ES2553400T3

ES2553400T3 - ADN polimerasas con actividad mejorada

Info

Publication number: ES2553400T3
Application number: ES12740895.3T
Authority: ES
Inventors: Keith Bauer; Thomas W. Myers; Fred Reichert; Shawn Suko
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2011-07-28
Filing date: 2012-07-26
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2032-07-26
Also published as: CA2839964A1; WO2013013822A1; CA2839964C; JP2014522656A; US20160002614A1; US9090883B2; CN103687943A; US20130196382A1; EP2737061A1; EP2737061B1; JP6378085B2; CN103687943B; US20180010106A1; US9738877B2

Abstract

ADN polimerasa que tiene una mayor eficiencia de transcriptasa inversa, en comparación con una ADN polimerasa de control, en la que el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 522 de la SEC ID Nº: 1 es cualquier aminoácido distinto de E y en la que la ADN polimerasa de control tiene la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa, excepto que el aminoácido de la ADN polimerasa de control correspondiente a la posición 522 de la SEC ID Nº: 1 es E.

Description

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reticulantes fotoactivables, aminoácidos de unión a metal, aminoácidos con marcaje de espín, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos que contienen metal, aminoácidos con grupos funcionales nuevos, aminoácidos que de forma covalente o no covalente interactúan con otras moléculas, aminoácidos fotoenjaulados y/o fotoisomerizables, aminoácidos radiactivos, aminoácidos que comprende biotina o un análogo de biotina, aminoácidos glicosilados, otros aminoácidos modificados co hidratos de carbono modificado, aminoácidos que comprenden polietilenglicol o poliéter, aminoácidos sustituidos con átomos pesados, aminoácidos químicamente escindibles y/o fotoescindibles, aminoácidos que contienen azúcar enlazado a carbono, aminoácidos con actividad redox, amino tioácido aminoácidos que contienen amino tioácido y aminoácidos que comprenden uno o más restos tóxicos.

El término “muestra biológica” abarca una variedad de tipos de muestras obtenidas de un organismo y se puede utilizar en un ensayo de diagnóstico o de control. El término abarca orina, sedimento de orina, sangre, saliva, y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejidos sólidos, tales como una muestra de biopsia o cultivos de tejidos o células derivadas de los mismos y la progenie de los mismos. El término abarca muestras que han sido manipuladas de cualquier forma después de su obtención, como por tratamiento con reactivos, solubilización, sedimentación, o enriquecimiento para ciertos componentes. El término abarca una muestra clínica, y también incluye células en cultivo celular, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluidos biológicos y muestras de tejido.

El término “mutante”, en el contexto de las ADN polimerasas de la presente invención, significa un polipéptido, normalmente recombinante, que comprende una o más sustituciones de aminoácidos con relación a una correspondiente ADN polimerasa, funcional.

El término "forma no modificada," en el contexto de una polimerasa mutante, es un término usado en la presente memoria a efectos de definir una ADN polimerasa mutante de la presente invención: el término “forma no modificada” se refiere a una ADN polimerasa funcional que tiene la secuencia de aminoácidos de la polimerasa mutante, excepto en una o más posición(es) de aminoácidos especificada como la caracterización de la polimerasa mutante. Por lo tanto, la referencia a una ADN polimerasa mutante en términos de (a) su forma no modificada y (b) una o más sustituciones de aminoácidos más especificadas significa que, con la excepción de la sustitución(es) de aminoácidos especificada, la polimerasa mutante tiene de otro modo una secuencia de aminoácidos idéntica a la forma no modificada en el motivo especificado. La “polimerasa no modificada” (y por lo tanto también la forma modificada que tiene una mayor eficiencia transcriptasa inversa, tolerancia al desapareamiento, velocidad de extensión y/o tolerancia de RT e inhibidores de la polimerasa) pueden *contener mutaciones adicionales para proporcionar una funcionalidad deseada, por ejemplo, la mejora de incorporación de dideosxirribonucleótidos, ribonucleótidos, análogos de ribonucleótidos, nucleótidos marcados con colorante, modulación de la actividad 5'nucleasa, modulación de la actividad 3'-nucleasa (verificación de las secuencias o “proofreading”) o similares. De acuerdo con ello, en la realización de la presente invención como se describe en la presente memoria, la forma no modificada de una ADN polimerasa está predeterminada. La forma no modificada de una ADN polimerasa puede ser, por ejemplo, una ADN polimerasa de tipo silvestre y/o de origen natural, o una ADN polimerasa que ya ha sido modificada intencionadamente. Una forma no modificada de la polimerasa es preferiblemente una ADN polimerasa termoestable, tales como las ADN polimerasas de varias bacterias termófilas, así como variantes funcionales de las mismas que tienen una identidad de secuencia sustancial a una polimerasa termoestable de tipo silvestre o de origen natural. Tales variantes pueden incluir, por ejemplo, ADN polimerasas quiméricas, tales como, por ejemplo, las ADN polimerasas quiméricas descritas en las Patentes US-6.228.628 y 7.148.049. En ciertas realizaciones, la forma no modificada de una polimerasa tiene actividad de transcriptasa inversa (RT).

El término “polimerasa termoestable” se refiere a una enzima que es estable al calor, es resistente al calor, y retiene la actividad suficiente para efectuar reacciones de extensión de polinucleótidos posteriores y no se desnaturalizado (inactiva) irreversiblemente cuando se somete a las temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de los ácidos nucleicos de doble cadena. Las condiciones de calentamiento necesarias para la desnaturalización de ácidos nucleicos son bien conocidas en la técnica y se ilustran en, por ejemplo, las Patentes US-4.683.202, 4.683.195 y 4.965.188. Como se utiliza en la presente memoria, una polimerasa termoestable es adecuada para su uso en una reacción de ciclos de temperatura tales como la reacción en cadena de la polimerasa (“PCR”). La desnaturalización irreversible para los propósitos de la presente memoria, se refiere a la pérdida permanente y completa de la actividad enzimática. Para una polimerasa termoestable, la actividad enzimática se refiere a la catálisis de la combinación de los nucleótidos en la manera apropiada para formar los productos de extensión de polinucleótidos que son complementarios a una cadena de ácido nucleico molde. Las ADN polimerasas termoestables de bacterias termófilas incluyen, por ejemplo, ADN polimerasas de Thermotoga maritima, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus flavus, Thermus filiformis, Thermus especies Sps17, Thermus especies Z05, Thermus caldophilus, Bacillus caldotenax, Thermotoga neopolitana y Thermosipho africanus.

El término “termoactiva” se refiere a una enzima que mantiene propiedades catalíticas a temperaturas comúnmente usadas para las etapas de transcripción inversa o de hibridación/extensión en las reacciones de RT-PCR y/o de PCR (es decir, de 45-80°C). Las enzimas termoestables son aquellas que no se desnaturalizan (inactivan) irreversiblemente cuando se somete a temperaturas elevadas necesarias para la desnaturalización de los ácidos nucleicos. Las enzimas termoactivas pueden o no pueden ser termoestables. Las ADN polimerasas termoactivas

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pueden ser dependientes de ADN o de ARN de especies termófilas o de especies mesófilas que incluyen, pero no se limitan a, Escherichia coli, virus de la leucemia murina de Moloney, y el virus de la mioblastosis aviar.

Tal como se usa en la presente memoria, una proteína “quimérico” se refiere a una proteína cuya secuencia de aminoácidos representa un producto de fusión de subsecuencias de las secuencias de aminoácidos de al menos dos proteínas distintas. Una proteína quimérica normalmente no es producida por manipulación directa de las secuencias de aminoácidos, sino, más bien, se expresan a partir de un gen “quimérico” que codifica para la secuencia de aminoácidos quimérica. En ciertas realizaciones, por ejemplo, una forma no modificada de una ADN polimerasa mutante de la presente invención es una proteína quimérica que consiste en una región amino-terminal (N-terminal) derivada de una ADN polimerasa de una especie del género Thermus y una región carboxi-terminal (Cterminal) derivada de la DNA polimerasa Tma. La región N-terminal se refiere a una región que se extiende desde el extremo N-terminal (posición de aminoácido 1) hasta un aminoácido interno. Del mismo modo, la región C-terminal se refiere a una región que se extiende desde un aminoácido interno hasta el extremo C-terminal.

El término “aptámero” se refiere a un ADN monocatenario que reconoce y se une a la ADN polimerasa e inhibe eficazmente la actividad de la polimerasa como se describe en la Patente US-5.693.502. También se discute el uso de aptámero y dUTP/UNG en la RT-PCR, por ejemplo, en Smith, E.S. et al., (Amplification of RNA: High-temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with a Magnesium-activated Thermostable DNA Polymerase, in PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Dieffenbach, C.W. and Dveksler, G.S., Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 211-219, (2003)).

En el contexto de las ADN polimerasas mutantes, “correspondencia” con otra secuencia (por ejemplo, regiones, fragmentos, nucleótidos o posiciones de aminoácidos, o similares) se basa en la convención de numeración de acuerdo con el número de posición de nucleótidos o aminoácidos y la alineación posterior de las secuencias de una manera que maximice el porcentaje de identidad de secuencia. Un aminoácido “que corresponde a la posición [X] de [secuencia específica]” se refiere a un aminoácido en un polipéptido de interés que se alinea con el aminoácido equivalente de una secuencia especificada. En general, como se describe en la presente memoria, el aminoácido que corresponde a una posición de una polimerasa puede ser determinado usando un algoritmo de alineación tal como BLAST como se describe a continuación. Debido a que no todas las posiciones dentro de una determinada “región de correspondencia” tienen que ser idénticas, las posiciones no coincidentes dentro de una región de correspondencia pueden ser consideradas como “posiciones de correspondencia”. En consecuencia, como se usa en la presente memoria, la referencia a una “posición de aminoácidos correspondiente a la posición del aminoácido [X]” de una ADN polimerasa especificada se refiere a posiciones equivalentes, basado en la alineación, en otras ADN polimerasas y homólogos y familias estructurales. En algunas realizaciones de la presente invención, la “correspondencia” de las posiciones de aminoácidos se determina con respecto a una región de la polimerasa que comprende uno o más motivos de SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 32 , 33, 34, 35, 36, 37 o 40. Cuando una secuencia de polipéptido de la polimerasa difiere de las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 32, 33, 34, 35, 36, 37 o 40 (por ejemplo, por cambios en aminoácidos o adición o deleción de aminoácidos), puede suceder que una mutación particular asociada con una actividad mejorada como se discute en la presente memoria no esté en el mismo número de posición que está en las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 32, 33, 34, 35, 36, 37 o 40. Esto se ilustra, por ejemplo, en la Tabla 1.

“Recombinante”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una secuencia de aminoácidos o a una secuencia de nucleótidos que ha sido modificada intencionalmente por métodos recombinantes. Con el término “ácido nucleico recombinante” se entiende en la presente memoria un ácido nucleico, formado originalmente in vitro, en general, mediante la manipulación de un ácido nucleico por endonucleasas de restricción, en una forma que no se encuentra normalmente en la naturaleza. Así, una ADN polimerasa de ácido nucleico mutante aislada, en una forma lineal, o un vector de expresión formado in vitro por ligación de moléculas de ADN que normalmente no se unen, se consideran recombinantes para los fines de esta invención. Se entiende que una vez que se crea un ácido nucleico recombinante y se reintroduce en una célula hospedadora, este se replicará de forma no recombinante, es decir, usando la maquinaria celular in vivo de la célula hospedadora en lugar de las manipulaciones in vitro; sin embargo, tales ácidos nucleicos, una vez producidos de forma recombinante, aunque posteriormente se repliquen de forma no recombinante, todavía se consideran recombinantes para los fines de la invención. Una “proteína recombinante” es una proteína producida mediante técnicas recombinantes, es decir, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante como se representa anteriormente.

Un ácido nucleico está “unido operativamente” cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si está colocado de manera que facilita la traducción.

El término “célula hospedadora” se refiere a organismos monocelulares procariotas y eucariotas (por ejemplo, bacterias, levaduras y actinomicetos) y células individuales de plantas o animales de orden superior cuando se cultivan en cultivo celular.

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generalmente un oligonucleótido de cadena sencilla (por ejemplo, oligodesoxirribonucleótido). La longitud apropiada de un cebador depende del uso previsto del cebador pero generalmente varía de 6 a 40 nucleótidos, más generalmente de 15 a 35 nucleótidos. Moléculas de cebador cortas generalmente requieren temperaturas más frías para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde. Un cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del molde pero debe ser suficientemente complementario para hibridar con un molde para que se produzca la elongación del cebador. En ciertas realizaciones, el término “par de cebadores” significa un conjunto de cebadores, incluyendo un cebador en sentido 5' (a veces denominado “directo”) que se hibrida con el complemento del extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico a amplificar y un cebador 3' antisentido (a veces llamado “inverso”) que se hibrida con el extremo 3' de la secuencia a amplificar (por ejemplo, si la secuencia diana se expresa como ARN o es un ARN). Un cebador puede marcarse, si se desea, mediante la incorporación de un marcador detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, marcadores útiles incluyen 32P, colorantes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (como se utiliza comúnmente en los ensayos ELISA), biotina, o haptenos y proteínas para los que se disponen antisueros o anticuerpos monoclonales.

El término “convencional” o “natural” cuando se refiere a las bases de ácido nucleico, nucleósidos trifosfato o nucleótidos se refiere a aquellos que existen naturalmente en el polinucleótido que se va a describir (es decir, para el ADN estos son dATP, dGTP, dCTP y dTTP). Además, dITP y 7-deaza-dGTP se utilizan con frecuencia en lugar de dGTP y 7-deaza-dATP se puede utilizar en lugar de dATP en las reacciones de síntesis in vitro de ADN, tal como la secuenciación. Colectivamente, estos pueden ser referidos como dNTPs.

El término “no convencional” o “modificado” cuando se refiere a una base de ácido nucleico, nucleósido o nucleótido

o incluye la modificación, derivaciones, o análogos de bases convencionales, nucleósidos, nucleótidos que ocurren naturalmente en un polinucleótido particular. Ciertos nucleótidos no convencionales están modificados en la posición 2' del azúcar ribosa en comparación con los dNTPs convencionales. Así, aunque para el ARN los nucleótidos de origen natural son ribonucleótidos (es decir, ATP, GTP, CTP, UTP, colectivamente rNTP), porque estos nucleótidos tienen un grupo hidroxilo en la posición 2' del azúcar, que, por comparación está ausente en los dNTPs, como se usa en la presente memoria, los ribonucleótidos son nucleótidos no convencionales como sustratos para las ADN polimerasas. Tal como se usa en la presente memoria, los nucleótidos no convencionales incluyen, pero no se limitan a, compuestos usados como terminadores para la secuenciación de ácidos nucleicos. Compuestos terminadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a aquellos compuestos que tienen una estructura 2',3' didesoxi y que se denominan como didesoxinucleósidos trifosfato. Los didesoxinucleósidos trifosfato ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP se conocen colectivamente como ddNTPs. Otros ejemplos de compuestos terminador incluyen análogos 2'-PO4 de ribonucleótidos (véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud Nº 2005/0037991 y 2005/0037398). Otros nucleótidos no convencionales incluyen fosforotioato dNTPs ([α-S]dNTPs), 5'-[ α-borano]-dNTPs, [α]-metil-fosfonato dNTPs y ribonucleósidos trifosfato (rNTPs). Bases no convencionales se pueden marcar con isótopos radiactivos tales como 32P, 33P o 35S; marcadores fluorescentes; marcadores quimioluminiscentes; marcadores bioluminiscentes; marcadores haptenos tales como biotina; o marcadores enzimáticos, tales como estreptavidina o avidina. Los marcadores fluorescentes pueden incluir colorantes que están cargados negativamente, tales como colorantes de la familia de la fluoresceína o colorantes que son de carga neutra, tales como colorantes de la familia de la rodamina, o colorantes que están cargados positivamente, tales como colorantes de la familia de la cianina. Los colorantes de la familia de la fluoresceína incluyen, por ejemplo, FAM, HEX, TET, JOE, NAN y ZOE. Los colorantes de la familia de la rodamina incluyen Texas Red, ROX, R110, R6G y TAMRA. Varios tintes o nucleótidos marcados con FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G, Texas Red y TAMRA son comercializados por Perkin-Elmer (Boston, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA) o sondas Invitrogen/Moleculares (Eugene, OR). Los colorantes de la familia de la cianina incluyen Cy2, Cy3, Cy5 y Cy7 y son comercializados por GE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, Inglaterra).

Como se usa en la presente memoria, “porcentaje de identidad de secuencia” se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en el que la porción de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, brechas) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico o residuo de aminoácido idénticos en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.

Los términos “idéntico” o porcentaje de “identidad”, en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas. Las secuencias son “sustancialmente idénticas” entre sí si tienen un porcentaje especificado de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son los mismos (por ejemplo., al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, o al menos 95% de identidad sobre una región determinada)), cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima en una ventana de comparación, o región designada según se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o mediante alineamiento manual e inspección visual. Las secuencias son “sustancialmente idénticas” entre sí si son al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, o al menos 55% idénticas. Estas

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un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la menor probabilidad de suma en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,2, generalmente menor que aproximadamente 0,01 y más generalmente menor que aproximadamente 0,001.

El término “eficacia de la transcripción inversa” se refiere a la fracción de moléculas de ARN que son transcritas inversamente como ADNc en una reacción de transcripción inversa dada. En ciertas realizaciones, las ADN polimerasas mutantes de la invención han mejorado la eficiencia de transcripción inversa en relación con las formas no modificadas de estas ADN polimerasas. Es decir, estas ADN polimerasas mutantes transcriben inversamente una mayor fracción de moldes de ARN que sus formas sin modificar en un conjunto particular de condiciones de reacción. La eficacia de la transcripción inversa se puede medir, por ejemplo, mediante la medición del punto de cruce (Cp) de una reacción de PCR utilizando un molde de ARN y comparando el valor de Cp con un valor Cp de una reacción de control en la que un molde de ADN de la misma secuencia (excepto que las U están reemplazadas con T) se amplifica, en el que las amplificaciones de ARN y ADN utilizan conjunto de cebadores comunes y la misma polimerasa, por ejemplo, como se describe en los ejemplos. Una polimerasa de ensayo tiene una mayor eficiencia RT cuando la polimerasa de ensayo tiene un valor Cp disminuido en comparación con una polimerasa de control cuando se utiliza ARN como un molde, pero tiene un valor de Cp sustancialmente sin cambios con respecto a la polimerasa control cuando se usa ADN como un molde. En algunas realizaciones una polimerasa de la invención tiene una eficiencia RT mejorada, de modo que Cp es al menos uno, dos, tres, cuatro, o cinco unidades menos que la polimerasa control correspondiente en el molde de ARN.

El término “tolerancia al desapareamiento” se refiere a la capacidad de una polimerasa para tolerar una secuencia que contiene desapareamiento, cuando se extiende un ácido nucleico (por ejemplo, un cebador u otro oligonucleótido) de una manera dependiente del molde uniendo (por ejemplo, covalentemente) uno o más nucleótidos con el ácido nucleico. El término “tolerancia al desapareamiento 3'” se refiere a la capacidad de una polimerasa para tolerar una secuencia (casi complementaria) que contiene desapareamiento en donde el ácido nucleico a ser extendido (por ejemplo, un cebador u otro oligonucleótido) tiene una falta de coincidencia con su molde en el nucleótido 3' terminal del cebador. Los desapareamientos en el molde también pueden estar situados en el penúltimo nucleótido 3' del cebador, o en otra posición dentro de la secuencia del cebador.

El término “discriminación por desapareamiento” se refiere a la capacidad de una polimerasa para distinguir una secuencia totalmente complementaria de una secuencia que contiene desapareamiento, cuando se extiende un ácido nucleico (por ejemplo, un cebador u otro oligonucleótido) de una manera dependiente del molde uniendo (por ejemplo, covalentemente) uno o más nucleótidos al ácido nucleico. El término “discriminación por desapareamiento 3'” se refiere a la capacidad de una polimerasa para distinguir una secuencia totalmente complementaria de una secuencia (casi complementaria) que contiene desapareamiento en donde el ácido nucleico a ser extendido (por ejemplo, un cebador u otro oligonucleótido) tiene una falta de apareamiento en el extremo 3' terminal comparado con el molde con el que hibrida el ácido nucleico. El término “desapareamiento” se refiere a la existencia de uno o más desapareamientos de bases (u “oposiciones de bases no complementarias”) dentro de un tramo de secuencias que de otro modo son formadoras de dúplex complementarios (o pueden formar dúplex complementarios).

El término “valor de Cp” o valor ·punto de cruce” se refiere a un valor que permite la cuantificación de los ácidos nucleicos diana de entrada. El valor de Cp puede ser determinado de acuerdo con el máximo por el método de la segunda derivada (Van Luu-The, et al., “Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second derivative calculation and double correction” BioTechniques, Vol. 38, Nº 2, Febrero 2005, pp. 287-293). En el método de la segunda derivada, un Cp corresponde al primer pico de una segunda curva derivada. Este pico corresponde al comienzo de una fase log-lineal. El método de la segunda derivada calcula un segundo valor de la derivada de la curva de intensidad de la fluorescencia en tiempo real, y se obtiene un único valor. El de Cp método original se basa en una aproximación diferenciable definida localmente, de los valores de intensidad, por ejemplo, mediante una función polinómica. A continuación, se calcula la tercera derivada. El valor de Cp es la raíz más pequeña de la tercera derivada. El Cp también puede determinarse utilizando el método de punto de ajuste, en el que el Cp está determinado por la intersección de una paralela con la línea del umbral en la región de log-lineal (Van Luu-La, et al., BioTechniques, vol.38, Nº 2, Febrero de 2005, pp.287-293). El valor de Cp proporcionado por el instrumento LightCycler ofrecido por Roche por cálculo de acuerdo con el método del máximo de la segunda derivada.

El término “eficiencia de la PCR” se refiere a una indicación de la eficiencia de amplificación de un ciclo a otro. La eficiencia de la PCR se calcula para cada condición mediante la ecuación: % de eficiencia de la PCR = (10(-pendiente) 1) x 100, en el que la pendiente se calculó por regresión lineal con el número de copias representadas en el eje y Cp representado en el eje x. La eficiencia de la PCR se puede medir usando un molde de cebador perfectamente apareado o no apareado.

El término “velocidad de extensión del ácido nucleico” se refiere a la velocidad a la que un biocatalizador (por ejemplo, una enzima, tal como una polimerasa, ligasa, o similares) extiende un ácido nucleico (por ejemplo, un cebador u otro oligonucleótido) de una manera dependiente del molde o de una manera independiente del molde uniendo (por ejemplo, covalentemente) uno o más nucleótidos al ácido nucleico. A modo ilustrativo, ciertas ADN polimerasas mutantes descritas en la presente memoria tienen velocidades de extensión de ácido nucleico

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X9 es Glu (E), Gly (G) o Asn (N); X10 es Ala (A) o Glu (E); X11 es Pro (P) o Glu (E).

En algunas realizaciones, las ADN polimerasas de la invención se pueden caracterizar por tener el siguiente motivo:

Ser-Thr-Ser-Ala-Ala-Val-Leu-X5-Ala-Leu-Arg-Glu-Ala-His-Pro-Ile (denominado también en la presente memoria en el código de una letra como S-T-S-A-A-V-L-X5-A-L-R-E-A-H-P-I) (SEC ID Nº: 10); en la que X5 es cualquier aminoácido distinto de Glu (E).

Ser-Thr-Ser-Ala-Ala-Val-Leu-X5-Ala-Leu-Arg-Glu-Ala-His-Pro-Ile (denominado también en la presente memoria en el código de una letra como S-T-S-A-A-V-L-X5-A-L-R-E-A-H-P-1) (SEC ID Nº: 11); en la que X5 es Gly (G).

Este motivo está presente dentro del dominio “pulgar” de muchas ADN polimerasas dependientes de ADN del tipo Familia A, en particular las ADN polimerasas termoestables de bacterias termófilas (Li et al., EMBO J. 17:7514-7525, 1998). Por ejemplo, la Figura 1 muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos de una región del dominio "pulgar" de las ADN polimerasas de varias especies de bacterias: Bacillus caldotenax, Bacillus stearothermophilus, Deinococcus radiodurans, Thermosipho africanus, Thermotoga maritima, Thermotoga neopolitana, Thermus aquaticus, Thermus caldophilus, Thermus filiformus, Thermus flavus, Thermus sp. Sps17, Thermus sp. Z05 y Thermus thermophilus. Como se muestra, la secuencia nativa correspondiente al motivo anterior está presente en cada una de estas polimerasas, lo que indica una función conservada de esta región de la polimerasa. La Figura 2 proporciona identidades de secuencia entre estas ADN polimerasas.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, la invención proporciona una polimerasa que comprende la SEC ID Nº: 8, 9, 10 o 11, que tiene la actividad y/o características mejoradas descritas en la presente memoria y en la que la ADN polimerasa es por lo demás una ADN polimerasa de tipo silvestre o una de origen natural, tal como, por ejemplo, una polimerasa de cualquiera de las especies de bacterias termófilas enumeradas anteriormente, o es sustancialmente idéntica a una ADN polimerasa de tipo silvestre o natural. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la polimerasa de la invención comprende la SEC ID Nº: 8, 9, 10, o 11 y es al menos 80%, 85%, 90%, o 95% idéntica a la SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 32, 33, 34, 35, 36, 37 o 40. En una variación, la forma no modificada de la polimerasa es de una especie del género Thermus. En otras realizaciones de la invención, la polimerasa no modificada es de una especie termófila diferente a Thermus, por ejemplo, Thermotoga. La secuencia de ácido nucleico y aminoácidos completa de numerosas ADN polimerasas termoestables están disponibles. Las secuencias de cada una de las polimerasas de Thermus aquaticus (Taq) (SEC ID Nº: 2), Thermus thermophilus (Tth) (SEC ID Nº: 6), Thermus species Z05 (SEC ID Nº: 1), Thermus species Sps17 (SEC ID Nº: 5), Thermotoga marítima (Tma) (SEC ID Nº: 34) y Thermosipho africanus (Taf) (SEC ID Nº: 33) han sido publicadas en el documento WO 92/06200. La secuencia de la ADN polimerasa de Thermus flavus (SEC ID Nº: 4) ha sido publicada en Akhmetzjanov y Vakhitov (Nucleic Acids Research 20: 5839, 1992). La secuencia de la ADN polimerasa termoestable de Thermus caldophilus (SEC ID Nº: 7) se encuentra en el EMBL/GenBank Nº de acceso U62584. La secuencia de la ADN polimerasa termoestable de Thermus filiformis se puede obtener de la ATCC Nº de depósito 42380 utilizando, por ejemplo, los métodos proporcionados en la Patente US-4.889.818, así como la información de secuencia proporcionada en la Tabla 1. La secuencia de la ADN polimerasa de Thermotoga neapolitana (SEC ID Nº: 35) procede de la base de datos de patentes GeneSeq Nº R98144 y del documento WO 97/09451. La secuencia de la ADN polimerasa termoestable de Bacillus caldotenax (SEC ID Nº: 37 se describe en, por ejemplo, Uemori et al. (J Biochem (Tokyo) 113 (3):401-410, 1993; ver también la base de datos Swiss-Prot, Nº de acceso Q04957 y GenBank, números de acceso D12982 y BAA02361). Ejemplos de formas no modificadas de ADN polimerasas que pueden ser modificadas como se describe en la presente memoria también se describen en, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos 6.228.628; 6.346.379; 7.030.220; 6.881.559; 6.794.177; 6.468775; 7.148.049; 7.179.590; 7.410.782; 7.378.262. En el Listado de secuencias también se proporcionan secuencias de polimerasa de longitud completa representativas. Por ejemplo, la ADN polimerasa de Deinococcus radiodurans (Dra) se muestra como SEC ID Nº: 32.

También susceptibles a las mutaciones descritas en la presente memoria son las ADN polimerasas funcionales que se han modificado previamente (por ejemplo, mediante sustitución, adición o deleción de aminoácidos). En algunas realizaciones, tales polimerasas funcionales modificadas conservan el motivo de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8 (o un motivo de la SEC ID Nº: 9, 10 o 11) y opcionalmente el motivo de aminoácidos de la SEC ID Nº: 38. Por lo tanto, las ADN polimerasas no modificadas adecuadas incluyen también variantes funcionales de las polimerasas de tipo silvestre o natural. Tales variantes generalmente tendrán una identidad o similitud de secuencia sustancial con la polimerasa de tipo silvestre o natural, generalmente al menos 80% de identidad de secuencia y más generalmente al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia.

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En algunas realizaciones, la polimerasa de la invención, además de tener un dominio polimerasa que comprende las SEC ID Nº: 8, 9, 10, o 11 también comprende un dominio nucleasa (por ejemplo, correspondiente a las posiciones 1 a 291 de Z05)

En algunas realizaciones, una polimerasa de la invención es una polimerasa quimérica, es decir, que comprende las regiones de polipéptidos de dos o más enzimas. Ejemplos de tales ADN polimerasas quiméricas se describen en, por ejemplo, Patente US-6.228.628. Particularmente adecuadas son las ADN polimerasas quiméricas de la familia CS, que incluyen las polimerasas CS5 (SEC ID Nº: 27) y CS6 (SEC ID Nº: 28) y variantes de las mismas que tienen una identidad o similitud sustancial en la secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº: 27 o la SEC ID Nº: 28 (generalmente al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos y más generalmente al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% de identidad de la secuencia de aminoácidos) y, por lo tanto, pueden ser modificadas para contener la SEC ID Nº: 8. Las ADN polimerasas CS5 y CS6 son enzimas quiméricas derivadas de las ADN polimerasas de Thermus sp. Z05 y Thermotoga marítima (Tma). Estas comprenden el dominio 5'nucleasa N-terminal de la enzima de Thermus y los dominios 3'-5'-exonucleasa C-terminal y polimerasa de la enzima Tma. Estas enzimas tienen actividad de transcriptasa inversa eficiente, pueden extender cebadores que contienen análogos de nucleótidos y pueden incorporar alfa-fosforotioato dNTPs, dUTP, dITP y también dNTPs marcados con marcadores de la familia de la fluoresceína y la cianina. Las polimerasas CS5 y CS6 también son enzimas de PCR activadas con Mg2+ eficientes. Las polimerasas CS5 y CS6 quiméricas se describen adicionalmente en, por ejemplo, la Patente US-7.148.049.

En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos individuales. Las ADN polimerasas proporcionadas en la presente memoria pueden comprender una o más sustituciones de aminoácidos en el sitio activo con respecto a la polimerasa no modificada. En algunas realizaciones, la sustitución(es) de aminoácidos comprenden por lo menos la posición X5 del motivo expuesta en la SEC ID Nº: 8 (o un motivo de la SEC ID Nº: 9, 10 o 11). Una sustitución de aminoácido en esta posición confiere una mayor eficiencia de la transcriptasa inversa, produciendo un ADN polimerasa mutante con una mayor eficiencia de transcriptasa inversa con respecto a la polimerasa no modificada. Generalmente, el aminoácido en la posición X5 está sustituido con un aminoácido que no se corresponde con la secuencia nativa del motivo expuesto en la SEC ID Nº: 8 (o un motivo de la SEC ID Nº: 9, 10 o 11).Por lo tanto, generalmente, el aminoácido en la posición X5, si está sustituido, no es Glu

(E) como es el que existe en esta posición en las polimerasas de origen natural (véase, por ejemplo, Figura 1). En ciertas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos incluyen G, A, L, M, F, W, P, S, T, C, Y, Q, D, K, R, V, I, N, o H en la posición X5. En ciertas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos incluyen glicina (G) en la posición X5. Otra sustitución(es) de aminoácido adecuada en uno o más de los sitios identificados se puede determinar usando, por ejemplo., métodos conocidos de mutagénesis dirigida al sitio y la determinación del rendimiento en los ensayos de extensión de polinucleótidos descritos con más detalle en la presente memoria o de otra modo conocidos para los expertos en la técnica.

En algunas realizaciones, la polimerasa de la invención comprende la SEC ID Nº: 8, 9, 10, o 11 y además comprende uno o más cambios de aminoácidos adicionales (por ejemplo, por sustitución, adición o deleción de aminoácidos) en comparación con una polimerasa nativa. En algunas realizaciones, tales polimerasas conservan el motivo de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8 (o un motivo de la SEC ID Nº: 9, 10 o 11), y además comprenden el motivo de aminoácidos de la SEC ID Nº: 38 (correspondiente a la mutación D580X de Z05 (SEC ID Nº: 1)) como sigue:

Thr-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser-X7-X8-Pro-Asn-Leu-Gln-Asn (también denominado en este documento en el código de una letra como T-G-R-L-S-S-X7-X8-P-N-L-Q-N) (SEC ID Nº: 38); en la que

X7 es Ser (S) o Thr (T); y X8 es cualquier aminoácido distinto de Asp (D) o Glu (E)

La mutación caracterizada por la SEC ID Nº: 38 se trata con más detalle en, por ejemplo, la publicación de patente US-2009/0148891.Tales polimerasas variantes funcional generalmente tendrán una identidad o similitud de secuencia sustancial con la de la polimerasa de tipo silvestre o natural (por ejemplo, SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 32, 33, 34, 35, 36, 37 o 40), generalmente al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos y más generalmente al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos.

En algunas realizaciones, la ADN polimerasa de la invención comprende una sustitución de aminoácido en la posición X5 (por ejemplo, como en un motivo seleccionado de la SEC ID Nº: 8, 9, 10 o 11) y comprende una sustitución de aminoácidos correspondiente a la SEC ID Nº: 38.

Otras sustitución(es) de aminoácidos adecuadas en uno o más de los sitios identificados se puede determinar usando, por ejemplo, métodos conocidos de mutagénesis dirigida al sitio y la determinación del rendimiento en los ensayos de extensión de polinucleótidos descritos con más detalle en la presente memoria o de otra manera conocidos para los expertos en la técnica, por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos descritas en la Publicación de Patente US 2009/0148891 y 2009/0280539.

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Debido a que la longitud precisa de las ADN polimerasas varían, las posiciones de los aminoácidos precisas que corresponden a cada uno de X5 de la SEC ID Nº: 8, 9, 10 o 11 o X8 de la SEC ID Nº: 38 puede variar dependiendo de la polimerasa mutante particular utilizada. Los programas de alineación de secuencias de aminoácidos y ácido nucleicos están fácilmente disponibles (véase, por ejemplo, los mencionados más arriba) y, dados los motivos particulares identificados en la presente memoria, sirven para ayudar en la identificación de los aminoácidos exactos (y los codones correspondientes) para la modificación de acuerdo con la presente invención. Las posiciones correspondientes a cada uno de X5 y X8 se muestran en la Tabla 1 para ADN polimerasas termoestables quiméricas representativas y ADN polimerasas termoestables de especies termófilas ilustrativas.

Tabla 1. Posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones del motivo X5 (por ejemplo, de la SEC ID Nº: 8, 9, 10, y 11) y X8 (de la SEC ID Nº: 38) en las polimerasas ilustrativas

Organismo o secuencia quimérica: Posición del aminoácido

Consenso (SEC ID Nº :): X5 X8 (de la SEC ID Nº: 38)

T. thermophilus (6): 522 580

T. caldophilus (7): 522 580

T.sp. Z05 (1): 522 580

T. aquaticus (2): 520 578

T. flavus (4): 519 577

T. filiformis (3): 518 576

T.sp. Sps17 (5): 518 576

T. marítima (34): 582 640

T. neapolitana (35): 582 640

T. africanus (33): 581 639

B. caldotenax (37): 562 621

B. stearothermophilus (36): 562 620

CS5 (27): 582 640

CS6 (28): 582 640

D. radiodurans (32): 610 668

En algunas realizaciones, la ADN polimerasa de la presente invención es la ADN polimerasa de Thermus sp. Z05 ADN (SEC ID Nº: 1) o una variante de la misma (por ejemplo, portadora de la mutación D580G o similar). Como se ha mencionado anteriormente, en la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp., la posición X5 corresponde a ácido glutámico (E) en la posición 522; la posición X8 corresponde a aspartato (D) en la posición 580. Así, en ciertas variaciones de la invención, la polimerasa mutante comprende al menos una sustitución de aminoácidos, respecto a una ADN polimerasa de Thermus sp. Z05, en E522 y/o D580. Por lo tanto, generalmente, el aminoácido en la posición 522 no es E. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 522 se selecciona de G, A, L, M, F, W, P, S, T, C, Y, Q, D, K, R, V, I, N o H. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 552 de la SEC ID Nº: 1 es un aminoácido que tiene una cadena lateral no polar sin carga (por ejemplo, G, A, L, M, W, P, F, C, V o I) a pH neutro. En ciertas realizaciones, el residuo de aminoácidos en la posición 522 es G. En ciertas realizaciones, los residuos de aminoácidos en la posición D580 se pueden seleccionar de leucina (L), glicina (G), treonina (T), glutamina (Q), alanina ( A), serina (S), asparagina (N), arginina (R) y lisina (K).

Ejemplos de ADN polimerasa de Thermus sp. Z05 mutantes incluyen los que comprenden la sustitución(es) de aminoácidos E522G y/o D580G. En algunas realizaciones, la ADN polimerasa de Thermus sp. Z05 mutante comprende, por ejemplo., Sustituciones de aminoácidos de residuos E552G y D580G. En ciertas realizaciones, el mutante ADN polimerasa Z05 de Thermus sp comprende, por ejemplo, sustituciones de residuos de aminoácidos independientemente seleccionados entre E522G y/o D580G.

Además de la mutación de los motivos de las SEC ID Nº: 8, 9, 10, 11 y 38 como se describe en la presente memoria, las ADN polimerasas de la presente invención también pueden incluir otra modificación(es), no de sustitución (s). Tales modificaciones pueden incluir, por ejemplo, modificaciones covalentes conocidas en la técnica por conferir una ventaja adicional en las aplicaciones que comprenden la extensión de polinucleótidos. Por ejemplo, una modificación de este tipo es una modificación covalente reversible térmicamente que inactiva la enzima, pero que se invierte para activar la enzima tras la incubación a una temperatura elevada, tal como una temperatura generalmente utilizada para la extensión de polinucleótidos. Reactivos ilustrativos para tales modificaciones térmicamente reversibles se describen en la Patente US-5.773.258 y 5.677.152.

Las ADN polimerasas de la presente invención se pueden construir mediante la mutación de las secuencias de ADN que codifican para la polimerasa no modificada correspondiente (por ejemplo, una polimerasa de tipo silvestre o una variante correspondiente a partir de la cual se deriva la polimerasa de la invención), tal como mediante el uso de

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técnicas comúnmente conocidas como mutagénesis dirigida al sitio. Las moléculas de ácido nucleico que codifican la forma no modificada de la polimerasa pueden mutarse por una variedad de técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocidas para un experto normal en la técnica (véase, por ejemplo, PCR Strategies (M. A. Innis, D. H. Gelfand, and J. J. Sninsky eds., 1995, Academic Press, San Diego, CA) en el Capítulo 14; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky and T. J. White eds., Academic Press, NY, 1990).

A modo de ejemplo no limitativo, el sistema de dos cebadores, utilizado en el kit Transformer Site-Directed Mutagenesis de Clontech, se puede emplear para la introducción de mutantes dirigidos al sitio en un polinucleótido que codifica para una forma no modificada de la polimerasa. Después de la desnaturalización del plásmido diana en este sistema, dos cebadores se hibridan simultáneamente con el plásmido; uno de estos cebadores contiene la mutación dirigida al sitio deseada, el otro contiene una mutación en otro punto del plásmido que da lugar a la eliminación de un sitio de restricción. La síntesis de la segunda cadena se lleva a cabo a continuación, estando estrechamente asociadas estas dos mutaciones, y los plásmidos resultantes se transforma en una cepa mutS de E. coli. El ADN del plásmido se aísla de las bacterias transformadas, se trata con la correspondiente enzima de restricción (linealizando así los plásmidos no mutados) y luego se retransforma en E. coli. Este sistema permite la generación de mutaciones directamente en un plásmido de expresión, sin la necesidad de subclonación ni de la generación de fagémidos monocatenarios. La fuerte asociación entre las dos mutaciones y la posterior linealización de los plásmidos no mutados dan como resultado una alta eficiencia de mutación y permiten el cribado mínimo. Después de la síntesis del cebador del sitio de restricción inicial, este método requiere el uso de un sólo nuevo tipo de cebador por sitio de la mutación. En lugar de preparar cada mutante posicional por separado, se puede sintetizar un conjunto de cebadores de oligonucleótidos “degenerados diseñados” con el fin de introducir todas las mutaciones deseadas en un sitio dado de forma simultánea. Los transformantes se pueden seleccionar mediante la secuenciación del ADN del plásmido a través de la región mutagenizada para identificar y ordenar clones mutantes. Cada ADN mutante puede entonces ser restringido y analizado por electroforesis, tal como, por ejemplo, en un gel de Aumento de la detección de mutaciones (Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) para confirmar que no se han producido otras alteraciones en la secuencia (por comparación del desplazamiento de banda con control no mutagenizado). Alternativamente, toda la región de ADN puede ser secuenciada para confirmar que no se han producido eventos mutacionales adicionales fuera de la región específica.

Las ADN polimerasas con más de un aminoácido sustituido se pueden generar de varias maneras. En el caso de los aminoácidos situados muy juntos en la cadena polipeptídica, pueden mutarse simultáneamente utilizando un oligonucleótido que codifique para todas las sustituciones de aminoácidos deseadas. Sin embargo, si los aminoácidos están situados a cierta distancia unos de otros (separados por más de diez aminoácidos, por ejemplo) es más difícil generar un único oligonucleótido que codifique todos los cambios deseados. En su lugar, se pueden usar uno de los dos métodos alternativos. En el primer método, se genera un oligonucleótido aislado para cada aminoácido a ser sustituido. Los oligonucleótidos se hibridaron a continuación simultáneamente con el ADN molde monocatenario y la segunda cadena de ADN que se sintetiza a partir del molde codificará todas las sustituciones de aminoácidos deseadas. Un método alternativo implica dos o más rondas de mutagénesis para producir el mutante deseado. La primera ronda es como se describe para los mutantes individuales: el ADN que codifica para la polimerasa no modificada se utiliza para el molde, un oligonucleótido que codifica para la primera sustitución(es) de aminoácidos deseada) se hibrida con este molde y entonces se genera la molécula de ADN heterodúplex. La segunda ronda de mutagénesis utiliza el DNA mutado producido en la primera ronda de mutagénesis como molde. Por lo tanto, esta molde ya contiene una o más mutaciones. El oligonucleótido que codifica para la sustitución(es) de aminoácidos adicional deseadas se hibrida a continuación con este molde y la cadena resultante de ADN codifica ahora para las mutaciones de la primera y segunda rondas de mutagénesis. Este ADN resultante se puede utilizar como un molde en una tercera ronda de mutagénesis, etc. Alternativamente, se pueden utilizar el método de mutagénesis multi-sitio de Seyfang y Jin (Anal. Biochem. 324:285-291. 2004).

En consecuencia, también se proporcionan ácidos nucleicos recombinantes que codifican para cualquiera de las ADN polimerasas de la presente invención. Con un ácido nucleico de la presente invención, que codifica para una ADN polimerasa, se puede usar una variedad de vectores. Cualquier vector que contenga un replicón y secuencias control obtenidas de una especie compatible con la célula hospedadora se pueden utilizar en la práctica de la invención. Generalmente, los vectores de expresión incluyen regiones de ácido nucleico reguladoras de la transcripción y de la traducción unidas operativamente al ácido nucleico que codifica la ADN polimerasa. El término “secuencias de control” se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión al ribosoma. Además, el vector puede contener un elemento positivo retroregulador (PRE) para aumentar la semivida del ARNm transcrito (ver Gelfand et al. Patente US-4.666.848). Las regiones de ácido nucleico reguladoras de la transcripción y la traducción serán generalmente apropiadas para la célula hospedadora utilizada para expresar la polimerasa. En la técnica, son conocidos numerosos tipos de vectores de expresión apropiados, y secuencias reguladoras adecuadas para una variedad de células hospedadoras. En general, las secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción pueden incluir, por ejemplo., secuencias promotoras, sitios de unión ribosomal, secuencias de inicio y fin de la transcripción, secuencias de inicio y fin de la traducción y secuencias potenciadoras o activadoras. En realizaciones típicas, las secuencias reguladoras incluyen un promotor y secuencias de inicio y fin

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Preparación de la biblioteca de extractos. Parte 2 -Extracción: Los sedimentos celulares de la etapa de fermentación se resuspendieron en 25 µl de tampón de lisis (Tabla 3 a continuación) y se transfirieron a placas del termociclador de 384 pocillos y se sellaron. Hay que señalar el tampón contenía lisozima para ayudar a la lisis celular y ADNasa para eliminar el ADN del extracto. Para lisar las células, las placas se incubaron a 37 °C durante 15 minutos, se 5 congelaron durante la noche a -20 °C y se incubaron de nuevo a 37 °C durante 15 minutos. Se añadió sulfato de amonio (1,5 µl de una solución 2 M) y las placas se incubaron a 75 °C durante 15 minutos para precipitar e inactivar proteínas contaminantes, incluyendo las nucleasas añadidas exógenamente. Las placas se centrifugaron a 3000 xg durante 15 minutos a 4 °C y los sobrenadantes se transfirieron a una placa del termociclador de 384 pocillos limpia. Estas placas de extracto se congelaron a -20 °C para su uso posterior en cribados. Cada pocillo contenía

10 aproximadamente 0,5-3 µM de la enzima polimerasa mutante de la biblioteca.

Tabla 3. Tampón de lisis

Componente: Concentración o porcentaje

Tris pH 7.5: 50 mM

EDTA: 1 mM

MgCl2: 6 mM

Tween 20: 0,5% v/v

Lisozima (de polvo): 1 mg/ml

ADNasa I: 0,05 Unidades/µl

Ejemplo 2: Identificación de ADN polimerasas mutantes con una mayor eficiencia de transcripción inversa

15 Selección de bibliotecas de extractos en cuanto a una eficiencia de la transcripción reversa mejorada: La biblioteca de extractos se seleccionó mediante la comparación de los valores Cp (punto de cruce) de las curvas de crecimiento generadas por la actividad 5'-nucleasa fluorescente (TaqMan) de extractos de enzima bruta en un sistema de RT-PCR de la amplificación de un amplicón de 240 pares de bases del transcrito JP2-5 del virus de la hepatitis C (VHC )

20 que contiene las primeras 800 bases del VHC del genotipo Ib 5'NTR en pSP64 poli (A) (Promega).

Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador cinético Roche LC 480 en formato de 384 pocillos, conteniendo cada pocillo 1,5 µl de un extracto de enzima individual diluido 5 veces con tampón que contiene Tris-HCl 20 mM, pH 8, KCl 100 mM, EDTA 0,1 mM y Tween-20 0,1% añadido a 18,5 µl de mezcla maestra de RT-PCR

25 descritos en la Tabla 4. Las condiciones de termociclado fueron: 1 minuto a 65 °C (etapa “RT”); 5 ciclos de 94 °C durante 15 segundos, seguido por 60 °C durante 30 segundos y 45 ciclos de 91 °C durante 15 segundos, seguido por 60 °C durante 30 segundos.

Tabla 4

Componente: Concentración

Tricina pH 8,3: 50 mM

KOAc: 100 mM

Glicerol: 5% (v/v)

DMSO: 2 % (v/v)

Cebador 1: 200 nM

Cebador 2: 200 nM

Sonda TaqMan: 75 nM

Aptámero: 200 nM

dATP: 200 µM

dCTP: 200 µM

dGTP: 200 µM

dUTP: 400 µM

UNG: 0.04 Unidades/µl

Diana de ARN: 5000 copias/µl

Mn(OAc)2: 2,1 mM

30 Aproximadamente 5000 clones fueron seleccionados utilizando el protocolo anterior. Veintiún clones fueron seleccionados del pool original para hace una nueva selección basada en los valores de punto de cruce (Cp) iniciales y los valores de meseta fluorescentes por encima de un valor de corte arbitrario calculado mediante el método del máximo de la segunda derivada (Abs Quant/2nd derivative max method). Se extrajeron muestras de los

35 pocillos del cultivo correspondientes a los extractos superiores y se transfirieron a medio de crecimiento fresco y se

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volvieron a cultivar para producir nuevas placas de cultivo que contienen los mejores mutantes, así como una serie de cultivos parentales Z05 D580X (X = G, K y R) para ser utilizados para las comparaciones. Estas placas de cultivo se utilizaron a continuación para preparar extractos brutos frescos que se cuantificaron y volvieron a seleccionar a concentraciones de 20 nm con las mismas condiciones de mezcla maestra como se describe en la Tabla 4. La Tabla 5 muestra los valores Cp obtenidos a partir del aumento de la señal FAM debido a la escisión de la sonda TaqMan. Los resultados muestran que el clon 0818-M22 amplifica la diana de ARN con mayor eficiencia que la parental Z05 D580G.

Tabla 5.

Clon: Cp promedio

0818-M22: 19,2

Z05 D580R: 24,0

Z05 D580K: 24,5

Z05 D580G: 27,5

La secuencia de ADN de la región mutada del gen de la polimerasa se secuenció para determinar la mutación o mutaciones que estaban presentes en cualquier clon individual. El clon 0818-M22 fue elegido para realizar más ensayos, por lo que la proteína polimerasa mutante se expresaba en el cultivo en matraz, se purificó hasta homogeneidad y se cuantificó.

Uso del mutante Z05 D580G en la RT-PCR basada en Mn2+: Los resultados de la secuenciación revelaron que el clon 0818-M22 lleva mutaciones E522G, N545Y y T642I, además de la mutación D580G parental. Se comparó el mutante purificado Z05 D580G_E522G_N545Y_T642I (0818-M22) con el D580G Z05 parental en TaqMan RT-PCR basada en Mn2+. Las eficiencias de transcripción inversa y PCR se midieron mediante la comparación de los valores Cp de amplificaciones del transcrito de ARN JP2-5 y del plásmido lineal de ADN JP2-5 digerido con la endonucleasa de restricción EcoRI. Los oligonucleótidos y las condiciones mezcla maestra (Tabla 4) fueron los mismos que se utilizaron en la selección original. Cada reacción tenía ya sea 100.000 copias del transcrito JP2-5, 100.000 copias del ADN del plásmido lineal pJP2-5 o 1.000 copias del ADN del plásmido lineal pJP2-5. Todas las dianas se amplificaron con el cebador 1 y el cebador 2, como se ha descrito anteriormente, en las reacciones duplicadas para generar un amplicón 240 pares de bases. Todas las reacciones se realizaron en el termociclador Roche Light Cycler 480 con un volumen de reacción de 15 µl. Los Puntos de cruce (CPS) fueron calculados mediante el método Abs Quant/2nd derivative max method y se promediaron. Las amplificaciones se llevaron a cabo utilizando un intervalos de concentraciones de la ADN polimerasa de 2,5 NM-30 nM. Condiciones de termociclado fueron: 1 minuto a 65 °C (etapa “RT”); 5 ciclos de 94 °C durante 15 segundos, seguido por 60 °C durante 30 segundos y 45 ciclos de 91 °C durante 15 segundos, seguido por 60 °C durante 30 segundos. La Tabla 6 muestra los valores Cp obtenidos a partir del aumento de la señal fluorescente debido a la escisión de la sonda TaqMan en la condición de la enzima de 20 nM.

Tabla 6. Valores Cp de la amplificación del ARN JP2-5 del VHC y ADN pJP2-5

Enzima: 105 copias de ARN Cp 105 copias de ADN Cp 103 copias de ARN Cp

Z05 D580G: 31,6 19,7 27,5

Z05 D580G_E522G_N545Y_T642I: 20,7 19,0 26,7

Los resultados indican que el Z05 D580G_E522G_N545Y_T642I mutante permite la amplificación más eficiente de la diana de ARN sin compromiso de eficiencia de la PCR sobre el ADN diana, en comparación con el parental.

Uso del mutante Z05 D580G en la RT-PCR basada en Mg2+: El mutante purificada Z05 D580G_E522G N545Y_T642I también se comparó con el D580G Z05 parental en cuanto a la capacidad de realizar la TaqMan RT-PCR en presencia de Mg2+. Las condiciones de mezcla maestra utilizadas fueron idénticas a las descritos en la Tabla 4, excepto que la concentración de KOAc se varió de 20 mM a 160 mM y se sustituyó Mn (OAc)2 con Mg(OAc)2 2,1 mM. Cada reacción tenía enzima 30nM y o bien 100.000 copias de transcrito de JP2-5, 100.000 copias de ADN de plásmido lineal pJP2-5 o 1.000 copias de ADN de plásmido lineal pJP2-5. Todas las dianas se ampliaron con el mismo conjunto de cebadores en reacciones duplicadas para generar un amplicón de 240 pares de bases. Las eficiencias de la PCR y la RT-PCR se determinaron mediante la comparación de los valores Cp entre el ADN y el ARN. Todas las reacciones se realizaron en el termociclador Roche Light Cycler 480 con un volumen de reacción de 15 µl. Se calcularon los puntos de cruce (CPS) mediante el método Abs Quant/2nd derivative max method y se promediaron. Las condiciones de termociclado fueron: 65 °C -5 minutos, 70 °C-5 minutos y 75 °C-5 minutos (etapa “RT” de tres temperaturas); 5 ciclos de 94 °C durante 15 segundos, seguido por 62 °C durante 30 segundos y 45 ciclos de 91 °C durante 15 segundos, seguido por 62 °C durante 30 segundos. La Tabla 7 muestra los valores Cp obtenidos a partir de un aumento de la señal fluorescente debido a la escisión de la sonda TaqMan en la condición de KOAc 40 nM.

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Claims

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