ES2546945T3 - Polimerasa - Google Patents

Abstract

Una ADN polimerasa pol A con una selección más amplia de sustratos que es capaz de evitar un sitio abásico, en la que la polimerasa comprende la secuencia de aminoácidos del clon designado en el presente documento como 3A10 (SEC ID Nº 80).

Description

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Figura 23. Se midió la capacidad de procesamiento de Taq WT, M1 y M4 a tres concentraciones diferentes de la polimerasa en ausencia (A) o en presencia (B) de ADN trampa. La capacidad de procesamiento para la incorporación de nucleótidos en cada posición resultó ser variable, pero esencialmente idéntica para las tres polimerasas. Por ejemplo, la probabilidad de disociación enzimática es mayor en las posiciones 2-5 en comparación con las posiciones 6 y 7 para las tres polimerasas. En presencia de ADN trampa (para asegurar que la extensión de todos los cebadores es el resultado de una sola unión al ADN), el 13 % de Taq WT unida, el 28 % de M1 y el 15 % de M4 extendieron los cebadores hasta el final del molde. Las probabilidades de terminación para las posiciones 2 a 5 variaron del 15 al 25 % para Taq WT y M1, y del 13 al 35 % para M4, mientras que en las posiciones 6 y 7, la probabilidad de la terminación fue del 5 % para Taq WT, 1 % para M1 y 2-4 % para M4. La replicación del ADN se ha caracterizado como de baja capacidad de procesamiento cuando la probabilidad de terminación alcanza el 40-80 %15. Los presentes resultados sugieren que tanto M1 como M4 son polimerasas procesadoras, con capacidad de procesamiento igual o superior a Taq WT, argumento que va en contra de una interdependencia mecanicista de la baja capacidad de procesamiento y la síntesis translesión.

Descripción detallada

(A) Principios subyacentes a la tecnología CST

En el presente documento, se describe un método de generación de una ADN polimerasa obtenida por ingeniería genética con una selección más amplia de sustratos que comprende las etapas de:

(a)

preparar ácido nucleico que codifica una ADN polimerasa mutante, en el que la polimerasa se genera usando cebadores flanqueantes que portan un extremo de distorsión 3’;

(b)

compartimentar el ácido nucleico de la etapa (a) en microcápsulas;

(c)

expresar el ácido nucleico para producir su respectiva ADN polimerasa dentro de las microcápsulas;

(d)

clasificar el ácido nucleico que codifica la ADN polimerasa mutante que presenta una selección más amplia de sustratos; y

(e)

expresar la ADN polimerasa mutante que presenta una selección más amplia de sustratos.

Las técnicas de evolución dirigida y de autorreplicación compartimentada se detallan en los documentos GB 97143002, GB 98063936 y GB 01275643, a nombre de los presentes inventores. Dichos documentos se incorporan en el presente documento por referencia.

Los inventores modificaron los métodos de autorreplicación compartimentada y, sorprendentemente, generaron ADN polimerasas que presentaban una selección más amplia de sustratos como se define en el presente documento.

En particular, los inventores se dieron cuenta de que para la autorreplicación de la Polimerasa Taq, los compartimentos deben permanecer estables a las altas temperaturas del termociclado de la PCR. La encapsulación de las PCR se ha descrito previamente para las vesículas de lípidos (Oberholzer, T., Albrizio, M. y Luisi, P. L. (1995) Chem. Biol. 2, 677-82, y células y tejidos fijados (Haase, A. T., Retzel, E. F. y Staskus, K. A. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87, 4971-5; Embleton, M. J., Gorochov, G., Jones, P. T. y Winter, G. (1992) Nucleic Acids) pero con bajas eficacias.

Los presentes inventores han desarrollado recientemente emulsiones de aceite en agua, pero modificando la composición del agente tensioactivo, así como la proporción del aceite con respecto al agua. Los detalles se dan en el Ejemplo 1. Dichas modificaciones aumentaron en gran medida la estabilidad al calor de los compartimentos y permitieron que los rendimientos de PCR en la emulsión se acercaran a los de la PCR en solución. Más adelante, se aporta más información sobre el método de la autorreplicación compartimentada.

Microcápsulas.

Las microcápsulas usadas de acuerdo con el método descrito en el presente documento requieren propiedades físicas apropiadas para permitir el funcionamiento del método.

En primer lugar, para garantizar que los ácidos nucleicos y los productos génicos no se puedan difundir entre las microcápsulas, el contenido de cada microcápsula debe estar aislado del contenido de las microcápsulas circundantes, de manera que no haya intercambio o que haya poco intercambio de los ácidos nucleicos y los productos génicos entre la microcápsulas durante el período de tiempo del experimento.

En segundo lugar, el método requiere que solo haya un número limitado de ácidos nucleicos por microcápsula. Esto garantiza que el producto génico de un ácido nucleico individual se aísle de los otros ácidos nucleicos. Por lo tanto, el acoplamiento entre el ácido nucleico y el producto génico será altamente específico. El factor de enriquecimiento es el mayor con una media de uno o pocos ácidos nucleicos por microcápsula, siendo la unión entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado lo más estrecha posible, pues el producto génico de un ácido nucleico individual se aislará de los productos de todos los otros ácidos nucleicos. Sin embargo, aún no usándose la situación teóricamente óptima, como media, de un solo ácido nucleico o menos por microcápsula, una proporción de

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en aceite. Una recopilación reciente enumeraba más de 16.000 tensioactivos, muchos de los cuales se usan como agentes emulsionantes (Ash y Ash, 1993). Los aceites adecuados incluyen tensioactivos de aceites minerales blancos ligeros y no iónicos (Schick, 1966), tales como monooleato de sorbitán (SpanTM 80; ICI) y monooleato de polioxietilensorbitano (TweenTM 80; ICI) y Triton-X-100.

El uso de tensioactivos aniónicos también puede ser beneficioso. Los tensioactivos adecuados incluyen colato de sodio y taurocolato de sodio. Se prefiere particularmente el desoxicolato de sodio, preferentemente, a una concentración del 0,5 % p/v o inferior. En algunos casos, la inclusión de dichos tensioactivos puede aumentar la expresión de los ácidos nucleicos y/o la actividad de los productos génicos. La adición de algunos tensioactivos aniónicos a una mezcla de reacción no emulsionada, suprime completamente la traducción. Sin embargo, durante la emulsión, el tensioactivo se transfiere desde la fase acuosa a la interfase y la actividad se restablece. La adición de un tensioactivo aniónico a las mezclas que se van a emulsionar garantiza que las reacciones se realicen únicamente después de la compartimentalización.

En general, la creación de una emulsión requiere la aplicación de energía mecánica para forzar la unión de las fases. Existe una variedad de maneras de hacerlo, que utilizan una variedad de dispositivos mecánicos, incluyendo agitadores (tales como varillas de agitación magnéticas, agitadores de hélice y turbina, dispositivos de paletas y batidores), homogeneizadores (incluyendo los homogeneizadores de rotor-estator, homogeneizadores de válvula de alta presión y homogeneizadores de chorro), molinos coloidales, ultrasonidos y dispositivos de “emulsión de membrana” (Becher, 1957; Dickinson, 1994).

Las microcápsulas acuosas formadas en emulsiones de agua en aceite son generalmente estables con poco o ningún intercambio de ácidos nucleicos o productos génicos entre las microcápsulas. Además, los presentes inventores han demostrado que se realizan varias reacciones bioquímicas en las microcápsulas de emulsión. Además, procesos bioquímicos complicados, principalmente la transcripción y la traducción de genes también están activos en las microcápsulas de emulsión. Existe la tecnología para crear emulsiones con volúmenes de todo tipo hasta escalas industriales de miles de litros (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).

El tamaño preferido de la microcápsula variará dependiendo de los requisitos exactos de cualquier proceso de selección individual que se vaya a realizar.

En todos los casos, habrá un equilibrio óptimo entre el tamaño de la genoteca, el enriquecimiento requerido y la concentración requerida de componentes en las microcápsulas individuales para lograr la expresión y la reactividad eficaces de los productos génicos.

En el Ejemplo 1, se ofrecen los detalles de un ejemplo de una emulsión usada cuando se realiza el método descrito en el presente documento.

Expresión dentro de microcápsulas

Los procesos de expresión deben producirse dentro de cada microcápsula individual.

Tanto la transcripción in vitro como la transcripción-traducción acopladas son menos eficaces a concentraciones subnanomolares de ADN. Debido a la necesidad de que solo esté presente un número limitado de moléculas de ADN en cada microcápsula, esto fija por tanto un límite superior práctico del posible tamaño de la microcápsula. Preferentemente, el volumen medio de las microcápsulas es inferior a 5,2 x 10-16 m3, (que se corresponde a una microcápsula esférica de diámetro inferior a 10 m, más preferentemente, inferior a 6,5 x 10-17 m3 (5 m), más preferentemente de aproximadamente 4,2 x 10-18 m3 (2 m) e idealmente de aproximadamente 9 x 10-18 m3 (2,6 m).

La concentración eficaz de ADN o ARN en las microcápsulas se puede aumentar artificialmente mediante diversos métodos que serán bien conocidos por los expertos en la materia. Estos incluyen, por ejemplo, la adición de productos químicos que excluyen volumen, tales como polietilenglicoles (PEG), y una variedad de técnicas de amplificación génica, que incluyen la transcripción usando ARN polimerasas que incluyen las que proceden de bacterias tales como E. coli (Roberts, 1969; Blattner y Dahlberg, 1972; Roberts et al., 1975; Rosenberg et al., 1975), eucariotas, por ejemplo, (Weil et al., 1979; Manley et al., 1983) y bacteriófagos tales como T7, T3 y SP6 (Melton et al., 1984); la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki et al., 1988); la amplificación con la replicasa Q (Miele et al., 1983; Cahill et al., 1991; Chetverin y Spirin, 1995; Katanaev et al., 1995); la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Landegren et al., 1988; Barany, 1991); y el sistema de replicación autosostenida de secuencias (Fahy et al., 1991) y la amplificación por desplazamiento de cadena (Walker et al., 1992). Se podrían usar incluso técnicas de amplificación génica que requieren un ciclado térmico, tales como PCR y LCR, si las emulsiones y la transcripción in vitro o los sistemas acoplados de transcripción-traducción son termoestables (por ejemplo, se podrían preparar los sistemas acoplados de transcripción-traducción a partir de un organismo termoestable tal como Thermus aquaticus).

El aumento de la concentración local eficaz de ácido nucleico permite el uso de manera eficaz de microcápsulas de mayor tamaño. Esto permite un límite superior práctico preferido para el volumen de la microcápsula de

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también se pueden preparar introduciendo mutaciones en un ácido nucleico o en una combinación de ácidos nucleicos "al azar" mediante una variedad de técnicas in vivo, que incluyen; el uso de “cepas mutadoras”, de bacterias tales como E. coli mutD5 (Liao et al., 1986; Yamagishi et al., 1990; Low et al., 1996). Las mutaciones al azar, también se pueden introducir tanto in vivo como in vitro mediante mutágenos químicos y radiación ionizante o UV (véase Friedberg et al., 1995.), o incorporando análogos de bases mutagénicos (Freese, 1959; Zaccolo et al., 1996). Las mutaciones "aleatorias" también se pueden introducir en genes in vitro durante la polimerización, por ejemplo, mediante el uso de polimerasas propensas a errores (Leung et al., 1989). En el método descrito en el presente documento, el repertorio de fragmentos nucleicos usado puede ser un repertorio mutante de Taq que se haya mutado usando PCR propensa a error. Los detalles se proporcionan en el Ejemplo 1. De acuerdo con el método descrito en el presente documento, el término "aleatoria" puede ser en términos de posiciones aleatorias con repertorio aleatorio de aminoácidos en esas posiciones o pueden ser posiciones seleccionadas (predeterminadas) con un repertorio aleatorio de aminoácidos en esas posiciones seleccionadas.

Se pueden introducir otras diversificaciones mediante el uso de la recombinación homóloga bien in vivo (véase Kowalczykowski et al., 1994) o in vitro (Stemmer, 1994a; Stemmer, 1994b).

Microcápsulas/Clasificación

Además de los ácidos nucleicos descritos anteriormente, las microcápsulas descritas en el presente documento comprenderán componentes adicionales requeridos para que tenga lugar el proceso de clasificación. Otros componentes del sistema comprenderán, por ejemplo, los necesarios para la transcripción y/o traducción del ácido nucleico. Estos se seleccionan según los requisitos de un sistema específico entre los siguientes; un tampón adecuado, un sistema de transcripción/replicación in vitro y/o un sistema de traducción in vitro que contiene todos los ingredientes necesarios, enzimas y cofactores, ARN polimerasa, nucleótidos, ácidos nucleicos (naturales o sintéticos), ARN de transferencia, ribosomas y aminoácidos, y los sustratos de la reacción de interés con el fin de permitir la selección del producto génico modificado.

Un tampón adecuado será aquel en el que todos los componentes deseados del sistema biológico están activos, y dependerá, por tanto, de los requisitos de cada sistema de reacción específico. Los tampones adecuados para las reacciones biológicas y/o químicas son conocidos en la técnica y los protocolos proporcionados en diferentes textos de laboratorio, tales como Sambrook et al., 1989.

El sistema de traducción in vitro comprenderá normalmente un extracto celular, por lo general, de bacterias (Zubay, 1973; Zubay, 1980; Lesley et al., 1991; Lesley, 1995), reticulocitos de conejo (Pelham y Jackson, 1976) o germen de trigo (Anderson et al., 1983). Muchos sistemas adecuados se encuentran disponibles en el mercado (por ejemplo, en Promega) incluyendo algunos que permitirán una transcripción/traducción acoplada (todos los sistemas bacterianos y el reticulocito y los sistemas de extractos de germen de trigo TNTTM de Promega). Si se desea, la mezcla de aminoácidos usada puede incluir aminoácidos sintéticos para aumentar el posible número o la variedad de proteínas producidas en la genoteca. Esto se puede lograr cargando los ARNt con aminoácidos artificiales y usando estos ARNt para la traducción in vitro de las proteínas que se van a seleccionar (Ellman et al., 1991; Benner, 1994; Mendel et al., 1995).

Tras cada serie de selección, se puede ensayar el enriquecimiento de la combinación de ácidos nucleicos en aquellos que codifican las moléculas de interés mediante reacciones de transcripción/replicación in vitro, no compartimentalizada, o reacciones acopladas de transcripción-traducción. La combinación seleccionada se clona en un vector plasmídico adecuado, y el ARN o la proteína recombinante se produce a partir de los clones individuales para una purificación y ensayo adicionales.

Identificación de microcápsulas

Las microcápsulas se pueden identificar en virtud de un cambio inducido por el producto génico deseado que se produce o se manifiesta en la superficie de la microcápsula, o es detectable desde el exterior, como se describe en el apartado iii (Clasificación de microcápsulas). Este cambio, cuando se identifica, se usa para desencadenar la modificación del gen dentro del compartimento. En un aspecto preferido descrito en el presente documento, la identificación de microcápsulas se basa en un cambio de las propiedades ópticas de la microcápsula, dando como resultado una reacción que conduce a luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia dentro de la microcápsula. La modificación del gen dentro de las microcápsulas estaría desencadenada por la identificación de la luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia. Por ejemplo, la identificación de la luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia puede desencadenar el bombardeo del compartimento con fotones (u otras partículas u ondas), que conduce a la modificación del ácido nucleico. Ya se ha descrito un procedimiento similar previamente para la clasificación rápida de células (Keij et al., 1994). La modificación del ácido nucleico puede ser el resultado, por ejemplo, de acoplar un "marcador" molecular, confinado por un grupo protector fotolábil, a los ácidos nucleicos: el bombardeo con fotones de una longitud de onda apropiada conduce a la eliminación del confinamiento. Tras ello, todas las microcápsulas se combinan y los ácidos nucleicos se agrupan entre sí en un entorno. Los ácidos nucleicos que codifican los productos génicos que muestran la actividad deseada se pueden seleccionar mediante purificación por afinidad, usando una molécula que se une específicamente o reacciona específicamente con el "marcador".

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A continuación, se describirá la invención mediante los siguientes ejemplos, que, bajo ningún concepto, son limitantes de la invención reivindicada en el presente documento.

Ejemplo 1

Métodos generales

Lista de cebadores:

1: 5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACA AAA ATC TAG ATA ACG AGG GTA-3'; desapareamiento A•G

2: 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GTA CCA CCG AAC TGC GGG TGA CGC CAA GCC-3; desapareamiento C•C

3: 5'-AAA AAT CTA GAT AAC GAG GGC AA-3'

4: 5'-ACC ACC GAA CTG CGG GTG ACG CCA AGC G-3'

5: 5'-GAA CTG CGG GTG ACG CCA AGC GCA 3'; desapareamiento A•A

6: 5'-CC GAA CTG CGG GTG ACG CCA AGC GG 3'; desapareamiento G•G

7: 5'-GAA CTG CGG GTG ACG CCA AGC GCG3'; desapareamiento G•A

8: 5'-AAA AAT CTA GAT AAC GAG GGC AA-3'

9: 5'-CCG ACT GGC CAA GAT TAG AGA GTA TGG-3'

10: 5'-GAT TTC CAC GGA TAA GAC TCC GCA TCC-3'

11: 5'-GGC AGA CGA TGA TGC AGA TAA CCA GAG C-3'

12: 5'-GCC GAT AGA TAG CCA CGG ACT TCG TAG-3'

13: 5'-GGA GTA GAT GCT TGC TTT TCT GAG CC-3'

14: 5-GAG TTC GTG CTT ACC GCA GAA TGC AG-3'

15: 5'-ACC GAA CTG CGG GTG ACG CCA AGC G 3'

16: 5'-ACC GAA CTG CGG GTG ACG CCA AGC C 3'

17: 5'-ACC GAA CTG CGG GTG ACG CCA AGC A 3'

18: 5'-AAA CAG CGC TTG GCG TCA CCC GCA GTT CGG T-3'

19: 5'-AAA CAG GGC TTG GCG TCA CCC GCA GTT CGG T-3'

20: 5'-AAA CAG AGC TTG GCG TCA CCC GCA GTT CGG T-3'

21: 5'-AAA CAC CGC TTG GCG TCA CCC GCA GTT CGG T-3'

22: 5'-AGC TAC CAT GCC TGC ACG AAT TCG GCA TCC GTC GCG ACC ACG GTC GCA GCG-3' (intacto)

23: 5'-AGC TAC CAT GCC TGC ACG ACA XCG GCA TCC GTC GCG ACC ACG GTC GCA GCG-3'; X = sitio abásico

24: 5'-AGC TAC CAT GCC TGC ACG AAX XCG GCA TCC GTC GCG ACC ACG GTC GCA GCG-3, XX = dímero CPD

25: 5'-CGT GGT CGC GAC GGA TGC CG-3'

26: 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA-3'

27: 5'-ACT GXT CTC CCT ATA GTG AGT CGT ATT A-3'; X = 5NI.

Materiales y métodos

Manipulación del ADN y expresión de proteínas. La expresión de clones de Taq para la detección y la selección de CSR fue como se describe (10). Para las mediciones cinéticas y los ensayos de extensión en gel, se purificaron las polimerasas como se describe (32) usando una resina de intercambio iónico Biorex70 (BioRad). Todas las extensiones de PCR y de cebador se realizaron en 1 x tampón de Taq (KCl 50 mM/Tris•HCl 10 mM (pH 9,0)/Triton X-100 al 0,1 %/MgCl2 1,5 mM), con dNTP (0,25 mM (Amersham Pharmacia Biotech, NJ)) y cebadores apropiados a menos que se especifique lo contrario. Las secuencias de los cebadores se proporcionan en la información complementaria. Las reacciones de extensión de cebadores se terminaron mediante la adición de formamida al 95 %/EDTA 10 mM, y se analizan en geles de poliacrilamida al 20 %/urea 7 M.

Selección de CSR. Se combinaron genotecas previamente seleccionadas por su actividad L1* y L2* (10) y se realizaron 3 series de selección de CSR como se describe (10), a excepción del uso de los cebadores 1: (desapareamiento A•G) y 2: (desapareamiento C•C) y 15 ciclos de (94 ºC 1 min, 55 ºC 1 min, 72 ºC 8 min). Se recombinaron los clones de la serie 2 mediante un proceso de extensión escalonada (StEP) de transposición por PCR (33) como se describe. Para la serie 3, los ciclos de CSR se redujeron a 10 y tiempos de hibridación de hasta 30 s.

PCR. Se usó un ensayo de PCR para rastrear y clasificar los clones. En resumen, se normalizaron los clones en cuanto a la actividad en la PCR con los cebadores apareados 3, 4 y la actividad con los cebadores desapareados 1 y 2 (1 M de cada) determinados a un número de ciclos mínimo (15-25 ciclos). Se determinó la capacidad de extensión para los diferentes desapareamientos mediante el mismo ensayo usando los cebadores de desapareamiento 2 (desapareamiento C•C), 5 (desapareamiento A•A), 6 (desapareamiento G•G), 7 (desapareamiento G•A) con el cebador apareado 3 o el cebador 1 (desapareamiento A•G) con el cebador apareado

4. Se llevó a cabo la incorporación de sustratos artificiales en una PCR de 50 ciclos usando condiciones convencionales y dNTP S 50 M (Promega) o FITC-12-dATP 50 M (Perkin-Elmer), rodamina-5-dUTP (Perkin

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