ES2564692T3 - ADN polimerasas con discriminación incrementada de no correspondencia 3' - Google Patents

ADN polimerasas con discriminación incrementada de no correspondencia 3' Download PDF

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Abstract

ADN polimerasa que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID nº 1 o a SEC ID nº 2 y que presenta una actividad de discriminación de no correspondencias 3' en comparación con una ADN polimerasa de control, en la que la ADN polimerasa comprende un motivo en el dominio de polimerasa que comprende: A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-X10-R-V-L-F-D-E-L, en el que: X10 es A, G, K o R (SEC ID nº 10), en el que la ADN polimerasa de control presenta la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa excepto en que el aminoácido X10 de la ADN polimerasa de control es E.

Description

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ligado a una secuencia codificante en el caso de que afecte a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión ribosómica se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que se encuentre posicionado de manera que facilite la traducción.
La expresión "célula huésped" se refiere a organismos unicelulares tanto procarióticos como eucarióticos (por ejemplo bacterias, levaduras y actinomicetos) y células individuales de plantas o animales de orden superior cultivados en cultivo celular.
El término "vector" se refiere a un trozo de ADN, típicamente de doble cadena, en el que puede haberse insertado un trozo de ADN foráneo. El vector puede ser, por ejemplo, de origen plasmídico. Los vectores contienen secuencias polinucleótidas de "replicón" que facilitan la replicación autónoma del vector en una célula huésped. El ADN foráneo se define como ADN heterólogo, que es ADN no presente naturalmente en la célula huésped, que, por ejemplo, replica la molécula del vector, codifica un marcador seleccionable o cribable, o codifica para un transgén. El vector se utiliza para transportar el ADN foráneo o heterólogo al interior de una célula huésped adecuada. Una vez dentro de la célula huésped, el vector puede replicarse independientemente o concurrentemente con el ADN cromosómico del huésped, y pueden generarse varias copias del vector y su ADN insertado. Además, el vector puede contener además los elementos necesarios que permiten la transcripción del ADN insertado para formar una molécula de ARNm o de otro modo provocar la replicación del ADN insertado en múltiples copias de ARN.
Algunos vectores de expresión adicionalmente contienen elementos de secuencia contiguos al ADN insertado que incrementan la semivida del ARNm expresado y/o permiten la traducción del ARNm en una molécula de proteína. De esta manera, pueden sintetizarse rápidamente muchas moléculas de ARNm y del polipéptido codificado por el ADN insertado.
El término "nucleótido", además de referirse a los monómeros ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos naturales, en la presente memoria se entenderá que se refiere a variantes estructurales relacionadas de los mismos, incluyendo derivados y análogos, que son funcionalmente equivalentes con respecto al contexto particular en el que se está utilizando el nucleótido (por ejemplo la hibridación con una base complementaria), a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
La expresión "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refiere a un polímero que puede ser correspondiente de un ácido nucleico de ribosa (ARN) o un polímero ácido nucleico de desoxirribosa (ADN), o un análogo de los mismos. Lo anterior incluye polímeros de nucleótidos, tales como ARN y ADN, así como formas sintéticas, formas modificadas (por ejemplo química o bioquímicamente modificadas) de las mismas, y polímeros mixtos (por ejemplo subunidades de tanto ARN como ARN). Entre las modificaciones ejemplares se incluyen la metilación, la sustitución de uno o más nucleótidos naturales por un análogo, modificaciones internucleótidas, tales como enlaces sin carga (por ejemplo fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos y similares), fracciones colgantes (por ejemplo polipéptidos), intercalantes (por ejemplo acridina, psoralén y similares), quelantes, alquilantes y enlaces modificados (por ejemplo ácidos nucleicos alfa-anoméricos y similares). También se encuentran incluidas moléculas sintéticas que imitan a los polinucleótidos en su capacidad de unirse a una secuencia designada, mediante enlaces de hidrógeno y otras interacciones químicas. Típicamente, los monómeros nucleótidos se encuentran unidos mediante enlaces fosfodiéster, aunque las formas sintéticas de ácidos nucleicos pueden comprender otros enlaces (por ejemplo ácidos péptido-nucleicos tal como se indica en Nielsen et al. (Science 254:1497-1500, 1991). Un ácido nucleico puede ser o puede incluir, por ejemplo, un cromosoma o segmento cromosómico, un vector (por ejemplo un vector de expresión), un casete de expresión, un polímero de ADN o ARN desnudo, el producto de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un oligonucleótido, una sonda y un cebador. Un ácido nucleico puede ser, por ejemplo, de cadena sencilla, de doble cadena o de triple cadena, y no se encuentra limitado a ninguna longitud en particular. A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de ácidos nucleicos comprende o codifica secuencias complementarias, además de cualquier secuencia indicada explícitamente.
El término "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico que incluye por lo menos dos unidades monoméricas de ácidos nucleicos (por ejemplo nucleótidos). Un oligonucleótido típicamente incluye entre aproximadamente seis y aproximadamente 175 unidades monoméricas de ácidos nucleicos, más típicamente entre aproximadamente ocho y aproximadamente 100 unidades monoméricas de ácidos nucleicos, y todavía más típicamente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 unidades monoméricas de ácidos nucleicos (por ejemplo aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35 o más unidades monoméricas de ácidos nucleicos). El tamaño exacto de un oligonucleótido depende de muchos factores, incluyendo la función última o utilización del oligonucleótido. Los oligonucleótidos se preparan opcionalmente mediante cualquier método adecuado, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, el aislamiento de una secuencia existente o natural, la replicación o amplificación del ADN, la transcripción inversa, la clonación y la digestión de restricción de secuencias apropiadas, o la síntesis química directa mediante un método tal como el método de fosfotriéster de Narang et al. (Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979), el método de fosfodiéster de Brown et al. (Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979), el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al. (Tetrahedron Lett. 22:18591862, 1981); el método de triéster de Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981); los métodos de síntesis automatizada, o el método de soporte sólido de la patente US nº 4.458.066, u otros métodos conocidos por el experto en la materia.
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El término "cebador" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un polinucleótido capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis de ácidos nucleicos dirigida por molde en caso de encontrarse bajo condiciones en que se inicia la extensión del polinucleótido (por ejemplo bajo condiciones que comprenden la presencia de los nucleósidos trifosfato necesarios (tal como dicta el molde que se copia) y una polimerasa en un tampón apropiado y a una temperatura o ciclo o ciclos de temperatura adecuados (por ejemplo tal como en una reacción en cadena de polimerasa)). A título ilustrativo adicional, los cebadores también pueden utilizarse en una diversidad de otros procedimientos de síntesis mediados por oligonucleótidos, incluyendo como iniciadores de la síntesis de ARN de novo y en procedimientos in vitro relacionados con la transcripción (por ejemplo la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (ABSAN), la amplificación mediada por la transcripción (AMT), etc.). Un cebador es típicamente un oligonucleótido de cadena sencilla (por ejemplo un oligodesoxirribonucleótido). La longitud apropiada de un cebador depende de la utilización pretendida del cebador, aunque típicamente se encuentra comprendida entre 6 y 40 nucleótidos, más típicamente entre 15 y 35 nucleótidos. Las moléculas de cebador cortas generalmente requieren temperaturas más bajas para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde. Un cebador no debe reflejar necesariamente la secuencia exacta del molde, pero debe ser suficientemente complementario para hibridarse con un molde para que se produzca la elongación del cebador. En determinadas realizaciones, la expresión "pareja de cebadores" se refiere a un conjunto de cebadores que incluye un cebador de sentido 5' (en ocasiones denominado "directo") que se hibrida con el complemento del extremo 5' de la secuencia de ácidos nucleicos que debe amplificarse, y un cebador antisentido 3' (en ocasiones denominado "inverso") que se hibrida con el extremo 3' de la secuencia que debe amplificarse (por ejemplo en el caso de que la secuencia diana se exprese como ARN o sea un ARN). Un cebador puede marcarse, si se desea, mediante la incorporación de un marcaje detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, entre los marcajes útiles se incluyen 32P, pigmentos fluorescentes, reactivos electrodensos, enzimas (tales como los utilizados comúnmente en los ensayos de ELISA), biotina o haptenos y proteínas para los que se dispone de antisueros o anticuerpos monoclonales.
La expresión "sonda de nucleasa 5'" se refiere a un oligonucleótido que comprende por lo menos una fracción de marcaje emisora de luz y que se utiliza en una reacción de nucleasa 5' para llevar a cabo la detección del ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, por ejemplo, una sonda de nucleasa 5' incluye únicamente una sola fracción emisora de luz (por ejemplo un pigmento fluorescente, etc.). En determinadas realizaciones, una sonda de nucleasa 5' incluye regiones de autocomplementariedad de manera que las sondas son capaces de formar estructuras de horquilla bajo condiciones seleccionadas. A título ilustrativo adicional, en algunas realizaciones una sonda de nucleasa 5' comprende por lo menos dos fracciones de marcaje y emite radiación de intensidad creciente después de que uno de los dos marcajes se escinda o de otro modo se separe del oligonucleótido. En determinadas realizaciones, se marca una sonda de nucleasa 5' con dos pigmentos fluorescentes diferentes, por ejemplo un pigmento informador en el extremo 5' y el pigmento o fracción inhibidor en el extremo 3'. En algunas realizaciones, las sondas de nucleasa 5' se marcan en una o más posiciones aparte de, o además de, las posiciones terminales. En el caso de que la sonda se encuentre intacta, la transferencia de energía típicamente ocurre entre los dos fluoróforos, de manera que la emisión fluorescente del pigmento informador resulta inhibida por lo menos en parte. Durante una etapa de extensión de una reacción en cadena de polimerasa, por ejemplo, una sonda de nucleasa 5' unida a un ácido nucleico molde se escinde por la actividad de nucleasas 5' a 3' de, por ejemplo, una polimerasa Taq u otra polimerasa que presente dicha actividad, de manera que la emisión fluorescente del pigmento informador ya no se encuentra inhibida. También se describen sondas de nucleasa 5' ejemplares en, por ejemplo, las patentes US nº 5.210.015, nº 5.994.056 y nº 6.171.785. En otras realizaciones, una sonda de nucleasa 5' puede marcarse con dos o más pigmentos informadores diferentes y un pigmento o fracción inhibidora 3'-terminal.
El término "FRET" o "transferencia de energía de resonancia fluorescente" o "transferencia de energía de resonancia de Foerster" se refiere a una transferencia de energía entre por lo menos dos cromóforos, un crómoforo donante y un cromóforo aceptor (denominado inhibidor). El donante típicamente transfiere la energía al aceptor cuando el donante es excitado por radiación lumínica de una longitud de onda adecuada. El aceptor típicamente reemite la energía transferida en forma de radiación lumínica con una longitud de onda diferente. En el caso de que el aceptor sea un inhibidor "oscuro", disipa la energía transferida en una forma que no es luz. Que un fluoróforo particular actúe como donante o aceptor depende de las propiedades del otro elemento de la pareja FRET. Entre las parejas de donante-aceptor utilizadas comúnmente se incluyen la pareja FAM-TAMRA. Son inhibidores utilizados comúnmente, DABCILO y TAMRA. Entre los inhibidores oscuros utilizados comúnmente se incluyen BlackHole Quenchers™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa Black™ (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa) y BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).
El término "convencional" o "natural" en referencia a bases de ácidos nucleicos, nucleósidos trifosfato o nucleótidos se refiere a aquellos presentes naturalmente en el polinucleótido que se describe (es decir, para el ADN son dATP, dGTP, dCTP y dTTP). Además, se utilizan frecuentemente dITP y 7-deaza-dGTP en lugar de dGTP, y 7-deaza-dATP puede utilizarse en lugar de dATP en reacciones de síntesis de ADN in vitro, tales como la secuenciación. Colectivamente pueden denominarse dNTP.
La expresión "no convencional" o "modificado" en referencia a una base de ácidos nucleicos, nucleósido o nucleótido incluye las modificaciones, derivaciones o análogos de bases convencionales, nucleósidos o nucleótidos que se observan naturalmente en un polinucleótido particular. Determinados nucleótidos no convencionales se encuentran
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modificados en la posición 2' del azúcar ribosa en comparación con los dNTP convencionales. De esta manera, aunque para el ARN los nucleótidos naturales son ribonucleótidos (es decir, ATP, GTP, CTP, UTP, colectivamente rNTP), debido a que estos nucleótidos presentan un grupo hidroxilo en la posición 2' del azúcar que, a título comparativo, se encuentra ausente en los dNTP, tal como se utiliza en la presente memoria, los ribonucleótidos son nucleótidos no convencionales como sustratos para las ADN polimerasas. Tal como se utiliza en la presente memoria, entre los nucleótidos no convencionales se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, compuestos utilizados como terminadores para la secuenciación de ácidos nucleicos. Entre los compuestos terminadores ejemplares se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, compuestos que presentan una estructura de 2',3'-dideoxi y se denominan dideoxinucleósidos trifosfato. Los dideoxinucleósidos trifosfato ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP se denominan colectivamente ddNTP. Entre los ejemplos adicionales de compuestos terminadores se incluyen análogos 2'-PO4 de ribonucleótidos (ver, por ejemplo, las solicitudes publicadas de patente US nº 2005/0037991 y nº 2005/0037398). Entre otros nucleótidos no convencionales se incluyen los dNTP fosforioato ([[α]-S]dNTPs), los dNTP 5’-[α]-borano, los dNTP [α]-metil-fosfonato y los ribonucleósidos trifosfato (rNTP). Las bases no convencionales pueden marcarse con isótopos radioactivos tales como 32P, 33P o 35S, marcajes fluorescentes, marcajes quimioluminiscentes, marcajes bioluminiscentes, marcajes haptenos tales como biotina, o marcajes enzimáticos tales como estreptavidina o avidina. Entre los marcajes fluorescentes pueden incluirse pigmentos con carga negativa, tales como pigmentos de la familia de la fluoresceína, o pigmentos de carga neutra, tales como pigmentos de la familia de la rodamina, o pigmentos con carga positiva, tales como los pigmentos de la familia de la cianina. Entre los pigmentos de la familia de la fluoresceína se incluyen, por ejemplo, FAM, HEX, TET, JOE, NAN y ZOE. Entre los pigmentos de la familia de la rodamina se incluyen rojo Texas, ROX, R110, R6G y TAMRA. Diversos pigmentos o nucleótidos marcados con FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G, rojo Texas y TAMRA son comercializados por Perkin-Elmer (Boston, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA) o Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR). Entre los pigmentos de la familia de la cianina se incluyen Cy2, Cy3, Cy5 y Cy7 y son comercializados por GE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, Inglaterra).
Tal como se utiliza en la presente memoria, el "porcentaje de identidad de secuencias" se determina mediante la comparación de dos secuencias alineadas óptimamente en una ventana de comparación, en la que la parte de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que se observa una base de ácidos nucleicos o residuo aminoácido idéntico en ambas secuencias, rindiendo el número de posiciones correspondientes, dividiendo el número de posiciones correspondientes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el número por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencias.
Los términos "idéntico" e "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Las secuencias son "sustancialmente idénticas" en el caso de que presenten un porcentaje especificado de nucleótidos o residuos aminoácidos que son iguales (por ejemplo por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% de identidad en una región especificada), al comparar y alinear para la máxima correspondiente en una ventana de comparación o región designada según se mide utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias siguientes o mediante alineación manual e inspección visual. Estas definiciones también se refieren al complemento de una secuencia de ensayo. Opcionalmente, la identidad existe en una región que presenta una longitud de por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos, o más típicamente en una región de 100 o 500 o 1.000 o más nucleótidos de longitud.
Las expresiones "similitud" o "porcentaje de similitud" en el contexto de dos o más secuencias de polipéptido, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que presentan un porcentaje especificado de residuos aminoácidos que son iguales o similares según definen las sustituciones conservadoras de aminoácidos (por ejemplo una similitud de 60%, opcionalmente similares al 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% en una región especificada), al compararse y alinearse para la máxima correspondencia en una ventana de comparación o región designada según se mide utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias siguiente, o mediante alineación manual e inspección visual. Las secuencias son "sustancialmente similares" entre sí en el caso de que sean por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50% o por lo menos 55% similares entre sí. Opcionalmente, esta similitud existe en una región que presenta una longitud de por lo menos aproximadamente 50 aminoácidos, o más típicamente en una región de por lo menos aproximadamente 100 a 500 o 1.000 o más aminoácidos de longitud.
Para la comparación entre secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con las que se comparan las secuencias de ensayo. Al utilizar un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de ensayo y de referencia en un ordenador, se fijan las coordenadas de la subsecuencia, en caso necesario, y se fijan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Habitualmente se utilizan los parámetros por defecto del programa, o pueden fijarse parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades o similitudes de secuencia para las secuencias de ensayo respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.
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En la presente memoria, X10 se selecciona de entre L, M, W, P, T, F, Y, C, N, D, V, I, R, K, Q, H, S, A o G. Se da a conocer además que X10 se selecciona de entre R, K, A o G (SEC ID nº 49).
Se dan a conocer además ADN polimerasas derivadas de una especie del género Thermus que pueden caracterizarse porque presentan el motivo siguiente:
Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-Ser-Arg-Asp-Gln-Leu-X10-Arg-Val-Leu-Phe-Asp-Glu-Leu (también denominado en el código de una letra: A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-X10-R-V-L-F-D-E-L), en el que X10 es cualquier aminoácido diferente de Glu (E) (SEC ID nº 9).
En algunas realizaciones, las ADN polimerasas de la invención derivadas de una especie del género Thermus pueden caracterizarse porque presentan el motivo siguiente:
Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-Ser-Arg-Asp-Gln-Leu-X10-Arg-Val-Leu-Phe-Asp-Glu-Leu (también denominado en el código de una letra: A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-X10-R-V-L-F-D-E-L), en el que: X10 es Ala (A), Gly (G), Lys (K) o Arg (R) (SEC ID nº 10).
En algunas realizaciones, las ADN polimerasas de la invención derivadas de una especie del género Thermus pueden caracterizarse porque presentan el motivo siguiente:
Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-Ser-Arg-Asp-Gln-Leu-X10-Arg-Val-Leu-Phe-Asp-Glu-Leu (también denominado en el código de una letra: A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-X10-R-V-L-F-D-E-L), en el que: X10 es Lys (K) (SEC ID nº 11).
Además, se da a conocer que las ADN polimerasas pueden comprender sustituciones de aminoácidos adicionales, por ejemplo en las posiciones X6 y X13 del motivo nativo (SEC ID nº 26). Las sustituciones adicionales en las posiciones X6 y X13 también pueden resultar en una discriminación incrementada de no correspondencias 3'. De esta manera, se dan a conocer ADN polimerasas que pueden caracterizarse porque presentan el motivo siguiente:
Ala-Gly-X1-X2-Phe-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Gln-X9-X10-X11-X12-Leu-X13-X14-X15-Leu (también denominado en la presente memoria con el código de una letra: A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Q-X9-X10-X11-X12-L-X13-X14-X15-L), en el que: X1 es His (H), Glu (E) o Gln (Q), X2 es Pro (P), Thr (T) o Glu (E), X3 es Asn (N) o His (H), X4 es Leu (L) o Ile (I), X5 es Asn (N) o Arg (R), X6 es cualquier aminoácido, X7 es Arg (R), Pro (P) o Ser (S), X8 es Asp (D), Lys (K) o Thr (T), X9 es Leu (L) o Val (V), X10 es cualquier aminoácido diferente de Glu (E), Ser (S), Ala (A) o Gly (G), X11 es Arg (R), Asn (N), Tyr (Y), Thr (T) o Val (V), X12 es Val (V) o Ile (I), X13 es cualquier aminoácido, X14 es Asp (D) o Glu (E), y X15 es Glu (E) o Lys (K) (SEC ID nº 42).
Se dan a conocer además ADN polimerasas que pueden caracterizarse porque presentan el motivo siguiente: Ala-Gly-X1-Pro-Phe-Asn-X4-Asn-X6-X7-X8-Gln-X9-X10-X11-X12-Leu-X13-X14-X15-Leu (también denominado en la presente memoria con el código de una letra: A-G-X1-P-F-N-X4-N-X6-X7-X8-Q-X9-X10-X11-X12-L-X13-X14-X15-L), en el que: X1 es His (H) o Glu (E), X4 es Leu (L) o Ile (I), X6 es cualquier aminoácido, X7 es Arg (R) o Pro (P), X8 es Asp (D) o Lys (K), X9 es Leu (L) o Val (V), X10 es cualquier aminoácido diferente de Glu (E) o Ser (S), X11 es Arg (R) o Asn (N), X12 es Val (V) o Ile (I), X13 es cualquier aminoácido, X14 es Asp (D) o Glu (E), y X15 es Glu (E) o Lys (K) (SEC ID nº 43).
Se da a conocer además que las ADN polimerasas pueden caracterizarse porque presentan el motivo siguiente (correspondiente a las ADN polimerasas derivadas de Thermus y Thermotoga): 14
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Ala-Gly-X1-Pro-Phe-Asn-X4-Asn-Ser-X7-X8-Gln-X9-X10-Arg-X12-Leu-Phe-X14-X15-Leu (también denominadas en la presente memoria en el código de una letra: A-G-X1-P-F-N-X4-N-S-X7-X8-Q-X9-X10-R-X12-L-F-X14-X15-L), en el que: X1 es His (H) o Glu (E), X4 es Leu (L) o Ile (I), X7 es Arg (R) o Pro (P), X8 es Asp (D) o Lys (K), X9 es Leu (L) o Val (V), X10 es cualquier aminoácido diferente de Glu (E) o Ser (S), X12 es Val (V) o Ile (I), X14 es Asp (D) o Glu (E), y X15 es Glu (E) o Lys (K) (SEC ID nº 44).
Se dan a conocer además ADN polimerasas que pueden caracterizarse porque presentan el motivo siguiente: Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-X6-Arg-Asp-Gln-Leu-X10-Arg-Val-Leu-X13-Asp-Glu-Leu (también denominado en el código de una letra: A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L), en el que: X6 es cualquier aminoácido, X10 es cualquier aminoácido diferente de Glu (E), y X13 es cualquier aminoácido (SEC ID nº 45).
Se dan a conocer además ADN polimerasas que pueden caracterizarse porque presentan el motivo siguiente: Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-X6-Arg-Asp-Gln-Leu-X10-Arg-Val-Leu-X13-Asp-Glu-Leu (también denominado en el código de una letra: A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L), en el que: X6 es cualquier aminoácido diferente de Ser (S), X10 es cualquier aminoácido diferente de Glu (E), y X13 es cualquier aminoácido diferente de Phe (F) (SEC ID nº 46).
Se dan a conocer además ADN polimerasas que pueden caracterizarse porque presentan el motivo siguiente: Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-X6-Arg-Asp-Gln-Leu-X10-Arg-Val-Leu-X13-Asp-Glu-Leu (también denominada en la presente memoria en el código de una letra: A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L), en el que: X6 es Ser (S), Gly (G), Ala (A), Asp (D), Phe (F), Lys (K), Cys (C), Thr (T) o Tyr (Y), X10 es Ser (S), Gln (Q), Ala (A), Gly (G), Lys (K) o Arg (R), y X13 es Phe (F), Ala (A), Gly (G), Ser (S), Thr (T), Tyr (Y), Asp (D) or Lys (K) (SEC ID nº 47).
Se dan a conocer además ADN polimerasas que pueden caracterizarse porque presentan el motivo siguiente: Ala-Gly-His-Pro-Phe-Asn-Leu-Asn-X6-Arg-Asp-Gln-Leu-X10-Arg-Val-Leu-X13-Asp-Glu-Leu (también denominado en el código de una letra: A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-X10-R-V-L-X13-D-E-L), en el que: X6 es Ser (S), Gly (G), Ala (A), Asp (D), Phe (F), Lys (K), Cys (C), Thr (T) o Tyr (Y), X10 es Lys (K), y X13 es Phe (F), Ala (A), Gly (G), Ser (S), Thr (T), Tyr (Y), Asp (D) o Lys (K) (SEC ID nº 48).
Este motivo se encuentra presente en el dominio de "dedos" de muchas ADN polimerasas dependientes de ADN de familia A, particularmente las ADN polimerasas termoestables de bacterias termofílicas (Li et al., EMBO J. 17:75147525, 1998). Por ejemplo, la figura 1 muestra una alineación de secuencias de aminoácidos que comprende la secuencia nativa correspondiente al motivo anteriormente indicado en ADN polimerasas de varias especies de bacterias: Escherichia coli, Bacillus caldotenax, Bacillus stearothermophilus, Deinococcus radiodurans, Thermosipho africanus, Thermotoga maritima, Thermotoga neopolitana, Thermus aquaticus, Thermus caldophilus, Thermus filiformus, Thermus flavus, Thermus sp. Sps17, Thermus sp. Z05 y Thermus thermophilus. Tal como se muestra, el motivo de SEC ID nº 8, excepto en el que X10 es E, S, A o G, se encuentra presente en cada una de dichas polimerasas, indicando una función conservada de esta región de la polimerasa. La figura 2 proporciona identidades de secuencia entre dichas ADN polimerasas.
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, se da a conocer una polimerasa que comprende SEC ID nº 8, 9, 10 o 11 (por ejemplo en la que X10 se selecciona, según resulte apropiado en la secuencia de consenso, de entre G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, K, R o H), que presenta la actividad y/o las características mejoradas indicadas en la presente memoria, y en la que la ADN polimerasa de otro modo es una ADN polimerasa de tipo salvaje o natural, tal como, por ejemplo, una polimerasa de cualquiera de las especies de bacterias termofílicas listadas anteriormente,
o es sustancialmente idéntica a dicha ADN polimerasa de tipo salvaje o natural. Por ejemplo, la polimerasa comprende SEC ID nº 8, 9, 10 o 11 y es idéntica por lo menos al 80%, 85%, 90% o 95% respecto a SEC ID nº 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 36, 37, 38, 39, 40 o 41. En una variación, la forma no modificada de la polimerasa es una especie del género Thermus. Se da a conocer además que la polimerasa no modificada procede de una especie termofílica de un género diferente de Thermus, por ejemplo de Thermotoga. Se encuentran disponibles las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos completa para numerosas ADN polimerasas termoestables. Cada una de las secuencias de Thermus aquaticus (Taq) (SEC ID nº 2), Thermus thermophilus (Tth) (SEC ID nº 6), Thermus sp. Z05 (SEC ID nº 1), Thermus species Sps17 (SEC ID nº 5), Thermotoga maritima (Tma) (SEC ID nº 2) y Thermosipho africanus (Taf) (SEC ID nº 37) han sido publicadas en la solicitud publicada de patente internacional PCT nº WO 92/06200. La secuencia de la ADN polimerasa de Thermus flavus (SEC ID nº 4) ha sido publicada en Akhmetzjanov y Vakhitov
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indicados supra) y, dados los motivos particulares identificados en la presente memoria, sirven para ayudar en la identificación de los aminoácidos exactos (y codones correspondientes) para la modificación según la presente invención. Las posiciones correspondientes a cada uno de X6, X10, X13 y X8 se muestran en la Tabla 1 para ADN polimerasas termoestables quiméricas representativas y ADN polimerasas termoestables de especies termofílicas ejemplares.
Tabla 1. Posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones de motivo X3, X10, X13 (por ejemplo de SEC ID nº 8, 9, 10 y 11) y X8 (de SEC ID nº 27) en las polimerasas ejemplares.
Organismo o secuencia quimérica
Posición de aminoácido
Consenso (SEC ID nº )
X6 X10 X13 X8 (de SEC ID nº 27).
T. thermophilus (6)
488 493 497 580
T. caldophilats (7)
488 493 497 580
T. sp. Z05 (1)
488 493 497 580
T. aquaticus (2)
486 491 495 578
T. flavus (4)
485 490 494 577
T. filiformis (3)
484 489 493 576
T. sp. Sps17 (5)
484 489 493 576
T. maritima (38)
548 553 557 640
T. neapolitana (39)
548 553 557 640
T. africanus (37)
548 553 557 639
B. caldotenax (41)
530 535 539 621
B. stearothermophilus (40)
530 535 539 620
CS5 (29)
548 553 557 640
CS6 (30)
548 553 557 640
En algunas realizaciones, la ADN polimerasa mutante de la presente invención se deriva de la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. (SEC ID nº 1) o una variante de la misma (por ejemplo D580G o similar). Tal como se ha indicado anteriormente, en la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. nativa, la posición X10 corresponde al ácido glutámico (E) en la posición 493; la posición X6 corresponde a la serina (S) en la posición 488; la posición X13 corresponde a la fenilalanina (F) en la posición 497 de SEC ID nº 1, y la posición X8 de la SEC ID nº 27 corresponde al aspartato (D) en la posición 580 de la SEC ID nº 1. De esta manera, se da a conocer que la polimerasa mutante comprende por lo menos una sustitución de aminoácido, respecto a la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp., en E493, S488, F497 y D580. De esta manera, se da a conocer que el aminoácido en la posición E493 no es E. Se da a conocer además que el aminoácido en la posición 493 se selecciona de entre G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, K, R o H. Se da a conocer además que el residuo aminoácido en la posición E493 es S, A, Q, G, K o R. En determinadas realizaciones, el residuo aminoácido en la posición E493 es A, G, K o R. Se da a conocer además que típicamente el aminoácido en la posición S488, en caso de sustituirse, no es S. Se da a conocer además que el aminoácido en la posición 488 de la SEC ID nº 1 se selecciona de entre G, A, V, L, I, M, F, W, P, E, T, C, N, Q, D, Y, K, R o H. Se da a conocer además que el residuo aminoácido en la posición S488 puede sustituirse o no sustituirse, y es S, G, A, D, F, K, C, T o Y. Se da a conocer además que típicamente el aminoácido en la posición F497, en caso de sustituirse, no es F. Se da a conocer además que el aminoácido en la posición 497 se selecciona de entre G, A, V, L, I, M, E, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, K, R o H. Se da a conocer además que el residuo aminoácido en la posición F497 puede sustituirse o no sustituirse, y es F, A, G, S, T, Y, D o K. Se da a conocer además que los residuos aminoácidos en la posición D580 pueden seleccionarse de entre leucina (L), glicina (G), treonina (T), glutamina (Q), alanina (A), serina (S), asparagina (N), arginina (R) y lisina (K). Entre las ADN polimerasas Z05 de Thermus sp. mutantes se incluyen las que comprenden la sustitución o sustituciones de aminoácidos E493K y D580G.
Entre las ADN polimerasas Z05 de Thermus sp. ejemplares se incluyen las que comprende la sustitución o sustituciones de aminoácidos E493S, E493A, E493Q, E493G, E493K, E493R, S488F, S488T, S488Y, S488G, S488A, S488D, S488K, S488C, F497Y, F497S, F497T, F497A, F497G, F497D, F497K y/o D580G Se da a conocer además que la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. mutante comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos aminoácidos E493 K (o E493A, E493Q, E493G, E493S, E493R) y D580G. Se da a conocer además que la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. mutante comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos aminoácidos E493 K (o E493A, E493Q, E493G, E493S, E493R) y S488F (o S488T, S488Y, S488G, S488A, S488D, S488K, S488C). Se da a conocer además que la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. mutante comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos aminoácidos E493 K (o E493A, E493Q, E493G, E493S, E493R) y F497S (o F497Y, F497T, F497A, F497G, F497D, F497K). Se da a conocer además que la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. mutante comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos aminoácidos E493 K (o E493A, E493Q, E493G, E493S, E493R), F497S (o F497Y, F497T, F497A, F497G, F497D, F497K) y S488F (o S488T, S488Y, S488G, S488A, S488D, S488K, S488C). Se da a conocer además que la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. mutante comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos aminoácidos seleccionados independientemente de entre E493K (o E493A, E493Q, E493G, E493S, E493R), F497S (o F497Y, F497T, F497A, F497G, F497D, F497K), S488F (o S488T, S488Y, S488G, S488A, S488D, S488K, S488C) y/o D580G).
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Se da a conocer que la ADN polimerasa se deriva de una especie de Thermus, y el aminoácido correspondiente a la posición 493 de la SEC ID nº 1 es un aminoácido que no presenta una cadena lateral con carga negativa polar a pH neutro (por ejemplo E). De esta manera, se da a conocer que la ADN polimerasa se deriva de una especie de Thermus y el aminoácido correspondiente a la posición 493 de la SEC ID nº 1 presenta una cadena lateral sin carga polar (por ejemplo S, Q), una cadena lateral sin carga no polar (por ejemplo A, G) o una cadena lateral con carga positiva polar (por ejemplo R o K) a pH neutro (por ejemplo aproximadamente pH 7,4). En algunas realizaciones, el aminoácido correspondiente a la posición 493 de la SEC ID nº 1 presenta una cadena lateral sin carga no polar (por ejemplo A, G) o una cadena lateral con carga positiva polar por ejemplo R o K). En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 493 de la SEC ID nº 1 que presenta una cadena lateral con carga positiva polar es R o K. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 493 de SEC ID nº 1 que presenta una cadena lateral con carga positiva polar es K.
En algunas realizaciones, las ADN polimerasas de la presente invención también pueden incluir otras modificaciones no por sustitución. Entre dichas modificaciones pueden incluirse, por ejemplo, modificaciones covalentes que es conocido de la técnica que confieren una ventaja adicional en aplicaciones que comprenden la extensión de polinucleótidos. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la ADN polimerasa mutante incluye además una modificación covalente térmicamente reversible. Las ADN polimerasas que comprenden dichas modificaciones térmicamente reversibles resultan particularmente adecuadas para las aplicaciones de inicio en caliente tales como, por ejemplo, diversas técnicas de PCR de inicio en caliente. Los reactivos modificadores térmicamente reversibles que pueden utilizarse de acuerdo con las ADN polimerasas mutantes de la presente invención se describen en, por ejemplo, la patente US nº 5.773.258.
Por ejemplo, las polimerasa particularmente adecuadas que comprenden una modificación covalente térmicamente reversible son:
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en la que R1 y R2 son hidrógenos o radicales orgánicos, que pueden estar unidos, o que presenta la fórmula II a continuación:
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en la que R1 y R2 son radicales orgánicos, que pueden encontrarse unidos, y los hidrógenos se encuentran en cis, esencialmente tal como se indica en Birch et al., supra.
Las ADN polimerasas de la presente invención pueden construirse mutando las secuencias de ADN que codifican la polimerasa no modificada correspondiente (por ejemplo una polimerasa de tipo salvaje o una variante correspondiente a partir de la que se deriva la polimerasa de la invención), tal como mediante la utilización de técnicas comúnmente denominadas mutagénesis dirigida a sitio. Las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la forma no modificada de la polimerasa pueden mutarse mediante una diversidad de técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocidas por el experto ordinario en la materia (ver, por ejemplo, PCR Strategies (M. A. Innis, D. H. Gelfand y J. J. Sninsky editores, 1995, Academic Press, San Diego, CA), capítulo 14; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky y T. J. White eds., Academic Press, NY, 1990).
A título de ejemplo no limitativo, el sistema de dos cebadores, utilizado en el kit de mutagénesis dirigida a sitio Transformer de Clontech, puede utilizarse para introducir mutantes dirigidos a sitio en un polinucleótido codificante de una forma no modificada de la polimerasa. Tras la desnaturalización del plásmido diana en este sistema, se hibridan simultáneamente dos cebadores con el plásmido: uno de estos cebadores contiene la mutación dirigida a sitio deseada; el otro contiene una mutación en otro punto en el plásmido que resulta en la eliminación de un sitio de restricción. A continuación, se lleva a cabo la síntesis de segunda cadena, ligando estrechamente dichas dos mutaciones, y los plásmidos resultantes se transforman en una cepa mutS de E. coli. Se aísla el ADN plasmídico a partir de las bacterias transformadas, cortadas con el enzima de restricción relevante (linearizando de esta manera los plásmidos no mutados) y después se transforma nuevamente en E. coli. Este sistema permite la generación de mutaciones directamente en un plásmido de expresión, sin la necesidad de subclonación o la generación de fagémidos de cadena sencilla. El ligamiento estrecho de las dos mutaciones y la posterior linearización de plásmidos no mutados resulta en una elevada eficiencia de mutación y permite un cribado mínimo. Tras la síntesis del cebador
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numerosos tipos de vectores de expresión apropiados, y secuencias reguladoras adecuadas, para una diversidad de células huésped. En general, entre las secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción pueden incluirse, por ejemplo, secuencias de promotor, sitios de unión ribosómica, secuencias de inicio y parada transcripcional, secuencias de inicio y parada traduccional y secuencias intensificadoras o activadoras. En realizaciones típicas, entre las secuencias reguladoras se incluyen un promotor y secuencias de inicio y parada transcripcional. Entre los vectores típicamente también se incluye una región policonectora que contiene varios sitios de restricción para la inserción de ADN foráneo. En determinadas realizaciones, se utilizan "señalizadores de fusión" para facilitar la purificación y, si se desea, la eliminación posterior de la secuencia de etiqueta/señalizadora, por ejemplo una "etiqueta de His". Sin embargo, éstas generalmente no resultan necesarias al purificar una proteína termoactiva y/o termoestable a partir de un huésped mesofílico (por ejemplo E. coli), en el que puede utilizarse una "etapa térmica". La construcción de vectores adecuados que contiene ADN codificante de secuencias replicación, secuencias reguladoras, genes de selección fenotípica y las polimerasas mutantes de interés se prepara utilizando procedimientos estándares de ADN recombinante. Los plásmidos aislados, vectores víricos y fragmentos de ADN se corta, adaptan y ligan entre sí en un orden específico para generar los vectores deseados, tal como es bien conocido de la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, 2a ed. 1989)).
En determinadas realizaciones, el vector de expresión contiene un gen marcador seleccionable para permitir la selección de las células huésped transformadas. Los genes de selección son bien conocidos de la técnica y varían según la célula huésped utilizada. Entre los genes de selección adecuados pueden incluirse, por ejemplo, genes codificantes de la resistencia a ampicilina y/o a tetraciclina, que permite que las células transformadas con estos vectores crezcan en presencia de estos antibióticos.
En un aspecto de la presente invención, se introduce en una célula un ácido nucleico codificante de una ADN polimerasa de la invención, solo o en combinación con un vector. Por "se introduce en" o equivalentes gramaticales en la presente memoria se hace referencia a que los ácidos nucleicos entran en las células de una manera adecuada para la integración, amplificación y/o expresión posteriores del ácido nucleico. El método de introducción está dictado en gran medida por el tipo celular diana. Entre los métodos ejemplares se incluyen la precipitación con CaPO4, la fusión de liposomas, Lipofectin®, la electroporación, la infección vírica y similares.
En algunas realizaciones se utilizan procariotas como células huésped para las etapas de clonación iniciales de la presente invención. Resultan particularmente útiles para la producción rápida de grandes cantidades de ADN, para la producción de ADN molde de cadena sencilla utilizado para la mutagénesis dirigida a sitio, para el cribado de muchos mutantes simultáneamente y para la secuenciación de ADN de los mutantes generados. Entre las células huésped procarióticas adecuadas se incluyen E. coli K12 cepa 94 (ATCC nº 31.446), E. coli cepa W3110 (ATCC nº 27,325), E. coli K12 cepa DG116 (ATCC nº 53,606), E. coli X1776 (ATCC No. 31,537) yd E. coli B; sin embargo, muchas otras cepas de E. coli, tales como HB101, JM101, NM522, NM538, NM539 y muchas otras especies y géneros de procariotas, incluyendo bacilos tales como Bacillus subtilis, otras enterobacteriáceas tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcesans, y diversas especies de Pseudomonas pueden ser utilizados como huéspedes. Las células huésped procarióticas u otras células huésped con paredes celulares rígidas se transforman típicamente utilizando el método de cloruro de calcio tal como se describe en la sección 1.82 de Sambrook et al., supra. Alternativamente, puede utilizarse la electroporación para la transformación de estas células. Las técnicas de transformación de procariotas se describen en, por ejemplo, Dower, en Genetic Engineering, Principles and Methods 12:275-296 (Plenum Publishing Corp., 1990); Hanahan et al., Meth. Enzymol., 204:63, 1991. Entre los plásmidos utilizados típicamente para la transformación de E. coli se incluyen pBR322, pUCI8, pUCI9, pUCIl8, pUC119 y Bluescript M13, la totalidad de los cuales se describe en las secciones 1.12 a 1.20 de Sambrook et al., supra. Sin embargo, también se encuentran disponibles otros muchos vectores adecuados.
En algunas realizaciones, las ADN polimerasas de la presente invención se producen mediante cultivo de una célula huésped transformada con un vector de expresión que contiene un ácido nucleico codificante de la ADN polimerasa, bajo condiciones apropiadas para inducir o causar la expresión de la ADN polimerasa. Los métodos de cultivo de células huésped transformadas bajo condiciones adecuadas para la expresión de proteínas son bien conocidas de la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra). Entre las células huésped adecuadas para la producción de las polimerasas de vectores plasmídicos que contiene promotor pL lambda se incluyen E. coli cepa DG116 (ATCC nº 53606) (ver la patente US nº 5.079.352 y Lawyer F.C. et al., PCR Methods and Applications 2:275-87, 1993). Tras la expresión, la polimerasa puede ser recolectada y aislada. Los métodos para purificar la ADN polimerasa termoestable se describen en, por ejemplo, Lawyer et al., supra.
Tras la purificación, puede someterse a ensayo la discriminación de no correspondencias 3' de una ADN polimerasa. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se determina la actividad de discriminación de no correspondencias 3' mediante la comparación de la amplificación de una secuencia diana perfectamente correspondiente con el cebador, y la amplificación de una diana que presenta una no correspondencia de una sola base en el extremo 3' del cebador. La amplificación puede detectarse, por ejemplo, en tiempo real mediante la utilización de sondas TaqManTM. La capacidad de una polimerasa de distinguir entre las dos secuencias diana puede estimarse comparando las Cp de las dos reacciones. Opcionalmente, puede llevarse a cabo la amplificación simultánea de un segundo gen diana en cada pocillo y detectarse en un segundo canal óptico a modo de control. La expresión "valor de delta Cp" se refiere a
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