Cp 를 비교함으로써 추정될 수 있다. 임의적으로는, 각 웰에서 제 2 표적 유전자의 동시 증폭이 수행될 수 있고 대조군으로서 제 2 의 최적 채널에서 검출된다. "델타 Cp 값" 은, 미스매칭되는 주형 - 매칭되는 표적의 Cp 사이에서 값의 차이를 지칭한다 (예를 들어, 실시예 참조). 몇몇 구현예에서, 본 발명의 개선된 중합효소는 SEQ ID NO:8 의 위치 X10 에서 천연 아미노산 (예를 들어, E) 을 갖는 동일한 대조군 중합효소에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 델타 Cp 값을 갖는다. 몇몇 구현예에서, 이러한 측정은 실시예에 제시된 정확한 재료 및 조건으로 제조된다.
본 발명의 방법
본 발명의 개선된 DNA 중합효소는 그러한 효소 활성이 요구되는 임의의 원하는 목적으로 사용될 수 있다. 개선된 DNA 중합효소는 본원에 기술된 바와 같은 열활성 또는 열안정성 DNA 중합효소일 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명의 중합효소를 사용하는, PCR 을 포함하는 폴리뉴클레오티드 신장 방법이 제공된다. 몇몇 구현예에서, 본 발명은, 주형 핵산의 증폭이 표적 핵산의 존재를 즉시 검출하기 위해 요구될 때 RNA 또는 DNA 주형을 확장시키기 위해 유용한 열활성 NDA 중합효소를 제공한다. 몇몇 구현예에서, 본 발명은 표적 핵산을 확장하고/하거나 증폭하기 위해 요구될 때 유용한 열안정성 DNA 중합효소를 제공한다. 폴리뉴클레오티드 신장에 적합한 조건은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., supra] 참조). 또한, 문헌 [Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (4th ed., John Wiley & Sons 1999)] 을 참조한다. 일반적으로, 프라이머는 어닐링되고, 즉 프라이머-주형 착물을 형성하기 위해 표적 핵산으로 하이브리드화된다. 프라이머-주형 착물은 프라이머의 3'-말단으로 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가를 허용하기 위해 적합한 환경에서 돌연변이체 DNA 중합효소 및 뉴클레오시드 트리포스페이트와 접촉되어, 이로써 표적 핵산에 상보적인 확장된 프라이머가 제조된다. 프라이머는 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체(들)을 포함할 수 있다. 또한, 뉴클레오시드 트리포스페이트는 통상적인 뉴클레오티드, 통상적이지 않은 뉴클레오티드 (예를 들어, 리보뉴클레오티드 또는 라벨링된 뉴클레오티드), 또는 이의 혼합물일 수 있다. 몇몇 변형에서, 폴리뉴클레오티드 신장 반응은 표적 핵산의 증폭을 포함한다. DNA 중합효소 및 프라이머 쌍을 사용하는 핵산 증폭에 적합한 조건은 또한 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, PCR 증폭 방법) (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supra; PCR Applications: Protocols for fucntional Genomics (Innis et al. eds., Academic Press 1999] 참조).
몇몇 구현예에서, 3'-미스매치 구별이 증가된 존재하는 중합효소의 사용은, 예를 들어, 희귀한 대립형질 검출에 대해 허용된다. 예를 들어, 특정 중합효소의 3'-미스매치 구별의 정확도가 이의 민감도를 설정한다 (상이하나 이에 관련된 비-표적 서열의 다량의 존재 하에 표적 서열의 소량을 정확히 검출하기 위한 능력). 따라서, 3'-미스매치 구별이 증가된 것은 희귀 대립형질의 검출을 위한 더 큰 민감도를 생성한다. 희귀 대립형질 검출은, 유전적으로 희귀한 변화에 대한 기타 샘플, 예를 들어, 정상 세포의 질량에서 암 대립형질을 보유하는 세포를 생검 선별할 때 유용하다.
몇몇 구현예에서, 개선된 중합효소는 대립형질 특이적 PCR 또는 단일 뉴클레오티드 다형 (SNP) 검출에서 폴리뉴클레오티드 신장에 사용된다. 예시적인 SNP 검출 방법이 하기 문헌에 기술되어 있다: [Chen et al., "Single nucleotide polymorphism genotyping: biochemistry, protocol, cost and throughput" Pharmacogenomics J. 3 (2): 77-96 (2003)]; [Kwok et al., "Detection of single nucleotide polymorphisms" Curr. Issues Mol. Biol. 5(2):43-60 (April 2003)]; [Shi, "Technologies for individual genotyping: detection of genetic polymorphisms in drug targets and disease genes" Am. J. Pharmacogenomics 2(3): 197-205 (2002)]; 및 [Kwok, "Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms" Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:235-58 (2001)]. 고-처리량 SNP 검출에 대한 예시적인 기술이 하기 문헌에 기술되어 있다: [Marnellos, "High-throughput SNP analysis for genetic association studies" Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 6(3):317-21 (May 2003)]. 통상적인 SNP 검출 방법은 하기를 포함하나 이에 한정되지 않는다: TaqMan 검정, 분자 봉화 검정, 핵산 어레이, 대립형질-특이적 프라이머 신장, 대립형질-특이적 PCR, 정렬되는 프라이머 신장, 동종 프라이머 신장 검정, 질량 분광분석으로 검출되는 프라이머 신장, 피로서열화, 유전적 어레이에 대해 분류되는 다중 프라이머 신장, 롤링 서클 증폭과의 결찰, 동종 결찰, OLA (미국 특허 제 4,988,167 호), 유전적 어레이에 대해 분류되는 다중 결찰 반응, 제한-단편 길이 다형, 단일 염기 신장-태그 검정, 및 Invader 검정. 그러한 방법은, 예를 들어, 발광 또는 화학발광 검출, 형광 검출, 시간-분해 형광 검출, 형광 공명 에너지 이동, 형광 극성화, 질량 스펙트럼분석, 및 전기 검출같은 검출 기전과 조합되어 사용될 수 있다.
다중의 상이한 대립형질의 검출은 또한 다중 반응을 사용하여 완성될 수 ldT고, 이는 단일 반응에서 다중의 상이한 대립형질의 검출을 허용한다. 다중 반응에서, 둘 이상의 대립형질-특이적 프라이머가 확장되어 사용되고, SNP 를 증폭시키거나 다중 뉴클레오티드 다형 또는 대립형질을 증폭시킨다. 단일 및 다중 뉴클레오티드 다형의 다중 검출을 위한 예시적인 방법은 미국 특허 공보 제 2006/0172324 호에 기술되어 있다.
본원에 기술되는 개선된 중합효소를 사용하는 신장 생성물 또는 증폭 생성물을 검출하기 위한 다른 방법은 형광 이중-가닥 뉴클레오티드 결합 염료 또는 형광 이중-가닥 뉴클레오티드 삽입 염료의 사용을 포함한다. 형광 이중-가닥 DNA 결합 염료의 예는 SYBR-그린 (Molecular Probes) 을 포함한다. 형광 이중-가닥 삽입 염료의 예는 에티듐 브로마이드를 포함한다. 이중 가닥 DNA 결합 염료는, 프라이머 신장 생성물 및/또는 증폭 생성물를 측정하기 위해 용융 곡선 분석과 결합되어 사용될 수 있다. 용융 곡선 분석은, 온보드 소프트웨어 (SDS 2.1) 를 갖는 ABI 5700/7000 (96 웰 포맷) 또는 ABI 7900 (384 웰 포맷) 장치와 같은 실시간 PCR 장치에서 수행될 수 있다. 대안적으로는, 용융 곡선 분석은 종결점 분석으로서 수행될 수 있다. 용융점 분석의 예시적인 방법은 미국 특허 공보 제 2006/0172324 호에 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 중합효소는 DNA 서열화, DNA 라벨링, 또는 프라이머 신장 생성물의 라벨링에서 프라이머 신장을 위해 사용된다. 예를 들어, "Sanger" 디데옥시뉴클레오티드 방법 (문헌 [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463, 1977]) 에 의한 DNA 서열화는, 통상적이지 않은 사슬-말단 뉴클레오티드를 혼입할 수 있는 중합효소에 대해 본 발명에 의해 개선된다.
기본 "Sanger" 방법에서 발전하여 새로운 벡터 (문헌 [Yanisch-Perron et al., Genes 33:103-119, 1985]) 및 염기 유사체가 제공되어 있다 (문헌 [Mills et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2232-2235, 1979]; 및 [Barr et al., Biotechniques 4:428-432, 1986]). 일반적으로, DNA 서열화는 크기에 의해 후속 분리되는 부분 단편의 분포를 생성하는, 사슬-말단 염기 유사체의 존재에서 주형-의존적 프라이머 신장을 요구한다. 기본 디데옥시 서열화 절차는 하기를 포함한다: (i) 임의적으로는 라벨링된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 주형에 어닐랑하는 것; (ii) 4 개의 별도의 반응에서 DNA 중합효소를 갖는 프라이머를 확장하는 것, 임의 라벨링되는 하나의 사슬 말단화제 예컨대 ddNTP 의 양을 제한하고 라벨링되지 않은 dNTP 의 혼합물을 함유하는 별도의 4 개의 반응에서 DNA 중합효소로 프라이머를 확장하는 것; 및 (iii) 반응 생성물의 4 개의 세트를 고해상도 변성 폴리아크릴아미드/우레아 겔에 대해 분해하는 것. 반응 생성물은 뉴클레오티드 서열을 부여하기 위해 자가방사기록법 또는 형광 검출에 의해 겔에서 검출될 수 있고 (사용되는 라벨에 의존적임), 이미지는 뉴클레오티드 서열을 부여하기 위해 조사될 수 있다. 이들 방법은 E. coli Pol I 또는 변형된 T7 DNA 중합효소의 Klenow 단편과 같은 DNA 중합효소를 이용한다.
Taq DNA 중합효소와 같은 열안정성 중합효소의 이용가능성은, 열안정성 DNA 중합효소와의 서열화를 위한 개선된 방법을 야기하며 ([Innis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9436, 1988] 참조), 이의 변형은 "사이클 서열화: 로서 지칭된다 (Murray, Nuc Acids Res. 17:8889, 1989). 따라서, 본 발명의 열안정성의 중합효소는 그러한 방법과 조합하여 사용될 수 있다. 염기성 디데옥시 서열화에 대한 대안으로서, 사이클 서열화는 사슬 종결제의 존재 하에 주형 서열에 상보적인 표적 서열의 선형의 비대칭 증폭이다. 단일 사이클은 모든 가능한 길이의 신장 생성물의 패밀리를 제조한다. DNA 주형으로부터 신장 반응 생성물의 변성에 따르면, 프라이머 어닐링 및 프라이머 신장의 다중 사이클은 ddNTP 와 같은 종결제의 존재 하에 발생한다. 사이클 서열화는 통상적인 사슬-종결 서열화 보다 적은 주형 DNA 를 요구한다. 열안정성 DNA 중합효소는 사이클 서열화에서 많은 이점이 있는데, 각 사이클에서 발생하는 고온 변성 (예를 들어, 90-95 ℃)의 다중 사이클에 내성이 있고 핵산 표적에 대해 프라이머의 특이적 하이브리드화에 대해 요구되는 엄격한 어닐링 온도에 내성이 있다. 이러한 이유로, AMPLITAQ® DNA 중합효소 및 이의 유도체 및 자손은, 예를 들어, AmpliTaq CS DNA 중합효소 및 AmpliTaq FS DNA 중합효소는 Perkin-Elmer (Norwalk, CT) 및 Applied Biosystems (Foster City, CA) 와 같은 회사에 의해 시판되는 Taq 사이클 서열화 키트에 포함되어 있다.
개선된 중합효소는 454 서열화 (Roche) 에 사용된다 (Margulies, M et al. 2005, Nature, 437, 376-380). 454 서열화는 2 개의 단계를 포함한다. 제 1 단계에서, DNA 은 대략 300-800 염기 쌍의 단편으로 절단되고, 단편은 둔해진 말단을 갖는다. 이후, 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단편의 말단에 라이게이션된다. 어댑터는 단편의 증폭 및 서열화에 대한 프라이머로서 제공된다. 단편은 5'-비오틴 태그를 함유하는 어댑터 B 를 사용하여 DNA 포획 비드, 예를 들어, 스트렙타비딘-코팅된 비드에 부착될 수 있다. 비드에 부착되는 단편은, 유-수 에멀젼의 액적 내에서 PCR 증폭된다. 하나의 비드 상에서 복제적으로 증폭된 DNA 단편의 다중 복사본이 생성된다. 제 2 단계에서, 비드는 웰에서 포획된다 (피코-리터 크기). 피로서열화는 평행적으로 각 DNA 단편에 대해 수행된다. 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가는 서열화 장치에서 CCD 카메라에 의해 기록되는 광 신호를 생성한다. 신호 강도는, 혼입되는 뉴클레오티드의 수에 비례한다.
피로서열화는, 뉴클레오티드 첨가에 따라 방출되는 피로포스페이트 (PPi) 를 사용한다. PPi 은 아데노신 5'-포스포술페이트의 존재 하에 ATP 술푸릴라아제에 의해 ATP 로 전환된다. 루시퍼라아제는 루시페린을 옥시루시페린으로 전환하기 위해 ATP 를 사용하고, 이러한 반응은 검출되고 분석되는 광을 생성한다.
사슬 종결 서열화 방법의 변형은, 염료-프라이머 서열화 및 염료-종결자 서열화를 포함한다. 염료-프라이머 서열화에서, ddNTP 종결제는 라벨링되지 않고, 라벨링된 프라이머는 신장 생성물을 검출하기 위해 이용된다 (Smith et al., Nature 32:674-679, 1986). 염료-종결자 DNA 서열화에서, DNA 중합효소는 DNA 프라이머의 말단 상에 형광 라벨링된 ddNTP 및 dNTP 를 혼입하기 위해 사용된다 (Lee et al., Nuc. Acids. Res. 20:2471, 1992). 이러한 공정은, 염료 라벨링된 프라이머를 합성하지 않는다는 이점을 제공한다. 더욱이, 염료-종결자 반응은, 모든 4 개의 반응이 동일한 튜브에서 수행될 수 있다는 점에서 보다 편리하다.
둘 모두의 염료-프라이머 및 염료-종결자 방법은 "Applied Biosystems" (Foster City, CA) (미국 특허 제 5,171,534) 에 의해 제조되는 자동 서열화 장치를 사용하여 자동화될 수 있다. 장치를 사용할 때, 완려된 서열화 반응 혼합물은, 장치에 마운팅되는 변성 폴리아크릴아미드 겔 또는 모세관 상에서 분획화된다. 장치의 바닥에서 레이져는 겔을 통해 크기에 따라 전기영동으로 분리되는 것으로서 형광 생성물을 검출한다.
형광 염료의 2 개의 유형은, 염료-종결자 서열화가 음성적으로 전하되고 양쪽성 형광 염료에 대해 사용되는 종결제를 라벨링하기 위해 통상적으로 사용된다. 음성 전하를 띄는 형광 염료는 플루오세인 및 BODIPY 패밀리의 것을 포함한다. BODIPY 염료 (4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센) 는 국제 특허 공보 제 WO 97/00967 호에 기술된다. 양쪽성 형광 염료는 로다민 패밀리의 것을 포함한다. 시판되는 사이클 서열화 키트는 종결제 라벨링된 로다민 유도체로 라벨링된 종결제를 사용한다. 그러나, 로다민-라벨링된 종결제는 다소 비용이 있으며 생성물은 서열화 생성물로 공동-이동하기 때문에 겔 상에 로딩되기 전에 혼입되지 않은 염료-ddNTP 로부터 분리되어야만 한다. 로다민 염료 패밀리 종결제는 GC-풍부 영역에서 헤어핀 구조를 안정화시키는 것으로 보이며, 이는 변칙적으로 이주하는 생성물을 야기한다. 이는 dITP 의 사용을 포함할 수 있고, 이는 2차 구조를 완화하나 또한 종결제의 혼입의 효율에 영향을 미친다.
대조적으로, 플루오세인-라벨링된 종결제는, 서열화 생성물 보다 신속하게 이주하고 더욱 큰 네트 음성 전하를 가지기 때문에 겔 로딩 전에 분리 단계를 제거한다. 또한, 플루오세인-라벨링된 서열화 생성물은 로다민으로 라벨링된 서열화 생성물 보다 더 양호한 전기화학 이주를 갖는다. 야생형 Taq DNA 중합효소가 플루오세인 패밀리 염료로 라벨링된 종결제를 효율적으로 혼입하지 않으나, 이는 미국 특허 출원 공보 제 2002/0142333 호에 기술된 바와 같이 변형된 효소를 효율적으로 사용함으로써 수행될 수 있다. 따라서, US 2002/0142333 에 기술된 바와 같은 변형은, 프라이머 신장율이 개선된 플루오세인-패밀리-염료-혼입되는 열안정성 중합효소를 제조하기 위해 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 변형되지 않은 DNA 중합효소는 US 2002/0142333 에 기술된 바와 같은 변형된 열안정성 중합효소이고 US 2002/0142333 및 SEQ ID NO:8 에 제시된 모티프 (또는 SEQ ID NO:9, 10 또는 11 의 모티프), 및 임의적으로는 SEQ ID NO:27 의 모티프를 갖는다.
본 발명의 돌연변이체 DNA 중합효소가 사용될 수 있는 다른 예시적인 핵산 서열화는 리보뉴클레오티드의 2'-PO4 유사체를 포함하는 종결자 화합물을 관계된 것을 포함한다 (참조, 예를 들어, 미국 출원 공보 제 2005/0037991 호 및 제 2005/0037398 호, 및 미국 특허 출원 제 12/174,488 호).
키트
본 발명의 또다른 양태에서, 키트는 본원에 기술되는 프라이머 신장 방법에 사용되기 위해 제공된다. 몇몇 구현예에서, 키트는 본 발명에 따른 3'-미스매치 구별이 증가된 본 발명의 DNA 중합효소를 제공하는 하나 이상의 용기를 사용하고 이를 함유하여 구분된다. 추가의 시약(들)을 제공하는 하나 이상의 추가의 용기가 또한 포함될 수 있다. 그러한 추가의 용기는 상기 기술되는 방법에 따른 프라이머 신장 절차에 사용되기 위한 당업자에 의해 인지되는 임의의 시약 또는 다른 요소를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 핵산 증폭 절차 (예를 들어, PCR, RT-PCR), DNA 서열화 절차, 또는 DNA 라벨링 절차에 사용되기 위한 시약을 포함하는, 상기 기술되는 방법에 따른 프라이머 신장 절차에 사용되는 당업자에 의해 인지되어 있는 임의의 시약 또는 기타 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 키트는 또한 소정의 폴리뉴클레오티드 주형, 또는 5'-센스 프라이머 및 상응하는 3'-안티센스 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍에 대한, 프라이머 신장 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 5'-센스 프라이머를 제공하는 용기를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 키트는, 프라이머는 상기 기술되는 바와 같이 다중 반응에 유용한 단일 뉴클레오티드 다형 또는 다중 뉴클레오티드 다형에 대해 완전히 상보적인 하나 이상의 프라이머를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 다른 비-돌연변히적으로 배제되는 변이체이서, 키트는 뉴클레오시드 트리포스페이트 (통상적인 것 및/또는 통상적이지 않은 것) 를 제공하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 특정 구현예에서, 키트는 알파-포스포로티오에이트 dNTP, dUTP, dITP, 및/또는 라벨링된 dNTP 예컨대, 예를 들어, 플루오세인- 또는 시아닌-염료 패밀리 dNTP 를 포함한다. 다른 비-돌연변이적으로 배제되는 구현예에서, 키트는 프라이머 신장 반응에 적합한 완충제를 제공하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 키트는 하나 이상의 라벨링된 또는 라벨링되지 않은 탐침을 포함한다. 탐침의 예는 이중-라벨링된 FRET (형광 공명 에너지 이동) 탐침 및 분자 비콘 탐침을 포함한다. 다른 구현예에서, 키트는 예를 들어 고온 출발 PCR 검정에 대한 앰타머를 함유한다.
반응 혼합물
본 발명의 또다른 양태에서, 상기 기술되는 바와 같이 3'-미스매치 구별이 증가된 중합효소를 포함하는 반응 혼합물이 제공된다. 반응 혼합물은 또한 예를 들어, 핵산 증폭 절차 (예를 들어, PCR, RT-PCR), DNA 서열화 절차, 또는 DNA 라벨링 절차에 사용되기 위한 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 반응 혼합물은 프라이머 신장 반응에 적합한 완충제를 포함한다. 반응 혼합물은 또한, 주형 핵산 (DNA 및/또는 RNA), 하나 이상의 프라이머 또는 탐침 폴리뉴클레오티드, 뉴클레오시드 트리포스페이트 (예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 라벨링된 뉴클레오티드, 통상적이지 않은 뉴클레오티드 포함), 염 (예를 들어, Mn2 +, Mg2 +), 및 라벨 (예를 들어, 형광물질) 을 함유할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 반응 혼합물은 또한 이중-가닥 DNA 결합 염료, 예컨대 SYBR 그린, 또는 이중 가닥 DNA 삽입 염료, 예컨대 에티듐 브로마이드를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 반응 혼합물은, 프라이머 신장 조건 하에서, 5'-센스 프라이머 및 상응하는 3' 안티센스 프라이머를 포함하는 소정의 폴리뉴클레오티드 주형, 또는 프라이머 쌍에 하이브리드 가능한 5'-센스 프라이머를 함유한다. 특정 구현예에서, 반응 혼합물은 또한 증폭되는 주형 핵산, 예를 들어 Taqman® 탐침의 검출을 위한 형광발광 생성 FRET 가수분해 탐침을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 반응 혼합물은 단일 뉴클레오티드 다형 또는 다중 뉴클레오티드 다형에 완전히 상보적인 둘 이상의 프라이머를 함유한다. 몇몇 구현예에서, 반응 혼합물은 알파-포스포로티오에이트 dNTP, dUTP, dITP, 및/또는 라벨링된 dNTP 예컨대, 예를 들어, 플루오세인- 또는 시아닌-염료 패밀리 dNTP 을 함유한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공되나, 이로써 한정되지는 것은 아니다.
실시예 1: 3'- 미스매치 구별이 증가된 돌연변이체 DNA 중합효소의 확인
Z05 D580G 중합효소에서의 돌연변이를, 주형에 대해 3'-미스매치를 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 확장하기 위한 능력이 감소되었는지 여부를 확인하였다. 간단히 말하면, 이러한 스크리닝 공정에 포함되는 단계는, 돌연변이체 효소의 라이브러리 생성, 발현 및 부분 정제, 원하는 특성을 위한 효소의 스크리닝, DNA 서열화, 클로날 정제, 및 선택되는 후보 돌연변이체의 특성화이다. 이들 각 단계를 하기에 기술한다.
클로날 라이브러리 생성: Z05 D580G DNA 중합효소의 중합효소 도메인을 인코딩하는 핵산을 이러한 핵산 서열을 포함하는 플라스미드의 Blp I 및 Bgl II 제한 부위 사이의 에러나기 쉬운 (돌연변이생성) PCR 으로 처리하였다. 증폭되는 서열을 SEQ ID NO:33 으로서 제공하였다. 이에 사용되는 프라이머는 하기와 같다:
진행방향 프라이머: 5'-CTACCTCCTGGACCCCTCCAA-3' (SEQ ID NO:31); 및,
역방향 프라이머: 5'-ATAACCAACTGGTAGTGGCGTGTAA-3' (SEQ ID NO:32).
PCR 을 돌연변이율 범위 내에서 라이브러리를 생성하기 위해, 1.8-3.6 mM 으로부터 Mg2 + 농도 범위를 사용하여 수행하였다. 완충제 조건은 50 mM Bicine pH 8.2, 115 mM KOAc, 8% w/v 글리세롤, 및 0.2 mM 각각 dNTP 였다. GeneAmp® AccuRT Hot Start PCR 효소를 0.15 U/㎕ 에서 사용하였다. 50 ㎕ 반응 부피 당 선형화된 Z05 D580G 플라스미드 DNA 의 5x105 복사본으로 출발하는 반응을, 60 초 동안 94 ℃ 의 온도를 사용하여 변성시키고, 증폭의 30 사이클을 수행하였다 (15 초 동안 94 ℃ 의 변성 온도, 15 초 동안 60 ℃ 의 어닐링 온도, 120 초 동안 72 ℃ 의 신장 온도, 및 이어서 5 분 동안 72 ℃ 의 온도에서 최종 신장).
생성되는 앰플리콘을 "QIAquick PCR Purification Kit" (Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA) 로 정제하고, Blp I 및 Bgl II 으로 절단하고, 이어서 "QIAquick PCR Purification Kit" 로 재-정제하였다. Z05 D580G 벡터 플라스미드를 동일한 2 개의 제한 효소로 절단하고 알칼리 포스페이타아제로 처리하고, 재조합하고 (RAS, cat# 03359123001) "QIAquick PCR Purification Kit" 로 정제함으로써 제조하였다. 절단 벡터 및 돌연변이된 삽입체를 1:3 비로 혼합하고 실온에서 5 분 동안 T4 DNA 리가아제로 처리하였다 (NEB Quick Ligation™ Kit). 결찰을 "QIAquick PCR Purification Kit" 로 정제하고 전기영동에 의해 E.coli 숙주 균주로 형질전환시켰다.
발현되는 배양액의 분취액을 암피실린-선택적 배지에 플레이팅하여 각 형절전환에서 독특한 형질전환체의 수를 결정하였다. 형질전환체를 크리오-보호제로서 글리세롤의 존재 하에 -70 ℃ 내지 -80 ℃ 에서 저장하였다.
이후, 각 라이브러리를 다량 포맷의 암피실린-선택적 아가 플레이트 상에 퍼트렸다. 개개의 콜로니를, 자동 콜로니 픽커 (QPix2, Genetix Ltd) 를 사용하여 암피실린 및 10% w/v 글리세롤을 갖는 2X Luria 브로쓰를 함유하는 384-웰 플레이트로 이동시켰다. 이들 플레이트를 30 ℃ 에서 밤새 인큐베이션하여 배양액이 배양되도록 하였고 이어서 -70 ℃ 내지 -80 ℃ 에서 저장하였다. 2X Luria 브로쓰에 첨가된 글리세롤은, 배양 성장을 제공하기에 충분히 낮으나 크리오-보조제를 제공하기에는 충분히 높다. 수 개의 돌연변이생성 (Mg2 +) 수준에서 수 천개의 콜로니를 이후 사용하는 방식으로 제조하였다.
추출 라이브러리 제조 파트 1 - 발효: 상기 기술된 클로날 라이브러리부터, 스크리닝 목적에 적합한 부분적으로 정제된 추출물의 상응하는 라이브러리를 제조하였다. 이러한 공정의 제 1 단계는 각 클론의 소-스케일 발현 배양액을 제조하기 위한 것이었다. 이들 배양액은 96-웰 포맷에서 배양시키고; 따라서 각 384-웰 라이브러리 플레이트에 대한 4 개의 발현 배양 플레이트가 존재하였다. 클로날 플레이트의 각 웰로부터 0.5 ㎕ 를 96 웰 시드 플레이트 (배지 A 의 150 ㎕ 함유) 의 웰에 이동시켰다 (하기 표 3 참조). iEMS 플레이트 인큐베이터/진탕기 (ThermoElectron) 에서 이러한 시드 플레이트를 30 ℃ 에서 1150 rpm 에서 밤새 진탕시켰다. 이어서, 다량 포맷 96 웰 플레이트 (Nunc # 267334) 에서 250 ㎕ 배지 A 로 20 ㎕ 를 접종하는 시점에서, 이들 시드 배양액을 동일한 배지를 접종하기 위해 사용하였다. 이들 플레이트를 진탕하면서 37 ℃ 에서 밤새 인큐베이션하였다. 발현 플라스미드는 전사 대조군 요소를 함유하였고, 이는 30 ℃ 에서가 아닌 37 ℃ 에서 발현을 허용하였다. 밤새 인큐베이션 후, 배양액은 전형적으로는 1-10% 의 총 세포 단백질에서 클론 단백질을 배양시켰다. 이들 배양액으로부터 세포를 원심분리로 수확하였다. 이들 세포는 냉동시키거나 (-20 ℃) 즉시 가공시켰다 (후술되는 바와 같음).
[표 2] 배지 A (사용전 필터-살균)
Figure 112012104951131-pct00004
추출 라이브러리 제조 파트 2 - 추출:
발효 단계로부터 세포 펠릿을 25 ㎕ 용균 완충제 (하기 표 3) 에서 재현탁시키고 384-웰 써모사이클러 플레이트로 이동시키고 밀봉시켰다. 완충제는 세포 용균을 보조하기 위해 라이소좀을 함유했고, 추출물로부터 DNA 를 제거하기 위해 DNase 를 함유함을 숙지한다. 세포를 용해하기 위해 플레이트를 15 분 동안 37 ℃ 에서 인큐베이션하였고, -20 ℃ 에서 밤새 냉동시키고, 15 분 동안 37 ℃ 에서 다시 인큐베이션하였다. 암모늄 술페이트를 첨가하고 (2 M 용액 1.5 ㎕) 플레이트를 15 분 동안 75 ℃ 에서 인큐베이션하여 단백질을 침전시키고 오염된 단백질을 불활성화시켰다 (첨가된 외인성 뉴클레아제를 포함). 플레이트를 4 ℃ 에서 15 분 동안 3000 x g 에서 원심분리하고 상청액을 신선한 384-웰 써모사이클러 플레이트에 이동시켰다. 이들 추출 플레이트를 스크린에서 이후 사용을 위해 -20 ℃ 에서 냉동시켰다. 각각의 웰은 돌연변이체 라이브러리 중합효소 효소의 약 0.5-3 ㎕ 를 함유했다.
[표 3] 용균 완충제
Figure 112012104951131-pct00005
3'- 프라이머 미스매치 신장율이 감소된 추출 라이브러리의 스크리닝: 올리고뉴클레오티드 주형에 대해 완벽히 매칭되는 프라이머의 신장율 대 3' G:T 미스매치를 갖는 프라이머의 신장율을 비교함으로써 추출 라이브러리를 스크리닝하였다.
상기 효소 추출액을, 384-웰 써모사이클러 플레이트에서 20 mM Tris-HCl, pH 8, 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 및 0.2% Tween-20 을 함유하는 완충제 22.5 ㎕ 와 추출액 2.5 ㎕ 을 결합함으로써 프라이머 신장 반응에 대해 10-배 희석시키고, 피복하고, 90 ℃ 에서 10 분 동안 가열시켰다. 프라이머와 완벽히 매칭되는 대조군 반응물을 384-웰 PCR 플레이트에서 15 ㎕ 마스터 믹스와 희석 추출물 0.5 ㎕ 과 결합시켰다. 전성 주형의 신장을 CCD 카메라를 사용하여 변형된 열 사이클로에서 매 10 초 모니터링하였다 (참조, Watson, supra). 마스터 믹스는 50 nM 전성 프라이머 주형, 25 mM Tricine, pH 8.3, 100 mM KOAc, 0.6X SYBR 그린 I, 200 μM 각 dNTP, 100 nM 앱타머, 및 2.5 mM 마그네슘 아세테이트를 함유했다. 백그라운드 형광으로부터 신장-유래 형광을 구분하기 위해, 프라이머 가닥 신장이 반응 마스터 믹스로부터 뉴클레오티드를 남겨두어 예방되는 실험에서 평행 웰을 인큐베이션하였다. 3'-미스매칭된 프라이머를 갖는 반응을, 1.5 ul 희석 추출물을 각 반응에 첨가하고 1.5 mM 망간 아세테이트를 마그네슘 아세테이트 대신 대체한다는 점을 제외하고는 상기와 같이 수행하였다. 추출물의 양을 3 배로 증가시키는 것 및 금속 활성화제로서 망간을 사용하는 것은, 둘 모두 미스매치 신장을 보다 적당하게 만들고 따라서 3'-미스매치 신장에 대항하여 차별하기 위한 가장 큰 능력을 갖는 효소에 대해 스크린의 선택성을 개선시킨다.
대략 5000 개의 돌연변이체 추출물을 상기 프로토콜을 이용하여 스크리닝하였다. 대략 7% 의 본래의 풀을 부정의 컷오프 초과의 프라이머 신장 값을 완벽히 매칭하는 것 및 완벽한 매칭 신장율에 대한 낮은 미스매치에 기초하여 재스크리닝을 위해 선택하였다. 상부 추출물에 상응하는 배양액 웰을 신선한 성장 배지에 샘플링하고 최선의 돌연변이체를 함유하는 새로운 배양 플레이트를 제조하기 위해 재-성장시키고, 부모 배양액의 수를 비교를 위해 사용하였다. 이어서, 이들 배양 플레이트를 사용하여 본래의 스크린 표현형을 확인하기 위해 재스크리닝되는 신선한 추출물을 제조하기 위해 사용하였다. 완벽한 3'-매칭된 프라이머 및 3'-미스매칭된 프라이머를 갖는 반응물에 대한 프라이머 신장율을, 곡선의 선형 부분에 대한 시간에 따른 형광에서 증가 기울기로서 계산하였다. 완벽히 매칭된 신장 기울기에 의해 나누어진 미스매칭된 신장 기울기의 율을 랭크를 위해 사용하고 최선의 후보자를 선택하였다. 이들의 각각의 유전자형 및 표현형을 갖는 재스크리닝으로부터 선택된 클론 (+ 부모 클론 Z05 D580G 를 비교하기 위해) 을 하기 표에 포함시켰다.
[표 4]
Figure 112012104951131-pct00006
Z05 E493 위치에서 다양한 아미노산 치환: 대립형질-특이적 PCR 에서 미스매치 구별에 대한 Z05 DNA 중합효소의 E493 위치에서 다양한 치환의 결과를 시험하였다. 이들 치환은, 하나 또는 둘 모두의 효소에 대해 벡터로 PCR-기재 부위-지향 돌연변이생성 또는 클로닝 합성 유전자 단편에 의해 둘 모두의 Z05 DNA 중합효소 및 Z05 D580G DNA 중합효소를 생성하고, 발현되는 돌연변이체 효소를 정제하고 정량화하였다. Z05 E493 돌연변이체 G (글리신), K (라이신), 및 R (아르기닌); 및 Z05 D580G 돌연변이체 A (알라닌), G (글리신), K (라이신), 및 R (아르기닌) 를 대립형질-특이적 PCR 검정에서 이들 각각의 부모 효소와 비교하였다.
이러한 실시예의 대조군 DNA 중합효소는 하기이다: 위치 580 에서 아미노산이 글리신 (예를 들어, D580G 치환) (하기 본원에서 Z05 D580G 중합효소) 인 것을 예외로 하는 SEQ ID NO:1 의 써무스 종 (Thermus sp.) Z05 DNA 중합효소 또는 SEQ ID NO:1 의 써무스 종 (Thermus sp.) Z05 DNA 중합효소.
인간 BRAF 유전자의 영역을 증폭하는 프라이머를 사용하고, 상기 표적이 BRAF, V600K 의 코돈 600 에서 돌연변이를 가질 때 표적으로 완벽히 매칭된다. 인간 게놈 DNA 에 존재하는, 야생형 BRAF 표적에 대항하여, 대립형질 선택적 프라이머는 3'-말단에서 단일 A:C 미스매치를 생성한다. 통상적인 프라이머는 BRAF 유전자에 완벽히 매칭되고, 그 자체로 탐침 서열이고, 이는 실시간 TaqMan 검출 증폭을 허용한다. 각 반응은 16 ㎕ 의 최종 부피에서 BRAF V600R 돌연변이체 서열을 함유하는 10,000 개 또는 100 개 복사본의 선형화된 플라스미드 또는 10,000 개 복사본 (33 ng) 의 야생형 인간 게놈 세포주 DNA를 갖는다. 효소의 상이한 최적 염을 허용하기 위해, 25 내지 130 mM 의 KCl 농도 범위를 사용하여 증폭을 수행하였다. 완충제 조건은, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 2.5 mM MgCl2, 0.2 mM 각 dNTP, 0.02 U/㎕ UNG, 및 200 nM 앱타머였다. 진행방향 및 역방향 프라이머는 100 nM 이고 및 탐침은 25 nM 이다. 모든 DNA 중합효소를 20 nM 에서 검정하고 반응에 대해 2 % (v/v) 효소 저장 완충제 (50% v/v 글리세롤, 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Tween 20) 를 첨가하였다. 반응은 Roche LightCycler 480 열 사이클러에서 수행되고, 60 초 동안 95 ℃ 의 온도를 사용하여 변성되고, 이어서 증폭의 99 사이클을 수행하고, 10 초 동안 92 ℃ 의 변성 온도를 사용하고 30 초 동안 62 ℃ 의 어닐링 온도를 사용한다.
반응을 이중으로 수행하고, 교차점 "Cp" 를 "Abs Quant/2nd derivatived Max" 방법으로 계산하고 Cp 를 평균냈다. 가장 이른 10,000 개의 복사본 완벽 매칭 플라스미드 Cp 를 생성하는 KCl 농도에서 100 및 10,000 개의 복사본 완벽 매칭 플라스미드 반응의 기울기로부터 PCR 효율을 계산하였다. 고 복사본 델타 Cp 은, 3'-미스매칭된 야생형 게놈 표적의 10,000 개의 복사본을 갖는 반응의 Cp 값 및 완벽 매칭 플라스미드 표적의 10,000 개의 복사본을 갖는 반응의 Cp 값 사이의 차이와 동일하다.
가장 이른 고 복사본 플라스미드 Cp 를 생성하는 각 효소에 대한 KCl 농도에서 평균 Cp 값 및 계산되는 PCR 효율 및 고 복사본 델타 Cp 를 함유시켰다. Z05 DNA 중합효소의 위치 E493 에서 수 개의 아미노산 치환을 나타내는 데이타는 대립형질-선택적 PCR 을 미스매칭하는 프라이머의 개선된 구별을 야기한다.
[표 5] E493 돌연변이체 Z05 효소를 사용하는 인간 게놈 DNA 대 BRAF V600K 돌연변이체 플라스미드 증폭의 Cp
Figure 112012104951131-pct00007
이 실시예는 E493A, E493G, E493K, 및 E493R 돌연변이체 효소가, 대조군 중합효소, Z05 및 Z05 D580G 둘 다에 비해 희귀 대립형질 검출을 개선시킨다는 것을 설명한다.
실시예 2: E491K 돌연변이를 갖는 Taq DNA 중합효소
이 실시예는 3'-미스매치 구별이 증가되는 Taq DNA 중합효소의 E491 위치에서의 돌연변이를 나타낸다.
Z05 DNA 중합효소에서 E493 에 대한 상동 아미노산 위치는 Taq DNA 중합효소에서 E491 이다. E491K (라이신) 돌연변이를 함유하는 합성 DNA 단편을, Taq DNA 중합효소로 클로닝하고 발현 단백질을 정제하고 정량화하였다. 이후, Taq E491K DNA 중합효소를 대립형질-선택적 PCR 검정에서 부모 Taq DNA 중합효소와 비교하였다.
이 실시예의 대조군 DNA 중합효소는 SEQ ID NO:2 의 써무스 종 (Thermus sp.) Taq DNA 중합효소이다.
인간 BRAF 유전자의 영역을 증폭하고, 상기 표적이 BRAF, V600K 의 코돈 600 을 가질 때 표적으로 완벽히 매칭되는 프라이머를 사용하였다. 야생형 BRAF 표적에 대항하여 (인간 게놈 DNA 에 존재함), 대립형질 선택적 프라이머는 3' 말단에서 단일 A:C 미스매치를 생성한다. 통상적인 프라이머는 실시간 TaqMan 검출 증폭을 허용하는 BRAF 유전자 (그 자체로 탐침 서열) 에 완벽히 매칭된다. 각 반응은, 16 ㎕ 의 최종 부피에서 BRAF V600R 돌연변이체 서열을 함유하는 선형화된 플라스미드의 10,000 또는 100 개의 복사본, 또는 야생형 인간 게놈 세포주 DNA 의 10,000 개의 복사본 (33 ng) 을 가졌다. 효소의 상이한 최적 염을 허용하기 위해, 25 내지 130 mM 의 KCl 농도 범위를 이용하여 증폭을 수행하였다. 완충제 조건은, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 2.5 mM MgCl2, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dCTP, 0.2 mM dGTP, 0.4 mM dUTP, 0.2 μM 앱타머, 및 0.02 U/㎕ UNG 였다. 진행방향 및 역방향 프라이머는 100 nM 였고 탐침은 25 nM 였다. 모든 DNA 중합효소를 20 nM 에서 검정하고 2 % (v/v) 효소 저장 완충제 (50% v/v 글리세롤, 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Tween 20) 를 반응물에 첨가하였다. 반응을 Roche LightCycler 480 열적 사이클러에서 수행하였고, 60 초 동안 95 ℃ 의 온도를 사용하여 변성하고, 이어서 10 초 동안 92 ℃ 의 변성 온도를 사용하여 증폭의 99 사이클을 수행하고, 30 초 동안 62 ℃ 의 어닐링을 수행하였다.
반응을 이중으로 하고, 교차점 ("Cp" 는 "Abs Quant/2nd derivative Max" 방법으로부터 계산됨) 및 Cp 를 평균 냈다. PCR 효율을 가장 이른 10,000 복사본 완벽 매칭 플라스미드 Cp 를 생성하는 KCl 농도에서 100 및 10,000 개의 복사본 완벽 매치 플라스미드 반응의 기울기로부터 계산하였다. 고 복사본 델타 Cp 은 3'-미스매칭된 야생형 게놈 표적의 10,000 개의 복사복을 갖는 반응의 Cp 값 및 완벽 매칭 플라스미드 표적의 10,000 개의 복사본을 갖는 반응의 Cp 값 사이의 차이와 동일하다.
표 6 은 가장 이른 고 복사복 플라스미드 Cp 가 생성되는 각 효소에 대한 KCl 농도에서 Cp 값의 평균치 및 PCR 효율 및 고 복사본 델타 Cp 를 계산치를 나타낸다. 데이타는, Taq DNA 중합효소에서 E491K 아미노산 치환이 대립형질-선택적 PCR 에서 프라이머 미스매치의 구별이 개선되는 것을 나타낸다.
[표 6] E491 돌연변이체 Taq 효소를 사용하는 인간 게놈 DNA 대 BRAF V600K 돌연변이체 플라스미드 증폭의 Cp
Figure 112012104951131-pct00008
이 실시예는 E491K 돌연변이체 효소가, 부모 대조군 효소 Taq 에 비해 희귀 대립형질 검출을 개선시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 3: 3'- 미스매치 구별이 증가된 추가의 돌연변이체 중합효소의 확인
이 실시예는 3'-미스매치 구별이 증가된 써무스 종 (Thermus sp.) Z05 DNA 중합효소의 위치 S488 에서 돌연변이를 갖는 중합효소를 나타낸다.
이러한 실시예의 대조군 DNA 중합효소는, 위치 580 에서 아미노산이 글리신 (예를 들어, D580G 치환) (이하 본원에서 Z05 D580G 중합효소) 인 것을 예외로 하고는, SEQ ID NO:1 의 써무스 종 (Thermus sp.) Z05 DNA 중합효소 및 SEQ ID NO:1 의 써무스 종 (Thermus sp.) Z05 DNA 중합효소이다.
반응을 이중으로 하고, 교차점 ("Cp") 을 "Abs Quant/2nd derivative Max" 방법에 의해 계산하고 Cp 를 평균냈다. 가장 이른 10,000 개의 복사본 완벽 매칭 플라스미드 Cp 를 생성하는 KCl 농도에서 100 내지 10,000 개의 복사본 완벽 매칭 플라스미드 반응의 기울기로부터 PCR 효율을 계산하였다. 고 복사본 델타 Cp 은 3'-미스매칭된 야생형 게놈 표적의 10,000 개의 복사본을 갖는 반응의 Cp 값 및 완벽 매칭된 플라스미드 표적의 10,000 개의 복사본을 갖는 반응의 Cp 값 사이의 차이와 동일하다.
반응 조건을 실시예 1 에 기술하였다. 표 7 은 가장 이른 고 복사본 플라스미드 Cp 및 계산된 PCR 효율 및 고 복사본 델타 Cp 를 생성하는 각 효소에 대한 KCl 농도에서 평균 Cp 값을 나타낸다. 표 7 에서의 데이타는, 대립형질-선택적 PCR 에서 프라이머 미스매치의 구별이 개선되는 것을 야기하는 Z05 DNA 중합효소의 위치 S488 에서 수 개의 아미노산 치환을 나타낸다.
[표 7] 인간 게놈 DNA 대 BRAF V600K 돌연변이체 플라스미드 증폭의 Cp
Figure 112012104951131-pct00009
이 실시예는 S488C, S448F, S488G, S488T, S488Y, S488A, S488D, 및 S488K 돌연변이체 효소가, 부모 대조군 효소, Z05 및 Z05 D580G 에 비해 희귀 대립형질 검출을 개선시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 4: 3'- 미스매치 구별이 증가된 추가의 돌연변이체 중합효소의 확인
이 실시예는, 중합효소가 3'-미스매치 구별이 증가된 써무스 종 (Thermus sp.) Z05 DNA 중합효소의 위치 F497 에서 다양한 치환을 갖는 것을 나타낸다. 이들 치환은 하나 또는 둘 모두의 효소에 대해 벡터로의 클로닝 합성 유전자 단편에 의해 둘 모두의 Z05 DNA 중합효소 및 Z05 D580G DNA 중합효소를 생성하고 발현되는 돌연변이체 효소를 정제하고 정량화하였다. Z05 F497 돌연변이체 A (알라닌), G (글리신), S (세린), T (트레오닌), 및 Y (티로신); 및 Z05 D580G 돌연변이체 D (아스파르트산), K (라이신) 및 S (세린) 을 대립형질-특이적 PCR 검정에서 각각의 부모 효소와 비교하였다.
이러한 실시예의 대조군 DNA 중합효소는, 위치 580 에서 아미노산이 글리신 (예를 들어, D580G 치환) (이하 본원에서 Z05 D580G 중합효소) 인 것을 예외로 하는, SEQ ID NO:1 의 써무스 종 Z05 DNA 중합효소 또는 SEQ ID NO:1 의 써무스 종 Z05 DNA 중합효소이다.
반응 조건은 실시예 1 에 기술되어 있다. 표 8 은, 가장 이른 고 복사본 플라스미드 Cp 를 생성하는 각 효소에 대한 KCl 농도에서 평균 낸 Cp 값 및 계산된 PCR 효율 및 고 복사본 델타 Cp 를 나타낸다. 데이타는, Z05 DNA 중합효소의 위치 F497 에서 수 개의 아미노산 치환이 대립형질-선택적 PCR 에서 프라이머 미스매치의 구별을 개선시킨다는 것을 나타낸다.
[표 8] F497 돌연변이체 Z05 효소를 사용하는 인간 게놈 DNA의 존재 하에 BRAF V600K 돌연변이체 플라스미드 증폭의 Cp
Figure 112012104951131-pct00010
이 실시예는, F497A, F497G, F497S, F497T, F497Y, F497D, 및 F497K 돌연변이체 효소가, 부모 대조군 효소, Z05 및 Z05 D580G 에 비해 희귀 대립형질 검출을 개선시킨다는 것을 나타낸다.
본원에 기술되는 실시예 및 구현예는 단지 설명할 목적으로 제공되며 당업자에 의해 이의 다양한 변형 또는 변경이 제안될 수 있음이 숙지될 것이다.
서열 목록 정보
Figure 112012104951131-pct00011
Figure 112012104951131-pct00012
Figure 112012104951131-pct00013

SEQ ID NO :8
A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L,
[이때 X6 은 S, G, A, D, F, K, C, T, 또는 Y; X10 은 E 이외의 아미노산; X13 은 F, A, G, S, T, Y, D 또는 K 임].
SEQ ID NO :9
A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-X10-R-V-L-F-D-E-L,
[이때 X10 은 E 이외의 아미노산임].
SEQ ID NO :10
A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-X10-R-V-L-F-D-E-L
[이때 X10 은 A, G, K 또는 R 임].
SEQ ID NO :11
A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-X10-R-V-L-F-D-E-L
[이때 X10 은 K 임].
Figure 112012104951131-pct00014

Figure 112012104951131-pct00015

SEQ ID NO :26 천연 공통 모티프
A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Q-X9-X10-X11-X12-L-X13-X14-X15-L,
[이때 X1 은 H, E, 또는 Q; X2 은 P, T, 또는 E; X3 은 N 또는 H; X4 은 L 또는 I; X5 은 N 또는 R; X6 은 S; X7 은 R, P, 또는 S; X8 은 D, K, 또는 T; X9 은 L 또는 V; X10 은 E, S, A, 또는 G; X11 은 R, N, Y, T, 또는 V; X12 은 V 또는 I; X13 은 F 또는 Y; X14 은 D 또는 E; 및 X15 은 E 또는 K 임].
SEQ ID NO :27 변형된 Z05 D580 모티프
T-G-R-L-S-S-X7-X8-P-N-L-Q-N
[이때 X7 은 Ser (S) 또는 Thr (T); 및 X8 은 Asp (D), 또는 Glu (E) 이외의 임의의 아미노산임].
SEQ ID NO :28 보존된 DNA 중합효소 활성 부위
DYSQIELR
Figure 112012104951131-pct00016
Figure 112012104951131-pct00017
Figure 112012104951131-pct00018
Figure 112012104951131-pct00019

SEQ ID NO :42
A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Q-X9-X10-X11-X12-L-X13-X14-X15-L,
[이때 X1 은 H, E, 또는 Q; X2 은 P, T, 또는 E; X3 은 N 또는 H; X4 은 L 또는 I; X5 은 N 또는 R; X6 은 임의의 아미노산; X7 은 R, P, 또는 S; X8 은 D, K, 또는 T; X9 은 L 또는 V; X10 은 E, S, A, 또는 G 이외의 임의의 아미노산; X11 은 R, N, Y, T, 또는 V; X12 은 V 또는 I; X13 은 임의의 아미노산; X14 은 D 또는 E; X15 은 E 또는 K 임].
SEQ ID NO :43
A-G-X1-P-F-N-X4-N-X6-X7-X8-Q-X9-X10-X11-X12-L-X13-X14-X15-L,
[이때 X1 은 H 또는 E; X4 은 L 또는 I; X6 은 임의의 아미노산; X7 은 R 또는 P; X8 은 D 또는 K; X9 은 L 또는 V; X10 은 E 또는 S 이외의 임의의 아미노산; X11 은 R 또는 N; X12 은 V 또는 I; X13 은 임의의 아미노산; X14 은 D 또는 E; 및 X15 은 E 또는 K 임].
SEQ ID NO :44
A-G-X1-P-F-N-X4-N-S-X7-X8-Q-X9-X10-R-X12-L-F-X14-X15-L,
[이때 X1 은 H 또는 E; X4 은 L 또는 I; X7 은 R 또는 P; X8 은 D 또는 K; X9 은 L 또는 V; X10 은 E 또는 S 이외의 임의의 아미노산; X12 은 V 또는 I; X14 은 D 또는 E; 및 X15 은 E 또는 K 임].
SEQ ID NO :45
A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L
[이때 X6 은 임의의 아미노산; X10 은 E 이외의 임의의 아미노산; 및 X13 은 임의의 아미노산임].
SEQ ID NO :46
A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L
[이때 X6 은 S 이외의 임의의 아미노산; X10 은 E 이외의 임의의 아미노산; 및 X13 은 F 이외의 임의의 아미노산임].
SEQ ID NO :47
A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L
[이때 X6 은 S, G, A, D, F, K, C, T, 또는 Y; X10 은 S, Q, A, G, K, 또는 R; 및 X13 은 F, A, G, S, T, Y, D 또는 K 임].
SEQ ID NO :48
A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L
[이때 X6 은 S, G, A, D, F, K, C, T, 또는 Y; X10 은 K; 및 X13 은 F, A, G, S, T, Y, D 또는 K 임].
SEQ ID NO :49
A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L
[이때 X6 은 S, G, A, D, F, K, C, T, 또는 Y; X10 은 R, K, A 또는 G; 및 X13 은 F, A, G, S, T, Y, D 또는 K 임].
SEQ ID NO :50
A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L
[이때 X6 은 S; X10 은 R, K, A 또는 G; 및 X13 은 F 임].
SEQ ID NO :51
T-G-R-L-S-S-X7-X8-P-N-L-Q-N
[이때 X7 은 S 또는 T; 및 X8 은 L, G, T, Q, A, S, N, R 또는 K 임].
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG Roche Diagnostics GmbH <120> DNA Polymerases With Increased 3'-Mismatch Discrimination <130> 26426 WO-HS <140> Not yet assigned <141> Not yet assigned <150> US 61/356,279 <151> 2010-06-18 <160> 51 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 834 <212> PRT <213> Thermus sp. <220> <223> Thermus sp. Z05 DNA polymerase (Z05) <400> 1 Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe 50 55 60 Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80 Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln 85 90 95 Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu 100 105 110 Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys 115 120 125 Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg 130 135 140 Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu 145 150 155 160 Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys 165 170 175 Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp 180 185 190 Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205 Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg 210 215 220 Val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu Asp 225 230 235 240 Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu 245 250 255 Glu Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270 Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly 275 280 285 Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro 290 295 300 Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp 305 310 315 320 Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Lys Glu Gly Arg Val His Arg 325 330 335 Ala Lys Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly 340 345 350 Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Asp 355 360 365 Leu Ala Pro Ser Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro 370 375 380 Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp 385 390 395 400 Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ala Glu Arg Leu Gln Gln 405 410 415 Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr 420 425 430 Gln Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala 435 440 445 Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu 450 455 460 Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala 465 470 475 480 Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu 485 490 495 Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly 500 505 510 Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His 515 520 525 Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys 530 535 540 Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly 545 550 555 560 Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu 565 570 575 Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu 580 585 590 Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu 595 600 605 Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu 610 615 620 Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile 625 630 635 640 His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Ser Pro Glu Ala Val 645 650 655 Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu 660 665 670 Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr 675 680 685 Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys 690 695 700 Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly 705 710 715 720 Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn 725 730 735 Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn 740 745 750 Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val 755 760 765 Lys Leu Phe Pro His Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln 770 775 780 Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu 785 790 795 800 Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala 805 810 815 Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala 820 825 830 Lys Gly <210> 2 <211> 832 <212> PRT <213> Thermus aquaticus <220> <223> Thermus equaticus DNA polymerase (Taq) <400> 2 Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val 50 55 60 Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu 85 90 95 Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu 100 105 110 Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys 115 120 125 Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp 130 135 140 Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro 165 170 175 Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn 180 185 190 Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu 195 200 205 Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu 210 215 220 Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe 260 265 270 Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 290 295 300 Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 305 310 315 320 Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro 325 330 335 Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu 340 345 350 Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro 355 360 365 Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 370 375 380 Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 385 390 395 400 Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu 405 410 415 Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 420 425 430 Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 450 455 460 Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 465 470 475 480 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495 Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 515 520 525 Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 530 535 540 Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 580 585 590 Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala 595 600 605 Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 610 615 620 Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr 625 630 635 640 Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 675 680 685 Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 690 695 700 Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 705 710 715 720 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg 725 730 735 Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765 Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 770 775 780 Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 785 790 795 800 Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu 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Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His 515 520 525 Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys 530 535 540 Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val His Pro Asn Thr Gly 545 550 555 560 Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu 565 570 575 Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu 580 585 590 Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu 595 600 605 Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu 610 615 620 Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile 625 630 635 640 His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Pro Glu Ala Val 645 650 655 Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu 660 665 670 Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr 675 680 685 Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys 690 695 700 Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly 705 710 715 720 Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn 725 730 735 Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn 740 745 750 Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val 755 760 765 Lys Leu Phe Pro Arg Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln 770 775 780 Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Gly Ala Glu Glu 785 790 795 800 Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala 805 810 815 Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Met Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala 820 825 830 Lys Gly <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA polymerase domain motif <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa = Ser, Gly, Ala, Asp, Phe, Lys, Cys, Thr or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa = any amino acid other than Glu <220> <221> VARIANT <222> (18)...(18) <223> Xaa = Phe, Ala, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp or Lys <400> 8 Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Xaa Arg Asp Gln Leu Xaa Arg Val 1 5 10 15 Leu Xaa Asp Glu Leu 20 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA polymerase domain motif <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa = any amino acid other than Glu <400> 9 Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Xaa Arg Val 1 5 10 15 Leu Phe Asp Glu Leu 20 <210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA polymerase domain motif <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa = Ala, Gly, Lys or Arg <400> 10 Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Xaa Arg Val 1 5 10 15 Leu Phe Asp Glu Leu 20 <210> 11 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA polymerase domain motif <400> 11 Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Lys Arg Val 1 5 10 15 Leu Phe Asp Glu Leu 20 <210> 12 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic region from polymerase domain of Thermus sp. Z05 DNA polymerase (Z05) <400> 12 Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser 1 5 10 15 Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala 20 25 30 Leu Gly Lys Thr 35 <210> 13 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic region from polymerase domain of Thermus aquaticus DNA polymerase (Taq) <400> 13 Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser 1 5 10 15 Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu Pro Ala 20 25 30 Ile Gly Lys Thr 35 <210> 14 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic region from polymerase domain of Thermus filiformus DNA polymerase (Tfi) <400> 14 Glu Ala Glu Val His Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser 1 5 10 15 Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu Pro Pro 20 25 30 Ile Gly Lys Thr 35 <210> 15 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic region from polymerase domain of Thermus flavus DNA polymerase (Tfl) <400> 15 Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser 1 5 10 15 Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu Pro Ala 20 25 30 Ile Gly Lys Thr 35 <210> 16 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic region from polymerase domain of Thermus sp. Sps17 DNA polymerase (Sps17) <400> 16 Glu Ala Glu Val His Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser 1 5 10 15 Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu Pro Pro 20 25 30 Ile Gly Lys Thr 35 <210> 17 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic region from polymerase domain of Thermus thermophilus DNA polymerase (Tth) <400> 17 Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser 1 5 10 15 Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala 20 25 30 Leu Gly Lys Thr 35 <210> 18 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic region from polymerase domain of Thermus caldophilus DNA polymerase (Tca) <400> 18 Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser 1 5 10 15 Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala 20 25 30 Leu Gly Lys Thr 35 <210> 19 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic region from polymerase domain of Thermotoga maritima DNA polymerase (Tma) <400> 19 Ala Glu Glu Ile Tyr Arg Ile Ala Gly Glu Pro Phe Asn Ile Asn Ser 1 5 10 15 Pro Lys Gln Val Ser Arg Ile Leu Phe Glu Lys Leu Gly Ile Lys Pro 20 25 30 Arg Gly Lys Thr 35 <210> 20 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic region from polymerase domain of Thermotoga neopolitana DNA polymerase (Tne) <400> 20 Ala Glu Lys Ile Tyr Gln Ile Ala Gly Glu Pro Phe Asn Ile Asn Ser 1 5 10 15 Pro Lys Gln Val Ser Asn Ile Leu Phe Glu Lys Leu Gly Ile Lys Pro 20 25 30 Arg Gly Lys Thr 35 <210> 21 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic region from polymerase domain of Thermosipho africanus DNA polymerase (Taf) <400> 21 Lys Glu Lys Val Phe Glu Ile Ala Gly Glu Thr Phe Asn Leu Asn Ser 1 5 10 15 Ser Thr Gln Val Ala Tyr Ile Leu Phe Glu Lys Leu Asn Ile Ala Pro 20 25 30 Tyr Lys Lys 35 <210> 22 <400> 22 000 <210> 23 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic region from polymerase domain of Deinococcus radiodurans DNA polymerase (Dra) <400> 23 Glu Ser Gln Ile His Glu Tyr Ala Gly Glu Glu Phe His Ile Arg Ser 1 5 10 15 Pro Lys Gln Leu Glu Thr Val Leu Tyr Asp Lys Leu Glu Leu Ala Ser 20 25 30 Ser Lys Lys Thr 35 <210> 24 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic region from polymerase domain of Bacillus stearothermophilus DNA polymerase (Bst) <400> 24 Glu Arg Arg Ile Tyr Glu Leu Ala Gly Gln Glu Phe Asn Ile Asn Ser 1 5 10 15 Pro Lys Gln Leu Gly Thr Val Leu Phe Asp Lys Leu Gln Leu Pro Val 20 25 30 Leu Lys Lys Thr 35 <210> 25 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic region from polymerase domain of Bacillus caldotenax DNA polymerase (Bca) <400> 25 Glu Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Ala Gly Gln Glu Phe Asn Ile Asn Ser 1 5 10 15 Pro Lys Gln Leu Gly Val Ile Leu Phe Glu Lys Leu Gln Leu Pro Val 20 25 30 Leu Lys Lys Ser 35 <210> 26 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic native consensus motif for region from polymerase domain of bacterial DNA polymerase <220> <221> VARIANT <222> (3)...(3) <223> Xaa = His, Glu or Gln <220> <221> VARIANT <222> (4)...(4) <223> Xaa = Pro, Thr or Glu <220> <221> VARIANT <222> (6)...(6) <223> Xaa = Asn or His <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa = Leu or Ile <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa = Asn or Arg <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa = Arg, Pro or Ser <220> <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa = Asp, Lys or Thr <220> <221> VARIANT <222> (13)...(13) <223> Xaa = Leu or Val <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa = Glu, Ser, Ala or Gly <220> <221> VARIANT <222> (15)...(15) <223> Xaa = Arg, Asn, Tyr, Thr or Val <220> <221> VARIANT <222> (16)...(16) <223> Xaa = Val or Ile <220> <221> VARIANT <222> (18)...(18) <223> Xaa = Phe or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (19)...(19) <223> Xaa = Asp or Glu <220> <221> VARIANT <222> (20)...(20) <223> Xaa = Glu or Lys <400> 26 Ala Gly Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Leu Xaa Xaa Xaa Leu 20 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polymerase motif corresponding to the D580X mutation of Z05, modified Z05 D580 motif <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa = Ser or Thr <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa = any amino acid other than Asp or Glu <400> 27 Thr Gly Arg Leu Ser Ser Xaa Xaa Pro Asn Leu Gln Asn 1 5 10 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic conserved DNA polymerase active site motif A <400> 28 Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg 1 5 <210> 29 <211> 893 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic chimeric CS5 DNA polymerase derived from N-terminal 5'-nuclease domain of Thermus sp. Z05 and C-terminal 3'-5' exonuclease and polymerase domains of Thermotoga maritima DNA polymerases <400> 29 Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe 50 55 60 Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80 Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln 85 90 95 Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu 100 105 110 Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys 115 120 125 Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg 130 135 140 Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu 145 150 155 160 Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys 165 170 175 Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp 180 185 190 Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205 Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg 210 215 220 Val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu Asp 225 230 235 240 Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu 245 250 255 Glu Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270 Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly 275 280 285 Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro Val Gly Tyr Arg Ile Val Lys Asp Leu 290 295 300 Val Glu Phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe 305 310 315 320 Ala Ile Asp Leu Glu Thr Ser Ser Leu Asp Pro Phe Asp Cys Asp Ile 325 330 335 Val Gly Ile Ser Val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro 340 345 350 Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu Val Leu Lys 355 360 365 Lys Leu Lys Glu Ile Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys Ile Val Gly Gln 370 375 380 Asn Leu Lys Phe Asp Tyr Lys Val Leu Met Val Lys Gly Val Glu Pro 385 390 395 400 Val Pro Pro Tyr Phe Asp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro 405 410 415 Asn Glu Lys Lys Phe Asn Leu Asp Asp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly 420 425 430 Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu 435 440 445 Phe Gly Phe Ser Phe Ala Asp Val Pro Val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr 450 455 460 Ser Cys Glu Asp Ala Asp Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser 465 470 475 480 Leu Lys Leu His Glu Ala Asp Leu Glu Asn Val Phe Tyr Lys Ile Glu 485 490 495 Met Pro Leu Val Asn Val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly Val Tyr 500 505 510 Val Asp Thr Glu Phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys 515 520 525 Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Tyr Arg Ile Ala Gly Glu Pro Phe 530 535 540 Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Val Ser Arg Ile Leu Phe Glu Lys Leu 545 550 555 560 Gly Ile Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly Asp Tyr Ser Thr 565 570 575 Arg Ile Glu Val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu Ile Ile Pro 580 585 590 Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile 595 600 605 Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg Ile His Ala 610 615 620 Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp 625 630 635 640 Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu Ile 645 650 655 Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile Val Ser Ala 660 665 670 Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile Leu Ala His Leu Ser Gly Asp 675 680 685 Glu Asn Leu Leu Arg Ala Phe Glu Glu Gly Ile Asp Val His Thr Leu 690 695 700 Thr Ala Ser Arg Ile Phe Asn Val Lys Pro Glu Glu Val Thr Glu Glu 705 710 715 720 Met Arg Arg Ala Gly Lys Met Val Asn Phe Ser Ile Ile Tyr Gly Val 725 730 735 Thr Pro Tyr Gly Leu Ser Val Arg Leu Gly Val Pro Val Lys Glu Ala 740 745 750 Glu Lys Met Ile Val Asn Tyr Phe Val Leu Tyr Pro Lys Val Arg Asp 755 760 765 Tyr Ile Gln Arg Val Val Ser Glu Ala Lys Glu Lys Gly Tyr Val Arg 770 775 780 Thr Leu Phe Gly Arg Lys Arg Asp Ile Pro Gln Leu Met Ala Arg Asp 785 790 795 800 Arg Asn Thr Gln Ala Glu Gly Glu Arg Ile Ala Ile Asn Thr Pro Ile 805 810 815 Gln Gly Thr Ala Ala Asp Ile Ile Lys Leu Ala Met Ile Glu Ile Asp 820 825 830 Arg Glu Leu Lys Glu Arg Lys Met Arg Ser Lys Met Ile Ile Gln Val 835 840 845 His Asp Glu Leu Val Phe Glu Val Pro Asn Glu Glu Lys Asp Ala Leu 850 855 860 Val Glu Leu Val Lys Asp Arg Met Thr Asn Val Val Lys Leu Ser Val 865 870 875 880 Pro Leu Glu Val Asp Val Thr Ile Gly Lys Thr Trp Ser 885 890 <210> 30 <211> 893 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic chimeric CS6 DNA polymerase derived from N-terminal 5'-nuclease domain of Thermus sp. Z05 and C-terminal 3'-5' exonuclease and polymerase domains of Thermotoga maritima DNA polymerases <400> 30 Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe 50 55 60 Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80 Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln 85 90 95 Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu 100 105 110 Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys 115 120 125 Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg 130 135 140 Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu 145 150 155 160 Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys 165 170 175 Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp 180 185 190 Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205 Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg 210 215 220 Val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu Asp 225 230 235 240 Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu 245 250 255 Glu Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270 Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly 275 280 285 Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro Val Gly Tyr Arg Ile Val Lys Asp Leu 290 295 300 Val Glu Phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe 305 310 315 320 Ala Ile Ala Leu Ala Thr Ser Ser Leu Asp Pro Phe Asp Cys Asp Ile 325 330 335 Val Gly Ile Ser Val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro 340 345 350 Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu Val Leu Lys 355 360 365 Lys Leu Lys Glu Ile Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys Ile Val Gly Gln 370 375 380 Asn Leu Lys Phe Asp Tyr Lys Val Leu Met Val Lys Gly Val Glu Pro 385 390 395 400 Val Pro Pro Tyr Phe Asp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro 405 410 415 Asn Glu Lys Lys Phe Asn Leu Asp Asp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly 420 425 430 Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu 435 440 445 Phe Gly Phe Ser Phe Ala Asp Val Pro Val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr 450 455 460 Ser Cys Glu Asp Ala Asp Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser 465 470 475 480 Leu Lys Leu His Glu Ala Asp Leu Glu Asn Val Phe Tyr Lys Ile Glu 485 490 495 Met Pro Leu Val Asn Val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly Val Tyr 500 505 510 Val Asp Thr Glu Phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys 515 520 525 Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Tyr Arg Ile Ala Gly Glu Pro Phe 530 535 540 Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Val Ser Arg Ile Leu Phe Glu Lys Leu 545 550 555 560 Gly Ile Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly Asp Tyr Ser Thr 565 570 575 Arg Ile Glu Val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu Ile Ile Pro 580 585 590 Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile 595 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Artificial Sequence <220> <223> synthetic mutant BRAF V600R target polynucleotide <400> 35 agtaaaaata ggtgattttg gtctagctac aaggaaatct cgatggagtg ggtcccatca 60 gtttgaacag ttgtctggat ccattttgtg gatggtaaga attgaggcta 110 <210> 36 <211> 921 <212> PRT <213> Deinococcus radiodurans <220> <223> Deinococcus radiodurans DNA polymerase (Dra) <400> 36 Met Ala Asp Ala Ser Pro Asp Pro Ser Lys Pro Asp Ala Leu Val Leu 1 5 10 15 Ile Asp Gly His Ala Leu Ala Phe Arg Ser Tyr Phe Ala Leu Pro Pro 20 25 30 Leu Asn Asn Ser Lys Gly Glu Met Thr Asp Ala Ile Val Gly Phe Met 35 40 45 Lys Leu Leu Leu Arg Leu Ala Arg Gln Lys Ser Asn Gln Val Ile Val 50 55 60 Val Phe Asp Pro Pro Val Lys Thr Leu Arg His Glu Gln Tyr Glu Gly 65 70 75 80 Tyr Lys Ser Gly Arg Ala Gln Thr Pro Glu Asp Leu Arg Gly Gln Ile 85 90 95 Asn Arg Ile Arg Ala Leu Val Asp Ala Leu Gly Phe Pro Arg Leu Glu 100 105 110 Glu Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Ile Ala Ser Leu Thr Arg Met 115 120 125 Ala Glu Gly Lys Gly Tyr Glu Val Arg Ile Val Thr Ser Asp Arg 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285 Leu Tyr Glu Glu Ala Glu Pro Thr Gly Tyr Glu Ile Val Lys Asp His 290 295 300 Lys Thr Phe Glu Asp Leu Ile Glu Lys Leu Lys Glu Val Pro Ser Phe 305 310 315 320 Ala Leu Asp Leu Glu Thr Ser Ser Leu Asp Pro Phe Asn Cys Glu Ile 325 330 335 Val Gly Ile Ser Val Ser Phe Lys Pro Lys Thr Ala Tyr Tyr Ile Pro 340 345 350 Leu His His Arg Asn Ala His Asn Leu Asp Glu Thr Leu Val Leu Ser 355 360 365 Lys Leu Lys Glu Ile Leu Glu Asp Pro Ser Ser Lys Ile Val Gly Gln 370 375 380 Asn Leu Lys Tyr Asp Tyr Lys Val Leu Met Val Lys Gly Ile Ser Pro 385 390 395 400 Val Tyr Pro His Phe Asp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro 405 410 415 Asn Glu Lys Lys Phe Asn Leu Glu Asp Leu Ser Leu Lys Phe Leu Gly 420 425 430 Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Ser Pro Leu 435 440 445 Phe Gly Phe Ser Phe Ala Asp Val Pro Val Asp Lys Ala Ala Glu Tyr 450 455 460 Ser Cys Glu Asp Ala Asp Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Ile Leu Ser 465 470 475 480 Met Lys Leu His Glu Ala Glu Leu Glu Asn Val Phe Tyr Arg Ile Glu 485 490 495 Met Pro Leu Val Asn Val Leu Ala Arg Met Glu Phe Asn Trp Val Tyr 500 505 510 Val Asp Thr Glu Phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys 515 520 525 Leu Glu Glu Leu Ala Glu Lys Ile Tyr Gln Ile Ala Gly Glu Pro Phe 530 535 540 Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Val Ser Asn Ile Leu Phe Glu Lys Leu 545 550 555 560 Gly Ile Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly Asp Tyr Ser Thr 565 570 575 Arg Ile Glu Val Leu Glu Glu Ile Ala Asn Glu His Glu Ile Val Pro 580 585 590 Leu Ile Leu Glu Phe Arg Lys Ile Leu Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile 595 600 605 Asp Thr Leu Pro Lys Leu Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg Phe His Ala 610 615 620 Ser Phe His Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp 625 630 635 640 Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu Ile 645 650 655 Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asp Trp Trp Ile Val Ser Ala 660 665 670 Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile Leu Ala His Leu Ser Gly Asp 675 680 685 Glu Asn Leu Val Lys Ala Phe Glu Glu Gly Ile Asp Val His Thr Leu 690 695 700 Thr Ala Ser Arg Ile Tyr Asn Val Lys Pro Glu Glu Val Asn Glu Glu 705 710 715 720 Met Arg Arg Val Gly Lys Met Val Asn Phe Ser Ile Ile Tyr Gly Val 725 730 735 Thr Pro Tyr Gly Leu Ser Val Arg Leu Gly Ile Pro Val Lys Glu Ala 740 745 750 Glu Lys Met Ile Ile Ser Tyr Phe Thr Leu Tyr Pro Lys Val Arg Ser 755 760 765 Tyr Ile Gln Gln Val Val Ala Glu Ala Lys Glu Lys Gly Tyr Val Arg 770 775 780 Thr Leu Phe Gly Arg Lys Arg Asp Ile Pro Gln Leu Met Ala Arg Asp 785 790 795 800 Lys Asn Thr Gln Ser Glu Gly Glu Arg Ile Ala Ile Asn Thr Pro Ile 805 810 815 Gln Gly Thr Ala Ala Asp Ile Ile Lys Leu Ala Met Ile Asp Ile Asp 820 825 830 Glu Glu Leu Arg Lys Arg Asn Met Lys Ser Arg Met Ile Ile Gln Val 835 840 845 His Asp Glu Leu Val Phe Glu Val Pro Asp Glu Glu Lys Glu Glu Leu 850 855 860 Val Asp Leu Val Lys Asn Lys Met Thr Asn Val Val Lys Leu Ser Val 865 870 875 880 Pro Leu Glu Val Asp Ile Ser Ile Gly Lys Ser Trp Ser 885 890 <210> 40 <211> 876 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilus <220> <223> Bacillus stearothermophilus DNA polymerase (Bst) <400> 40 Met Lys Asn Lys Leu Val Leu Ile Asp Gly Asn Ser Val Ala Tyr Arg 1 5 10 15 Ala Phe Phe Ala Leu Pro Leu Leu His Asn Asp Lys Gly Ile His Thr 20 25 30 Asn Ala Val Tyr Gly Phe Thr Met Met Leu Asn Lys Ile Leu Ala Glu 35 40 45 Glu Gln Pro Thr His Ile Leu Val Ala Phe Asp Ala Gly Lys Thr Thr 50 55 60 Phe Arg His Glu Thr Phe Gln Asp Tyr Lys Gly Gly Arg Gln Gln Thr 65 70 75 80 Pro Pro Glu Leu Ser Glu Gln Phe Pro Leu Leu Arg Glu Leu Leu Lys 85 90 95 Ala Tyr Arg Ile Pro Ala Tyr Glu Leu Asp His Tyr Glu Ala Asp Asp 100 105 110 Ile Ile Gly Thr Met Ala Ala Arg Ala Glu Arg Glu Gly Phe Ala Val 115 120 125 Lys Val Ile Ser Gly Asp Arg Asp Leu Thr Gln Leu Ala Ser Pro Gln 130 135 140 Val Thr Val Glu Ile Thr Lys Lys Gly Ile Thr Asp Ile Glu Ser Tyr 145 150 155 160 Thr Pro Glu Thr Val Val Glu Lys Tyr Gly Leu Thr Pro Glu Gln Ile 165 170 175 Val Asp Leu Lys Gly Leu Met Gly Asp Lys Ser Asp Asn Ile Pro Gly 180 185 190 Val Pro Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Val Lys Leu Leu Lys Gln Phe 195 200 205 Gly Thr Val Glu Asn Val Leu Ala Ser Ile Asp Glu Ile Lys Gly Glu 210 215 220 Lys Leu Lys Glu Asn Leu Arg Gln Tyr Arg Asp Leu Ala Leu Leu Ser 225 230 235 240 Lys Gln Leu Ala Ala Ile Cys Arg Asp Ala Pro Val Glu Leu Thr Leu 245 250 255 Asp Asp Ile Val Tyr Lys Gly Glu Asp Arg Glu Lys Val Val Ala Leu 260 265 270 Phe Gln Glu Leu Gly Phe Gln Ser Phe Leu Asp Lys Met Ala Val Gln 275 280 285 Thr Asp Glu Gly Glu Lys Pro Leu Ala Gly Met Asp Phe Ala Ile Ala 290 295 300 Asp Ser Val Thr Asp Glu Met Leu Ala Asp Lys Ala Ala Leu Val Val 305 310 315 320 Glu Val Val Gly Asp Asn Tyr His His Ala Pro Ile Val Gly Ile Ala 325 330 335 Leu Ala Asn Glu Arg Gly Arg Phe Phe Leu Arg Pro Glu Thr Ala Leu 340 345 350 Ala Asp Pro Lys Phe Leu Ala Trp Leu Gly Asp Glu Thr Lys Lys Lys 355 360 365 Thr Met Phe Asp Ser Lys Arg Ala Ala Val Ala Leu Lys Trp Lys Gly 370 375 380 Ile Glu Leu Arg Gly Val Val Phe Asp Leu Leu Leu Ala Ala Tyr Leu 385 390 395 400 Leu Asp Pro Ala Gln Ala Ala Gly Asp Val Ala Ala Val Ala Lys Met 405 410 415 His Gln Tyr Glu Ala Val Arg Ser Asp Glu Ala Val Tyr Gly Lys Gly 420 425 430 Ala Lys Arg Thr Val Pro Asp Glu Pro Thr Leu Ala Glu His Leu Ala 435 440 445 Arg Lys Ala Ala Ala Ile Trp Ala Leu Glu Glu Pro Leu Met Asp Glu 450 455 460 Leu Arg Arg Asn Glu Gln Asp Arg Leu Leu Thr Glu Leu Glu Gln Pro 465 470 475 480 Leu Ala Gly Ile Leu Ala Asn Met Glu Phe Thr Gly Val Lys Val Asp 485 490 495 Thr Lys Arg Leu Glu Gln Met Gly Ala Glu Leu Thr Glu Gln Leu Gln 500 505 510 Ala Val Glu Arg Arg Ile Tyr Glu Leu Ala Gly Gln Glu Phe Asn Ile 515 520 525 Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Thr Val Leu Phe Asp Lys Leu Gln Leu 530 535 540 Pro Val Leu Lys Lys Thr Lys Thr Gly Tyr Ser Thr Ser Ala Asp Val 545 550 555 560 Leu Glu Lys Leu Ala Pro His His Glu Ile Val Glu His Ile Leu His 565 570 575 Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Gln Ser Thr Tyr Ile Glu Gly Leu Leu 580 585 590 Lys Val Val His Pro Val Thr Gly Lys Val His Thr Met Phe Asn Gln 595 600 605 Ala Leu Thr Gln Thr Gly Arg Leu Ser Ser Val Glu Pro Asn Leu Gln 610 615 620 Asn Ile Pro Ile Arg Leu Glu Glu Gly Arg Lys Ile Arg Gln Ala Phe 625 630 635 640 Val Pro Ser Glu Pro Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala Asp Tyr Ser Gln 645 650 655 Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Ile Ala Glu Asp Asp Asn Leu Ile 660 665 670 Glu Ala Phe Arg Arg Gly Leu Asp Ile His Thr Lys Thr Ala Met Asp 675 680 685 Ile Phe His Val Ser Glu Glu Asp Val Thr Ala Asn Met Arg Arg Gln 690 695 700 Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr Gly 705 710 715 720 Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Thr Arg Lys Glu Ala Ala Glu Phe Ile 725 730 735 Glu Arg Tyr Phe Ala Ser Phe Pro Gly Val Lys Gln Tyr Met Asp Asn 740 745 750 Ile Val Gln Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr Val Thr Thr Leu Leu His 755 760 765 Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile Thr Ser Arg Asn Phe Asn Val Arg 770 775 780 Ser Phe Ala Glu Arg Thr Ala Met Asn Thr Pro Ile Gln Gly Ser Ala 785 790 795 800 Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile Asp Leu Ser Val Arg Leu Arg 805 810 815 Glu Glu Arg Leu Gln Ala Arg Leu Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu 820 825 830 Ile Leu Glu Ala Pro Lys Glu Glu Ile Glu Arg Leu Cys Arg Leu Val 835 840 845 Pro Glu Val Met Glu Gln Ala Val Ala Leu Arg Val Pro Leu Lys Val 850 855 860 Asp Tyr His Tyr Gly Pro Thr Trp Tyr Asp Ala Lys 865 870 875 <210> 41 <211> 877 <212> PRT <213> Bacillus caldotenax <220> <223> Bacillus caldotenax DNA polymerase (Bca) <400> 41 Met Lys Lys Lys Leu Val Leu Ile Asp Gly Ser Ser Val Ala Tyr Arg 1 5 10 15 Ala Phe Phe Ala Leu Pro Leu Leu His Asn Asp Lys Gly Ile His Thr 20 25 30 Asn Ala Val Tyr Gly Phe Thr Met Met Leu Asn Lys Ile Leu Ala Glu 35 40 45 Glu Glu Pro Thr His Met Leu Val Ala Phe Asp Ala Gly Lys Thr Thr 50 55 60 Phe Arg His Glu Ala Phe Gln Glu Tyr Lys Gly Gly Arg Gln Gln Thr 65 70 75 80 Pro Pro Glu Leu Ser Glu Gln Phe Pro Leu Leu Arg Glu Leu Leu Arg 85 90 95 Ala Tyr Arg Ile Pro Ala Tyr Glu Leu Glu Asn Tyr Glu Ala Asp Asp 100 105 110 Ile Ile Gly Thr Leu Ala Ala Arg Ala Glu Gln Glu Gly Phe Glu Val 115 120 125 Lys Val Ile Ser Gly Asp Arg Asp Leu Thr Gln Leu Ala Ser Pro His 130 135 140 Val Thr Val Asp Ile Thr Lys Lys Gly Ile Thr Asp Ile Glu Pro Tyr 145 150 155 160 Thr Pro Glu Ala Val Arg Glu Lys Tyr Gly Leu Thr Pro Glu Gln Ile 165 170 175 Val Asp Leu Lys Gly Leu Met Gly Asp Lys Ser Asp Asn Ile Pro Gly 180 185 190 Val Pro Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Val Lys Leu Leu Arg Gln Phe 195 200 205 Gly Thr Val Glu Asn Val Leu Ala Ser Ile Asp Glu Ile Lys Gly Glu 210 215 220 Lys Leu Lys Glu Thr Leu Arg Gln His Arg Glu Met Ala Leu Leu Ser 225 230 235 240 Lys Lys Leu Ala Ala Ile Arg Arg Asp Ala Pro Val Glu Leu Ser Leu 245 250 255 Asp Asp Ile Ala Tyr Gln Gly Glu Asp Arg Glu Lys Val Val Ala Leu 260 265 270 Phe Lys Glu Leu Gly Phe Gln Ser Phe Leu Glu Lys Met Glu Ser Pro 275 280 285 Ser Ser Glu Glu Glu Lys Pro Leu Ala Lys Met Ala Phe Thr Leu Ala 290 295 300 Asp Arg Val Thr Glu Glu Met Leu Ala Asp Lys Ala Ala Leu Val Val 305 310 315 320 Glu Val Val Glu Glu Asn Tyr His Asp Ala Pro Ile Val Gly Ile Ala 325 330 335 Val Val Asn Glu His Gly Arg Phe Phe Leu Arg Pro Glu Thr Ala Leu 340 345 350 Ala Asp Pro Gln Phe Val Ala Trp Leu Gly Asp Glu Thr Lys Lys Lys 355 360 365 Ser Met Phe Asp Ser Lys Arg Ala Ala Val Ala Leu Lys Trp Lys Gly 370 375 380 Ile Glu Leu Cys Gly Val Ser Phe Asp Leu Leu Leu Ala Ala Tyr Leu 385 390 395 400 Leu Asp Pro Ala Gln Gly Val Asp Asp Val Ala Ala Ala Ala Lys Met 405 410 415 Lys Gln Tyr Glu Ala Val Arg Pro Asp Glu Ala Val Tyr Gly Lys Gly 420 425 430 Ala Lys Arg Ala Val Pro Asp Glu Pro Val Leu Ala Glu His Leu Val 435 440 445 Arg Lys Ala Ala Ala Ile Trp Ala Leu Glu Arg Pro Phe Leu Asp Glu 450 455 460 Leu Arg Arg Asn Glu Gln Asp Arg Leu Leu Val Glu Leu Glu Gln Pro 465 470 475 480 Leu Ser Ser Ile Leu Ala Glu Met Glu Phe Ala Gly Val Lys Val Asp 485 490 495 Thr Lys Arg Leu Glu Gln Met Gly Glu Glu Leu Ala Glu Gln Leu Arg 500 505 510 Thr Val Glu Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Ala Gly Gln Glu Phe Asn Ile 515 520 525 Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val Ile Leu Phe Glu Lys Leu Gln Leu 530 535 540 Pro Val Leu Lys Lys Ser Lys Thr Gly Tyr Ser Thr Ser Ala Asp Val 545 550 555 560 Leu Glu Lys Leu Ala Pro Tyr His Glu Ile Val Glu Asn Ile Leu Gln 565 570 575 His Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Gln Ser Thr Tyr Ile Glu Gly Leu 580 585 590 Leu Lys Val Val Arg Pro Asp Thr Lys Lys Val His Thr Ile Phe Asn 595 600 605 Gln Ala Leu Thr Gln Thr Gly Arg Leu Ser Ser Thr Glu Pro Asn Leu 610 615 620 Gln Asn Ile Pro Ile Arg Leu Glu Glu Gly Arg Lys Ile Arg Gln Ala 625 630 635 640 Phe Val Pro Ser Glu Ser Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala Asp Tyr Ser 645 650 655 Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Ile Ala Glu Asp Asp Asn Leu 660 665 670 Met Glu Ala Phe Arg Arg Asp Leu Asp Ile His Thr Lys Thr Ala Met 675 680 685 Asp Ile Phe Gln Val Ser Glu Asp Glu Val Thr Pro Asn Met Arg Arg 690 695 700 Gln Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr 705 710 715 720 Gly Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys Glu Ala Ala Glu Phe 725 730 735 Ile Glu Arg Tyr Phe Glu Ser Phe Pro Gly Val Lys Arg Tyr Met Glu 740 745 750 Asn Ile Val Gln Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr Val Thr Thr Leu Leu 755 760 765 His Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile Thr Ser Arg Asn Phe Asn Val 770 775 780 Arg Ser Phe Ala Glu Arg Met Ala Met Asn Thr Pro Ile Gln Gly Ser 785 790 795 800 Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile Asp Leu Asn Ala Arg Leu 805 810 815 Lys Glu Glu Arg Leu Gln Ala Arg Leu Leu Leu Gln Val His Asp Glu 820 825 830 Leu Ile Leu Glu Ala Pro Lys Glu Glu Met Glu Arg Leu Cys Arg Leu 835 840 845 Val Pro Glu Val Met Glu Gln Ala Val Thr Leu Arg Val Pro Leu Lys 850 855 860 Val Asp Tyr His Tyr Gly Ser Thr Trp Tyr Asp Ala Lys 865 870 875 <210> 42 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA polymerase domain motif <220> <221> VARIANT <222> (3)...(3) <223> Xaa = His, Glu or Gln <220> <221> VARIANT <222> (4)...(4) <223> Xaa = Pro, Thr or Glu <220> <221> VARIANT <222> (6)...(6) <223> Xaa = Asn or His <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa = Leu or Ile <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa = Asn or Arg <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa = Arg, Pro or Ser <220> <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa = Asp, Lys or Thr <220> <221> VARIANT <222> (13)...(13) <223> Xaa = Leu or Val <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa = any amino acid other than Glu, Ser, Ala or Gly <220> <221> VARIANT <222> (15)...(15) <223> Xaa = Arg, Asn, Tyr, Thr or Val <220> <221> VARIANT <222> (16)...(16) <223> Xaa = Val or Ile <220> <221> VARIANT <222> (18)...(18) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (19)...(19) <223> Xaa = Asp or Glu <220> <221> VARIANT <222> (20)...(20) <223> Xaa = Glu or Lys <400> 42 Ala Gly Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Leu Xaa Xaa Xaa Leu 20 <210> 43 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA polymerase domain motif <220> <221> VARIANT <222> (3)...(3) <223> Xaa = His or Glu <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa = Leu or Ile <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa = Arg or Pro <220> <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa = Asp or Lys <220> <221> VARIANT <222> (13)...(13) <223> Xaa = Leu or Val <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa = any amino acid other than Glu or Ser <220> <221> VARIANT <222> (15)...(15) <223> Xaa = Arg or Asn <220> <221> VARIANT <222> (16)...(16) <223> Xaa = Val or Ile <220> <221> VARIANT <222> (18)...(18) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (19)...(19) <223> Xaa = Asp or Glu <220> <221> VARIANT <222> (20)...(20) <223> Xaa = Glu or Lys <400> 43 Ala Gly Xaa Pro Phe Asn Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Leu Xaa Xaa Xaa Leu 20 <210> 44 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA polymerase domain motif <220> <221> VARIANT <222> (3)...(3) <223> Xaa = His or Glu <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa = Leu or Ile <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa = Arg or Pro <220> <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa = Asp or Lys <220> <221> VARIANT <222> (13)...(13) <223> Xaa = Leu or Val <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa = any amino acid other than Glu or Ser <220> <221> VARIANT <222> (16)...(16) <223> Xaa = Val or Ile <220> <221> VARIANT <222> (19)...(19) <223> Xaa = Asp or Glu <220> <221> VARIANT <222> (20)...(20) <223> Xaa = Glu or Lys <400> 44 Ala Gly Xaa Pro Phe Asn Xaa Asn Ser Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Leu Phe Xaa Xaa Leu 20 <210> 45 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA polymerase domain motif <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa = any amino acid other than Glu <220> <221> VARIANT <222> (18)...(18) <223> Xaa = any amino acid <400> 45 Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Xaa Arg Asp Gln Leu Xaa Arg Val 1 5 10 15 Leu Xaa Asp Glu Leu 20 <210> 46 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA polymerase domain motif <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa = any amino acid other than Ser <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa = any amino acid other than Glu <220> <221> VARIANT <222> (18)...(18) <223> Xaa = any amino acid other than Phe <400> 46 Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Xaa Arg Asp Gln Leu Xaa Arg Val 1 5 10 15 Leu Xaa Asp Glu Leu 20 <210> 47 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA polymerase domain motif <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa = Ser, Gly, Ala, Asp, Phe, Lys, Cys, Thr or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa = Ser, Gln, Ala, Gly, Lys or Arg <220> <221> VARIANT <222> (18)...(18) <223> Xaa = Phe, Ala, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp or Lys <400> 47 Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Xaa Arg Asp Gln Leu Xaa Arg Val 1 5 10 15 Leu Xaa Asp Glu Leu 20 <210> 48 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA polymerase domain motif <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa = Ser, Gly, Ala, Asp, Phe, Lys, Cys, Thr or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (18)...(18) <223> Xaa = Phe, Ala, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp or Lys <400> 48 Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Xaa Arg Asp Gln Leu Lys Arg Val 1 5 10 15 Leu Xaa Asp Glu Leu 20 <210> 49 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA polymerase domain motif <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa = Ser, Gly, Ala, Asp, Phe, Lys, Cys, Thr or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa = Arg, Lys, Ala or Gly <220> <221> VARIANT <222> (18)...(18) <223> Xaa = Phe, Ala, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp or Lys <400> 49 Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Xaa Arg Asp Gln Leu Xaa Arg Val 1 5 10 15 Leu Xaa Asp Glu Leu 20 <210> 50 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA polymerase domain motif <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa = Arg, Lys, Ala or Gly <400> 50 Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Xaa Arg Val 1 5 10 15 Leu Phe Asp Glu Leu 20 <210> 51 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA polymerase domain motif <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa = Ser or Thr <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa = Leu, Gly, Thr, Gln, Ala, Ser, Asn, Arg or Lys <400> 51 Thr Gly Arg Leu Ser Ser Xaa Xaa Pro Asn Leu Gln Asn 1 5 10

Claims (15)

  1. 대조군 DNA 중합효소와 비교시 3'-미스매치 구별 활성이 증가된 DNA 중합효소로서,
    상기 DNA 중합효소는 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열에서 위치 493 번의 아미노산 잔기가 G, K 또는 R 중 임의의 하나로 치환된 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 대조 DNA 중합효소는 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열로 이루어지거나; 또는
    상기 DNA 중합효소는 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열에서 위치 493 번의 아미노산 잔기가 A, G, K 또는 R 중 임의의 하나로 치환되고, 위치 580 번의 아미노산 잔기가 G 로 치환된 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 대조 DNA 중합효소는 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열에서 위치 580 번의 아미노산 잔기가 G 로 치환된 아미노산 서열로 이루어지거나; 또는
    상기 DNA 중합효소는 SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열에서 위치 491 번의 아미노산 잔기가 K 로 치환된 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 대조 DNA 중합효소는 SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열로 이루어지는, DNA 중합효소.
  2. 대조군 DNA 중합효소와 비교시 3'-미스매치 구별 활성이 증가된 DNA 중합효소로서, 상기 DNA 중합효소는 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열에서 위치 493 번의 아미노산 잔기가 K 로 치환되고, 위치 580 번의 아미노산 잔기가 G 로 치환되고, 위치 416 번의 아미노산 잔기가 H 로 치환되고, 위치 733 번의 아미노산 잔기가 L 로 치환된 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 대조 DNA 중합효소는 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열에서 위치 580 번의 아미노산 잔기가 G 로 치환된 아미노산 서열로 이루어지는, DNA 중합효소.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 DNA 중합효소를 인코딩하는 재조합 핵산.
  9. 제 8 항에 따른 재조합 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 DNA 중합효소를 프라이머, 폴리뉴클레오티드 주형, 및 뉴클레오시드 트리포스페이트와 접촉시켜 신장된 프라이머를 제조하는 것을 포함하는, 프라이머 신장을 수행하는 방법.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 DNA 중합효소를 제공하는 하나 이상의 용기를 포함하는, 신장된 프라이머 제조용 키트.
  12. 제 11 항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 용기를 추가로 포함하는 키트:
    (a) 소정의 폴리뉴클레오티드 주형에 하이브리드될 수 있는 프라이머를 제공하는 용기;
    (b) 뉴클레오시드 트리포스페이트를 제공하는 용기; 및
    (c) 프라이머 신장용 완충제를 제공하는 용기.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 DNA 중합효소, 하나 이상의 프라이머, 폴리뉴클레오티드 주형, 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 포함하는 반응 혼합물.
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