ES2274901T3 - Procedimiento de evolucion dirigida. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la selección de un enzima capaz de amplificar un ácido nucleico a partir de un molde, comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes: a) proporcionar un conjunto de ácidos nucleicos que comprende unos elementos que codifican un enzima que es capaz de amplificar ácidos nucleicos a partir de un molde o una variante del enzima; b) subdividir el conjunto de ácidos nucleicos en microcápsulas, de manera que cada microcápsula comprende un elemento ácido nucleico del conjunto junto con el enzima o la variante codificada por el elemento ácido nucleico; c) dejar que se produzca la replicación del ácido nucleico; y d) detectar la replicación del elemento ácido nucleico por parte del enzima.
Description
Procedimiento de evolución dirigida.
La presente invención se refiere a
procedimientos para la utilización en la evolución in vitro
de bibliotecas moleculares. Particularmente, la presente invención
se refiere a procedimientos de selección de ácidos nucleicos que
codifican productos génicos, en los que el ácido nucleico y la
actividad del producto génico codificado se encuentran ligados
mediante compartimentación.
La evolución requiere la generación de
diversidad genética (diversidad de ácidos nucleicos) seguida de la
selección de los ácidos nucleicos que codifican características
beneficiosas. Debido a que la actividad de los ácidos nucleicos y
sus productos génicos codificados se encuentran físicamente ligados
en los organismos biológicos (codificando los ácidos nucleicos el
molde molecular de las células en las que se encuentran confinados),
las alteraciones del genotipo que resultan en uno o más cambios
adaptativos del fenotipo producen beneficios para el organismo,
resultando en mayores supervivencia y descendencia. De esta manera,
múltiples rondas de mutación y de selección pueden resultar en un
enriquecimiento progresivo de los organismos (y del genotipo
codificante) con una adaptación creciente a una condición de
selección dada. Los sistemas in vitro para la evolución
rápida de los ácidos nucleicos o de las proteínas deben imitar este
proceso a nivel molecular, en el sentido de que el ácido nucleico y
la actividad del producto génico codificado deben encontrarse
ligados y la actividad del producto génico debe ser
seleccionable.
Las tecnologías de selección in vitro
representan un campo en rápida expansión y con frecuencia resultan
más poderosas que el diseño racional para la obtención de
biopolímeros con las propiedades deseadas. En la pasada década, los
experimentos de selección utilizando, por ejemplo, la tecnología de
expresión en fago o las tecnologías SELEX, han proporcionado muchos
nuevos polinucléotidos y ligandos polipéptidos. La selección para la
catálisis ha demostrado ser más difícil. Entre las estrategias
utilizadas, se incluyen la unión de análogos de estado de
transición, el enlace covalente a inhibidores suicidas, el
acoplamiento por proximidad y el enlace covalente de producto.
Aunque estos enfoques se centran sólo en una etapa particular del
ciclo enzimático, se han conseguido algunos éxitos. Finalmente, sin
embargo, sería deseable la selección directamente para el recambio
catalítico. De hecho, un simple cribado para recambio catalítico de
bibliotecas mutantes bastante pequeñas ha resultado
considerablemente más exitoso que los diversos enfoques de selección
y ha proporcionado algunos catalizadores con velocidades catalíticas
significantemente mejoradas.
Aunque las polimerasas representan un
prerrequisito para las tecnologías que definen la biología
molecular, es decir, la mutagénesis sitio-dirigida,
la clonación de ADNc y en particular la secuenciación de Sanger y la
PRC, con frecuencia adolecen de serias desventajas, debido al hecho
de que se les pide que realicen tareas para las que no han sido
optimizadas por la naturaleza. Aparentemente, se han realizado pocos
intentos para mejorar las propiedades de las polimerasas disponibles
en la naturaleza y de adaptarlas a aplicaciones específicas mediante
la ingeniería de proteínas. Los avances técnicos han sido en gran
parte periféricos, y entre ellos se incluyen la utilización de
polimerasas procedentes de un abanico más amplio de organismos, de
sistemas de tampones y de aditivos, así como de mezclas de
enzimas.
Tradicionalmente, los intentos de mejorar las
propiedades de las polimerasas se han basado en la ingeniería de
proteínas. Por ejemplo, las variantes de la polimerasa Taq
(por ejemplo, el fragmento Stoffel y el Klentaq) han sido generadas
mediante una eliminación total o parcial de su dominio
5'-3' exonucleasa y muestran una termoestabilidad y
una fidelidad mejoradas, aunque a costa de una procesividad reducida
(Barnes 1992, Gene 112:29-35; Lawyer et
al., 1993, PCR Methods and Applications 2:275). Además,
la disponibilidad de estructuras de alta resolución para proteínas
ha permitido el diseño racional de mutantes con propiedades
mejoradas (por ejemplo, los mutantes de la Taq con
propiedades mejoradas de incorporación de dideoxinucleótidos en la
secuenciación cíclica (Li et al., 1999, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 96:9491). Los enfoques genéticos in vivo se han
utilizado también para el diseño de proteínas, por ejemplo mediante
la complementación de una cepa polA^{-} para la selección de
polimerasas activas de entre repertorios de polimerasas mutantes
(Suzuki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9670,
1996). Sin embargo, el enfoque de la complementación genética
resulta limitado para las propiedades que pueden seleccionarse.
Algunos avances recientes de la biología
molecular han permitido la coselección in vitro de algunas
moléculas según sus propiedades, conjuntamente con los ácidos
nucleicos que las codifican. Los ácidos nucleicos seleccionados
pueden, posteriormente, clonarse para un análisis o utilización
adicional, o someterse a rondas adicionales de mutación y selección.
La creación de grandes bibliotecas de ácidos nucleicos representa
una tarea común a todos estos procedimientos. Las moléculas que
presentan las características (la actividad) deseadas pueden
aislarse mediante regímenes de selección que seleccionan para la
actividad deseada del producto génico codificado, tal como la
actividad bioquímica o biológica deseada, por ejemplo actividad de
unión.
El documento WO 99/02671 y Tawfik D. y Griffiths
A. D., Nature Biotech. 16:652, 1998, describen un
procedimiento para el aislamiento de uno o más elementos genéticos
que codifican un producto génico que presenta una actividad deseada.
En primer lugar, los elementos genéticos se compartimentan en
microcápsulas, y luego se transcriben y/o se traducen para la
producción de sus productos génicos respectivos (ARN o proteínas) en
el interior de las microcápsulas. Alternativamente, los elementos
genéticos se encuentran contenidos en el interior de una célula
huésped, en la que tiene lugar la transcripción y/o la traducción
(expresión) del producto génico y las células huésped en primer
lugar se compartimentan en microcápsulas. Posteriomente, se separan
los elementos genéticos que producen el producto génico con la
actividad deseada. El procedimiento descrito en el documento WO
99/02671 depende de que el producto génico modifique catalíticamente
la microcápsula o el elemento genético (o ambos), de manera que el
enriquecimiento de la entidad o entidades modificados permita la
selección de la actividad deseada.
Suzuki et al., (1996) PNAS
93:9670-9675, y los documentos WO 98/23733 y
94/26766 describen la mutagénesis aleatoria de las ADN polimerasas
que conduce a una termoestabilidad mejorada, y ADN polimerasas que
presentan una termoestabilidad mejorada.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente
invención, se proporciona un procedimiento para la selección de un
enzima capaz de amplificar el ácido nucleico a partir de un molde,
comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes: (a)
proporcionar un conjunto de ácidos nucleicos que comprende elementos
que codifican un enzima capaz de amplificar ácidos nucleicos a
partir de un molde o de una variante del enzima; (b) subdividir el
conjunto de ácidos nucleicos en microcápsulas, de manera que cada
microcápsula comprenda un elemento de ácido nucleico del conjunto,
junto con el enzima replicasa del ácido nucleico o variante
codificada por el elemento ácido nucleico; (c) permitir que se
produzca la replicación del ácido nucleico; y (d) detectar la
replicación del elemento ácido nucleico por parte del enzima.
Se proporciona, de acuerdo con un segundo
aspecto de la presente invención, un procedimiento de selección de
un polipéptido capaz de modificar la actividad de una reacción
enzimática que es capaz de amplificar el ácido nucleico a partir de
un molde, comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes: (a)
proporcionar un enzima capaz de amplificar el ácido nucleico a
partir de un molde; (b) proporcionar un conjunto de ácidos nucleicos
que comprende elementos que codifican uno o más polipéptidos
candidatos; (c) subdividir el conjunto de ácidos nucleicos en
microcápsulas, de manera que cada microcápsula comprenda un elemento
ácido nucleico del conjunto, el polipéptido codificado por el
elemento ácido nucleico, y el enzima; y (d) detectar la replicación
del elemento ácido nucleico por parte del enzima.
Preferentemente, el polipéptido es un promotor
de la actividad enzimática. El polipéptido puede ser un enzima,
preferentemente una quinasa o una fosforilasa, capaz de actuar sobre
el enzima, modificando su actividad. El polipéptido puede ser un
chaperón implicado en el plegamiento o en el ensamblamiento del
enzima o puede resultar necesario para el mantenimiento de la
función de la replicasa (por ejemplo, telomerasa, HSP 90).
Alternativamente, el polipéptido puede estar implicado en una ruta
metabólica, presentando dicha ruta, como producto final, un sustrato
que se encuentra implicado en una reacción de replicación. Además,
el polipéptido puede ser cualquier enzima capaz de catalizar una
reacción que modifica un agente inhibidor (natural o artificial) del
enzima, de manera que se reduce o se anula su actividad inhibidora.
Finalmente, el polipéptido puede estimular la actividad NAP de una
manera no catalítica, por ejemplo, mediante la asociación con el
enzima o con su sustrato, etc. (por ejemplo, los factores de
procesividad en el caso de las ADN polimerasas, por ejemplo la ADN
polimerasa de T7 y la tiorredoxina).
Los enzimas capaces de amplificar los ácidos
nucleicos a partir de un molde pueden ser, por ejemplo, moléculas de
enzima de polipéptido o de ácido ribonucleico. En una forma de
realización particularmente preferida, el enzima según la presente
invención es un enzima replicasa, es decir, un enzima capaz de
amplificar ácido nucleico a partir de un molde, tal como, por
ejemplo, un enzima polimerasa (o ligasa). En una forma de
realización preferida de la presente invención, la amplificación del
ácido nucleico resulta de más de una ronda de replicación de ácido
nucleico. Preferentemente, la amplificación del ácido nucleico es
una amplificación exponencial.
Preferentemente, la reacción de amplificación se
selecciona de entre las siguientes: una reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), una reacción en cadena de la
transcriptasa-polimerasa inversa
(RT-PCR), una PCR anidada, una reacción en cadena de
la ligasa (LCR), un sistema de amplificación basado en la
transcripción (TAS), una replicación autosostenida de secuencia
(3SR), NASBA, una reacción de amplificación mediada por
transcripción (TMA), y una amplificación por desplazamiento de
cadena (SDA).
En una forma de realización particularmente
preferida, el número de copia del elemento ácido nucleico, tras la
amplificación, resulta sustancialmente proporcional a la actividad
de la replicasa, a la actividad de un polipéptido requerido y a la
afinidad de unión del primer y segundo polipéptidos.
La replicación de los ácidos nucleicos puede
detectarse mediante ensayo del número de copia del elemento ácido
nucleico. Alternativamente, o adicionalmente, la replicación de los
ácidos nucleicos puede detectarse determinando la actividad de un
polipéptido codificado por el elemento ácido nucleico.
En una forma de realización altamente preferida,
las condiciones en la microcápsula se ajustan para que seleccionen
para una replicasa o un polipéptido activos bajo dichas condiciones,
o para una pareja de polipéptidos capaces de una interacción estable
bajo dichas condiciones.
Preferentemente, la replicasa presenta actividad
de polimerasa, de transcriptasa inversa o de ligasa.
El polipéptido puede proporcionarse desde el
ácido nucleico mediante transcripción y traducción in vitro.
Alternativamente, el polipéptido puede proporcionarse desde un ácido
nucleico in vivo en un huésped de expresión.
En una forma de realización preferida, las
microcápsulas están constituidas por el componente acuoso
encapsulado de una emulsión de agua en aceite. Preferentemente, la
emulsión de agua en aceite se prepara mediante la emulsificación de
una fase acuosa con una fase oleosa en presencia de un surfactante,
que comprende Span 80 al 4,5% v/v, Tween 80 al 0,4% v/v, y Triton
X100 al 0,1% v/v, o en presencia de un surfactante que comprende
Span 80, Tween 80 y Triton X100 en sustancialmente las mismas
proporciones. Preferentemente, la proporción de las fases
agua:aceite es de 1:2, lo que conduce a un tamaño de gota adecuado.
Estas emulsiones presentan una estabilidad térmica superior a la de
emulsiones más ricas en aceite.
Preferentemente, el procedimiento según la
presente invención puede utilizarse para la selección de enzimas
replicasa que presentan una termoestabilidad superior a la
termoestabilidad de un enzima correspondiente no seleccionado. Más
preferentemente, el enzima replicasa es una polimerasa Taq
que presenta una semivida incrementada en más de 10 veces, comparada
con la semivida de la Polimerasa Taq de tipo salvaje, a
97,5°C.
El enzima replicasa puede presentar una mayor
tolerancia a la heparina que un enzima no seleccionado.
Preferentemente, el enzima replicasa es una polimerasa Taq,
activa a una concentración de 0,083 unidades/\mul o superior de
heparina.
El enzima replicasa puede ser capaz de extender
un cebador que presenta un desapareamiento 3'. Preferentemente, el
desapareamiento 3' es un desapareamiento 3'
purina-purina o un desapareamiento 3'
pirimidina-pirimidina. Más preferentemente, el
desapareamiento 3' es un desapareamiento A-G o un
desapareamiento C-C.
Por ejemplo, el procedimiento de la presente
invención puede utilizarse para la selección de un mutante de la
polimerasa Taq que comprende las mutaciones (sustituciones de
aminoácidos): F73S, R205K, K219E, M236T, E434D y A608V.
Por ejemplo, el procedimiento de la presente
invención puede utilizarse para la selección de un mutante de la
polimerasa Taq que comprende las mutaciones (sustituciones de
aminoácidos): K225E, E388V, K540R, D578G, N583S y M747R.
Por ejemplo, el procedimiento de la presente
invención puede utilizarse para la selección de un mutante de la
polimerasa Taq que comprende las mutaciones (sustituciones de
aminoácidos): G84A, D144G, K314R, E520G, A608V, E742G.
Por ejemplo, el procedimiento de la presente
invención puede utilizarse para la selección de un mutante de la
polimerasa Taq que comprende las mutaciones (sustituciones de
aminoácidos): D58G, R74P, A109T, L245R, R343G, G370D, E520G, N583S,
E694K, A743P.
La presente invención utiliza, ventajosamente,
una emulsión de agua en aceite que se puede obtener mediante la
emulsificación de una fase acuosa con una fase oleosa en presencia
de un surfactante que comprende Span 80 al 4,5% v/v, Tween 80 al
0,4% v/v y Triton X100 al 0,1% v/v, o en presencia de un surfactante
que comprende Span 80, Tween 80 y Triton X100 en sustancialmente las
mismas proporciones. Preferentemente, la proporción entre las fases
de agua:aceite es de 1:2. Aparentemente, esta proporción permite la
difusión de los dNTP (y presumiblemente, de otras moléculas
pequeñas) entre las microcápsulas a temperaturas superiores, lo que
resulta beneficioso para algunas aplicaciones, pero no para otras.
La difusión puede controlarse mediante el incremento de la
proporción de las fases agua:aceite a 1:4.
La figura 1A es un diagrama que muestra una
forma de realización de un procedimiento según la presente
invención, tal como se aplica a la selección de una polimerasa de
evolución autónoma, en la que el número de copia génicas se
encuentra relacionado con el recambio enzimático.
La figura 1B es un diagrama que muestra un
esquema general de la autorreplicación compartimentada (CSR): 1) se
clona y se expresa en E. coli un repertorio de genes de
polimerasa diversificados. Las esferas representan moléculas de
polimerasa activas. 2) Las células bacterianas que contienen la
polimerasa y los genes codificantes se suspenden en un tampón de
reacción que contiene cebadores flanqueantes y nucleótidos
trifosfatos (dNTP) y se segregan en compartimientos acuosos. 3) El
enzima polimerasa y los genes codificantes se liberan de la célula,
permitiendo que se produzca la autorreplicación. Las polimerasas de
baja actividad (hexágono blanco) no consiguen replicar su gen
codificante. 4) Se liberan los genes de polimerasa
"descendientes", se rediversifican y se clonan nuevamente en
otro ciclo de CSR.
La figura 2 es un diagrama que muestra los
compartimientos acuosos de la emulsión termoestable que contiene
células de E. coli que expresan la proteína verde
fluorescente (GFP) previamente a (A, B) y posteriormente al
termociclado (C), tal como se visualiza mediante un microscopio
óptico. Las imágenes (A, B) representan la misma fotografía. La
imagen (A) se visualiza a 535 nm para observar la fluorescencia GFP
y la imagen (B) se visualiza en luz visible, para observar las
células bacterianas dentro de los compartimientos. El carácter
borroso de las bacterias fluorescentes en la imagen (A) se debe al
movimiento browniano durante la exposición. Las dimensiones medias
de los compartimientos, según se determinan mediante difracción
láser, se proporcionan posteriormente.
La figura 3A es un diagrama que muestra el cruce
entre compartimientos de emulsión. Se amplifican de manera
individual o conjunta dos reacciones PCR estándar, que difieren en
el tamaño del molde (PCR1 (0,9 kb), PCR2 (0,3 kb)) y en presencia de
Taq (PCR1: + Taq, PCR2: sin enzima). Cuando se
combinan en solución, se amplifican ambos moldes. Cuando se
emulsionan separadamente, previamente al mezclado, sólo se amplifica
la PCR1. M: marcador HaeIII de \PhiX174.
La figura 3B es un diagrama que muestra el cruce
entre compartimientos de emulsión. Las células bacterianas que
expresan la polimerasa Taq de tipo salvaje (2,7 kb) o el
fragmento Stoffel de la polimerasa Taq (de baja actividad
bajo las condiciones del tampón) (1,8 kb) se mezclan en una
proporción 1:1 previamente a la emulsificación. En solución, se
amplifica preferentemente el fragmento Stoffel, que es más corto. En
emulsión predominantemente se produce la amplificación del gen de la
Taq de tipo salvaje y una amplificación débil del fragmento
Stoffel (flecha). M: marcador HindIII de \lambda.
La figura 4 es un diagrama que muestra detalles
de una forma de realización de un procedimiento según la presente
invención, según se aplica a la selección de una polimerasa de
desarrollo autónomo.
La figura 5 es un diagrama que muestra detalles
de una forma de realización de un procedimiento según la presente
invención con el fin de seleccionar la incorporación de sustratos
nuevos o no usuales.
La figura 6 es un diagrama que muestra la
selección de ARN que presenta actividad catalítica (intermolecular)
utilizando los procedimientos de la presente invención.
La figura 7 es un diagrama que muestra un modelo
de un complejo de Taq-ADN.
La figura 8: A: esquema general de una reacción
CSR cooperativa.
El nucleósido difosfato quinasa (ndk) se expresa
desde un plásmido y convierte los desoxinucléosidos difosfato que no
son sustratos para la polimerasa Taq, en desoxinucléosidos
trifosfatos, que sí representan sustratos para la poli-
merasa Taq. Tan pronto como ndk ha producido cantidades suficientes de sustrato, la Taq puede replicar el gen ndk.
merasa Taq. Tan pronto como ndk ha producido cantidades suficientes de sustrato, la Taq puede replicar el gen ndk.
B: las células bacterianas que expresan la ndk
de tipo salvaje (0,8 kb) o un fragmento truncado inactivo (0,5 kb)
se mezclan en la proporción 1:1 previamente a la emulsificación. En
solución, se amplifica, preferentemente, el fragmento truncado, que
es más corto. En emulsión, se amplifica preferentemente el gen ndk
de tipo salvaje y el fragmento truncado sólo se amplifica débilmente
(flecha), indicando que en emulsión sólo se amplifican los genes ndk
activos que producen sustrato. M: marcador HaeIII de
\PhiX174.
La práctica de la presente invención utilizará,
a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de
química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante e
inmunología, que se encuentran comprendidas dentro de los
conocimientos del experto en la materia. Dichas técnicas se
encuentran descritas en la literatura (ver, por ejemplo, J.
Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª edición, Libros 1-3, Cold
Spring Harbor Laboratory Press; B. Roe, J. Crabtree y A. Kahn, 1996,
DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley &
Sons; J. M. Polak and James O'D. MacGee, 1990, In situ
Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M.
J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical
Approach, Irl. Press; y D. M. J. Lilley y J. E. Dahlberg, 1992,
Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical
Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press).
La presente invención describe una nueva
tecnología de selección, denominada CSR (autorreplicación
compartimentada). Esta tecnología presenta el potencial de
expandirse a un sistema genérico de selección para la catálisis, así
como para las interacciones macromoleculares.
La CSR, en su forma más simple, implica la
segregación de los genes que codifican y dirigen la producción de
ADN polimerasas en el interior de compartimientos acuosos discretos,
espacialmente separados, de una nueva emulsión termoestable de agua
en aceite. Con la provisión de nucleótidos trifosfato y cebadores
flanqueantes apropiados, las polimerasas replican sólo sus propios
genes. Consecuentemente, sólo se replican los genes que codifican
polimerasas activas, mientras que las variantes inactivas que no
pueden copiar sus genes, desaparecen del conjunto de genes. Por
analogía a los sistemas biológicos, entre las variantes adaptadas
diferencialmente, la más activa (la más adecuada) produce la mayor
"descendencia", correlacionando directamente, de esta manera,
el número de copia posterior a la selección y el recambio
enzimático.
La CSR no se encuentra limitada a las
polimerasas sino que puede aplicarse a una gran diversidad de
transformaciones enzimáticas, construidas alrededor del "motor
replicasa". Por ejemplo, se puede seleccionar un enzima que
alimente una polimerasa que, a su vez, replique sus genes. Resulta
posible concebir esquemas más complejos de reacciones cooperativas
acopladas en las que varios enzimas producen sustratos de replicasa
o consumen inhibidores de replicasa.
Las polimerasas desempeñan un papel central en
el mantenimiento del genoma, y en la transmisión y la expresión de
la información genética. Asimismo, las polimerasas se encuentran en
el corazón de la biología moderna, dando lugar a tecnologías
cruciales, tales como la mutagénesis, las bibliotecas de ADNc, la
secuenciación y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Sin
embargo, las polimerasas comúnmente utilizadas con frecuencia
adolecen de serias desventajas, debido a que se utilizan para
realizar tareas para las que no han sido optimizadas por la
naturaleza. De hecho, la mayor parte de los avances han sido
periféricos, entre ellos la utilización de las polimerasas de
diferentes organismos, la mejora de los sistemas tamponadores y de
aditivos, así como las mezclas de enzimas. La CSR es un nuevo
sistema de selección idóneo para el aislamiento de polimerasas "de
diseño" para aplicaciones específicas. Muchas características de
la función polimerasa pueden "mejorarse" (por ejemplo, la
procesividad, la selección del sustrato, etc.). Además, la CSR
representa una herramienta para el estudio de la función polimerasa,
por ejemplo para sondear zonas inmutables, para estudiar componentes
del replisoma, etc. Además, la CSR puede utilizarse para la
clonación funcional directa de polimerasas, directamente desde
diversas poblaciones microbianas no cultivadas.
La CSR representa un nuevo principio de
selección de repertorio de polipéptidos. Los enfoques anteriores
presentaban diversos procedimientos de "expresión" en los que
el fenotipo y el genotipo (el polipéptido y los genes codificantes)
se encuentran ligados como parte de un "paquete genético" que
contiene los genes codificantes y que expresa el polipéptido en el
"exterior". La selección se realiza mediante una etapa de
purificación de afinidad, después de la cual los clones
supervivientes se cultivan (amplifican) en células para llevar a
cabo rondas de selección adicionales (con sesgos resultantes en las
selecciones distorsionadoras del crecimiento). Resultan distorsiones
adicionales de las diferencias de eficiencia de expresión de los
diferentes polipéptidos.
En otro grupo de procedimientos, tanto los
polipéptidos como los genes codificantes se "empaquetan" en el
interior de una célula. La selección ocurre in vivo mediante
la modificación de la célula por parte del polipéptido, de manera
que dicha célula adquiere un nuevo fenotipo, por ejemplo el
crecimiento en presencia de un antibiótico. Al aplicar la presión de
selección a las células completas, estos enfoques tienden a generar
falsos positivos. Además, las estrategias de complementación in
vivo resultan limitadas, ya que las condiciones de selección, y
por lo tanto los fenotipos seleccionables, no pueden elegirse
libremente y se encuentran limitados además por los límites de la
viabilidad del huésped.
En la CSR no existe una conexión física directa
(covalente o no covalente) entre el polipéptido y el gen
codificante. Se "cultivan" más copias de genes exitosos in
vitro y directamente, como parte del proceso de selección.
La CSR puede aplicarse a un amplio abanico de
ADN polimerasas y ARN polimerasas, de hecho a todos los polipéptidos
(o polinucleótidos) implicados en la replicación o en la expresión
génica. La CSR puede aplicarse también a las ADN ligasas y a las ARN
ligasas, ensamblando sus genes desde fragmentos
oligonucleótidos.
La CSR es el único sistema de selección en el
que la velocidad de recambio de un enzima se encuentra directamente
ligada al número de copia posterior a la selección de su gene
codificante.
Existe un gran interés en los polímeros
polinucleótidos con bases alteradas, con azúcares alterados o
incluso con químicas del esqueleto alteradas. Sin embargo,
habitualmente la síntesis en fase sólida sólo puede proporcionar
polímeros relativamente cortos y no es inesperado que las
polimerasas naturales incorporen mal la mayoría de análogos. La CSR
resulta idónea para la selección de polimerasas más tolerantes a los
sustratos no naturales, con el fin de preparar polímeros
polinucleótidos con propiedades nuevas para la química, la biología
y la nanotecnología (por ejemplo, filamentos de ADN).
Finalmente, la emulsión termoestable
desarrollada para la CSR presenta aplicaciones propias. Con más de
10^{9} microcompartimientos/ml, la emulsión PCR (ePCR) ofrece la
posibilidad de una multiplexación de la PCR en paralelo a una escala
sin precedentes, con potenciales aplicaciones desde el análisis de
la conexión génica hasta la construcción de repertorios genómicos
directamente a partir de células aisladas. También puede resultar
útil para aplicaciones de PCR diagnóstica a gran escala, tal como la
"PCR digital" (Vogelstein & Kinzler, PNAS
96:9236-9241, 1999). La compartimentación de las
reacciones individuales puede, asimismo, igualar la competencia
entre los diferentes segmentos genéticos que se amplifican, tanto en
la PCR de cebado múltiple como en la PCR de cebado aleatorio,
llevando a una distribución menos sesgada de los productos de
amplificación. La ePCR puede, por lo tanto, proporcionar una
alternativa a la DOP-PCR de genoma completo (y
metodologías relacionadas) o de hecho puede ser utilizada para que
la DOP-PCR (y metodologías relacionadas) resulten
más efectiva.
El sistema de selección según la presente
invención se basa en la autorreplicación en un sistema
compartimentado. La presente invención se basa en el hecho de que
las replicasas activas pueden replicar ácidos nucleicos (en
particular sus secuencias codificantes), mientras que las replicasas
inactivas no pueden. Por lo tanto, en los procedimientos de la
presente invención, se proporciona un sistema compartimentado en el
que una replicasa presente en un compartimiento resulta
sustancialmente incapaz de actuar sobre cualquier otro molde aparte
de sobre los presentes en ese compartimiento; en particular, no
puede replicar un molde dentro de cualquier otro compartimiento. En
formas de realización altamente preferidas, el ácido nucleico de
molde presente en el interior del compartimiento codifica la
replicasa. De esta manera, la replicasa no puede replicar ninguna
otra secuencia aparte de su propia secuencia codificante; la
replicasa se encuentra, por lo tanto, "ligada" a su secuencia
codificante. Como resultado, en las formas de realización altamente
preferidas de la presente invención, la concentración final de la
secuencia codificante (es decir, el número de copia) depende de la
actividad del enzima codificado por la misma.
El sistema de selección de la presente
invención, tal como se aplica a la selección de replicasas, presenta
la ventaja de que vincula el recambio catalítico (K_{cat}/K_{m})
al número de copia del gen codificante del catalizador
posteriormente a la selección. De esta manera, la compartimentación
ofrece la posibilidad de ligar fenotipo y genotipo de un enzima
replicasa, tal como se describe con mayor detalle a continuación,
mediante una reacción enzimática acoplada que implica como una de
sus etapas la replicación del gen o genes del enzima o enzimas.
Los procedimientos de la presente invención
utilizan preferentemente bibliotecas de ácidos nucleicos, la
naturaleza y construcción de las cuales se explica con mayor detalle
a continuación. La biblioteca de ácidos nucleicos comprende un
conjunto de ácidos nucleicos diferentes, que codifican variantes de
una entidad particular (la entidad que se debe seleccionar). De esta
manera, por ejemplo, tal como se utilizan para la selección de las
replicasas, los procedimientos de la presente invención utilizan una
biblioteca o un conjunto de ácidos nucleicos que contiene elementos
que codifican la replicasa o variantes de la replicasa. Cada una de
las entidades codificada por los distintos elementos de la
biblioteca presenta propiedades diferentes, por ejemplo, una
tolerancia variable al calor o a la presencia de moléculas pequeñas
inhibidoras, o tolerancia del desapareamiento de pares de bases (tal
como se explica con mayor detalle posteriormente). La población de
variantes de ácido nucleico, por lo tanto, proporciona un material
de partida para la selección y resulta, en muchos aspectos, análoga
a la variación observada en una población natural de organismos
causada por las mutaciones.
Según la presente invención, los diferentes
elementos de la biblioteca o colección de ácidos nucleicos se
encuentran ordenados o compartimentados en una gran cantidad de
compartimientos o microcápsulas. En las formas de realización
preferidas, cada compartimiento contiene sustancialmente un elemento
ácido nucleico del conjunto (en una o diversas copias). Además, el
compartimiento comprende asimismo el polipéptido o polinucleótido
(en una o preferentemente en diversas copias) codificado por dicho
elemento ácido nucleico (sea una replicasa, un polipéptido, etc.,
tal como se comenta posteriormente). La naturaleza de estos
compartimientos resulta en intercambios mínimos, o sustancialmente
en la ausencia de intercambios de macromoléculas (tales como ácidos
nucleicos y polipéptidos) entre los diferentes compartimientos. Tal
como se explica con mayor detalle a continuación, las formas de
realización altamente preferidas de la presente invención utilizan
compartimientos acuosos en el interior de emulsiones de agua en
aceite. Tal como se ha explicado anteriormente, cualquier actividad
de replicasa presente en el compartimiento (mostrada por la
replicasa, modificada por el polipéptido, o mostrada por el
polipéptido que actúa conjuntamente con otro polipéptido) únicamente
puede actuar sobre el molde en el interior del compartimiento.
Las condiciones existentes en el interior de los
compartimientos pueden modificarse con el fin de seleccionar para
los polipéptidos activos bajo estas condiciones. Por ejemplo, cuando
se seleccionan las replicasas, los compartimientos pueden presentar
una temperatura elevada para seleccionar las replicasas con mayor
termoestabilidad. Además, utilizando los procedimientos de selección
descritos en la presente memoria sobre las proteínas de fusión que
comprenden replicasa termoestable y una proteína de interés
permitirán la selección de proteínas termoestables.
Resulta deseable un procedimiento para la
incorporación de termoestabilidad en proteínas de importancia
comercial que de otra manera resultarían lábiles, con miras a su
producción y distribución a gran escala. Se ha descrito un sistema
informador para mejorar el plegamiento de las proteínas, mediante la
expresión de las proteínas como fusiones con proteína fluorescente
verde (GFP) (Waldo et al., Nat. Biotechnol.
17:691-695, 1999). La función de ésta está
relacionado con la influencia del plegamiento productivo de la
proteína fusionada sobre el plegamiento y/o la funcionalidad de la
GFP, permitiendo la evolución dirigida de las variantes que
presentan un plegamiento y una expresión mejorados. Según este
aspecto de la presente invención, las proteínas se fusionan con una
replicasa termoestable (o con un polipéptido que estimula la
actividad de replicasa) y se selecciona para fusiones activas en la
emulsión, como procedimiento de evolución de las proteínas que
presentan termoestabilidad y/o solubilidad incrementadas. Resulta
previsible que las variantes inestables de la pareja de fusión
formen agregados y precipiten antes o durante el ciclo térmico,
comprometiendo de esta manera la actividad de replicasa en el
interior de los compartimientos respectivos. Las fusiones viables
permitirán la autoamplificación en emulsión, estando ligada la tasa
de recambio a la estabilidad de la pareja de fusión.
En un enfoque relacionado, puede evolucionar
actividad chaperonina nueva o incrementada, mediante la coexpresión
de una biblioteca de chaperones conjuntamente con una proteína de
fusión de polimerasa-polipéptido, en la que el grupo
proteína se pliega incorrectamente (bajo las condiciones de
selección). La replicación del gen o genes codificantes del chaperón
sólo puede continuar después de que la actividad chaperonina haya
rescatado la actividad de polimerasa en la proteína de fusión de
polimerasa-polipéptido.
Puede realizarse una medición de la
termoestabilidad del enzima mediante medios convencionales conocidos
en la técnica. Por ejemplo, la actividad catalítica del enzima
nativo puede someterse a ensayo a una temperatura específica como
referencia. Los ensayos enzimáticos son bien conocidos en la
técnica, y se han establecido ensayos estándar a lo largo de los
años. Por ejemplo, la incorporación de nucleótidos mediante una
polimerasa se cuantifica mediante, por ejemplo, la utilización de
dNTP marcados radioactivamente, tales como dATP, y los ensayos de
unión a filtros tales como los conocidos en la técnica. El enzima
cuya termoestabilidad es objeto de ensayo, se preincuba a una
temperatura elevada y a continuación se realiza una medición de su
actividad retenida (por ejemplo, la actividad de polimerasa en el
caso de las polimerasas) a una temperatura inferior óptima y se
compara con la referencia. En el caso de la polimerasa Taq,
la temperatura elevada es 97,5°C; la temperatura óptima es 72°C. La
termoestabilidad puede expresarse en forma de semivida a la
temperatura elevada (es decir, el tiempo de incubación a la
temperatura superior, sobre la cual la polimerasa pierde el 50% de
su actividad). Por ejemplo, las replicasas termoestables, los
polipéptidos o proteínas de fusión seleccionados mediante la
presente invención pueden presentar una semivida 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9, 10 veces o superior a la semivida de los enzimas nativos. Más
preferentemente, las replicasas termoestables, etc., presentan una
semivida que resulta 11 veces, o más, superior cuando se compara de
esta manera. Preferentemente, las polimerasas seleccionadas se
preincuban a 95°C o más, a 97,5°C o más, a 100°C o más, a 105°C o
más, a 110ºC o más. Por lo tanto, en una forma de realización
altamente preferida de la presente invención, se proporcionan
polimerasas con una termoestabilidad incrementada que presentan una
semivida a 97,5°C que resulta 11 veces, o más, superior a la
semivida del correspondiente enzima de tipo salvaje (nativo).
La resistencia a un agente inhibidor, tal como
la heparina en el caso de las polimerasas, puede también someterse a
ensayo y medirse tal como anteriormente. La resistencia a la
inhibición puede expresarse en términos de la concentración de
factor inhibidor. Por ejemplo, en formas de realización preferidas
de la presente invención, se proporcionan polimerasas resistentes a
la heparina que se encuentran activas hasta una concentración de
heparina comprendida en el intervalo de entre 0,083 unidades/\mul
y 0,33 unidades/\mul. A título comparativo, los ensayos de la
presente invención indican que la concentración de heparina que
inhibe la polimerasa Taq (tipo salvaje) nativa se encuentra
comprendida en el intervalo entre 0,0005 unidades/\mul y 0,0026
unidades/\mul.
La resistencia se expresa convenientemente en
términos de concentración de inhibidor, que se observa que inhibe la
actividad de replicasa, de proteína o polipéptido de fusión, en
comparación con la concentración que se observa que inhibe el enzima
nativo. De esta manera, las replicasas, las proteínas de fusión o
los polipéptidos resistentes seleccionados mediante la presente
invención, pueden presentar una resistencia de 10, 20, 30, 40, 50,
60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190,
200 veces, o más, superior comparada con el enzima nativo. Más
preferentemente, las replicasas resistentes, etc., presentan una
resistencia al plegamiento incrementada de 130 veces, o más,
superior cuando se comparan de esta manera. Preferentemente, las
replicasas seleccionadas, etc., presentan una actividad superior en
50% o más, en 60% o más, en 70% o más, en 80% o más, en 90% o más o
incluso de 100% de la actividad a la concentración del factor
inhibidor. Además, los compartimientos pueden contener cantidades de
un agente inhibidor, tal como la heparina, para seleccionar para las
replicasas que presentan actividad bajo dichas condiciones.
Tal como se explica posteriormente, los
procedimientos de la presente invención pueden utilizarse para
seleccionar una pareja de polipéptidos interactuantes, y las
condiciones en el interior de los compartimientos pueden alterarse
con el objetivo de seleccionar polipéptidos capaces de actuar bajo
estas condiciones (por ejemplo, elevada concentración salina,
temperatura elevada, etc.). Los procedimientos de la presente
invención pueden asimismo utilizarse para seleccionar el
plegamiento, la estabilidad y/o la solubilidad de un polipéptido
fusionado con actividad bajo estas condiciones (por ejemplo, elevada
concentración salina, elevada temperatura, agentes caotrópicos,
etc.).
El procedimiento de selección de la presente
invención puede utilizarse para seleccionar diversas actividades
replicativas, por ejemplo para la actividad de polimerasa. En este
caso, la replicasa es una polimerasa, y la reacción catalítica es la
replicación de la polimerasa de su propio gen. De esta manera, la
polimerasa o polimerasas defectuosas o las polimerasas inactivas
bajo las condiciones en las que se lleva a cabo la reacción (las
condiciones de selección) resultan incapaces de amplificar sus
propios genes. Similarmente, las polimerasas menos activas
replicarán sus propias secuencias codificantes en el interior de sus
compartimientos más lentamente. De acuerdo con ello, estos genes se
encontrarán infrarrepresentados o incluso desaparecerán del conjunto
de genes.
Las polimerasas activas, por otra parte, son
capaces de replicar sus propios genes y el número de copia
resultante de estos genes se incrementará. En una forma de
realización preferida de la presente invención, el número de copia
de un gen en el interior del conjunto presentará una relación
directa con la actividad del polipéptido codificado, bajo las
condiciones en las que se lleva a cabo la reacción. En esta forma de
realización preferida, la polimerasa más activa será la más
representada en el conjunto final (es decir, su número de copia en
el conjunto será el mayor). Tal como se apreciará, esto permite una
fácil clonación de las polimerasas activas, en detrimento de las
inactivas. Por lo tanto, el procedimiento de la presente invención
puede vincular directamente la tasa de recambio del enzima al número
de copia resultante del gen que lo codifica.
A título de ejemplo, el procedimiento puede
aplicarse al aislamiento de polimerasas activas (ADN polimerasas,
ARN polimerasas y transcriptasas inversas) de organismos
termofílicos. Brevemente, se expresa intracelularmente una
polimerasa termoestable en células bacterianas y éstas se
compartimentalizan (por ejemplo, en una emulsión
agua-aceite) en un tampón apropiado junto con
cantidades apropiadas de los cuatro dNTP y oligonucleótidos
cebadores en ambos extremos del gen de polimerasa o en secuencias de
plásmido flanqueantes del gen de polimerasa. La polimerasa y su gen
se liberan de las células mediante un cambio escalonado de
temperatura que provoca la lisis de las células y destruye las
actividades enzimáticas asociadas a la célula huésped. Las
polimerasas de los organismos mesofílicos (o polimerasas menos
termoestables) pueden expresarse de manera análoga, exceptuando que
la lisis de las células debe realizarse a temperatura ambiente (por
ejemplo mediante la expresión de una proteína lítica, por ejemplo
derivada de bacteriófagos líticos, mediante lisis mediada por
detergente (por ejemplo, Bugbuster^{TM}, disponible
comercialmente) o la lisis puede realizarse a temperaturas elevadas
en presencia de un agente de estabilización de polimerasa (por
ejemplo, concentraciones elevadas de prolina (ver el Ejemplo 27) en
el caso de Klenow o trehalosa en el caso de la RT). En estos casos,
la actividad de polimerasa de fondo de la cepa huésped puede
interferir con las selecciones y puede resultar preferida la
utilización de cepas mutantes (por ejemplo, polA^{-}).
Alternativamente, los genes de polimerasa (tanto
en forma de plásmido como de fragmentos lineales) pueden
compartimentarse, tal como se ha descrito anteriormente, y la
polimerasa puede expresarse in situ en el interior de los
compartimientos utilizando la transcripción traducción in vitro
(ivt), seguida de un cambio escalonado de temperatura para
destruir las actividades enzimáticas asociadas al extracto de
traducción in vitro. Las polimerasas de los organismos
mesofílicos (o polimerasas menos termoestables) pueden expresarse
in situ de manera análoga exceptuando que, con el fin de
evitar las actividades enzimáticas asociadas al extracto de
traducción in vitro, puede resultar preferida la utilización
de un extracto de traducción reconstituido a partir de componentes
purificados definidos, tales como el sistema PURE (Shimizu et
al., Nat. Biotech. 19:751, 2001).
A continuación, el termociclado de la PCR
conduce a la amplificación de los genes de la polimerasa mediante
los polipéptidos codificados por los mismos, es decir, sólo se
amplificarán los genes que codifican polimerasas activas o que
codifican polimerasas activas bajo las condiciones seleccionadas.
Además, el número de copia del gen X de la polimerasa, tras la
autoamplificación, será directamente proporcional a la actividad
catalítica de la polimerasa X codificada por el mismo (ver las
figuras 1A y 1B).
Mediante la modificación de las condiciones de
selección en el interior del compartimiento, resulta posible
utilizando los procedimientos de la presente invención seleccionar
polimerasas u otras replicasas que presenten propiedades deseadas.
Por lo tanto, mediante la exposición de repertorios de genes de
polimerasa (diversificados mediante mutagénesis dirigida o
aleatoria) a autoamplificación y alterando las condiciones bajo las
que dicha autoamplificación puede producirse, el sistema puede
utilizarse para el aislamiento y la construcción de polimerasas con
propiedades alteradas, mejoradas o nuevas. Entre estas propiedades
mejoradas se pueden incluir una termoestabilidad incrementada,
procesividad incrementada, exactitud incrementada (una mejor
corrección de errores), incorporación incrementada de sustratos no
favorables (por ejemplo, ribonucleótidos, bases generales
modificadas con pigmentos, tales como el
5-nitroindol, u otros sustratos poco habituales,
tales como los nucleótidos de pireno (Matray & Kool,
Nature 399:704-708, 1999) (figura 3) o
resistencia a inhibidores (por ejemplo, la heparina en muestras
clínicas). Entre las propiedades nuevas se pueden incluir la
incorporación de sustratos artificiales (por ejemplo,
ribonucleótidos), la capacidad de evitar la lectura de zonas dañadas
(por ejemplo sitios abásicos (Paz-Elizur T. et
al., Biochemistry 36:1766, 1997), dímeros de timidina (Wood R.
D. Nature 399:639, 1999), bases de hidantoína (Duarte V.
et al., Nucleic Acids Res. 27:496, 1999) y posiblemente
incluso químicas nuevas (por ejemplo, esqueletos nuevos, tales como
PNA (Nielsen PE. Curr. Opin. Biotechnol.
10(1):71-5, 1999) o sulfona (Benner SA et
al., Pure Appl. Chem. 70(2):263-6, feb.
1998) o químicas de azúcar alterado (A. Eschenmoser, Science
284:2118-24, 1999). También puede utilizarse para el
aislamiento o la evolución de factores que mejoran o modifican la
función de la polimerasa, tales como los factores de procesividad
(como la tiorredoxina en el caso de la ADN polimerasa de T7 (Doublie
S. et al., Nature 391:251, 1998).
Sin embargo, también pueden seleccionarse según
la presente invención otros enzimas además de las replicasas, tales
como telomerasas, helicasas, etc. De esta manera, la telomerasa se
expresa in situ (en compartimientos) mediante, por ejemplo,
la traducción in vitro junto con ARN de telomerasa (añadida o
transcrita in situ también; por ejemplo, Bachand et
al., RNA 6:778-784, 2000).
Los compartimientos también contienen polimerasa
Taq y dNTP y cebadores específicos de telómero. A
temperaturas reducidas la Taq se encuentra inactiva pero la
telomerasa activa añadirá telómeros a su propio gen codificante (un
fragmento de ADN lineal con extremos apropiados). Después de la
reacción de la telomerasa, el termociclado sólo amplifica los genes
que codifican telomerasa activa. Puede introducirse diversidad en el
gen o ARN de telomerasa (o en ambos) y puede ser dirigida o
aleatoria. Tal como se aplica para la selección de las helicasas, el
procedimiento de selección es esencialmente el descrito para las
telomerasas, exceptuando que para desenrollar las cadenas se utiliza
helicasa en vez de la desnaturalización por calor.
Los procedimientos de la presente invención
también pueden utilizarse para la selección de enzimas reparadores
de ADN o para polimerasas de translesión, tales como las Pol IV y
Pol V de E. coli. En este caso, se introducen daños en los
cebadores (química dirigida) o se genera aleatoriamente mediante un
tratamiento mutagénico (por ejemplo, con radiación UV, con
compuestos químicos mutagénicos, etc.). Esto permite la selección
para enzimas capaces de reparar los cebadores necesarios para la
replicación o capaces de reparar su propia secuencia genética
(recuperación de información) o que resulta en "reparasas"
mejoradas para la terapia genética, etc.
Los procedimientos de la presente invención
también pueden utilizarse en sus diversas formas de realización para
la selección de polipéptidos capaces de modular, directa o
indirectamente, la actividad de replicasa. Además, la presente
invención puede utilizarse para seleccionar para una pareja de
polipéptidos capaces de interaccionar, o para la selección de ácidos
nucleicos catalíticos, tales como ARN catalítico (los ribozimas).
Estas y otras formas de realización se explicarán con mayor detalle
posteriormente.
Tal como se indica en la presente memoria, un
enzima de procesamiento de ácidos nucleicos es cualquier enzima, que
puede ser una proteína enzima o un ácido nucleico enzima, que es
capaz de modificar, extender (por ejemplo en por lo menos un
nucleótido), amplificar o, de otra manera, influir sobre los ácidos
nucleicos para convertirlos en seleccionables para la amplificación
según la presente invención. Estos enzimas, por lo tanto, presentan
una actividad que resulta en, por ejemplo, la amplificación,
estabilización, desestabilización, hibridación o desnaturalización,
replicación, protección o desprotección de los ácidos nucleicos, o
cualquier otra actividad a partir de la que puede seleccionarse un
ácido nucleico mediante amplificación. Entre los ejemplos se
incluyen helicasas, telomerasas, ligasas, recombinasas, integrasas y
replicasas. Las replicasas resultan preferentes.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "replicación" se refiere al proceso de copia,
dependiente de un molde, de una secuencia de ácidos nucleicos. Los
ácidos nucleicos se comentan y se ejemplifican posteriormente.
Generalmente, el producto resultante de la replicación es otro ácido
nucleico, que puede ser de la misma especie o de otra diferente. De
esta manera, se incluyen la replicación de ADN para la producción de
ADN, la replicación de ADN para la producción de ARN, la replicación
de ARN para la producción de ADN y la replicación de ARN para la
producción de ARN. Por lo tanto, el término "replicación"
pretende comprende procesos tales como la replicación, la
polimerización, la ligación de oligonucleótidos o polinucleótidos
(por ejemplo, el triplete trinucleótido
5'-trifosfatos) para formar secuencias más largas,
la transcripción, la transcripción inversa, etc., de ADN.
El término "replicasa" pretende referirse a
un enzima que presenta una actividad catalítica, que es capaz de
unir nucleótidos, uniendo bloques entre sí para formar secuencias de
ácidos nucleicos. Entre estos bloques de construcción nucleótidos se
incluyen, pero sin limitación, nucleósidos, nucleósidos trifosfato,
desoxinucleósidos, desoxinucleósidos trifosfato, nucleótidos (que
comprenden una base nitrogenada, tal como adenina, guanina,
citosina, uracilo, timina, etc., un azúcar de 5 carbonos y uno o más
grupos fosfato), nucleótidos trifosfato, desoxinucleótidos, tales
como desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxicitidina, desoxiuridina,
desoxiguanidina, desoxinucleótidos trifosfato (dNTP), y análogos
sintéticos o artificiales de los mismos. Entre los bloques de
construcción también se incluyen los oligómeros o los polímeros de
cualquiera de los indicados anteriormente, por ejemplo
trinucleótidos (tripletes), oligonucleótidos y polinucleótidos.
De esta manera, una replicasa puede extender una
secuencia de ácido nucleico preexistente (cebador) mediante la
incorporación de nucleótidos o desoxinucleótidos. Dicha actividad es
conocida en la técnica como "polimerización", y los enzimas que
la llevan a cabo son conocidos como "polimerasas". Un ejemplo
de una replicasa polimerasa de este tipo es la ADN polimerasa, capaz
de replicar el ADN. El cebador puede ser químicamente igual o
diferente a la secuencia extendida (por ejemplo, es sabido que la
ADN polimerasa de mamífero extiende la secuencia de ADN desde un
cebador de ARN). En el término replicasa se incluyen asimismo las
enzimas que unen entre sí las secuencias de ácido nucleico, tanto si
son polímeros u oligómeros, para formar secuencias de ácido nucleico
más largas. Esta actividad la muestran las ligasas, que ligan trozos
de ADN o de ARN.
La replicasa puede consistir en su integridad de
una secuencia de replicasa o puede comprender una secuencia de
replicasa unida a un polipéptido heterólogo o a otra molécula, tal
como un polipéptido, mediante medios químicos o en forma de una
proteína de fusión o puede ensamblarse a partir de dos o más partes
constituyentes.
Preferentemente, la replicasa de acuerdo con la
presente invención es una ADN polimerasa, una ARN polimerasa, una
transcriptasa inversa una ADN ligasa o una ARN ligasa.
Preferentemente, la replicasa es una replicasa
termoestable. Tal como se utiliza en la presente memoria, una
replicasa "termoestable" es una replicasa que presenta una
resistencia significativa a la desnaturalización térmica a
temperaturas elevadas, típicamente superiores a la temperatura
corporal (37°C). Preferentemente, esta temperatura se encuentra
comprendida en el intervalo entre 42°C y 160°C, más preferentemente
se encuentra comprendida en el intervalo entre 60ºC y 100ºC, más
preferentemente, es superior a 90°C. Comparada con una replicasa no
termoestable, la replicasa termoestable presenta una semivida
(tiempo de incubación a temperaturas elevadas que resulta en una
pérdida de actividad del 50%) significativamente incrementada.
Preferentemente, la replicasa termoestable retiene 30% o más de su
actividad tras la incubación a temperaturas elevadas, más
preferentemente, 40%, 50%, 60%, 70% u 80% o más de la actividad.
Todavía más preferentemente, la replicasa retiene 80% de su
actividad. Más preferentemente, la actividad retenida es 90%, 95% o
más, incluso el 100%. Las replicasas no termoestables muestran una
retención de actividad reducida o nula tras incubaciones similares a
la temperatura elevada.
Un ejemplo de replicasa es la ADN polimerasa.
Los enzimas ADN polimerasa son enzimas intracelulares naturales y la
célula los utiliza para replicar cadenas de ácidos nucleicos
utilizando una molécula de molde para la elaboración de una cadena
complementaria de ácidos nucleicos. Los enzimas con actividad de ADN
polimerasa catalizan la formación de un enlace entre el grupo 3'
hidroxilo en el extremo creciente de un cebador de ácidos nucleicos
y el grupo 5' fosfato de un nucleótido trifosfato. Estos nucleótidos
trifosfato se seleccionan habitualmente de entre desoxiadenosina
trifosfato (A), desoxitimidina trifosfato (T), desoxicitidina
trifosfato (C) y desoxiguanosina trifosfato (G). Sin embargo, las
ADN polimerasas pueden incorporar versiones modificadas o alteradas
de estos nucleótidos. El orden en el que se añaden los nucleótidos
lo rige el apareamiento de bases a la cadena de ADN molde; dicho
apareamiento de bases se realiza mediante enlace de hidrógeno
"canónico" (un enlace de hidrógeno entre los nucleótidos A y T,
y entre los nucleótidos G y C de las cadenas opuestas de ADN),
aunque se conocen en la técnica apareamientos de bases no canónicos,
tales como el apareamiento de bases G:U (ver, por ejemplo, Adams
et al., The Biochemistry of the Nucleic Acids,
14-32, (11ª edición, 1992). La utilización in
vitro de los enzimas con una actividad de ADN polimerasa ha
sido, durante los últimos años, más frecuente en una diversidad de
aplicaciones bioquímicas, entre las que se incluyen la reacción de
síntesis de ADNc, la reacción de secuenciación de ADN (ver Sambrook
et al., 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989), y la amplificación de ácidos nucleicos mediante
procedimientos tales como la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) (Mullis et al., patentes US nº 4.683.195, nº 4.683.202
y nº 4.800.159) y los procedimientos de amplificación mediados por
la transcripción de ARN (por ejemplo, Kacian et al.,
publicación de PCT nº WO 91/01384).
Algunos procedimientos, tales como la PCR,
utilizan ciclos de extensión de cebadores mediante la utilización de
la actividad de la ADN polimerasa, seguida de desnaturalización
térmica del ácido nucleico de cadena doble resultante, con el fin de
proporcionar un nuevo molde para otra ronda de hibridación y
extensión del cebador. Debido a que las elevadas temperaturas
necesarias para la desnaturalización de las cadenas generan
inactivaciones irreversibles de muchas ADN polimerasas, el
descubrimiento y la utilización de ADN polimerasas capaces de
mantener su actividad a temperaturas superiores a aproximadamente
37°C hasta aproximadamente 42°C (enzimas de ADN polimerasa
termoestables) proporciona una ventaja de costes y de eficiencia de
trabajo. Se han descubierto ADN polimerasas termoestables en varios
organismos termofílicos, entre los que se incluyen, aunque sin
limitación, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus y
especies de los géneros Bacillus, Thermococcus, Sulfolobus y
Pyrococcus. Las ADN polimerasas pueden purificarse
directamente a partir de estos organismos termofílicos. Sin embargo,
se pueden obtener incrementos sustanciales de rendimiento de la ADN
polimerasa mediante, primero, una clonación del gen codificante del
enzima en un vector de expresión multicopia mediante procedimientos
de tecnología de ADN recombinante, insertando el vector en una cepa
de célula huésped capaz de expresar el enzima, cultivando las
células huésped que contienen el vector, extrayendo después la ADN
polimerasa de la cepa de célula huésped que ha expresado el
enzima.
Las ADN polimerasas bacterianas que se han
caracterizado hasta la fecha presentan determinados perfiles de
similitudes y diferencias que han llevado a que algunos los
clasifiquen en dos grupos: aquéllas cuyos genes contienen
intrones/inteínas (ADN polimerasas de clase B), y aquéllas cuyos
genes de ADN polimerasa son aproximadamente similares a las ADN
polimerasas I de E. coli y que no contienen intrones (ADN
polimerasas de clase A).
Se han clonado y expresado diversas ADN
polimerasas termoestables de clase A y de clase B derivadas de
organismos termofílicos. Entre los enzimas de clase A: Lawyer, et
al., J. Biol. Chem. 264:6427-6437 (1989) y
Gelfund et al., patente US nº 5.079.352 informan sobre la
clonación y expresión de una ADN polimerasa termoestable de longitud
completa derivada de Thermus aquaticus (Taq). Lawyer
et al., en PCR Methods and Applications
2:275-287(1993) y Barnes, publicación PCT WO
nº 92/06188 (1992), dan a conocer la clonación y la expresión de
versiones truncadas de la misma ADN polimerasa, mientras que
Sullivan, publicación de patente EPO nº 0482714A1 (1992), informa
sobre la clonación de una versión mutada de la ADN polimerasa
Taq. Asakura et al., J. Ferment. Bioeng. (Japón),
74:265-269 (1993) han informado de la clonación y la
expresión de una ADN polimerasa de Thermus thermophilus.
Gelfund et al., Publicación PCT WO nº 92/06202 (1992), da a
conocer una ADN polimerasa termoestable purificada de Thermosipho
africanus. Akhmetzjanov y Vakhitov, Nucleic Acids Res.
20:5839 (1992) informan sobre una ADN polimerasa termoestable de
Thermus flavus. Uemori et al., J. Biochem.
113:401-410, 1993) y la publicación EPO nº 0517418A2
(1992) informan sobre la clonación y la expresión de una ADN
polimerasa de la bacteria termofílica Bacillus caldotenax.
Ishino et al., solicitud de patente japonesa HEI nº
4[1992]-131400 (fecha de publicación 19 de
noviembre de 1993) informan sobre la clonación de una ADN polimerasa
de Bacillus stearothermophilus. Entre los enzimas de la clase
B: Comb et al., Publicación EPO nº 0455430A3 (1991), Comb
et al., publicación de patente EPO nº 0547920A2 (1993) y
Perler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
89:5577-5581 (1992) informan sobre una ADN
polimerasa termoestable recombinante de Thermococcus
litoralis. Pisani et al., Nucleic Acids Res.
20:2711-2716 (1992) y la publicación PCT nº WO
93/25691 (1993) dan a conocer una ADN polimerasa termoestable
clonada de Sulfolobus solofatarius. Uemori et al., Nucleic
Acids. Res. 21:259-265 (1993) dan a conocer un
enzima termoestable de Pyrococcus furiosus, mientras que la
ADN polimerasa recombinante se deriva de la especie
Pyrococcus, tal como se da a conocer en Comb et al.,
publicación EPO nº 0547359A1 (1993).
Muchas ADN polimerasas termoestables presentan
otras actividades además de la actividad de ADN polimerasa; entre
éstas se incluyen la actividad 5'-3'exonucleasa y/o
la actividad 3'-5'exonucleasa. Las actividades
5'-3' y 3'-5' exonucleasa resultan
conocidas para los expertos en la materia. La actividad
3'-5'exonucleasa mejora la exactitud de la cadena
recién sintetizada, eliminado las bases incorrectas que pueden haber
sido incorporadas; las ADN polimerasas en las que dicha actividad
resulta reducida o se encuentra ausente, incluyendo, según se ha
informado, la ADN polimerasa Taq, (ver Lawyer et al., J.
Biol. Chem. 264:6427-6437), presentan una
elevada tasa de errores en la incorporación de residuos nucleótidos
a la cadena de extensión del cebador. En aplicaciones tales como los
procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos, en los que la
replicación de ADN resulta, con frecuencia, geométrica en relación
al número de ciclos de extensión del cebador, dichos errores pueden
conducir a serios problemas artefactuales, tales como la
heterogeneidad de secuencia del ácido nucleico producto de
amplificación (amplicón). Por lo tanto, una actividad
3'-5'exonucleasa representa una característica
deseable de una ADN polimerasa termoestable, utilizada para dichos
propósitos.
En contraste, la actividad
5'-3'exonucleasa, que se encuentra presente con
frecuencia en los enzimas de ADN polimerasa, con frecuencia no
resulta deseable en una aplicación particular debido a que puede
digerir los ácidos nucleicos, incluyendo los cebadores, que
presentan un extremo 5' no protegido. Por lo tanto, una ADN
polimerasa termoestable con actividad
5'-3'exonucleasa atenuada, o en la que esta
actividad se encuentra ausente, también representa una
característica deseada de un enzima para aplicaciones bioquímicas.
Se han descrito diversos enzimas de ADN polimerasa en los que se ha
introducido una modificación en una ADN polimerasa, que realiza esta
función. Por ejemplo, el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de
E. coli puede producirse en forma de fragmento proteolítico
del holoenzima en el que se ha eliminado el dominio de la proteína
que controla la actividad de la 5'-3'exonucleasa. El
fragmento Klenow todavía retiene la actividad de polimerasa y la
actividad 3'-5'exonucleasa. Barnes, supra, y
Gelfund et al., patente US nº 5.079.352 han producido ADN
polimerasas recombinantes Taq defectivos para la actividad
5'-3' exonucleasa. Ishino et al., publicación
EPO nº 0517418A2 han producido una ADN polimerasa defectiva para la
actividad 5'-3' exonucleasa, derivada de
Bacillus caldotenax. Por otra parte, las polimerasas con
carencia de dominios 5'-3'exonucleasa presentan, con
frecuencia, una procesividad reducida.
Las roturas y los huecos en la cadena de ADN se
generan, de manera transitoria durante la replicación, la reparación
y la recombinación. En los núcleos de las células de los mamíferos,
la reunión de dichas roturas de cadena depende de varios enzimas ADN
polimerasas y ADN ligasas diferentes. El mecanismo de unión de las
interrupciones de la cadena de ADN por los enzimas ADN ligasa ha
sido ampliamente descrito. La reacción se inicia mediante la
formación de un complejo covalente enzima-adenilato.
Los enzimas ADN ligasa de los mamíferos y de los virus emplean el
ATP como cofactor, mientras que los enzimas bacterianos ADN ligasa
utilizan el NAD para la generación de un grupo adenililo. En el caso
de las ligasas que utilizan el ATP, el ATP se corta formando AMP y
pirofosfato, con el residuo adenililo unido mediante enlace
fosforamidato al grupo \varepsilon-amino de un
residuo de lisina específico en el sitio activo de la proteína
(Gumport, R. I., et al., PNAS 68:2559-63,
1971). El residuo de AMP reactivado del intermediario ADN
ligasa-adelinato se transfiere al fosfato 5'
terminal de una rotura de una cadena en un ADN de doble cadena,
generando un complejo ADN-AMP covalente con un
enlace 5'-- 'fosfoanhídrido. Este intermediario de reacción también
ha sido aislado en enzimas ADN ligasa de mamíferos y de microbios,
pero presenta una vida más corta que el enzima adenililado. En la
etapa final de la ligación del ADN, los enzimas ADN ligasa no
adenililados, necesarios para la generación de un enlace
fosfodiéster, catalizan el desplazamiento del residuo de AMP
mediante ataque de un grupo 3'hidroxilo contiguo en el sitio
adenililado.
La existencia de tres enzimas ADN ligasa
diferentes, las ADN ligasa I, II y III, ha sido establecida
previamente mediante la caracterización bioquímica e inmunológica de
los enzimas purificados (Tomkinson, A. E. et al., J. Biol.
Chem. 266:21728-21735, 1991 y Roberts, E., et
al., J. Biol. Chem. 269:3789-3792, 1994).
Los procedimientos de la presente invención
implican la amplificación con molde de los ácidos nucleicos
deseados. El término "amplificación" se refiere al incremento
del número de copia de un fragmento de ácido nucleico particular (o
de una porción del mismo) como resultado de una reacción enzimática
en cadena (tal como una reacción en cadena de la polimerasa, una
reacción en cadena de la ligasa, o una replicación autosostenida de
una secuencia) o como resultado de la replicación de la integridad o
de parte del vector en el que ha sido clonado. Preferentemente, la
amplificación según la presente invención es una amplificación
exponencial, tal como muestra, por ejemplo, una reacción en cadena
de la polimerasa.
Se han descrito en la técnica muchos
procedimientos de amplificación de dianas y de señales, por ejemplo
se pueden encontrar revisiones generales de estos procedimientos en
Landegren, U., et al., Science 242:229-237,
(1998) y Lewis, R., Genetic Engineering News 10:1,
54-55, (1990). Estos procedimientos de amplificación
pueden utilizarse en los procedimientos de la presente invención, e
incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la PCR in
situ, la reacción de amplificación de ligasa (LAR), la
hibridación de ligasa, replicasa del bacteriófago Q\beta, un
sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS), la
amplificación genómica con secuenciación del transcrito (GAWTS), la
amplificación basada en una secuencia de ácido nucleico (NASBA) y la
hibridación in situ.
La PCR es un procedimiento de amplificación de
ácidos nucleicos descrito, inter alia, en las patentes US nº
4.683.195 y nº 4.683.202. La PCR consiste en ciclos repetidos de
reacciones de extensión del cebador generados por la ADN polimerasa.
El ADN diana se desnaturaliza por calor y los dos oligonucleótidos,
que flanquean la secuencia diana en cadenas opuestas del ADN que se
va a amplificar, se hibridan. Estos oligonucleótidos se convierten
en cebadores para la utilización con la ADN polimerasa. El ADN se
copia mediante la extensión del cebador para realizar una segunda
copia de las dos cadenas. Mediante la repetición del ciclo de
desnaturalización por calor, la hibridación y la extensión del
cebador, el ADN diana puede amplificarse un millón de veces o más,
en un periodo de aproximadamente entre dos y cuatro horas. La PCR
representa una herramienta biológica molecular que debe utilizarse
conjuntamente con una técnica de detección para determinar los
resultados de la amplificación. Una ventaja de la PCR es que
incrementa la sensibilidad mediante la amplificación de la cantidad
de ADN diana de 1 millón a 1 billón de veces, en aproximadamente 4
horas.
La reacción en cadena de la polimerasa puede
utilizarse en los procedimientos de selección de la presente
invención, de la manera siguiente. Por ejemplo, la PCR puede
utilizarse para seleccionar variantes de la polimerasa Taq
con actividad de polimerasa. Tal como se ha descrito con mayor
detalle anteriormente, se genera una biblioteca de ácidos nucleicos,
codificando cada uno de ellos una replicasa o una variante de una
replicasa, por ejemplo una polimerasa Taq, y se subdivide
dicha biblioteca en compartimientos. Cada compartimiento comprende
sustancialmente un elemento de la biblioteca junto con la replicasa
o la variante codificada por ese elemento.
La polimerasa o la variante puede expresarse
in vivo en el interior de una bacteria transformada o en
cualquier otro huésped de expresión adecuado, por ejemplo, en
células de levadura, de insectos o de mamífero, estando el huésped
de expresión encapsulado en el interior del compartimiento. La
variante de polimerasa y los ácidos nucleicos que la codifican se
liberan del interior del compartimiento mediante la aplicación de
calor o mediante otros medios adecuados. En el caso de un huésped
bacteriano, puede utilizarse la expresión retardada de una proteína
lítica, por ejemplo, la proteína E de \PhiX174, o un lisógeno
inducible de \lambda, para romper la bacteria.
Resultará evidente que la polimerasa u otro
enzima no necesariamente es una proteína heteróloga expresada en ese
huésped (por ejemplo, un plásmido), sino que pueden expresarse a
partir de un gen que forma parte del genoma del huésped. Por lo
tanto, la polimerasa puede ser, por ejemplo, una polimerasa
bacteriana endógena o nativa. Los presentes inventores han
demostrado que, en el caso de la nucleótido difosfato quinasa (ndk),
la expresión (no inducida) endógena de ndk resulta suficiente para
la generación de los dNTP para su propia replicación. Por lo tanto,
los procedimientos de selección según la presente invención pueden
utilizarse para la clonación funcional directa de polimerasas y de
otros enzimas de poblaciones microbianas diversas (y no
cultivadas).
Alternativamente, la biblioteca de ácido
nucleico puede compartimentarse junto con los componentes de un
sistema de transcripción/traducción in vitro (tal como se
describe, con mayor detalle, en el presente documento), estando la
variante de la polimerasa expresada in vitro en el interior
del compartimiento.
Cada compartimiento comprende también los
componentes para una reacción PCR, por ejemplo, nucleótidos
trifosfatos (dNTP), tampón, magnesio, y cebadores oligonucleótidos.
Los cebadores oligonucleótidos pueden presentar secuencias que
corresponden a secuencias flanqueantes del gen de polimerasa (es
decir, en el interior del ADN genómico o en el interior del vector
de ADN) o que corresponden a secuencias en el interior del gen de la
polimerasa. A continuación, se inicia el termociclado de la PCR para
permitir que cualquier variante de polimerasa con actividad de
polimerasa amplifique la secuencia de ácido nucleico.
Las polimerasas activas amplificarán sus
secuencias de ácido nucleico correspondientes, mientras que las
secuencias de ácido nucleico que codifican las polimerasas de
actividad reducida o inactivas resultarán débilmente replicadas o no
se replicarán en absoluto. Generalmente, el número de copia final de
cada elemento de la biblioteca de ácidos nucleicos se espera que sea
proporcional al nivel de actividad de la variante de polimerasa
codificada por el elemento. Los ácidos nucleicos que codifican las
polimerasas activas se encontrarán sobrerrepresentados, y los ácidos
nucleicos que codifican polimerasas de actividad reducida o nula
resultarán infrarrepresentados. A continuación, las secuencias
amplificadas resultantes pueden clonarse, secuenciarse, etc. y se
podrá someter a ensayo la capacidad de replicación de cada
elemento.
Tal como se describe con mayor detalle en otro
sitio, las condiciones en el interior de cada compartimiento pueden
alterarse para seleccionar las polimerasas activas bajo estas
condiciones. Por ejemplo, se puede añadir heparina a la mezcla de
reacción para seleccionar las polimerasas resistentes a la heparina.
Puede elevarse la temperatura a la cual tiene lugar la PCR puede
incrementarse para seleccionar las variantes de polimerasa
resistentes al calor. Además, pueden seleccionarse las polimerasas
capaces de extender secuencias de ADN, tales como cebadores con
extremos 3' alterados o con partes alteradas de la secuencia del
cebador. Entre los extremos 3' alterados u otras alteraciones pueden
incluirse bases no naturales (azúcares alterados o grupos base),
bases modificadas (por ejemplo, extremos 3' bloqueados) o incluso
cebadores con químicas del esqueleto alteradas (por ejemplo,
cebadores de PNA).
La PCR-TR se utiliza para
amplificar dianas de ARN. En este proceso, el enzima transcriptasa
inversa se utiliza para convertir el ARN en ADN complementario
(ADNc), que puede a continuación amplificarse mediante PCR. Este
procedimiento ha demostrado ser útil para la detección de virus de
ARN.
Los procedimientos de la presente invención
pueden utilizar la PCR-TR. De esta manera, el
conjunto de ácidos nucleicos que codifican la replicasa o sus
variantes puede proporcionarse en forma de una biblioteca de ARN.
Esta biblioteca puede generarse in vivo en bacterias, células
de mamífero, levaduras, etc., que se compartimentalizan, o mediante
transcripción in vitro de ADN compartimentado. El ARN podría
codificar una replicasa co-compartimentada (por
ejemplo, una transcriptasa o una polimerasa inversa) que ha sido
expresada in vivo (y se ha liberado en una emulsión junto con
el ARN utilizando medios dados a conocer posteriormente) o in
vitro. Otros componentes necesarios para la amplificación
(polimerasas y/o transcriptasas inversas, dNTP, cebadores) también
se encuentran compartimentados. Bajo una o más presiones de
selección dadas, el producto de ADNc de la reacción de transcripción
inversa se utiliza como molde para la amplificación PCR. Tal como
ocurre con otras reacciones de replicación (en particular ndk en los
Ejemplos), el ARN puede codificar un abanico de enzimas que
alimentan la reacción.
La replicación de secuencias autosostenida (3SR)
es una variación del TAS, que implica la amplificación isotérmica de
un molde de ácido nucleico mediante rondas secuenciales de
actividades de transcriptasa inversa (RT), de polimerasa y de
nucleasa mediadas por un cóctel enzimático y cebadores
oligonucleótidos adecuados (Guatelli et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87:1874, 1990). En lugar de una desnaturalización por
calor, se utiliza la degradación enzimática del ARN del heterodúplex
de ARN/ADN. Se añaden a la reacción la ARNasa H y el resto de
enzimas y todas las etapas se suceden a la misma temperatura y sin
adiciones posteriores de reactivos. Tras este procedimiento se han
conseguido amplificaciones de 10^{6} a 10^{9} en una hora a
42°C.
Por lo tanto, los procedimientos de la presente
invención pueden extenderse a la selección de polimerasas o de
replicasas de organismos mesofílicos, utilizando la amplificación
isotérmica 3SR (Guatelli et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:7797, (1990); Compton, Nature 7:350:91-92,
(1991) en lugar de un termociclado de PCR. Tal como se ha descrito
anteriormente, la 3SR implica la acción concertada de dos enzimas:
una ARN polimerasa y una transcriptasa inversa cooperan en una
reacción acoplada de transcripción y de transcripción inversa,
conduciendo a la amplificación simultánea de ARN y ADN.
Evidentemente, en este sistema la autoamplificación puede aplicarse
a cualquiera de las dos enzimas implicados o a ambos
simultáneamente. También puede incluir la evolución de la actividad
ARNasa H, tanto como parte del enzima transcriptasa inversa (por
ejemplo, la RT de VIH-1) como
independientemente.
Las diversas actividades enzimáticas que definen
la 3SR y los procedimientos asociados a la misma son dianas de
selección mediante la utilización de los procedimientos de la
presente invención. Las variantes de la ARN polimerasa de T7, de la
transcriptasa inversa (RT) o de la ARNasa H pueden proporcionarse en
el interior de compartimientos acuosos de las emulsiones, y
seleccionarse bajo condiciones de otra manera limitativas. Estas
variantes pueden introducirse mediante "pellets genéticos" de
E. coli (es decir, bacterias que expresan el polipéptido), o
mediante otros medios, tal como se describe en otro sitio en el
presente documento. La liberación inicial en emulsión puede
encontrarse mediada por lisis enzimática (por ejemplo, lisógeno de
lambda) o térmica, o mediante otros procedimientos dados a conocer
en la presente memoria. El último procedimiento puede requerir la
utilización de agentes que estabilicen la actividad enzimática a
temperaturas transitoriamente elevadas. Por ejemplo, puede resultar
necesario incluir ciertas cantidades de prolina, glicerol, trehalosa
u otros agentes estabilizantes conocidos de la técnica, para
estabilizar los enzimas termosensibles, tales como la transcriptasa
inversa. Además, la eliminación por etapas del agente puede llevarse
a cabo para la selección para una estabilidad incrementada del
enzima termosensible.
Alternativamente, y tal como se da a conocer en
otros sitios, las variantes pueden producirse mediante
transcripción-traducción acoplada, alimentando los
productos expresados en el ciclo de 3SR.
También se apreciará que resulta posible
sustituir la transcriptasa inversa por la ADN polimerasa Tth
termoestable. Es conocido que la ADN polimerasa Tth presenta una
actividad de transcriptasa inversa y el molde de ARN se transcribe
inversamente de manera efectiva formando molde de ADN utilizando
este enzima. Por lo tanto, resulta posible seleccionar las variantes
útiles de este enzima mediante, por ejemplo, la introducción de
variantes de ARN polimerasa de T7, expresadas en bacterias, en la
emulsión y preincubando a una temperatura de otra manera no
permisiva.
El Ejemplo 18, posteriormente, muestra una
manera en la que los procedimientos de la presente invención pueden
aplicarse a la selección de replicasas utilizando la replicación de
secuencia autosostenida (3SR).
La reacción de amplificación de ligación o el
sistema de amplificación de ligación utiliza ADN ligasa y cuatro
oligonucleótidos; dos por cada cadena diana. Esta técnica se
describe en Wu, D. Y. y Wallace, R. B., Genomics 4:560, 1988.
Los oligonucleótidos se hibridan con las secuencias contiguas en el
ADN diana y se unen con la ligasa. La reacción se desnaturaliza por
calor y se repite el ciclo.
Por analogía a la aplicación a las polimerasas,
el procedimiento de la presente invención puede aplicarse a las
ligasas, particularmente, a las ligasas de organismos termofílicos.
Se sintetizan oligonucleótidos complementarios a una cadena de la
secuencia genética de la ligasa (como apareamiento perfecto o
comprendiendo diversidad dirigida o aleatoria). Los oligos de los
dos extremos se solapan hasta el interior del vector o de las
regiones no traducidas del gen de la ligasa. El gen de la ligasa se
clona para su expresión en un huésped apropiado o se
compartimentaliza junto a los oligonucleótidos y a una fuente de
energía adecuada (habitualmente ATP (o NADPH)). Si resulta
necesario, la ligasa expresada tal como se ha indicado anteriormente
en bacterias se libera de las células mediante lisis térmica. Los
compartimientos contienen un tampón apropiado junto con cantidades
apropiadas de una fuente de energía adecuada (ATP o NADH) y
oligonucleótidos que codifican todo el gen de ligasa, así como las
secuencias flanqueantes requeridas para la clonación. La ligación de
los oligonucleótidos conduce al ensamblaje de un gen de ligasa de
longitud completa (con molde el gen de ligasa en el plásmido de
expresión) por una ligasa activa. En los compartimientos que
contienen una ligasa inactiva no tiene lugar ensamblaje alguno. Tal
como ocurre con las polimerasas, el número de copia de un gen X de
la ligasa tras la autoligación preferentemente es proporcional a la
actividad catalítica bajo las condiciones de selección de la ligasa
X codificada por el mismo.
Después de la lisis de la célula, el
termociclado conduce a la hibridación de los oligonucleótidos al gen
de ligasa. Sin embargo, la ligación de los oligos y, de esta manera,
el ensamblaje de la longitud completa del gen de ligasa, depende de
la presencia de una ligasa activa en el mismo compartimiento. De
esta manera, sólo los genes que codifican ligasas activas
ensamblarán sus propios genes codificantes a partir de los
oligonucleótidos presentes. A continuación, los genes ensamblados
pueden amplificarse, diversificarse y clonarse nuevamente en otra
ronda de selección, si resulta necesaria. Los procedimientos de la
presente invención resultan, por lo tanto, adecuados para la
selección de ligasas, que son más rápidas o más eficientes durante
la ligación.
Tal como se indica en otro sitio, la ligasa
puede producirse in situ mediante la expresión en un huésped
bacteriano u otro huésped adecuado, o mediante traducción in
vitro. La ligasa puede ser una ligasa oligonucleótido (por
ejemplo, una ribozima o desoxirribozima) que ensambla su propia
secuencia a partir de los fragmentos disponibles, o la ligasa puede
ser una ligasa convencional (un polipéptido). La longitud de los
oligonucleótidos dependerá de la reacción particular pero, si
resulta necesario, los oligonucleótidos pueden ser muy cortos (por
ejemplo, tripletes). Tal como se indica en otro sitio, el
procedimiento de la presente invención puede utilizarse para
seleccionar un polipéptido capaz de modular la actividad de ligasa,
tanto directa como indirectamente. Por ejemplo, el gen a evolucionar
puede ser de otro enzima o enzimas, que genera un sustrato para la
ligasa (por ejemplo NADH) o que consume un inhibidor. En este caso,
los oligonucleótidos codifican partes del otro enzima o enzimas,
etc.
La reacción de ligación entre los
oligonucleótidos puede incorporar químicas alternativas, por ejemplo
enlaces amidas. Mientras los enlaces químicos no interfieran con la
copia de molde de la cadena opuesta por cualquier replicasa (por
ejemplo, una transcriptasa inversa), puede evolucionar una gran
diversidad de químicas de enlace y de ligasas que la catalizan.
En esta técnica, la ARN replicasa para el
bacteriófago Q\beta, que replica ARN de cadena simple, se utiliza
para la amplificación del ADN diana, tal como se describe en Lizardi
et al. Bio. Technology 6:1197, (1988). Primero, el ADN diana
se hibrida con un cebador que incluye un promotor de T7 y una región
con una secuencia 5' de Q\beta. Utilizando este cebador, la
transcriptasa inversa genera ADNc, conectando el cebador a su
extremo 5' en el procedimiento. Estas dos etapas son similares al
protocolo TAS. El heterodúplex resultante se desnaturaliza por
calor. A continuación, un segundo cebador, que contiene una región
con una secuencia 3' de Q\beta, se utiliza para iniciar una
segunda ronda de síntesis de ADNc. Esto resulta en un ADN de cadena
doble que contiene ambos extremos 5' y 3' del bacteriófago Q\beta,
así como un sitio de unión a la ARN polimerasa de T7 activa. A
continuación, la ARN polimerasa de T7 transcribe la doble cadena de
ADN formando un nuevo ARN, que imita el Q\beta. Después de un
lavado extensivo para eliminar cualquier muestra no hibridada, el
nuevo ARN se eluye de la diana y es replicada por la Q\beta
replicasa. Esta última reacción crea una amplificación de 10^{7}
veces en aproximadamente 20 minutos. Puede generarse un ruido de
fondo significativo debido a las cantidades minúsculas de ARN de
muestra que resulta retenido de manera no específica durante la
reacción.
Puede utilizarse una reacción que utilice la
Q\beta replicasa, tal como se ha descrito anteriormente, para la
construcción de una reacción de selección continua en una forma de
realización alternativa según la presente invención.
Por ejemplo, el gen para la Q\beta replicasa
(con regiones 5' y 3' apropiadas) se añade a una reacción de
traducción in vitro y se compartimentaliza. En los
compartimientos, la replicasa se expresa e inmediatamente comienza a
replicar su propio gen. Sólo los genes que codifican una replicasa
activa se replican a sí mismos. La replicación continúa hasta que se
agotan los NTP. Sin embargo, debido a que resulta posible hacer que
los NTP se difundan por la emulsión (ver la descripción de ndk en
los Ejemplos), la reacción de replicación puede alimentarse desde el
exterior y puede continuar durante mucho más tiempo, esencialmente
hasta que no haya sitio libre en el interior de los compartimientos
para una replicación adicional. Resulta posible propagar
adicionalmente la reacción, mediante la dilución en serie de la
mezcla de emulsión en una fase oleosa fresca y su reemulsificación
tras la adición de una fase acuosa fresca que contiene NTP. Es
conocido que la replicasa Q\beta presenta una tendencia elevada al
error, de manera que la replicación por sí sola introduce mucha
diversidad aleatoria (que puede resultar deseable). Los
procedimientos descritos en el presente documento permiten la
evolución de formas de replicasa Q\beta más específicas (por
ejemplo, dependientes de cebador). Como sucede con otras reacciones
de replicación (en particular ndk en los Ejemplos), se puede
evolucionar un abanico de enzimas que alimentan la reacción.
Pueden aprovecharse tecnologías de amplificación
alternativas en la presente invención. Por ejemplo, la amplificación
por círculo rodante (Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225,
1988) es una tecnología de amplificación disponible comercialmente
(RCAT^{TM}) regulada por la ADN polimerasa y que puede replicar
sondas de oligonucleótidos circulares con una cinética tanto lineal
como geométrica bajo condiciones isotérmicas.
En presencia de dos cebadores diseñados
adecuadamente, se produce una amplificación geométrica mediante el
desplazamiento y la hiperramificación de la cadena de ADN para
generar 10^{12} o más copias de cada círculo en 1 hora.
Si se utiliza un solo cebador, RCAT genera, en
pocos minutos, una cadena lineal de miles de copias de ADN unidas en
tándem de una diana unida covalentemente a dicha diana.
\newpage
En otra técnica adicional, la amplificación por
desplazamiento de cadena (SDA; Walter et al., PNAS (USA),
80:392, 1992) comienza con una secuencia específicamente definida
que es única para una diana específica. Aunque, en contraste con
otras técnicas basadas en el termociclado, la SDA es un proceso
isotérmico que utiliza una serie de cebadores, ADN polimerasas y un
enzima de restricción para amplificar exponencialmente la secuencia
única de ácido nucleico.
La SDA comprende tanto una fase de generación de
diana como una fase de amplificación exponencial.
Durante la generación de la diana, el ADN de
cadena doble se desnaturaliza por calor creando dos copias de cadena
simple. Una serie de cebadores especialmente diseñados se combinan
con la ADN polimerasa (cebadores de amplificación para la copia de
la secuencia básica y cebadores de choque para desplazar las cadenas
recién creadas) para formar dianas alteradas capaces de amplificarse
exponencialmente.
El procedimiento de amplificación exponencial
comienza con las dianas alteradas (cadenas parciales de ADN de
cadena simple, con sitios de reconocimiento de enzimas de
restricción) de la etapa de generación de diana.
Se une un cebador de amplificación a cada cadena
en su secuencia de ADN complementario. A continuación, la ADN
polimerasa utiliza el cebador para identificar una posición para
extender el cebador a partir de su extremo 3', utilizando la diana
alterada como molde para añadir nucleótidos individuales. De esta
manera, el cebador extendido forma un segmento de ADN de doble
cadena que contiene un sitio completo de reconocimiento de enzima de
restricción en cada extremo.
A continuación, se une un enzima de restricción
al segmento de ADN de doble cadena en su sitio de reconocimiento. El
enzima de restricción se disocia del sitio de reconocimiento tras
cortar únicamente una cadena del segmento de dos cadenas, formando
una muesca. La ADN polimerasa reconoce la muesca y extiende la
cadena desde este sitio, desplazando la cadena formada previamente.
De esta manera, se producen y se recuperan repetidamente muescas en
el sitio de reconocimiento por parte del enzima de restricción y de
la ADN polimerasa, con un desplazamiento continuo de las cadenas de
ADN que contienen el segmento diana.
Cada cadena desplazada se encuentra disponible a
continuación para la hibridación con los cebadores de amplificación,
tal como se ha indicado anteriormente. El procedimiento continúa con
la repetición de la creación de muescas, de la extensión y del
desplazamiento de nuevas cadenas de ADN, resultando en un
amplificación exponencial del ADN diana original.
Se han utilizado procedimientos conocidos de
evolución in vitro para la generación de moléculas de ARN
catalíticamente activas (ribozimas) con un diverso abanico de
actividades. Sin embargo, estos procedimientos han implicado la
selección mediante automodificación, lo que inherentemente aísla
variantes que dependen de la catálisis de proximidad y que muestran
una actividad reducida en trans.
La compartimentación proporciona unos medios de
selección de ribozimas que verdaderamente actúan en trans,
capaces de recambio múltiple, sin la necesidad de unir el sustrato
al ribozima mediante interacciones de enlace covalente o de enlaces
de hidrógeno (es decir, mediante apareamiento de bases).
En su caso más sencillo, puede introducirse en
la emulsión un gen que codifica un ribozima y transcribirse
fácilmente, tal como se ha demostrado mediante la transcripción y la
amplificación 3SR in situ del ARN que codifica la polimerasa
Taq, de la manera siguiente: primero, el gen de la polimerasa
Taq se transcribe en emulsión. Se emulsionan 100 \mul de
una mezcla de reacción que comprende HEPES-KOH 80 mM
(pH 7,5), MgCl_{2} 24 mM, espermidina 2 mM, DTT 40 mM, rNTP (30
mM), 50 ng de molde Taq de T7 (ver el Ejemplo 18. Selección
mediante la utilización de la replicación autosostenida de
secuencias, 3SR), 60 unidades de ARN polimerasa de T7 (USB), 40
unidades de ARNsin (Promega), utilizando el protocolo estándar. Las
emulsiones se incuban a 37°C durante un periodo de hasta 6 horas, y
el análisis de los productos de reacción mediante electroforesis en
gel mostró niveles de producción de ARN comparables a los del
control no emulsionado.
Mediante la creación de una proyección 5' (por
ejemplo, mediante la ligación de adaptadores de ADN o de ARN) en el
gen emulsionado, se seleccionan las variantes de ARN con la
capacidad de llevar a cabo la adición dirigida por molde de dNTP
sucesivos en trans (es decir la actividad de polimerasa, ver
figura 6). Los genes que han sido "rellenados" pueden
rescatarse mediante PCR utilizando cebadores complementarios a la
región de cadena simple del gen (es decir, la región de cadena
simple previa al rellenado por ribozima) o mediante la captura de
nucleótidos modificados con biotina (o modificados de otra manera)
que se incorporan tras la PCR. En los compartimientos sin actividad
de ARN catalítico, esta región sigue siendo de cadena simple, y la
PCR no consigue amplificar el molde (alternativamente no se
incorporan los nucleótidos y el molde no resulta capturado, y se
elimina).
También puede utilizarse un enfoque de
acoplamiento para extender adicionalmente el abanico de actividades
enzimáticas que pueden seleccionarse. Por ejemplo, la
coemulsificación de una ADN polimerasa con el gen descrito
anteriormente (proyección 5') puede utilizarse para seleccionar los
ribozimas que convierten un sustrato NTP, que en otras
circunstancias no resulta adecuado, en un sustrato que puede ser
utilizado por la polimerasa. Tal como anteriormente, el gen
"rellenado" puede rescatarse a continuación mediante PCR. Este
enfoque también puede utilizarse para seleccionar proteínas enzimas
polimerasa producidas in situ a partir de un molde similar
(es decir, con una proyección 3'). En la figura 6 se proporciona un
diagrama que muestra la selección de ARN que presenta actividad
catalítica.
En otra forma de realización, la presente
invención se utiliza para seleccionar un polipéptido capaz de
modificar la actividad de una replicasa. En esta forma de
realización, se genera un conjunto de ácidos nucleicos que comprende
elementos que codifican uno o más polipéptidos candidatos. Los
elementos de la biblioteca de ácidos nucleicos se compartimentalizan
junto con una replicasa (que, tal como se ha explicado
anteriormente, es capaz de actuar sólo sobre el ácido nucleico que
codifica el polipéptido).
Los polipéptidos candidatos pueden ser
funcionalmente o químicamente distintos entre sí o pueden ser
variantes de un polipéptido del que se conoce, o del que se
sospecha, que resulta capaz de modular la actividad de replicasa. A
continuación, los elementos del conjunto se segregan en
compartimientos junto con los polipéptidos o los polinucleótidos que
codifican, de manera que, preferentemente, cada compartimiento
comprende un solo elemento del conjunto junto con su polipéptido
afín codificado. Cada compartimiento también comprende una o más
moléculas de la replicasa. Por lo tanto, el polipéptido codificado
resulta capaz de modular la actividad de replicasa, impidiendo o
potenciando la replicación del ácido nucleico compartimentado (es
decir, el ácido nucleico que codifica el polipéptido). De esta
manera, el polipéptido resulta capaz de actuar, a través de la
replicasa, incrementando o reduciendo el número de moléculas de su
ácido nucleico codificante. En una forma de realización altamente
preferida de la presente invención, el polipéptido resulta capaz de
mejorar la actividad de replicasa, permitiendo detectar o
seleccionar el polipéptido mediante la detección del ácido nucleico
codificante.
El polipéptido modulador puede actuar directa o
indirectamente sobre la replicasa. Por ejemplo, el polipéptido
modulador puede ser un enzima que comprende una actividad, que actúa
sobre la molécula replicasa, por ejemplo, mediante una modificación
postraducción de la replicasa, activando o inactivando la replicasa.
El polipéptido puede actuar quitando o añadiendo un ligando de la
molécula de replicasa. Es conocido que muchas replicasas, tales como
las polimerasas y las ligasas, se regulan mediante fosforilación, de
manera que en las formas de realización preferidas, el polipéptido
según la presente invención es una quinasa o una fosforilasa. El
polipéptido modulador también puede interaccionar directamente con
la replicasa y modificar sus propiedades (por ejemplo, la
tiorredoxina y la ADN polimerasa de T7, elementos del replisoma, por
ejemplo el anclaje, la helicasa etc. con la ADN polimerasa III).
Alternativamente, el polipéptido modulador puede
ejercer sus efectos sobre la replicasa de una manera indirecta. Por
ejemplo, la modulación de la actividad de replicasa puede tener
lugar mediante un tercer cuerpo, que resulta modificado por el
polipéptido modulador, por ejemplo tal como se ha descrito
anteriormente.
Además, el polipéptido modulador puede ser un
enzima que forma parte de una ruta que proporciona, como producto
final, un sustrato para la replicasa. En esta forma de realización,
el polipéptido modulador se encuentra implicado en la síntesis de un
intermediario (o el producto final) de la ruta. De acuerdo con ello,
la tasa de replicación (y por lo tanto la cantidad de ácido nucleico
que codifica el polipéptido) depende de la actividad del polipéptido
modulador.
Por ejemplo, el polipéptido modulador puede ser
una quinasa implicada en la biosíntesis de bases,
dexosirribonucleósidos, desoxirribonucleótidos, tales como dAMP,
dCMP, dGMP y dTMP, desoxirribonucleósidos difosfato (tales como
dADP, dCDP, dCTP y dTDP), desoxirribonucleósidos trifosfato, tales
como dATP, dCTP, dGTP o dTTP, o nucleósidos, nucleótidos, tales como
AMP, CMP, GMP y UMP, nucleósidos difosfato (tales como ADP, CDP, CTP
y UDP), nucleósidos trifosfato, tales como ATP, CTP, GTP o UTP, etc.
El polipéptido modulador puede encontrarse implicado en la síntesis
de otros intermediarios en la biosíntesis de los nucleótidos (tal
como se describe y es bien conocido en los libros de texto de
bioquímica, tales como el de Stryer o el de Lehninger), tales como
IMP, ácido
5-fosfo-\alpha-D-ribosa-1-pirofosfórico,
5-fosfo-\beta-D-ribosilamina,
5-fosforribosil-glicinamida,
5-fosforribosil-N-formilglicinamida,
etc. De esta manera, el polipéptido puede comprender un enzima, tal
como la ribosafosfato pirofosfoquinasa, la fosforribosilglicinamida
sintetasa, etc. Otros ejemplos de tales polipéptidos resultarán
evidentes para los expertos en la materia. Los procedimientos de la
presente invención permiten la selección de estos polipéptidos con
actividad catalítica mejorada.
Todavía en otra forma de realización, el
modulador "desbloquea" un constituyente del cóctel de
replicación (cebadores, dNTP, replicasa, etc.). Un ejemplo de un
constituyente bloqueado sería un cebador o un dNTP con un grupo
químico unido que inhibe la replicasa utilizada en el ciclo CSR.
Alternativamente, la pareja de cebadores utilizada podría
engancharse covalentemente por un agente de unión, permitiendo la
escisión del agente por parte del modulador, que los dos cebadores
amplifiquen su gen en presencia de replicasa suplementada. Un
ejemplo de un agente de unión sería un ácido
nucleico-péptido (PNA). Además, mediante el diseño
de un oligonucleótido de grandes dimensiones codificante de una
pareja de cebadores con inclusión de la secuencia de nucleótidos
diana, podrían evolucionar nuevos enzimas de restricción específicos
de sitio. Tal como se ha indicado anteriormente, la tasa de
replicación (y por lo tanto la cantidad de ácido nucleico que
codifica el polipéptido) depende de la actividad del polipéptido
modulador. Alternativamente, el modulador puede modificar el extremo
5' de un cebador de manera que los productos de la amplificación que
incorporan el cebador pueden capturarse mediante un agente adecuado
(por ejemplo, mediante un anticuerpo) y, de esta manera,
enriquecerse y amplificarse nuevamente.
En una forma de realización adicional, el
alcance de la CSR puede ampliarse adicionalmente para seleccionar
polipéptidos que no son necesariamente termoestables. Se
compartimentalizan vehículos de transporte (por ejemplo E.
coli) que contienen constructos de expresión que codifican una
forma secretable de un modulador/replicasa de interés. La inclusión
de un agente de inducción en la fase acuosa y la incubación a una
temperatura permisiva (por ejemplo, 37°C) permite la expresión y la
secreción del modulador/replicasa en el interior del compartimiento.
A continuación, se deja suficiente tiempo para que el modulador
actúe de cualquiera de las maneras mencionadas anteriormente, con el
fin de facilitar la posterior amplificación del gen codificante del
mismo (por ejemplo, consumiendo un inhibidor de replicación). El
cambio de temperatura consiguiente durante el procedimiento de
amplificación sirve para eliminar del compartimiento las actividades
enzimáticas de la célula huésped (que han sido segregadas hasta este
momento de la fase acuosa) y liberar el gen codificante para la
amplificación.
De esta manera, según una forma de realización
de la presente invención, se proporciona un procedimiento de
selección de un polipéptido implicado en una ruta que presenta, como
producto final, un sustrato que se encuentra implicado en una
reacción de replicación ("un polipéptido de la ruta"),
comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes: (a)
proporcionar una replicasa; (b) proporcionar un conjunto de ácidos
nucleicos que comprende elementos codificantes cada uno de ellos de
un polipéptido de la ruta o de una variante de un polipéptido de la
ruta; (c) subdividir el conjunto de ácidos nucleicos en
compartimientos, de manera que cada compartimiento comprenda un
elemento ácido nucleico del conjunto, el polipéptido de la ruta o la
variante codificada por el elemento ácido nucleico, la replicasa, y
otros componentes de la ruta; y (d) detectar la amplificación de los
elementos ácido nucleico por parte de la replicasa.
Los Ejemplos (en particular el Ejemplo 19 y los
Ejemplos siguientes) muestran la utilización de la presente
invención en la selección de la nucleósido difosfato quinasa (NDP
quinasa), que cataliza la transferencia de un grupo fosfato desde el
ATP a un desoxinucleósido difosfato para la producción de
desoxinucleósido trifosfato.
Todavía en otra forma de realización, el
polipéptido modulador consume un inhibidor de la actividad de
replicasa. Por ejemplo, es conocido que la heparina es un inhibidor
de la actividad de replicasa (polimerasa). El presente procedimiento
permite la selección de una heparinasa con una actividad mejorada,
mediante la compartimentación de una biblioteca de ácidos nucleicos
que codifican la heparinasa o variantes de este enzima, en presencia
de heparina y polimerasa. Las variantes de heparinasa con actividad
mejorada resultan capaces de romper la heparina más eficazmente o
más rápidamente, eliminando de esta manera la inhibición de la
actividad de replicasa en el interior del compartimiento y
permitiendo la replicación del ácido nucleico en el interior del
compartimiento (es decir, el ácido nucleico que codifica esa
variante de heparinasa).
Los sistemas de selección de interacciones
proteína-proteína más importantes son los
procedimientos in vivo, siendo el más importante y el mejor
desarrollado el sistema de levadura de dos híbridos (Fields &
Song, Nature, 340:245-246, 1989). En este
sistema y en enfoques relacionados, se generan dos proteínas
híbridas: un híbrido-cebo que comprende proteína X
fusionada a un dominio de unión del ADN y un
híbrido-presa que comprende la proteína Y fusionada
a un dominio de activación de la transcripción con una interacción
afín de X e Y que reconstituye el activador transcripcional. Se han
propuesto otros dos sistemas in vivo en los que la cadena
polipeptídica de un enzima se expresa en dos partes fusionadas a dos
proteínas X e Y, en las que la interacción afín X-Y
reconstituye la función del enzima (Karimova, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 95:5752-6, 1998; Pelletier, Nat.
Biotechnol. 17:683-690, 1999) proporcionando un
fenotipo seleccionable sobre la célula.
Se ha demostrado recientemente que la polimerasa
Taq puede dividirse de una manera similar (Vainshtein et
al., Protein Science 5:1785, 1996). Según la presente invención,
por lo tanto, se proporciona un procedimiento de selección de una
pareja de polipéptidos capaces de interaccionar establemente,
mediante la división de la polimerasa Taq o de cualquier otro
enzima o factor auxiliar a la reacción de la polimerasa.
Este procedimiento comprende diversas etapas. La
primera etapa consiste en proporcionar un primer ácido nucleico y un
segundo ácido nucleico. El primer ácido nucleico codifica una
primera proteína de fusión que comprende un primer subdominio de un
enzima replicasa (u otros, véase anteriormente) fusionado a un
primer polipéptido, mientras que el segundo ácido nucleico codifica
una segunda proteína de fusión que comprende un segundo subdominio
de un enzima replicasa (u otros, véase anteriormente) fusionado a un
segundo polipéptido. La naturaleza de las dos proteínas de fusión
permite que la interacción estable de los subdominios de la primera
y de la segunda replicasa (u otros, véase anteriormente) genere la
actividad de replicasa (bien directa o indirectamente). Por lo menos
uno de entre los primer y segundo ácidos nucleicos (preferentemente
ambos) se proporciona en forma de un conjunto de ácidos nucleicos
que codifican las variantes del primer y/o segundo polipéptido o
polipéptidos, respectivamente.
A continuación, el conjunto o conjuntos de
ácidos nucleicos se subdivididen en compartimientos, de manera que
cada compartimiento comprende un primer ácido nucleico y un segundo
ácido nucleico, junto con sus respectivas proteínas de fusión
codificadas mediante el primer y el segundo ácidos nucleicos.
Después, se deja que el primer polipéptido se una al segundo
polipéptido, de manera que la unión del primer y el segundo
polipéptido lleve a una interacción estable de los subdominios de la
replicasa, generando la actividad de replicasa. Finalmente, se
detecta la amplificación de por lo menos uno de entre el primer y el
segundo ácidos núcleos, por parte de la replicasa.
La presente invención, por lo tanto, cubre un
sistema de selección in vitro en el que la reconstitución de
la función de la replicasa mediante la asociación afín de dos
ligandos polipéptidos conduce a la amplificación y a la unión de los
genes de los dos ligandos. Este sistema in vitro de dos
híbridos resulta particularmente adecuado para la investigación de
las interacciones proteína-proteína a temperaturas
elevadas, por ejemplo, para la investigación de los protenomas de
los organismos termofílicos o para la construcción de interacciones
altamente estables.
El sistema también puede aplicarse al cribado y
aislamiento de compuestos moleculares que estimulan las
interacciones afines. Por ejemplo, los compuestos pueden encontrarse
químicamente unidos a los cebadores o a los dNTP y, de esta manera,
sólo incorporarse a amplicones si estimulan la asociación. Con el
fin de evitar entrecruzamientos, dichos compuestos deberían
liberarse sólo después de que la compartimentación haya finalizado,
por ejemplo mediante acoplamiento a microperlas o mediante inclusión
en microesferas solubles.
Resulta deseable la selección de condiciones de
encapsulación adecuadas. Dependiendo de la complejidad y del tamaño
de la biblioteca que debe cribarse, puede resultar beneficioso
configurar el procedimiento de encapsulación de manera que 1 o menos
de 1 ácido nucleico se encapsulen en cada microcápsula o
compartimiento. Esto proporcionará el máximo poder de resolución.
Sin embargo, cuando la biblioteca es de mayor tamaño y/o
complejidad, esto puede resultar inviable; puede resultar preferido
encapsular o compartimentalizar juntos varios ácidos nucleicos y
depender de la aplicación repetida del procedimiento de la presente
invención para conseguir la separación de la actividad deseada.
Puede utilizarse una combinación de los procedimientos de
encapsulación para obtener el enriquecimiento deseado.
Los estudios teóricos indican que, cuanto mayor
es el número de variantes de ácidos nucleicos creados, mayor es la
probabilidad de que una molécula creada presente las propiedades
deseadas (ver Perelson y Oster, J. Theor. Biol. 81:64570,
1979, para una descripción de la aplicación de esta observación a
repertorios de anticuerpos). Recientemente también se ha confirmado
en la práctica que, de hecho, los repertorios de
anticuerpos-fagos mayores generan más anticuerpos
con mejores afinidades de unión que los repertorios menores
(Griffiths et al., Embo. J. 13:3245-60,
1994). Para garantizar que se generan las variantes raras y que, de
esta manera, podrán ser seleccionadas, resulta deseable un tamaño
grande de biblioteca. De esta manera, resulta beneficiosa la
utilización de microcápsulas óptimamente pequeñas.
Además de los ácidos nucleicos descritos
anteriormente, las microcápsulas o compartimientos según la presente
invención pueden comprender adicionalmente los componentes
requeridos para que tenga lugar la reacción de replicación. Entre
otros componentes que el sistema puede comprender se incluyen los
necesarios para la transcripción y/o la traducción del ácido
nucleico. Éstos se seleccionan para los requisitos de un sistema
específico de entre los siguientes: un tampón adecuado, un sistema
de transcripción/replicación in vitro y/o un sistema de
traducción in vivo que contiene todos los ingredientes, los
enzimas y los cofactores necesarios, ARN polimerasa, nucleótidos,
ácidos nucleicos (naturales o sintéticos), los ARN de transferencia,
ribosomas y aminoácidos, y los sustratos de la reacción de interés
para permitir la selección del producto génico modificado.
Un tampón adecuado es en el que todos los
componentes deseados del sistema biológico se encuentran activos y,
por lo tanto, dependerá de los requisitos de cada sistema de
reacción específico. Son conocidos de la técnica los tampones
adecuados para las reacciones biológicas y/o químicas y se
proporcionan recetas en diversos textos de laboratorio (Sambrook
et al., Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, New York, 1989).
La replicasa puede proporcionase mediante la
expresión en un huésped adecuado, tal como se describe en otros
sitios, o puede producirse mediante una transcripción/traducción
in vitro en un sistema adecuado, tal como es conocido de la
técnica.
El sistema de traducción in vitro
habitualmente comprende un extracto celular, típicamente bacteriano
(Zubay, Annu. Rev. Genet. 7:267-87, 1973;
Zubay, Methods Enzymol. 65:856-77, 1980;
Lesley et al., J. Biol. Chem.
266(4):2632-8, 1991; Lesley, Methods Mol.
Biol. 37:265-78, 1995), reticulocitos de conejo
(Pelham y Jackson, Eur. J. Biochem.
67:247-56, 1976), o germen de trigo (Anderson et
al., Methods Enzymol. 101:635-44, 1983). Muchos
sistemas adecuados se encuentran disponibles comercialmente (por
ejemplo de Promega), incluyendo algunos que permiten la
transcripción/traducción acoplada (todos los sistemas bacterianos y
todos los sistemas de extractos de reticulocitos y de germen de
trigo TNT^{TM} de Promega). La mezcla de aminoácidos utilizada
puede incluir, si se desea, aminoácidos sintéticos, para incrementar
el posible número de variedades de proteínas producidas en la
biblioteca. Esto puede conseguirse cargando los ARNt con aminoácidos
artificiales y utilizando estos ARNt para la traducción in
vitro de las proteínas que se van a seleccionar (Ellman et
al., Methods Enzymol. 202:301-36, 1991; Benner,
Trends Biotechnol. 12:158-63, 1994; Mendel et
al., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.
24:435-62, 1995). La utilización de sistemas de
traducción in vitro reconstituidos a partir de componentes
purificados como el sistema PURE (Shimizu et al., Nat.
Biotech. 19:751, 2001) puede resultar particularmente
deseable.
Después de cada ronda de selección, puede
someterse a ensayo el enriquecimiento de los ácidos nucleicos del
conjunto para los que codifican las moléculas de interés, mediante
una transcripción/replicación in vitro no compartimentada o
mediante reacciones de transcripción-traducción
acopladas. El conjunto seleccionado se clona en un vector plásmido
adecuado y el ARN o la proteína recombinante se produce a partir de
los clones individuales para purificación y ensayo adicionales.
La presente invención se refiere además a un
procedimiento para la producción de un producto génico, tras
seleccionar mediante el procedimiento de la presente invención el
ácido nucleico que codifica el producto génico. Claramente, el ácido
nucleico mismo puede expresarse directamente mediante medios
convencionales para producir el producto génico. Sin embargo, pueden
utilizarse técnicas alternativas, tal como resultará evidente para
los expertos en la materia. Por ejemplo, la información genética
incorporada en el producto génico puede incorporarse a un vector de
expresión adecuado, y expresarse en el mismo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "compartimiento" es sinónimo de "microcápsula" y
los términos se utilizan de manera intercambiable. La función del
compartimiento es permitir la colocalización del ácido nucleico y
del correspondiente polipéptido codificado por el ácido nucleico.
Preferentemente, esto se consigue mediante la capacidad del
compartimiento para restringir sustancialmente la difusión del molde
y de las cadenas del producto a otros compartimientos. Cualquier
actividad de replicasa del polipéptido se restringe, por lo tanto, a
cualquier ácido nucleico confinado dentro del compartimiento, y no a
otros ácidos nucleicos presentes en otros compartimientos. Otra
función de los compartimientos es la de restringir la difusión de
las moléculas generadas en una reacción química o enzimática, que
alimentan o desbloquean una reacción de replicación.
Los compartimientos de la presente invención,
por lo tanto, requieren de unas propiedades físicas adecuadas para
permitir el funcionamiento de la presente invención.
En primer lugar, con el fin de garantizar que
los ácidos nucleicos y los polipéptidos no se difundan entre
compartimientos, el contenido de cada compartimiento debe aislarse
del contenido de los compartimientos circundantes, de manera que
exista un intercambio mínimo o nulo de ácidos nucleicos y de
polipéptidos entre compartimientos a una escala de tiempo
significativa.
En segundo lugar, el procedimiento de la
presente mención requiere la existencia de sólo una cantidad
limitada de ácidos nucleicos en cada compartimiento, o que todos los
elementos en el interior de cada compartimiento sean clónicos (es
decir, idénticos). Esto garantiza que el polipéptido codificado por
cada ácido nucleico individual, y que corresponde a dicho ácido
nucleico, se encuentre aislado de otros ácidos nucleicos diferentes.
De esta manera, el acoplamiento entre ácidos nucleicos y sus
correspondientes polipéptidos será altamente específico. El máximo
factor de enriquecimiento se consigue con una media de una o menos
especies clónicas de ácido nucleico por compartimiento, siendo la
unión entre el ácido nucleico y la actividad del polipéptido
codificado tan estrecha como resulte posible, debido a que el
polipéptido codificado por un ácido nucleico individual permanece
aislado del resto de productos de otros ácidos nucleicos. Sin
embargo, incluso cuando no se dé la situación teórica óptima de una
media de un ácido nucleico, o inferior, por compartimiento, puede
resultar beneficiosa una cantidad de 5, 10, 50, 100 ó 1.000, o más,
ácidos nucleicos por compartimiento para la selección en una
biblioteca de gran tamaño. Las rondas de selección posteriores,
incluyendo las compartimentaciones renovadas con diferentes
distribuciones de ácidos nucleicos, permitirán una selección más
estricta de los ácidos nucleicos. Preferentemente, la media es de
una única especie clónica de ácido nucleico, o menos, por
compartimiento.
Además, cada compartimiento contiene un ácido
nucleico; esto significa que, aunque algunos compartimientos pueden
permanecer vacíos, las condiciones se ajustan de manera que,
estadísticamente, cada compartimiento contenga por lo menos uno, y
preferentemente únicamente un ácido nucleico.
En tercer lugar, la formación y la composición
de los compartimientos no debe destruir el funcionamiento de la
maquinaria de expresión de los ácidos nucleicos ni la actividad de
los polipéptidos.
En consecuencia, cualquier sistema de
compartimentación utilizado debe cumplir dichos tres requisitos. El
sistema o sistemas apropiados pueden variar dependiendo de la
naturaleza precisa de los requisitos de cada aplicación de la
presente invención, tal como resultará evidente para el experto en
la materia.
Se encuentra disponible una diversidad de
tecnologías de compartimentación, por ejemplo los afrones gaseosos
(Juaregi y Varley, Biotechnol. Bioeng. 59:471, 1998) y los
nanotubos prefabricados (Huang y Schreiber, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 94:25, 1997). Resultan deseables tamaños de
compartimiento y químicas superficiales diferentes para las
diferentes aplicaciones, tal como se describe con mayor detalle a
continuación. Por ejemplo, puede resultar suficiente la utilización
de materiales porosos limitadores de la difusión, tales como geles o
alginatos (Draget et al., Int. J. Macromol. 21:47, 1997) o
materiales de tipo zeolita. Además, cuando se realiza una PCR in
situ o una PCR en celdas, las celdas pueden tratarse con un
fijador entrecruzante para formar compartimientos porosos que
permitan la difusión de los dNTP, los enzimas y los cebadores.
\newpage
Se dispone de una gran diversidad de
procedimientos de compartimentación o de microencapsulación (Benita,
S., editor, Microencapsulation: methods and industrial applications.
Drugs and pharmaceutical sciences. Editado por Swarbrick, J. New
York: Marcel Dekker, 1996) y pueden utilizarse para la creación de
compartimientos utilizados de acuerdo con la presente invención. De
hecho, se han identificado más de 200 procedimientos de
microencapsulación o de compartimentación en la literatura (Finch,
C. A., Encapsulation and controlled release. Spec. Publ. R. Soc.
Chem. 138:35, 1993).
Entre éstos se incluyen las vesículas acuosas
rodeadas de membrana, tales como las vesículas de lípidos
(liposomas)(New, R. R. C., editor, Liposomes: a practical approach.
The practical approach series. Editado por Rickwood, D. y Hames, B.
D. Oxford University Press, 1990) y las vesículas surfactantes
aniónicas (Van Hal, D. A., Bouwstra, J. A. y Junginger, H. E.,
Nonionic surfactant vesicles containing estradiol for topical
application, en: Microencapsulation: methods and industrial
applications (Benita, S. editor), páginas
329-347. Marcel Dekker, New York, 1996). Éstas son
cápsulas membranosas cerradas de una única o múltiples bicapas de
moléculas ensambladas de manera no covalente, estando separada cada
bicapa de las bicapas contiguas por un compartimiento acuoso. En el
caso de los liposomas, la membrana se compone de moléculas de
lípidos; éstos habitualmente son fosfolípidos, aunque también pueden
incorporarse esteroles, tales como el colesterol, al interior de las
membranas (New, R. R. C., editor, Liposomes: a practical approach.
The practical approach series. Editado por Rickwook, D. y Hames, B.
D., Oxford: Oxford University Press, 1990). Se pueden llevar a cabo
una diversidad de reacciones bioquímicas catalizadas por enzimas,
incluyendo la polimerización de ADN y ARN, en el interior de los
liposomas (Chakrabarti J. Mol. Evol.,
39:555-9, 1994; Oberholzer Biochem. Biophys. Res.
Commun. 207:250-7, 1995; Oberholzer Chem.
Biol. 2:677-82, 1995; Walde, Biotechnol.
Bioeng. 57:216-219, 1998; Wick y Luisi, Chem.
Biol. 3:277-85, 1996).
Con un sistema de vesículas rodeadas de membrana
la mayor parte de la fase acuosa se encuentra en el exterior de las
vesículas y, por lo tanto, no se encuentra compartimentada. Esta
fase acuosa continua debe eliminarse, o inhibir o destruir los
sistemas biológicos presentes en la misma (por ejemplo mediante la
digestión de los ácidos nucleicos con ADNsa o ARNasa) con el fin de
que las reacciones se encuentren limitadas a las microcápsulas
compartimentadas (Luisi et al., Methods Enzymol.
136:188-216, 1987).
Se ha demostrado que las reacciones bioquímicas
catalizadas por enzimas también pueden realizarse en compartimientos
de microcápsulas generados mediante una diversidad de procedimientos
diferentes. Muchos enzimas se encuentran activos en las soluciones
de micelas inversas (Bru y Walde, Eur. J. Biochem.
199:95-103, 1991; Bru y Walde, Biochem. Mol. Biol.
Int. 31:685-92, 1993; Creagh et al., Enzyme
Microb. Technol. 15:383-92, 1993; Haber et
al., 1993; Kumar et al., Biophys. J.
55:789-792, 1989; Luisi, P. L. y B., S. H. Activity
and conformation of enzymes in reverse micellar solutions. Methods
Enzymol. 136(188):188-216, 1987; Mao y Walde,
Biochem. Biophys. Res. Comun. 178:1105-1112, 1991;
Mao, Q. y Walde, P., Substrate effects on the enzymatic activity of
alpha-chymotrypsin in reverse micelles, Biochem.
Biophys. Res. Commun. 178(3):1105-12, 1991;
Mao Eur. J. Biochem. 208:165-70, 1992; Perez, G. M.,
Sanchez, F. A. y Garcia, C. F. Application of
active-phase plot to the kinetic analysis of
lipoxygenase in reverse micelles, Biochem. J. (1992), Walde, P.,
Goto, A., Monnard, P. A., Wessicken, M. y Luisi, P. L., Oparin's
reactions revisited: enzymatic synthesis of poly(adenylic
acid) in micelles and self-reproducing vesicles, J.
Am. Chem. Soc. 116:7541-7547, 1994; Walde, P., Han
D. y Luisi, P. L. Spectroscopic and kinetic studies of lipases
solubilized in reverse micelles, Biochemistry
32:4029-34, 1993; Walde Eur. J. Biochem.
173:401-9, 1988), tales como el sistema
AOT-isooctano-agua (Menger, F. M. y
Yamada, K. J. Am. Chem. Soc. 101:6731-6734,
1979).
Los compartimientos pueden asimismo generarse
mediante polimerización interfacial y complejación interfacial
(Whateley, T. L. Microcapsules: preparation by interfacial
polymerisation and interfacial complexation and their applications,
in Microencapsulation: methods and industrial applications (Benita,
S. ed.), páginas 349-375, Marcel Dekker, New York,
1996). Los compartimientos de las microcápsulas de este tipo pueden
presentar membranas rígidas no permeables o semipermeables. Todas
las microcápsulas semipermeables limitadas por membranas de nitrato
de celulosa, por membranas de poliamida y por membranas de
lípido-poliamida pueden soportar reacciones
bioquímicas, incluyendo sistemas multienzima (Chang, Methods
Enzymol. 136:67-82, 1987; Chang, Artif. Organs.
16:71-4, 1992; Lim, Appl. Biochem. Biotechnol.
10:81-5, 1984). Los compartimientos de
alginato/polilisina (Lim y Sun, Science 210:908-10,
1980), que pueden formarse bajo condiciones muy suaves, han
demostrado ser muy biocompatibles, proporcionando, por ejemplo, un
procedimiento eficaz de encapsulado de células y tejidos vivos
(Chang, Artif. Organs. 16:71-4, 1992; Sun, ASAIO J.
38:125-7, 1992).
También pueden utilizarse sistemas de
compartimentación no membranosos basados en la partición de fases de
un medio acuoso en un sistema coloidal, tal como una emulsión.
Preferentemente, los compartimientos de la
presente invención se forman a partir de emulsiones; sistemas
heterogéneos de dos fases líquidas no miscibles con una de las fases
dispersada en la otra en forma de gotas de tamaño microscópico o
coloidal (Becher, P. Emulsions: theory and practice, Reinhold, New
York, 1957; Sherman, P. Emulsion Science, Academic Press, London,
1968; Lissant, K. J., editor, Emulsions and emulsion
technology, Surfactant Science, New York: Marcel Dekker, 1974;
Lissant, K. J., editor, Emulsions and emulsion technology,
Surfactant Science, New York: Marcel Dekker, 1984).
Las emulsiones pueden producirse a partir de
cualquier combinación adecuada de líquidos no miscibles.
Preferentemente, la emulsión de la presente invención presenta agua
(que contiene los componentes bioquímicos) como la fase presente en
forma de gotas finamente divididas (la fase dispersa, interna o
discontinua) y un líquido hidrofóbico no miscible (un "aceite")
como la matriz en la que se suspenden estas gotas (la fase no
dispersa, continua o externa). Dichas emulsiones son conocidas como
dispersiones "de agua en aceite" (W/O). Esto presenta la
ventaja de que toda la fase acuosa que contiene los componentes
bioquímicos se encuentra compartimentada en gotas discretas (la fase
interna). La fase externa, siendo un aceite hidrofóbico,
generalmente no contiene componentes bioquímicos y, por lo tanto, es
inerte.
La emulsión puede estabilizarse mediante la
adición de uno o más agentes activos en superficie (surfactantes).
Estos surfactantes son conocidos como agentes emulsionantes y actúan
en la interfase agua/aceite para evitar (o por lo menos para
demorar) la separación de las fases. Pueden utilizarse muchos
aceites y emulsionantes para la generación de emulsiones de agua en
aceite; una compilación reciente proporciona una lista de más de
16.000 surfactantes, muchos de los cuales se utilizan como agentes
emulsionantes (Ash, M. y Ash, I. Handbook of industrial surfactants,
Gower, Aldershot, 1993). Entre los aceites adecuados se incluyen el
aceite mineral blanco ligero y los surfactantes aniónicos (Schik,
1966 ), tales como el monoleato de sorbitán (Span^{TM} 80; ICI) y
el monoleato de polioxietilensorbitán (Tween^{TM} 80; ICI) o el
t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton
X-100).
La utilización de surfactantes aniónicos también
puede resultar beneficiosa. Entre los surfactantes adecuados se
incluyen el colato sódico y el taurocolato sódico. El desoxicolato
sódico resulta particularmente preferido, preferentemente a una
concentración de 0,5% p/v o inferior. La inclusión de dichos
surfactantes puede, en algunos casos, incrementar la expresión de
los ácidos nucleicos y/o la actividad de los polipéptidos. La
adición de ciertos surfactantes aniónicos a una mezcla de reacción
no emulsionada impide completamente la traducción. Durante la
emulsificación, sin embargo, el surfactante se transfiere desde la
fase acuosa hasta la interfase y la actividad se recupera. La
adición de un surfactante aniónico a las mezclas que se van a
emulsificar garantiza que las reacciones se produzcan sólo una vez
finalizada la compartimentación.
La creación de una emulsión requiere
generalmente la aplicación de energía mecánica para forzar la unión
de las fases. Existe una diversidad de maneras para ello que
utilizan una diversidad de dispositivos mecánicos, incluyendo
agitadores (tales como barras agitadores magnéticas, agitadores de
hélices y turbinas, dispositivos de palas y batidoras),
homogeneizadores (incluyendo homogeneizadores de
rotor-estator, homogeneizadores de válvula de alta
presión y homogeneizadores a chorro), molinos coloidales;
dispositivos ultrasónicos y dispositivos de "emulsificación por
membrana" (Becher, P., Emulsions: theory and practice, Reinhold,
New York, 1957; Dickinson, E. In Wedlock, D. J. (editor), Emulsions
and droplet size control,
Butterworth-Heine-mann, Oxford, Vol.
páginas 191-257, 1994).
Los compartimientos acuosos formados en
emulsiones de agua en aceite generalmente son estables, con poco o
ningún intercambio de polipéptidos o ácidos nucleicos entre
compartimientos. Además, es conocido que varias reacciones
bioquímicas pueden transcurrir en compartimientos en emulsión.
Además, los procesos bioquímicos complejos, notablemente la
transcripción y la traducción génicas, también se encuentran activos
en el interior de las microcápsulas en emulsión. En la actualidad
existe la tecnología para crear emulsiones con volúmenes de cargas
industriales de miles de litros (Becher, P. Emulsions: theory and
practice, Reinhold, New York, 1957; Sherman, P. Emulsion Science,
Academic Press, London, 1968; Lissant, K. J., editor. Emulsions
and emulsion technology, Surfactant Science New York: Marcel
Dekker, 1974; Lissant, K. J., editor. Emulsions and emulsion
technology, Surfactant Science New York: Marcel Dekker,
1984).
El tamaño preferido de compartimiento varía
dependiendo de los requisitos precisos del procedimiento de
selección individual que debe llevarse a cabo de acuerdo con la
presente invención. En todos los casos, debe hallarse un equilibrio
óptimo entre el tamaño de la biblioteca génica, el enriquecimiento
requerido y la concentración de componentes requerida en el interior
de los compartimientos individuales, para conseguir una expresión y
una reactividad eficientes de los polipéptidos.
Los procedimientos de expresión pueden
producirse in situ en el interior de cada microcápsula
individual o bien exógenamente en el interior de las células (por
ejemplo, bacterias) o en otras formas de subcompartimentación
adecuadas. Tanto la transcripción in vitro como la
transcripción-traducción acoplada pierden eficiencia
a concentraciones de ADN subnanomolares. Por lo tanto, el requisito
de la presencia en cantidad limitada de moléculas de ADN en cada
compartimiento genera en la práctica un límite superior al tamaño de
compartimiento posible en el que se lleva a cabo la transcripción
in vitro. Preferentemente, para la expresión in situ
mediante la transcripción y/o la traducción in vitro, el
volumen medio de los compartimientos es inferior a 5,2 x 10^{-16}
m^{3} (correspondiente a un compartimiento esférico de diámetro
inferior a 1 \mum).
Una alternativa es la separación de expresión y
compartimentación, por ejemplo utilizando un huésped celular. Para
la inclusión de células (en particular células eucariotas) pueden
resultar preferidos los diámetros medios de compartimiento superior
a 10 \mum.
Tal como se muestra en los Ejemplos, para
colocalizar el gen de polimerasa y la proteína codificada en el
interior del mismo compartimiento de la emulsión, se utilizó, como
"vehículo de transporte", una bacteria (E. coli) que
sobreexpresaba la polimerasa Taq. Las células de E.
coli (diámetro de 1 \mum a 5 \mum) caben fácilmente en los
compartimientos de la emulsión de la presente invención, dejando
simultáneamente sitio para cantidades suficientes de reactivos de
PCR, tales como nucleótidos trifosfato y cebadores (tal como se
muestra en la figura 2). La etapa de desnaturalización del primer
ciclo de PCR rompe la célula bacteriana y libera la polimerasa
expresada y su gen codificante en el interior del compartimiento,
permitiendo que se produzca la autorreplicación destruyendo
simultáneamente las actividades enzimáticas bacterianas de fondo.
Además, análogamente a las estrategias de inicio en caliente, esta
"subcompartimentación" celular evita la liberación de la
actividad de polimerasa a temperaturas ambiente y los productos de
amplificación no específicos resultantes.
La concentración eficaz de ADN o de ARN en los
compartimientos puede incrementarse artificialmente mediante ciertos
procedimientos que resultarán bien conocidos para los expertos en la
materia. Entre los mismos se incluyen, por ejemplo, la adición de
volumen excluyendo compuestos químicos, tales como
polietilenglicoles (PEG), y una diversidad de técnicas de
amplificación génica, incluyendo la transcripción mediante ARN
polimerasas, incluyendo las de origen bacteriano, tales como la de
E. coli (Roberts, Nature 224:1168-74,
1969; Blattner y Dahlberg, Nat. New Biol.
237:227-32, 1972; Roberts et al., J. Biol.
Chem. 250:5530-41, 1975; Rosenberg et al., J.
Biol. Chem. 250:4755-4764, 1975), eucariotas, por
ejemplo (Weil et al., J. Biol. Chem.
254:6163-6173, 1979; Manley et al., Methods
Enzymol. 101:568-82, 1983) y bacteriófagos, tales
como T7, T3 y SP6 (Melton et al., Nucleic Acids Res.
12:7035-56, 1984); la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) (Saiki et al., Science
239:487-91, 1988); la amplificación por la Q\beta
replicasa (Miele et al., J. Mol. Biol.
171:281-95, 1983; Cahill et al., Clin. Chem.
37:1482-5, 1991; Chetverin y Spirin, Prog. Nucleic
Acid. Res. Mol. Biol. 51:225-70, 1995; Katanaev
et al., FEBS Lett. 359:89-92, 1995); la
reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Landegren et al.,
Science 241:1077-80, 1988; Barany, PCR Methods Appl.
1:5-16, 1991); y el sistema de amplificación
autosostenida de secuencias (Fahy et al., PCR Methods Appl.
1:25-33, 1991) y la amplificación por desplazamiento
de cadena (Walter et al., Nucleic Acids Res.
20:1691-6, 1992). Las técnicas de amplificación
génica que requieren del termociclado, tales como la PCR y la LCR,
también pueden utilizarse si las emulsiones y los sistemas de
transcripción o de transcripción-traducción acoplada
in vitro son termoestables (por ejemplo, los sistemas de
transcripción-traducción acoplada pueden realizarse
a partir de un organismo termoestable, tal como Thermus
aquaticus).
El incremento de la concentración local efectiva
de ácidos nucleicos permite la utilización eficaz de compartimientos
más grandes.
El tamaño del compartimiento debe ser
suficientemente grande para alojar todos los componentes requeridos
para las reacciones bioquímicas que deben producirse en el interior
del compartimiento. Por ejemplo, tanto las reacciones de
transcripción como las reacciones de
transcripción-traducción acoplada in vitro,
requieren de una concentración total de nucleósido trifosfato de
aproximadamente 2 mM.
Por ejemplo, con el fin de transcribir un gen
para formar una única molécula corta de ARN de una longitud de 500
bases, se requeriría un mínimo de 500 moléculas de nucleósido
trifosfato por compartimiento (8,33 x 10^{-22} moles). Con el
objetivo de constituir una solución 2 mM, este número de moléculas
debe estar contenido en el interior de un compartimiento de volumen
4,17 x 10^{-19} litros (4,17 x 10^{-22} m^{3}), que en el caso
de ser un compartimiento esférico presentaría un diámetro de 93 nm.
Por lo tanto, el diámetro mínimo preferido para las microcápsulas es
de aproximadamente 0,1 \mum (100 nm).
Cuando se utilizan huéspedes de expresión como
vehículos de transporte, los requisitos relativos al tamaño del
compartimiento son mucho menos restrictivos. Básicamente, el tamaño
del compartimiento debe ser suficiente para contener el huésped de
expresión, así como cantidades suficientes de reactivos para llevar
a cabo las reacciones requeridas. De esta manera, en estos casos,
resultan preferidos los tamaños de compartimiento más grandes
(>10 \mum). Mediante una elección apropiada del vector
utilizado para la expresión en el huésped, puede controlarse la
concentración de molde en el interior de los compartimientos a
partir del origen del vector y número de copia resultante (por
ejemplo, E. coli: colE(pUC) > 100, p15: 30 a 50,
pSC101: 1 a 4). De la misma manera, la concentración del producto
génico puede controlarse seleccionando el promotor de expresión y el
protocolo de expresión (por ejemplo, la inducción completa de la
expresión frente a la expresión a partir de un promotor débil).
Preferentemente, la concentración del producto génico es la máxima
posible.
Además, la utilización de compartimientos
alimentadores permite la alimentación de sustratos desde el exterior
(ver Ghadessy et al., PNAS 98:4552; 01, 2001). La
alimentación de las reacciones de emulsión desde el exterior puede
permitir dimensiones de compartimiento <0,1 \mum para las
selecciones de ribozimas, debido a que no resulta necesario que los
reactivos se encuentren contenidos por completo en el interior del
compartimiento.
El tamaño de las microcápsulas o de los
compartimientos de la emulsión puede modificarse simplemente
mediante el ajuste de las condiciones de emulsión utilizadas para
formar la emulsión de acuerdo con los requisitos del sistema de
selección. A mayor tamaño de compartimiento, mayor volumen de la
biblioteca de ácidos nucleicos resultará necesario para encapsular
una biblioteca dada de ácidos nucleicos, debido a que el factor
limitativo último será el tamaño del compartimiento y, de esta
manera, el número de compartimientos de microcápsulas posibles por
unidad de volumen.
El tamaño de los compartimientos se selecciona
teniendo en cuenta no sólo los requisitos del sistema de replicación
utilizado para el ácido nucleico, sino también los requisitos del
sistema de selección utilizado para el mismo. De esta manera, los
componentes del sistema de selección, tales como un sistema de
modificación químico, pueden requerir volúmenes de reacción y/o
concentraciones de reactivos que no resultan óptimos para la
replicación. Tal como se describe en la presente memoria, dichos
requisitos pueden cumplirse en una etapa secundaria de
reencapsulación; además, pueden cumplirse mediante la selección del
tamaño de compartimiento, con el fin de maximizar globalmente la
replicación y la selección. Resulta preferido determinar
empíricamente el volumen y la concentración óptimos de los
reactivos, por ejemplo, tal como se describe en la presente
memoria.
En una forma de realización altamente preferida
de la presente invención, la emulsión es una emulsión de agua en
aceite. La emulsión de agua en aceite se prepara mediante la
adición, gota a gota, de la fase acuosa en una fase oleosa en
presencia de un surfactante que comprende Span 80 al 4,5% (v/v),
Tween 80 aproximadamente al 0,4% (v/v) y Triton X100 aproximadamente
entre el 0,05% y el 0.1% (v/v) en aceite mineral, preferentemente en
una proporción de las fases aceite:agua de 2:1 ó 3:1. Aparentemente,
la proporción de los tres surfactantes resulta importante para las
propiedades ventajosas de la emulsión y, de acuerdo con ello, la
presente invención comprende asimismo una emulsión de agua en aceite
que presenta cantidades incrementadas de surfactante, pero que
presenta sustancialmente la misma proporción de Span 80, de Tween 80
y de Triton X100. En una forma de realización preferida, el
surfactante comprende Span 80 al 4,5% (v/v), Tween 80 al 0,4% (v/v)
y Triton X100 al 0,05% (v/v).
La emulsión de agua en aceite se forma
preferentemente bajo agitación constante en viales de criogenización
de fondo redondo de 2 ml bajo agitación constante a 1.000 rpm
durante 4 ó 5 minutos adicionales tras la adición completa de la
fase acuosa. La velocidad de adición puede ser de hasta 12
gotas/minuto (ca. 10 \mul cada gota). La fase acuosa puede
incluir sólo agua, o puede comprender una solución de tampón que
presenta componentes adicionales, tales como ácidos nucleicos,
nucleótidos trifosfato, etc. En una forma de realización preferida,
la fase acuosa comprende una mezcla de reacción PCR, tal como se da
a conocer en otro sitio del presente documento, así como ácidos
nucleicos y polimerasa. La emulsión de agua en aceite puede formarse
a partir de una fase acuosa de 200 \mul (por ejemplo, una mezcla
de reacción PCR) y una fase oleosa de 400 \mul, tal como se ha
descrito anteriormente.
La emulsión de agua en aceite según la presente
invención presenta propiedades ventajosas de estabilidad térmica
incrementada. De esta manera, no se aprecian cambios en el tamaño de
los compartimientos ni evidencia de coalescencia tras 20 ciclos de
PCR, según el análisis de difracción láser y al microscopio óptico.
Esto se muestra en la figura 2. Además, la reacción en cadena de la
polimerasa se produjo eficientemente en el interior de los
compartimientos de esta composición de agua en aceite, aproximándose
a las velocidades observadas en PCR en solución. Las dimensiones
medias de los compartimientos acuosos en la emulsión de agua en
aceite de acuerdo con la presente invención, son de aproximadamente
15 \mum. Una vez formados, los compartimientos de la emulsión de
acuerdo con la presente invención no permiten el intercambio de
macromoléculas, tales como ADN y proteínas, en grado significativo
(tal como se muestra en la figura 3A). Esto se debe,
presumiblemente, a que el elevado peso molecular y la naturaleza
cargada de las macromoléculas impiden la difusión a través de la
cubierta surfactante hidrofóbica, incluso a temperaturas
elevadas.
Se ha descrito anteriormente un ácido nucleico
de acuerdo con la presente invención. Preferentemente, el ácido
nucleico es una molécula o un constructo seleccionado de entre el
grupo constituido por una molécula de ADN, una molécula de ARN, una
molécula de ácido nucleico parcial o totalmente artificial,
constituido por bases exclusivamente sintéticas o de una mezcla de
bases naturales y sintéticas, cualquiera de los indicados
anteriormente unido a un polipéptido, y cualquiera de los
anteriormente indicados unido a cualquier otro grupo o constructo
molecular. De manera ventajosa, el otro grupo o constructo molecular
puede seleccionarse de entre el grupo que consiste de ácidos
nucleicos, sustancias poliméricas, particularmente perlas, por
ejemplo perlas de poliestireno, sustancias magnéticas, tales como
perlas magnéticas, marcajes, tales como fluoróforos o marcajes
isotópicos, reactivos químicos, agentes ligantes, tales como
macrociclos y similares.
El ácido nucleico puede comprender secuencias
reguladoras adecuadas, tales como las requeridas para la expresión
eficiente del producto génico, por ejemplo promotores,
potenciadores, secuencias de inicio de traducción, secuencias de
poliadenilación, sitios de corte y empalme y similares.
En la presente memoria se utilizan los términos
"aislamiento", "separación" y "selección", así como
variaciones de los mismos. El término "aislamiento", de acuerdo
con la presente invención, se refiere al procedimiento de separación
de una entidad de una población heterogénea, por ejemplo una mezcla,
de manera que dicha mezcla se encuentre libre de por lo menos una
sustancia a la que se encontraba asociada antes del procedimiento de
aislamiento. En una forma de realización preferida, el término
"aislamiento" se refiere a la purificación de una entidad
esencialmente hasta alcanzar la homogeneidad. El término
"separación" de una entidad se refiere al procedimiento de
aislar preferentemente entidades deseadas respecto a entidades no
deseadas. En la medida en que este procedimiento se relaciona con el
aislamiento de entidades deseadas, los términos "aislamiento" y
"separación" son equivalentes. El procedimiento de la presente
invención permite la separación de ácidos nucleicos de conjuntos
(bibliotecas o repertorios) de ácidos nucleicos que contienen el
ácido nucleico deseado. Se utiliza "seleccionar" para referirse
al procedimiento (incluyendo el procedimiento de separación) de
aislamiento de una entidad de acuerdo con una propiedad particular
de la misma.
El término "oligonucleótido" se refiere a
una molécula comprendida de dos o más desoxirribonucleótidos o
ribonucleótidos, preferentemente más de tres. El tamaño exacto del
oligonucleótido dependerá de la función o uso último del
oligonucleótido. El oligonucleótido puede derivarse sintéticamente o
mediante clonación.
Los ácidos nucleicos seleccionados según la
presente invención pueden manipularse adicionalmente. Por ejemplo,
los ácidos nucleicos que codifican una replicasa seleccionada o
polipéptidos interaccionantes se incorporan a un vector, y se
introducen en el interior de células huésped adecuadas para la
producción de líneas celulares transformadas que expresan el
producto génico. A continuación, las líneas celulares resultantes
pueden propagarse para el análisis cualitativo y/o cuantitativo
reproducible del efecto o efectos de potenciales fármacos que
afecten a la función del producto génico. De esta manera, las
células que expresan el producto génico pueden utilizarse para la
identificación de compuestos, particularmente de compuestos de pesos
moleculares reducidos, que modulan la función del producto génico.
De esta manera, las células huésped que expresan el producto génico
resultan útiles para el cribado de fármacos y un objetivo adicional
de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento
para la identificación de compuestos que modulan la actividad del
producto génico, comprendiendo dicho procedimiento la exposición de
las células que contienen el ADN heterólogo que codifica el producto
génico, en el que dichas células producen el producto génico
funcional, a por lo menos un compuesto o a una mezcla de compuestos
o a una señal cuya capacidad para modular la actividad de dicho
producto génico se desea determinar, y realizando a continuación un
seguimiento de dichas células en busca de cambios causados por dicha
modulación. Dicho ensayo permite la identificación de moduladores,
tales como agonistas, antangonistas y moduladores alostéricos del
producto génico. Tal como se utiliza en la presente memoria, un
compuesto o una señal que modula la actividad del producto génico se
refiere a un compuesto que modifica la actividad del producto génico
de manera que la actividad del producto génico resulta diferente en
presencia del compuesto o de la señal (en comparación con la
actividad en ausencia de dicho compuesto o señal).
Los ensayos de cribado basados en células pueden
diseñarse mediante la construcción de líneas celulares en las que la
expresión de una proteína informadora, es decir, una proteína
fácilmente ensayable, tal como la
\beta-galactosidasa, la cloranfenicol
acetiltransferasa (CAT) o la luciferasa, depende del producto
génico. Este ensayo permite la detección de compuestos que modulan
directamente la función del producto génico, tales como compuestos
que antagonizan el producto génico, o compuestos que inhiben o
potencian otras funciones celulares requeridas para la actividad del
producto génico.
La presente invención también proporciona un
procedimiento para afectar exógenamente a los procesos dependientes
del producto génico que se producen dentro de las células. Las
células huésped productoras de productos de genes recombinantes, por
ejemplo células de mamífero, pueden ponerse en contacto con un
compuesto de ensayo, y a continuación evaluarse el efecto o efectos
moduladores del mismo mediante la comparación de la respuesta
mediada por el producto génico, en presencia y en ausencia del
compuesto de ensayo, o relacionando la respuesta mediada por el
producto génico de las células de ensayo, o de las células de
control (es decir, las células que no expresan el producto génico),
a la presencia del compuesto.
El procedimiento de la presente invención
resulta útil para la separación de bibliotecas de ácidos nucleicos.
En la presente memoria, los términos "biblioteca",
"repertorio" y "conjunto" se utilizan con sus significados
ordinarios conocidos de la técnica, de manera que una biblioteca de
ácidos nucleicos codifica un repertorio de productos génicos. En
general, las bibliotecas se construyen partiendo de colecciones de
ácidos nucleicos y presentan propiedades que facilitan la
separación. La selección inicial de un ácido nucleico de una
biblioteca de ácidos nucleicos utilizando la presente invención
requerirá, en la mayor parte de los casos, el cribado de un gran
número de variantes de ácidos nucleicos. Las bibliotecas de ácidos
nucleicos pueden crearse de una diversidad de maneras diferentes,
incluyendo las siguientes.
Los conjuntos de ácidos nucleicos naturales
pueden clonarse a partir de ADN o ADNc genómico (Sambrook et
al., Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, New York, 1989); por ejemplo, las bibliotecas de
anticuerpos fágicos, construidas a partir de repertorios de
amplificación por PCR de genes de anticuerpos procedentes de
donantes inmunizados o no inmunizados, han demostrado ser fuentes
muy eficaces de fragmentos de anticuerpos funcionales (Winter et
al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-55, 1994;
Hoogenboom, H. R., Trends Biotechnol. 15:62-70,
1997). Designing and optimizing library selection strategies for
generating high-affinity antibodies. Trends
Biotechnol. 15:62-70; Hoogenboom, H. R., Trends
Biotechnol. 15:62-70, 1997). Las bibliotecas
genéticas también pueden construirse mediante la codificación de
todos los genes (ver por ejemplo, Smith, G. P., Science
228:1315-7, 1985; Parmley, S. F. y Smith, G. P.,
Gene 73:305-18, 1988) o parte de los genes (ver por
ejemplo, Lowman et al., Biochemistry
30:10832-8, 1991) o conjuntos de genes (ver por
ejemplo, Nissim, A., Hoogenboom et al., Embo. J.
13:692-8, 1994) en un oligonucleótido sintético
aleatorio o dopado. Las bibliotecas también pueden construirse
mediante la introducción de mutaciones en un ácido nucleico o
conjunto de ácidos nucleicos "aleatoriamente" mediante una
diversidad de técnicas in vivo, incluyendo: la utilización de
"cepas mutadoras" de una bacteria, tal como mutD5 de
E. coli (Liao et al., Proc. Nal. Acad. Sci. USA
83:576-80, 1986; Yamagishi et al., Protein
Eng. 3:713-9, 1990; Low et al., J. Mol. Biol.
260:359-68, 1996); la utilización del sistema de
hipermutación de anticuerpos de los linfocitos \beta (Yelamos
et al., Nature 376:225-9, 1995). Las
mutaciones aleatorias también pueden introducirse, tanto in
vivo como in vitro, con mutágenos químicos, y mediante
ionización o irradiación ultravioleta (ver Friedberg et al.,
DNA repair and mutagenesis, ASM Press, Washington D.C., 1995) o
mediante la incorporación de análogos mutagénicos de bases (ver
Freese, J. Mol. Biol. 1:87, 1959; Zaccolo et al., J. Mol.
Biol. 255:589-603, 1996). Las mutaciones
"aleatorias" también pueden introducirse en los genes in
vitro durante la polimerización, por ejemplo utilizando
polimerasas con tendencia al error (Leung et al., Technique
1:11-15, 1989).
Puede introducirse diversificación adicional
mediante la utilización de recombinación homóloga tanto in
vivo (Kowalczykowski et al., Microbiol. Rev.
58:401-65, 1994) como in vitro (Stemmer,
Nature 370:389-9, 1994; Stemmer, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91: 10747-51, 1994).
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "agente" incluye, aunque sin limitación, un átomo o una
molécula, en el que la molécula puede ser orgánica o inorgánica, una
molécula efectora biológica y/o un ácido nucleico que codifica un
agente, tal como una molécula efectora biológica, una proteína, un
polipéptido, un péptido, un ácido nucleico, un ácido
nucleico-péptido (PNA), un virus, una partícula
similar a un virus, un nucleótido, un ribonucleótido, un análogo
sintético de un nucleótido, un análogo sintético de un
ribonucleótido, un nucleótido modificado, un ribonucleótido
modificado, un aminoácido, un análogo de aminoácido, un aminoácido
modificado, un análogo modificado de aminoácido, un esteroide, un
proteoglicano, un lípido, un ácido graso y un carbohidrato. El
agente puede encontrarse en solución o en suspensión (por ejemplo,
en forma cristalina, coloidal u otra forma particulada). El agente
puede encontrarse en forma de monómero, dímero, oligómero, etc., o
de otra manera en forma de complejo.
Tal como se utilizan en la presente memoria, los
términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se
refieren a un polímero en el que los monómeros son aminoácidos y se
encuentran unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o disulfuro.
El término "polipéptido" se refiere a una cadena de longitud
completa de aminoácidos naturales o a un "fragmento del mismo"
o a un "péptido", tal como una región seleccionada del
polipéptido, que se une con otra proteína, péptido o polipéptido, de
manera modulable por un ligando, o se une a un polímero de
aminoácidos, o a un fragmento o péptido del mismo, que es parcial o
totalmente no natural. La expresión "fragmento del mismo" se
refiere a una secuencia de aminoácidos que es una porción del
polipéptido de longitud completa, de entre aproximadamente 8 y
aproximadamente 500 aminoácidos, preferentemente de entre
aproximadamente 8 y aproximadamente 300, más preferentemente de
entre aproximadamente 8 y aproximadamente 200, y todavía más
preferentemente de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 ó
100 aminoácidos de longitud. El término "péptido" se refiere a
una secuencia corta de aminoácido de 10 a 40 aminoácidos de
longitud, preferentemente de 10 a 35 aminoácidos. Además, pueden
incluirse aminoácidos no naturales, por ejemplo
\beta-alanina, fenilglicina y homoarginina.
También pueden utilizarse aminoácidos comunes, no codificados por
genes, en la presente invención. Todos los aminoácidos utilizados en
la presente invención pueden ser isómeros ópticos D y L. Resultan
preferidos los isómeros L. Además, también resultan útiles otros
peptidomiméticos, por ejemplo, en secuencias ligadoras de
polipéptidos de la presente invención (ver Spatola, 1983, en
Chemistry and biochemistry of amino acids, peptides and
proteins, editor Weinstein, Marcel Dekker, New York, página
267). Una "molécula de unión a polipéptido" es una molécula,
preferentemente un polipéptido, una proteína o un péptido, con la
capacidad de unirse a otro polipéptido, proteína o péptido.
Preferentemente, esta capacidad de unión resulta modulable por un
ligando.
El término "sintético", tal como se utiliza
en la presente memoria, significa que el procedimiento o la
sustancia descrita no se encuentran normalmente en la Naturaleza.
Preferentemente, se define una sustancia sintética como una
sustancia producida mediante síntesis in vitro o
manipulación.
El término "molécula" se utiliza en la
presente memoria para referirse a cualquier átomo, molécula,
macromolécula (por ejemplo, un polipéptido) o a una combinación de
dichas entidades. El término "ligando" puede utilizarse de
manera intercambiable con el término "molécula". Las moléculas
según la presente invención pueden encontrarse libres en solución o
pueden encontrarse parcial o totalmente inmovilizadas. Pueden
encontrarse presentes como entidades discretas o pueden encontrarse
como parte de un complejo junto a otras moléculas. Preferentemente,
las moléculas según la presente invención incluyen los polipéptidos
expuestos en la superficie de las partículas de bacteriófago. Más
preferentemente, entre las moléculas según la presente invención se
incluyen bibliotecas de polipéptidos presentadas como partes
integrantes de la cobertura de las proteínas en la superficie
exterior de las partículas de bacteriófago. Los procedimientos para
la producción de bibliotecas que codifican polipéptidos
aleatorizados resultan conocidos de la técnica y pueden aplicarse a
la presente invención. La aleatorización puede ser total o parcial;
en el caso de una aleatorización parcial, los codones seleccionados
preferentemente codifican opciones de aminoácidos, y no codones de
parada.
El marco de lectura abierta de la polimerasa
Taq se amplifica mediante PCR a partir del ADN genómico de
Thermus aquaticus utilizando los cebadores 1 y 2, se corta
con XbaI y SalI y se liga a pASK75 (Skerra A.,
Gene 151:131, 1994) cortado con XbaI y con
SalI. pASK75 es un vector de expresión que dirige la síntesis
de las proteínas exógenas en E. coli bajo el control
transcripcional del promotor/operador tetA.
Los clones se criban para las inserciones
utilizando los cebadores 3 y 4, y se someten a ensayo para la
expresión de la polimerasa Taq activa (Taq pol) (ver
posteriormente). El mutante D785H/E786V de pol Taq inactiva
se produce mediante mutagénesis Quickchange (Stratagene). Los
residuos mutados resultan críticos para la actividad (Doublie S.
et al., Nature 391:251, 1988; Kiefer J. R. et al.,
Nature 391:304, 1998). Los clones resultantes se criban para la
mutación utilizando un cribado PCR con los cebadores 3, 5 y la
digestión diagnóstica de los productos con PmII. Los clones mutantes
se someten a ensayo para expresión de la Polimerasa Taq
activa (ver posteriormente).
Las células TG1 transformadas se cultivan en
medio 2 x TY con 0,1 mg/ml de ampicilina. Para la expresión, los
cultivos incubados durante la noche se diluyeron en proporción 1/100
con medio 2 x TY fresco y se cultivaron hasta DO_{600} = 0,5 a
37°C. La expresión de proteínas se indujo mediante la adición de
tetraciclina anhidra hasta una concentración final de 0,2 \mug/ml.
Tras cuatro horas de incubación adicional a 37°C, las células se
centrifugaron, se lavaron una vez y se volvieron a suspender en un
volumen similar de 1 x tampón de polimerasa SuperTaq (KCl 50 mM,
Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), Triton
X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM) (HT Biotechnology
Ltd., Cambridge, UK).
Las células lavadas se añadieron directamente a
una mezcla de reacción PCR (2 \mul por cada 30 \mul de volumen
de reacción) que comprendía un plásmido de molde (20 ng), los
cebadores 4 y 5 (1 \muM cada uno), los dNTP (0,25 mM), 1 x tampón
de polimerasa SuperTaq, sobre la que se extendió un aceite mineral.
Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 94°C para liberar
la polimerasa Taq de las células y, a continuación, se
termociclaron con 30 ciclos de perfil siguiente: 90°C (durante 1
minuto), 55°C (durante 1 minuto) y 72°C (durante 2 minutos).
La emulsificación de las reacciones se llevó a
cabo de la manera siguiente. Se añadieron, gota a gota (12
gotas/minuto), 200 \mul de la mezcla de reacción PCR (plásmido de
expresión de Taq (200 ng), cebadores 3 y 4 (1 \muM cada
uno), dNTP (0,25 mM), de polimerasa Taq (10 unidades) a la
fase oleosa (un aceite mineral, Sigma) en presencia de Span 80 al
4,5% (v/v) (Fluka), Tween 80 al 0,4% (v/v) (Sigma) y Triton X100 al
0,05% (v/v) (Sigma) bajo agitación constante (1.000 rpm) en un vial
de criogenización de fondo redondo de 2 ml (Costar, Cambridge, MA).
Después de la adición completa de la fase acuosa, la agitación se
mantuvo durante 4 minutos adicionales. A continuación, las mezclas
emulsionadas se transfirieron a tubos de PCR de pared delgada de 0,5
ml (100 \mul/tubo) y se llevó a cabo la PCR utilizando 25 ciclos
con el perfil siguiente: 94°C (1 minuto), 60°C (1 minuto) y 72°C (3
minutos), tras 5 minutos iniciales de incubación a 94°C. Las mezclas
de reacción se recuperaron mediante la adición de un volumen doble
de éter, agitación con vórtex y centrifugación durante 2 minutos
previamente a la eliminación de la fase de éter. El producto
amplificado se visualizó mediante electroforesis en gel de agarosa,
utilizando los procedimientos estándar (ver, por ejemplo, J.
Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, 1989, Molecular cloning: A
laboratory manual, 2ª edición, Libros 1-3, Cold
Spring Harbor Laboratory Press).
Para la emulsificación de células completas que
expresaban polimerasa Taq, el protocolo se modificó de la
manera siguiente: se omitió el plásmido de expresión de Taq y
la polimerasa Taq en el cóctel de la reacción y se añadieron,
en su lugar, 5 x 10^{8} células de E. coli TG1 inducidas
(que contenían la polimerasa Taq expresada, así como el
plásmido de expresión), junto con el aditivo tetrametilcloruro
amónico (50 \muM), y ARNasa (al 0,05% p/v, Roche, UK). El número
de ciclos de PCR también se redujo a 20.
Con el fin de analizar la relación
genotipo-fenotipo durante la autorreplicación, se
mezclaron células que expresaban una polimerasa Taq de tipo
salvaje (Taq wt) o un fragmento Stoffel (Taq sf) de
baja actividad (bajo las condiciones del tampón) (F. C. Lawyer,
et al., PCR Methods Appl. 2:275-87, 1993) en
una proporción de 1:1 y se someten a PCR, en emulsión o en solución.
En solución, se amplifica preferentemente la Taq sf, de menor
tamaño. Sin embargo, en emulsión se produce la autorreplicación casi
exclusiva del gen de longitud completa de la Taq wt (figura
3B). El número de células bacterianas se ajusta de manera que la
mayoría de los compartimientos de la emulsión contengan una sola
célula. Sin embargo, debido a que las células se encuentran
distribuidas aleatoriamente entre los compartimientos, resulta
inevitable que una pequeña fracción de los compartimientos contenga
dos o más células. Debido a que, aparentemente, los compartimientos
no intercambian ADN de molde (figura 3A), la pequeña cantidad de
amplificación de Taq sf en emulsión es probable que se
origine en el interior de estos compartimientos. Claramente, su
abundancia es reducida y, por lo tanto, resulta improbable que
afecte a las selecciones. De hecho, en un ensayo de selección, una
sola ronda de CSR resulta suficiente para el aislamiento de los
clones de la Taq wt a partir de un exceso de 10^{6} veces
de un mutante Taq inactivo.
Utilizando la PCR con tendencia a error, se
prepararon dos repertorios de mutantes aleatorios de la Taq
(L1 (J. P. Vartanian, M. Henry, S. Wain Hobson, Nucleic Acid
Res. 24:2627-2631, 1996) y L2 (M. Zaccolo, E.
Gherardi, J. Mol. Biol. 285:775-83, 1999).
Sólo 1% a 5% de los clones de L1 o L2 se encontraban activos, según
la PCR, aunque una sola ronda de selección CSR para actividad de
polimerasa, bajo las condiciones estándar de la PCR, incrementó la
proporción de clones activos hasta el 81% (L1^{*}) y el 77%
(L2^{*}).
Se construyeron variantes del gen de la
polimerasa Taq mediante dos procedimientos diferentes de PCR
con tendencia a error.
En el primer procedimiento se utilizaron
análogos de nucleósidos dPTP y dLTP (Zaccolo et al., J. Mol.
Biol. 255:589-603, 1996). Brevemente, se llevó a
cabo una reacción PCR de 3 ciclos que comprendía KCl 50 mM,
Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), TritonX-100
al 0,1%, MgCl_{2} 2 mM, dNTP (500 \muM), dPTP (500 \muM), dLTP
(500 \muM), 1 pM de ADN de molde, cebadores 8 y 9 (1 \muM cada
uno), 2,5 unidades de polimerasa Taq, en un volumen total de
50 \mul, con el perfil térmico siguiente: 94°C (1 minuto), 55°C (1
minuto) y 72°C (5 minutos). A continuación, se transfirió una
alícuota de 2 \mul a una reacción PCR estándar de 100 \mul que
comprendía KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0),
TritonX-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM, dNTP (250
\muM), cebadores 6 y 7 (1 \muM por cada uno) y 2,5 unidades de
polimerasa Taq. Esta reacción se cicló 30 veces con un perfil
de 94°C (30 segundos), 55°C (30 segundos) y 72°C (4 minutos). El
producto amplificado se purificó en gel, y se clonó en pA5K75, tal
como se ha explicado anteriormente, para crear la biblioteca L2.
El segundo procedimiento utilizó una combinación
parcial de dNTP y MnCl_{2} para la introducción de errores durante
la PCR. La mezcla de reacción comprendía KCl 50 mM,
Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), Triton
X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 2,5 mM, MnCl_{2} 0,3 mM,
1 pM de ADN de molde, dTTP (1 mM), dCTP (1 mM), dGTP (1 mM), dATP
(100 \muM), cebadores 8 y 9 (1 \muM por cada uno) y 2,5 unidades
de polimerasa Taq. Esta reacción se cicló 30 veces con un perfil de
94°C (30 segundos), 55°C (30 segundos) y 72°C (4 minutos), y los
productos amplificados se clonaron, tal como se ha explicado
anteriormente, para crear la biblioteca L1.
Para la selección de las polimerasas activas,
las reacciones de PCR en el interior de las emulsiones se llevaron a
cabo tal como se ha descrito anteriormente, aunque utilizando los
cebadores 8 y 9. Para la selección de las variantes con
termoestabilidad incrementada, las emulsiones se preincubaron a 99°C
durante 7 minutos previamente al ciclado, tal como se ha indicado
anteriormente. Para la selección de las variantes con actividad
incrementada en presencia del inhibidor heparina, se añadió la
heparina hasta concentraciones de entre 0,08 unidades/\mul y 0,16
unidades/\mul, y se llevó a cabo el ciclado, tal como se ha
indicado anteriormente. Los protocolos detallados se exponen en los
ejemplos adicionales, posteriormente.
Los productos de amplificación resultantes de
los compartimientos que contenían una polimerasa activa se
extrajeron de la emulsión con éter, tal como se ha indicado
anteriormente, y se purificaron mediante extracción estándar con
fenolcloroformo. Posteriormente, se añadieron 0,5 volúmenes de una
solución de PEG/MgCl_{2} (PEG 800 al 30% v/v, MgCl_{2} 30 mM) y
después del mezclado, se llevó a cabo una centrifugación a 13.000
rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante (que
contenía los cebadores y los dNTP no incorporados) se descartó y el
sedimento se volvió a suspender en TE. A continuación, los productos
amplificados se purificaron adicionalmente en columnas de
centrifugado (Qiagen) para asegurar una completa eliminación de los
cebadores. A continuación, estos productos se amplificaron
nuevamente utilizando los cebadores 6 y 7 (que se encuentran
externamente anidados en los cebadores 8 y 9) en una reacción PCR
estándar, con la excepción de que sólo se utilizaron 20 ciclos. Los
productos amplificados nuevamente se purificaron en gel y se
volvieron a clonar en pASK75, tal como se ha indicado anteriormente.
Los transformantes se colocaron en un plato y las colonias se
cribaron, tal como se indica posteriormente. Los restos se rasparon
en 2 x TY/0,1 mg/ml de ampicilina, se diluyeron hasta DO_{600} =
0,1 y se cultivaron/indujeron, tal como se ha indicado
anteriormente, para la repetición del protocolo de selección.
Se recogieron colonias y se introdujeron en una
placa de cultivo de 96 pocillos (Costar), se cultivaron y se
indujeron para la expresión, tal como se ha indicado anteriormente.
Para el cribado, se utilizaron 2 \mul de células en una reacción
PCR de 30 \mul para el ensayo de actividad en una placa de PCR de
96 pocillos (Costar) utilizando los cebadores 4 y 5. Se utilizó un
bloque de gradiente de temperatura para el cribado de los
seleccionados con termoestabilidad incrementada. Las reacciones se
preincubaron durante 5 minutos a temperaturas comprendidas en el
intervalo de 94,5ºC a 99°C, previamente a un ciclado estándar, tal
como se ha indicado anteriormente, con los cebadores 4 y 5 ó 3 y 4.
Para el cribado de las polimerasas compatibles con la heparina, se
añadió la heparina a una concentración de 0,1 unidades/30 \mul
durante el cribado PCR de colonias en formato de 96 pocillos.
A continuación, las polimerasas activas se
sometieron a ensayo en un intervalo de concentraciones de heparina
comprendido entre 0,007 unidades/30 \mul y 3,75 unidades/30 \mul
y se compararon con el tipo salvaje.
Se determinaron Kcat y Km (dTTP) utilizando un
sustrato homopolimérico (Polesky et al., J. Biol. Chem.
265:
14579-91, 1990). La mezcla de reacción final (de 25 \mul) comprendía 1 x tampón SuperTaq (HT Biotech.), poli(dA).oligo(dT)(500 nM, Pharmacia), y concentraciones variables de [\alpha-^{32}P]dTTP (aproximadamente 0,01 Ci/mmol). La reacción se inició mediante la adición de 5 \mul de enzima en tampón 1 x SuperTaq para proporcionar una concentración final de enzima comprendidas en el intervalo entre 1 nM y 5 nM. Las reacciones se incubaron durante 4 minutos a 72°C, se enfriaron con EDTA, como en el Ejemplo 14, y se aplicaron a los filtros DE-81 de 24 mm. Los filtros se lavaron y se midió la actividad, tal como en el Ejemplo 14. Los parámetros cinéticos se determinaron utilizando el gráfico de Lineweaver-Burke estándar. Unos experimentos con sustrato homopolimérico reducido al 50% no mostraron evidencia de grandes diferencias en la incorporación de dTTP por la polimerasa, indicando que se encuentra presente en exceso suficiente para validar el protocolo de análisis cinético utilizado.
14579-91, 1990). La mezcla de reacción final (de 25 \mul) comprendía 1 x tampón SuperTaq (HT Biotech.), poli(dA).oligo(dT)(500 nM, Pharmacia), y concentraciones variables de [\alpha-^{32}P]dTTP (aproximadamente 0,01 Ci/mmol). La reacción se inició mediante la adición de 5 \mul de enzima en tampón 1 x SuperTaq para proporcionar una concentración final de enzima comprendidas en el intervalo entre 1 nM y 5 nM. Las reacciones se incubaron durante 4 minutos a 72°C, se enfriaron con EDTA, como en el Ejemplo 14, y se aplicaron a los filtros DE-81 de 24 mm. Los filtros se lavaron y se midió la actividad, tal como en el Ejemplo 14. Los parámetros cinéticos se determinaron utilizando el gráfico de Lineweaver-Burke estándar. Unos experimentos con sustrato homopolimérico reducido al 50% no mostraron evidencia de grandes diferencias en la incorporación de dTTP por la polimerasa, indicando que se encuentra presente en exceso suficiente para validar el protocolo de análisis cinético utilizado.
Con el fin de establecer si las condiciones de
los compartimientos acuosos presentes en una emulsión resultaban
permisivos para la catálisis, se emulsificó una mezcla de reacción
estándar y se llevó a cabo una PCR. Esto conduce a la amplificación
del gen de polimerasa Taq del tamaño adecuado presente en el
plásmido de molde, con un rendimiento suficiente para permitir la
visualización utilizando una electroforesis en gel de agarosa
estándar.
Se emulsificaron las células de E. coli
que expresaban la polimerasa Taq y se llevó a cabo la PCR
utilizando cebadores flanqueantes del casete de la polimerasa en el
vector de expresión. La emulsificación de hasta 5 x 10^{8} células
(para un volumen total de 600 \mul) llevó a la formación de
producto detectable mediante electroforesis en gel de agarosa. Por
lo tanto, las células se segregan en los compartimientos acuosos, en
los que las condiciones resultan adecuadas para la autoamplificación
del gen de la polimerasa por la polimerasa Taq expresada. Se
estima que las emulsiones similares contienen aproximadamente 1 x
10^{10} compartimientos por ml (Tawfik D. y Griffiths A.D.,
Nature Biotech. 16:652, 1998). El gran número de células que
pueden ser emulsionadas permite la selección a partir de repertorios
diversos de proteínas aleatorizadas.
Para que resulten viables para un procedimiento
de selección, la mayoría de los compartimientos acuosos en la
emulsión deberían contener una sola célula, y la integridad de los
compartimientos debería mantenerse durante el ciclado térmico. Esto
se somete a ensayo incluyendo en la emulsión las células que
contienen un molde competidor que puede distinguirse por su menor
tamaño.
Las células de E. coli que expresan la
polimerasa Taq se coemulsifican con las células de E.
coli que expresan el fragmento Stoffel en una proporción de uno
a uno. El fragmento Stoffel resulta de baja actividad bajo las
condiciones utilizadas en la emulsión y, de esta manera, la
amplificación de su casete de expresión por la misma pareja de
cebadores utilizada para la autoamplificación de la Taq, es
el resultado de la co-compartimentación con una
célula que expresa polimerasa Taq activa o de la fuga de
polimerasa Taq entre compartimientos. Tras la PCR, se
descubrió que la gran mayoría de los productos se correspondían con
el gen de la polimerasa Taq activa, validando de esta manera
la premisa de una célula por compartimiento duradero (ver figura 2,
Ghadessy et al., PNAS 98:4552, 2001).
Para demostrar que el procedimiento puede
seleccionar variantes potencialmente raras, se emulsificó un exceso
de células que expresaban polimerasa inactiva de 10^{6} veces
respecto a las que expresaban la forma activa. Tras la PCR y la
clonación del producto amplificado, un solo cribado de expresión
utilizando un formato de 96 pocillos indicó que se había producido
un enriquecimiento de 10^{4} veces para la polimerasa activa.
\newpage
Las polimerasas con termoestabilidad
incrementada presentan importancia práctica potencial, debido a que
reducen la pérdida de actividad durante el termociclado y permiten
temperaturas de desnaturalización más elevadas para la amplificación
de moldes ricos en GC. De esta manera, los presentes inventores en
primer lugar utilizaron el procedimiento de selección de la presente
invención para la evolución dirigida de las variantes de Taq
con termoestabilidad incrementada, comenzando por bibliotecas
preseleccionadas (L1*, L2*) e incrementando progresivamente la
temperatura y la duración de la desnaturalización térmica inicial.
Tras 3 rondas de selección, se aisló la T8 (Tabla 1), un clon de la
Taq con una semivida 11 veces más larga a 97,5°C que la
semivida del enzima Taq de tipo salvaje que ya es
termoestable (Tabla 2), convirtiendo a T8 en el elemento más
termoestable que se conoce de la familia de Pol I (los clones se
cribaron y se marcaron mediante ensayo PCR. Brevemente, se añadieron
2 \mul de células inducidas a 30 \mul de una mezcla para PCR y
se realizó un ensayo de amplificación de un fragmento de 0,4 kb,
bajo las condiciones de selección (por ejemplo, cantidades
crecientes de heparina). La termoestabilidad y la resistencia a la
heparina de los clones purificadas de tipo salvaje y mutantes de
Taq etiquetados con His y se determinó tal como se detalla en
Lawyer et al., PCR Methods Appl. 2:275-287,
1993; Lawyer et al., J. Biol. Chem.
264:6427-37, 1989, utilizando ADN de esperma de
salmón activado y concentraciones normalizadas de enzimas). Las
mutaciones que proporcionaban termoestabilidad a la T8 (y a la
mayoría de los mutantes menos termoestables) se agrupaban en el
dominio 5'-3' exonucleasa (Tabla 1). De hecho, las
variantes por truncamiento de la polimerasa Taq (F. C.
Lawyer, et al., PCR Methods Appl. 2:275-87,
1993; W. M. Barnes, Gene 112: 29-35, 1992)
que carecían del dominio exonucleasa mostraban una termoestabilidad
mejorada, lo que sugiere que podría ser menos termoestable que el
dominio principal de polimerasa. La menor termoestabilidad del
dominio exonucleasa podría presentar un significado funcional (por
ejemplo, ser un reflejo de una necesidad de mayor flexibilidad),
debido a que las mutaciones estabilizantes en T8 aparentemente
reducen la actividad exonucleasa (en aproximadamente 5 veces) (la
actividad de la 5'-3' exonucleasa se determina
esencialmente tal como se detalla en Y. Xu, et al., J. Mol.
Biol. 268:284-302, 1997), aunque en tampón 1 x
Taq con 0,25 mM de dNTP y el oligonucleótido
22-mero de Y. Xu, et al., J. Mol. Biol.
268:284-302, 1997), marcado 5' con Cy5, (Amersham).
Las mediciones cinéticas de equilibrio se realizaron tal como en: A.
H. Polesky, T. A. Steiz, N. D. Grindley, C. M. Joyce, J. Biol.
Chem. 265:14759-91, 1990, utilizando el sustrato
homopolimérico poli(dA)_{200} (Pharmacia) y un
cebador oligo(dT)_{40} a 50°C) (por lo menos a
temperatura reducida).
*según PCR (en comparación con la
Taq_{wt}) a 97,5ºC
**según PCR (en comparación con la
Taq_{wt})
Se expresaron dos bibliotecas de variantes de la
polimerasa Taq generadas mediante PCR con tendencia a error,
en E. coli (biblioteca L1, 8 x 10^{7} clones, biblioteca
L2, 2 x 10^{7} clones; ver el Ejemplo 5) y se emulsificaron tal
como se indica anteriormente. La primera ronda de PCR se llevó a
cabo para enriquecer para las variantes activas utilizando el perfil
de termociclado estándar de la polimerasa Taq, indicado de
manera general anteriormente. Se purificaron los productos de
amplificación enriquecidos, y se volvieron a clonar para generar
bibliotecas que comprendían variantes activas (L1*, L2*;
aproximadamente 10^{6} clones por cada biblioteca). Un cribado de
las bibliotecas L1* y L2* demostró que 81% y 77%, respectivamente,
de los clones seleccionados aleatoriamente se encontraban
activos.
Se aplicó una presión selectiva a las
bibliotecas L1* y L2* durante la siguiente ronda de PCR mediante la
preincubación de las emulsiones a 99°C durante 6 ó 7 minutos,
previamente al ciclo normal de PCR. Bajo estas condiciones, la
polimerasa Taq de tipo salvaje pierde toda su actividad. Los
productos amplificados se enriquecieron y se clonaron, tal como
anteriormente, en un cribado de expresión de 96 pocillos utilizado
para la selección de variantes activas bajo condiciones de PCR
normales. Esto rindió 7 clones de la biblioteca L2* y 10 clones de
la biblioteca L1*. A continuación, estos clones se cribaron para
termoestabilidad incrementada utilizando un bloque PCR de gradiente
de temperatura, con preincubación de 5 minutos a una temperatura
comprendida entre 94,5°C y 99°C, previamente al ciclado estándar.
Según la electroforesis en gel, se encontraron 5 clones de cada
biblioteca con termoestabilidad incrementada en comparación con el
tipo salvaje. Estos mutantes eran capaces de amplificar eficazmente
la diana de 320 pb tras una preincubación a 99°C durante 5 minutos.
El enzima de tipo salvaje no presentaba actividad detectable tras la
preincubación a temperaturas superiores a 97°C durante 5 o más
minutos.
Los ensayos de inactivación térmica de
polimerasas WT y purificadas etiquetadas con His se llevaron a cabo
en una mezcla de PCR estándar de 50 \mul que comprendía 1 x tampón
SuperTaq (HT Biotech.), 0,5 ng de ADN de plásmido de molde, dATP,
dTTP, dGTP (200 \muM de cada uno), cebadores 3 y 4 (10 \muM de
cada uno) y polimerasa (aproximadamente 5 nM). Las mezclas de
reacción se cubrieron con aceite y se incubaron a 97,5°C, se
extrajeron alícuotas de 5 \mul y se almacenaron en hielo, tras
intervalos definidos. Estas alícuotas se sometieron a ensayo en 50
\mul de tampón de reacción de actividad, que comprendía ácido
N-tris[hidroximetil]-3-aminopropanosulfónico
(TAPS) 25 mM (pH 9,5), \beta-mercaptoetanol 1 mM,
MgCl_{2} 2 mM, dATP 200 \muM, dTTP 200 \muM, dGTP 200 \muM,
[\alpha-^{32}P]dCTP 100 \muM (0,05
Ci/mmol), y 250 \mug/ml de ADN de molde de esperma de salmón
activado. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 72°C y se
detuvieron mediante la adición de EDTA (25 mM final). Los volúmenes
de reacción se enrasaron a 500 \mul con una solución S (EDTA 2 mM,
50 \mug/ml de ADN de esperma de salmón sonicado) y se añadieron
500 \mul de TCA al 20% (v/v)/pirofosfato sódico al 2% (v/v). Tras
20 minutos de incubación en hielo, las reacciones se aplicaron a
filtros GF/C (Whatman) de 24 mm. Los nucleótidos que no habían sido
incorporados se eliminaron mediante tres lavados con TCA al 5%
(v/v), pirofosfato sódico al 2% (v/v), seguido de dos lavados con
etanol al 96% (v/v). Los filtros secos se analizaron en viales de
centelleo que contenían Ecoscint A (National Diagnostics). El ensayo
se calibró utilizando una cantidad conocida de una solución de dCTP
marcados (omitiendo los lavados).
Tal como se ha indicado anteriormente, los
procedimientos de la presente invención también pueden utilizarse
para evolucionar la resistencia a un inhibidor de actividad
enzimática. La heparina es un anticoagulante ampliamente utilizado,
aunque también es un potente inhibidor de la actividad de
polimerasa, dificultando las amplificaciones PCR de muestras
sanguíneas clínicas (J. Satsangi, D. P. Jewell, K. Welsh, M. Bunce,
J. I. Bell, Lancet 343: 1509-10, 1994).
Aunque la heparina puede eliminarse de las muestras sanguíneas
mediante diversos procedimientos, éstos pueden resultar costosos y
lentos. La disponibilidad de una polimerasa compatible con la
heparina mejoraría enormemente, por lo tanto, la caracterización de
los amplicones terapéuticamente significativos, y evitaría la
necesidad de tratamientos de heparina de las muestras posiblemente
de coste prohibitivo (Taylor A. C., Mol. Ecol. 6: 383,
1997).
Las bibliotecas L1* y L2* se combinaron y se
seleccionaron en emulsión para polimerasas activas, en como máximo
0,16 unidades de heparina por \mul. Tras una única ronda, se
aislaron 5 clones activos en un cribado PCR de 96 pocillos
incorporando 0,1 unidades/30 \mul de la reacción, no mostrando el
tipo salvaje actividad alguna. La titulación mostraba que 4 de estos
clones se encontraban activos en como máximo cuatro veces la
cantidad de heparina que inhibía el tipo salvaje (0,06 unidades/30
\mul frente a 0,015 unidades/30 \mul). El otro clon se
encontraba activo en como máximo ocho veces la cantidad de heparina
que inhibía el tipo salvaje (0,12 unidades/30 \mul frente a 0,015
unidades/30 \mul).
Mediante la utilización de la selección en
presencia de cantidades crecientes de heparina, se aisló H15, una
variante de Taq, funcional en la PCR a una concentración
hasta 130 veces superior a la concentración inhibidora de heparina
(Tabla 2). Inesperadamente, las mutaciones que proporcionaban
resistencia a la heparina también se agrupaban, en este caso en la
base de los subdominios dedo y pulgar de la polimerasa, regiones
implicadas en la unión de ADN dúplex. De hecho, a juzgar por una
estructura de alta resolución reciente del complejo de ADN de la
Taq (Y. Li, S. Korolev, G. Walkman, EMBO J.
17:7514-25, 1998) cuatro de los seis residuos
mutados a H15 (K540, D578, N583, M747) entra en contacto directo con
la cadena molde o la cadena producto (tal como se muestra en la
figura 7). Las mutaciones de H15 son aparentemente neutras (o se
compensan entre sí) en lo que se refiere a la afinidad para el ADN
biocatenario (mientras que, presumiblemente, reducen la afinidad
para la heparina) (Tabla 2) (la K_{D} para el ADN se determina
utilizando BIAcore. Brevemente, el 68-mero utilizado
en M. Astatke, N. D. Grindley, C. M. Joyce, J. Biol. Chem.
270:1945-54, 1995) se biotinila en el extremo 5' y
se une a un chip sensor SA y la unión de las polimerasas se mide en
tampón 1 x Taq (ver anteriormente) a 20°C. Los valores
relativos de K_{D} se estiman mediante un ensayo de clasificación
PCR utilizando cantidades decrecientes de molde). No se conoce con
exactitud la base molecular de la inhibición por heparina, pero los
resultados de los presentes inventores sugieren fuertemente que los
sitios de unión para el ADN y la heparina en el sitio activo de la
polimerasa se superponen (y presumiblemente de manera mutuamente
excluyente), dando soporte a la idea de que la heparina ejerce su
efecto inhibitorio imitando y compitiendo con el ADN bicatenario
para la unión en el sitio activo. La observación de los presentes
inventores de que la inhibición de la heparina se reduce
marcadamente bajo condiciones de exceso de molde de ADN (los clones
se criban y se clasifican mediante un ensayo de PCR. Brevemente, se
añaden 2 \mul de células inducidas a una mezcla PCR de 30 \mul y
se analiza la amplificación de un fragmento de 0,4 kb bajo las
condiciones de selección, por ejemplo cantidades crecientes de
heparina). La termoestabilidad y la resistencia a la heparina de los
clones de la Taq wt purificados marcados con His y los clones
de la Taq mutante se determinan tal como en F. C. Lawyer,
et al. PCR Methods Appl. 2:275-87, 1993; F.
C. Lawyer, et al., J. Biol. Chem.
264:6427-37, 1989) utilizando un ADN de esperma de
salmón activado y concentraciones normalizadas de enzimas, la Tabla
2 parece concordar con esta hipótesis.
| ^{*}preparado comercial de Taq (HT Biotechnology), | |
| \begin{minipage}[t]{150mm} ^{**}con etiqueta His_{6} en el extremo N-terminal, medido mediante incorporación de CTP^{32} en ADN de esperma de salmón,\end{minipage} | |
| ^{***}sin etiqueta, medido mediante ensayo de PCR, | |
| ^{\dagger}Taq, valor publicado: 1 nM^{-1} (l), Klenow (Cambio), 4 nM^{-1}, | |
| \begin{minipage}[t]{150mm} ^{\ddagger}ADN pol I de E. coli, valor publicado: 3,8 s^{-1} (A. H. Polesky, T. A. Steitz, N. D. Grindley, C. M. Joyce, J. Biol. Chem. 265:14579-91, 1990),\end{minipage} | |
| \begin{minipage}[t]{150mm} ^{\NAK}en comparación con la Taq_{wt} medida mediante ELISA de mutS (Genecheck) (P. Debbie, et al., Nucleic Acids Res. 25:4825-4829, 1997), Pfu (Stratagene): 0,2.\end{minipage} |
Un resultado clásico de los experimentos de
replicación in vitro es una adaptación de la secuencia del
molde a una replicación más rápida (S. Spiegelman, Q. Rev.
Biophys. 4:213-253, 1971). De hecho, los
presentes inventores han observado asimismo una evolución del molde
mediante mutaciones silenciosas. A diferencia de las mutaciones del
código (AT a GC frente a GC a AT/29 frente a 16), las mutaciones no
codificadas presentan una predisposición sorprendente (AT a GC
frente a GC a AT/0 frente a 42) a presentar un contenido reducido de
GC, lo que se ha considerado generalmente que estimula una
replicación más eficaz, facilitando la separación de las cadenas y
desestabilizando las estructuras secundarias. Además de seleccionar
para la adaptación, el procedimiento de la presente invención
también puede seleccionar para la adaptabilidad; es decir, las
polimerasas podrían evolucionar hacia una velocidad de automutación
óptima, presumiblemente superior (M. Eigen,
Naturwissenschaften 58:465-523, 1971). De
hecho, los mutantes pueden surgir espontáneamente en poblaciones
bacterianas asexuales bajo estrés adaptativo (F. Taddei et
al., Nature 387:700-2, 1997); P. D. Sniegowski,
P. J. Gerrish, R. E. Lenski, Nature 387:703-5,
1997). Por analogía, se podría argumentar que el procedimiento de la
presente invención podría favorecer las variantes de polimerasa con
mayor tendencia a error y por lo tanto capaces de una evolución
adaptativa más rápida. Sin embargo, ninguna de las polimerasas
seleccionadas mostró tasas de error incrementadas (Tabla 2). La
eliminación de la recombinación y la reducción de la carga de
mutaciones durante el ciclo del procedimiento de la presente
invención podría incrementar las presiones selectivas hacia enzimas
con mayor tendencia a error.
La tolerancia a la heparina de las polimerasas
se analiza utilizando un ensayo similar al utilizado para la
estabilidad térmica. La heparina se diluye en serie en tampón de
actividad (0 a 320 unidades/45 \mul) y se añadieron 5 \mul de
enzima en la mezcla de PCR estándar descrita anteriormente. Las
reacciones se incubaron y la incorporación se sometió a ensayo tal
como anteriormente.
Los cebadores utilizados eran el cebador 9
(LMB388ba5WA) y el cebador 10 (8fo2WC). Esta combinación de
cebadores presentaba variantes de polimerasa con un desapareamiento
3' purina-purina (A-G), y un
desapareamiento 3' pirimidina-pirimidina
(C-C). Estos son los desapareamientos peor tolerados
por la polimerasa Taq (Huang et al., 1992, Nucleic
Acids Res. 20(17):4567-73) y se extienden
poco.
El protocolo de selección esencialmente era el
mismo que el utilizado anteriormente, con la excepción de que dichos
dos cebadores se utilizaron en emulsión. Además, el tiempo de
extensión se incrementó en 8 minutos. Tras dos rondas de selección,
se aislaron 7 clones que presentaban un incremento de hasta 16 veces
de la extensión a partir del desapareamiento, según un ensayo de
clasificación por PCR (ver Ejemplo 2: utilización de los cebadores 5
y 11) y estandarizado para la actividad utilizando la pareja de
cebadores normal. A continuación, estos clones se introdujeron
aleatoriamente de nuevo en las bibliotecas L1* y L2* originales
junto con la Taq de tipo salvaje y se repitió el
procedimiento de selección, aunque con un número de ciclos inferior
(10) en la reacción CSR. Esta ronda de selección rindió numerosos
clones, el mejor de los cuales presentaba un incremento de la
extensión del desapareamiento de hasta 32 veces, según la PCR (ver
Ejemplo 2) utilizando los cebadores 5 y 11.
La incorporación de un par de bases incorrecto
por la polimerasa Taq puede detener el procedimiento de
polimerización, debido a que ciertos desapareamientos (veáse lo
mencionado anteriormente) resultan pobremente extendidos por la
Taq. De esta manera, la polimerasa Taq, no puede
utilizarse por sí sola en la amplificación de moldes grandes (>6
kb)(Barnes). Este problema puede resolverse suplementando la
Taq con una polimerasa con una actividad
3'-5' exonucleasa (por ejemplo, la polimerasa Pfu),
que elimina las bases incorporadas incorrectamente y permite la
reanudación de la polimerización por la Taq. Por lo tanto, se
analiza la capacidad de los clones anteriores para llevar a cabo la
amplificación de fragmentos grandes de ADN (PCR de larga distancia)
partiendo de un molde de ADN de lambda, debido a que la
incorporación de una base incorrecta es probable que no detenga la
polimerización. Mediante la utilización de los cebadores 12 (LBA23)
y 13 (LFO46) (1 \muM cada uno) en una reacción PCR de 50 \mul
que contenía 3 ng de ADN de lambda (New England Biolabs), dNTP (0,2
mM) y tampón 1 x PCR (HT Biotech), el clon M1 pudo amplificar un
fragmento de 23 kb utilizando 20 repeticiones de un ciclo de
amplificación de dos etapas (94°C, 15 segundos; 68°C, 25 minutos).
La polimerasa de tipo salvaje no pudo extender los productos de
longitud superior a 13 kb utilizando el mismo tampón de reacción. La
Taq comercial (Perkin Elmer) no pudo extender más de 6 kb
utilizando el tampón proporcionado por el fabricante.
Con el fin de demostrar la fiabilidad de la 3SR
en el interior de la emulsión, se amplifica el gen de polimerasa
Taq en primer lugar mediante PCR a partir del plásmido
parental (ver el Ejemplo 1) utilizando un cebador directo diseñado
para incorporar un promotor de ARN polimerasa de T7 en el producto
de PCR. Se preparó una mezcla de reacción 3SR de 250 \mul que
comprendía el gen de Taq modificado (50 ng), 180 unidades de
ARN polimerasa de T7 (USB, 63 unidades de transcriptasa inversa, HT
Biotech), rNTP (12,5 mM), dNTP (1 mM), MgCl_{2} (10 mM), cebador
Taqba2T7 (cebador 12; 125 pmoles), cebador 88fo2 (cebador 4; 125
pmoles), Tris-HCl 25 mM (pH 8,3), KCl 50 mM y DTT
2,0 mM. Se emulsificaron 200 \mul de esta mezcla utilizando el
protocolo estándar. Tras una incubación prolongada a temperatura
ambiente, se observó que tenía lugar la amplificación del gen de la
Taq (representando un tamaño de gen modelo) dentro de la
emulsión, según una electroforesis en gel estándar.
Con el fin de ampliar adicionalmente el alcance
del procedimiento, se llevó a cabo la reacción 3SR en un extracto de
transcripción/traducción in vitro (EcoPro, Novagen). El gen
Taq inactivo (ver Ejemplo 1) se amplificó a partir del
plásmido parental utilizando los cebadores 2 (TaqfoSal) y 12
(Taqba2T7). Se añaden 100 ng (aproximadamente 1 x 10^{10} copias)
para preparar 100 \mul de fase acuosa que comprendía extracto
EcoPro (70 \mul), metionina (4 \mul), transcriptasa inversa (84
unidades, HT Biotech), cebador 12 (Taqba2T7, 2 \muM), cebador 13
(TaqfoLMB2, 2 \muM), dNTP (250 \muM). La fase acuosa se
emulsificó en 400 \mul de una fase oleosa utilizando el protocolo
estándar. Tras la incubación a 37°C durante la noche, se extrajo la
emulsión utilizando el protocolo estándar y la fase acuosa se
purificó adicionalmente utilizando una columna de purificación PCR
(Qiagen). La eliminación completa de los cebadores se asegura
tratando 5 \mul de eluido de la columna con 2 \mul de reactivo
ExoZap (Stratagene). El ADN producido en la emulsión por la 3SR se
rescata utilizando 2 \mul de eluido de columna tratada en una
reacción PCR estándar de 50 \mul, utilizando 20 ciclos de
amplificación y los cebadores 6 (LMB, referencia 2) y 12 (Taqba2T7).
En comparación con la señal de fondo (la reacción de control en la
que se omite la transcriptasa inversa de la reacción 3SR), pudo
observarse una banda intensa del tamaño correcto al visualizar los
productos mediante electroforesis en gel de agarosa. Por lo tanto,
la reacción 3SR puede llevarse a cabo en extractos de
transcripción/traducción, permitiendo la evolución dirigida de
agentes expresados en los compartimientos acuosos.
La polimerasa Taq WT presenta una
actividad limitada de transcriptasa inversa (Perler et al.,
Adv. Protein Chem. 48:377-435, 1996). También es
sabido que las transcriptasas inversas (por ejemplo, la
transcriptasa inversa de VIH, que presenta actividad tanto de
transcriptasa inversa como de polimerasa) presentan
considerablemente más tendencia a error que otras polimerasas. Esto
plantea la posibilidad de que una polimerasa con mayor tendencia a
error (en la que resulta evidente una tolerancia incrementada a
sustratos no afines) podría mostrar actividad de transcriptasa
inversa incrementada. Los genes de las variantes de Taq M1,
M4, así como los mutantes inactivos, se amplificaron a partir de
plásmidos parentales utilizando los cebadores 12 (Taqba2T7) y 2
(TaqfoSal) y la reacción 3SR se llevó cabo, tal como anteriormente,
en el extracto de transcripción/traducción (Novagen), con la
excepción de que la transcriptasa inversa no se añadió exógenamente.
En las reacciones de control, se omitió la metionina de la mezcla de
reacción. Tras 3 horas de incubación a 37°C, la reacción se trató
tal como anteriormente, y se llevó a cabo PCR utilizando la pareja
de cebadores 6 y 12 para rescatar los productos sintetizados durante
la reacción 3SR. De entre los clones estudiados, el clon M4
proporcionó la banda más intensa de tamaño correcto en comparación
con la reacción de control, al visualizar los productos mediante
electroforesis en gel de agarosa. Por lo tanto, aparentemente el
clon M4 presenta algún grado de actividad de transcriptasa inversa.
Este resultado demuestra que resulta posible expresar replicasas
funcionalmente activas in vitro. Cuando se acopla a la
selección mediante compartimentación, podrían evolucionar nuevas
replicasas.
El Ejemplo 19 y los Ejemplos siguientes
describen cómo pueden utilizarse los procedimientos de la presente
invención para seleccionar un enzima implicado en una ruta
metabólica cuyo producto final es un sustrato para la replicasa.
Estos Ejemplos muestran un procedimiento para la selección de una
nucleósido difosfato quinasa (NDP quinasa) que cataliza la
transferencia de un grupo fosfato desde el ATP a un desoxinucleósido
difosfato para la producción de un desoxinucleósido trifosfato
(dNTP). En esta reacción, el enzima seleccionable (NDK) proporciona
sustratos para que la polimerasa Taq amplifique el gen que lo
codifica. Este procedimiento de selección difiere del procedimiento
de autorreplicación compartimentada de replicasa (CSR, Ghadessy y
Holliger) en el que la replicación es un procedimiento acoplado,
permitiendo la selección de enzimas (ácidos nucleicos y proteínas)
que no son replicasas. La bacterias que expresan NDK (y que
contienen su gen en un vector de expresión) se coemulsifican con su
sustrato (en este caso, dNDP y ATP) junto con otros reactivos
necesarios para facilitar su amplificación (la polimerasa
Taq, cebadores específicos para el gen ndk, y tampón). La
compartimentación en emulsión de agua en aceite garantiza la
segregación de variantes individuales de la biblioteca. Los clones
activos proporcionan los dNTP necesarios para que la polimerasa
Taq amplifique el gen ndk. Las variantes con actividad
incrementada proporcionan más sustratos para su propia amplificación
y, por lo tanto, el número de copia posterior a la selección se
correlaciona con la actividad enzimática dentro de las restricciones
de la actividad de polimerasa. Surgen presiones selectivas
adicionales de la cantidad mínima de dNTP requerida para la
actividad de polimerasa y, por lo tanto, los clones con actividad
catalítica incrementada se amplifican preferentemente a expensas de
las variantes de actividad reducida (la selección es para Kcat y
para Km).
Al mostrar que los presentes inventores pueden
hacer que evolucione un enzima cuyo producto alimenta la reacción de
la polimerasa, los presentes inventores esperan coevolucionar
eventualmente múltiples enzimas relacionados mediante una ruta en la
que el producto de un enzima es el sustrato para el siguiente. Puede
introducirse diversidad en dos o más genes, y ambos genes pueden
cotransformarse en el mismo huésped de expresión en plásmidos o en
fagos. Los presentes inventores esperan desarrollar sistemas de
enzimas cooperantes que permitan la selección para la síntesis de
sustratos artificiales y su posterior incorporación al ADN.
Se clonó un plásmido de expresión pUC19 que
contenía el fragmento de restricción EcoRI/HindIII,
con el marco de lectura abierto de la nucleósido difosfato quinasa
de Myxococcus xanthus. El plásmido se preparó en un cultivo
durante la noche, y se transformó en la cepa ndk-, pykA-, pykF- de
E. coli QL1387. Se cultivó un cultivo durante la noche de
QL1387/pUC19ndk en presencia de cloranfenicol (10 \mug/ml de
concentración final), ampicilina (100 \mug/ml de concentración
final) y glucosa (al 2%) durante un periodo de 14 a 18 horas. El
cultivo de incubación durante la noche se diluyó 1:100 en (2 X TY,
10 \mug/ml de cloranfenicol, 100 \mug/ml de ampicilina y glucosa
al 0,1%). Las células se cultivaron hasta una DO(600 nm) de
0,4 y se indujeron con IPTG (1 mM de concentración final) durante 4
horas a 37°C. Tras la inducción de las proteínas, las células se
lavaron una vez en tampón SuperTaq (Tris-HCl 10 mM,
pH 9, KCl 50 mM, Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2}
1,5 mM, HT Biotechnology) y se suspendieron nuevamente en un volumen
1/10 del mismo tampón. Se cuantificó el número de células mediante
análisis espectrofotométrico, con la aproximación DO_{600} 0,1 = 1
x 10^{8} células/ml.
Para establecer si los desoxinucleósidos
difosfato podían ser fosforilados por la NDP quinasa en un tampón
Taq, se llevó cabo una reacción PCR estándar en la que los
dNTP se sustituyeron por dNDP y ATP, una molécula donadora de
fosfato. La nucleósido difosfato quinasa se expresa en E.
coli QL1387 (una cepa de E. coli con deficiencia de ndk y
piruvato quinasa) tal como se describe en el Ejemplo anterior. Las
células se mezclaron con la mezcla de reacción de PCR.
Las células lavadas se añadieron a una mezcla de
reacción PCR (aproximadamente 8x10^{5} células/\mul de
concentración final) que contenían tampón SuperTaq, 0,5
\muM de cebadores, 100 \muM de cada dNDP, 400 \muM de ATP, y
polimerasa SuperTaq (0,1 unidades/\mul de concentración
final, HT Biotechnology).
Tras romper las células a 65°C durante 10
minutos, incubar la mezcla de reacción durante 10 minutos a 37°C, y
realizar un termociclado (15 ciclos de 94°C durante 15 segundos,
55°C durante 30 segundos, 72°C durante 1 minuto y 30 segundos), los
productos amplificados se visualizaron en un gel de agarosa/TBE al
1,5% estándar teñido con bromuro de etidio (Sambrook). Los
resultados de este experimento demostraron que la NDP quinasa
expresada podía fosforilizar los dNDP, proporcionando a la
polimerasa Taq sustratos para la amplificación por PCR del
gen ndk.
Se repitió el experimento con la etapa adicional
de emulsificación de la mezcla de reacción con aceite mineral y
detergente, tal como se ha descrito anteriormente. Se descubrió que
la NDP quinasa se encontraba activa en el interior de
compartimientos acuosos de una emulsión.
La mezcla de emulsión original permitía la
difusión de moléculas de tamaño reducido entre compartimientos
durante el termociclado. Sin embargo, mediante el ajuste de la
proporción de agua y aceite y minimizando el perfil del
termociclado, se minimizó el intercambio de productos y sustratos
entre compartimientos, resultando en una relación más estrecha entre
genotipo y fenotipo. Dado que las velocidades de difusión pueden
controlarse modificando la mezcla de emulsión, podría resultar
posible ajustar las condiciones de tampón después de la
emulsificación, permitiendo posiblemente un mayor control de las
condiciones de selección (es decir, ajustando el pH con la adición
de ácidos o bases, o iniciando/parando las reacciones con la adición
de sustratos o inhibidores).
Se añadieron, gota a gota (1 gota/5 segundos),
150 \mul de una mezcla de reacción PCR (tampón SuperTaq, 0,5
\muM de cada cebador, 100 \muM de cada dNDP, 400 \muM de ATP,
0,1 unidades/\mul de polimerasa Taq, 8 x 10^{5}
células/\mul de QL1387/ndk) a 450 \mul de una fase oleosa
(aceite mineral) en presencia de Span 80 al 4,5% v/v, Tween 80 al
0,4% v/v yTriton X-100 al 0,05% v/v bajo agitación
constante en un vial de criogenización de fondo redondo de 2 ml
(Corning). Tras la adición de la fase acuosa, se mantuvo la
agitación durante 5 minutos adicionales. Se introdujeron alícuotas
(100 \mul) de las reacciones de emulsión en tubos para PCR de
pared delgada y se termociclaron tal como se ha indicado
anteriormente.
La recuperación de los productos amplificados
tras la emulsificación se llevó cabo de la manera siguiente. Tras el
termociclado, los productos se recuperaron mediante extracción con 2
volúmenes de éter dietílico, se sometieron a agitación con vórtex y
se centrifugaron durante 10 minutos en una microcentrífuga de
laboratorio. Los productos de amplificación se analizaron tal como
anteriormente.
Los niveles de actividad de fondo de quinasa se
determinaron mediante la emulsificación de las células TG1 de E.
coli en tampón Taq con sustratos, tal como se ha descrito
anteriormente. Se observó que la nucleósido difosfato quinasa de
E. coli retenía suficiente actividad tras la
desnaturalización inicial para proporcionar actividad de quinasa
significativa en el ensayos de la presente invención. El plásmido de
expresión pUC19 que contiene el gen ndk se transforma en una cepa
deficiente en ndk de E. coli QL1387. En comparación con el
mutante de inactivación génica catalítico de la mx ndk (H117A), en
el ensayo de la presente invención se determinó que la actividad de
fondo de la quinasa resultaba despreciable (los productos
amplificados no podían visualizarse mediante electroforesis en gel
de agarosa) cuando el ndk se expresa desde la cepa de inactivación
génica.
Se coemulsificó una mutación de inactivación
génica catalítica (NDK H117A) de la NDP quinasa con la NDP quinasa
de tipo salvaje en cantidades iguales. El mutante inactivo de ndk se
distinguió porque daba lugar a un producto de amplificación de menor
tamaño, debido a que las regiones 5' y 3' flanqueantes del ORF
situado más abajo de los sitios cebadores, resultan eliminadas
durante la construcción del mutante de inactivación génica. El
procedimiento de emulsificación de la presente invención proporciona
una inclinación completa hacia la amplificación de la quinasa
activa, según se determina mediante electroforesis en gel de
agarosa.
El enfoque implica la compartimentación de las
células en cuestión en la emulsión (ver el documento WO 9303151)
conjuntamente con reactivos PCR, etc. y polimerasa. Sin embargo, en
vez de ligar genes derivados de una célula mediante ensamblaje por
PCR, se utiliza(n) un(os) cebadore(s)
biotinilado(s), así como perlas de poliestireno recubiertas
de estreptavidina (o cualquier otro medio adecuado para la unión de
cebadores a las perlas). De esta manera, los fragmentos PCR de una
única célula se transfieren a una única perla. Se agrupan las
perlas, se interrogan para la presencia de una mutación o alelo
determinado utilizando sondas marcadas fluorescentemente (como se
describe en "Digital PCR") y se cuantifican mediante FACS. La
PCR multiplex permite la interrogación simultánea de 10 o
posiblemente más marcadores. Las perlas individuales pueden asimismo
separarse para la secuenciación.
Entre las aplicaciones se incluyen, por ejemplo,
el diagnóstico de tumores asintomáticos, basado en la detección de
un número reducido de células mutantes en un gran exceso de células
normales. La ventaja de este procedimiento sobre las técnicas de
tinción celular es la capacidad de procesamiento. Potencialmente, se
pueden interrogar simultáneamente de 10^{8} a 10^{9}
células.
El presente ejemplo se refiere a la selección de
polimerasas con actividad catalítica o procesividad reducidas. La
autorreplicación compartimentada (CSR), tal como se ha descrito,
representa un procedimiento de selección de variantes de polimerasa
con una adaptación incrementada a las diferentes condiciones de
selección. Los mutantes con actividad catalítica incrementada
presentan una ventaja selectiva sobre los que resultan menos activos
bajo las condiciones de selección. Sin embargo, para muchos
objetivos de selección (por ejemplo, especificidad de sustrato
alterada) resulta probable que los intermediarios a lo largo de la
ruta evolutiva hacia el nuevo fenotipo presenten una actividad
catalítica reducida. Por ejemplo, en estudios cinéticos de la ADN
polimerasa I de E. coli, las mutaciones, tales como la E710A,
incrementaron la afinidad y la incorporación de ribonucleótidos a
expensas de velocidades catalíticas inferiores y una afinidad
inferior hacia los sustratos de tipo salvaje
(desoxirribonucleótidos) (F. B. Perler, S. Klumar, H. Kong, Adv.
In Prot. Chem. 49:377-430, 1996). El mutante
correspondiente de la ADN polimerasa I Taq, E615A, podía
incorporar ribonucleótidos en los productos de PCR más eficazmente
que la polimerasa de tipo salvaje. Sin embargo, utilizando los
sustratos de tipo salvaje, dicha polimerasa sólo puede sintetizar
fragmentos cortos y no el gen Taq de longitud completa, tal
como se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa. Por lo
tanto, resultaría difícil seleccionar para esta mutación mediante
CSR. En otro experimento de selección en el que se hace evolucionar
la Beta-glucuronidasa hacia
\beta-galactosidasa, el fenotipo deseado se
obtiene tras varias rondas de selección, aunque a expensas de la
actividad catalítica. También se descubrió que las variantes
seleccionadas en las rondas de selección iniciales resultaban
capaces de catalizar la conversión de varios sustratos diferentes no
utilizados por ninguno de los enzimas parentales, y a velocidades
catalíticas muy inferiores (T. A. Steitz, J. Biol. Chem.
274:17395-8, 1999).
Con el fin de abordar el problema de la
capacidad de seleccionar variantes de polimerasa con actividad
catalítica o procesividad reducidas, tal como puede ocurrir a lo
largo de una trayectoria evolutiva hacia un fenotipo deseado, se
utiliza una variante de CSR en la que sólo se aleatoriza y se
replica una región de tamaño reducido (un "tramo") del gen
investigado. Esta técnica se denomina "CSR de tramo corto"
(spCSR). La spSCR permite que las polimerasas menos activas o de
menor procesividad todavía puedan resultar enriquecidas en una ronda
de selección, mediante la reducción de la ventaja selectiva
proporcionada a los mutantes altamente activos o procesivos. Este
procedimiento se basa en los procedimientos de autorreplicación
compartimentada descritos anteriormente, aunque, debido a que no se
replica el gen completo, el procedimiento de tramo corto también
resulta útil, por ejemplo para investigar dominios específicos
independientes del resto de la proteína.
Existen muchas maneras de introducir diversidad
localizada en un gen, entre los que se encuentran la PCR con
tendencia a error (utilizando manganeso o bases sintéticas, tal como
se ha descrito anteriormente para la biblioteca de polimerasa
Taq), transposición de ADN (C. A. Brautigam, T. A. Steitz,
Curr. Opin. Struct. Biol. 8:54-63, 1998; Y. Li, S.
Korolev, G. Waksman, EMBO J. 17:7514-25, 1998), la
mutagénesis de casete (E. Bedford, S. Tabor, C. C. Richardson, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 94:479-84, 1997), y la
mutagénesis dirigida por oligonucleótidos degenerados (Y. Li, V.
Mitaxov, G. Waksman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:
9491-6, 1999; M. Suzuki, D. Baskin, L. Hood, L. A.
Loeb, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9670-5, 1996) y
sus variantes, por ejemplo la mutagénesis de extremos cohesivos (J.
L. Jestin, P. Kristensen, G. Winter, Angew. Chem. Int. Ed.
38:1124-1127, 1999), y la mutagénesis aleatoria
mediante la amplificación de plásmido completo (T. Oberholzer, M.
Albrizio, P. L. Luisi, Chem. Biol. 2:677-82, 1995).
Puede utilizarse un escaneo combinatorio de alaninas (A. T. Haase,
E. F. Retzel, K. A. Staskus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:4971-5, 1990) para generar variantes de
bibliotecas para determinar qué residuos de aminoácidos resultan
funcionalmente importantes.
Los datos estructurales (M. J. Embleton, G.
Gorochov, P. T. Jones, G. Winter, Nucleic Acids Res.
20:3831-7, 1992), los de alineación de secuencias
(D. S. Tawfik, A. D. Griffiths, Natl. Biotechnol.
16:652-656, 1998) y bioquímicos obtenidos en
estudios de la ADN polimerasa I han revelado regiones del gen
implicadas en la unión de nucleótidos y la catálisis. Entre las
diversas regiones diana posibles se incluyen las regiones 1 a 6, tal
como se comenta en D. S. Tawfik, A. D. Griffiths, Natl. Biotechnol.
16:652-656, 1998) (las regiones 3, 4, y 5 también se
denominan Motivo A, B, y C, respectivamente, en la ADN polimerasa I
Taq). Otras posibles regiones diana serían las regiones que
se conservan entre varias especies diferentes, a las que los datos
estructurales implican en el contacto del sustrato nucleótido o que
se encuentran implicadas en la catálisis o en la proximidad del
sitio activo, o cualquier otra región importante para la función
polimerasa o para la unión del sustrato.
Durante una ronda de selección, se requiere que
cada variante de biblioteca replique sólo la región de diversidad.
Esto puede conseguirse fácilmente proporcionando cebadores en una
reacción PCR que flanquean la región diversificada. Las selecciones
CSR se realizarían esencialmente de la manera descrita. Tras la
selección CSR, la región corta que se diversifica y se replica, se
reintroduce a continuación en el gen iniciador (u otra estructura
genética, por ejemplo una biblioteca de mutantes del gen parental,
un gen relacionado, etc.) utilizando sitios de restricción
adecuadamente situados o procedimientos de recombinación PCR, tales
como la transposición por PCR o la mutagénesis Quickchange, etc. El
ciclo spCSR puede repetirse muchas veces y puede dirigirse a
múltiples regiones de manera simultánea o iterativamente,
amplificando los cebadores flanqueantes regiones individuales de
manera separada o
inclusiva.
inclusiva.
Con el fin de incrementar la astringencia de las
elecciones en una etapa posterior, la spCSR es regulable simplemente
mediante el incremento de la longitud de la secuencia replicada, tal
como definen los cebadores flanqueantes hasta la CSR de la longitud
completa. De hecho, para la selección para procesividad, inter
alia, puede resultar beneficioso extender el segmento replicado
más allá del gen codificado hasta la totalidad del vector,
utilizando estrategias análogas al iPCR (PCR inverso).
La spCSR puede presentar ventajas sobre la CSR
de la longitud completa, no sólo cuando se buscan variantes de
polimerasa con actividades o procesividades reducidas, sino también
cuando se realiza el mapeo de regiones discretas de una proteína
buscando una mutabilidad, por ejemplo conjuntamente con un escaneo
combinatorio de alaninas (A. T. Haase, E. F. Retzel, K. A. Staskus,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4971-5, 1990),
para determinar qué residuos aminoácidos resultan funcionalmente
importantes. Dicha información puede resultar útil en una etapa
posterior como guía para enfoques semirracionales, es decir, para
fijar como diana la diversidad de residuos/regiones no implicados en
la actividad central de la polimerasa. Además, la spCSR puede
utilizarse para trasplantar segmentos de polipéptidos entre
polimerasas (tal como el injerto de CDR de inmunoglobulina). Un
simple intercambio de segmentos puede conducir inicialmente a
polimerasas de actividad reducida, debido a impedimentos estéricos y
puede requerir una "reorganización" para integrar los segmentos
funcionalmente. La reorganización puede realizarse utilizando la CSR
de la longitud completa (por ejemplo partiendo de bibliotecas
existentes de mutantes aleatorios) o utilizando la spCSR dirigida a
regiones secundarias (la "región de Vernier" en los
anticuerpos).
También pueden localizarse tramos cortos en
cualquiera de los extremos N-terminales o
C-terminales en forma de extensiones de las
secuencias existentes de gen de polimerasa o en forma de inserciones
internas. Existen precedentes en la Naturaleza de estas extensiones
e inserciones modificadoras del fenotipo. Por ejemplo, tanto una
extensión C-terminal de la ADN pol de T5, como la
inserción ligante de tiorredoxina en la ADN pol de T7 resultan
cruciales para la procesividad de estos enzimas y les permiten la
replicación eficaz de genomas de los fagos T de gran tamaño (>30
kb). Las extensiones de los extremos N-terminales o
C-terminales también han demostrado mejorar la
actividad de otros enzimas.
Se clonó fragmento Klenow a partir de ADN
genómico de E. coli en el vector de expresión pASK75 (al
igual que con la Taq) y se expresó en la cepa DH5\alphaZ1
(Lutz R. y Bujard H., Nucleic Acids Res. 25:1203, 1997) de E.
coli. Las células se lavaron y se volvieron a suspender en Tris
10 mM, pH 7,5. Se añadieron 2 x 10^{8} células resuspendidas (20
\mul) a 200 \mul de tampón de PCR a temperatura reducida (LTP)
(Iakobashvili, R. & Lapidot, A., Nucleic Acid Res. 27: 1566,
1999) y se emulsificaron tal como se describe en Ghadessy et
al., PNAS 98:4552, 2001). El LPT era de Tris 10 mM (pH 7,5),
L-prolina 5,5 M, glicerol al 15% p/v, MgCl_{2} 15
mM + cebadores adecuados (debido a que la prolina reduce la
temperatura de fusión, los cebadores deben ser
40-meros o más grandes) y dNTP, y se emulsificó tal
como se ha descrito anteriormente. El ciclo de PCR de temperatura
reducida fue de 70°C durante 10 minutos y 50 x (70°C durante 30
segundos, 37°C durante 12 minutos). La fase acuosa se extrajo, tal
como se ha descrito anteriormente, y los productos de selección se
amplificaron nuevamente, tal como se describe en Ghadessy et
al., PNAS 98:4552,
2001).
2001).
Resultarán evidentes para los expertos en la
materia diversas modificaciones y variaciones de los procedimientos
y sistemas descritos de la invención sin apartarse del alcance de la
invención. Aunque la invención se ha descrito en relación a formas
de realización preferidas específicas, se debe entender que la
invención según las reivindicaciones no debería limitarse
indebidamente a dichas formas de realización específicas. De hecho,
se pretende que diversas modificaciones de los modos de poner en
práctica la invención descritos que resultan evidentes para los
expertos en biología molecular o campos afines se encuentren
comprendidas dentro del alcance de las reivindicaciones
siguientes.
siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Clon T7-88 termoestable:
secuencia de nucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
Clon T7-88 termoestable:
secuencia de aminoácidos
\vskip1.000000\baselineskip
Clon T9 termoestable: secuencia de ácidos
nucleicos
\newpage
Clon T9 termoestable: secuencia de
aminoácidos
\vskip1.000000\baselineskip
Clon T13 termoestable: secuencia de
aminoácidos
\vskip1.000000\baselineskip
Clon 8(T8) termoestable: secuencia de
ácidos nucleicos
\newpage
Clon 8(T8) termoestable: secuencia de
aminoácidos
Nota: no se han secuenciado los dos primeros
aminoácidos de los extremos N-terminales.
\vskip1.000000\baselineskip
Clon 94 resistente a la heparina: secuencia de
ácidos nucleicos
\vskip1.000000\baselineskip
Clon H94 resistente a la heparina: secuencia de
aminoácidos
Nota: no se determinaron los 5 aminoácidos
N-terminales
\newpage
Clon 15 resistente a la heparina: secuencia de
ácidos nucleicos
\newpage
Clon 15 resistente a la heparina: secuencia de
aminoácidos
Nota: no se determinaron los 5 aminoácidos
N-terminales.
\vskip1.000000\baselineskip
Clon M1 con extensión desde un desapareamiento:
secuencia de ácidos nucleicos
\vskip1.000000\baselineskip
Clon M1 con extensión desde un desapareamiento:
secuencia de aminoácidos
Nota: no se determinaron los 2 aminoácidos
N'-terminales
\newpage
Clon M4 con extensión del desapareamiento:
secuencia de ácidos nucleicos
\newpage
Clon M4 con extensión de un desapareamiento:
secuencia de aminoácidos
Nota: no se determinaron los 6 aminoácidos
N-terminales
<110> Medical Research Council
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de evolución
dirigida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P8257WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial - secuencia sintética (Cebador 1, designación -
TaqbaXba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial - secuencia sintética (Cebador 2 designación -
TaqfoSal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggtgcgga gtcgactcac tccttggcgg agagccagtc ctc
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial - secuencia sintética (Cebador 3, designación - 88ba4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaatctag ataacgaggg caa
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial - secuencia sintética (Cebador 4, designación - 88fo2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccaccgaac tgcgggtgac gccaagcg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial - secuencia sintética (Cebador 5, designación -
Taqba(scr)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtacgtgg agaccctctt cggcc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial - secuencia sintética (Cebador 6, designación - LMB2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaaaacgac ggccagt
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial - secuencia sintética (Cebador 7, designación - LMB3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggaaacag ctatgac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial - secuencia sintética (Cebador 8, designación -
88ba4LMB3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggaaacag ctatgacaaa aatctagata acgagggcaa
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial - secuencia sintética (Cebador 9, designación -
88fo2LMB2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaaaacgac ggccagtacc accgaactgc gggtgacgcc aagcg
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial - secuencia sintética (Cebador 10, designación -
LMB388ba5WA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (38)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> desapareamiento
a-g
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggaaacag ctatgacaaa aatctagata acgaggga
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial - secuencia sintética (Cebador 11, designación -
8fo2WC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (45) .. (45)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> desapareamiento
c-c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaaaacgac ggccagtacc accgaactgc gggtgacgcc aagcc
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial - secuencia sintética (Cebador 12, designación -
LBA23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagtagatg cttgcttttc tgagcc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial - secuencia sintética (Cebador 13, designación -
LFO46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctggtta tctgcatcat cgtctgcc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2500
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus aquaticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clon T7-88
termoestable
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 829
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus aquaticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clon T7-88
termoestable: Secuencia de aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2554
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus aquaticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clon T9 termoestable: Secuencia de
ácido nucleico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2553–)..(2554)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" puede ser cualquiera de
entre a, c, t, g
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 829
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus aquaticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clon T9 termoestable: Secuencia de
aminoácido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 829
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus aquaticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clon T13 termoestable: Secuencia de
aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2499
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus aquaticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clon 8 (T8) termoestable: Secuencia
de ácido nucleico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 827
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus aquaticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clon 8 (T8) termoestable: Secuencia
de aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> No se secuenciaron los primeros dos
aminoácidos en el extremo N
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2483
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus aquaticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clon 94 resistente a la heparina:
Secuencia de ácido nucleico
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 825
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus aquaticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clon H94 resistente a la heparina.
Secuencia de aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nota: no se determinaron los 5
aminoácidos N-terminales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2480
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus aquaticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clon 15 resistente a la heparina:
Secuencia de ácido nucleico
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 827
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus aquaticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clon 15 resistente a la heparina:
Secuencia de aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nota: no se determinaros los 5
aminoácidos N-terminales.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2850
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus aquaticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clon M1 con extensión de un
desapareamiento: secuencia de aminoácidos.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 830
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus aquaticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clon M1 con extensión de un
desapareamiento: secuencia de aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nota: no se determinaron los 2
aminoácidos N'terminales.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2484
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus aquaticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clon M4 con extensión de un
desapareamiento: Secuencia de ácido nucleico.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 826
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus aquaticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clon M4 con extensión de un
desapareamiento: Secuencia de aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nota: no se determinaron los 6
aminoácidos N-terminales.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (25)
1. Procedimiento para la selección de un enzima
capaz de amplificar un ácido nucleico a partir de un molde,
comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes:
- a)
- proporcionar un conjunto de ácidos nucleicos que comprende unos elementos que codifican un enzima que es capaz de amplificar ácidos nucleicos a partir de un molde o una variante del enzima;
- b)
- subdividir el conjunto de ácidos nucleicos en microcápsulas, de manera que cada microcápsula comprende un elemento ácido nucleico del conjunto junto con el enzima o la variante codificada por el elemento ácido nucleico;
- c)
- dejar que se produzca la replicación del ácido nucleico; y
- d)
- detectar la replicación del elemento ácido nucleico por parte del enzima.
2. Procedimiento para la selección de un agente
capaz de modificar la actividad de una enzima que es capaz de
amplificar el ácido nucleico a partir de un molde, comprendiendo el
procedimiento las etapas siguientes:
- a)
- proporcionar un enzima que es capaz de amplificar el ácido nucleico a partir de un molde;
- b)
- proporcionar un conjunto de ácidos nucleicos que comprende unos elementos que codifican uno o más polipéptidos candidatos;
- c)
- subdividir el conjunto de ácidos nucleicos en microcápsulas, de manera que cada microcápsula comprende un elemento ácido nucleico del conjunto, el agente codificado por el elemento ácido nucleico, y el enzima; y
- d)
- detectar la replicación del elemento ácido nucleico por parte del enzima.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que el agente es un promotor de la actividad enzimática.
4. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3,
en el que el agente es un enzima, preferentemente una quinasa o una
fosforilasa, capaz de actuar sobre el enzima para modificar su
actividad.
5. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3,
en el que el agente es un polipéptido implicado en una ruta
metabólica, presentando la ruta metabólica como producto final un
sustrato que se encuentra implicado en la reacción de replicación de
un ácido nucleico.
6. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3,
en el que el agente es un polipéptido capaz de producir un sustrato
o de consumir un inhibidor en una reacción de replicación de un
ácido nucleico.
7. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3,
en el que el agente es un polipéptido capaz de modificar un
nucleótido cebador o un sustrato nucleósido trifosfato utilizado en
una reacción de replicación de un ácido nucleico, de manera que:
- a)
- su extremo 3' se convierte en extensible; o
- b)
- una porción de sustrato anexo al nucleótido cebador o nucleósido trifosfato se modifica de manera que permite la detección o la captura del producto apéndice del nucleótido cebador o nucleósido trifosfato incorporado.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el tratamiento del elemento
ácido nucleico constituye la replicación de la totalidad o de uno o
de varios segmentos de dicho elemento.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el tratamiento del elemento
ácido nucleico comprende una reacción de relleno de una proyección
5' anexa a dicho elemento o una extensión de un extremo 3' de dicho
elemento.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la amplificación del ácido nucleico es el resultado de más de
una ronda de replicación de ácido nucleicos.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que la replicación del ácido nucleico es una amplificación
exponencial.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la reacción de replicación es
una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una reacción en
cadena de la transcriptasa-polimerasa inversa
(RT-PCR), una PCR anidada, una reacción en cadena de
la ligasa (LCR), un sistema de amplificación basado en la
transcripción (TAS), una replicación de secuencia autosostenida
(3SR), NASBA, una reacción de amplificación mediada por
transcripción (TMA) o una amplificación por desplazamiento de cadena
(SDA).
13. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el número de copia del elemento ácido nucleico tras la
amplificación resulta sustancialmente proporcional a la actividad
del enzima.
14. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que el número de copia del elemento ácido nucleico tras la
amplificación resulta sustancialmente proporcional a la actividad
del polipéptido.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, en el que el número de copia del elemento
ácido nucleico tras la amplificación resulta sustancialmente
proporcional a la afinidad de unión y/o a la cinética del primer y
del segundo polipéptidos.
16. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la replicación del ácido
nucleico se detecta mediante ensayo del número de copia del elemento
ácido nucleico.
17. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que la replicación del ácido nucleico
se detecta mediante ensayo del número de copia de los segmentos del
elemento ácido nucleico.
18. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que la replicación del ácido nucleico
se detecta mediante ensayo de la presencia de un marcado del
elemento ácido nucleico.
19. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que la replicación del ácido nucleico
se detecta mediante la determinación de la actividad de un
polipéptido codificado por el elemento ácido nucleico.
20. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que las condiciones en la
microcápsula se ajustan para seleccionar para un enzima o para un
agente activo bajo dichas condiciones.
21. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido se proporciona
a partir del ácido nucleico mediante transcripción y traducción
in vitro.
22. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el elemento ácido nucleico es
incorporado a un vector e introducido en una célula huésped para
expresar el polipéptido.
23. Procedimiento según la reivindicación 22,
que comprende la expresión del polipéptido a partir del vector.
24. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que las microscápsulas comprenden
microcápsulas acuosas de una emulsión de agua en aceite.
25. Procedimiento según la reivindicación 24, en
el que la emulsión de agua en aceite se produce emulsionando una
fase acuosa con una fase oleosa y un surfactante que comprende Span
80 al 4,5% v/v, Tween 80 al 0,4% v/v y Triton X100 al 0,1% v/v, o un
surfactante que comprende Span 80, Tween 80 y Triton X100 en
sustancialmente las mismas proporciones.
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