ES2304580T3 - Procedimiento de evolucion dirigida. - Google Patents

Abstract

Método para aumentar la concentración de una molécula de ácido nucleico, comprendiendo dicho método: (a) formar una emulsión de agua en aceite estable al calor, que comprende microcompartimentos acuosos encapsulados que tienen una densidad superior a 10 9 microcompartimentos por ml; (b) incluir dentro de una pluralidad de dichos microcompartimentos un ácido nucleico y una disolución acuosa que comprende los componentes necesarios para realizar la amplificación del ácido nucleico mediante la reacción en cadena de la polimerasa, incluyendo dichos componentes una polimerasa termoestable; y (c) realizar una ciclación térmica para efectuar la amplificación de dicho ácido nucleico para producir copias amplificadas de dicho ácido nucleico, aumentando de ese modo la concentración de dicho ácido nucleico, en el que la polimerasa termoestable tiene una termoestabilidad aumentada en comparación con la correspondiente enzima de tipo natural, resistencia a la heparina aumentada en comparación con la correspondiente enzima de tipo natural o puede extender un cebador que tiene un apareamiento erróneo en 3''.

Description

Procedimiento de evolución dirigida.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para aumentar la concentración de una molécula de ácido nucleico presente utilizando emulsiones de agua en aceite.

Antecedentes de la invención

La evolución requiere la generación de diversidad genética (diversidad en el ácido nucleico) seguido por la selección de aquellos ácidos nucleicos que codifican para características beneficiosas. Debido a que la actividad de los ácidos nucleicos y su producto génico codificado están vinculados físicamente en los organismos biológicos (los ácidos nucleicos que codifican para la información molecular de las células en las que están confinados), las alteraciones en el genotipo que dan como resultado cambio(s) adaptativo(s) del fenotipo producen beneficios para el organismo dando como resultado un aumento de la supervivencia y la descendencia. Por tanto, múltiples rondas de mutación y selección pueden dar como resultado el enriquecimiento progresivo de los organismos (y el genotipo codificante) con una adaptación creciente a una condición de selección dada. Los sistemas para la evolución rápida de los ácidos nucleicos o las proteína in vitro deben imitar este proceso al nivel molecular en que deben estar vinculados el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado y debe poder seleccionarse la actividad del producto génico.

Las tecnologías de selección in vitro son un campo en rápida expansión y a menudo demuestran que son más poderosas que el diseño racional para obtener biopolímeros con las propiedades deseadas. En la pasada década, los experimentos de selección, usando por ejemplo tecnologías de presentación en fago o SELEX, han proporcionado muchos ligandos de polipéptido y polinucleótido novedosos. Se ha demostrado que la selección para la catálisis es más difícil. Las estrategias han incluido la unión de análogos del estado de transición, enlace covalente a inhibidores suicidas, acoplamiento por proximidad y enlace covalente del producto. Aunque estos enfoques se centran sólo en una parte en concreto del ciclo enzimático, ha habido algunos éxitos. Sin embargo, en última instancia sería deseable seleccionar directamente el recambio catalítico. De hecho, el simple examen de bibliotecas mutantes bastante pequeñas para seleccionar el recambio catalítico ha sido algo más satisfactorio que los diversos enfoques de selección y ha proporcionado algunos catalizadores con velocidades catalíticas mejoradas enormemente.

Aunque las polimerasas son un requisito previo para tecnologías que definen la biología molecular, es decir, mutagénesis dirigida al sitio, clonación de ADNc y en particular secuenciación de Sanger y PCR, a menudo tienen graves deficiencias debido al hecho de que se preparan para realizar tareas para las que la naturaleza no las ha optimizado. Parece que se han hecho algunos intentos para mejorar las propiedades de las polimerasas disponibles a partir de la naturaleza y para adaptarlas para aplicaciones específicas mediante ingeniería de proteínas. Los avances técnicos han sido en gran parte periféricos e incluyen el uso de polimerasas de una gama más amplia de organismos, sistemas de aditivo y tampón así como combinaciones de enzimas.

Los intentos para mejorar las propiedades de las polimerasas se han basado tradicionalmente en la ingeniería de proteínas. Por ejemplo, se han generado variantes de la Taq polimerasa (por ejemplo, fragmento Stoffel y Klentaq) mediante deleción completa o parcial de su dominio de exonucleasa 5'-3' y muestran una termoestabilidad y fidelidad mejoradas aunque a costa de reducir la procesividad (Bames 1992, Gene 112, 29-35, Lawyer et al, 1993, PCR Methods and Applications 2, 275). Además, la disponibilidad de estructuras de alta resolución para las proteínas ha permitido el diseño racional de mutantes con propiedades mejoradas (por ejemplo, mutantes de Taq con propiedades mejoradas de incorporación de didesoxinucleótidos para la secuenciación por ciclos, Li et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci USA 96, 9491). También se han usado enfoques genéticos in vivo para el diseño de proteínas, por ejemplo mediante complementación de una cepa polA^{-} para seleccionar polimerasas activas de repertorios de polimerasas mutantes (Suzuki et al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sci USA 93, 9670). Sin embargo, el enfoque de complementación genética está limitado en las propiedades que pueden seleccionarse.

Avances recientes en la biología molecular han permitido que algunas moléculas se seleccionen conjuntamente in vitro según sus propiedades junto con los ácidos nucleicos que codifican para las mismas. Los ácidos nucleicos seleccionados pueden clonarse posteriormente para su uso o análisis adicionales, o someterse a rondas adicionales de mutación y selección. Es común a estos métodos el establecimiento de grandes bibliotecas de ácidos nucleicos. Pueden aislarse moléculas que tienen las características deseadas (actividad) a través de regímenes de selección que seleccionan la actividad deseada del producto génico codificado, tal como una actividad bioquímica o biológica deseada, por ejemplo actividad de unión.

El documento WO99/02671 describe un método para aislar uno o más elementos genéticos que codifican para un producto génico que tiene una actividad deseada. Los elementos genéticos se compartimentalizan en primer lugar en microcápsulas, y luego se transcriben y/o traducen para producir sus respectivos productos génicos (ARN o proteína) dentro de las microcápsulas. Alternativamente, los elementos genéticos están contenidos dentro de una célula huésped en la que tiene lugar la transcripción y/o traducción (expresión) del producto génico y las células huésped se compartimentalizan en primer lugar en microcápsulas. Posteriormente, se clasifican los elementos genéticos que producen el producto génico que tiene la actividad deseada. El método descrito en el documento WO99/02671 se basa en el producto génico que modifica catalíticamente la microcápsula o en el elemento genético (o ambos), de modo que el enriquecimiento de la entidad o entidades modificadas permite la selección de la actividad deseada.

Sumario de la invención y de la descripción

El método de la presente invención proporciona un método para aumentar la concentración de una molécula de ácido nucleico, comprendiendo el método las etapas expuestas en la reivindicación 1.

Según un primer aspecto de la presente descripción, se proporciona un método de selección de una enzima de procesamiento de ácidos nucleicos (NAP), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un conjunto de ácidos nucleicos que comprenden miembros que codifican para una enzima NAP o una variante de la enzima NAP; (b) subdividir el conjunto de ácidos nucleicos en compartimentos, de modo que cada compartimento comprende un miembro de ácido nucleico del conjunto junto con la enzima NAP o variante codificada por el miembro de ácido nucleico; (c) permitir que se produzca el procesamiento de los ácidos nucleicos; y (d) detectar el procesamiento del miembro de ácido nucleico por la enzima NAP.

Según un segundo aspecto de la presente descripción, se proporciona un método de selección de un agente que puede modificar la actividad de una enzima NAP, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una enzima NAP; (b) proporcionar un conjunto de ácidos nucleicos que comprende miembros que codifican para uno o más agentes candidatos; (c) subdividir el conjunto de ácidos nucleicos en compartimentos, de modo que cada compartimento comprende un miembro de ácido nucleico del conjunto, el agente codificado por el miembro de ácido nucleico y la enzima NAP; y (d) detectar el procesamiento del miembro de ácido nucleico mediante la enzima NAP.

Preferiblemente, el agente es un promotor de la actividad de la enzima NAP. El agente puede ser una enzima, preferiblemente una cinasa o una fosforilasa, que puede actuar sobre la enzima NAP para modificar su actividad. El agente puede ser una chaperona implicada en el plegamiento o ensamblaje de la enzima NAP o puede requerirse para el mantenimiento de la función replicasa (por ejemplo, telomerasa, HSP 90). Alternativamente, el agente puede ser un polipéptido o polinucleótido implicado en una ruta metabólica, teniendo la ruta como producto final un sustrato que está implicado en una reacción de replicación. Además, el agente puede ser cualquier enzima que pueda catalizar una reacción que modifique un agente inhibidor (natural o no natural) de la enzima NAP de tal modo que se reduce o suprime su actividad inhibidora. Finalmente, el agente puede promover la actividad NAP de manera no catalítica, por ejemplo, mediante la asociación con la enzima NAP o su sustrato, etc. (por ejemplo, factores de procesividad en el caso de ADN polimerasas, por ejemplo ADN polimerasa de T7 y tiorredoxina).

Según un tercer aspecto de la presente descripción, se proporciona un método de selección de un par de polipéptidos que pueden dar una interacción estable, comprendiendo el método: (a) proporcionar un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico, codificando el primer ácido nucleico para una primera proteína de fusión que comprende un primer subdominio de una enzima NAP fusionado con un primer polipéptido, codificando el segundo ácido nucleico para una segunda proteína de fusión que comprende un segundo subdominio de una enzima NAP fusionado con un segundo polipéptido; en el que la interacción estable del primer y el segundo subdominios de la enzima NAP genera actividad de la enzima NAP, y en el que al menos uno del primer y segundo ácidos nucleicos se proporciona en forma de un conjunto de ácidos nucleicos que codifican para variantes de los respectivos primero y/o segundo polipéptido(s); (b) subdividir el conjunto o conjuntos de ácidos nucleicos en compartimentos, de modo que cada compartimento comprende un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico junto con las proteínas de fusión respectivas codificadas por el primer y el segundo ácidos nucleicos; (c) permitir que el primer polipéptido se una al segundo polipéptido, de modo que la unión del primer y el segundo polipéptidos conduzca a una interacción estable de los subdominios de la enzima NAP para generar actividad de la enzima NAP; y (d) detectar el procesamiento de al menos uno del primer y segundo ácidos nucleicos mediante la enzima NAP.

Además, pueden sustituirse los dominios de la enzima NAP a los que se hace referencia en (a) anteriormente, por dominios de un polipéptido que puede modificar la actividad de las enzimas NAP, tal como se trató en el segundo aspecto de la presente invención, y la actividad de la enzima NAP usada para seleccionar tales polipéptidos modificadores que tienen propiedades deseadas.

Preferiblemente, cada uno del primer y segundo ácidos nucleicos se proporciona a partir de un conjunto de ácidos nucleicos.

Preferiblemente, el primer y segundo ácidos nucleicos se unen de manera o bien covalente (por ejemplo, como parte de la misma molécula molde) o bien no covalente (por ejemplo, mediante anclaje sobre perlas, etc.).

Las enzimas NAP pueden ser, por ejemplo, moléculas enzimáticas de polipéptido o ácido ribonucleico. En una realización sumamente preferida, la enzima NAP según la invención es una enzima replicasa, es decir, una enzima que puede amplificar un ácido nucleico a partir de un molde, tal como por ejemplo una enzima polimerasa (o ligasa). La invención se describe a continuación en el presente documento con referencia específica a replicasas; sin embargo, los expertos en la técnica entenderán que la invención es aplicable igualmente a otras enzimas NAP, tales como telomerasas y helicasas, tal como se expone adicionalmente a continuación, que procesan ácidos nucleicos de maneras no limitadas a la amplificación sino que, no obstante, pueden seleccionarse detectando la amplificación de ácidos nucleicos, es decir, que promueven la replicación indirectamente.

En una realización preferida de la descripción, la amplificación del ácido nucleico resulta de más de una ronda de replicación de ácido nucleico. Preferiblemente, la amplificación del ácido nucleico es una amplificación exponencial.

La reacción de amplificación se selecciona preferiblemente de las siguientes: una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR), una PCR anidada, una reacción en cadena de la ligasa (LCR), un sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS), una replicación de secuencia autosostenida (3SR), NASBA, una reacción de amplificación mediada por transcripción (TMA) y una amplificación por desplazamiento de cadena (SDA).

En una realización sumamente preferida, el número de copias tras la amplificación del miembro de ácido nucleico es sustancialmente proporcional a la actividad de la replicasa, a la actividad de un agente requerido, a la afinidad de unión del primer y segundo polipéptidos.

La replicación del ácido nucleico puede detectarse sometiendo a ensayo el número de copias del miembro de ácido nucleico. Alternativamente, o además, la replicación del ácido nucleico puede detectarse determinando la actividad de un polipéptido codificado por el miembro de ácido nucleico.

En una realización sumamente preferida, se ajustan las condiciones en el compartimento para seleccionar una replicasa o agente activo en tales condiciones, o un par de polipéptidos que puedan dar interacción estable en tales condiciones.

La replicasa tiene preferiblemente actividad polimerasa, transcriptasa inversa o ligasa.

El polipéptido puede proporcionarse a partir del ácido nucleico mediante transcripción y traducción in vitro. Alternativamente, el polipéptido puede proporcionarse a partir del ácido nucleico in vivo en un huésped de expresión.

En una realización preferida, los compartimentos consisten en el componente acuoso encapsulado de una emulsión de agua en aceite. La emulsión de agua en aceite se produce preferiblemente emulsionando una fase acuosa con una fase de aceite en presencia de un tensioactivo que comprende un 4,5% v/v de Span 80, un 0,4% v/v de Tween 80 y un 0,1% v/v de Triton X100, o un tensioactivo que comprende Span 80, Tween 80 y Triton X100 sustancialmente en las mismas proporciones. Preferiblemente, la razón de fases de agua:aceite es de 1:2, lo que conduce a un tamaño de gota adecuado. Tales emulsiones tienen una estabilidad térmica mayor que las emulsiones más ricas en aceite.

Como un cuarto aspecto de la presente descripción, se proporciona una enzima replicasa identificada mediante un método según cualquier reivindicación anterior. Preferiblemente, la enzima replicasa tiene una termoestabilidad mayor que una enzima no seleccionada correspondiente. Más preferiblemente, la enzima replicasa es una Taq polimerasa que tiene una semivida aumentada en más de 10 veces a 97,5ºC en comparación con la Taq polimerasa de tipo natural.

La enzima replicasa puede tener una mayor tolerancia a la heparina que una enzima no seleccionada correspondiente. Preferiblemente, la enzima replicasa es una Taq polimerasa activa a una concentración de 0,083 unidades/\mul o más de heparina.

La enzima replicasa puede ser capaz de extender un cebador que tiene un apareamiento erróneo en 3'. Preferiblemente, el apareamiento erróneo en 3' es un apareamiento purina-purina en 3' erróneo o un apareamiento pirimidina-pirimidina en 3' erróneo. Más preferiblemente, el apareamiento erróneo en 3' es un apareamiento A-G erróneo o el apareamiento erróneo en 3' es un apareamiento C-C erróneo.

Según un quinto aspecto de la presente descripción, se proporciona un mutante de Taq polimerasa mutante que comprende las mutaciones (sustituciones de aminoácidos): F73S, R205K, K219E, M236T, E434D y A608V.

La presente descripción, en un sexto aspecto, proporciona un mutante de Taq polimerasa que comprende las mutaciones (sustituciones de aminoácido): K225E, E388V, K540R, D578G, N583S y M747R.

La presente descripción, en un séptimo aspecto, proporciona un mutante de Taq polimerasa que comprende las mutaciones (sustituciones de aminoácidos): G84A, D144G, K314R, E520G, A608V, E742G.

La presente descripción, en un octavo aspecto, proporciona un mutante de Taq polimerasa que comprende las mutaciones (sustituciones de aminoácidos): D58G, R74P, A109T, L245R, R343G, G370D, E520G, N583S, E694K, A743P.

En un noveno aspecto de la presente descripción, se proporciona una emulsión de agua en aceite que puede obtenerse emulsionando una fase acuosa con una fase de aceite en presencia de un tensioactivo que comprende un 4,5% v/v de Span 80, un 0,4% v/v de Tween 80 y un 0,1% v/v de Triton X100, o un tensioactivo que comprende Span 80, Tween 80 y Triton X100 sustancialmente en las mismas proporciones. Preferiblemente, la razón de fases de agua:aceite es de 1:2. Esta razón parece permitir la difusión de dNTP (y presumiblemente otras moléculas pequeñas) entre los compartimentos a temperaturas superiores, lo que es beneficioso para algunas aplicaciones pero no para otras. La difusión puede controlarse aumentando la razón de fases de agua:aceite hasta 1:4.

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Breve descripción de los dibujos

La figura 1A es un diagrama que muestra una realización de un método según la presente descripción tal como se aplica a la selección de una polimerasa autoevolutiva, en el que el número de copias del gen está vinculado con el recambio enzimático.

La figura 1B es un diagrama que muestra un esquema general de autorreplicación compartimentalizada (CSR): 1) Se clona y expresa un repertorio de genes de polimerasa diversificados en E. coli. Las esferas representan moléculas de polimerasa activas. 2) Se suspenden células bacterianas que contienen la polimerasa y el gen codificante en tampón de reacción que contiene nucleótidos trifosfato (dNTP) y cebadores flanqueantes y se segregan en compartimentos acuosos. 3) La enzima polimerasa y el gen codificante se liberan de la célula permitiendo que continúe la autorreplicación. Las polimerasas escasamente activas (hexágono blanco) no pueden replicar su gen codificante. 4) Se liberan los genes de polimerasa de "descendencia", se vuelven a diversificar y se vuelven a clonar para otro ciclo de CSR.

La figura 2 es un diagrama que muestra los compartimentos acuosos de la emulsión estable al calor que contienen células E. coli que expresan la proteína verde fluorescente (GFP) antes de (A, B) y después de la termociclación (C), tal como se obtienen imágenes mediante microscopía óptica. (A, B) representan el mismo marco. Se obtiene la imagen de (A) a 535 nm para la fluorescencia de GFP y (B) en luz visible para visualizar las células bacterianas dentro de los compartimentos. La difuminación de las bacterias fluorescentes en (A) se debe al movimiento browniano durante la exposición. Se facilitan a continuación las dimensiones promedio del compartimento tal como se determinan mediante difracción láser.

La figura 3A es un diagrama que muestra el entrecruzamiento entre compartimentos de emulsión. Se amplifican individualmente o se combinan dos reacciones de PCR convencionales, que difieren en el tamaño del molde (PCR1 (0,9 kb), PCR2 (0,3 kb)) y la presencia de Taq (PCR1: + Taq, PCR 2: sin enzima). Si se combinan en disolución, se amplifican ambos moldes. Si se emulsionan por separado, antes del mezclado, sólo se amplifica PCR1. M: marcador \phi174 HaeIII.

La figura 3B es un diagrama que muestra el entrecruzamiento entre compartimentos de emulsión. Se mezclan 1:1 células bacterianas que expresan Taq polimerasa de tipo natural (2,7 kb) o el fragmento Stoffel de Taq polimerasa (escasamente activo en las condiciones del tampón) (1,8 kb) antes del emulsionamiento. En disolución, se amplifica preferentemente el fragmento Stoffel más corto. En emulsión, hay predominantemente amplificación del gen de Taq de tipo natural y sólo una débil amplificación del fragmento Stoffel (flecha). M: marcador: \lambdaHindIII.

La figura 4 es un diagrama que muestra detalles de una realización de un método según la presente descripción tal como se aplica a la selección de una polimerasa autoevolutiva.

La figura 5 es un diagrama que muestra detalles de una realización de un método según la presente descripción para seleccionar la incorporación de sustratos novedosos o poco comunes.

La figura 6 es un diagrama que muestra la selección de ARN que tiene actividad catalítica (intermolecular) usando los métodos de la descripción.

La figura 7 es un diagrama que muestra un modelo de un complejo de Taq-ADN.

Figura 8: A: Esquema general de una reacción de CSR cooperativa.

La nucleósido difosfato cinasa (ndk) se expresa a partir de un plásmido y convierte desoxinucleósidos difosfato que no son sustratos para la Taq polimerasa en desoxinucleósidos trifosfato que sí lo son. Tan pronto como la ndk ha producido cantidades suficientes de sustrato, Taq puede replicar el gen de ndk.

B: Se mezclan 1:1 células bacterianas que expresan ndk de tipo natural (0,8 kb) o un fragmento truncado inactivo (0,5 kb) antes del emulsionamiento. En disolución, se amplifica preferentemente el fragmento truncado más corto. En emulsión, hay predominantemente amplificación del gen de ndk de tipo natural y sólo una débil amplificación del fragmento truncado (flecha), lo que indica que en emulsión sólo se amplifican genes de ndk activos que producen sustrato. M: marcador HaeIII \phi174.

Descripción detallada de la invención y la descripción

La práctica de la presente invención y descripción empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de la química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de las capacidades de un experto habitual en la técnica. Tales técnicas se explican en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, libros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; B. Roe, J. Crabtree y A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak y James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; y, D. M. J. Lilley y J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press. Cada uno de estos textos generales se incorpora al presente documento como referencia.

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Autorreplicación compartimentalizada

La descripción describe una tecnología de selección novedosa, que se denomina CSR (autorreplicación compartimentalizada). Tiene el potencial de expandirse en un sistema de selección genérico para catálisis así como para interacciones macromoleculares.

En su forma más sencilla, la CSR implica la segregación de genes que codifican para y dirigen la producción de ADN polimerasas dentro de compartimentos acuosos diferenciados, separados espacialmente de una emulsión de agua en aceite estable al calor novedosa. Provistas de nucleótidos trifosfato y cebadores flanqueantes apropiados, las polimerasas replican sólo sus propios genes. En consecuencia, se replican sólo los genes que codifican para polimerasas activas, mientras que las variantes inactivas que no pueden copiar sus genes desaparecen del conjunto de genes. Por analogía a los sistemas biológicos, entre variantes adaptadas diferencialmente, la más activa (la más idónea) produce la mayor parte de la "descendencia", correlacionando por tanto directamente el número de copias tras la selección con el recambio enzimático.

La CSR no se limita a polimerasas sino que puede aplicarse a una amplia variedad de transformaciones enzimáticas, construidas alrededor del "motor de replicasa". Por ejemplo, puede seleccionarse una enzima "que alimenta" una polimerasa que a su vez replica su gen. Pueden preverse esquemas de reacción cooperativos acoplados más complicados en los que varias enzimas o bien producen sustratos de replicasas o bien consumen inhibidores de replicasas.

Las polimerasas ocupan un papel central en el mantenimiento del genoma, la transmisión y expresión de la información genética. Las polimerasas también son el núcleo de la biología moderna, permitiendo tecnologías centrales tales como mutagénesis, bibliotecas de ADNc, secuenciación y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Sin embargo, las polimerasas usadas comúnmente tienen con frecuencia graves deficiencias ya que se usan para realizar tareas para las que la naturaleza no las ha optimizado. De hecho, la mayoría de los avances han sido secundarios, incluyendo el uso de polimerasas de diferentes organismos, sistemas de aditivo y tampón mejorados así como combinaciones de enzimas. La CSR es un sistema de selección novedoso adecuado de manera ideal para el aislamiento de polimerasas "de diseño" para aplicaciones específicas. Muchas características de la función de la polimerasa están abiertas a "mejora" (por ejemplo, procesividad, selección de sustratos, etc.). Además, la CSR es una herramienta para estudiar la función de la polimerasa, por ejemplo, para analizar con sonda regiones inmutables, estudiar componentes del replisoma etc. Además, puede usarse la CSR para la clonación funcional al azar de polimerasas, directamente a partir de poblaciones microbianas no cultivadas, diversas.

La CSR representa un principio novedoso de selección de repertorios de polipéptidos. Enfoques previos han mostrado diversos métodos de "presentación" en los que el fenotipo y el genotipo (polipéptido y gen codificante) están vinculados como parte de un "paquete genético" que contiene el gen codificante y que expone el polipéptido en el "exterior". La selección se produce mediante una etapa de purificación por afinidad tras la cual los clones supervivientes se hacen crecer (se amplifican) en células para rondas adicionales de selección (con sesgos resultantes en las selecciones que distorsionan el crecimiento). Resultan distorsiones adicionales de diferencias en las eficacias de presentación entre diferentes polipéptidos.

En otro grupo de métodos, tanto el polipéptido como el/los gen(es) codificante(s) se "empaquetan" dentro de una célula. La selección se produce in vivo a través del polipéptido que modifica la célula de tal forma que adquiere un fenotipo novedoso, por ejemplo crecimiento en presencia de un antibiótico. Ya que la presión de selección se aplica sobre células completas, tales enfoques tienden a ser propensos a la generación de falsos positivos. Además, las estrategias de complementación in vivo están limitadas porque las condiciones de selección, y por tanto los fenotipos seleccionables, no pueden elegirse libremente y además están restringidos por los límites de la viabilidad del huésped.

En la CSR, no hay un enlace físico directo (covalente o no covalente) entre el polipéptido y el gen codificante. Se "hacen crecer" más copias de genes satisfactorios directamente e in vitro como parte del proceso de selección.

La CSR puede aplicarse a un amplio espectro de ADN y ARN polimerasas, de hecho, a todos los polipéptidos (o polinucleótidos) implicados en la replicación o expresión génica. La CSR también puede aplicarse a ADN y ARN ligasas que ensamblan sus genes a partir de fragmentos de oligonucleótidos.

La CSR es el único sistema de selección en el que la tasa de recambio de una enzima está vinculada directamente con el número de copias tras la selección de su gen codificante.

Hay un gran interés por polímeros de polinucleótido con bases alteradas, azúcares alterados o incluso químicas de estructura principal. Sin embargo, la síntesis en fase sólida habitualmente puede sólo proporcionar polímeros relativamente cortos y las polimerasas que se producen de manera natural incorporan de manera no sorprendente la mayoría de los análogos de manera escasa. La CSR es adecuada de manera ideal para la selección de polimerasas más tolerantes de sustratos no naturales con el fin de preparar polímeros de polinucleótido con propiedades novedosas para la química, biología y nanotecnología (por ejemplo, hilos de ADN).

Finalmente, la emulsión estable al calor desarrollada para la CSR tiene aplicaciones por sí misma. Con > 10^{9} microcompartimentos/ml, la emulsión de PCR (ePCR) ofrece la posibilidad de multiplexación de PCR en paralelo a una escala sin precedentes con aplicaciones potenciales desde el análisis del ligamiento génico hasta la construcción de repertorios genómicos directamente a partir de células individuales. También puede tener aplicaciones para aplicaciones de PCR de diagnóstico a gran escala como "PCR digital" (Vogelstein & Kinzler (1999), PNAS, 96, 9236-9241). Las reacciones individuales de compartimentalización también pueden compensar la competencia entre diferentes segmentos de genes que se amplifican en PCR con cebadores o bien al azar o bien múltiplex y conduce a una distribución menos sesgada de los productos de amplificación. Por tanto, la ePCR puede proporcionar una alternativa a la DOP-PCR de genoma completo (y metodologías relacionadas) o de hecho puede usarse para hacer más eficaz la DOP-PCR (y metodologías relacionadas).

El sistema de selección según la descripción se basa en la autorreplicación en un sistema compartimentalizado. La descripción se basa en el hecho de que las replicasas activas pueden replicar ácidos nucleicos (en particular sus secuencias codificantes), mientras que las replicasas inactivas no. Por tanto, en los métodos de la descripción, se proporciona un sistema compartimentalizado en el que una replicasa en un compartimento no puede actuar sustancialmente sobre ningún molde diferente de los moldes dentro de ese compartimento; en particular, no puede actuar para replicar un molde dentro de cualquier otro compartimento. En realizaciones sumamente preferidas, el ácido nucleico molde dentro del compartimento codifica para la replicasa. Por tanto, la replicasa no puede replicar nada más que su secuencia codificante; por tanto, la replicasa está "vinculada" con su secuencia codificante. Como resultado, en realizaciones sumamente preferidas de la descripción, la concentración final de la secuencia codificante (es decir, el número de copias) depende de la actividad de la enzima codificada por ella.

El sistema de selección, tal como se aplica para la selección de replicasas, tiene la ventaja de que vincula el recambio catalítico (k_{cat}/K_{m}) con el número de copias tras la selección del gen que codifica para el catalizador. Por tanto, la compartimentalización ofrece la posibilidad de vincular el genotipo y fenotipo de una enzima replicasa, tal como se describe con más detalle a continuación, mediante una reacción enzimática acoplada que implica la replicación del gen o genes de la/las enzima(s) como una de sus etapas.

Los métodos de la descripción hacen uso preferiblemente de bibliotecas de ácidos nucleicos, cuya naturaleza y construcción se explicarán con más detalle a continuación. La biblioteca de ácidos nucleicos comprende un conjunto de diferentes ácidos nucleicos, miembros de dichas variantes codificadas de una entidad particular (la entidad que va a seleccionarse). Por tanto, por ejemplo, tal como se usa para seleccionar replicasas, los métodos de la descripción emplean una biblioteca o conjunto de ácido nucleico que tiene miembros que codifican para la replicasa o variantes de la replicasa. Cada una de las entidades codificadas por los diversos miembros de la biblioteca tendrá propiedades diferentes, por ejemplo, tolerancia variable al calor o a la presencia de moléculas pequeñas inhibidoras, o tolerancia para los apareamientos erróneos de pares de bases (tal como se explica con más detalle a continuación). Por tanto, la población de variantes de ácidos nucleicos proporciona un material de partida para la selección, y es análoga de muchas maneras a la variación en una población natural organismos producidos por mutación.

Según la descripción, los diferentes miembros de la biblioteca o conjunto de ácidos nucleicos se clasifican o compartimentalizan en muchos compartimentos o microcápsulas. En realizaciones preferidas, cada compartimento contiene sustancialmente un miembro de ácido nucleico del conjunto (en una o varias copias). Además, el compartimento también comprende el polipéptido o polinucleótido (en una o preferiblemente varias copias) codificado por ese miembro de ácido nucleico (ya sea una replicasa, un agente, un polipéptido, etc. tal como se trata a continuación). La naturaleza de estos compartimentos es tal que se produce un intercambio mínimo de macromoléculas (tales como ácidos nucleicos y polipéptidos) o sustancialmente no se produce entre diferentes compartimentos. Tal como se explica con más detalle a continuación, realizaciones sumamente preferidas de la descripción hacen uso de compartimentos acuosos dentro de emulsiones de agua en aceite. Tal como se explicó anteriormente, cualquier actividad replicasa presente en el compartimento (ya sea mostrada por la replicasa, modificada por un agente o mostrada por el polipéptido que actúa junto con otro polipéptido) sólo puede actuar sobre el molde dentro del compartimento.

Las condiciones dentro de los compartimentos pueden variarse con el fin de seleccionar polipéptidos activos en esas condiciones. Por ejemplo, cuando se seleccionan replicasas, los compartimentos pueden tener una temperatura aumentada para seleccionar replicasas con estabilidad térmica superior. Además, el uso de los métodos de selección descritos en el presente documento sobre proteínas de fusión que comprenden una replicasa termoestable y una proteína de interés permitirán la selección de proteínas térmicamente estables.

Es deseable un método para la incorporación de estabilidad térmica en proteínas de otro modo lábiles de importancia comercial con respecto a su producción y distribución a gran escala. Se ha descrito un sistema indicador para mejorar el plegamiento de las proteínas expresando las proteínas como fusiones con proteína verde fluorescente (GFP) (Waldo et al (1999), Nat Biotechnol 17: 691-695). La función de esta última está relacionada con el plegamiento productivo de la proteína fusionada que influye en el plegamiento y/o la funcionalidad de la GFP, permitiendo la evolución dirigida de variantes con plegamiento y expresión mejorados. Según este aspecto de la descripción, las proteínas se fusionan con una replicasa termoestable (o un agente que promueve la actividad replicasa) y se seleccionan las fusiones activas en emulsión como método para evolucionar proteínas con termoestabilidad y/o solubilidad aumentadas. Se espera que las variantes inestables de la pareja de fusión se agreguen y precipiten antes de o durante la ciclación térmica, comprometiendo así la actividad replicasa dentro de los compartimentos respectivos. Las fusiones viables permitirán la autoamplificación en emulsión, estando vinculada la tasa de recambio con la estabilidad de la pareja de fusión.

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En un enfoque relacionado, puede evolucionarse una actividad chaperonina novedosa o aumentada mediante la coexpresión de una biblioteca de chaperonas junto con una proteína de fusión de polimerasa-polipéptido, en el que el resto de proteína se pliega de manera errónea (en las condiciones de selección). La replicación del/de los gen(es) que codifican para la chaperonina sólo puede continuar después de que la actividad chaperonina haya rescatado la actividad polimerasa en las proteína de fusión de polimerasa-polipéptido.

La termoestabilidad de una enzima puede medirse mediante medios convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede someterse a ensayo la actividad catalítica de la enzima nativa a una cierta temperatura como un valor de referencia. Los ensayos enzimáticos se conocen bien en la técnica, y se han establecido ensayos convencionales a lo largo de los años. Por ejemplo, se mide la incorporación de nucleótidos por una polimerasa, por ejemplo, mediante el uso de dNTP radiomarcados tales como dATP y ensayos de unión a filtro conocidos en la técnica. Se preincuba la enzima cuya termoestabilidad va a someterse a ensayo a una temperatura elevada y luego se mide su actividad conservada (por ejemplo, actividad polimerasa en el caso de polimerasas) a una temperatura inferior, óptima y se compara con el valor de referencia. En el caso de la Taq polimerasa, la temperatura elevada es de 97,5ºC; la temperatura óptima es de 72ºC. La termoestabilidad puede expresarse en forma de la semivida a la temperatura elevada (es decir, el tiempo de incubación a una temperatura superior a partir del cual la polimerasa pierde el 50% de su actividad). Por ejemplo, las replicasas termoestables, las proteínas de fusión o los agentes seleccionados por la invención pueden tener una semivida que es 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X o más que la de la enzima nativa. Lo más preferiblemente, las replicasas termoestables, etc. tienen una semivida que es 11x o más cuando se comparan de esta forma. Preferiblemente, se preincuban polimerasas seleccionadas a 95ºC o más, 97,5ºC o más, 100ºC o más, 105ºC o más o 110ºC o más. Por tanto, en una realización sumamente preferida de la descripción, se proporcionan polimerasas con termoestabilidad aumentada que presentan una semivida a 97,5ºC que es 11x o más que la de la correspondiente enzima de tipo natural (nativa).

También puede someterse a ensayo la resistencia a un agente inhibidor, tal como heparina en el caso de polimerasas, y medirse como anteriormente. La resistencia a la inhibición puede expresarse en cuanto a la concentración del factor inhibidor. Por ejemplo, en realizaciones preferidas de la descripción, se proporcionan polimerasas resistentes a heparina que son activas con hasta una concentración de heparina de entre 0,083 unidades/\mul y 0,33 unidades/\mul. Para la comparación, los ensayos indican que la concentración de heparina que inhibe la Taq polimerasa nativa (de tipo natural) está en la región de entre 0,0005 y 0,0026 unidades/\mul.

La resistencia se expresa de manera conveniente en cuanto a la concentración de inhibidor que se encuentra que inhibe la actividad de la replicasa, proteína de fusión o agente seleccionados, en comparación con la concentración que se encuentra que inhibe la enzima nativa. Por tanto, los agentes, proteínas de fusión o replicasas resistentes seleccionados por la descripción pueden tener una resistencia de 10X, 20X, 30X, 40X, 50X, 60X, 70X, 80X, 90X, 100X, 110X, 120X, 130X, 140X, 150X, 160X, 170X, 180X, 190X, 200X o más en comparación con la enzima nativa. Lo más preferiblemente, las replicasas resistentes, etc. tienen una resistencia aumentada 130x o más veces cuando se comparan de esta forma. Las replicasas seleccionadas, etc. tienen preferiblemente una actividad del 50% o más, el 60% o más, el 70% o más, el 80% o más, el 90% o más o incluso el 100% a la concentración del factor inhibidor. Además, los compartimentos pueden contener cantidades de un agente inhibidor tal como heparina para seleccionar replicasas que tienen actividad en tales condiciones.

Tal como se explicó anteriormente, pueden usarse los métodos de la descripción para seleccionar un par de polipéptidos que interaccionan, y pueden alterarse las condiciones dentro de los compartimentos para elegir polipéptidos que puedan actuar en esas condiciones (por ejemplo, alto contenido en sal o temperatura elevada, etc.). También pueden usarse los métodos de la descripción para seleccionar el plegamiento, estabilidad y/o solubilidad de un polipéptido fusionado que actúa en esas condiciones (por ejemplo, alto contenido en sal, o temperatura elevada, agentes caotrópicos, etc.).

El método de selección de la presente descripción puede usarse para seleccionar diversas actividades replicativas, por ejemplo, actividad polimerasa. En el presente documento, la replicasa es una polimerasa, y la reacción catalítica es la replicación mediante la polimerasa de su propio gen. Por tanto, las polimerasas defectuosas o las polimerasas que son inactivas en las condiciones en las que se lleva a cabo la reacción (las condiciones de selección) no pueden amplificar sus propios genes. De manera similar, las polimerasas que son menos activas replicarán sus secuencias codificantes dentro de sus compartimentos más lentamente. Por consiguiente, estos genes estarán representados de manera insuficiente o incluso desaparecerán del conjunto de genes.

Por otra parte, las polimerasas activas pueden replicar sus propios genes, y aumentará el número de copias resultante de estos genes. En una realización preferida de la invención, el número de copias de un gen dentro del conjunto tendrá una relación directa con la actividad del polipéptido codificado en las condiciones en las que se lleva a cabo la reacción. En esta realización preferida, la polimerasa más activa será la más representada en el conjunto final (es decir, su número de copias dentro del conjunto será el mayor). Tal como se apreciará, esto permite la fácil clonación de polimerasas activas con respecto a las inactivas. Por tanto, el método de la descripción puede vincular directamente la tasa de recambio de la enzima con el número de copias resultante del gen que codifica para ella.

Como ejemplo, el método puede aplicarse al aislamiento de polimerasas activas (ADN, ARN polimerasas y transcriptasas inversas) de microorganismos termófilos. En resumen, se expresa intracelularmente una polimerasa termoestable en células bacterianas y éstas se compartimentalizan (por ejemplo en una emulsión de agua-aceite) en un tampón apropiado junto con cantidades apropiadas de los cuatro dNTP y oligonucleótidos que ceban en cualquier extremo del gen de la polimerasa o en secuencias de plásmido que flanquean el gen de la polimerasa. La polimerasa y su gen se liberan de las células mediante una etapa de temperatura que lisa las células y destruye las actividades enzimáticas asociadas con la célula huésped. Las polimerasas de microorganismos mesófilos (o polimerasas menos termoestables) pueden expresarse de manera análoga excepto la lisis celular que debe realizarse o bien a temperatura ambiente (por ejemplo, mediante la expresión de una proteína lítica (por ejemplo, derivada de bacteriófagos líticos, mediante lisis mediada por detergentes (por ejemplo, Bugbuster^{TM}, disponible comercialmente) o bien la lisis puede realizarse a temperatura elevada en presencia de un agente estabilizador de polimerasa (por ejemplo, altas concentraciones de prolina (véase el ejemplo 27) en el caso de Klenow o trehalosa en el caso de RT). En tales casos, la actividad polimerasa de fondo de la cepa huésped puede interferir en la selecciones y es preferible utilizar cepas mutantes (por ejemplo, polA^{-}).

Alternativamente, pueden compartimentalizarse como anteriormente los genes de polimerasa (o bien como plásmidos o bien como fragmentos lineales) y expresarse la polimerasa in situ dentro de los compartimentos usando transcripción-traducción in vitro (ivt), seguido por una etapa de temperatura para destruir las actividades enzimáticas asociadas con el extracto de traducción in vitro. Pueden expresarse in situ polimerasas de microorganismos mesófilos (o polimerasas menos termoestables) de manera análoga excepto que, con el fin de evitar las actividades enzimáticas asociadas con el extracto de traducción in vitro, puede ser preferible usar un extracto de traducción reconstituido a partir de componentes purificados definidos como el sistema PURE (Shimizu et al (2001) Nat. Biotech., 19: 751).

La termociclación de PCR conduce entonces a la amplificación de los genes de la polimerasa mediante los polipéptidos para los que codifican, es decir, sólo se amplificarán los genes que codifican para polimerasas activas o las polimerasas activas en las condiciones elegidas. Además, el número de copias de un gen de polimerasa X tras la autoamplificación será directamente proporcional a la actividad catalítica de la polimerasa X para la que codifica (véanse las figuras 1A y 1B).

Mediante la variación de las condiciones de selección dentro del compartimento, pueden seleccionarse polimerasas u otras replicasas con propiedades deseadas usando los métodos de la descripción. Por tanto, mediante la exposición de repertorios de genes de polimerasa (diversificados a través de mutación dirigida o al azar) a autoamplificación y mediante la alteración de las condiciones en las que puede producirse la autoamplificación, puede usarse el sistema para el aislamiento y la ingeniería de polimerasas con propiedades alteradas, potenciadas o novedosas. Tales propiedades potenciadas pueden incluir termoestabilidad aumentada, procesividad aumentada, precisión aumentada (mejor corrección de lectura), incorporación aumentada de sustratos desfavorables (por ejemplo, ribonucleótidos, bases generales modificadas con colorante tales como 5-nitroindol, u otros sustratos poco comunes tales como nucleótidos de pireno (Matray & Kool (1999), Nature 399, 704-708) (figura 3) o resistencia a inhibidores (por ejemplo, heparina en muestras clínicas). Propiedades novedosas pueden ser la incorporación de sustratos no naturales (por ejemplo, ribonucleótidos), lectura con desviación de sitios dañados (por ejemplo, sitios abásicos (Paz-Elizur T. et al (1997) Biochemistry 36, 1766), dímeros de timidina (Wood R.D. (1999) Nature 399, 639), bases de hidantoína (Duarte V et al (1999) Nucleic Acids Res. 27, 496) y posiblemente incluso químicas novedosas (por ejemplo, estructuras principales novedosas tales como PNA (Nielsen PE. Curr Opin Biotechnol. 1999; 10(1):71-5) o sulfona (Benner SA et al. Pure Appl Chem. feb. de 1998; 70(2):263-6) o químicas de azúcar alteradas (A. Eschenmoser, Science 284, 2118-24 (1999)). También puede usarse para aislar o evolucionar factores que potencian o modifican la función de la polimerasa tales como factores de procesividad (como tiorredoxina en el caso de la ADN polimerasa de T7 (Doublie S. et al (1998) Nature 391, 251)).

Sin embargo, también pueden seleccionarse otras enzimas además de replicasas, tales como telomerasas, helicasas, etc. según la descripción. Por tanto, la telomerasa se expresa in situ (en compartimentos) mediante, por ejemplo, traducción in vitro junto con ARN de telomerasa (o bien añadido o bien transcrito in situ también; por ejemplo Bachand et al., (2000) RNA 6:778-784).

Los compartimentos también contienen Taq pol. y dNTP y cebadores específicos de telómeros. A baja temperatura, la Taq es inactiva pero la telomerasa activa añadirá telómeros a su propio gen codificante (un fragmento de ADN lineal con extremos apropiados). Tras la reacción de la telomerasa, la termociclación sólo amplifica los genes que codifican para telomerasas activas. Puede introducirse diversidad en el gen o ARN de telomerasa (o ambos) y puede ser dirigida o al azar. Tal como se aplica a la selección de helicasas, el método de selección es esencialmente el mismo que se describió para telomerasas, pero se usa la helicasa para desenrollar las cadenas en lugar de desnaturalización por calor.

Los métodos de la descripción también pueden usarse para seleccionar enzimas de reparación del ARN o polimerasas de translesión tales como Pol IV y Pol V de E. coli. En el presente documento, se introduce daño en los cebadores (química dirigida) o al azar mediante tratamiento con mutágenos (por ejemplo, UV, productos químicos mutagénicos, etc.). Esto permite la selección de enzimas que pueden reparar los cebadores requeridos para la replicación o la propia secuencia génica (recuperación de la información) o, dando como resultado "reparasas" mejoradas para terapia génica, etc.

Los métodos de la descripción también pueden usarse en sus diversas realizaciones para seleccionar agentes que pueden modular directa o indirectamente la actividad replicasa. Además, la invención puede usarse para seleccionar un par de polipéptidos que pueden interaccionar, o para la selección de ácidos nucleicos catalíticos tales como ARN catalítico (ribozimas). Estas y otras realizaciones se explicarán con más detalle a continuación.

Enzimas de procesamiento de ácidos nucleicos

Tal como se hace referencia en el presente documento, una enzima de procesamiento de ácidos nucleicos es cualquier enzima, que puede ser una enzima proteica o una enzima de ácido nucleico, que puede modificar, extender (tal como en al menos un nucleótido), amplificar o influir de otra manera a ácidos nucleicos de modo que haga que el ácido nucleico pueda seleccionarse mediante amplificación según la presente descripción. Por tanto, tales enzimas tienen una actividad que da como resultado, por ejemplo, amplificación, estabilización, desestabilización, hibridación o desnaturalización, replicación, protección o desprotección de ácidos nucleicos, o cualquier otra actividad basándose en la cual puede seleccionarse un ácido nucleico mediante amplificación. Los ejemplos incluyen helicasas, telomerasas, ligasas, recombinasas, integrasas y replicasas. Se prefieren las replicasas.

Replicasa/replicación

Tal como se usa en el presente documento, el término "replicación" se refiere al copiado dependiente de molde de una secuencia de ácido nucleico. A continuación, se tratan y se ponen ejemplos de los ácidos nucleicos. En general, el producto de la replicación es otro ácido nucleico, ya sea de la misma especie o de una especie diferente. Por tanto, se incluyen la replicación de ADN para producir ADN, la replicación de ADN para producir ARN, la replicación de ARN para producir ADN y la replicación de ARN para producir ARN. Por tanto, "replicación" pretende abarcar procesos tales como la replicación de ADN, polimerización, ligación de oligonucleótidos o polinucleótidos (por ejemplo, trinucleótidos (triplete) 5' trifosfato) para formar secuencias más largas, transcripción, transcripción inversa, etc.

El término "replicasa" pretende significar cualquier enzima que tiene actividad catalítica que puede unir elementos estructurales de nucleótido entre sí para formar secuencias de ácido nucleico. Tales elementos estructurales de nucleótido incluyen, pero sin limitarse a, nucleósidos, nucleósidos trifosfato, desoxinucleósidos, desoxinucleósidos trifosfato, nucleótidos (que comprenden una base que contiene nitrógeno tal como adenina, guanina, citosina, uracilo, timina, etc., un azúcar con 5 carbonos y uno o más grupos fosfato), nucleótidos trifosfato, desoxinucleótidos tales como desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxicitidina, desoxiuridina, desoxiguanidina, desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) y análogos sintéticos o artificiales de éstos. Los elementos estructurales también incluyen oligómeros o polímeros de cualquiera de los anteriores, por ejemplo, trinucleótidos (tripletes), oligonucleótidos y polinucleótidos.

Por tanto, una replicasa puede extender una secuencia de ácido nucleico preexistente (cebador) incorporando nucleótidos o desoxinucleótidos. Tal actividad se conoce en la técnica como "polimerización", y las enzimas que llevan a cabo esto se conocen como "polimerasas". Un ejemplo de una replicasa polimerasa de este tipo es la ADN polimerasa, que puede replicar el ADN. El cebador puede ser igual químicamente, o diferente, de la secuencia extendida (por ejemplo, se sabe que la ADN polimerasa de mamíferos extiende una secuencia de ADN a partir de un cebador de ARN). El término replicasa también incluye aquellas enzimas que unen entre sí secuencias de ácido nucleico, ya sean polímeros u oligómeros, para formar secuencias de ácido nucleico más largas. Las ligasas, que ligan trozos de ADN o ARN, muestran una actividad de este tipo.

La replicasa puede consistir completamente en una secuencia de replicasa, o puede comprender una secuencia de replicasa unida a un polipéptido heterólogo u otra molécula tal como un agente mediante medios químicos o en forma de una proteína de fusión o ensamblarse a partir de dos o más partes constituyentes.

Preferiblemente, la replicasa es una ADN polimerasa, ADN polimerasa, transcriptasa inversa, ADN ligasa o ARN ligasa.

Preferiblemente, la replicasa es una replicasa termoestable. Una replicasa "termoestable" tal como se usa en el presente documento es una replicasa que muestra una resistencia significativa a la desnaturalización térmica a temperaturas elevadas, normalmente superiores a la temperatura corporal (37ºC). Preferiblemente, tal temperatura está en el intervalo de 42ºC a 160ºC, más preferiblemente, entre 60ºC hasta 100ºC, lo más preferiblemente, es superior a 90ºC. En comparación con una replicasa no termoestable, la replicasa termoestable presenta una semivida (tiempo de incubación a temperaturas elevadas que da como resultado una pérdida de actividad del 50%) significativamente aumentada. Preferiblemente, la replicasa termoestable conserva el 30% o más de su actividad tras la incubación a la temperatura elevada, más preferiblemente el 40%, 50%, 60%, 70% u 80% o más de su actividad. Aún más preferiblemente, la replicasa conserva una actividad del 80%. Lo más preferiblemente, la actividad conservada es del 90%, 95% o más, incluso del 100%. Las replicasas no termoestables mostrarían poca o ninguna conservación de la actividad tras incubaciones similares a la temperatura elevada.

Polimerasa

Un ejemplo de una replicasa es la ADN polimerasa. Las enzimas ADN polimerasa son enzimas intracelulares que se producen de manera natural, y las usa una célula para replicar una cadena de ácido nucleico usando una molécula molde para fabricar una cadena de ácido nucleico complementaria. Las enzimas que tienen actividad ADN polimerasa catalizan la formación de un enlace entre el grupo hidroxilo en 3' en el extremo en crecimiento de un cebador de ácido nucleico y el grupo fosfato en 5' de un nucleótido trifosfato. Estos nucleótidos trifosfato se seleccionan habitualmente de desoxiadenosina trifosfato (A), desoxitimidina trifosfato (T), desoxicitidina trifosfato (C) y desoxiguanosina trifosfato (G). Sin embargo, las ADN polimerasas pueden incorporar versiones modificadas o alteradas de estos nucleótidos. El orden en el que se añaden los nucleótidos lo dicta el apareamiento de bases a una cadena molde de ADN; tal apareamiento de bases se consigue mediante puentes de hidrógeno "canónicos" (puentes de hidrógeno entre los nucleótidos A y T y los nucleótidos G y C de las cadenas de ADN opuestas), aunque se conoce en la técnica el apareamiento de bases no canónico, tal como el apareamiento de bases G:U. Véase, por ejemplo, Adams et al., The Biochemistry of the Nucleic Acids 14-32 (11ª ed. 1992). El uso in vitro de enzimas que tienen actividad ADN polimerasa se ha hecho en los últimos años más común en una variedad de aplicaciones bioquímicas incluyendo reacciones de síntesis de ADNc y de secuenciación de ADN (véase Sambrook et al., (2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) y amplificación de ácidos nucleicos mediante métodos tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Mullis et al., patentes estadounidenses números 4.683.195, 4.683.202 y 4.800,159) y métodos de amplificación mediada por transcripción de ARN (por ejemplo, Kacian et al., publicación PCT número WO91/01384).

Métodos tales como PCR hacen uso de ciclos de extensión de cebadores a través del uso de una actividad ADN polimerasa, seguido por desnaturalización térmica del ácido nucleico bicatenario resultante con el fin de proporcionar un nuevo molde para otra ronda de hibridación con cebadores y extensión. Debido a que las altas temperaturas necesarias para la desnaturalización de las cadenas da como resultado las inactivaciones irreversibles de muchas ADN polimerasas, el descubrimiento y uso de ADN polimerasas que pueden permanecer activas a temperaturas superiores a de aproximadamente 37ºC a 42ºC (enzimas ADN polimerasa termoestables) proporcionan una ventaja en costes y eficacia del trabajo. Se han descubierto ADN polimerasas termoestables en varios microorganismos termófilos incluyendo, pero sin limitarse a Thermus aquaticus, Thermus thermophilus y especies de los géneros Bacillus, Thermococcus, Sulfolobus, Pyrococcus. Las ADN polimerasas pueden purificarse directamente a partir de estos microorganismos termófilos. Sin embargo, pueden obtenerse aumentos sustanciales en el rendimiento de la ADN polimerasa clonando en primer lugar el gen que codifica para la enzima en un vector de expresión de múltiples copias mediante métodos de tecnología de ADN recombinante, insertando el vector en una cepa de células huésped que puede expresar la enzima, cultivando las células huésped que contienen el vector, extrayendo luego la ADN polimerasa de una cepa de células huésped que ha expresado la enzima.

Las ADN polimerasas bacterianas que se han caracterizado hasta la fecha tienen ciertos patrones de similitudes y diferencias que han conducido a algunos a dividir estas enzimas en dos grupos: aquellas cuyos genes contienen intrones/inteínas (ADN polimerasas de clase B) y aquellas cuyos genes de ADN polimerasa son aproximadamente similares al de la ADN polimerasa I de E. coli y no contienen intrones (ADN polimerasas de clase A).

Se han clonado y expresado varias ADN polimerasas termoestables de clase A y clase B derivadas de microorganismos termófilos. Entre las enzimas de clase A: Lawyer, et al., J. Biol. Chem. 264:6427-6437 (1989) y Gelfund et al, patente estadounidense número 5.079.352, notifican la clonación y expresión de una ADN polimerasa termoestable de longitud completa derivada de Thermus aquaticus (Taq). Lawyer et al., en PCR Methods and Applications, 2:275-287 (1993), y Bames, publicación PCT número WO92/06188 (1992), dan a conocer la clonación y expresión de versiones truncadas de la misma ADN polimerasa, mientras que Sullivan, publicación EPO número 0482714A1 (1992), notifica la clonación de una versión mutada de la ADN polimerasa Taq. Asakura et al., J. Ferment. Bioeng. (Japón), 74:265-269 (1993) han clonado y expresado, según se informa, una ADN polimerasa de Thermus thermophilus. Gelfund et al., publicación PCT número WO92/06202 (1992), han dado a conocer una ADN polimerasa termoestable de Thermosipho africanus. Se notifica una ADN polimerasa termoestable de Thermus flavus por Akhmetzjanov y Vakhitov, Nucleic Acids Res., 20:5839 (1992). Uemori et al., J. Biochem. 113: 401-410 (1993) y publicación EPO número 0517418A2 (1992) han notificado la clonación y expresión de una ADN polimerasa de la bacteria termófila Bacillus caldotenax. Ishino et al., solicitud de patente japonesa número HEI 4[1992]-131400 (fecha de publicación 19 de noviembre de 1993) notifican la clonación de una ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus. Entre las enzimas de clase B: se notifica una ADN polimerasa termoestable recombinante de Thermococcus litoralis por Comb et al., publicación EPO número 0 455 430 A3 (1991), Comb et al., publicación EPO número 0547920A2 (1993) y Perler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.), 89:5577-5581 (1992). Se da a conocer una ADN polimerasa termoestable de Sulfolobus solofatarius en Pisani et al., Nucleic Acids Res. 20:2711-2716 (1992) y en la publicación PCT WO93/25691 (1993). La enzima termoestable de Pyrococcus furiosus se da a conocer en Uemori et al., Nucleic Acids Res., 21:259-265 (1993), mientras que se deriva una ADN polimerasa recombinante de Pyrococcus sp. en Comb et al., publicación EPO número 0547359A1 (1993).

Muchas ADN polimerasas termoestables tienen actividades adicionales a una actividad ADN polimerasa; éstas pueden incluir una actividad exonucleasa 5'-3' y/o una actividad exonucleasa 3'-5'. Las actividades de las exonucleasas 5'-3' y 3'-5' las conocen bien los expertos habituales en la técnica. La actividad exonucleasa 3'-5' mejora la precisión de la cadena recién sintetizada eliminando las bases incorrectas que puedan haberse incorporado; las ADN polimerasas en las que tal actividad es baja o está ausente incluyen, según se notifica, Taq ADN polimerasa, (véase Lawyer et al., J. Biol Chem. 264:6427-6437), tienen elevadas tasas de error en la incorporación de residuos de nucleótido en la cadena de extensión de cebadores. En aplicaciones tales como procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos en los que la replicación del ADN es a menudo geométrica en relación con el número de ciclos de extensión de cebadores, tales errores pueden conducir a problemas por artefactos graves tales como heterogeneidad de secuencia del producto de amplificación de ácido nucleico (amplicón). Por tanto, una actividad exonucleasa 3'-5' es una característica deseada de una ADN polimerasa termoestable usada para tales fines.

En cambio, la actividad exonucleasa 5'-3' presente a menudo en enzimas ADN polimerasa no se desea a menudo en una aplicación particular ya que puede digerir ácidos nucleicos, incluyendo cebadores, que tienen un extremo 5' desprotegido. Por tanto, una ADN polimerasa termoestable con una actividad exonucleasa 5'-3', o en la que tal actividad está ausente, también es una característica deseada de una enzima para aplicaciones bioquímicas. Se han descrito diversas enzimas ADN polimerasa en las que se ha introducido una modificación en una ADN polimerasa, que consiguen este objeto. Por ejemplo, puede producirse el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli como un fragmento proteolítico de la holoenzima en el que se ha eliminado el dominio de la proteína que controla la actividad exonucleasa 5'-3'. El fragmento Klenow conserva todavía la actividad polimerasa y la actividad exonucleasa 3'-5'. Bames, citado anteriormente, y Gelfund et al., patente estadounidense número 5.079.352 han producido Taq ADN polimerasas recombinantes deficientes en exonucleasa 5'-3'. Ishino et al., publicación EPO número 0517418A2, han producido una ADN polimerasa deficiente en actividad exonucleasa 5'-3' derivada de Bacillus caldotenax. Por otra parte, las polimerasas que carecen del dominio de exonucleasa 5'-3' tienen a menudo procesividad reducida.

Ligasa

Se generan transitoriamente roturas y huecos en la cadena de ADN durante la replicación, reparación y recombinación. En núcleos de células de mamíferos, el que se vuelvan a unir tales roturas de la cadena depende de varias enzimas ADN polimerasas y ADN ligasas diferentes. Se ha descrito ampliamente el mecanismo para unir las interrupciones de la cadena de ADN mediante enzimas ADN ligasas. La reacción se inicia mediante la formación de un complejo covalente de enzima-adenilato. Las enzimas ADN ligasa de mamíferos y virales emplean ATP como cofactor, mientras que las enzimas ADN ligasa bacterianas usan NAD para generar el grupo adenililo. En el caso de ligasas que utilizan ATP, el ATP se escinde en AMP y pirofosfato con el residuo de adenililo unido mediante un enlace fosforamidato al grupo \varepsilon-amino de un residuo de lisina específico en el sitio activo de la proteína (Gumport, R. I., et al., PNAS, 68:2559-63 (1971)). Se transfiere el residuo de AMP reactivado del producto intermedio de ADN ligasa-adenilato al extremo terminal 5'-fosfato de una rotura de cadena sencilla en ADN bicatenario para generar un complejo covalente de ADN-AMP con un enlace 5'-5'-fosfoanhídrido. Este producto intermedio de reacción también se ha aislado para enzimas ADN ligasa microbianas y de mamíferos, pero tiene una vida más corta que la enzima adenililada. En la etapa final de la ligación de ADN, las enzimas ADN ligasa no adenililadas requeridas para la generación de un enlace fosfodiéster catalizan el desplazamiento del residuo de AMP a través del ataque por el grupo 3'-hidroxilo adyacente en el sitio adenililado.

La existencia de tres enzimas ADN ligasa diferentes, ADN ligasa I, II y III se establece previamente mediante la caracterización bioquímica e inmunológica de las enzimas purificadas (Tomkinson, A. E. et al., J. Biol. Chem., 266: 21728-21735 (1991) y Roberts, E., et al., J. Biol. Chem., 269:3789-3792 (1994)).

Amplificación

Los métodos de esta invención implican la amplificación con molde de ácidos nucleicos deseados. "Amplificación" se refiere al aumento en el número de copias de un fragmento de ácido nucleico particular (o una parte de éste) que resulta o bien de una reacción en cadena enzimática (tal como una reacción en cadena de la polimerasa, una reacción en cadena de la ligasa o una replicación de secuencia autosostenida) o bien de la replicación de todo o parte del vector en el que se ha clonado. Preferiblemente, la amplificación según la invención es una amplificación exponencial, tal como se muestra por ejemplo mediante la reacción en cadena de la polimerasa.

Se han descrito en la bibliografía muchos métodos de amplificación de señales y dirigida, por ejemplo, revisiones generales de estos métodos en Landegren, U., et al., Science 242:229-237 (1988) y Lewis, R., Genetic Engineering News 10:1, 54-55 (1990). Estos métodos de amplificación pueden usarse en los métodos de la invención, e incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR in situ, reacción de amplificación de la ligasa (LAR), hibridación de ligasas, replicasa del bacteriófago Q\Box, sistema de amplificación basado en transcripción (TAS), amplificación genómica con secuenciación del transcrito (GAWTS), amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA) e hibridación in situ.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La PCR es un método de amplificación de ácidos nucleicos descrito, entre otros, en las patentes estadounidenses números 4.683.195 y 4.683.202. La PCR consiste en ciclos repetidos de reacciones de extensión de cebadores generadas por la ADN polimerasa. El ADN diana se desnaturaliza por calor y se hibridan dos oligonucleótidos, que encierran la secuencia diana en cadenas opuestas del ADN que va a amplificarse. Estos oligonucleótidos se convierten en cebadores para su uso con la ADN polimerasa. Se copia el ADN mediante la extensión de cebadores para preparar una segunda copia de ambas cadenas. Mediante la repetición del ciclo de desnaturalización por calor, hibridación y extensión de cebadores, puede amplificarse el ADN diana un millón de veces o más en aproximadamente de dos a cuatro horas. La PCR es una herramienta de biología molecular, que debe usarse junto con una técnica de detección para determinar los resultados de la amplificación. Una ventaja de la PCR es que aumenta la sensibilidad amplificando la cantidad de ADN diana en de 1 millón a 1 billón de veces en aproximadamente 4 horas.

La reacción en cadena de la polimerasa puede usarse tal como sigue. Por ejemplo, puede usase la PCR para seleccionar variantes de la Taq polimerasa que tienen actividad polimerasa. Tal como se describió con más detalle anteriormente, se genera una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican cada uno para una replicasa o una variante de la replicasa, por ejemplo, la Taq polimerasa, y se subdivide en compartimentos. Cada compartimento comprende sustancialmente un miembro de la biblioteca junto con la replicasa o variante codificada por ese miembro.

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La polimerasa o variante puede expresarse in vivo en una bacteria transformada o cualquier otro huésped de expresión adecuado, por ejemplo células de levaduras o de insectos o de mamíferos, y el huésped de expresión encapsularse dentro de un compartimento. Se aplica calor o cualquier otro medio adecuado para romper el huésped y liberar la variante de polimerasa y su ácido nucleico codificante dentro del compartimento. En el caso de un huésped bacteriano, puede emplearse la expresión programada de una proteína lítica, por ejemplo la proteína E de \phi174, o el uso de un lisógeno \lambda inducible para la ruptura de la bacteria.

Resultará evidente que no es necesario que la polimerasa u otra enzima sea una proteína heteróloga expresada en ese huésped (por ejemplo, un plásmido), sino que puede expresarse a partir de un gen que forma parte del genoma del huésped. Por tanto, la polimerasa puede ser, por ejemplo, una polimerasa bacteriana endógena o nativa. Se ha mostrado que en el caso de la nucleótido difosfato cinasa (ndk), la expresión endógena (no inducida) de ndk es suficiente para generar dNTP para su propia replicación. Por tanto, pueden emplearse los métodos de selección según la descripción para la clonación funcional directa de polimerasas y otras enzimas de poblaciones microbianas diversas (y no cultivadas).

Alternativamente, la biblioteca de ácidos nucleicos puede compartimentalizarse junto con componentes de un sistema de transcripción/traducción in vitro (tal como se describe con más detalle en este documento), y expresarse la variante de polimerasa in vitro dentro del compartimento.

Cada compartimento también comprende componentes para una reacción de PCR, por ejemplo, nucleótidos trifosfato (dNTP), tampón, magnesio y cebadores de oligonucleótido. Los cebadores de oligonucleótido pueden tener secuencias que corresponden a secuencias que flanquean el gen de la polimerasa (es decir, dentro del ADN genómico o de vector) o a secuencias dentro del gen de la polimerasa. Se inicia entonces la ciclación térmica de la PCR para permitir que cualquier variante de polimerasa que tenga actividad polimerasa amplifique la secuencia de ácido nucleico.

Las polimerasas activas amplificarán sus secuencias de ácido nucleico correspondientes, mientras que las secuencias de ácido nucleico que codifican para polimerasas débilmente activas o inactivas se replicarán débilmente o no se replicarán en absoluto. En general, se espera que el número final de copias de cada miembro de la biblioteca de ácidos nucleicos sea proporcional al nivel de actividad de la variante de polimerasa codificada por él. Los ácidos nucleicos que codifican para polimerasas activas estarán representados en exceso, y los ácidos nucleicos que codifican para polimerasas inactivas o débilmente activas estarán representados de manera insuficiente. Entonces, las secuencias amplificadas resultantes pueden clonarse y secuenciarse, etc., y someterse a ensayo la capacidad de replicación de cada miembro.

Tal como se describe con más detalle en otra parte, pueden alterarse las condiciones dentro de cada compartimento para seleccionar polimerasas activas en esas condiciones. Por ejemplo, puede añadirse heparina a la mezcla de reacción para elegir polimerasas que son resistentes a heparina. Puede elevarse la temperatura a la que tiene lugar la PCR para seleccionar variantes de polimerasa resistentes al calor. Además, pueden seleccionarse polimerasas que pueden extender secuencias de ADN tales como cebadores con extremos 3' alterados o partes alteradas de la secuencia de cebador. Los extremos 3' alterados u otras alteraciones pueden incluir bases no naturales (azúcar o restos de base alterados), bases modificadas (por ejemplo, extremos 3' bloqueados) o incluso cebadores con químicas de estructura principal alteradas (por ejemplo, cebadores de PNA).

Transcriptasa inversa-PCR

Se usa la RT-PCR para amplificar dianas de ARN. En este procedimiento, se usa la enzima transcriptasa inversa para convertir ARN en ADN complementario (ADNc), que entonces puede amplificarse usando la PCR. Se ha probado que este método es útil para la detección de virus de ARN.

Los métodos de la descripción pueden emplear RT-PCR. Por tanto, puede proporcionarse el conjunto de ácidos nucleicos que codifican para la replicasa o sus variantes en forma de una biblioteca de ARN. Esta biblioteca podría generarse in vivo en bacterias, células de mamíferos, levaduras, etc. que están compartimentalizadas, o mediante transcripción in vitro de ADN compartimentalizado. El ARN podría codificar para una replicasa co-compartimentalizada (por ejemplo, transcriptasa inversa o polimerasa) que se ha expresado in vivo (y liberarse en emulsión junto con el ARN por medios dados a conocer a continuación) o in vitro. Otros componentes necesarios para la amplificación (polimerasa y/o transcriptasa inversa, dNTP, cebadores) también están compartimentalizados. Bajo la/las presión(es) de selección dada(s), el producto de ADNc de la reacción de transcripción inversa sirve como molde para la amplificación por PCR. Como con otras reacciones de replicación (en particular, ndk en los ejemplos), el ARN puede codificar para una gama de enzimas que alimentan la reacción.

Replicación de secuencia autosostenida (3SR)

La replicación de secuencia autosostenida (3SR) es una variación de la TAS, que implica la amplificación isotérmica de un molde de ácido nucleico mediante rondas secuenciales de actividades transcriptasa inversa (RT), polimerasa y nucleasa que están mediadas por un cóctel enzimático y cebadores de oligonucleótido apropiados (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874). Se usa la degradación enzimática del ARN del heterodúplex de ARN/ADN en lugar de desnaturalización por calor. Se añaden la ARNasa H y todas las demás enzimas a la reacción y tienen lugar todas las etapas a la misma temperatura y sin adiciones de reactivos adicionales. Siguiendo este procedimiento, se han logrado amplificaciones de 10^{6} a 10^{9} en una hora a 42ºC.

Por tanto, pueden extenderse los métodos de la descripción para seleccionar polimerasas o replicasas de organismos mesófilos usando la amplificación isotérmica 3SR (Guatelli et al Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7797; Compton (1991) Nature 7; 350:91-92) en lugar de termociclación de PCR. Tal como se describió anteriormente, la 3SR implica la acción concertada de dos enzimas: una ARN polimerasa así como una transcriptasa inversa cooperan en una reacción acoplada de transcripción y transcripción inversa, lo que conduce a la amplificación simultánea tanto de ARN como ADN. Claramente, en este sistema puede aplicarse la autoamplificación a cualquiera de las dos enzimas implicadas o a ambas simultáneamente. También puede incluirse la evolución de la actividad ARNasa H o bien como parte de la enzima transcriptasa inversa (por ejemplo, RT de VIH-1) o bien por sí misma.

Las diversas actividades enzimáticas que definen la 3SR y métodos relacionados son todas dianas para la selección usando los métodos de la invención. Pueden proporcionarse variantes de o bien la ARN polimerasa de T7, la transcriptasa inversa (RT) o bien la ARNasa H dentro de los compartimentos acuosos de las emulsiones, y seleccionarse en condiciones por lo demás limitativas. Estas variantes pueden introducirse mediante "aglomerados génicos" de E. coli, (es decir, bacterias que expresan el polipéptido), u otros medios tal como se describe en otra parte de este documento. La liberación inicial en la emulsión puede estar mediada por lisis enzimática (por ejemplo, lisógeno lambda) o térmica, u otros métodos dados a conocer en el presente documento. Esta última puede necesitar el uso de agentes que estabilizan la actividad enzimática a temperaturas transitoriamente elevadas. Por ejemplo, puede ser necesario incluir cantidades de prolina, glicerol, trehalosa u otros agentes estabilizadores conocidos en la técnica para efectuar la estabilización de enzimas termosensibles tales como transcriptasa inversa. Además, puede emprenderse la eliminación gradual del agente para seleccionar un aumento de estabilidad de la enzima termosensible.

Alternativamente, y tal como se describe en otra parte, pueden producirse variantes mediante traducción y transcripción acopladas, alimentándose los productos expresados en el ciclo de 3SR.

Se apreciará también que es posible sustituir la transcriptasa inversa por la Tth ADN polimerasa termoestable. Se sabe que la Tht ADN polimerasa tiene actividad transcriptasa inversa y el molde de ARN se transcribe eficazmente de manera inversa en el ADN molde usando esta enzima. Por tanto, es posible seleccionar variantes útiles de esta enzima, por ejemplo, introduciendo variantes de ARN polimerasa de T7 expresadas por bacterias en la emulsión y preincubación a una temperatura por lo demás no permisiva.

El ejemplo 18 a continuación es un ejemplo que muestra una manera en que pueden aplicarse los métodos de la descripción a la selección de replicasas usando la replicación de secuencia autosostenida (3SR).

Amplificación por ligación (LAR/LAS)

La reacción de amplificación por ligación o el sistema de amplificación por ligación usa ADN ligasa y cuatro oligonucleótidos, dos por cadena diana. Esta técnica se describe por Wu, D. Y. y Wallace, R. B. (1989) Genomics 4:560. Los oligonucleótidos hibridan con secuencias adyacentes en el ADN diana y se unen mediante la ligasa. La reacción se desnaturaliza por calor y se repite el ciclo.

Por analogía a la aplicación a polimerasas, el método puede aplicarse a ligasas, en particular de microorganismos termófilos. Se sintetizan oligonucleótidos complementarios a una cadena de la secuencia del gen de la ligasa (o bien como un apareamiento perfecto o bien comprendiendo diversidad dirigida o al azar). Los dos oligonucleótidos de extremo se superponen en las regiones no traducidas o de vector del gen de la ligasa. El gen de la ligasa se clona para su expresión en un huésped apropiado y se compartimentaliza junto con los oligonucleótidos y una fuente de energía apropiada (habitualmente ATP (o NADPH)). Si es necesario, se libera de las células la ligasa expresada en bacterias como anteriormente mediante lisis térmica. Los compartimentos contienen tampones apropiados junto con cantidades apropiadas de una fuente de energía apropiada (ATP o NADH) y oligonucleótidos que codifican para la totalidad del gen de la ligasa así como para secuencias flanqueantes requeridas para la clonación. La ligación de los oligonucleótidos conduce al ensamblaje de un gen de ligasa de longitud completa (utilizado como molde por el gen de la ligasa en el plásmido de expresión) mediante una ligasa activa. En los compartimentos que contienen una ligasa inactiva, no tendrá lugar ensamblaje. Como con las polimerasas, el número de copias de un gen de ligasa X tras la autoligación será preferiblemente proporcional a la actividad catalítica en las condiciones de selección de la ligasa X para la que codifica.

Tras la lisis de la célula, el termociclación conduce a la hibridación de los oligonucleótidos con el gen de la ligasa. Sin embargo, la ligación de los oligonucleótidos y, por tanto, el ensamblaje del gen de la ligasa de longitud completa dependen de la presencia de una ligasa activa en el mismo compartimento. Por tanto, sólo los genes que codifican para ligasas activas ensamblarán sus propios genes codificantes a partir de los presentes oligonucleótidos. Entonces pueden amplificarse los genes ensamblados, diversificarse y volverse a clonar para otra ronda de selección si es necesario. Por tanto, los métodos de la descripción son adecuados para la selección de ligasas, que son más rápidas y más eficaces en la ligación.

Tal como se indica en otra parte, la ligasa puede producirse o bien in situ mediante expresión a partir de un huésped bacteriano u otro adecuado, o bien mediante traducción in vitro. La ligasa puede ser una oligonucleótido (por ejemplo, ribo o desoxirribozima) ligasa que ensambla su propia secuencia a partir de los fragmentos disponibles, o la ligasa puede ser una ligasa convencional (de polipéptidos). La longitud de los oligonucleótidos dependerá de la reacción particular, pero si es necesario, pueden ser muy cortos (por ejemplo, tripletes). Tal como se indica en otra parte, puede usarse el método de la descripción para seleccionar un agente que puede modular la actividad ligasa, o bien directa o bien indirectamente. Por ejemplo, el gen que va a evolucionarse puede ser otra enzima o enzimas que generan un sustrato para la ligasa (por ejemplo, NADH) o consumen un inhibidor. En este caso, los oligonucleótidos codifican para partes de la otra enzima o enzimas, etc.

La reacción de ligación entre oligonucleótidos puede incorporar químicas alternativas, por ejemplo, enlaces amida. Siempre que los enlaces químicos no interfieran en el copiado con molde de la cadena opuesta mediante cualquier replicasa (por ejemplo, transcriptasa inversa), puede evolucionarse una amplia variedad de químicas de enlace y ligasas que las catalizan.

Replicasa Q\beta

En esta técnica, se usa la ARN replicasa para el bacteriófago Q\beta, que replica ARN monocatenario, para amplificar el ADN diana, tal como se describe por Lizardi et al. (1988) Bio. Technology 6:1197. En primer lugar, se hibrida el ADN diana con un cebador que incluye un promotor de T7 y una región de secuencia en 5' de Q\beta. Usando este cebador, la transcriptasa inversa genera un ADNc que conecta el cebador con su extremo 5' en el procedimiento. Estas dos etapas son similares a las del protocolo de TAS. El heterodúplex resultante se desnaturaliza por calor. A continuación, se usa un segundo cebador que contiene una región de secuencia en 3' de Q\beta para iniciar una segunda ronda de síntesis de ADNc. Esto da como resultado un ADN bicatenario que contiene ambos extremos 5' y 3' del bacteriófago Q\beta así como un sitio de unión de ARN polimerasa de T7 activa. Entonces, la ARN polimerasa de T7 transcribe el ADN bicatenario en nuevo ARN, que imita a Q\beta. Tras lavado exhaustivo para eliminar cualquier sonda no hibridada, se eluye el nuevo ARN de la diana y se replica mediante la replicasa de Q\beta. Esta última reacción crea una amplificación de 10^{7} veces en aproximadamente 20 minutos. Puede formarse un fondo significativo debido a cantidades minúsculas de ARN de sonda que se conserva de manera no específica durante la reacción.

Puede usarse una reacción que emplea replicasa de Q\beta tal como se describió anteriormente para construir una reacción de selección continua en una realización alternativa.

Por ejemplo, se añade el gen para la replicasa de Q\beta (con regiones en 5' y 3' apropiadas) a una reacción de traducción in vitro y se compartimentaliza. En los compartimentos, se expresa la replicasa e inmediatamente comienza a replicar su propio gen. Sólo los genes que codifican para una replicasa activa se replican a sí mismos. La replicación continúa hasta que se agotan los NTP. Sin embargo, ya que puede hacerse que los NTP difundan a través de la emulsión (véase la descripción de ndk en los ejemplos), la reacción de replicación puede "alimentarse" desde el exterior y continuar durante mucho más tiempo, esencialmente hasta que no hay más espacio dentro de los compartimentos para la replicación adicional. Es posible propagar la reacción adicionalmente mediante la dilución en serie de la mezcla de emulsión en una nueva fase de aceite y el nuevo emulsionamiento tras la adición de una nueva fase acuosa que contiene NTP. Se sabe que la replicasa de Q\beta es muy propensa a errores, de modo que la replicación sola introducirá mucha diversidad al azar (lo que pude ser deseable). Los métodos descritos en el presente documento permiten la evolución de formas más específicas (por ejemplo, dependientes de cebadores) de la replicasa de Q\beta. Como con otras reacciones de replicación (en particular ndk en los ejemplos), puede evolucionarse una gama de enzimas que se alimentan a la reacción.

Otras técnicas de amplificación

Puede aprovecharse tecnología de amplificación alternativa en la presente invención. Por ejemplo, la amplificación por círculo rodante (Lizardi et al., (1998) Nat Genet 19:225) es una tecnología de amplificación disponible comercialmente (RCAT^{TM}) que está dirigida por la ADN polimerasa y puede replicar sondas de oligonucleótidos circulares con cinética o bien lineal o bien geométrica en condiciones isotérmicas.

En presencia de dos cebadores diseñados de manera adecuada, se produce una amplificación geométrica mediante desplazamiento de la cadena de ADN e hiperramificación para generar 10^{12} o más copias de cada círculo en 1 hora.

Si se usa un único cebador, la RCAT genera en unos pocos minutos una cadena lineal de miles de copias de ADN unidas en tándem de una diana unida covalentemente a esa diana.

Una técnica adicional, amplificación por desplazamiento de cadena (SDA; Walker et al., (1992) PNAS (USA) 80:392) comienza con una secuencia definida específicamente, única para una diana específica. Pero a diferencia de otras técnicas que se basan en la ciclación térmica, la SDA es un procedimiento isotérmico que utiliza una serie de cebadores, ADN polimerasa y una enzima de restricción para amplificar exponencialmente la secuencia de ácido nucleico única.

La SDA comprende tanto una fase de generación de la diana como una fase de amplificación exponencial.

En la generación de la diana, se desnaturaliza por calor ADN bicatenario creando dos copias monocatenarias. Se combina una serie de cebadores fabricados de manera especial con ADN polimerasa (cebadores de amplificación para copiar la secuencia de bases y cebadores de tope ("bumper") para desplazar las cadenas recién creadas) para formar dianas alteradas que puedan dar amplificación exponencial.

El procedimiento de amplificación exponencial comienza con las dianas alteradas (cadenas de ADN parcial monocatenario con sitios de reconocimiento de enzimas de restricción) de la fase de generación de la diana.

Se une un cebador de amplificación a cada cadena en su secuencia de ADN complementaria. Entonces, la ADN polimerasa usa el cebador para identificar una ubicación para extender el cebador desde su extremo 3', usando la diana alterada como un molde para añadir nucleótidos individuales. El cebador extendido forma así un segmento de ADN bicatenario que contiene un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción completo en cada extremo.

Entonces se une una enzima de restricción al segmento de ADN bicatenario en su sitio de reconocimiento. La enzima de restricción se disocia del sitio de reconocimiento tras haber escindido sólo una cadena del segmento de doble cara, formando una mella. La ADN polimerasa reconoce la mella y extiende la cadena desde el sitio, desplazando la cadena creada previamente. Por tanto, se mella de manera repetida el sitio de reconocimiento y se restaura mediante la enzima de restricción y la ADN polimerasa con desplazamiento continuo de las cadenas de ADN que contienen el segmento diana.

Entonces, cada cadena desplazada está disponible para hibridar con los cebadores de amplificación como anteriormente. El procedimiento continúa con el mellado, extensión y desplazamiento repetidos de nuevas cadenas de ADN, dando como resultado la amplificación exponencial de la diana de ADN original.

Selección de ARN catalítico

Se han usado métodos conocidos de evolución in vitro para generar moléculas de ARN catalíticamente activas (ribozimas) con una gama diversa de actividades. Sin embargo, éstos han implicado la selección mediante automodificación, que aísla de manera inherente variantes que se basan en catálisis por proximidad y que presentan actividades en trans reducidas.

La compartimentalización proporciona un medio para seleccionar ribozimas que realmente actúan en trans, que pueden dar recambio múltiple, sin la necesidad de anclar el sustrato a la ribozima mediante interacciones de enlace covalente o puentes de hidrógeno (es decir, apareamiento de bases).

En su caso más simple, puede introducirse un gen que codifica para una ribozima en la emulsión y transcribirse inmediatamente tal como se demostró mediante la transcripción y la amplificación por 3SR del ARN que codifica para la Taq polimerasa in situ tal como sigue: en primer lugar, se transcribe el gen de la Taq polimerasa en la emulsión. Se emulsionan 100 \mul de una mezcla de reacción que comprende HEPES-KOH 80 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 24 mM, espermidina 2 mM, DTT 40 mM, rNTP (30 mM), 50 ng de molde de T7-Taq (véase el ejemplo 18. Selección usando replicación de secuencia autosostenida (3SR)), 60 unidades de ARN polimerasa de T7 (USB), 40 unidades de RNAsin (Promega) usando el protocolo convencional. Se incuban las emulsiones a 37ºC durante hasta 6 horas y el análisis de los productos de reacción mediante electroforesis en gel mostró que los niveles de producción de ARN eran comparables a los del control no emulsionado.

Creando una proyección en 5' (por ejemplo, mediante ligación de adaptadores de o bien ADN o bien de ARN) en el gen emulsionado, se seleccionan variantes de ARN con la capacidad de llevar a cabo la adición dirigida por molde de dNTP sucesivos en trans (es decir, actividad polimerasa, véase la figura 6). Pueden rescatarse genes que se han "rellenado" mediante PCR usando cebadores complementarios a la región monocatenaria del gen (es decir, la región que es monocatenaria antes del rellenado con la ribozima) o mediante captura de nucleótidos modificados con biotina (o de otra manera) que se incorporan seguido por PCR. En compartimentos sin actividad de ARN catalítico, esta región sigue siendo monocatenaria, y la PCR no podrá amplificar el molde (alternativamente, no se incorporan nucleótidos y no se captura el molde si no que se elimina por lavado).

También puede usarse un enfoque de acoplamiento para extender adicionalmente la gama de actividades enzimáticas que podrían seleccionarse. Por ejemplo, puede usarse el emulsionamiento conjunto de una ADN polimerasa con el gen descrito anteriormente (proyección en 5') para seleccionar ribozimas que convierten una sustrato de NTP de otro modo inadecuado en uno que puede utilizarse por la polimerasa. Como anteriormente, el gen "rellenado" puede rescatarse entonces mediante PCR. También puede usarse el enfoque anterior para seleccionar una enzima polimerasa proteica producida in situ a partir de un molde similar (es decir, con una proyección en 3'). Se muestra como figura 6 un diagrama de muestra la selección de ARN que tiene actividad catalítica.

Selección de agentes que pueden modificar la actividad replicasa

En otra realización, se usa la descripción para seleccionar un agente que puede modificar la actividad de una replicasa. En esta realización, se genera un conjunto de ácidos nucleicos que comprende miembros que codifican para uno o más genes candidatos. Se compartimentalizan los miembros de la biblioteca de ácidos nucleicos junto con una replicasa (que, tal como se explicó anteriormente, sólo puede actuar sobre el ácido nucleico que codifica para el agente).

Los agentes candidatos pueden ser funcional o químicamente distintos entre sí, o pueden ser variantes de un agente que se sabe o se sospecha que puede modular la actividad replicasa. Se segregan entonces los miembros del conjunto en compartimentos junto con los polipéptidos o polinucleótidos codificados por ellos, de modo que preferiblemente, cada compartimento comprende un único miembro del conjunto junto con su polipéptido codificado relacionado. Cada compartimento también comprende una o más moléculas de la replicasa. Por tanto, el agente polipeptídico codificado puede modular la actividad replicasa, impedir o potenciar la replicación del ácido nucleico compartimentalizado (es decir, el ácido nucleico que codifica para el agente). De esta manera, el agente polipeptídico puede actuar a través de la replicasa para aumentar o disminuir el número de moléculas de su ácido nucleico codificante. En una realización sumamente preferida, el agente puede potenciar la actividad replicasa, para permitir la detección o selección del agente detectando el ácido nucleico codificante.

El agente de modulación puede actuar directa o indirectamente sobre la replicasa. Por ejemplo, el agente de modulación puede ser una enzima que comprende una actividad que actúa sobre la molécula de replicasa, por ejemplo, mediante una modificación postraduccional de la replicasa, para activar o inactivar la replicasa. El agente puede actuar quitando o poniendo un ligando de la molécula de replicasa. Se sabe que muchas replicasas, tales como polimerasas y ligasas, están reguladas por fosforilación, de modo que en realizaciones preferidas, el agente es una cinasa o una fosforilasa. El agente de modulación también puede interaccionar directamente con la replicasa y modificar sus propiedades (por ejemplo, tiorredoxina y ADN polimerasa de T7, miembros del replisoma, por ejemplo abrazadera, helicasa etc. con ADN polimerasa III).

Alternativamente, el agente de modulación puede ejercer sus efectos sobre la replicasa de una manera indirecta. Por ejemplo, la modulación de la actividad replicasa puede tener lugar a través de un tercer cuerpo, tercer cuerpo que se modifica por el agente de modulación, por ejemplo tal como se describió anteriormente.

Además, el agente de modulación puede ser una enzima, que forma parte de una ruta que produce como producto final un sustrato para la replicasa. En esta realización, el agente de modulación está implicado en la síntesis de un producto intermedio (o el producto final) de la ruta. Por consiguiente, la tasa de replicación (y por tanto la cantidad de ácido nucleico que codifica para el agente) depende de la actividad del agente de modulación.

Por ejemplo, el agente de modulación puede ser una cinasa que está implicada en la biosíntesis de bases, desoxirribonucleósidos, desoxirribonucleótidos tales como dAMP, dCMP, dGMP y dTMP, desoxirribonucleósidos difosfato (tales como dADP, dCDP, dCTP y dTDP), desoxirribonucleósidos trifosfato tales como dATP, dCTP, dGTP o dTTP, o nucleósidos, nucleótidos tales como AMP, CMP, GMP y UMP, nucleósidos difosfato (tales como ADP, CDP, CTP y UDP), nucleósidos trifosfato tales como ATP, CTP, GTP o UTP, etc. El agente de modulación puede estar implicado en la síntesis de otros productos intermedios de la biosíntesis de nucleótidos (tal como se describe y se conoce bien a partir de libros de texto de bioquímica tales como Stryer o Lehninger), tales como IMP, ácido 5-fosfo-\alpha-D-ribosa-1-pirofosfórico, 5-fosfo-\beta-D-ribosilamina, 5-fosforribosil-glicinamida, 5-fosforribosil-N-formilglicinamida, etc. Por tanto, el agente puede comprender una enzima tal como ribosa-fosfato pirofosfocinasa, fosforribosilglicinamida sintetasa, etc. Otros ejemplos de tales agentes resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Los métodos de la descripción permiten la selección de tales agentes con actividad catalítica mejorada.

Aún en otra realización, el modulador funciona para "desbloquear" un constituyente del cóctel de replicación (cebadores, dNTP, replicasa, etc.). Un ejemplo de constituyente bloqueado sería un cebador o dNTP con un resto químico unido que inhibe a la replicasa usada en el ciclo de CSR. Alternativamente, el par de cebadores usados podría estar anclado covalentemente mediante un agente de unión, permitiendo la escisión del agente por el modulador que ambos cebadores amplifiquen su gen en presencia de replicasa complementada. Un ejemplo de un agente de unión sería un ácido nucleico peptídico (PNA). Adicionalmente, diseñando un oligonucleótido grande que codifica para un par de secuencias de cebador intercaladas por secuencias de nucleótidos diana, podrían evolucionarse enzimas de restricción específicas del sitio novedosas. Como anteriormente, la tasa de replicación (y por tanto, la cantidad de ácido nucleico que codifica para el agente) depende de la actividad del agente de modulación. Alternativamente, el modulador puede modificar el extremo 5' de un cebador de modo que los productos de amplificación que incorporan el cebador pueden capturarse por un agente adecuado (por ejemplo, un anticuerpo) y por tanto enriquecerse y volverse a amplificar.

En una realización adicional, el alcance de la CSR puede ampliarse adicionalmente para seleccionar agentes que no son necesariamente termoestables. Se compartimentalizan vehículos de inserción (por ejemplo, E. coli) que contienen constructos de expresión que codifican para una forma secretable de un modulador/replicasa de interés. La inclusión de un agente de inducción en la fase acuosa y la incubación a temperatura permisiva (por ejemplo, 37ºC) permiten la expresión y secreción del modulador/replicasa en el compartimento. Entonces se deja tiempo suficiente para que el modulador actúe de cualquiera de las maneras mencionadas anteriormente para facilitar la amplificación posterior del gen que codifica para él (por ejemplo, consume un inhibidor de la replicación). El cambio de temperatura subsiguiente durante el procedimiento de amplificación sirve para librar al compartimento de las actividades enzimáticas de la célula huésped (que se han segregado hasta este punto de la fase acuosa) y liberar el gen codificante para la amplificación.

Por tanto, según una realización de la descripción, se proporciona un método para seleccionar un polipéptido implicado en una ruta que tiene como producto final un sustrato que está implicado en una reacción de replicación ("un polipéptido de la ruta"), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una replicasa; (b) proporcionar un conjunto de ácidos nucleicos que comprenden miembros que codifican cada uno para un polipéptido de la ruta o una variante del polipéptido de la ruta; (c) subdividir el conjunto de ácidos nucleicos en compartimentos, de modo que cada compartimento comprende un miembro de ácido nucleico del conjunto, el polipéptido de la ruta o la variante codificada por el miembro de ácido nucleico, la replicasa y los otros componentes de la ruta; y (d) detectar la amplificación del miembro de ácido nucleico mediante la replicasa.

Los ejemplos (en particular el ejemplo 19 y los ejemplos siguientes) muestran la selección de nucleósido difosfato cinasa (NDP cinasa), que cataliza la transferencia de un grupo fosfato de ATP a un desoxinucleósido difosfato para producir un desoxinucleósido trifosfato.

Aún en otra realización, el agente de modulación es tal que consume un inhibidor de la actividad replicasa. Por ejemplo, se sabe que la heparina es un inhibidor de la actividad replicasa (polimerasa). El método permite la selección de una heparinasa con actividad potenciada, mediante la compartimentalización de una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican para heparinasa o variantes de esta enzima, en presencia de heparina y polimerasa. Las variantes de heparinasa con actividad potenciada pueden degradar la heparina en mayor grado o más rápidamente, eliminando así la inhibición de la actividad replicasa dentro del compartimento y permitiendo la replicación del ácido nucleico dentro del compartimento (es decir, el ácido nucleico que codifica para esa variante de heparinasa).

Selección de polipéptidos de interacción

Los sistemas más importantes para la selección de interacciones proteína-proteína son métodos in vivo, siendo el más importante y mejor desarrollado el sistema de doble híbrido en levaduras (Fields & Song, Nature (1989) 340, 245-246). En este sistema y enfoques relacionados, se generan dos proteínas híbridas: un híbrido cebo que comprende proteína X fusionada con un dominio de unión a ADN y un híbrido presa que comprende proteína Y fusionada con un dominio de activación de la transcripción con interacción relacionada de X e Y que reconstituye el activador transcripcional. Se han propuesto otros dos sistemas in vivo en los que se expresa la cadena de polipéptido de una enzima en dos partes fusionadas con dos proteínas X e Y en los que la interacción X-Y relacionada reconstituye la función de la enzima (Karimova (1998) Proc Natl Acad Sci USA, 95, 5752-6; Pelletier (1999) Nat Biotechnol, 17, 683-690) confiriendo un fenotipo seleccionable en la célula.

Recientemente, se ha mostrado que la Taq polimerasa puede dividirse de una manera similar (Vainshtein et al (1996) Protein Science 5, 1785). Según la invención, por tanto, se proporciona un método de selección de un par de polipéptidos que pueden dar interacción estable dividiendo la Taq polimerasa o cualquier enzima o factor auxiliar para la reacción de la polimerasa.

El método comprende varias etapas. La primera etapa consiste en proporcionar un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico. El primer ácido nucleico codifica para una primera proteína de fusión que comprende un primer subdominio de una enzima replicasa (u otra, véase anteriormente) fusionado con un primer polipéptido, mientras que el segundo ácido nucleico codifica para una segunda proteína de fusión que comprende un segundo subdominio de una enzima replicasa (u otra, véase anteriormente) fusionado con un segundo polipéptido. Las dos proteínas de fusión son tales que la interacción estable del primer y segundo subdominios de replicasa (u otra, véase anteriormente) genera actividad replicasa (o bien directa o bien indirectamente). Al menos uno del primer y segundo ácidos nucleicos (preferiblemente ambos) se proporciona en forma de un conjunto de ácidos nucleicos que codifican para variantes del/de los respectivo(s) primer y/o segundo polipéptido(s).

El conjunto o conjuntos de ácidos nucleicos se subdividen entonces en compartimentos, de modo que cada compartimento comprende un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico junto con proteínas de fusión respectivas codificadas por el primer y el segundo ácidos nucleicos. Entonces se permite que el primer polipéptido se una al segundo polipéptido, de modo que la unión del primer y segundo polipéptidos conduce a la interacción estable de los subdominios de replicasa para generar actividad replicasa. Finalmente, se detecta la amplificación de al menos uno del primer y segundo ácidos nucleicos mediante la replicasa.

Por tanto, la descripción abarca un sistema de selección in vitro mediante el cual la reconstitución de la función replicasa a través de la asociación relacionada de dos ligandos polipeptídicos dirige la amplificación y el ligamiento de los genes de los dos ligandos. Tal sistema de doble híbrido in vitro es particularmente adecuado para la investigación de interacciones proteína-proteína a altas temperaturas, por ejemplo, para la investigación de los protenomas de microorganismos termófilos o la modificación mediante ingeniería genética de interacciones sumamente estables.

El sistema también puede aplicarse a la selección y el aislamiento de compuestos moleculares que promueven interacciones relacionadas. Por ejemplo, pueden unirse químicamente compuestos o bien a cebadores o bien a dNTP y por tanto sólo se incorporarían en amplicones si promueven la asociación. Con el fin de impedir el entrecruzamiento, tales compuestos tendrían que liberarse sólo tras haber tenido lugar la compartimentalización, por ejemplo mediante acoplamiento a microperlas o mediante inclusión en microesferas solubles.

Selecciones de una sola etapa y de múltiples etapas

Es deseable la selección de condiciones de encapsulación adecuadas. Dependiendo de la complejidad y tamaño de la biblioteca que va a seleccionarse, puede ser beneficioso ajustar el procedimiento de encapsulación de modo que 1 o menos de 1 ácido nucleico se encapsule por microcápsula o compartimento. Esto proporcionará el mayor poder de resolución. Sin embargo, cuando la biblioteca es más grande y/o más compleja, esto puede ser imposible de llevar a cabo; puede ser preferible encapsular o compartimentalizar varios ácidos nucleicos juntos y basarse en la aplicación repetida del método de la invención para lograr la clasificación de la actividad deseada. Puede usarse una combinación de procedimientos de encapsulación para obtener el enriquecimiento deseado.

Estudios teóricos indican que cuanto mayor es el número de variantes de ácidos nucleicos creadas, más probable es que se cree una molécula con las propiedades deseadas (véase Perelson y Oster, 1979 J Theor Biol, 81, 64570 para una descripción de cómo se aplica esto a repertorios de anticuerpos). Recientemente, también se ha confirmado prácticamente que los repertorios de anticuerpos en fagos más grandes dan origen, de hecho, a más anticuerpos con mejores afinidades de unión que los repertorios más pequeños (Griffiths et al., (1994) Embo J, 13, 3245-60). Para garantizar que se generan variantes raras y, por tanto, pueden seleccionarse, es deseable una biblioteca grande. Por tanto, es beneficioso el uso de microcápsulas óptimamente pequeñas.

Además de los ácidos nucleicos descritos anteriormente, las microcápsulas o compartimentos según la invención pueden comprender componentes adicionales requeridos para que tenga lugar la reacción de replicación. Otros componentes del sistema pueden comprender, por ejemplo, aquellos necesarios para la transcripción y/o traducción del ácido nucleico. Éstos se seleccionan para los requisitos de un sistema específico de los siguientes: un tampón, un sistema de transcripción/replicación in vitro y/o un sistema de traducción in vitro adecuado que contienen todos los componentes, enzimas y cofactores, ARN polimerasa, nucleótidos, ácidos nucleicos (naturales o sintéticos), ARN de transferencia, ribosomas y aminoácidos necesarios, y los sustratos de la reacción de interés con el fin de permitir la selección del producto génico modificado.

Tampón

Un tampón adecuado será uno en el que todos los componentes deseados del sistema biológico son activos y, por tanto, dependerá de los requisitos de cada sistema de reacción específico. Se conocen en la técnica tampones adecuados para reacciones biológicas y/o químicas y se proporcionan fórmulas en diversos libros de texto de laboratorio (Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York).

Traducción in vitro

La replicasa puede proporcionarse mediante la expresión a partir de un huésped adecuado tal como se describió en otra parte, o puede producirse mediante transcripción/traducción in vitro en un sistema adecuado tal como se conoce en la técnica.

El sistema de traducción in vitro comprenderá normalmente un extracto celular, normalmente de bacterias (Zubay, 1973, Annu Rev Genet, 7, 267-87; Zubay, 1980, Methods Enzymol, 65, 856-77; Lesley et al., 1991 J Biol Chem 266(4), 2632-8; Lesley, 1995 Methods Mol Biol, 37, 265-78.), reticulocitos de conejo (Pelham y Jackson, 1976, Eur J Biochem, 67, 247-56) o germen de trigo (Anderson et al., 1983, Methods Enzymol, 101, 635-44). Muchos sistemas están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Promega) incluyendo algunos que permitirán la transcripción/traducción acopladas (todos los sistemas bacterianos y los sistemas de extractos de reticulocitos y germen de trigo TNT^{TM} de Promega). La mezcla de aminoácidos usada puede incluir, si se desea, aminoácidos sintéticos, para aumentar el posible número o la variedad de proteínas producidas en la biblioteca. Esto puede conseguirse cargando ARNt con aminoácidos artificiales y usando estos ARNt para la traducción in vitro de las proteínas que van a seleccionarse (Ellman et al., 1991, Methods Enzymol, 202, 301-36; Benner, 1994, Trends Biotechnol, 12, 158-63; Mendel et al., 1995, Annu Rev Biophys Biomol Struct, 24, 435-62). Puede ser particularmente deseable el uso de sistemas de traducción in vitro reconstituidos a partir de componentes purificados como el sistema PURE (Shimizu et al (2001) Nat. Biotech., 19, 751).

Tras cada ronda de selección, puede someterse a ensayo el enriquecimiento del conjunto de ácidos nucleicos para aquellos que codifican para las moléculas de interés mediante reacciones de transcripción/traducción acopladas o de transcripción/replicación in vitro no compartimentalizadas. El conjunto seleccionado se clona en un vector de plásmido adecuado y se produce ARN o proteína recombinante a partir de los clones individuales para su purificación y ensayo adicionales.

La descripción se refiere además a un método para producir un producto génico, una vez que se ha seleccionado un ácido nucleico que codifica para el producto génico mediante el método de la invención. Claramente, el propio ácido nucleico puede expresarse directamente mediante medios convencionales para producir el producto génico. Sin embargo, pueden emplearse técnicas alternativas, tal como resultará evidente para los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede incorporarse la información genética incorporada en el producto génico, en un vector de expresión adecuado, y expresarse a partir del mismo.

Compartimentos

Tal como se usa en el presente documento, el término "compartimento" es sinónimo a "microcápsula" y los términos se usan de manera intercambiable. La función del compartimento es permitir la ubicación conjunta del ácido nucleico y el correspondiente polipéptido codificado por el ácido nucleico. Esto se logra preferiblemente mediante la capacidad del compartimento de restringir sustancialmente la difusión las cadenas del producto y el molde hacia otros compartimentos. Por tanto, se restringe cualquier actividad replicasa del polipéptido a que se ejerza sobre un ácido nucleico dentro de los límites de un compartimento, y no otros ácidos nucleicos en otros compartimentos. Otra función de los compartimentos es restringir la difusión de las moléculas generadas en una reacción química o enzimática que alimentan o desbloquean una reacción de replicación.

Por tanto, los compartimentos de la presente invención requieren propiedades físicas apropiadas para permitir el funcionamiento de la invención.

En primer lugar, para garantizar que los ácidos nucleicos y polipéptidos no difundan entre compartimentos, debe aislarse el contenido de cada compartimento del contenido de los compartimentos circundantes, de modo que no hay intercambio de ácidos nucleicos y polipéptidos, o muy poco, entre los compartimentos a lo largo de una escala de tiempo significativa.

En segundo lugar, el método de la presente invención requiere que sólo haya un número limitado de ácidos nucleicos por compartimento, o que todos los miembros dentro de un único compartimento sean clonales (es decir, idénticos). Esto garantiza que se aislará el polipéptido codificado por y correspondiente a un ácido nucleico individual de otros ácidos nucleicos diferentes. Por tanto, el acoplamiento entre un ácido nucleico y su polipéptido correspondiente será sumamente específico. El factor de enriquecimiento es el mayor con una especie clonal de ácido nucleico o menos en promedio por compartimento, siendo el vínculo entre el ácido nucleico y la actividad del polipéptido codificado tan estrecho como sea posible, ya que se aislará el polipéptido codificado por un ácido nucleico individual de los productos de todos los demás ácidos nucleicos. Sin embargo, incluso si no se usa la situación teóricamente óptima de, en promedio, un único ácido nucleico o menos por compartimento, una proporción de 5, 10, 50, 100 ó 1000 o más ácidos nucleicos por compartimento puede demostrar ser beneficiosa en la selección a partir de una biblioteca grande. Rondas posteriores de selección, incluyendo compartimentalización renovada con distribución de ácidos nucleicos diferente, permitirán una selección más rigurosa de los ácidos nucleicos. Preferiblemente, en promedio, hay una única especie clonal de ácido nucleico, o menos, por compartimento.

Además, cada compartimento contiene un ácido nucleico; esto significa que mientras que algunos compartimentos pueden permanecer vacíos, se ajustan las condiciones de modo que, estadísticamente, cada compartimento contendrá al menos uno, y preferiblemente sólo un ácido nucleico.

En tercer lugar, la formación y composición de los compartimentos no debe suprimir la función de la maquinaria para la expresión de los ácidos nucleicos y la actividad de los polipéptidos.

En consecuencia, cualquier sistema de compartimentalización usado debe satisfacer estos tres requisitos. El/los sistema(s) apropiado(s) pueden variar dependiendo de la naturaleza precisa de los requisitos en cada aplicación de la invención, tal como resultará evidente para el experto.

Están disponibles diversas tecnologías para la compartimentalización, por ejemplo, microburbujas de gas (Juaregi y Varley, 1998, Biotechnol Bioeng 59, 471 y nanopocillos prefabricados (Huang y Schreiber, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 94, 25). Para diferentes aplicaciones, pueden ser deseables diferentes tamaños de compartimento y químicas de superficie, tal como se trata con más detalle a continuación. Por ejemplo, puede ser suficiente utilizar materiales porosos que limitan la difusión como geles o alginato (Draget et al., 1997, Int J Macromol 21, 47) o materiales de tipo zeolita. Además, cuando se lleva a cabo PCR in situ o PCR en células, las células pueden tratarse con un fijador reticulante para formar compartimentos porosos que permiten la difusión de dNTP, enzimas y cebadores.

Está disponible una amplia variedad de procedimientos de compartimentalización o microencapsulación (Benita, S., Ed. (1996). Microencapsulation: methods and industrial applications. Drugs and pharmaceutical sciences. Editado por Swarbrick, J. Nueva York: Marcel Dekker) y pueden usarse para crear los compartimentos usados según la presente invención. De hecho, se han identificado más de 200 métodos de microencapsulación o compartimentalización en la bibliografía (Finch, C. A. (1993) Encapsulation and controlled release. Spec. Publ. -R. Soc. Chem. 138, 35).

Éstos incluyen vesículas acuosas envueltas con membrana tales como vesículas lipídicas (liposomas) (New, R. R. C., Ed. (1990). Liposomes: a practical approach. The practical appraoch series. Editado por Rickwood, D. & Hames, B. D. Oxford: Oxford University Press) y vesículas de tensioactivo no iónico (van Hal, D. A., Bouwstra, J. A. & Junginger, H. E. (1996). Nonionic surfactant vesicles containing estradiol for topical application. En Microencapsulation: methods and industrial applications (Benita, S., ed.), págs. 329-347. Marcel Dekker, Nueva York.). Éstas son cápsulas membranosas cerradas de una única o múltiples bicapas de moléculas ensambladas de manera no covalente, estando separada cada bicapa de la adyacente por un compartimento acuoso. En el caso de liposomas, la membrana está compuesta de moléculas lipídicas; estas son normalmente fosfolípidos pero también pueden incorporarse esteroles tales como colesterol en las membranas (New, R. R. C., Ed. (1990). Liposomes: a practical approach. The practical appraoch series. Editado por Rickwood, D. & Hames, B. D. Oxford: Oxford University Press). Puede realizarse dentro de los liposomas una variedad de reacciones bioquímicas catalizadas por enzimas, incluyendo la polimerización de ARN y ADN (Chakrabarti J Mol Evol. (1994), 39, 555-9; Oberholzer Biochem Biophys Res Commun. (1995), 207, 250-7; Oberholzer Chem Biol. (1995) 2, 677-82.; Walde, Biotechnol Bioeng (1998), 57, 216-219; Wick & Luisi, Chem Biol. (1996), 3, 277-85).

Con un sistema de vesículas envueltas con membrana, gran parte de la fase acuosa está fuera de las vesículas y por tanto no está compartimentalizada. Esta fase acuosa, continua debe eliminarse o deben inhibirse o destruirse los sistemas biológicos en él (por ejemplo, mediante digestión de ácidos nucleicos con ADNasa o ARNasa) con el fin de que las reacciones se limiten a las microcápsulas compartimentalizadas (Luisi et al., Methods Enzymol. 1987, 136, 188-216).

También se han demostrado reacciones bioquímicas catalizadas por enzimas en compartimentos de microcápsulas generados mediante una variedad de otros métodos. Muchas enzimas son activas en disoluciones micelares inversas (Bru & Walde, Eur J Biochem. 1991, 199, 95-103.; Bru & Walde, Biochem Mol Biol Int. 1993, 31, 685-92; Creagh et al., Enzyme Microb Technol. 1993, 15, 383-92; Haber et al., 1993 NO PUEDE ENCONTRARSE; Kumar et al., Biophys J 1989, 55, 789-792; Luisi, P. L. & B., S.-H. (1987). Activity and conformation of enzymes in reverse micellar solutions. Methods Enzymol 136(188), 188-216; Mao & Walde, Biochem Biophys Res Commun 1991, 178, 1105-1112; Mao, Q. & Walde, P. (1991). Substrate effects on the enzymatic activity of alpha-chymotrypsin in reverse micelles. Biochem Biophys Res Commun 178(3), 1105-12; Mao Eur J Biochem. 1992, 208, 165-70; Perez, G. M., Sanchez, F. A. & Garcia, C. F. (1992). Application of active-phase plot to the kinetic analysis of lipoxygenase in reverse micelles. Biochem J.; Walde, P., Goto, A., Monnard, P.-A., Wessicken, M. & Luisi, P. L. (1994) Oparin's reactions revisited: enzymatic synthesis of poly(adenylic acid) in micelles and self-reproducing vesicles. J. Am. Chem. Soc. 116, 7541-7547; Walde, P., Han, D. & Luisi, P. L. (1993). Spectroscopic and kinetic studies of lipases solubilized in reverse micelles. Biochemistry 32, 4029-34; Walde Eur J Biochem. 1988 173, 401-9) tal como el sistema AOT-isooctano-agua (Menger, F. M. & Yamada, K. (1979). J. Am. Chem. Soc. 101, 6731-6734).

También pueden generarse compartimentos mediante polimerización interfacial y complejación interfacial (Whateley, T. L. (1996) Microcapsules: preparation by interfacial polymerisation and interfacial complexation and their applications. En Microencapsulation: methods and industrial applications (Benita, S., ed.), págs. 349-375. Marcel Dekker, Nueva York). Los compartimentos de microcápsulas de esta clase pueden tener membranas rígidas, no permeables, o membranas semipermeables. Las microcápsulas semipermeables rodeadas por membranas de nitrato de celulosa, membranas de poliamida y membranas de lípido-poliamida pueden soportar todas reacciones bioquímicas, incluyendo sistemas multienzimáticos (Chang, Methods Enzymol. 1987, 136, 67-82; Chang, Artif Organs. 1992, 16, 71-4; Lim Appl Biochem Biotechnol. 1984, 10:81-5). También se ha probado que los compartimentos de alginato/polilisina (Lim & Sun, Science (1980) 210, 908-10), que pueden formarse en condiciones muy suaves, son muy biocompatibles, proporcionando, por ejemplo, un método eficaz de encapsulación de células y tejidos vivos (Chang, Artif Organs. (1992) 16, 71-4; Sun ASAIO J. (1992), 38, 125-7).

También pueden usarse sistemas de compartimentalización no membranosos basados en el reparto de fases de un entorno acuoso en un sistema coloidal, tal como una emulsión.

Los compartimentos de la presente invención, y preferiblemente los de la presente descripción, se forman a partir de emulsiones; sistemas heterogéneos de dos fases líquidas inmiscibles con una de las fases dispersa en la otra como gotas de tamaño microscópico o coloidal (Becher, P. (1957) Emulsions: theory and practice. Reinhold, Nueva York; Sherman, P. (1968) Emulsion science. Academic Press, Londres; Lissant, K.J., ed Emulsions and emulsion technology. Surfactant Science Nueva York: Marcel Dekker, 1974; Lissant, K.J., ed. Emulsions and emulsion technology. Surfactant Science Nueva York: Marcel Dekker, 1984).

Pueden producirse emulsiones a partir de cualquier combinación adecuada de líquidos inmiscibles. Preferiblemente, la emulsión de la presente invención tiene agua (que contiene los componentes bioquímicos) como la fase presente en forma de gotas finamente divididas (la fase dispersa, interna o discontinua) y un líquido hidrófobo, inmiscible (un "aceite") como la matriz en la que estas gotas se suspenden (la fase no dispersa, continua o externa). Tales emulsiones se denominan "agua en aceite" (W/O). Esto tiene la ventaja de que la fase acuosa completa que contiene los componentes bioquímicos está compartimentalizada en gotas diferenciadas (la fase interna). La fase externa, que es un aceite hidrófobo, no contiene generalmente ninguno de los componentes bioquímicos y por tanto es inerte.

La emulsión puede estabilizarse mediante la adición de uno o más agentes de superficie activa (tensioactivos). Estos tensioactivos se denominan agentes emulsionantes y actúan en la interfase agua/aceite para impedir (o al menos retrasar) la separación de las fases. Pueden usarse muchos aceites y muchos emulsionantes para la generación de emulsiones de agua en aceite; una recopilación reciente enumeró por encima de 16.000 tensioactivos, muchos de los cuales se usan como agentes emulsionantes (Ash, M. y Ash, I. (1993) Handbook of industrial surfactants. Gower, Aldershot). Los aceites adecuados incluyen aceite mineral blanco ligero y tensioactivos no iónicos (Schick, 1966 no encontrado) tales como monooleato de sorbitano (Span^{TM} 80; ICI) y monooleato de polioxietilensorbitano (Tween^{TM} 80; ICI) o t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100).

El uso de tensioactivos aniónicos también puede ser beneficioso. Los tensioactivos adecuados incluyen colato de sodio y taurocolato de sodio. Se prefiere particularmente el desoxicolato de sodio, preferiblemente a una concentración del 0,5% p/v, o inferior. La inclusión de tales tensioactivos puede aumentar en algunos casos la expresión de los ácidos nucleicos y/o la actividad de los polipéptidos. La adición de algunos tensioactivos aniónicos a una mezcla de reacción no emulsionada suprime completamente la traducción. Sin embargo, durante el emulsionamiento, el tensioactivo se transfiere de la fase acuosa a la interfase y se restaura la actividad. La adición de un tensioactivo aniónico a las mezclas que van a emulsionarse garantiza que las reacciones se realizan sólo tras la compartimentalización.

La creación de una emulsión requiere generalmente la aplicación de energía mecánica para forzar las fases entre sí. Existe una variedad de formas de realizar esto que utilizan una variedad de dispositivos mecánicos, incluyendo agitadores (tales como barras agitadoras magnéticas, agitadores de hélice y turbina, dispositivos de paletas y batidoras), homogeneizadores (incluyendo homogeneizadores de rotor-estator, homogeneizadores de válvula de alta presión y homogeneizadores a chorro), molinos coloidales, dispositivos de ultrasonidos y de "emulsionamiento de membrana" (Becher, P. (1957) Emulsions: theory and practice. Reinhold, Nueva York; Dickinson, E. (1994) En Wedlock, D.J. (ed.), Emulsions and droplet size control. Butterworth-Heine-mann, Oxford, Vol. págs. 191-257).

Los compartimentos acuosos formados en emulsiones de agua en aceite son generalmente estables con poco intercambio, si hay alguno, de polipéptidos o ácidos nucleicos entre compartimentos. Adicionalmente, se sabe que varias reacciones bioquímicas se realizan en compartimentos de emulsión. Además, los procesos bioquímicos complicados, en particular la transcripción y la traducción génicas, también son activos en las microcápsulas de emulsión. Existe la tecnología para crear emulsiones con volúmenes hasta llegar a escalas industriales de miles de litros (Becher, P. (1957) Emulsions: theory and practice. Reinhold, Nueva York; Sherman, P. (1968) Emulsion science. Academic Press, Londres; Lissant, K.J., ed Emulsions and emulsion technology. Surfactant Science Nueva York: Marcel Dekker, 1974; Lissant, K.J., ed. Emulsions and emulsion technology. Surfactant Science Nueva York: Marcel Dekker, 1984).

El tamaño de compartimento preferido variará dependiendo de los requisitos precisos de cualquier procedimiento de selección individual que vaya a realizarse. En todos los casos, habrá un equilibrio óptimo entre el tamaño de la biblioteca génica, el enriquecimiento requerido y la concentración requerida de los componentes en los compartimentos individuales para lograr una expresión y reactividad eficaces de los polipéptidos.

Los procedimientos de expresión pueden producirse o bien in situ dentro de cada microcápsula individual o bien de manera exógena dentro de células (por ejemplo, bacterias) u otras formas adecuadas de subcompartimentalización. Tanto la transcripción in vitro como la transcripción-traducción acopladas se hacen menos eficaces a concentraciones de ADN subnanomolares. Debido al requisito de que esté presente sólo un número limitado de moléculas de ADN en cada compartimento, esto establece por tanto un límite superior práctico sobre el tamaño de compartimento posible en el que se usa la transcripción in vitro. Preferiblemente, para la expresión in situ usando la transcripción y/o la traducción in vitro, el volumen medio de los compartimentos es inferior a 5,2 x 10^{-16} m^{3}, (que corresponde a un compartimento esférico de diámetro inferior a 1 \mum).

Una alternativa es la separación de expresión y compartimentalización, por ejemplo usando un huésped celular. Para la inclusión de células (en particular células eucariotas), pueden preferirse diámetros medios de compartimento superiores a 10 \muM.

Tal como se muestra en los ejemplos, para ubicar conjuntamente el gen de la polimerasa y la proteína codificada dentro del mismo compartimento de emulsión, se usaron bacterias (E. coli) que sobreexpresaban la Taq polimerasa como "vehículos de suministro". Las células de E. coli (diámetro de 1-5 \muM) se ajustan fácilmente a los compartimentos de emulsión mientras dejan espacio para cantidades suficientes de reactivos de PCR como nucleótidos trifosfato y cebadores (tal como se muestra en la figura 2). La etapa de desnaturalización del primer ciclo de PCR rompe la célula bacteriana y libera la polimerasa expresada y su gen codificante en el compartimento permitiendo que se realice la autorreplicación mientras que se destruyen simultáneamente las actividades enzimáticas bacterianas de fondo. Además, por analogía con las estrategias de arranque en caliente, esta "subcompartimentalización" celular impide la liberación de la actividad polimerasa a temperaturas ambiente y los productos de amplificación no específicos resultantes.

La concentración de ADN o ARN eficaz en los compartimentos puede aumentarse artificialmente mediante diversos métodos que serán bien conocidos para los expertos en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, la adición de productos químicos de exclusión por volumen tales como polietilenglicoles (PEG) y una variedad de técnicas de amplificación génica, incluyendo la transcripción usando ARN polimerasas incluyendo aquellas de bacterias tales como E. coli (Roberts, 1969 Nature 224, 1168-74; Blattner y Dahlberg, 1972 Nat New Biol. 237, 227-32; Roberts et al., 1975 J Biol Chem. 250, 5530-41; Rosenberg et al., 1975 J Biol Chem 250, 4755-4764), eucariotas por ejemplo (Weil et al., 1979 J Biol Chem. 254, 6163-6173; Manley et al., 1983 Methods Enzymol. 101, 568-82) y bacteriófagos tales como T7, T3 y SP6 (Melton et al., 1984 Nucleic Acids Res. 12, 7035-56.); la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki et al., 1988 Science 239, 487-91); la amplificación con replicasa Q\beta (Miele et al., 1983 J Mol Biol. 171, 281-95; Cahill et al., 1991 Clin Chem. 37, 1482-5; Chetverin y Spirin, 1995 Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 51, 225-70; Katanaev et al., 1995 FEBS Lett., 359, 89-92); la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Landegren et al., 1988 Science, 241; 1077-80; Barany, 1991 PCR Methods Appl., 1, 5-16); y el sistema de replicación de secuencia autosostenida (Fahy et al., 1991 PCR Methods Appl. 1, 25-33) y la amplificación por desplazamiento de la cadena (Walker et al., 1992 Nucleic Acids Res. 20, 1691-6). También pueden usarse técnicas de amplificación génica que requieren una ciclación térmica tales como PCR y LCR, si las emulsiones y los sistemas de transcripción o de transcripción-traducción acopladas in vitro son termoestables (por ejemplo, los sistemas de transcripción-traducción acopladas podrían prepararse a partir de un microorganismo termoestable tal como Thermus aquaticus).

El aumento de la concentración de ácido nucleico local eficaz permite que se usen eficazmente compartimentos más grandes.

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El tamaño de compartimento debe ser lo suficientemente grande para acomodar todos los componentes requeridos de las reacciones biológicas que se necesitan producir dentro del compartimento. Por ejemplo, in vitro, tanto las reacciones de transcripción como las reacciones de transcripción-traducción acopladas requieren una concentración de nucleósido trifosfato total de aproximadamente 2 mM.

Por ejemplo, con el fin de transcribir un gen en una única molécula de ARN corto de 500 bases de longitud, esto requeriría un mínimo de 500 moléculas de nucleósido trifosfato por compartimento (8,33 x 10^{-22} moles). Con el fin de constituir una disolución 2 mM, este número de moléculas debe estar contenido dentro de un compartimento de un volumen de 4,17 x 10^{-19} litros (4,17 x 10^{-22} m^{3} que si fuera esférico tendría un diámetro de 93 nm. Por tanto, el límite inferior preferido para las microcápsulas es un diámetro de aproximadamente 0,1 \mum (100 nm).

Cuando se usan huéspedes de expresión como vehículos de suministro, existen requisitos mucho menos estrictos sobre el tamaño de compartimento. Básicamente, el compartimento debe ser de tamaño suficiente para contener el huésped de expresión así como cantidades suficientes de reactivos para llevar a cabo las reacciones requeridas. Por tanto, en tales casos se prefieren tamaños de compartimento mayores > 10 \muM. Mediante una elección apropiada del vector usado para la expresión en el huésped, la concentración de molde dentro de los compartimentos puede controlarse por medio del origen del vector y el número de copias resultante (por ejemplo, E. coli: colE (pUC) >100, p15: 30-50, pSC101: 1-4). Asimismo, la concentración del producto génico puede controlarse por la cantidad mediante la elección del promotor de expresión y el protocolo de expresión (por ejemplo, la inducción total de la expresión frente al escape del promotor). Preferiblemente, la concentración del producto génico es tan alta como sea posible.

Además, el uso de compartimentos de alimentador permite la alimentación de sustratos desde el exterior (véase Ghadessy et al. (2001), PNAS, 98, 4552; 01). La alimentación de las reacciones en emulsión desde el exterior puede permitir dimensiones de compartimento <0,1 \muM para las selecciones de ribozimas, ya que los reactivos no necesitan estar contenidos en su totalidad dentro del compartimento.

El tamaño de las microcápsulas o compartimentos de emulsión puede variarse simplemente adaptando las condiciones de emulsión usadas para formar la emulsión según los requisitos del sistema de selección. Cuanto mayor es el tamaño de compartimento, mayor es el volumen que se requerirá para encapsular una biblioteca de ácido nucleico dada, ya que el factor finalmente limitativo será el tamaño del compartimento y por tanto el número de compartimentos de microcápsula posibles por volumen unitario.

El tamaño de los compartimentos se selecciona no solo con respecto a los requisitos del sistema de replicación, sino también a los del sistema de selección empleado para el ácido nucleico. Por tanto, los componentes del sistema de selección, tal como un sistema de modificación química, pueden requerir volúmenes de reacción y/o concentraciones de reactivo que no son óptimos para la replicación. Tal como se expone en el presente documento, tales requisitos pueden acomodarse mediante una etapa de reencapsulación secundaria; además, pueden acomodarse seleccionando el tamaño de compartimento con el fin de maximizar la replicación y selección como un todo. Se prefiere la determinación empírica del volumen de compartimento y concentración de reactivo óptimos, por ejemplo, tal como se expone en el presente documento.

En la presente invención y en una realización sumamente preferida de la presente descripción, la emulsión es una emulsión de agua en aceite. La emulsión de agua en aceite se prepara añadiendo una fase acuosa gota a gota a una fase de aceite en presencia de un tensioactivo que comprende Span 80 al 4,5% (v/v), Tween 80 aproximadamente al 0,4% (v/v) y Triton X100 aproximadamente al 0,05-0,1% (v/v) en aceite mineral, preferiblemente a una razón de fases de aceite:agua de 2:1 ó 3:1. Parece que la razón de los tres tensioactivos es importante para las propiedades ventajosas de la emulsión, y por consiguiente, la invención también abarca una emulsión de agua en aceite que tiene cantidades aumentadas de tensioactivo pero con la misma razón de Span 80, Tween 80 y Triton X100, de manera sustancial. En una realización preferida, el tensioactivo comprende Span 80 al 4,5% (v/v), Tween 80 al 0,4% (v/v) y Triton X100 al 0,05% (v/v).

La emulsión de agua en aceite se forma preferiblemente en agitación constante en viales de biocongelación de fondo redondo de 2 ml con agitación continuada a 1000 rpm durante 4 ó 5 minutos adicionales tras la adición completa de la fase acuosa. La tasa de adición puede ser de hasta 12 gotas/min. (aproximadamente de 10 \mul cada una). La fase acuosa puede incluir tan sólo agua, o puede comprender una disolución tamponada que tiene componentes adicionales tales como ácidos nucleicos, nucleótidos trifosfato, etc. En una realización preferida, la fase acuosa comprende una mezcla de reacción de PCR tal como se dio a conocer en otra parte en este documento, así como ácido nucleico y polimerasa. La emulsión de agua en aceite puede formarse a partir de 200 \mul de fase acuosa (por ejemplo, mezcla de reacción de PCR) y 400 \mul de fase de aceite tal como se describió anteriormente.

La emulsión de agua en aceite según la invención tiene propiedades ventajosas de estabilidad térmica aumentada. Por tanto, no se observa cambios en el tamaño de compartimento o pruebas de coalescencia tras 20 ciclos de PCR tal como se evalúa mediante difracción láser y microscopía óptica. Esto se muestra en la figura 2. Además, la reacción en cadena de la polimerasa se realizó de manera eficaz dentro de los compartimentos de esta composición de agua en aceite, para aproximarse a las tasas observadas en la PCR en disolución. Las dimensiones promedio del compartimento acuoso en la emulsión de agua en aceite según la invención son en promedio de 15 \mum de tamaño. Una vez formados, los compartimentos de la emulsión según la invención no permiten el intercambio de macromoléculas de tipo ADN y proteínas en ningún grado significativo (tal como se muestra en la figura 3A). Esto es de suponer porque el gran peso molecular y la naturaleza cargada de las macromoléculas impiden la difusión a través del revestimiento de tensioactivo hidrófobo, incluso a temperaturas elevadas.

Ácidos nucleicos

Un ácido nucleico según la presente invención y la presente descripción es tal como se describió anteriormente. Preferiblemente, el ácido nucleico es una molécula o constructo seleccionado del grupo que consiste en una molécula de ADN, una molécula de ARN, una molécula de ácido nucleico parcial o completamente artificial que consiste exclusivamente en bases sintéticas o una mezcla de fases sintéticas y que se producen de manera natural, una cualquiera de las anteriores ligada a un polipéptido, y una cualquiera de las anteriores ligada a otro cualquier grupo o constructo molecular. De manera ventajosa, el otro grupo o constructo molecular puede seleccionarse del grupo que consiste en ácidos nucleicos, sustancias poliméricas, particularmente perlas, por ejemplo perlas de poliestireno, sustancias magnéticas tales como perlas magnéticas, marcadores, tales como fluoróforos o marcadores isotópicos, reactivos químicos, agentes de unión tales como macrociclos y similares.

El ácido nucleico puede comprender secuencias reguladoras adecuadas, tales como las requeridas para la expresión eficaz del producto génico, por ejemplo promotores, potenciadores, secuencias de iniciación traduccional, secuencias de poliadenilación, sitios de corte y empalme y similares.

Los términos "aislar", "clasificar" y "seleccionar", así como variaciones de los mismos, se usan en el presente documento. El aislamiento, según la presente invención, se refiere al procedimiento de separación de una entidad de una población heterogénea, por ejemplo una mezcla, de modo que esté libre de al menos una sustancia con la que está asociada antes del procedimiento de aislamiento. En una realización preferida, el aislamiento se refiere a la purificación de una entidad esencialmente hasta la homogeneidad. La clasificación de una entidad se refiere al procedimiento de aislamiento preferentemente de entidades deseadas respecto a entidades no deseadas. En cuanto que esto se refiera al aislamiento de las entidades deseadas, los términos "aislar" y "clasificar" son equivalentes. El método de la presente invención permite la clasificación de ácidos nucleicos deseados a partir de conjuntos (bibliotecas o repertorios) de ácidos nucleicos que contienen el ácido nucleico deseado. Se usa la selección para referirse al procedimiento (incluyendo el procedimiento de clasificación) de aislamiento de una entidad según una propiedad particular de la misma.

"Oligonucleótido" se refiere a una molécula compuesta por dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, preferiblemente más de tres. El tamaño exacto del oligonucleótido dependerá de la última función o uso del oligonucleótido. El oligonucleótido puede derivarse de manera sintética o mediante clonación.

Los ácidos nucleicos seleccionados según la descripción pueden manipularse adicionalmente. Por ejemplo, se incorporan en un vector el ácido nucleico que codifica para la replicasa seleccionada o polipéptidos de interacción y se introduce en células huésped adecuadas para producir líneas celulares transformadas que expresan el producto génico. Entonces, pueden propagarse las líneas celulares resultantes para el análisis cualitativo y/o cuantitativo reproducible del/de los efecto(s) de posibles fármacos que afectan a la función del producto génico. Por tanto, pueden emplearse las células que expresan el producto génico para la identificación de compuestos, particularmente compuestos de peso molecular pequeño, que modulan la función del producto génico. Por tanto, las células huésped que expresan el producto génico son útiles para la selección del fármaco y es un objeto adicional de la presente descripción proporcionar un método para identificar compuestos que modulan la actividad del producto génico, comprendiendo dicho método exponer células que contienen ADN heterólogo que codifica para el producto génico, en el que dichas células producen el producto génico funcional, a al menos un compuesto o mezcla de compuestos o señal cuya capacidad para modular la actividad de dicho producto génico intenta determinarse y después de eso monitorizar dichas células para detectar cambios provocados por dicha modulación. Un ensayo de este tipo permite la identificación de moduladores, tales como agonistas, antagonistas y moduladores alostéricos del producto génico. Tal como se usa en el presente documento, un compuesto o señal que modula la actividad del producto génico se refiere a un compuesto que altera la actividad del producto génico de tal manera que la actividad del producto génico es diferente en presencia del compuesto o señal (en comparación con la ausencia de dicho compuesto o señal).

Pueden diseñarse ensayos de selección basados en células construyendo líneas celulares en las que la expresión de una proteína indicadora, es decir, una proteína que puede someterse a ensayo fácilmente, tal como \beta galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) o luciferasa, es dependiente del producto génico. Un ensayo de este tipo permite la detección de compuestos que modulan directamente la función del producto génico, tales como compuestos que antagonizan el producto génico, o compuestos que inhiben o potencian otras funciones celulares requeridas para la actividad del producto génico.

La presente descripción proporciona también un método para afectar de manera exógena a procesos dependientes del producto génico que se producen en células. Pueden ponerse en contacto las células huésped que producen el producto génico recombinante, por ejemplo células de mamíferos, con un compuesto de prueba, y entonces puede evaluarse el/los efecto(s) modulador(es) del mismo comparando la respuesta mediada por el producto génico en presencia y ausencia del compuesto de prueba, o relacionando la respuesta mediada por el producto génico de las células de prueba, o las células control (es decir, células que no expresan el producto génico), con la presencia del compuesto.

Bibliotecas de ácido nucleico

El método de la presente descripción es útil para clasificar bibliotecas de ácidos nucleicos. En el presente documento, los términos "biblioteca", "repertorio" y "conjunto" se usan según su significado ordinario en la técnica, tal como una biblioteca de ácidos nucleicos que codifica para un repertorio de productos génicos. En general, las bibliotecas se construyen a partir de conjuntos de ácidos nucleicos y tienen propiedades que facilitan la clasificación. La selección inicial de un ácido nucleico a partir de una biblioteca de ácidos nucleicos usando la presente invención requerirá en la mayoría de los casos el examen de un gran número de ácidos nucleicos variantes. Pueden crearse bibliotecas de ácidos nucleicos en una variedad de formas diferentes, incluyendo las siguientes.

Pueden clonarse conjuntos de ácidos nucleicos que se producen de manera natural a partir de ADN genómico o ADNc (Sambrook et al., 1989 Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York.); por ejemplo, las bibliotecas de anticuerpos en fago, preparadas mediante repertorios de amplificación por PCR de genes de anticuerpos de donantes inmunizados o no inmunizados han probado ser fuentes muy eficaces de fragmentos de anticuerpos funcionales (Winter et al., 1994 Annu Rev Immunol, 12, 433-55.; Hoogenboom, H. R. (1997) Trends Biotechnol., 15, 62-70). El diseño y la optimización de estrategias de selección de bibliotecas para generar anticuerpos de alta afinidad. Trends Biotechnol. 15, 62-70; Hoogenboom, H.R. (1997) Trends Biotechnol., 15, 62-70). También pueden prepararse bibliotecas de genes codificando todos (véase por ejemplo Smith, G.P. (1985) Science, 228, 1315-7; Parmley, S.F. y Smith, G.P. (1988) Gene, 73, 305-18) o parte de los genes (véase por ejemplo Lowman et al., (1991) Biochemistry, 30, 10832-8) o conjuntos de genes (véase por ejemplo Nissim, A., Hoogenboom et al., (1994) Embo J, 13, 692-8) mediante un oligonucleótido sintético aleatorizado o dopado. También pueden prepararse bibliotecas introduciendo mutaciones en un ácido nucleico o conjunto de ácidos nucleicos "al azar" mediante una variedad de técnicas in vivo, incluyendo; el uso de "cepas mutágenas" de bacterias tales como E. coli mutD5 (Liao et al., (1986) Proc Natl Acad Sci USA, 83, 576-80; Yamagishi et al., (1990) Protein Eng, 3, 713-9; Low et al., (1996), J Mol Biol, 260, 359-68); el uso del sistema de hipermutación de anticuerpos de linfocitos B (Yelamos et al., (1995), Nature, 376, 225-9). También pueden introducirse mutaciones al azar tanto in vivo como in vitro mediante mutágenos químicos e ionización o irradiación UV (véase Friedberg et al., 1995, DNA repair and mutagenesis. ASM Press, Washington D.C), o incorporación de análogos de base mutagénicos (Freese, 1959, J. Mol. Biol., 1, 87; Zaccolo et al., (1996), J Mol Biol, 255, 589-603). También pueden introducirse mutaciones "al azar" en genes in vitro durante la polimerización por ejemplo usando polimerasas propensas a errores (Leung et al., (1989), Technique, 1, 11-15).

Puede introducirse una diversificación adicional usando recombinación homóloga o bien in vivo (Kowalczykowski et al., (1994) Microbiol Rev, 58, 401-65 o bien in vitro (Stemmer, (1994), Nature, 370, 389-9.; Stemmer, (1994) Proc Natl Acad Sci USA, 91, 10747-51).

Agente

Tal como se usa en el presente documento, el término "agente" incluye pero no se limita a un átomo o molécula, en el que una molécula puede ser inorgánica u orgánica, una molécula efectora biológica y/o un ácido nucleico que codifica para un agente tal como una molécula efectora biológica, una proteína, un polipéptido, un péptido, un ácido nucleico, un ácido nucleico peptídico (PNA), un virus, una partícula similar a virus, un nucleótido, un ribonucleótido, una análogo sintético de un nucleótido, un análogo sintético de un ribonucleótido, un nucleótido modificado, un ribonucleótido modificado, un aminoácido, un análogo de aminoácido, un aminoácido modificado, un análogo de aminoácido modificado, un esteroide, un proteoglicano, un lípido, un ácido graso y un hidrato de carbono. Un agente puede estar en disolución o en suspensión (por ejemplo, en forma cristalina, coloidal o cualquier otra forma). El agente puede estar en forma de un monómero, dímero, oligómero, etc., o de otra forma en un complejo.

Polipéptido

Tal como se usa en el presente documento, los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se refieren a un polímero en el que los monómeros son aminoácidos y se unen entre sí a través de enlaces peptídicos o disulfuro. "Polipéptido" se refiere o bien a una cadena de aminoácidos que se producen de manera natural de longitud completa o bien a un "fragmento de la misma" o "péptido", tal como una región seleccionada del polipéptido que se une a otra proteína, péptido o polipéptido de una manera modulable mediante un ligando, o a un polímero de aminoácidos, o un fragmento o péptido del mismo, que es parcial o completamente no natural. Por tanto, "fragmento de la misma" se refiere a una secuencia de aminoácidos que es una porción de un polipéptido de longitud completa, de entre aproximadamente 8 y aproximadamente 500 aminoácidos de longitud, preferiblemente de aproximadamente 8 a aproximadamente 300, más preferiblemente de aproximadamente 8 a aproximadamente 200 aminoácidos e incluso más preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 ó 100 aminoácidos de longitud. "Péptido" se refiere a una secuencia de aminoácidos corta que tiene 10-40 aminoácidos de longitud, preferiblemente 10-35 aminoácidos. Adicionalmente, pueden incluirse aminoácidos no naturales, por ejemplo, \beta-alanina, fenilglicina y homoarginina. También pueden usarse en la presente invención aminoácidos comúnmente encontrados, que no están codificados por genes. Todos los aminoácidos usados en la presente invención pueden ser o bien el isómero óptico D o bien el L. Se prefieren los isómeros L. Además, también son útiles otros peptidomiméticos, por ejemplo en secuencias de ligador de polipéptidos de la presente invención (véase Spatola, (1983), en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Weinstein, ed., Marcel Dekker, Nueva York, p. 267). Una "molécula de unión a polipéptido" es una molécula, preferiblemente un polipéptido, proteína o péptido, que tiene la capacidad de unirse a otro polipéptido, proteína o péptido. Preferiblemente, esta capacidad de unión puede modularse mediante un ligando.

El término "sintético", tal como se usa en el presente documento, significa que el proceso o sustancia descritos no se producen de manera ordinaria en la naturaleza. Preferiblemente, una sustancia sintética se define como una sustancia que se produce mediante síntesis o manipulación in vitro.

El término "molécula" se usa en el presente documento para referirse a cualquier átomo, ión, molécula, macromolécula (por ejemplo, polipéptido) o combinación de tales entidades. El termino "ligando" puede usarse de manera intercambiable con el término "molécula". Las moléculas según la invención pueden estar libres en disolución, o pueden estar parcial o totalmente inmovilizadas. Pueden estar presentes como entidades diferenciadas, o pueden complejarse con otras moléculas. Preferiblemente, las moléculas según la invención incluyen polipéptidos que se presentan en la superficie de partículas de bacteriófagos. Más preferiblemente, las moléculas según la invención incluyen bibliotecas de polipéptidos que se presentan como partes esenciales de las proteínas de la envuelta en la superficie externa de partículas de bacteriófagos. Se conocen en la técnica métodos para la producción de bibliotecas que codifican para polipéptidos aleatorizados y pueden aplicarse en la presente invención. La aleatorización puede ser total o parcial; en el caso de aleatorización parcial, los codones seleccionados codifican preferiblemente para opciones de aminoácidos y no de codones de parada.

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de plásmidos de expresión de la Taq polimerasa

Se amplifica el marco de lectura abierto de la Taq polimerasa mediante PCR a partir de ADN genómico de Thermus aquaticus usando los cebadores 1 y 2, se corta con XbaI y SalI y se liga en pASK75 (Skerra A. 1994, Gene 151, 131)) cortado con XbaI y SalI. pASK75 es un vector de expresión que dirige la síntesis de proteínas extrañas en E. coli bajo el control transcripcional del promotor/operador de tetA.

Se examinan los clones para seleccionar insertos usando los cebadores 3, 4 y se someten a ensayo para determinar la expresión de la Taq polimerasa activa (Taq pol) (véase a continuación). Se construye el mutante D785H/E786V de Taq pol inactiva usando mutagénesis Quickchange (Stratagene). Los residuos mutados son críticos para determinar la actividad (Doublie S. et al, 1998, Nature 391, 251; Kiefer J.R. et al, 1998, Nature 391,304). Se examinan los clones resultantes para seleccionar la mutación usando la selección por PCR con los cebadores 3, 5 y la digestión de diagnóstico de los productos con PmlI. Se someten a ensayo los clones mutantes para determinar la expresión de Taq pol activa (véase a continuación).

Ejemplo 2 Expresión de proteínas y ensayo de actividad

Se hacen crecer células TG1 transformadas en 2xTY con ampicilina 0,1 mg/ml. Para la expresión, los cultivos durante la noche se diluyen 1/100 en medio 2xTY fresco y se hacen crecer hasta una DO600=0,5 a 37ºC. Se induce la expresión de proteínas mediante la adición de tetraciclina anhidra hasta una concentración final de 0,2 \mug/ml. Tras 4 horas de incubación adicional a 37ºC, se centrifugaron las células, se lavaron una vez y se resuspendieron en un volumen igual de tampón de polimerasa SuperTaq 1 X (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM) (HT Biotechnology Ltd, Cambridge RU).

Se añaden las células lavadas directamente a una mezcla de reacción de PCR (2 \mul por 30 \mul de volumen de reacción) que comprende plásmido molde (20 ng), cebadores 4 y 5 (1 \muM cada uno), dNTP (0,25 mM), tampón de polimerasa SuperTaq 1 X y se recubre con aceite mineral. Se incuban las reacciones durante 10 min. a 94ºC para liberar la Taq pol de las células y luego se someten a termociclación con 30 ciclos del perfil de 94ºC (1 min.), 55ºC (1 min.), 72ºC (2 min.).

Ejemplo 3 Emulsionamiento de reacciones de amplificación

El emulsionamiento de reacciones se lleva a cabo tal como sigue. Se añaden 200 \mul de la mezcla de reacción de PCR (plásmido de expresión de Taq (200 ng), cebadores 3 y 4 (1 \muM cada uno), dNTP (0,25 mM), Taq polimerasa (10 unidades)) gota a gota (12 gotas/min.) a la fase de aceite (aceite mineral (Sigma)) en presencia de Span 80 al 4,5% (v/v) (Fluka), Tween 80 al 0,4% (v/v) (Sigma) y Triton X100 al 0,05% (v/v) (Sigma) en agitación constante (1000 rpm) en viales de biocongelación de fondo redondo de 2 ml (Costar, Cambridge MA). Tras la adición completa de la fase acuosa, se continúa la agitación durante 4 minutos adicionales. Entonces se transfieren las mezclas emulsionadas a tubos de PCR de pared delgada de 0,5 ml (100 \mul/tubo) y se lleva a cabo la PCR usando 25 ciclos del perfil de 94ºC (1 min.), 60ºC (1 min.), 72ºC (3 min.) tras una incubación de 5 min. inicial a 94ºC. Se recuperan las mezclas de reacción mediante la adición de un volumen doble de éter, agitando con vórtex y centrifugando durante 2 min. antes de la eliminación de la fase de éter. Se visualiza el producto amplificado mediante electroforesis en gel sobre geles de agarosa usando métodos convencionales (véase por ejemplo J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, libros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Para el emulsionamiento de células completas que expresan Taq polimerasa, se modifica el protocolo de la siguiente forma: se omiten el plásmido de expresión de Taq y la Taq polimerasa en el cóctel de reacción y en su lugar se añaden 5x10^{8} células TG1 de E. coli inducidas (que albergan la Taq polimerasa expresada así como el plásmido de expresión) junto con el aditivo de cloruro de tetrametilamonio (50 \muM) y ARNasa (0,05%, p/v, Roche, RU). El número de ciclos de PCR se reduce también a 20.

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Ejemplo 4 Autorreplicación de gen de Taq wt de longitud completa

Con el fin de someter a prueba el ligamiento genotipo-fenotipo durante la autorreplicación, se mezclaron células que expresan o bien la Taq polimerasa de tipo natural (Taq wt) o bien el fragmento Stoffel (Taq sf) poco activo (en las condiciones del tampón) (F. C. Lawyer, et al., PCR Methods Appl 2, 275-87 (1993)) a una razón 1:1 y se sometieron a CSR o bien en disolución o bien en emulsión. En disolución, se amplifica preferentemente el Taq sf más pequeño. Sin embargo, en emulsión, existe la autorreplicación casi exclusiva del gen de Taq wt de longitud completa (figura 3B). El número de células bacterianas se ajusta de modo que la mayoría de los compartimentos de emulsión contienen sólo una única célula. Sin embargo, debido a que las células se distribuyen al azar entre los compartimentos, es inevitable que una fracción minoritaria contenga dos o más células. Ya que los compartimentos no parecen intercambiar ADN molde (figura 3A), es probable que la pequeña cantidad de amplificación de Taq sf en emulsión se origine a partir de estos compartimentos. Claramente, su abundancia es baja y, como tal, improbable que afecte a las selecciones. De hecho, en una selección de prueba, una única ronda de CSR es suficiente para aislar clones de Taq wt a partir de un exceso de 10^{6} veces de un mutante de Taq inactivo.

Usando PCR propensa a errores, se prepararon dos repertorios de mutantes de Taq al azar (L1 (J. P. Vartanian, M. Henry, S. Wain-Hobson, Nucleic Acid Res. 24, 2627-2631 (1996)) y L2 (M. Zaccolo, E. Gherardi, J Mol Biol 285, 775-83 (1999)). Sólo el 1-5% de los clones L1 o L2 son activos, tal como se evalúa mediante PCR, pero una única ronda de selección por CSR para determinar la actividad polimerasa en condiciones de PCR convencional aumentó la proporción de clones activos hasta el 81% (L1*) y el 77% (L2*).

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Ejemplo 5 PCR mutagénica

Se construyen variantes del gen de la Taq polimerasa usando dos métodos diferentes de PCR propensa a errores.

El primero utiliza los análogos de nucleósido dPTP y dLTP (Zaccolo et al, (1996) J Mol Biol. 255, 589-603). En resumen, se lleva a cabo una reacción de PCR de 3 ciclos que comprende KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 2 mM, dNTP (500 \muM), dPTP (500 \muM), dLTP (500 \muM), ADN molde 1 pM, cebadores 8 y 9 (1 \muM cada uno), Taqpolimerasa (2,5 unidades) en un volumen total de 50 \mul con el perfil térmico de 94ºC (1 min.), 55ºC (1 min.), 72ºC (5 min). Entonces se transfiere una alícuota de 2 \mul a una reacción de PCR convencional de 100 \mul que comprende KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM, dNTP (250 \muM), cebadores 6 y 7 (1 \muM cada uno), Taq polimerasa (2,5 unidades). Se cicla esta reacción 30 x con el perfil de 94ºC (30 segundos), 55ºC (30 segundos), 72ºC (4 minutos). Se purifica con gel el producto amplificado y se clona en pASK75 como anteriormente para crear la biblioteca L2.

El segundo método utiliza una combinación de MnCl_{2} y dNTP sesgados para introducir errores durante la PCR. La mezcla de reacción comprende KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 2,5 mM, MnCl_{2} 0,3 mM, ADN molde 1 pM, dTTP, dCTP, dGTP (todos 1 mM), dATP (100 \muM), cebadores 8 y 9 (1 \muM cada uno) y Taq polimerasa (2,5 unidades). Se cicla esta reacción 30 x con el perfil de 94ºC (30 segundos), 55ºC (30 segundos), 72ºC (4 minutos) y se clonan los productos amplificados como anteriormente para crear la biblioteca L1.

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Ejemplo 6 Protocolo de selección

Para la selección de polimerasas activas; se llevan a cabo reacciones de PCR dentro de las emulsiones tal como se describieron anteriormente pero usando los cebadores 8, 9. Para la selección de variantes con termoestabilidad aumentada, se incuban previamente las emulsiones a 99ºC durante hasta 7 minutos antes de la ciclación como anteriormente. Para la selección de variantes con actividad aumentada en presencia de la heparina inhibidora, se añade la última a concentraciones de 0,08 y 0,16 unidades/\mul y se lleva a cabo la ciclación como anteriormente. Se exponen protocolos detallados en los ejemplos adicionales a continuación.

Se extraen de la emulsión con éter los productos de amplificación que resultan a partir de los compartimentos que contienen una polimerasa activa como anteriormente y luego se purifican mediante extracción con fenol-cloroformo convencional. A continuación, se añaden 0,5 volúmenes de disolución de PEG/MgCl_{2} (PEG 800 al 30% v/v, MgCl_{2} 30 mM) y tras mezclar se lleva a cabo la centrifugación a 13.000 RPM durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se desecha el sobrenadante (que contiene cebadores no incorporados y dNTP) y se resuspende el sedimento en TE. Entonces se purifican adicionalmente los productos amplificados en columnas de centrifugación (Qiagen) para garantizar la eliminación completa de los cebadores. Entonces se vuelven a amplificar estos productos usando los cebadores 6, 7 (que se anidan externamente con los cebadores 8 y 9) en una reacción de PCR convencional, con la excepción de que sólo se usan 20 ciclos. Los productos reamplificados se purifican en gel y vuelven a clonarse en pASK75 como anteriormente. Se siembran en placa los transformantes y se seleccionan las colonias como a continuación. El resto se descarta en 2xTY/ampicilina 0,1 mg/ml, se diluye hasta una DO_{600}= 0,1 y se hacen crecer/inducen como anteriormente para la repetición del protocolo de selección.

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Ejemplo 7 Protocolo de selección de colonias

Se recogen colonias en una placa de cultivo de 96 pocillos (Costar), se hacen crecer y se inducen para determinar la expresión como anteriormente. Para la selección, se usan 2 \mul de células en una reacción de PCR de 30 \mul para someter a prueba la actividad como anteriormente en una placa de PCR de 96 pocillos (Costar) usando los cebadores 4 y 5. Se usa un bloque de gradiente de temperatura para la selección de colonias seleccionadas con termoestabilidad aumentada. Se incuban previamente las reacciones durante 5 minutos a temperaturas que oscilan desde 94,5 hasta 99ºC antes de la ciclación convencional como anteriormente con los cebadores 4 y 5 ó 3 y 4. Para la selección de polimerasas compatibles con heparina, se añade heparina a 0,1 unidades/30 \mul durante la selección por PCR de colonias en formato de 96 pocillos. Entonces se someten a ensayo las polimerasas activas en un intervalo de concentraciones de heparina que oscilan desde 0,007 hasta 3,75 unidades/30 ml y se comparan con el tipo natural.

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Ejemplo 8 Ensayo para determinar la actividad catalítica de polimerasas

Se determinan Kcat y Km (dTTP) usando un sustrato homopolimérico (Polesky et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:14579-91). La mezcla de reacción final (25 ml) comprende tampón SuperTaq 1X (HT Biotech), poli(dA).oligo(dT) (500 nM, Pharmacia) y concentraciones variables de [\alpha-^{32}P]dTTP (aprox. 0,01 Ci/mmoles). Se inicia la reacción mediante la adición de 5 \mul de enzima en tampón SuperTaq 1X para dar una concentración de enzima final de entre 1-5 nM. Se incuban las reacciones durante 4 minutos a 72ºC, se extinguen con EDTA como en el ejemplo 14 y se aplican a filtros DE-81 de 24 mm. Se lavan los filtros y se mide la actividad como en el ejemplo 14. Se determinan los parámetros cinéticos usando el gráfico de Lineweaver-Burke convencional. Los experimentos que usan sustrato de homopolímero reducido en el 50% no muestran diferencia macroscópica en la incorporación de dTTP por la polimerasa, lo que indica que está presente en exceso suficiente para validar el protocolo de análisis cinético usado.

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Ejemplo 9 PCR convencional en compartimentos acuosos dentro de una emulsión

Para establecer si las condiciones en los compartimentos acuosos presentes en una emulsión permiten la catálisis, se emulsiona una mezcla de reacción convencional y se lleva a cabo la PCR. Esto conduce a la amplificación del gen de la Taq polimerasa de tamaño correcto presente en el molde de plásmido, con rendimientos suficientes para permitir la visualización usando electroforesis en gel de agarosa convencional.

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Ejemplo 10 Emulsionamiento de E. coli que expresa la Taq polimerasa y PCR posterior para amplificar el gen de la polimerasa

Se emulsionan células de E. coli que expresan la Taq polimerasa y se lleva a cabo la PCR usando cebadores que flanquean el casete de la polimerasa en el vector de expresión. El emulsionamiento de hasta 5 x 10^{8} células (por 600 \mul de volumen total) conduce a la formación de producto discernible tal como se evalúa mediante electroforesis en gel de agarosa. Por tanto, las células se segregan en los compartimentos acuosos en los que las condiciones son adecuadas para la autoamplificación del gen de la polimerasa mediante la Taq polimerasa expresada. Se calcula que las emulsiones similares contienen aproximadamente 1 x 10^{10} compartimentos por ml (Tawfik D. & Griffiths A.D. (1998) Nature Biotech. 16, 652). El gran número de células que pueden emulsionarse permite la selección de diversos repertorios de proteínas aleatorizadas.

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Ejemplo 11 Mantenimiento del ligamiento genotipo-fenotipo en emulsión

Para que sean viables para un método de selección, la mayoría de los compartimentos acuosos en la emulsión deben albergar una única célula y la integridad de los compartimentos debe mantenerse durante la ciclación térmica. Esto se somete a prueba incluyendo en la emulsión células que albergan un molde competidor que puede distinguirse por su tamaño más pequeño.

Se emulsiona conjuntamente E. coli que expresa la Taq polimerasa con E. coli que expresa el fragmento Stoffel a una razón de uno a uno. El fragmento Stoffel es poco activo en las condiciones usadas en la emulsión y por tanto la amplificación de su casete de expresión mediante el mismo par de cebadores usados para la autoamplificación de Taq es el resultado de la compartimentalización conjunta con una célula que expresa Taq polimerasa activa o el escape de la Taq polimerasa entre los compartimentos. Tras la PCR, se encuentra que la gran mayoría de los productos corresponden al gen de la Taq polimerasa activa, validando así la premisa de una célula por compartimento duradero (véase la figura 2, Ghadessy et al (2001), PNAS, 98, 4552).

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Ejemplo 12 Selección de prueba de la Taq polimerasa activa con respecto la inactiva

Para demostrar que el método puede seleccionar variantes potencialmente raras, se emulsiona conjuntamente un exceso de 10^{6} veces de células que expresan la polimerasa inactiva con respecto a aquellas que expresan la forma activa. Tras la PCR y la clonación del producto amplificado, una selección de expresión única usando un formato de 96 pocillos indicó un enriquecimiento de 10^{4} veces para la polimerasa activa.

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Ejemplo 13 Evolución dirigida de variantes de la Taq polimerasa con estabilidad térmica aumentada

Las polimerasas con termoestabilidad aumentada son de importancia práctica potencial, reduciendo la pérdida de actividad durante la termociclación y permitiendo temperaturas de desnaturalización superiores para la amplificación de moldes ricos en GC. Por tanto, se usa en primer lugar el método de selección de la invención para la evolución dirigida de variantes de Taq con termoestabilidad aumentada, partiendo de bibliotecas preseleccionadas (L1*, L2*) y aumentando progresivamente la temperatura y la duración de la desnaturalización térmica inicial. Tras 3 rondas de selección, se aisló T8 (tabla 1), un clon de Taq con una semivida 11 veces más larga a 97,5ºC que la enzima Taq wt ya termoestable (tabla 2), lo que hace a T8 el miembro más termoestable de la familia Pol I registrado (se seleccionan y se marcan clones mediante un ensayo de PCR. En resumen, se añaden 2 \mul de células inducidas a una mezcla de PCR de 30 \mul y se somete a ensayo la amplificación de un fragmento de 0,4 kb en las condiciones de selección (por ejemplo, cantidades crecientes de heparina). Se determina la termoestabilidad y resistencia a la heparina de los clones de Taq mutante y wt etiquetados con His como en (Lawyer et al., PCR Methods Appl 2, 275-287 (1993); Lawer et al., J Biol Chem 264, 6427-37 (1989) usando ADN de esperma de salmón activado y concentraciones de enzimas normalizadas). Las mutaciones que confieren termoestabilidad a T8 (y a una mayoría de mutantes menos termoestables) se agrupan en el dominio exonucleasa 5'-3' (tabla 1). De hecho, las variantes de truncamiento de la Taq polimerasa (F. C. Lawyer, et al., (1993) PCR Methods Appl 2, 275-87; W. M. Bames, (1992) Gene 112, 29-35) que carecen del domino exonucleasa muestran termoestabilidad mejorada, lo que sugiere que puede ser menos termoestable que el dominio polimerasa principal. La termoestabilidad inferior del dominio exonucleasa puede tener significación funcional (por ejemplo, reflejando una necesidad de una mayor flexibilidad), ya que las mutaciones estabilizantes en T8 parecen reducir la actividad exonucleasa (aproximadamente 5 veces) (se determina la actividad exonucleasa 5'-3' esencialmente como en (Y. Xu, et al., J Mol Biol 268, 284-302 (1997)) pero en tampón Taq 1x con dNTP 0,25 mM y el oligonucleótido 22-meros de (Y. Xu, et al., J Mol Biol 268, 284-302 (1997)) marcado en 5' con Cy5 (Amersham). Se mide la cinética en estado estacionario como en (A. H. Polesky, T. A. Steitz, N. D. Grindley, C. M. Joyce, J Biol Chem 265, 14579-91 (1990) usando el sustrato homopolimérico poli(dA)_{200} (Pharmacia) y el cebador oligo(dT)_{40} a 50ºC.) (al menos a temperatura baja).

TABLA 1 Propiedades de los clones seleccionados. Los clones en negrita se relacionan a través de las mutaciones subrayadas. Los clones se clasifican en relación con Taq wt

1

Se expresan en E. coli dos bibliotecas de variantes de la Taq polimerasa generadas usando PCR propensa a errores (biblioteca L1, 8x10^{7} clones, biblioteca L2 2x10^{7} clones; véase el ejemplo 5) y se emulsionan como anteriormente. Se lleva a cabo la primera ronda de PCR para enriquecer las variantes activas usando el perfil de termociclación de la Taq polimerasa convencional esbozado anteriormente. Se purifican los productos de amplificación enriquecidos y vuelven a clonarse para generar bibliotecas que comprenden las variantes activas (L1*, L2*; aproximadamente 10^{6} clones por cada biblioteca). Una selección de las bibliotecas L1* y L2* mostró respectivamente que el 81% y el 77% de los clones recogidos al azar eran activos.

Se aplica presión selectiva a las bibliotecas L1* y L2* durante la siguiente ronda de PCR incubando previamente las emulsiones a 99ºC durante 6 ó 7 minutos antes del ciclo de PCR normal. En estas condiciones, la Taq polimerasa de tipo natural pierde toda la actividad. Se enriquecen los productos amplificados y se clonan como anteriormente y se usa un examen de expresión de 96 pocillos para seleccionar las variantes activas en condiciones de PCR normales. Esto produce 7 clones a partir de la biblioteca L2* y 10 clones a partir de la biblioteca L1*. Entonces se examinan estos para seleccionar termoestabilidad aumentada usando un bloque de PCR en gradiente de temperatura, con una incubación previa de 5 minutos a temperaturas de 94,5 a 99ºC antes de la ciclación convencional. Tal como se evalúa mediante electroforesis en gel, están presentes 5 clones a partir de cada biblioteca con termoestabilidad aumentada en comparación con el tipo natural. Estos mutantes pueden amplificar eficazmente la diana de 320 pb tras la incubación previa a 99ºC durante 5 minutos. La enzima de tipo natural no tiene actividad discernible tras la incubación previa a temperaturas superiores a 97ºC durante 5 minutos o más.

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Ejemplo 14 Ensayo para determinar la estabilidad térmica de la polimerasa

Se llevan a cabo ensayos de inactivación térmica de polimerasas WT y etiquetadas con His purificadas en una mezcla de PCR de 50 \mul convencional que comprende tampón SuperTaq 1X (HT Biotech), 0,5 ng de molde de ADN de plásmido, dATP, dTTP y dGTP cada uno 200 \muM, cebadores 3 y 4 (10 \muM) y polimerasa (aproximadamente 5 nM). Se recubren con aceite las mezclas de reacción y se incuban a 97,5ºC, extrayéndose alícuotas de 5 \mul y almacenándose en hielo tras intervalos definidos. Estas alícuotas se someten a ensayo en un tampón de reacción de actividad de 50 \mul que comprende ácido N-tris[hidroximetil-3-amino-propanosulfónico (TAPS) 25 mM (pH 9,5), \beta-mercaptoetanol 1 mM, MgCl_{2} 2 mM, dATP, dTTP y dGTP cada uno 200 \muM, [\alpha-^{32}P]dCTP 100 mM (0,05 Ci/ mmoles) y molde de ADN de esperma de salmón activado 250 \mug/ml. Se incuban las reacciones durante 10 minutos a 72ºC, se paran mediante la adición de EDTA (25 mM final). Se completan los volúmenes de reacción hasta 500 \mul con disolución S (EDTA 2 mM, ADN de esperma de salmón cortado 50 \mug/ml) y se añaden 500 \mul de TCA al 20% (v/v) / pirofosfato de sodio al 2% (v/v). Tras 20 minutos de incubación en hielo, se aplican las reacciones a filtros GF/C de 24 mm (Whatman). Se eliminan los nucleótidos no incorporados mediante 3 lavados con TCA al 5% (v/v), pirofosfato de sodio al 2% (v/v) seguido por dos lavados con etanol al 96% (v/v). Se cuentan los filtros secados en viales de centelleo que contienen Ecoscint A (National Diagnostics). Se calibra el ensayo usando una cantidad conocida de la disolución de dCTP marcado (omitiendo los lavados).

Ejemplo 15 Evolución dirigida de variantes de la Taq polimerasa con actividad aumentada en presencia del inhibidor heparina

Tal como se indicó anteriormente, los métodos de la descripción también pueden usarse para evolucionar la resistencia a un inhibidor de la actividad enzimática. La heparina es un anticoagulante ampliamente usado, pero también un potente inhibidor de la actividad polimerasa, creando dificultades para las amplificaciones por PCR de muestras de sangre clínicas (J. Satsangi, D. P. Jewell, K. Welsh, M. Bunce, J. I. Bell, Lancet 343, 1509-10 (1994)). Aunque la heparina puede eliminarse de las muestras de sangre mediante diversos procedimientos, estos pueden ser tanto costosos como que requieren mucho tiempo. La disponibilidad de una polimerasa compatible con la heparina mejoraría por tanto en gran medida la caracterización de amplicones terapéuticamente significativos y evitaría la necesidad de un tra-
tamiento con heparinasa de las muestras posiblemente prohibitivo por su coste (Taylor A.C. (1997) Mol. Ecol 6, 383).

Las bibliotecas L1* y L2* se combinan y se seleccionan en emulsión para detectar polimerasas activas en hasta 0,16 unidades de heparina por \mul. Tras una única ronda, se aíslan 5 clones activos en el examen por PCR de 96 pocillos incorporando 0,1 unidades/30 \mul de reacción, no mostrando actividad el tipo natural. La titulación muestra que 4 de estos clones son activos en hasta cuatro veces la cantidad de heparina que inhibe al tipo natural (0,06 unidades/30 \mul frente a 0,015 unidades/30 \mul). El otro clon es activo en hasta ocho veces la cantidad de heparina que inhibe al tipo natural (0,12 unidades/30 \mul frente a 0,015 unidades/30 \mul).

Usando la selección en presencia de cantidades crecientes de heparina, se aisló H15, una variante de Taq funcional en PCR en hasta 130 veces la concentración inhibidora de heparina (tabla 2). De manera intrigante, las mutaciones que confieren resistencia a heparina también se agrupan, en este caso en la base de los subdominios dedo ("finger") y pulgar ("thumb") de la polimerasa, regiones implicadas en la unión a ADN dúplex. De hecho, evaluando a partir de una estructura de alta resolución reciente de un complejo Taq-ADN (Y. Li, S. Korolev, G. Waksman, EMBO J 17, 7514-25 (1998)) cuatro de seis residuos mutados en H15 (K540, D578, N583, M747) contactan directamente o bien con la cadena del molde o bien con la del producto (tal como se muestra en la figura 7). Las mutaciones en H15 parecen ser neutras (o que se compensan de manera mutua) en lo que respecta a la afinidad por el ADN dúplex (aunque presumiblemente reduciendo la afinidad por la heparina) (tabla 2) (se determina la K_{D} para el ADN usando BIAcore. En resumen, se biotinila el 68 mero usado en (M. Astatke, N. D. Grindley, C. M. Joyce, J Biol Chem 270, 1945-54 (1995)) en el extremo 5' y se une a un chip detector SA y se mide la unión de polimerasas en tampón Taq 1x (véase anteriormente) a 20ºC. Se calculan los valores relativos de K_{D} mediante ensayos de clasificación por PCR usando cantidades decrecientes de molde). No se conoce la base molecular precisa de la inhibición por heparina, pero los resultados sugieren fuertemente el solapamiento (y presumiblemente exclusivo de manera mutua) de los sitios de unión para el ADN y la heparina en el sitio activo de la polimerasa, apoyando la idea de que la heparina ejerce su efecto inhibidor imitando y compitiendo con el ADN dúplex por la unión al sitio activo. La observación de que la inhibición por heparina se reduce marcadamente en condiciones de ADN de molde en exceso, (véase (se seleccionan y clasifican clones mediante un ensayo de PCR. En resumen, se añaden 2 \mul de células inducidas a una mezcla de PCR de 30 \mul y se somete a ensayo la amplificación de un fragmento de 0,4 kb en las condiciones de selección (por ejemplo, cantidades crecientes de heparina). Se determina la termoestabilidad y la resistencia a heparina de clones de Taq mutante y wt etiquetados con His purificados como en (F. C. Lawyer, et al., PCR Methods Appl 2, 275-87 (1993); F. C. Lawyer, et al., J Biol Chem 264, 6427-37 (1989)) usando ADN de esperma de salmón activado y concentraciones de enzimas normalizadas, tabla 2) parecen concordar con esta hipótesis.

TABLA 2 Propiedades de los clones de Taq seleccionados

2

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Ejemplo 16 Evolución del molde en selección en emulsión

Un resultado clásico de experimentos de replicación in vitro es una adaptación de la secuencia del molde hacia una replicación más rápida (S. Spiegelman, Q. Rev. Biophys. 4, 213-253 (1971)). De hecho, también se observó una evolución del molde a través de mutaciones silenciosas. A diferencia de las mutaciones codificantes (AT en GC frente a GC en AT/29 frente a 16), las mutaciones no codificantes presentan un sesgo sorprendente (AT en GC frente a GC en AT/0 frente a 42) hacia una disminución del contenido en GC, que se piensa generalmente que promueve una replicación más eficaz facilitando la separación de las cadenas y desestabilizando las estructuras secundarias. Aparte de seleccionar para la adaptación, el método también puede seleccionar para la adaptabilidad; es decir, las polimerasas podrían evolucionar hacia una velocidad de automutación óptima, presumiblemente superior (M. Eigen, Naturwissenschaften 58, 465-523 (1971)). De hecho, pueden surgir espontáneamente mutágenos en poblaciones bacterianas asexuales bajo estrés adaptativo (F. Taddei, et al., Nature 387, 700-2 (1997); P. D. Sniegowski, P. J. Gerrish, R. E. Lenski, Nature 387, 703-5 (1997)). Por analogía, podría alegarse que el método podría favorecer a las variantes de la polimerasa que son más propensas a errores y por tanto que pueden experimentar una evolución adaptativa más rápida. Sin embargo, ninguna de las polimerasas seleccionadas presentó tasas de error aumentadas (tabla 2). La eliminación de la recombinación y la disminución de la carga mutacional durante el ciclo del método pueden aumentar las presiones selectivas hacia enzimas más propensas a errores.

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Ejemplo 17 Ensayo para determinar la tolerancia a heparina de las polimerasas

Se somete a ensayo la tolerancia a heparina de las polimerasas usando un ensayo similar al de la estabilidad térmica. Se diluye en serie la heparina en el tampón de actividad (0-320 unidades/45 \mul) y se añaden 5 \mul de enzima en la mezcla de PCR convencional anterior. Se incuban las reacciones y se somete a ensayo la incorporación como anteriormente.

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Ejemplo 18 Selección de variantes de Taq con capacidad aumentada de extender a partir de una base apareada erróneamente en 3'

Los cebadores usados son el cebador 9 (LMB388ba5WA) y el cebador 10 (8fo2WC). Esta combinación de cebadores presenta variantes de la polimerasa con un apareamiento erróneo purina-purina en 3' (A-G) y un apareamiento erróneo pirimidina-pirimidina en 3' (C-C). Estos son los apareamientos erróneos menos tolerados por la Taq polimerasa (Huang et al., 1992, Nucleic Acids Res 20(17):4567-73) y se extienden poco.

El protocolo de selección es esencialmente el mismo que anteriormente, excepto que se usan estos dos cebadores en emulsión. El tiempo de extensión también aumenta hasta 8 minutos. Tras dos rondas de selección, se aíslan 7 clones que presentan un aumento de hasta 16 veces en la extensión del apareamiento erróneo tal como se evalúa mediante un ensayo de clasificación por PCR (véase el ejemplo 2: usando los cebadores 5 y 11) y se normalizan para determinar la actividad usando el par de cebadores normales. Posteriormente, estos clones se seleccionan aleatoriamente de nuevo en las bibliotecas L1* y L2* originales junto con la Taq de tipo natural y se repite el proceso de selección, aunque con un número inferior de ciclos (10) durante la reacción de CSR. Esta ronda de selección produjo numerosos clones, el mejor de los cuales presentó un aumento de hasta 32 veces en la extensión del apareamiento erróneo tal como se evaluó mediante PCR (véase el ejemplo 2) usando los cebadores 5 y 11.

La incorporación de un par de bases incorrectas por la Taq polimerasa puede paralizar el proceso de polimerización ya que ciertos apareamientos erróneos (véase anteriormente) se extienden poco por la Taq. Como tal, la Taq polimerasa sola no puede usarse en la amplificación de moldes grandes (>6 Kb) (Barnes). Este problema puede superarse complementando la Taq con una polimerasa que tiene una actividad exonucleasa 3'-5' (por ejemplo, la polimerasa Pfu) que elimina las bases incorporadas de manera incorrecta y que permite la reanudación de la polimerización por la Taq. Por tanto, se investigan los clones anteriores para determinar su capacidad de llevar a cabo la amplificación de fragmentos de ADN grandes (PCR de larga distancia) a partir de un molde de ADN lambda, ya que no se esperaría que la incorporación de una base incorrecta paralizase la polimerización. Usando los cebadores 12 (LBA23) y 13 (LFO46) (cada uno 1 \muM) en una reacción de PCR de 50 \mul que contiene 3 ng de ADN lambda (New England Biolabs), dNTP (0,2 mM), tampón de PCR 1x (HT Biotech), el clon M1 puede amplificar un fragmento de 23 kb usando 20 repeticiones de un ciclo de amplificación de 2 etapas (94ºC, 15 segundos; 68ºC, 25 minutos). La polimerasa de tipo natural no puede extender productos por encima de 13 kb usando el mismo tampón de reacción. La Taq comercial(Perkin Elmer) no pudo extender más allá de 6 kb usando tampón suministrado por el fabricante.

Ejemplo 19 Selección usando replicación de secuencia autosostenida (3SR)

Para demostrar la viabilidad de la 3SR dentro de la emulsión, en primer lugar se amplifica por PCR el gen de la Taq polimerasa a partir del plásmido original (véase el ejemplo 1) usando un cebador directo que se diseña para que incorpore un promotor de la ARN polimerasa de T7 en el producto de PCR. Se prepara una mezcla de reacción de 3SR de 250 \mul que comprende el gen de la Taq modificado (50 ng), 180 unidades de ARN polimerasa de T7 (USB, 63 unidades de transcriptasa inversa (HT Biotech), rNTP (12,5 mM), dNTP (1 mM), MgCl_{2} (10 mM), cebador Taqba2T7 (cebador 12; 125 pmoles), cebador 88fo2 (cebador 4; 125 pmoles), Tris-HCl 25 mM (pH 8,3), KCl 50 mM y DTT 2,0 mM. Se emulsionan 200 \mul de ésta usando el protocolo convencional. Tras la incubación prolongada a temperatura ambiente, se observa que tiene lugar la amplificación del gen de la Taq (que representa un tamaño de gen modelo) dentro de la emulsión tal como se evalúa mediante electroforesis en gel convencional.

Para extender adicionalmente el alcance del método, se lleva a cabo la reacción de 3SR en un extracto de transcripción/traducción in vitro (EcoPro, Novagen). Se amplifica el gen de la Taq inactivo (véase el ejemplo 1) a partir del plásmido original usando los cebadores 2 (TaqfoSal) y 12 (Taqba2T7). Se añaden 100 ng (aprox. 1x10^{10} copias) para completar 100 \mul de la fase acuosa que comprende extracto EcoPro (70 \mul), metionina (4 \mul), transcriptasa inversa (84 unidades, HT Biotech), cebador 12 (Taqba2T7, 2 \muM), cebador 13 (TaqfoLMB2, 2 \muM), dNTP (250 \muM). Se emulsiona la fase acuosa en 400 \mul de fase de aceite usando el protocolo convencional. Tras la incubación a 37ºC durante la noche, se extrae la emulsión usando el protocolo convencional y se purifica adicionalmente la fase acuosa usando una columna de purificación de PCR (Qiagen). Se garantiza la eliminación completa de los cebadores tratando 5 \mul de eluato de la columna con 2 \mul de reactivo ExoZap (Stratagene). Se rescata el ADN producido en la emulsión mediante 3SR usando 2 \mul del eluato de la columna tratado en una reacción de PCR de 50 \mul por lo demás convencional usando 20 ciclos de amplificación y los cebadores 6 (LMB, ref 2) y 12 (Taqba2T7). En comparación con el fondo (la reacción control en la que se omite la transcriptasa inversa de la reacción de 3SR en emulsión), pudo observarse una banda de tamaño correcto más intensa cuando los productos se visualizan usando electroforesis en gel de agarosa. Por tanto, la reacción de 3SR puede realizarse en los extractos de transcripción/traducción, permitiendo la evolución dirigida de agentes expresados en compartimentos acuosos.

La Taq polimerasa wt tiene actividad transcriptasa inversa limitada (Perler et al., (1996) Adv Protein Chem. 48, 377-435). Se sabe también que las transcriptasas inversas (por ejemplo, trancriptasa inversa del VIH que tiene actividades tanto transcriptasa inversa como polimerasa) son considerablemente más propensas a errores que otras polimerasas. Esto eleva la posibilidad de que una polimerasa más propensa a errores (en la que es evidente un aumento de la tolerancia para un sustrato no análogo) puede presentar actividad transcriptasa inversa aumentada. Los genes para las variantes de Taq M1, M4 así como el mutante inactivo se amplifican a partir de plásmidos originales usando los cebadores 12 (Taqba2T7) y 2 (TaqfoSal) y se lleva a cabo la reacción de 3SR como anteriormente en el extracto de transcripción/traducción (Novagen) con la excepción de que la transcriptasa inversa no se añade de manera exógena. En las reacciones control, se omite la metionina de la mezcla de reacción. Tras 3 horas de incubación a 37ºC, se trata la reacción como anteriormente y se lleva a cabo la PCR usando el par de cebadores 6 y 12 para rescatar los productos sintetizados durante la reacción de 3SR. De los clones sometidos a prueba, el clon M4 dio una banda de tamaño correcto más intensa en comparación con la reacción control cuando los productos se visualizan usando electroforesis en gel de agarosa. Por tanto, el clon M4 parecería tener algún grado de actividad transcriptasa inversa. Este resultado muestra que es posible expresar replicasas funcionalmente activas in vitro. Cuando se acopló a la selección mediante compartimentalización, pudieron evolucionarse replicasas novedosas.

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Selección de agentes que modifican la actividad replicasa

El ejemplo 19 y los siguientes ejemplos describen cómo pueden emplearse los métodos de la descripción para seleccionar una enzima que está implicada en una ruta metabólica cuyo producto final es un sustrato para la replicasa. Estos ejemplos muestran un método para la selección de nucleósido difosfato cinasa (NDP cinasa), que cataliza la transferencia de un grupo fosfato desde el ATP hasta un desoxinucleósido difosfato para producir un desoxinucleósido trifosfato (dNTP). En este caso, la enzima seleccionable (NDK) proporciona sustratos para que la Taq polimerasa amplifique el gen que la codifica. Este método de selección difiere de la autorreplicación compartimentalizada de una replicasa (CSR, Ghadessy y Holliger) en que la replicación es un proceso acoplado, que permite la selección de enzimas (ácidos nucleicos y proteína) que no son replicasas por sí mismas. Las bacterias que expresan NDK (y que contienen su gen en un vector de expresión) se emulsionan conjuntamente con su sustrato (en este caso, dNDP y ATP) junto con los otros reactivos necesarios para facilitar su amplificación (Taq polimerasa, cebadores específicos para el gen de la ndk y tampón). La compartimentalización en una emulsión de agua en aceite garantiza la segregación de variantes de bibliotecas individuales. Los clones activos proporcionan los dNTP necesarios para que la Taq polimerasa amplifique el gen de la ndk. Las variantes con actividad aumentada proporcionan más sustrato para su propia amplificación y por tanto el número de copias tras la selección se correlaciona con la actividad enzimática dentro de las limitaciones de la actividad polimerasa. Surge una presión selectiva adicional de la cantidad mínima de dNTP requerida para la actividad polimerasa, por tanto, se amplifican preferentemente clones con actividad catalítica aumentada a expensas de variantes poco activas (la selección es para la kcat así como para la Km).

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Mostrando que puede evolucionarse una enzima cuyo producto se alimenta en la reacción de la polimerasa, se espera coevolucionar finalmente múltiples enzimas ligadas a través de una ruta en la que el producto de una enzima es el sustrato para la siguiente. Podría introducirse diversidad en dos o más genes y ambos genes podrían cotransformarse en el mismo huésped de expresión en plásmidos o fagos. Se espera desarrollar sistemas enzimáticos cooperativos que permitan seleccionar la síntesis de sustratos no naturales y su incorporación posterior en el ADN.

Ejemplo 20 Expresión inducida de NDP cinasa en células bacterianas

Se clona un plásmido de expresión pUC19 que contiene el fragmento de restricción EcoRI/HindIII con el marco de lectura abierto de la nucleósido disfosfato cinasa de Myxococcus Xanthus. Se prepara un plásmido a partir de un cultivo de toda la noche y se transforma en la cepa ndk-, pykA-, pykF- de E. coli QL1387. Se hace crecer un cultivo de toda la noche de QL1387/pUC19ndk en presencia de cloranfenicol (concentración final de 10 \mug/ml), ampicilina (concentración final de 100 \mug/ml) y glucosa (2%) durante 14-18 horas. El cultivo de toda la noche se diluye 1:100 (2XTY, cloranfenicol 10 \mug/ml, ampicilina 100 \mug/ml y glucosa al 0,1%). Se hacen crecer las células hasta una D.O. (600 nm) de 0,4 y se inducen con IPTG (concentración final de 1 mM) durante 4 horas a 37ºC. Tras la inducción de proteínas, se lavan las células una vez en tampón SuperTaq (tris-HCl 10 mM pH 9, KCl 50 mM, Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM, HT Biotechnology) y se resuspenden en 1/10 del volumen del mismo tampón. Se cuantifica el número de células mediante análisis espectrofotométrico con la aproximación de D.O.600 0,1 = 1x10^{8} células/ml.

Ejemplo 21 Reacción de transferencia de fosforilo en compartimentos acuosos dentro de una emulsión

Para establecer si los desoxinucleósidos difosfato pueden fosforilarse mediante la NDP cinasa en tampón Taq, se lleva a cabo una reacción de PCR convencional en la que se sustituyen los dNTP por dNDP y ATP, una molécula donadora de fosfato. Se expresa la nucleósido difosfato cinasa a partir de E. coli QL1387 (una cepa de E. coli deficiente en ndk y piruvato cinasa) tal como se describió en el ejemplo anterior. Se mezclan las células con la mezcla de reacción de PCR.

Se añaden las células lavadas a una mezcla de reacción de PCR (concentración final aproximadamente de 8e5 células/\mul) que contiene tampón SuperTaq, cebadores 0,5 \muM, dNDP cada uno 100 \muM, ATP 400 \muM, polimerasa SuperTaq (concentración final de 0,1 unidades/\mul, HT Biotechnology).

Tras romper las células a 65ºC durante 10 min, incubar la mezcla de reacción durante 10 minutos a 37ºC y termociclar (15 ciclos de 94ºC 15 s, 55ºC 30 s, 72ºC 1 min. 30 s), se visualizan los productos amplificados en un gel de agarosa al 15%/TBE convencional teñido con bromuro de etidio (Sambrook). Los resultados de este experimento muestran que la NDP cinasa expresada puede fosforilar dNDP para proporcionar a la Taq polimerasa sustratos para la amplificación por PCR del gen de la ndk.

Se repite el experimento, con la etapa adicional de emulsionar la mezcla de reacción con aceite mineral y detergente tal como se describió anteriormente. Se encuentra que la NDP cinasa es activa dentro de los compartimentos acuosos de una emulsión.

Ejemplo 22 Compartimentalización de variantes de la NDK mediante emulsionamiento

La mezcla de emulsión original permitió la difusión de moléculas pequeñas entre compartimentos durante la termociclación. Sin embargo, ajustando la razón de agua a aceite y minimizando el perfil de termociclación, se minimiza el intercambio de producto y sustrato entre compartimentos, dando como resultado un ligamiento más fuerte del genotipo al fenotipo. Dado que las velocidades de difusión pueden controlarse modificando la mezcla de emulsión, puede ser posible ajustar las condiciones del tampón tras el emulsionamiento, permitiendo posiblemente un mayor control de las condiciones de selección (es decir, ajustando el pH con la adición de ácido o base, o iniciando/parando reacciones con la adición de sustratos o inhibidores).

Se añaden 150 \mul de mezcla de reacción de PCR (tampón SuperTaq buffer, cada cebador 0,5 \muM, dNDP cada uno 100 \muM, ATP 400 \muM, Taqpolimerasa 0,1 unidades/\mul, 8x10^{5} células/\mul de QL1387/ndk) gota a gota (1 gota/5 s) a 450 \mul de fase de aceite (aceite mineral) en presencia de Span 80 al 4,5% v/v, Tween 80 al 0,4% v/v y Triton X-100 al 0,05% v/v en agitación constante en un vial de biocongelación de fondo redondo de 2 ml (Corning). Tras la adición de la fase acuosa, se continúa la agitación durante 5 minutos adicionales. Se toman alícuotas (100 \mul) de las reacciones de emulsión en tubos de PCR de pared delgada y se someten a termociclación tal como se indicó anteriormente.

La recuperación de los productos amplificados tras el emulsionamiento se lleva a cabo tal como sigue. Tras la termociclación, se recuperan los productos mediante extracción con 2 volúmenes de dietil éter, se agitan con vórtex y se centrifugan durante 10 minutos en una microcentrífuga de mesa. Se analizan los productos de amplificación como anteriormente.

Ejemplo 23 Minimización de la actividad cinasa de fondo

Se determinan los niveles de actividad cinasa de fondo emulsionando células TG1 de E. coli en tampón Taq con sustratos, tal como se describió anteriormente. Se encuentra que la nucleósido difosfato cinasa nativa de E. coli conservó suficiente actividad tras la desnaturalización inicial para proporcionar actividad cinasa significativa en el ensayo. Se transforma el plásmido de expresión pUC19 que contiene el gen de la ndk en una cepa de E. coli QL1387 deficiente en ndk. En comparación con un mutante deficiente catalítico de mx ndk (H117A), se determina que la actividad cinasa de fondo es insignificante en el ensayo (no pudieron visualizarse los productos amplificados mediante electroforesis en gel de agarosa) cuando se expresa la ndk a partir de la cepa deficiente.

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Ejemplo 24 Mantenimiento del ligamiento genotipo-fenotipo en emulsión

Se coemulsiona una mutación deficiente catalítica (NDK H117A) de la NDP cinasa con NDP cinasa de tipo natural en cantidades iguales. Se distingue el mutante inactivo de la ndk mediante un producto de amplificación más pequeño, dado que se eliminan las regiones 5' y 3' que flanquean el ORF en sentido 3' desde los sitios de cebado durante la construcción del mutante deficiente. El procedimiento de emulsionamiento da un sesgo completo hacia la amplificación de la actividad cinasa, tal como se determina mediante electroforesis en gel de agarosa.

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Ejemplo 25 Método para el genotipado paralelo de poblaciones heterogéneas de células

El enfoque implica la compartimentalización de las células en cuestión en la emulsión (véase el documento W09303151) junto con reactivos de PCR etc. y la polimerasa. Sin embargo, en lugar de ligar genes derivados de una célula mediante ensamblaje por PCR, se usan uno (o varios) cebadores biotinilados así como perlas de poliestireno recubiertas con estreptavidina (o cualquier otro medio adecuado para ligar cebadores sobre perlas). Por tanto, se transfieren los fragmentos de PCR de una única célula a una única perla. Se agrupan las perlas, se examinan para detectar la presencia de una cierta mutación o alelo usando sondas marcadas de manera fluorescente (tal como se describe para "PCR digital") y se cuentan mediante FACS. La PCR múltiplex permite el examen simultáneo de 10 o quizá más marcadores. También pueden clasificarse perlas únicas para la secuenciación.

Las aplicaciones incluyen, por ejemplo, el diagnóstico de tumores asintomáticos, que dependen de la detección de un número muy pequeño de células mutantes en un gran exceso de células normales. La ventaja de este método sobre la tinción celular es el rendimiento. Potencialmente, pueden examinarse simultáneamente 10^{8}-10^{9} células.

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Ejemplo 25 CSR de tramos cortos ("short-patch")

El presente ejemplo se refiere a la selección de polimerasas con baja actividad catalítica o procesividad. La autorreplicación compartimentalizada (CSR), tal como se describe, es un método de selección de variantes de polimerasas con adaptación aumentada a distintas condiciones de selección. Los mutantes con actividad catalítica aumentada tienen una ventaja selectiva con respecto a uno que es menos activo en las condiciones de selección. Sin embargo, para muchos objetivos de selección (por ejemplo, especificidad de sustrato alterada) es probable que los productos intermedios a lo largo de la ruta evolutiva hasta el nuevo fenotipo tengan actividad catalítica disminuida. Por ejemplo, a partir de estudios cinéticos de la ADN polimerasa I de E. coli, las mutaciones tales como E710A aumentaron la afinidad y la incorporación de ribonucleótidos a expensas de velocidades catalíticas inferiores y menos afinidad por los sustratos de tipo natural (desoxirribonucleótidos) (F. B. Perler, S. Kumar, H. Kong, Adv. en Prot. Chem. 48, 377-430 (1996)). El mutante correspondiente de la Taq ADN polimerasa I, E615A, pudo incorporar ribonucleótidos en productos de PCR de manera más eficaz que la polimerasa de tipo natural. Sin embargo, usando sustratos de tipo natural, sólo puede sintetizar fragmentos cortos y no el gen de la Taq de longitud completa, tal como se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa. Por tanto, sería difícil seleccionar esta mutación mediante CSR. En otro experimento de selección en el que se evoluciona la beta-glucuronidasa en una \beta-galactosidasa, se obtiene el fenotipo deseado tras varias rondas de selección pero a expensas de la actividad catalítica. Se encuentra también que las variantes seleccionadas en las rondas iniciales de selección pueden catalizar la conversión de varios sustratos diferentes no utilizados por cualquier enzima original y a velocidades catalíticas muy bajas (T. A. Steitz, J Biol Chem 274,
17395-8 (1999)).

Con el fin de tratar el problema de poder seleccionar variantes de polimerasas con baja actividad catalítica o procesividad tal como puede producirse a lo largo de una trayectoria evolutiva hasta un fenotipo deseado, se emplea una variante de la CSR, en la que sólo se aleatoriza y se replica una pequeña región (un "tramo") del gen en investigación. La técnica se denomina "CSR de tramos cortos" (spCSR, "short-patch CSR"). La spCSR permite que las polimerasas menos activas o procesivas se enriquezcan todavía durante una ronda de selección disminuyendo la ventaja selectiva dada a mutantes sumamente activos o procesivos. Este método expande el método descrito previamente de autorreplicación compartimentalizada, pero, debido a que no se replica el gen completo, el método de tramos cortos también es útil por ejemplo para investigar dominios específicos independientes del resto de la proteína.

Existen muchas formas de introducir diversidad localizada en un gen, entre estas están la PCR propensa a errores (usando manganeso o bases sintéticas, tal como se describió anteriormente para la biblioteca de Taq polimerasa), selección aleatoria de ADN (C. A. Brautigam, T. A. Steitz, Curr Opin Struct Biol 8, 54-63 (1998); Y. Li, S. Korolev, G.Waksman, EMBO J 17, 7514-25 (1998), mutagénesis de casete (E. Bedford, S. Tabor, C. C. Richardson, Proc Natl Acad Sci USA 94, 479-84 (1997)) y mutagénesis dirigida por oligonucleótidos degenerados (Y. Li, V. Mitaxov, G. Waksman, Proc Natl Acad Sci USA 96, 9491-6 (1999); M. Suzuki, D. Baskin, L. Hood, L. A. Loeb, Proc Natl Acad Sci USA 93, 9670-5 (1996)) y sus variantes, por ejemplo mutagénesis dirigida "sticky feet" (J. L. Jestin, P. Kristensen, G. Winter, Angew. Chem. Int. Ed. 38, 1124-1127 (1999)) y mutagénesis al azar mediante amplificación de plásmido completo (T. Oberholzer, M. Albrizio, P. L. Luisi, Chem Biol 2, 677-82 (1995)). Puede usarse exploración de alanina combinatoria (A. T. Haase, E. F. Retzel, K. A. Staskus, Proc Natl Acad Sci USA 87, 4971-5 (1990)) para generar variantes de bibliotecas para determinar qué residuos de aminoácido son funcionalmente importantes.

Los datos estructurales (M. J. Embleton, G. Gorochov, P. T. Jones, G. Winter, Nucleic Acids Res 20, 3831-7 (1992)), de alineamiento de secuencias (D. S. Tawfik, A. D. Griffiths, Nat. Biotechnol. 16, 652-656 (1998)) y bioquímicos a partir de los estudios de la ADN polimerasa I revelan regiones del gen implicadas en la unión a nucleótidos y catálisis. Varias posibles regiones para seleccionar como diana incluyen las regiones 1 hasta 6, tal como se trata en (D. S. Tawfik, A. D. Griffiths, Nat. Biotechnol. 16, 652-656 (1998)) (las regiones 3, 4 y 5 se denominan también motivo A, B y C, respectivamente, en la Taq ADN polimerasa I). Otras posibles regiones seleccionadas como diana serían aquellas regiones conservadas a través de varias especies diversas, aquellas implicadas mediante los datos estructurales en ponerse en contacto con el sustrato de nucleótidos o implicadas en la catálisis o en la proximidad al sitio activo, o cualquier otra región importante para la función polimerasa o unión al sustrato.

Durante una ronda de selección, se requiere que cada variante de bibliotecas replique sólo la región de diversidad. Esto puede lograrse fácilmente proporcionando cebadores en una reacción de PCR que flanquean la región diversificada. Las selecciones por CSR se realizarían esencialmente tal como se describe. Tras la selección por CSR, la región corta que se diversifica y se replica vuelve a introducirse ahora en el gen de partida (u otra estructura genética, por ejemplo, una biblioteca de mutantes del gen original, un gen relacionado, etc.) usando o bien sitios de restricción situados de manera apropiada o bien métodos de recombinación por PCR como selección aleatoria por PCR o mutagénesis Quickchange, etc. Puede repetirse el ciclo de spCSR muchas veces y podrían seleccionarse como diana múltiples regiones de manera simultánea o iterativa con cebadores flanqueantes que amplifican regiones individuales o bien de manera separada o bien de manera inclusiva.

El aumento de la rigurosidad en las selecciones en una spCSR de fase tardía puede ajustare simplemente aumentando la longitud de la secuencia replicada tal como se define por los cebadores flanqueantes hasta la CSR de longitud completa. De hecho, para la selección de la procesividad entre otras, puede ser beneficioso extender el segmento replicado más allá del gen codificante hasta el vector completo usando estrategias análogas a la iPCR (PCR
invertida).

La spCSR puede tener ventajas sobre la CSR de longitud completa no solo cuando se buscan variantes de polimerasas con bajas actividades o procesividades, sino también cuando se mapean regiones diferenciadas de una proteína para detectar mutabilidad, por ejemplo junto con la exploración de alanina combinatoria (A. T. Haase, E. F. Retzel, K. A. Staskus, Proc Natl Acad Sci USA 87, 4971-5 (1990)) para determinar qué residuos de aminoácido son funcionalmente importantes. Tal información puede ser útil en una fase tardía para guiar enfoques semirracionales, es decir, para seleccionar como diana la diversidad en residuos/regiones no implicadas en la actividad polimerasa central. Además, puede usarse la spCSR para trasplantar segmentos polipeptídicos entre polimerasas (como con el injerto de CDR de inmunoglobulinas). Un simple cambio de segmentos puede conducir inicialmente a polimerasas poco activas debido a choques estéricos y puede requerir "reconformación" para integrar segmentos funcionalmente. La reconformación puede realizarse usando o bien CSR de longitud completa (por ejemplo, a partir de bibliotecas de mutantes al azar existentes) o bien spCSR dirigida a regiones secundarias ("zona de Vernier" en anticuerpos).

También puede localizarse tramos cortos en el extremo o bien N-terminal o bien C-terminal como extensiones de las secuencias del gen de la polimerasa existentes o como inserciones internas. Existen en la naturaleza precedentes para tales extensiones e inserciones modificadoras del fenotipo. Por ejemplo, tanto una extensión C-terminal de la ADN pol de T5 como la inserción de unión a tiorredoxina en la ADN pol de T7 son críticas para la procesividad en estas enzimas y les permiten replicar de manera eficaz los genomas del fago T grandes (> 30 kb). También se ha mostrado que las extensiones N o C-terminales potencian la actividad en otras enzimas.

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Ejemplo 26 CSR a baja temperatura usando el fragmento Klenow

Se clonó el fragmento Klenow de ADN genómico de E. coli en el vector de expresión pASK75 (como con Taq) y se expresó en la cepa DH5\alphaZ1 de E. coli (Lutz R. & Bujard H. (1997), Nucleic Acids Res 25, 1203). Se lavaron las células y se resuspendieron en Tris 10 mM pH 7,5. Se añadieron 2x10^{8} células resuspendidas (20 \mul) a 200 \mul de tampón de PCR a baja temperatura (LTP) (Iakobashvili, R. & Lapidot, A. (1999), Nucleic Acids Res., 27, 1566) y se emulsionaron tal como se describió (Ghadessy et al. (2001), PNAS, 98, 4552). LTP era Tris 10 mM (pH 7,5), L-prolina 5,5 M, glicerol al 15% p/v, MgCl_{2} 15 mM + cebadores adecuados (ya que la prolina disminuye la temperatura de fusión, los cebadores necesitan ser de 40-meros o más largos) y dNTP y se emulsionó tal como se describió. La ciclación de la PCR a baja temperatura fue 70ºC 10 min., 50x (70ºC 30 s, 37ºC 12 min.). Se extrajo la fase acuosa tal como se describió y se reamplificaron los productos de selección purificados tal como se describió (Ghadessy et al., (2001) PNAS, 98, 4552).

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TABLA 3 Secuencias de los cebadores usados en los ejemplos

3

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Clon T7-88 termoestable: secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 14)

4

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Clon T7-88 termoestable: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 15)

5

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Clon T9 termoestable: secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 16)

6

7

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Clon T9 termoestable: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 17)

8

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Clon T13 termoestable: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 18)

9

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Clon 8(T8) termoestable: secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 19)

10

11

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Clon 8(T8) termoestable: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 20)

12

\hskip1.2cm

Nota: los primeros dos aminoácidos en el extremo N-terminal no están secuenciados

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Clon 94 resistente a heparina: secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 21)

13

14

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Clon H94 resistente a heparina: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 22)

15

\hskip1.2cm

Nota: no se determinan 5 aminoácidos N-terminales.

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\hskip1.2cm

Clon 15 resistente a heparina: secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 23)

16

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\hskip1.2cm

Clon 15 resistente a heparina: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 24)

17

\hskip1.2cm

Nota: no se determinan 5 aminoácidos N-terminales.

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\hskip1.2cm

Clon M1 de extensión del apareamiento erróneo: secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 25)

100

18

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\hskip1.2cm

Clon M1 de extensión del apareamiento erróneo: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 26)

19

\hskip1.2cm

Nota: no se determinan 2 aminoácidos N-terminales.

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\hskip1.2cm

Clon M4 de extensión del apareamiento erróneo: secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 27)

20

21

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\hskip1.2cm

Clon M4 de extensión del apareamiento erróneo: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 28)

22

\hskip1.2cm

Nota: no se determinan 6 aminoácidos N-terminales.

Claims (21)

1. Método para aumentar la concentración de una molécula de ácido nucleico, comprendiendo dicho método:

(a) formar una emulsión de agua en aceite estable al calor, que comprende microcompartimentos acuosos encapsulados que tienen una densidad superior a 10^{9} microcompartimentos por ml;

(b) incluir dentro de una pluralidad de dichos microcompartimentos un ácido nucleico y una disolución acuosa que comprende los componentes necesarios para realizar la amplificación del ácido nucleico mediante la reacción en cadena de la polimerasa, incluyendo dichos componentes una polimerasa termoestable; y

(c) realizar una ciclación térmica para efectuar la amplificación de dicho ácido nucleico para producir copias amplificadas de dicho ácido nucleico, aumentando de ese modo la concentración de dicho ácido nucleico,

en el que la polimerasa termoestable tiene una termoestabilidad aumentada en comparación con la correspondiente enzima de tipo natural, resistencia a la heparina aumentada en comparación con la correspondiente enzima de tipo natural o puede extender un cebador que tiene un apareamiento erróneo en 3'.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende además proporcionar dentro de una pluralidad de dichos microcompartimentos una perla y medios para unir los fragmentos de ácido nucleico producidos por dicha reacción en cadena de la polimerasa a dicha perla; y transferir dichos fragmentos de PCR a dicha perla.

3. Método según la reivindicación 2, en el que la perla comprende una perla de poliestireno.

4. Método según la reivindicación 2 ó 3, en el que la perla comprende un recubrimiento de estreptavidina u oligonucleótidos.

5. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el ácido nucleico comprende una etiqueta de biotina.

6. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que dichos componentes requeridos para realizar la amplificación del ácido nucleico mediante la reacción en cadena de la polimerasa incluyen cebadores biotinilados.

7. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que dicha emulsión es estable durante al menos veinte ciclos de PCR.

8. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la razón de fases de agua en aceite es de entre 1:2 y 1:4.

9. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que dicha emulsión de agua en aceite incluye un estabilizador de la emulsión.

10. Método según la reivindicación 9, en el que dicho estabilizador de la emulsión es un tensioactivo no iónico.

11. Método según la reivindicación 10, en el que el estabilizador de la emulsión se selecciona de monooleato de sorbitano, monooleato de polioxietilensorbitano y octilfenoxipolietoxietanol.

12. Método según la reivindicación 10, en el que el estabilizador de la emulsión se selecciona de Span 80, Tween 80 y Triton X-100.

13. Método según la reivindicación 9, en el que el estabilizador de la emulsión es un tensioactivo aniónico.

14. Método según la reivindicación 13, en el que el estabilizador de la emulsión se selecciona de colato de sodio, taurocolato de sodio, glicocolato de sodio y desoxicolato de sodio.

15. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho ácido nucleico es ADN genómico o ADNc.

16. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que cada compartimento contiene en promedio una o menos de una molécula de ácido nucleico.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que cada compartimento contiene en promedio entre 5 y 1000 moléculas de ácido nucleico.

18. Método según cualquier reivindicación anterior, que comprende además subdividir una biblioteca de ácidos nucleicos en dichos microcompartimentos.

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19. Método según la reivindicación 2, la reivindicación 3 o la reivindicación 4, que comprende además agrupar las perlas de los microcompartimentos y analizar el ácido nucleico amplificado para determinar la presencia de una cierta mutación o alelo.

20. Método según la reivindicación 2, la reivindicación 3 o la reivindicación 4, que comprende además clasificar las perlas individuales para la secuenciación.

21. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el ácido nucleico se suministra a un compartimento suministrando una célula que contiene el ácido nucleico a dicho compartimento.