PT1317539E - Método de evolução dirigida - Google Patents

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DESCRIÇÃO "MÉTODO DE EVOLUÇÃO DIRIGIDA"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a métodos para utilização em evolução in vitro de bibliotecas moleculares. Em particular, a presente invenção refere-se a métodos de selecçâo de ácidos nueleieos que codificam produtos de genes, em que o ácido nucleico e a actividade do produto do gene codificado estão ligados por compartimentais zaçã.o. ant:

DENTES DA INVENÇÃO variedade genética pela seiec cão desses cas benéfic as. Devido dos seus produtos ligados em oraanísmos ácidos nueleieos que codificam a coloraçã das células em que e i.0S Θ S L cd. O c o : : .L. .L. 1 J. CA 1.1 f d S } genótipo resu -1. G 3. Π G 0 em al .ter a ç a o (ç ó e s fenótipo produzem benef ICI05 p 3. Σ cl o organismo A evoiuçao requer a produção oe (diversidade nos ácidos nueleieos) seguida pela á.cidos nueleieos que codificam caractei à actividade dos ácidos nueleieos codificados pelos genes estão fisicamente iiqadc biológicos (os molecular azul alterações nc adaptstívs(s) c resultando em sobrevivência aumentada e descendência. Rondas múltiplas de muta.ção e selecçâo, pode d.este modo resultar no enriquecimento progressivo de organismos (e o genótipo codificante) com aumento de adaptação a uma determinada condição de selecçâo. Os sistemas cara evolução rápida de ácidos 1 nucleicos ou proteínas in vitra devem imitar este processo ao nível molecular em que o ácido nucleico e a activrdade do produto do gene codificado devera estar ligados e a actividade do produto do gene deve ser seleccionável.

As tecnologias de selecção in vitra são um campo em rápida expansão e mostram-se frequentemente mais poderosas do que a concepção racional para obter biopolímeros com propriedades desejadas, Na última década, as experiências de selecção utilizando e. g. exposição em fagos ou tecnologias SELEX, produziram muitos novos ligandos polinucleotidicos e poiipeptidicos. A selecção para a catálise mostrou-se ainda ma.is difícil. As estratégias incluíram a ligação de análogos de estado de transição, ligação covalente a inibidores suicidas, acoplamento por proximidade e ligação covalente do produto. Embora estas abordagens se foquem apenas numa parte particular do ciclo enzimático, registaram-se alguns sucessos, IJltimamente, contudo, é desejável fazer selecção directamente para processamento catalítico. De facto, o simples rastreio de processamento catalítico de bibliotecas de mutantes razoavelmente pequenas for bem mais bem sucedido do que as abordagens de várias selecções e produziu alguns catalisadores com taxas catalíticas bastante melhoradas.

Embora as polímerases sejam um pré-requisito para tecnologias que definem a biologia molecular, i. e. mutagénese dirigida ao sitio, clonagem de ADNc e, em particular, sequenciaçao de Sanger e PCE, sofrem, por vezes, sérios problemas devido ao facto de serem produzidas para realizar tarefas para as quais a. natureza não as optimizou. Foram realizadas várias tentativas para melhorar as propriedades de polímerases disponíveis a partir da natureza e parai as desenhar 2 para aplicações específicas por engenharia de proteínas. Os avanços técnicos foram bastante periféricos, e incluíram a utilização de polimerases a partir de uma vasta gama de organismos, sis tema. s tampão e adi uivos assim como misturas de enzimas,

As tentativas para melhorar as propriedades de polimerases basearam-se tradicronalmente em engenharia de proteínas. Por exemplo, as variantes de polimerase Taq (por exemplo, fragmento Stoffel e Klentaq) foram produzidas por deleção total ou parcial do seu domínio de exonuclease 5'-3' e apresentam terrrioestabl.lida.de e fid.elid.ade melhoradas embora com o custo de capacidade de processamento reduzida (Barnes 1992, Gene 112, 29-35, Lawyer et al., 1993, PCR Methods and Applications 2,275) * Adicionalmente, a disponibilidade de estruturas de elevada resolução parar proteínas permitiu a concepção racional de mutantes com propriedades melhoradas (por exemplo, mutantes de Taq com propriedades melhoradas de incorporação de didesoxinucleótidos para sequenciação cíclica, Li et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sei USA 96, 9491). As abordagens genéticas in vivo foram também utilizadas para a concepção de proteínas, por exemplo, por complemen tação de uma estirpe de uma polA" para seleccionar polimerases activas a partir de repertórios de polimerases mutantes (Suzuki et al,, 1996 Prece Natl. Acad. Sc± USA 93, 9670). Contudo, a abordagem da complementação genética é limitada nas propriedades que podem ser seleccionadas.

Os recentes co-seleccionar in propriedades em codificam. Os avanços da biologia molecular permitiram vitro algumas moléculas, de acordo com as suas simultâneo com os ácidos nucleicos que os ácidos nucleicos seleccionados podem subsequentemente ser cionados para análise posterior ou 3 utilização, ou ser submetidos a rondas adicionais de mutação e seiecção. É comum nestes métodos a preparação de grandes bibliotecas de ácidos nucieicos. As moléculas possuindo as caracteristicas desejadas {actividade} podem ser isoladas através de regimes de seiecção que seleccionam a actividade desejada peio produto codificado peio gene, tal como uma actividade bioquímica ou biológica desejada, por exemplo, a actividade de ligação. 0 documento WO99/02671 e Tawfik D. & Grrffiths A.D. (199S) Nature Biotech. 16, 652 descreve um método para isolar um ou mais elementos genéticos que codificam o produto do gene possuindo uma actividade desejada. Os elementos genéticos são primeiro compartimentalizados em microcápsulas, e depois transcritos e/ou traduzidos para produzir os seus produtos de genes respectivos (ARK ou proteína) nas microcápsuias, Al. terna, ti varriente, os elementos genéticos estão contidos numa célula hospedeira em que transcrição e/ou tradução (expressão) do produto do gene ocorre e as células Os elementos genéticos que produzem o produto do gene possuindo actividade desejada são subsequentemente separados. 0 método descrito no documento WO99/02671 baseia-se no produto do gene que modifica catalíticamente a mícrocápsuia ou o elemento genético (ou ambos), de modo que o enriquecimento nas entidades ou entidade desejadas permite a seiecção da actividade desejada.

Suzuki et al., (1996) PNAS 93:9670-9675, documento W098/23733 e documento W094/26766 descerevem mutagénese aleatória de polimerases de ADN conduzindo a termoestabilidade melhorada e polimerases de ADN possuindo termoestabilidade melhorada. 4

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, proporciona-se um método de selecçao de uma enzima que é capaz de amplificar ácido nucleico a partir de um molde, compreendendo o método, os passos de: (a) proporcionar uma mistura de ácidos nucleicos compreendendo membros que codificam uma enzima que é capaz de amplificar ácido nucleico a partir de um molde ou uma variante da enzima; (b) subdividir a mistura de ácidos nucleicos em compartimentos, de modo que cada compartimento compreende um ácid.o nucleico membro da mistura em conjunto com a enzima replicase de ácid.o nucleico ou variante codificada pelo ácido nucleico membro; (c) permitir que ocorra a replicação do ácido nucleico; e (d) detectar a replicação do ácido nucleico membro pela enzima. É proporcionado, de acordo com um segundo aspecto da presente invenção, um método de selecçao de um polipéptido capaz de modificar a actividade de uma reacção enzimática que é capaz de amplificar ácido nucleico a partir de um molde, compreendendo o método os passos de: (a) proporcionar uma enzima que é capaz de amplificar ácido nucleico a partir de um molde; (b) proporcionar uma misturai de ácidos nucleicos compreendendo membros que codificam um ou ruais polipéptídos candidatos; (c) subdividir a mistura de ácidos nucleicos em compartimentos, de modo que cada compartimento compreende um ácido nucleico membro da mistura, o polipéptido codificado pelo ácido nucleico membro, e a enzima; e (d) detectar a replicação do ácido nucleico membro peia enzima.. 5

De um moc io prefe ía o O lipéptido 0 um. promotor d.a activíd P ,··^ ítí Ο- ·_ da e nzima. 0 polipéptido pode ser uma enzima, de modo preferi do, uma cinass c το. unia losfo. rilase qn .e é capaz de actuar numa en zima que é capaz de am.Di.if ie ar acioo mu cl. eico a partir de um molde para modificar a sua actividade. 0 polipéptido pod.e ser uma chaperona envolvida na organização ou montagem da enzima ou estar envolvido na manutenção da função replicase (e. g. telomerase, HSP 90) . Alternativamente, o pol. ipépti do P o de estar envolvido n uma via metabólica, possuindo a via como um produto finai um su .bstrato que está envolvido na reacção de rep licação. 0 poiipéptr do pode além disso, ser qualq uer enzima que é capaz de ca tai is ar uma reacção que modific. a um age rd ,e i ri t Vi i ri n r (natural ou não natural) de urna enzima de modo a reduzir ou abolir a sua. actividade inrbidora. Finalmente, o polipéptido pode promover a actividade de NAP de um modo não catalítico, e. g, por associação com a enzima ou o seu substrato etc. (e. g. faetores de ca.paoid.ade de processamento no caso de pol.irnera.ses de ADN, e. g. polimerase de ADN de T7 & tiorredoxina).

As enzimas capazes de amplificar ácidos nucieicos a partir de um molde, podem ser, por exemplo, moléculas de enzima de polipéptido ou á.cido ribonucl eico. Numa forma de realização altamente preferida, a enzima de acordo com a invenção é uma enzima replicase, ; / /T.\ uma enzima, qu< e é capaz de amplif ácid.o nucleico a. ; parti r de um molde como, por exemplo, uma enzima polimerase (ou 1 ig ase) . Numa forma < de realiz ;ação preferida da invenção, a amplificação de ácidos nucieicos resulta em mais do que uma ronda Ce repiicaçâo Ce ácido nucleico. De modo preferido, a. amplificação do ácido nucleico é uma. amplif icaçã.o exponencial. 6 de modo preferido, A reacçao de amplificação é de modo preferido, seieccionada a partir do seguinte: reacçao de polímera,se em cadeia (PCR) , reacçao de transcriptase reversa-polimerase em cadeia (RT-PCR), PCR interno, reacçao de Iigase em cadeia (LCR), sistema de ampli f icaçao com ba.se na. transcrição (TAS), replicação de sequências auto-sustentada (3SR), NASBA, reacçao de amplifreação mediada por transcrição (TMA), e amplificação por deslocamento de cadeia ÍSDAt „

Numa forma de realização altamente preferida, o número cdpi as do ácido nucleic substan ciaimente proporcional activid ade de um pol; l.péptído ΐ p r i me i a: o e segundo po lipépt. i dos ri replicação de i ácido nucl ensaio do número de cópi Alterna tivamente, ou adi ciort nucleic o pode ser det ectada po. poiipép tido codificad· o pelo áci 5 actividade da reolicase. do cid.o nucleico membro * a replicação do ácido

Numa forma ΟΘ reali zação altamente prefer i.aa t as condições microcápsuia S cÍC ') ci. j U 3 X, cl d 3.3 para selec cionar uma replrcase ou ipéptido acti LVO sob tais co ndrções, ou i um pa ν' Qp poiipéptidos interacção es /ei sob tais condicões ipaz A replrcase possui, de modo preferido, actividade de polimerase, transcriptase reversa ou Iigase. 0 polipéptido pode ser proporcionado a partir do ácido mcleico cor transcrição e tradução in nitro. Alternatrvamente, 7 partir do ácido nucleic o polipéptido pode ser fornecido vivo num hospedeiro de expressão.

Numa forma óleo. A emuisãc de real í zr acão preferida, a. s mi crocápsu .las oner; te aquos o en capsulado nu :ma. emr rlsão água- Θ TU ” .CJU3. em-óleo e r\ ·- ; ^ e modo prefs ;rido, produzida por uma fase aquo sa com uma ui a s e de ó 1 e o na agem te tensi oact ivo compree; adendo 4,5% v/v de 7 de Tween 8 0 \T 0,1% v/v de Triton XI00, ou um

Span 80, 0,4% agente tensioactivo compreendendo Span 80, Tween 80 e Triton X100 substancialmente nas mesmas proporções. De modo preferido, a proporção da fase água: óleo é 1:2, que conduz a um tamanho de gota adequado. Estas emulsões possuem uma. estabilidade térmica superior do que as emulsões ricas em óleo,

De um modo preferido, o método de acordo com a invenção pode utilizado cara seieccionar enzimas reolicase possuindo uma ter moest; 3.0 u. .1. ,j. d.cl de s uper i o r á correspond 0T ate e π z ί . rua não sei eccio: nada. De modo mar s preferrc lo, a enzim cl rep iicase é a Taq por imera; se possui ndo uma semi-vida aumentada m .ar s de 10 veze Q :h Oi H ' 1 í quando cor mpam com a doli merase Taq O i- -l. .po se; . vageri A enzima replicase pode possuir uma maior tolerância à heparina do que uma enzima correspondente não seieccronada. De modo preferido, a izrma rs . o a. s e por irr

Taq activa a uma concentração de 0,083 unidades/pL ou mais de heparina. A enzima replicase pode ser capaz de estender um iniciador possuindo um desem.parelham.ento 3' . De modo preferido, o deseiriparel.haiTi.ento 3' é um desemparelhamento 3' purina-purina. ou a um desemparelhamento 3' pirrmidina-pirímidína. De um modo mais preferido, o desemparelhamento 3' é um desemparelhamento A-G ou o desemparelhamento 3' é um desemparelhamento C-C. sei mut

Por exem pio, o método da invenção pode s θ r utiliza do p ara eccionar uma polimerase Taq mutante, cor ΠΌ.η'06%ηθ.θ ndo d S ações (su): rstituições de aminoácidos) : F" 7 1 Q . JU/ R205K, K21 0,1)1 -Xl_l ;

e A608V M2;

Por exemplo, o método da invenção pode ser utilizado para seleccionar uma polimerase Taq mutante, compreendendo as mutações (substituições de aminoácidos): K225E, E388V, K540R, D578G, N583S e M747R.

Por exemplo, o método da invenção pode ser utilizado para seleccionar uma polimerase Taq mutante, compreendendo as mutações (substituições de aminoácidos): G84A, D144G, K314R, E520G, A608V, E742G.

Por exemplo, seleccionar uma mutações (substi L245R, R343G, G37 parai

Cl S o método da invenção pode ser utíiiz polimerase Taq mutante, compreend· tuiçoes de aminoácidos): D58G, R74P, OD, E520G, N583S, E694K, A743P. uma emulsão água-em-óleo fase aquosa com urna fase ctivo compreendendo 4,5% v/v Triton X100, ou um A invenção emprega vantajosamente que se obtém por emulsificação de urna óleo na presença de um agente tensio v/v Span 80, 0,4% v/v Tween 80 e 0,1 agente nnpreendendc >an

Tween 80 dron preferido, permitir a

De modo pa rece outras elevada

X100 substaneialmente nas mesmas proporções * a proporção água.: óleo é 1:2, esta pr opor ção difusão de dNTRs (e presumivelmente de pequenas) entre rnicrocápsulas a temperaturas 9 benéfico para algumas aplicações mas não para outras. A difusão pode ser controlada através do aumento da proporção água:óleo para 1:4.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura IA é um. dragrama apresentando uma forma de realização de um método de acordo com a. presente invenção aplicado à selecção de uma polimerase auto-evolutiva, em que o número de cópias do gene está ligado ao processamento enzimático. A Figura IB é um diagrama apresentando um esquema, geral de auto replicação compartimentai!zada (CSR): 1) Um repertório de diversos genes de polimerases é clonado e expresso em E. coli. As esferas representam moléculas activas de polimerase. 2) Células bacterianas contendo a polimerase e gene codificante são ressuspendidas em tampão de reacção contendo iniciadores de flanco e trifosfatos de nucleótido (dNTPs) e segregadas em compartimentos aquosos. 3) A enzima. polimerase e gene codificante são libertados da célula permitindo que prossiga a auto-replícação. As polimerases pouco activas (hexágono branco) não conseguem replicar o seu gene codificante. 4) Os genes de polimerases "descendentes" são libertados, rediversificados e reclonados para outro ciclo de CSR. A Figura 2 é um diagrama apresentando compartimentos aquosos da emulsão estável ao calor contendo células de E, coli que expressam a proteína verde fluorescente (GFP) antes de (A, B) , e após ciclos térmicos (C), como visualizado por microscopia óptica. (A, B) representam a mesma grelha, (A) é a imagem a 10

535 nro para a visualizar as cias bactéria; Brouuia.no du nuores célu .las f li aore ante :orno de t í A. é um G 3. emu. urbes em (A) exoosícao. P (B) em luz visível pé movimento rnédias do 1 3 3. devida ac dimensões

' Ç 3.0 . j. 3 S θ 1Γ S 5.0 G equrr, A Figura 3A. é um diagrama apresentando cruzamento entre os compartimentos da emulsão. Duas reacçoes convencionais de PCR, dí f e rindo no taman do presença de 'l'ci Q (P CR ampl .1.11 CG d cl. S 1 ndiv 1 v. Li C a. In solução, ambo s os mo 1 d.e sepa radamente , ant G S marc ador ΦΧ17 4 Hae. Eli . A Figura 3B Θ um comp artimento .3 (1θ emu is. a ρ orimerase rp ,-.r do t S r o f fel da r >olime r as< rr tamp ão) (1,8 kb) ; 0 G 0 rrr : + Tag, PCR 2: sem enzima) r são ante ou combinadas. Quando combinadas em são amplificados. Quando em.uisíficadas mistura, apenas PCR1 é amplificado. M: diagrama apresentando C1 u zamento ent Γ 0 O * Δ S C Θ -L1J 13. S lo 3. C l Θ Γ i. 3 11G 3 que express am ipo selvagem (2/7 kb) ou o fragmen to Taq (pouco activo sob a s condições do o t U 1 çiO-3 S .L * 1 G í .l L Θ 8 d d. emu.l sificacáo. Em

solução, o fragmento Stoffer mais curto é amplificado de mod.o preferido. Em emulsão, verifica-se predominantemente amplificação do gene da Taq do tipo selvagem e apenas amplificação fraca do fragmento Stoffer (seta). M: marcador XHindIII A Figura 4 é um diagrama apresentando detalhes de uma forma de realização de um método de acordo com a presente invenção aplicado à seleccão de uma pol.imera.se auto-evolutiva. 11 detalhes de uma forma A Figura 5 é um diagrama, apresentando de realização de um método de acordo com a presente invenção para seleccionar a incorporação de novos substratos ou pouco frequentes - Z\ Figura íp. O -jj m d 3.CÍJT 3.111 cl aprs ;sent ando a s eiec ção de ARN poss ui ndo act 0 V J_ 1 d a de c :a· 3 ci litica (in term oiecuiar) utn .lizando 0 s método s da inv enç : § o „ 7^ Figura íti um diagrama ap: :eser itando um modelo de um c omp ie XO 1 O P: IDE. Λ .Cl di.gura >< * A Λ TA ,C\ * ti sq u.e una gerai . ίΐθ uma. reacção c oope rativa CSR. J\ Q -Ϊ nas e de ,·-Ν 0 J. :osf atos de r iucle 6sido (nd k) é expressa a P artir de um P lasmideo 0 cc inverte difo sfatos de H idesoxin. '! "! C'' Ί eós 1 r] n p que não são subs tratos pa ra a. polimei :ase T a.q em tr i f O sf a.t 0 S· r ie desoxi .nuci .eósi dos que o S 3 O . Assim que ndk produz quantidades suficientes de substrato, a Taq pode replicar o gene ndk. B: As células bacterianas que expressam o ndk do tipo selvagem (0,8 kb) ou um fragmento truncado inactivo (0,5 kb) são misturadas 1:1 antes da emulsificação. Em solução, o fragmento truncado mais curto é amplifrcado de modo preferido. Em emulsão, existe predominantemente amplificação do gene nc :ik do tipo selv agem e apenas fraca amplificação do fragmento truncado (seta .) indicando qi: ie em emulsão, apenas 8 cl O cl.Ulp .1. .1. sacados ge 11 es ndk activos a produzir substrato.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA. DA INVENÇÃO A prática da presente invenção emprega, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de química, b.ÍO log .i. vx. molecular, mi crobio.log 1. a. y ΆΥ )N recombi nantt imu nol P ‘-d d- d , que estão dentro das cap >acic iades de ur na especi cl 1±S i técn ica. Tais t écni ϋ3. S SãO e xp 11 ca dar iit era tura Ver f d V g -, J Sambi :ook, E. , F. FritSí Man iat is, 1989, Molecu 1 a r C .1. .oning: A La .boratory Manual , Se* Edr Ção , Volumes 1 - 3, C o 1 d Spring Harb or Labor atory Press R Ç) o r 0 . Cr n e A. Kahn, 1996, i 1DN : rsol atron and St sqnen· Ess θ Γ11_'. i a ]. Technd i.ques f John Wiley & Sor - O / J. M Poial v Θ Γ\ ? P vx ' McGe :β/ J- Q Ο C) J .x i; , Γη Si tu Hyb r: idi zati on; Princl r) Ί (ti q Pra ct 1 ce; Oxf orc I University Press; M, u . Gait (Edlto r) , 011 gon n r-· j ρ 6 tido Synthe; sis: T- í Practi . C 3.S App. roach , IRL Press D, M. j. j liliey e J. E. Dahlberg, } OQ9 , Method; s of Er i z ymo DNA S-i- :.rucz urre P art A: S y Ώ t.'; aesls a? nd P hysj .cal An ci..]. v s .1 .s of ano. na of DNA Methods in Enzymoiogy, Academic Press. Cada um destes textos gerais é aqui incorporado por referência.

AU T 0 - RE PIJ 0AC AO COMPARTIMENTARIZADA denominou CSR. (ai potencial de ser catálise, assim c A invenção descreve uma nova tecnologia de seiecção, que se denominou CSR (auto-replicação compartimentarázada.) . Esta tem o de ser expandida num sistema de seiecção genérico para d para interacções macromoleculares.

Na sua forma mais simples, a CSR envolve a segregação de genes que codificam e dirigem a produção de polrmerases de ADN em compartimentos aquosos discretos, espacialmente separados, de uma emulsão água-em-óleo estável ao calor. Se forem 13 0 0 s de nucL l.eót idos e i pc viimerases replicam apí iniciadores de i S C·1 S o 0 u. id? p r ο ρ ο rei ο η a. d. ο s flanco adequac próρ rios ge n e s. reaparecem da mistura OP genes. Por biológicos, entre a 0 V ri Γ í r. i.n tes ma is activa (a ma is pr 0 W CJ 0 p- 1 o e a) lência", correlacionan do de s t e modo

Consequentemente, apenas genes que codificam polímerases activas são replicados, enquanto as variantes inactivas que não pociem copiar os seus genes c analogia com os sistemas diferentemente adaptadas, a directamente o núme: enzimático. de cópias pós-selecçâo com o processamento A. 0 SR não es tá 1 . imi O ad:3. a ρο I imerases uma vast :a varied ade de f r s n sforma ações en em funç; 3.0 da "ma Lquí n íZirí a da repl: icase". sei Θ C C1 0 na da uma eu z i ma que "alime nte" a p ve z repl ic a o seu t ger le o Poden a s e r r e a 11 z a o cooperat IV a ma i s c omp iicad os e m que sub str at os de replica s e s ou c onsome m inibic A s poi imeras ã Θ S ocu pam. i um pa pel cent gen orna, ransmis S cl O expr essão de inj pode ser aplicada a .ime.ra.se, que por sua varias ou proauzem .1 na manutenção do ^.^^mação genétrea. As polímerases estão também no centro da biologia moderna, possibilitando tecnologias essenciais, tais como rnutagénese, 0 ç a o de ρ o. Lime rase e: ormalmente LA t J_ J--L Z, OL O' CÍ quando são utilizada :eza não as ορtimi zou bibliotecas de ADNc, sequenciação e a r cadeia (PCR). Contudo, as polímerases sofrem frequentemente de sérios problema para realizar t.a.refas para as quais a na'

De facto, a. maioria dos avanços foi periférico, incluindo a utilização de polímerases de diferentes organismos, tampão

melhorado e sistemas aditivos assim como misturas de enzimas. A 14 CSR é um novo sistema de selecção idealmente adequado para o isolamento de polimerases "estilistas" para aplicações específicas. Muitas caracteristrcas da função da poiímerase estão abertas a. "melhoramento" (e. g, capacidade de

processamento, selecçao de substratos, etc.). Além disso, a CSR é uma ferramenta para estudar a função da polimerase, e. g. sondar regiões imutáveis, estudar componentes do repiissoma, etc. Além disso, a CSR pode ser utilizada para clonagem funcionai de polimerases por bombardeamento, drrectamente a partir de populações microbianas diversas, não cultiváveis. A CSR representa um novo princípio de selecçao de um repertório de polipéptidos. Abordagens anteriores caracterizaram vários métodos de "exposição" em que o fenótipo e genótipo (polipéptido e gene codificante) estão ligados como parte de um "pacote genético" contendo o gene codificante e expondo o polipéptido no "exterior". A selecção ocorre através de um passo de purificação por afinidade após o qual os clones sobreviventes são cultivados (amplificados) em células para outras rondas de selecção (com tendência resultante no crescimento de selecçoes distorcidas). Outras distorções resultam de diferenças nas eficiências de exposição entre diferentes polipéptidos.

Noutro conjunto de métodos, tanto o polipéptido como o(s) gene(s) codificante (s) são "empacotados" na célula. A selecção ocorre in vivo através do polipéptido modificando a célula de modo a adquirir um novo fenótipo, e. g. crescimento na presença de um antibiótico. Como a pressão de selecção é aplicada sobre as células completas, estas abordagens propiciam a produção de falsos positivos. Além disso, as estratégias de complementação in vivo estão limitadas as condições de selecção, e deste modo aos fenótipos seleccionáveis, não podem ser livremente 15 escolhidas e estão ainda restritas pelos limites da viabilidade do hospedeiro.

Na CSR, não existe ligação física (covalente ou não covaiente) entre polipéptido e gene codificante. Ma.is cópias de genes de sucesso são "multiplicadas" directamente e in vitro como parte do processo de selecção. A CSR é aplicável a um vasto espectro de polimerases de ADN e de ARN, concretamente a todos os polipéptidos (ou poiinucleótidos) envolvidos na replicaçâo ou expressão de genes. A CSR pode também ser aplicada a lí gases de ADN e de ARN' montando os seus genes a. partir de fragmentos oligonucleotidicos. CSR é o único sistema de selecção em que a taxa de sarnento de uma enzima está directamente ligada com o número de cópias pós-selecção do seu gene codificante.

Existe um grande interesse em polímeros de polinucleótido com bases alteradas, açúcares alterados ou mesmo químicas de estruturas. Contudo, a síntese de fase sólida pode apenas, normalmente, proporcionar polímeros relativamente curtos e as polimerases que ocorrem naturalmente incorporam fracamente, sem surpresas, a. maioria dos análogos. A CSR é idealmente adequada para a selecção de polimerases mais tolerantes a substratos não naturais, de modo a preparar polímeros de polinucleótido com novas propriedades para química, biologia e nanotecnologia (e. g. fios de ADN).

Finalmente, a emulsão estável ao calor desenvolvida para CSR possui as suas próprias aplicações. Com >10* de 16 o 0 Γ: β S á COi ostra pa fC 1“. .1 .T.' d.0 cé. lulas cLp iícações de PCR ! microcompartimentos/rnL, a PCR de emulsão (ePCR) oferece a possibilidade de PCR paralelo em multiplexo numa escala sem precedentes com potenciais aplicações desde a análise de ligação â construção de um repertório genómico directamente a únicas, Pode também ter aplicações para le diagnóstico em larga escala tal como "PCR fitai" (Vogelstein & Kinzler (1999), PNAS, 96,9236-9241),

Comp art 1 menta. lizando a. s rec equi librar a competição ent re são amplifica .dos em PCR mui ti} leva a uma dis tribuiç ão me? ampl zficação. Ά ePCR pode, alte "Γ Γ] cl T.". .1 V cl ao DOP-PC R no rei a cionada.s) ou ser de facto meto doiogias relacionada s) mal, 0 sistem a de selecç :So de auto -replícaç ão num s.i . 3 Γ. Θ Tílcl base ia-se no facto de que r . o e s i η o r v z o u a r s ρ o de z a .mio e m iferentes segmentos de genes que 3X0 ou com iniciação aleatória e s tendenciosa dos produtos de deste modo, proporcionar uma aenoma total (e metodolooias ip arti me n t a 11 z a d o . A. r n v e n ç: a o cases activas são capazes de replicar ácidos nucieicos (em particular as suais sequências eodificantes), enquanto as replicases inactivas não o fazem. Assim, nos métodos da invenção, proporciona-se um sistema compartimentalizado em que uma replicase num compartimento é substancialmente incapaz de actuar em qualquer outro molde que não sejam os moldes que estão nesse compartimento; em particular, não podem actuar para replicar um molde em qualquer outro compartimento. Em formas de realização altamente preferidas, o ácido nucleico molde no compartimento codifica a replicase. Assim, a replicase não pode replicar qualquer outro para além da sua sequência codificante; a replicase está deste modo "ligada" à sua sequência codificante. Como um resultado, numa formas de realização largamente preferida da invenção, a 17 concentração final da sequência codificante (1. e, o número de cópias) é dependente da actividade da enzima por ele codificada.

Este sistema de selecção aplicado à seiecção de replicases possuí a vantagem de ligar o processamento catalítico (kr^/íÇã ao número de cópias pós-selecção do gene que codifica o c a t a I ia ; a 0' O X * id S sim, a cc topar timental. i z ci c; a o ore: cece a possi 0 .1 .1.1 (ΙίΚΙθ 06 liga r o genót. ripo e o ter i.6 t ipo de uim a enzima. repl 1 f μ i. s e , como d e s c r i t o com m; ar s i detalhe a seaui • > a a ravΘ s de uma a :eacç :ão enzim aei c a a c ο ρ I. a ci a env oivendo a repl: Lca O cí. 0 do gene ou dc s ge nes da(s) enzrn .ia í s ) con ro um i dos seu s passo 0 * Os -.0. C"i .nvenção utr . 1. izam, '30 ITf.Oí -·! O v erendo, bibliotecas de ácidos nucleicos, cuja natureza e construção será explicada em maior detalhe a seguir. Ά biblioteca de ácidos nucleicos compreende uma mistura de diferentes ácidos nucleicos, (a entidade a. ser seleecíonada) . Assim, por exemplo, como utilizado para seleccionar replicases, os métodos da. invenção empregam uma biblioteca ou mistura de ácidos nucleicos possuindo membros que codificam uma replicai.se ou variantes da replicase. Cada urna das entidades codificadas pelos vários membros da biblioteca terá propriedades diferentes, e. g.r tolerância variável ao calor ou à presença de pequenas moléculas inibidoras, ou tolerância para desempareihamento de pares de bases (como explicado com mais detalhe a seguir). A população de variantes de ácido nuclerco, proporciona, deste modo um material gg par ti aa pcira ai serecçaio, e e, de murtas maneiras, anaroga a variação numa população natural de organismos causadai por mutação.

De acordo com esta invenção, os diferentes membros de uma biblioteca ou mistura de ácidos nucleicos são separados ou 18 compartimentai!zados em muitos compartimentos ou microcápsulas. Em formas de realização preferidas, cada compartimento contém substancialmente um ácido nucieico membro da mistura (em ama ou várias cópia.s) , Adícionalmente, o compartimento também compreende o polipéptido ou polinucleótido (numa, ou de modo preferido, várias cópias) codificado por esse ácido nucieico membro (quer seja a replicase, um polipéptido, etc., como a seguir discutido). A natureza destes compartimentos é de modo que não ocorre intercâmbio, mínimo ou substancial, de macromoléculas (tais como ácidos nucleicos e polipéptidos) entre diferentes compartimentos. Como explicado a seguir em mais detalhe, formas de realização iargamente preferidas da invenção utiliza compartimentos aquosos com emulsões água-em-óleo. Como explicado acima, qualquer actrvidade de replicase presente no compartimento (seja exibida pela replicase, modificada por um polipéptido ou exibido pelo polipéptido que actua em conjunto com outro polipéptido) pode apenas actuar no molde que está. no compa.rt imento ,

As condições nos compartimentos podem variar de modo a seleecíonar polipéptidos activos sob estas condições. Por exemplo, quando as replicases são seleccionadas, os compartimentos podem possuir uma temperatura aumentada para seleecíonar replicases com elevada estabilidade térmica. Além disso, utilizando os métodos de selecção aqui descritos em proteínas de fusão compreendendo a replicase termoestável e a proteina de interesse permitirá a selecção de proteínas termicamente estáveis. É desejável um método para a incorporação de estabilidade térmica em proteínas, de outro modo iábeis, de importância comerciai com vista à produção e distribuição em larga escala. 19

Foi descrito um sistema repórter para melhorar a organização de proteínas por expressão de proteínas em fusão com a proteína verde fluorescente (GFP) (Waldo et aí. (1999), Nat Biotechnol 17: 691-695). A função da última está relacionada com a organização da proteína, de fusão produzida influenciando a organização e/ou funcionalidade da GFP, possibilitando a evolução directa de variantes com organização e expressão melhoradas. De acordo com este aspecto da invenção, as proteínas são fundidas com uma replicase te.rmoestáve.1 (ou um polipéptido que promove a actividade de replicase) e a seiecção de fusões activas em emulsão como um método para obter proteínas com terrrioestabi.lida.de e/ou solubilidade aumentada. Espera-se que as variantes instáveis do parceiro de fusão se agreguem e precipitem antes de ou durante os ciclos térmicos, comprometendo deste modo a actividade de replicase nos respectivos compartimentos. As fusões viáveis permitirão a auto-amplificação em emulsão, com a taxa de processamento ligada à estabilidade do parceiro de fusão.

Numa abordagem relacionada, uma actividade de chaperonina nova ou aumentada pode ser desencadeada por co-expressão de uma biblioteca de chaperonas em conjunto com uma proteína de fusão poiimerase-polipéptido, em que a unidade de proteína não se organiza (sob as condições de seiecção) . A repiicação do (s) gene (s) que codificam a chaperonina podem apenas prosseguir depois da actividade de chaperonina ter capturado a actividade de polimerase na proteína de fusão poiimerase-polipéptido. A termoestabilidade de uma enzima, pode ser medida por meios convencionais conhecidos na técnica. Por exemplo, a actividade catalítica da enzima nativa pode ser ensaiada a uma certa temperatura como um ponto de referência. Os ensaios enzímátieos 20 são bem conhecidos na técnica, e os ensaros padrão foram estabelecidos ao longo dos anos. Por exemplo, a incorporação de nucleótídos por uma polirnerase é medida, por exemplo, peia utilíza.ção de dNTPs marcados radioactivamente, tais como dATP e ensaios de ligação a filtro conhecidos na técnica, A enzima cuja termoestabilidade vai ser ensaiada é pré-incubada a uma temperatura elevada e depois a sua actívidade retida (por exemplo, actividade de polirnerase no caso de polimerases) é medida a uma temperatura óptima inferior, e comparada com a referência. No caso da polirnerase Taq, a temperatura elevada é 97,5 °C; a temperatura óptima é 72 °C, A termoestabilidade pode ser expressa na. forma de semi-vida a. uma. temperatura elevada (i. e, tempo de incubação a urna temperatura superior acima da qual a. polirnerase perde 50% da. sua activrdade) , Por exemplo, as replicases termoestáveis, proteínas ou polipéptidos de fusão seleccionados pela invenção podem ter uma semi-vida que é 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X ou mais do que a enzima nativa.

De um modo muito preferido, as replicases termoestáveis etc., possuem uma semi-vida que é 11X ou mais quando comparada desta forma. De modo preferido, as polimerases seleccionadas são pré-incubadas a 95 °C ou mais, 97,5 °C ou mais, 100 °C ou mais, 105 °C ou mais, ou 110 °C ou. mais. Assim, numa forma de realização largamente preferida da invenção, proporcionam-se polimerases com termoestabilidade aumentada que apresenta uma semi-vida a 97,5 °C que é 11X ou ma. is do que a correspondente enzima do tipo selvagem (nativa). A resistência a um agente inibidor, tal como a heparina no caso de polimerases, pode também ser ensacada e medida como acima, A resistência, à inibição pode ser expressa em termos da concentração do factor inibidor. Por exemplo, nas formas de realização preferida da invenção, proporcionam-se polimerases 21 resistentes a heparina que são activas até uma concentração de heparina entre 0,083 unidades/pL a 0,33 unidades/pL. Para comparação, os ensaios indicam que a concentração de heparina que inibe a polímerase Taq nativa (do tipo selvagem) está na região entre 0, 0005 a. 0, 0026 unidades/pL. A resistência é convenientemente expressa em termos da concentração de inibidor, que se verifica inibir a actividade da replicase seleccionada, proteína ou polipéptido de fusão, comparada com a concentração, que se verifica inibir a enzima na tiva. riS it UTL t as replicases re sistentes, protí sinas de fusão, ou po iipép ordo se.; eccionados pela invenção podem P o s s rir 10X, 2 0 X, 3 0 X, 4 0 X, 50X, ό X, :X, o U X, 9 0X, 10 0X, 110X, 12 0X , 130X, 14 0 X, 15 ox, 160X, : . 7 0 X, 18 0 X, 19f ' X f 2 0 0X, ou ma. is resistência comparada com a enzima nativa. De modo mais preferido, as replicases resistentes etc. possuem 130x ou mais vezes resistência. aumentada quando comparada desta forma. As repli <—< ri o O O CÍ C' tf b seleccionadas etc. pos suem, de modo preferido, 50% ou mais, r\ o í’-. \J '5 ou mais, 7 0% ou mais, 8 0% c ru mais, 90% ou mais, ou ainda 10 0 % de actividade à concen traçao do factor inibidor. Além cii s s o , os COÍflp dl U- L O th podem c onter auantidades de um agente inibi dor tal como heparina, para seleccionar replicases possuindo actividade sob tais condições.

Como explicado abaixo, os métodos da invenção podem ser utilizados para seleccionar um par de polipéptidos que interagem, e as condições nos compartimentos podem ser alteradas para escolher polipéptidos capazes de actuar nestas condições (por exemplo, sal elevado, ou temperatura elevada, etc.). Os métodos da invenção também podem ser utilizados para seleccionar a montagem, estabilidade e/ou solubilidade de um polipéptido 22 1 e e v a C; o , s e r utiliza por exernpl plic ase ê Arca c;ão pe temperatura elevada, agentes caotrópicos, etc.). odo de seiecção da pre seionar várias act i vic setividade da polrme ^ -u, ertuos; S qu. a r s 3. oazes <: para a activiclade cia polimerase. Aqui, a polimerase, e a reacção catalítica é a pclimerase do seu próprio gene. Assim, polimerases ou polimerases que são inactivas nas condições sob reacção é realizada (as condições de seiecção) são ancapaze: amplificar os seus próprios genes. De modo semelhante, as polimerases que são menos activas irão replicar ma is lentamente as suas sequências codificantes nos seus compartimentos. Consequentemente, estes genes estarão sub-representados, ou irão mesmo desaparecer do conjunto de genes.

As polimerases activas, por outro lado, são capazes de replicar os seus próprios genes, e o número de cópias resultante desses genes será aumentado. Numa forma de realização preferida da invenção, o número de cópias de um gene no conjunto irá ter urna relaçã .o dírecta com cX cX C1. .ividade do polipéptrdo codificado nas condicões sob as quai s a r eacção é .C Θ 3 .lizad.a, Nesta forma de 2Γ Θ cl 1 J- Z cl Ç ã O preferida, a poli merase mais activa será a mais representa· da no conjunto final (r . e,, '.u ip eu número ae cópias no conjunto será o mas. s eleva· do). go mo será. entendido, isto permitirá, a clonagem fácil de polimerases activas em relação às inactivas. 0 método da invenção deste modo é capaz de ligar directarnente a taxa de processamento da enzima ao número de cópias resultante do gene que a codifica.

Como um exemple polimerases activas o método pode ser aplicado ao isolamento de {polimerases de ADN-, ARN- e transcriptases 23 0 Τ' s r is) de organisr ao s te rrnofilrcos. Resu: nidamente, uma imei :ase termoestável é exprt issa intracelularim snte em o td i ia i d ir ter: .anas e estas são compart imentalizadas (e. g. numa e. muisão água-óleo) em tampão apropriado, em conjunto com. quantidades apropriadas dos quatro dNTPs e olrgom .cleó tidos qi 10 iniciam em qualquer c ias extremidades do gene da poiime] !_ Cl se ou nas sequências do plasmídeo que flanqueiam o gene da h' U. iiimerase. A polimerase e o seu gene S cX 0 i . ibertados das células 0 T través de um passo de temperatura que 1.1 S 0. 3. S C Θ -i. U J-. 3. S 0 destrói as actividades enzimáticas associadas com a célula hospedeira. polímerases dos organismos mesofilicos (ou polimerases menos termoestáveis) podem ser expressas de um modo análogo, excepto que a lise celular deve proceder à temperatura ambiente (e. ou 0 0.0' 3 V Θ S d. a expressão de uma proteíi : a. J. .r t j. c a [ θ * g, c l.erivada. de bacterió f ag os líticos, através de lise mediada por detergente (e. g, Bug busterifc, disponivel comi srcialmente) ou a lise pode proceder a tempera. tara. elevada na presença de uni 0cen te estabí1i z.ação da p oi imer ase (e. g. concentra çoes elevadas d.0 prolina (ver exempi o 2 7) no caso de Klenow ou treaiose no c a s o de RT) . Nesses eas o s, a actividade de fundo da polimerase da estirpe hospedeira. pode interferir c :om as selecções e pode 8 0.0' preferível utilizar estirpes mutantes (e. g. polA”) . o s gene s da poiime i 0' 8. S Θ (seja c orno fragmentos li neares) P odem ser como acima e a. ρ c. ,xl. ime rase ser expreí xsa. .2 n tos utiliza: udo tr adução de transcrição in por um pas so de tempera' tura ρ ara de struir rs a s s o cm. adt is com o extra. C O O cl tradu. ç a o in oe organi s mos me s o f 1. i i c os (ou polim era. s e s podem ser expies isas in si tu de uir i m o do de modo a evita r activ idades enzim átr cas

Aiternativamente, plasmldeos ou compartimentalizados sítu nos compartímen: vitro (ivt), seguida actividades enzimátic; vitro, As polimerases menos termoestáveis) análogo, excepto que, 24

associa .d. as com O extracto de tradução in vitrOf pode ser preferi do ί rtili zar í o extracto ! oe t. r a du ç ci o reconstituído a partir oe cor iponentes s-1 a - rifícados definidos, como o sistema PIJRE (Shimízu et 3.1. (2001) Nat. Biotech,, 19: 751) . A termociclagem por PCR conduz então à amplificação dos genes da polímerase pelos polipéotidos que eles codificam, i. e. apenas os genes que codificar::. por imerases activas, ou polimerases activas nas condições escolhidas serão amplificados. Além disso, o número de cópias de um gene X da polimerase após auto-amplificação será directamente proporcional à actividade catalítica da polimerase X que ele codifica, (ver Figuras IA e 1B t . proprie dades desejada métodos d.esta invenção genes da Oolimeras ccionada ou aleatória)

Variando as condições de seiecçâo no compartimento, a: polimerases ou outras replicases c podem ser se.lecc.ionad.as utilizando Assim, expondo repertórios de 0' a auto-amplificação e alterando as condições sob as quais a auto ser, o siste :ma. pc )de ser u t i 1. iz . o '0 O i para. ação c 1θ ρ oiime: rases com ρ ropr.i edade ou nov as. I h 3 G cL 3 proprr edades aume nt aaa, jstabil: idade aum Θ π t, aaa ? capa .cidade d: p prec -J- S cd. O aumer rtada ( melhor capa cida.d.: ;ão aum .entad 3. 0.0 substre itos de sf avo ráver isolamento e modificacl alteradas, aument; tais como 5- como nu c 1. e ó 399, 7 0 4 - 7 0 8) Hep ar ina em processa me n to a umen t a d a, de revisão) , incorpo (e. g., ribonucleótidos, bases gerais com corante modificado, Ltroindoie, ou outros substratos não usuais, tais dos de pireno (Matray & Kool (1999), Nature (Fig. 3) ou resistência a inibi dores (e. g. nostras clínicas). Propriedades novas podem ser a .ncorporação de substratos não naturais (e. g, ribonucleótidos) , 25 desvio de leitura dos sítios lesados (e, g, sítios abásicos (Paz-Eiizur T. et ai, (1997) Biochemistry 36, 1766), dímeros de timídina (Wood R. '1999) Na t ure 399, 639), bases de hidantoina (Duarte 1 v et aí „ (j_ 9 9 9) Nucle. ic Acíds Res. 27, 496) e possi velrne nte mesmo novas químicas (e, g , novas estruturas, tais como PNA ( Tm i. θ J. s θ π x 'Έ Ca r r Opin B: iotecn moí, 1 999; 10(1): 71-5) ou sulfona (Benner SA et ai. Pure Appl Chem. 1998 Feb; 70(2): 263-6) ou químicas ae açuc ;a.r aiter adas (A. Escbeumoser, Science 284, 2118- 24 (1999) ) , Ta.rn.bi érn podem s e r u tilizados para. isolar ou envolver factores que a .umentam ou modificam a função da polímerase , tais como factore; ΐ de processamento (como tiorredoxi na no cas o de polímerase de A. DN de T7 (Doublie S. et ai. (1998) Nature 391, 2 51)) .

Contudo, também podem ser seleccionados de acordo com esta venção outras enzimas para além de replicase ;s, tais como lomeras es, helicases et ,c. Assim, a teiornerase é expressa in tu (em c omp a r tu. me n tos) cl ΤΓ. .T 3 VΘ S d-Θ } por exemplo ·, tradução in trc em conj unte > com Tei omerase-ARN (quer adicioi nado ou também transcrito in sita; e, g. Bachand et ai., (2000) RNA 6: 778-

Os compartimentos também contêm Pol Taq e dNTPs e iniciadores específicos de telómero. A temperatura baixa a Tag é ínactiva, mas a telornera.se activa irá fixar os telómeros ao seu próprio gene codificante (urn fragmento de ADN linear com extremidades 3. p I? Op ΙΓ 5.0-3.8 ) . Após a reac :ção da telomerase, cl terrnociclagem apenas ampl ifíca os ge nes que codificam genes de telomerase ac tiva. Pode ε ;er introduz ida du.versídade no gene ti C. telomerase oi . ARN (ou ambos) e pode ser direccionada ou aleatória. Como aplicado à selecçâo de helicases, o métodt selecção é essencialmente o mesmo que o descrito para 26 telomerases, rr í.cL Ό1 3. helicase é utiliza da para desemaranhar as cadeias, mais c io que a desnaturação peio calor.

Os mét o dos i desta invenção também podem ser urilizados para seieccionar enzi . ma s de reparação de A.DN ou p o J. u. m Θ r a s 0 s da translesão, tais como Pol IV e Pol V de E. coli, 1XI0 3 t td 3 '3 cl S O 3 f cl lesão é introduzida nos iniciadores (química direccionada) ou aleatória através de tratamento com mutagénio (e. g. UV, químicos mutagénicos, etc.)· Isto permite a selecção de enzimas capazes de reparar iniciadores necessários para replicação ou a sequência do seu próprio gene (recuperação de informação) ou, resultando em "reparases" melhoradas pa.ra terapia géniea, etc.

Os métodos desta invenção também podem ser utilizados nas suas vária capazes de, da replicas seieccionar para selecç catalítico formas de realização para seieccionar agentes directamente ou indírectamente, modular a actividade Adicionaimente, a invenção pode ser utilizada para um. par de polipéptidos capazes de interactuar, ou ao de ácidos nucleicos catalíticos, tais como ARN (ribozimas) . Estais e outras formas de realização adas em maior detalhe abaixo.

ENZIMAS DE PROCESSAMENTO DE ACIDO NUCLEICC

Como aqui referido, um a enz.i.rna de proc essamento eico é qualquer enzima, que pode ser uma enzima pr enzima de ácido nucleico , que 0 c apaz modificar. (tal como em pelo menos um nucleótido) , amplifrcar ou, de outro modo, influenciar ácidos nucleicos, tais como para tornar o ácido nucleico seleccionável por amplificação de acordo com a presente invenção. Essas enzimas possuem, deste modo, uma 27 aroplificação ΘΠ1 exemplo, actividade que result< estabí rizaçã o, aesest : ab i i i zaçâo, t libridação ou desna tur replic cL C cl O f protecção 0 \X c lespr otecc pão de ácidos nucie: LCOf qualquer oiu ura acuivu. d a de com I) d. S 0 na quar urn áci do nu c pode s 0 Γ selecciona r-1 r-> P 0 Γ a.mp 1 ificação. Exemplos in heiica O 0 ^ / telomerase S, 0 ΐ CJ cl S < 5 3 f recombinases, rnteg C cL O í es replicases. As replicases são preferidas ou

REPLICASE/REPLICAÇÃC

Como aqui utilizado, o termo "replicação" refere-se à cópia de unia sequência de ácido nucleico dependente do molde. Os ácidos nucleicos são discutidos e exemplificados abaixo. Em gerai, o produto da replicação é 0 da mesma espécie, ou de uma esp incluídas a replica ção de ADN para ADN para produzir A RN, 3. ΓΘΡ1 1 caçãi uma espécie diferente. Assim, estão .icação de ARN para produzir ARN. A "replicação", deste modo, pretende compreender processos, tais como replicação de ADN, poiimerização, ligação de oligonucleótídos ou polinucleótidos (e. g. 5' trifosfatos de tri-nucleótido (tripleto)) para formar sequências mais longas, transcrição, transcrição reversa, etc.

0 ter ]T; (A 'Λ replicase " pret .0.000 s i g n r f ic v v ; uma enzin :ia pc ) s s u ind.o act i vi /d -u* H íti v.-i ca AaTC· cat alítica, G1J e é capaz d0 uni r b .1 .ocos de c ο η ε itru çao, nu cl 0 (S tido ο r em conji unto para formar .d ^ quências de cL eido nu cl eí co. Esse s blocos de CG mstruç ‘ 3.0 de nu cl eótido i nclu .em. mas n â o 0 £ 5tão 1 im: n u c I e d s i d. o / trr: fosf. atos de nuc.l .eós ido, deso x i. nu c 1 e 6 s i. dos, dest u x i t r i tOS.ÍBL< o o. d.0 nu cl eósido, mu c J ..eót Id.OS (compreendendo uma base contendo azoto, tais como adenrna, guanina, citosina, uracilo, timina, etc., um açúcar de 28 5-carJbonos e um ou ma.is grupos fosfato) , trifosfatos de nucleótido, desoxinucleótidos tais como desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxicitidina, desoxiuridina, desoxiguanidina, trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTPs), e análogos destes sintéticos ou artificiais. Os blocos de construção também incluem oligómeros ou polímeros de qualquer um dos acima, por exemplo, trinueieótidos (tripletos), oiigonucleótidos e pol inucl.eót idos.

Assim, uma replicase pode estender uma sequência de ácido nucleico pré-existente (iniciador) através da incorporação de nucleótidos ou desoxinucleótidos. Essa act.ivida.de é conhecida na técnica corno "polimerização", e as enzimas que a realizam, são conhecidas como "polimerases". Um exemplo de uma. tal replicase poiimerase é a poiimerase de ADN, que é capaz de replicar ADN. 0 iniciador pode ser o mesmo, quimicamente, ou diferente da sequência estendida (por exemplo, a poiimerase de ADN de mamífero é conhecida por estender uma sequência de ADN a partir de um iniciador de ARN) . 0 termo replicase também inclui as enzimas que ligam em conjunto sequências de ácido nucleico, sejam polímeros ou oligómeros para formar sequências de ácido nucleico mais longas. Uma tal actividade é exibida pelas lígases, que ligam fragmentos de ADN ou ARN. A replicase pode consistir inteiramente na. sequência da replicase, ou pode compreender uma sequência de replicase ligada a um poripéptido heterólogo ou outra molécula, tal como um agente , por meios químicos, ou na forma de uma proteína de f u s a o, ou ser montada a partir de duas ou ma i. s partes constituintes. 29

De um modo preferido, a replicase de acordo com a invenção é a polimerase de ADN, polimerase de ARN, transcriptase reversa, ligase de ADN, ou lígase de ARN.

De um modo preferido, a replicase é uma. replicase termoestável. Uma replicase "termoestável", como aqui utilizado, é uma replicase, que demonstra a resistência significativa a desnaturação térmica a temperaturas elevadas, tipicamente acima da temperatura corporal (37 °C) , De um modo preferido, uma temperatura tal está no intervalo de 42 °C a 160 °C, de um modo mais preferido, entre 60 e 100 °C, de um modo muito preferido, acima de 90 °C. Comparada com uma replicase não termoestável, a replicase termoestável apresenta urna semi-vida significativamente aumentada (tempo de incubação a temperatura elevada que resulta numa perda de actívidade de 50%). De um modo pre f er ido , a rep] Lic ase t errm sestável re itém 30% ou mais da . sn cX C t i v i dade apos n a cri bação a t remperatura elev cX d cl. f de um modo ma i. pre A θ -T.’ .ido, 3 0%, 5 U % ; 60%, 7 0: % ou 80% or r ma.i s d. a sua. act i vi· d.a cie De um mo a o aind a mais pre ferido, a repl O cL e r; atém 80 % d. act iví dade, . De ram mc .do mu ito preferido, a ao tivi dade retida é d' 9 0 % l '•-A '3- o u ma i ib / mesrn o 1 „00%. Rep 1 i .case; i Ο Γ. .ermoest y.\ γ o t exibiriam pouca ou nenhuma retenção de actívidade após incubações semelhantes a temperatura elevada.

POLIMERASE

Um exempio da repricase i § cL p C iirmerase de ADN, As olimera ises de ADN são enz íma.s intracelulares que aturaiiT rente, e sao utilizadas ; por uma célula para repl enzimas ocorrem car uma ie para Enzimas cadeia de ácido nucieico utilizando uma molécula mc produzir uma cadeia de ácido nucieico complementar. 30 possuindo actividade de poi.iiriera.se de ADN catalizam a formação de uma ponte entre o grupo 3' hidroxilo na extremidade crescente de um iniciador de ácido nucleico e o grupo 5f fosfato de um trifosfato de nucleótido. Estes trifosfatos de nucleótido são norma.lm.ente seleccionados a. partir de trifosfato de desoxiadenosina (A) , trifosfato de desoxitimidina (T), trifosfato de desoxicítidina ÍC) e trifosfato de desoxiguanosina (G) . Contudo, as polimerases de ADN podem incorporar versões modificadas ou alteradas desses nucleótidos. A ordem em que os nucleótidos são adicionados é ditada por empareihamento de base a uma cadeia de ADN molde; esse empareihamento de bases é conseguido através de ligação de hidrogénio "canónica" (liga.ção de hidrogénio entre os nucleótidos A e T e os nucleótidos G e C de cadeias de ADN opostas), embora seja conhecida a técnica empareihamento não canónico, tal como empareihamento de bases G:U. Ver e. g,, Adams et al., The Biochemistry of the Nucleico Acids 14-32 (11a ed, 1992) . A utilização de enzimas in vitro possuindo actividade de polímerase de ADN, nos anos recentes, tem-se tornado mais comum numa variedade de aplicações bioquímicas, incluindo síntese de ADNc e reacçoes de sequenciação de ADN (ver Sambrook et al., (2a ed, Cold Spríng Harbor Laboratory Press, 1989) e amplificação de ácidos nucleicos através de métodos, tais como a reacção de polimerase em cadeia (PCR) (Muliis et al., Pat. U.S. N°s. 4683195, 4683202, e 4800159) e métodos de amplificação mediados pela transcrição de ARN (e. g., Kacian et al., Publicação PCT N°. WO91/01384). Métodos, tais como a PCR utilizam ciclos de extensão de iniciador através da. utilização de uma polimerase de actividade de ADN, seguida por desnaturação térmica, do á.cido nucleico de cadeia dupla resultante, de modo a proporcionar nm novo molde para uma outra ronda de empareihamento de iniciador e extensão. 31

Porque as temperaturas elevadas necessárias para a desnaturação da cadeia resultam nas inactivações irreversíveis de muitas polimerases de ADN, a descoberta e utilização de polimerases de ADIS! capazes de permanecer acurvas a. temperaturas acima de cerca de 37 °C a 42 ’5C (enzimas termoestáveis de polimerase de A.DN) proporciona uma vantagem no custo e eficiência do trabalho. As polimerases de ADN termoestáveis foram descobertas numa variedade de organismos termofílicos, incluindo, mas não estando limitados a Thermus aquaticus, Tkermus thermophi1us, e espécies dos géneros Bacillus, Thermococcus, Sulfolobus, Pyrococcus. As polimerases de ADN podem ser purificadas directamente a partir destes organismos termofílicos. Contudo, podem ser obtidos aumentos substanciais no rendimento da polimerase de ADN clonando primeiro o gene que codifica a enzima num vector de expressão de multicópias através de métodos da tecnologia do ADN recombinante, inserindo o vector numa estirpe de célula hospedeira capaz de expressar a enzima, cultivando as células hospedeiras contendo o vector, depois extraindo a polimerase de ADN de uma estirpe da célula hospedeira que expressou a enzima.

As pol.imera.ses de ADN bacterianas que foram caracteri zadas até à. data possuem certos padrões de semelhanças e diferenças que levaram alguns autores a dividir estas enzimas em dois grupos: aquelas cujos genes contêm intrões/inteínas (polimerases de ADN da Classe B) , e aquelas cujos genes da. polimerase de ADN são grosseiramente semelhantes aos da polimerase de ADN I de E. coli e não contêm intrões (polimerases de ADN da Classe A) . Várias polimerases de ADN de Classe A e Classe B termoestáveis, derivadas de organismos termofílicos foram clonadas e expressas. Entre as enzimas de classe A: Lawyer, et al., J. Biol. Chem. 264: 6427-6437 (1989) e Gelfund et al, Pat. 32 79352 íy Γ’θ J. α t ó. Ti l cl ADN terrnoestável Acus {Tsq) . Lawy; 2: 275-287 (1993 n.fi, Ν° , ου/9302, relatam a clonagem e expressão cie um; al derivada de

Thermus aquaticus (dag) . Lawyer et ai., em PCR Methods and Applications, 2: 275-287 (1993), e Barnes, Publicação PCT No. WO92/06188 (1992), revelam a clonagem e expressão de versões truncadas da mesma polimerase de ADN, enquanto que Suliivan, Publicação EPO N°. 0482714A1 (1992), relata a clonagem de uma versão mutada da polimerase de ADN dag. Asakura et al., J. 'ermen t. fíl cenas í Jap Aio) , 74: 265-269 (1993) relataram a lonagem ca. expressão ΌiTi Ί ima polimerase de ADN de Thermus thermophiius. Geifund et al. , Publicação PCT N°. WG92/06202 (1992), revelaram urna polimerase de ADN terrnoestável purificada de Tkermosipho africanas. Uma polimerase de ADN terrnoestável de Thermus flavas é relatada por Akhmetzjanov e Vakhitov, Nucleic Acids Res, , 20: 5839 (1992). Uernori et ai., J. Biochem, 113: 401-410 (1993) e Publicação EPO No. 0517418A2 (1992) relataram a clonagem e expressão de uma polimerase de ADN da bactéria termofílica Bacillus caldotenax. Ishino et alPedido de Patente Japonesa N°. HEI 4 [1992]—131400 (data de publicação 19 de Kov. , 1993) relataram a clonagem de uma polimerase de ADN de

Ba C r í .1 u S S i -.earothermophi 1 us. Entr; a as enzimas α ei 11 cl s >it e B í Uma po 1imerase de ADN termoest á ve 1 recombinante de Thermoa DCCUS 1 i toralís é relatada por Comb et ai. , Pui: ilrcação EPO No . 04 5543 A 0 (1991), omb ο t- e 1»f Pu! alie cl C cl O EPO N ° . 054792 0A2 (1 9 9 3) ? 0 Perler et Al ]_ n ^ . r rio « Na ti. Acad S( Ji , (USA), 89: 3 9 7 7-5 58 (1 992) . Um. 3 P O. 1imerase de ADN termo Θ s t ei v e 1 cl oriada •d e D u V- aja US _ i _ _c _ ,C' A ~L A u- Cl tar 1US é revela Cl cl em Pisan i e t d ~L * f 1\> uOi. eic Ac i CÍS Re 20: 2 7 11- 2716 (1992) . e na Pi ibirca çâo PC !T W093/2 5 691 d 993) V A enzima. te i :moes cavei ae Pi roec >CCuS furi ou c- 0 reve.1. Cl ti C. em Ue: mo: Γ1 et al v f Nu cl leic A.ci( -;/<q Res ., 21 : 2 5 °> ~ -265 (19 9 3) , en Guante O ue uma DOÍ Limerase de 7- iDN rec ombrna mte ca. derivada 0iTi 33

Firococcus sp. como revelado em Comb et ai., Publicação EPO M°, 0547359A1 (1993).

Muitas pol.irnera.ses de ADISÍ termoestáveis possuem actividad.es adicionais a uma actividade de polimerase de ADN; estas podem incluir uma actividade de exonuclease 5' -3' e/ou uma actividade de exonuclease 3'-5'. As actividades de exonucleases 5' - 3' e 3'-5' são bem conhecidas dos especialistas na técnica. A actividade de exonuclease 3'-5' melhora a precisão da cadeia sintetizada de novo removendo as bases incorrectas que podem ter sido incorporadas; as polimerases de ADN em que essa actividade é baixa ou está ausente, incluindo, relatadamente, pol.irnera.se de ADN Taq, {ver Lawyer et al., J Biol Chern. 264; 6427-6437) , possuem taxas de erro elevadas na incorporação de residuos de nucleótido na cadeia de extensão do iniciador. Em aplicações tais como processos de amplificação de ácido nueieieo, em que a replica.ção de ADN é frequentemente geométrica em relação ao numero de ciclos de extensão do iniciador, esses erros podem conduzir a problemas de artefacto sérios, tais como heterogeneidade de sequência do produto de amplificação (ampiicão) de ácido nucleico. Assim, uma actividade de exonuclease 3'-5' é uma característica desejada de uma polimerase de ADN termoestável utilizada para esses objectivos.

Por contraste, a actividade de exonuclease 5'-3' frequentemente presente nas enzimas de polimerase de ADN é frequentemente indesejável numa aplicação particular, uma vez que pode digerir ácidos nucleicos, incluindo iniciadores, que possuem uma extremd.dade 5' não protegida. Assim, uma polimerase de ADN termoestável com uma. actividade de exonuclease 5f-3f atenuada, ou em que essa actividade está ausente, é também uma caracteristica desejada de uma enzimaL para aplicações 34 bioquímicas - Foram descritas várias enzimas de poiimerase de ADN nas quais foi introduzida uma modificação numa poiimerase de ADN, que realiza este objectivo. Por exemplo, o fragmento de Klenow da poiimerase de ADN I de Eu cali pode ser produzida como um fragmento proteolítico da boloenzima em que o domínio da proteína que controlo a actividade de exonuclease 5F-3' foi removida. 0 fragmento de Klenow ainda retém a actividade de poiimerase e a actividade de exonuclease 3'-5', Barn.es, supra, e Gelfund et al., Pat. U.S. N°. 5079352 produziram polimerases de ADN Taq recombinantes defrcientes em exonuclease 5'-3' . Ishino et al.f Publicação EPO N° . 05Í74Í8A2, produziram uma poiimerase de ADN deficiente em exonuclease 5'-3' derivada de Bacillus caldotenax. Por outro lado, polimerases sem o domínio de exonuclease 5'-3' redu.zira.rn frequentemente a capacidade de processamento.

LIGA.SE São geradas quebras e intervalos das cadeias de ADN transientemente durante a replicação, reparação e recombinação. Em núcleos de células de mamíferos, a reliçação dessas quebras de cadeia depende de várias enzimas polimerases de ADN e ligase de ADN diferentes. O mecanismo para ligar as interrupções da cadeia de ADN pelas enzimas de ligase de ADN tem sido largamente descrito. A reacção é iniciada pela formação de um. complexo covaiente enzima-adenilato. As enzimas de ligase de ADN de mamífero e virais empregam ATP como cofactor, enquanto que as enzimas ligase de ADN bacterianas utilizam NAD para gerar o grupo adenililo. No caso de ligases que utilizam ATP, o ATP é clivado em AMP e pirofosfato com o resíduo adenililo ligado por uma ligação de fosforamidato ao grupo ε-amino de um resíduo de 35 i isina específico no sítio activc ) da. proteína (Gumport, 1—I PC /- N -A- -*l ! fct L. a -L. + f PNAS, 68: 2559-63 i ;i97i) ) . 0 resíduo c l.e AMP re a c ir. .i. v a. d o H O Írmediário ] _í g a s e de ADN-a deni lato é tr ansferido para o termina. 1 5' f osf at :o oe uma υ n i e; 3 Ψ ;ebra de c : a de.ia em ADN d e c a cl θ i a dupla para gerar um cornpl exo covalente DMA.-AMP com uma ligação fosfoaniclrido 5' 5' . Este intermediário de reacção também foi isolado para enzimas iigase de ADN microbianas e de mamífero, mas tem urna vida ma is curta do que a enzima adeni li lada.. No passo final da ligação de ADN, as enzimas Iigase de ADN não adenililadas necessárias para a criação de uma ligação fosfodiéster cataiizam o deslocamento do resíduo de AMP através do ataque pelo grupo adjacente 3f-hidroxilo no sitio adeni.1 ilado, Τ' oco rrênc da de três enzimas iigase de ADN d irer en Τ' C.\ Q v-, O / .se de ADN I, li e i: EI, é e. stabeiecida previa mient . 0 por c t;. eríza i. v ã 0 bioquim iea e imunolóc pica das enz i ma s ρ ·; Ί V 1 -f '! f'' a. das ;ki Λ .Cf A a.i * aí Ç,' 3.. 1 + ? D Biol. Ch eru, 266: 21 .728-21 735 d 9 0 be L d; ; E . s et e ] * f J. Bi ol. Chem. 269: 3789- -3792 ( 1.9 9 4 ) ) *

AMPLIFICACAO

Os métodos da invenção envolvem a arnplifreação a partir de um molde dos ácidos nucleicos desejados, "Amplificação" refere-se ao aumento no número de cópias de um fragmento de ácido nucleic o p artrcu dar (ou uma porção deste) r e S ti ltân Q o ou a par trr de uma JC Ç- acção enzimát: Lca em cadeia (tal corno uma reacção da polimer α S Θ em c aaec.a, c :.rna reacção de liga: se em ca d era, ou uma. replica ção de sequênc ia auto-sustentada) ; ou a partir d. a replica ção de t < sdo ou p arte do vector, no qual foi cionado. Dp urn modo preferido, a amplifreação de acordo eorn a invenção é uma 36 amplificação exponencial, como apresentado por, por exemplo, a reacção da polimerase em cadeia.

Muitos métodos de amplificação de alvo e de sinal foram descritos na. literatura, por exemplo, revisão geral destes métodos em Landegren,

Lewis, R., Geneti métodos i f i c in vença. o, e i n c 1 nem J_ Γ± S J. U u. , reacção 0iTi ! J p f- P5 ’/ ( * y CT L o. .j. Ο r'· * / íence 242: Engíneering News 10: 1,54 acão podem P p uti 1 izad.O; ã.o da polimerase em cadeia (PCR) , PCR ficação da ligase (LAR), hibrídação de ligase, replicase do bacteriófago Q, sistema de amplificação baseado na transcrição (TAS), amplificação genómica com sequencia.ção do transcrito (GAWTS) , amplificação com base na sequência do ácido nucleico (NASBA) e hibridação f.n sita.

Reacção da Polimerase em Cadeia (PCR) A PCR é um método de ampli freação d .e ácido nucleico descrito, inter al. ia, nas Pat. U.S. ! Od 4 68313 5 e 4683202. A PCR consiste em ciei os repetido S G0 reaeçoes ri v ρχ| ρn sa o d O iniciador gerados peia poli: merase de ADN. 0 ADN alvo é desnaturado por aquecimento '“Μ .ois oiig< onucleótidos, que flanqueiam a s o cj ' i o i i c a a l alvo em cadeias opos tas do AD aipo .1r .1 ca do f são hibr: i.dadas. Es tes oligonuc.] !. e o 11 d o s t iniciadores para uti li zação com a polimerase de ADN, copiado por extensão d .o iniciado r parai fazer uma segun tornam-se

de ambas as adeias. Repeti ndo cic :1o de desnata: l ί-i c a. c ) ρ 0 r aqu ec.im.en to, l i j P ϊ ί o a o a o do i. n .1 . c í a r] rã r β Θ xter: isão, o ADN alvo pod Θ s θ a arnp 1 i T 3 -q. .do um. mi] ..hão G0 vezes, OU J na 1. s , em cerca de d u a s a qua tro hc mas . A PCR é uma fer ram .ent a de bre ilogia molec miar G U. dev O O V' uti] _iz ada em con j uniu 0 c om ama técn i c ci de de t-i: ' c c a. o par cL 37 determinar os resultados da amplificação. Uma vantagem da PCR é que aumenta a sensibilidade amplificando a quantidade de ADN alvo em I milhão a 1 bilião de vezes em aproximadamente i horas. A reacção de polimerase em cadeia pode ser utilizada, nos métodos de selecção da invenção como se segue. Por exemplo, a PCR pode ser utilizada para seleccionar variantes de polimerase Taq possuindo actividade de polimerase. Como descrito em maior detalhe acima, é criada uma. biblioteca de ácidos nucleicos codificando, cada um, uma replicase ou uma variante da replicase, por exemplo, polimerase Taqf e sub-clividida em compartimentos. Cada compartimento compreende substancialmente um membro da biblioteca em conjunto com a replicase ou variante codificada por esse membro. A polimerase ou variante pode ser expressa in vivo numa bactéria transformada ou qualquer outro hospedeiro de expressão adequado, por exemplo células de levedura, ou de insecto ou de mamífero, e o hospedeiro de expressão é encapsulado num compartimento. É aplicado aquecimento ou outro meio adequado para rebentar o hospedeiro e para libertar a variante da poi ímerase e o seu ác.i P O 1 lucieico codi.fi cante no compartimente No caso ( ie um hospe ídeii :o bacteria.no, pOClvb õ er empregue expressão controlada no tempo de uma protein a litica, pc exemplo, c 1 r o t β í n a E d e Φ1 .74, ou a a til izaça.o d e um lisogén:! indutivei λ, para rebentar a bactéria.

Será eiaro que a polimerase ou outra enzima não precisa de ser uma proteína, heteróloga expressa nesse hospedeiro (e. g„, um plasmideo), i nas pode ser Θ Xp X* Θ S S cl 3. partir de um gene que f a.ça parte do gene Dma do hosped' eiro. Assim, a polimerase pode ser, por exemplo, ume L p ϋ 11- iTlíi X" 3. S (ú bacteriana endógena ou nativa. Foi 38 demonstrado que, no caso da cinase de difosfato de nucleótido (ndk), a expressão endógena (não induzrda) de ndk é suficiente par a criar dNTPs p cl '£ Cl Cl su a própria rep licae ci o * Assim, o s mé t odos de sei pcrão de acorí io com a mver i v ói O oodem se. r empreg ues par a a cl .onagem di recta f 1J : ncional de Ό p, iimerases e out ras enz imas a partir de popu. laç oes microb j pj pi -p .s divers a s ( θ não· cui tivadas) e ácidos rr ucieicos poae ser ;omponentes Qt; uíU 3 8 .stema de descrito em maior CÁ-j L 3.1110

Alternativamente, a 'biblioteca compartimentalizada em conjunto com transcrição/tradução in vitro (com ariante da polimerase expressa in vitro este documento), e o compartimento.

Cada compartimento também compreende componentes para uma reacção de PCR, por exemplo, trifosfatos de nucleótido (dNTPs), tampão, magnésio, e iniciadores oligonucleotidicos, Os iniciadores de οIigonucleótido podem possuir sequências correspondendo às sequências que flanqueiam o gene da polimerase (i. e., no ADN genómico ou do vector) ou às sequências no gene da polimerase. A crclização térmica da PCR é então iniciada para permitir que qualquer variante de polimerase possuindo actividade de polimerase amplifique a sequência de ácido nucleico. 7\ ,c\ s polimera; 8. .1 v a 3 irão ampi .ificar as sua s seqi: ) 0 r\q j 0 p de clC J- de nucleico corres ponde ntes, enq uanto que as sequ< r·. v-, ,·—« n ~i ~ l i ^ O. O de áci do nucleico < xue cc ;dif ic am polime rases fracame nt3 a ctivas 0 \X i n a Ctl vas serão f racarr lente ] ; p p p j s ou não repl. içadas de to d O * Em ger ' a .1. f θ s ρ θ τ 3. -se qi ae o ] número de cópias final da ca da memb Τ' o de uma biblioteca de ácidos nucleicos seja proporcional ao nivel de actividade da variante de polimerase codificada por eles. Os 39 ácidos nucieicos que codificam polimerases activas estarão sobrerrepresentadcs, e os ácidos nucleicc :;s que cc )dif rcam polimerases inactivas ou fracô aiente activas estarao sobrerrepresentadcs. As sequências amplifi cadas rest il tardes podem ser então clonadas e sequenciadas, etc., e a capacidade de replicação de cada membro ensaiada.

Como descrito em maior detalhe em qualquer outro sitio, as condições em cada. compartimento podem. ser alteradas para seleccionar polimerases activas nestas condições. Por exemplo, pode ser adicionada heparina à mistura de reacçâo para escolher polimerases, que são resistentes à. heparina. A. temperatura, a que a PCR ocorre pode ser elevada para seleccionar variantes de poiímerase resistentes ao aquecimento, Além. disso, podem, ser

seieccionadas •H 1—1 O Q* lerases que sejam cai pazes de ester ider sequências de AQN, tais como J Iniciadores < som extremidades 3' alteradas ou partes C: T.". Θ -T ci d tl S da secruênci; a do iniciador. 7\ ,C\ O extremidades alteradas em 3' ou. outras alterações podem incluir bases não naturais (partes do açúcar ou da base alteradas), bases modificadas íe. g. extremidades 3' bloqueadas) ou mesmo iniciadores com químicas da estrutura alteradas (e. ou iniciadores PNA).

Transcri.ptase reversa - PCR A RT-PCR é utilizada para amplificar alvos de ARN. Neste proces iq 0 f ci enzima transcrip· tase reversa é utilizada para conver ter Aí <N no AON complemer dar (ADNc), que pode ser então amplif i cado uti1izando a PCR. Este método demonstrou ser útil para a detecção de vírus de ARN. 40 6Π çãc í podem empr egar RT -PCK. r Lssim, rc os que codi: ficam uma plica C‘ O ou s nas orcio nado na f orm ia cie um; a bib lr oteca de de r d. a i ser c r d t-· st in vi vc. v em ba .cter r ti o r O, levedur. ‘as / Θ ' t- r'' / pq -i . rt Q 2 ,p u por trans criçâo ín V 2. l. 22< •-N de ADN A RN poderia co dif rc ar uma r epiic ase ( ati W * t.. rans crípt a s 6 re ve rsa ou s d .do expressa i rj vi vo (e 1 ibe rt ada n uma ie meios revelados abaixo)

Os métodos da i conjunto de ácidos nuc variantes pode ser pr ARN. Esta biblioteca células de mamitero, compartímentalizadas, compartimentalizado. co-compartimentali zada (e emulsão juntamente com o ARN atrai ou in vitro. Outros componentes necessários parai amplificação (polimerase e/ou transcriptase reversa, dNTPs, iniciadores) são também compartimentalizados, Sob uma dada pressão(ões) de selecção, o produto de ADNc da reacção de transcrição reversa serve como i um molde para a amplificação por PCR. Como com outras reacçc ses de replicação (em particular ndk nos Exempd Los) o ARN pode c sodific ::ar uma varieoaae de enzimas que alimentam í ii. reacção.

Reprrcaçâo de Sequência Auto-Sustentada (3SR) A r· epireação de sequência auto- -sustentada (3SR) é uma V 3. r i 3. Ç cl o de TAS, que envolve a ampli ireação isotermrca os ; um ácido m icleico molde, através de rondas sequenciais de tra.nscripta.se reversa. {RT) , actividades de polimerase e nuclease que são mediadas por um cocktail de enzimas e iniciadores de oligonucieótido apropriados (Guatellr et ai. (1390) Proc. Natl,

Acad. S r>us ^ 87: 187 4) . A ( Zl Θ O r cl Cl 3- Ç cl O d snzimática do ARN do hetero duplex de ARN/A RN ã em subst ituioao da G Θ S Ώ 3. r. uraçã.o por aquecimento, A ARNase L I e todas as outras enzima s são adie tonadas ci reací são e todos os passo s ocorrem â mesmai temperatur; a e sem ou trais adições de reagentes . Após este 41 racor f; CÍ0 a Kr e :m. uma hora isso 5 se r esten d idos para lie o rgar i.i sinos mesofíl i c o s ϊ 3 SR (Guateli .1 et ai . cad. Sc 1 . USI:i 87: 7 / ' r vez cie termo cri clagem por a.cç 8.0 c roncerta aa cie duas O ϋ mo uma tre mscrip tase lada cl· e tran scriçãc D e i f í C í ação simuit ânea t an to nest -Θ s istema ci a. uto- uer urna. das du a. s e π z ima s pro a 4 cesso, foram alcançadas am; utilizandc :> amp) Guatelii et al Compton (1 1991) PCR. Como descr. enzimas: uma p ícaçao isorermic (1990) Proc, Nat reversa cooperam numa reacçao transcrição reversa, conduzindo ; de ARN corno de ADISf. Cl arame ar envolvidas ou em ambas, simultaneamente. Também pode incluir a evolução da actividade de ARNase H, quer como parte da enzima tra.nscripta.se reversa (e. g, HIV-1 RT) ou por si só. de rri 1 / f rcion adas ados sob iodem ser i (i. e. ,

As várias actividades enzimáticas que definem 3SR e métodos relacionados são todos alvos para selecção utilizando os métodos da invenção. Variantes quer de polimerase de ARN de T7 transcripta .se reversa (RT) , ou ARNase H podem nos compar timentos aq nosos das emulsões, e condições, de outra fc rrna 1 imitantes. Estas introduzida .s através de "sedimentos de genes" L· a c e e .τι τ. 8. s que express ; am o polipépti do) , 01 descrito n< autro lado neste documento, A iib emulsão po de ser med dada cor lise enzimát e seiecc meio corno revelados. Estes li. agentes que Θ S t cii oil: t r a n s i e n t e me ele lisogene de lambda) ou lise térmica, ou outros métodos corno aqui Estes últimos podem necessitar da utilização de ram a actividade enzimática a temperaturas adas. Por exemplo, pode ser necessário 42 incluir quantidades de prolina, glicerol, trealose ou outros agentes estabilizadores como conhecidos na técnica para efectuar a estabilização de enzimas termossensíveis, tais como transcripta.se reversa * Além disso, a remoção passo-a-passo do polipéptido pode ser realizada para. seleccionar a esta.bilid.ade aumentada da enzima termossensivel.

Alternativamente, e como revelado noutro local, as variantes podem ser produzidas através de tradução de transcrição acoplada, com os produtos expressos alimentando o ciclo 3SR.

Será também entendido que é possível substituir a transcriptase reversa com a poiimerase de ADN termoestávei Tth, A poiimerase de ADN Tth é conhecida por possuir activrdade de transcriptase reversa e o molde de ARN é efectivamente submetida a transcrição reversa no molde de ADN utilizando esta enzima. É deste modo possível seleccionar variantes úteis desta enzima através de, por exemplo, introdução de variantes da poiimerase de ARN de T7 expressas em bactérias em emulsão e pré-incubação a uma temperatura de outro modo não permissivas. 0 Exemplo 18 abaixo é um exemplo, apresentando um modo em que os métodos da invenção podem ser aplicados para selecçâo de replicases utilizando replicaçâo de sequência auto-sustentada (3SR).

Amplificação de Ligação (LAR/LAS) A reacção de amplificação de ligação ou sistema de amplificação de ligação utiliza iigase de ADN e quatro oligonucieótidos, dois por cadeia alvo. Esta técnica é descrita 43 por Wu, D. Y. e Wallace, R,B, (1989) Genomics 4:560. Os oligonucleótidos hibridam com sequências adjacentes num ADN alvo e são unidos pela ligase. A reacção é desnaturada por aquecimento e o ciclo é repetido.

Por analogia com a aplicação a polimerases, este método pode ser aplicado a ligases, em particular a partir de organismos termofílicos. São sintetizados oligonucleótidos complementares a uma cadeia, da sequência do gene da ligase (quer como um emparelhamento perfeito ou compreendendo diversidade direccíonada ou aleatória) , Os oligos das duas extremidades sobrepõem-se no vedor ou regiões não traduzidas do gene da ligase. O gene da ligase é clonado para. expressão num hospedeiro apropriado e compartimentaiizado em conjunto com os oligonucleótidos e uma fonte de energia apropriada (normalmente ΆΊΡ (ou KADPH)), Se necessário, a ligase expressa como acima em bactérias é libertada das células por lise térmica. Os compartimentos contêm tampão apropriado em. conjunto com quantidades apropriadas de uma fonte de energia apropriada (ATP ou NADH) e oligonucleótidos codificando a totalidade do gene da ligase assim como sequências flanqueadoras necessárias para a clonagem. A ligação dos oligonucleótidos conduz à montagem de um gene da ligase de comprimento total (formado molde pelo gene da ligase no plasmideo de expressão) por uma ligase activa. Em compartimentos contendo uma ligase inactiva, não irá ocorrer montagem. Tal como com. as polimerases, o número de cópias de um gene da ligase X após auto-ligação será, de um modo preferido, proporcional à actividade catalítica nas condições de selecçâo da ligase X que a. codifica.

Após a lise da célula, a termociclagem conduz ao emparelhamento dos oligonucleótidos ao gene da ligase. Contudo, 44 ligase de activa no cantes do poaem. 8 6 uma o utr UCcí-O s â o s £ o ma i a ligação dos oligos e assim a montagem do gene da comprimento total depende da presença de uma ligase mesmo compartimento. Assim, apenas os genes que ligases activas irão montar os seus próprios codifi gene dos presentes oligonucleótidos. Os genes montados então amplrficados, di -vers ificad 0 G 6 reclonadc )s para ronda de seiecçao, se nec essári o. Os métodos da inve CÍ0 S Γ..Θ modo, adequados para a se.. ]. Θ c c ã 0 de liga se.sf que rápidas ou mais eficientes na ligação,

Como referido noutro iocai, a ligase pode ser produzida quer in situ pela expressão a partir de uma bactéria adequada ou outro hospedeiro, ou através de tradução ín vitro, A ligase pode ser uma ligase de oligonucleótidos (e, g. ribo ou desoxírribozima) montando a sua própria sequência a partir de fragmentos d isponiveis, '3 Ll Cl ligase pode ser uma ligase convenciona.1 (polipéptido ) , 0 c :omprime; ato dos ol 1 .gonucleót. idos irá depender da reacção p. articul ar mas, se necessár io, podem ser muito curtos (e. g. trip detos) . Como referido not itro local, o método desta invenção oc ;de ser utiiiz ado para seleccionar um poi ipéptido c ci.p a z cie iTi.· adular a ac u Lvi dade da 1. j. q a 0 0 f q u 0 directamente 0 u i n d i r e c t ame n t. e . For exemplo, o gene a ser desenvolvido pode ser uma l outra enzima ou enzimas que geram um substrato par ' a a 1 u q a s 0 {e. g. NADH) i ou consomem um inibidor, Neste caso, o 0 O .j. -J. Q O j. j. U O 1.01 Ót. id-OS codifi cf. im partes da outra enzima o i j θ π z a m a. ,s; 0 tc, A reacçã- 0 de ligação entre olicíonuc :leôtidos po de incorporar iicracoes quin aicas altern; ativas e. g. de d.mu. dd. w Desde que as ligações químicas não interfiram com a cópia do molde d.a cadeia oposta por qualquer replicase (e. g. transcriptase reversa), 45 pode ser desenvolvida uma vasta variedade de ligaçoe químicas e liasses o;ue a cataiizam.

Repiica.se QS ;erí óiac :J° QS, amplif icar o (198 8) Bi o. d 3 0 O C om. um da s eci uêncxa t a s e r eversa ri da de 5' no A.DN alvo, como descrito por Lizardi et al.

Technology 6:1197. Primeiro, o ADN alvo é bibridadc rnrcrad -L incluindo t 5' de QS Utrlizand· QP £··£_ ii r n A.DN c qu e ]. process Estes dois ;m promotor de T7 e uma regi; d este iniciador, a transcríptase re\ íga. o iniciador à sua extremidade 5 passos são semelhantes ao protocolo de TAS, 0 neteroduplex resultante é desnaturado por aquecimento. De seguida, um segundo iniciador contendo uma região da sequência 3' de ζ)β é utilizado pa.ra iniciar uma segunda ronda, de síntese de ADNc, Isto resulta num ADN de cadeia dupla contendo ambas as extremidades 5' e 3' do bacteriófago Q3, bem como um sítio de ligação à polimerase de ARN de T7 activa. A polimerase de ARN de 17 transcreve então o ADN de cadeia dupla em novo ARN, que mimeti 0;:

Após lavagem extensiva para remover qualquer sonda não hib r ic iciGcL, o novo T\ · RN é eluíc lo a partir do alvo replic :ado pel cL replicas e óc í ( Q β . A ú 11 im; ;l reacçãc ) c ria t mia amplli .1 c a ç ã.o d pr 1.0 veze: s em ap: roximadamen te 2 0 rnrnut OS Λ 0 fur ] 0 C'· sígni í uicat ivo poc je ser f o rma o :o i devido a qi A d 11 tidad.es r edu: sidas de sonda 0iTi ARN qu e é ret _l o. a de forma não 1 £ específica du irante d reacçg 10 , P. í τ θ a CÇB.O ei Tipregand· o a : rep lrca.se de y β como des c r i 1 r. o a c .i .ma pode utiliz pa· ;tru: uma reacçac de 46 continua num; invenção. t o .uma Ge r e a. r r r a. çâo ernativa d.e acordo com

Por exemplo, o gene para. a replicase de Qp (com regiões de 5' e 3' apropriados) é adicionado a uma reacção de tradução in vítro e compartimentalizada. Nos compartimentos, a replicase é expressa e começa imediatamente a replicar o seu próprio gene. Apenas os genes que codificam uma replicase activa se replicam a próprios. A replicaçã .o prossegue até os NTPs se extingui ...rem, ntudo, com o os NTPs ss o podem difundir através 0. ci. emulsão (v e r descrição de ndk nos Exemplos) , a reacção de rep licacão pode espaço livre nos possível prop agar ser "alimentada" a. partir de fora e prossegue durante muito mar teirico, essencialmente a. té que não exrst; (Lrzardi ei ma i s especifica: 3 ( e. g. dependeu tes do ò. S Θ de Q3. Come om outras reacç iões de alar ndk n 0 3 Exemplos) pod íTi ser e de enzimas < que alimentam a reac ção • ie Amplificação ; Çf L, ecnologra de ; rmp 1 ifrcaçáo adr terna ti V, a i j. a Por exemplo, a am pi ifreação ΘΤΠ circulo a. .i (1 9 9 8) h lã L Genet 19:1 P 2 5) é uma -O comercialme nte disDonivel (RC AI ÇiX) que compartimentos para postem uma reacção ainda mais, através de diluição em série da mistura de emulsão numa fase oleosa fresca e re-emuisificaçâo após adição de uma fase aquosa fresca contendo NTPs. Ά replicase de Qf3 é conhecida por ser á prova de erro, por isso, a replicação isoladamente irá introduzir montes de diversidade aleatória (que pode ser desejável). Os métodos aqui descritos permitem a evolução de forma: iniciador) de repl replicação (em j. 47 é conduzida pela polimerase de ADN e pode replicar sondas de oligonucleótido circular com quer com cinética Irnear ou aeométrica em condições isotérmicas.

Na presença de dois iniciadore; amplificação geométrica ocorre atra' de ADN e hiper-.rairi.ificaçao para ger.r círculo numa 1 hora.. mi.nu O --s A D C Θ utilíz a do um tos um ci 08 de ia lira .andem, ίΐΘ 88"! alvo I Outra técnr r~' pi pi Walk er et _ 1 / d± , f \ :im umco _n; equência especificamente definida specífico. Mas, contrariamente a outr a ciclização térmica, o 5DA é um de J. tò A L J. ,j. v õi '8 A ti J. cl de ácido nucleico A SDA compre^; fas e de amplificai Na formação por aquecimento c. de iniciadores es de ADN (i n i c i a d o i bas e e iniciadore ranc le choque para desloc yq ,·-< 0 0 ides adequa damente, a de d esloc arnento c|p cadeia U " o u ma i s c ó ρ ,i 8 S de cada , a ACAT gera, em poucos de c ;ópi ar i G0 8. ΌΝ 1igadas r'·. ;· ps a. esí •ρ 0 vC ) ) de C' i Ρ p P' -1— --J O O-. mento de cadeia 80: :3 92) , comet cem uma anu r'' para uir ! :n "j xj ρ, 5 té cn i ca s que se baseiam proc ;:esso isotérmi co que :e r a s e de ADN e uma enzima alme: 11. β 8 sequênci a única os, o ADN de cadeia dupla é desnaturado duas cópias de cadeia simples. Uma série lei; riadas de 48 vos a 1.t.; novo) para forma exponencial. capazes de ampli 0 p :c o c 0 s s o de a ção expo nencial começa com alvos alterados (cadeia s de ADN par ciai de cadeia simples com sítios de reconhecimento da e nzrma de : res triç( lo) da fase de formação de alvos é ligado a cada cadeia na sua >olimerase de ADN utiliza então

Um iniciador de amplificaç seouêncía de ADN comolementar. o iniciador pa.ra identificar uma. localrzação pa.ra estender o iniciador da sua. extremidade 3' , utilizando o alvo alterado como um molde para adicionar nucleótidos individuais. 0 iniciador estendido forma assim um segmento de ADN de cadeia dupla contendo um sitio completo de enzima de restrição em cada extremidade.

Uma enzima de restrição é então ligada ao segmento de cadeia dupla de ADK no seu sítro de reconhecimento. A enzima de restrição dissocía-se do sitio de reconhecimento após ter sido clivada, apenas uma cadeia do segmento de cadeia dupla, formando um intervalo. A polimerase de ADK reconhece o intervalo e estende a cadeia do sítio, deslocando a cadeia prevíamente criada. 0 Θ assi .m. repetidamen p interrompido e restaurado pela enzi ma de restrição e a polimerase de ADK com deslocamento contínuo das cadeias de ADK contendo o segmento alvo. o a g a. c a d e j_. a com iniciadores com a repetição deslocada está de amplificação de interrupção, então disponível como acima. 0 p extensão e deslo para em pareihar : ocesso continua ' ame n fo de novas 49 cadeias de ADN, alvo original.

resultando na amplificação exponencial do ADN

SELECÇÃO DE ARN CATALÍTICO

Foram utilizados métodos conhecidos de evolução ín vítro para gerar moléculas de ARN cataliticamente activas (ribozimas) com uma gama de actividades diversa. Contudo, estes envolveram seiecçâo por auto-modificação, que inerentemente isola variantes que se baseiam em catálise de proximidci.de e que apresentam actividades reduzidas em trans. A cornpartzmentalização produz meios para seleccionar ribozimas de verdadeira actuação trans, capazes de processamento múltiplo, sem a necessidade para prender o substrato ao ribozima através de interacções de ligação cova lente ou Irgação de hidrogénio (i. e., emparelhamento de bases).

No seu caso mais simples, um gene que codifica uma ribozima pode ser introduzido numa emulsão e rapidamente transcrito como demonstrado peia transcrição e a amplificação 3SR do ARN que codifica a polimerase Taq ín situ como se segue: 0 gene da polimerase Taq é primeiro transcrito em emulsão. É emulsifiçado 100 p.L de uma mistura de reacção compreendendo HEPES-KGH a 8 0 m.M (pH 7,5), MgCtU a 24 mM, espermidina a 2 rnM, DTT a 40 mM, rNTPs (30 mM), 50 ng de ΤΊ-Taq molde (ver Exemplo 18. Selecção Utilizando Replicação de Sequência Auto-Sustentada (3SR)), 60 unidades de polimerase de ARN de T7 (USB), 40 unidades de RNAsin (Promega) , utilizando o protocolo convencional. A.s emulsões são incubadas a 37 “c durante até 6 horas e análise dos produtos de reacção por electroforese em gel apresentou níveis de produção 50 A.RN para serem comparados com os do controlo não emulsí f ic

Criando nma. extremidade suspensa em 5' (e. g. através da ligação quer de adaptadores de ADN como de ARN) no gene emulsificado, os variantes de ARN são seleccionados pela sua capacidade para realizar a adição direccionada de molde de dNTPs sucessivos em trans (i. e. actividade da polimerase, ver Figura 6) . Os genes que foram "cheios" podem ser recuperados por PCR utilizando iniciadores complementares à região de cadeia simples do gene (i, e., a região, que é de oadeia simples antes ao enchimento por ribozima) ou por captura de nucleótidos modificados com biot ina (ou de outro mod o) que são i:r oorporo 3 O O >it f S Θ 01J _i. d 3. jD Ο.0 PCR. Nc :>s compa rtimentos se m actividade catai 11 i ca ARN, esta j região p eririanece em cadeia simples, e a PCR não conseguirá amplific rar o molde (alt ernativamente não são incorporados nucleót idos e o molde não é capturado, nu us removido por lavagem).

Também pode ser utilizada uma abc em de ac .amento para largar ainda mais o leque c Ίθ 3.C3.10 /.idades enzimáticas que podem e z s e i e c c i o r a o a. s Por exernp lo, pode ser uti1irada o-emuisificaçâo de uma polimerase de ADN com o gens i descrito cima (extremidade suspensa em 5f : ) para seleccionar ribozimas que convertem um substra to de NTP de outr; a fo: ou e p 0 G0 30.0 uti 1 izad.o pela polimerase. Com. gen e "cheio" pode ser então recuperado por aci ma também pode ser utilizada cara C; .Ο Ί anteriormente, o 'CR, A abordagem aionar a enzima polimerase de proteína produzida in si tu de um molde semelhante (i. e, com extremidade suspensa em 3'), Um diagrama apresentando a selecção de ARN possuindo actividade catalítica é apresentado como a Figura 6. 51

SELSCÇAO DE AGENTES CAPAZES DE MODIFICAR A ACTTVI DADE DA 1EPL d CASE

Noutra forma de reali Z cl Ç ã O ; cl invenção < - utrlizada para sereccionar um polipé] otido capaz de modificar a actividade de uma replicase. Nesta í :orma. de rea. lí Z c .1... á .. , e i j arriado um conjunto de ácidos nucleicos compreendendo membros que codificam um ou mais polipéptídos candidatos. Membros da biblioteca de ácidos nucleicos sâo compartimentalizadas em conjunto com uma replicase (que, como explicado acima, é capaz apenas de actuar no ácido nucleico codificando o polipéptido).

Os polipéptidos candidatos podem ser funcionalmente ou quimicamente distintos uns dos outros, ou podem ser variantes de um agente conhecido ou suspeito de ser capaz de modular a actividade da replicase. São er tão seg reqa.d. Ei O membros da mi stura. em compa: rtimentos em conjr mto c: em c ·>, c; polipéptidos ou porinucleó tidos que os codifíc iram, de modc i a que, de um modo preferido, caaa cornpar urmen to compreende um único menicr o aa mistura, e: m conjunto com o : seu po.l rpépt . i d o c o d. 1. f i c a d o Ό Θ "1.0 cognato. Caca compartimento também compree nde uma ou mais moléculas da replicase. Assim, o polir aéptic io codificado é capaz O moc lu ].; :X "Γ et cX C ; t i v i c iad.e da repli .case, pai --:j nir ou aument .ar 3. r;ep 1 ic ação d 0 3.0. I. d 0 1'^ Cl) o comparti .mental i; rad.o (.; A e, f 0 ciCZ do ni iclerco que C- 0 c iifica c i polípép tido) . Deste modo o P°1 ipé ptl Ldo é capaz de actuar através de uma replic 830 pc ira a. um ent a r ou dim 1 n u i r o ir úmero de molécula; s d.o seu - ácido nuciei . C 0 cod lf i CB Γ te. Ni ma f o rma G 0 T Θ 8 iiza.ção altament e pref e r i d. a da inv enç áo, o pc d ípép -tido é capa z de auir -entar a actrv zaacl0 de 52 replica.se, para permitir a detecção ou seiecção do polipéptido através da detecção do ácido nucleico codificante. 0 polipéptido de modulação pode autuar directarnente ou indirectamente sobre a replicase. Por exemplo, o polipéptido de modulação pode ser uma enzima compreendendo uma activrdade, que actua na molécula de replicase, por exemplo, por uma modificação pós-tradução da replicase, para activar ou inactivar a replicase. 0 polipéptido pode actuar retirando ou colocando um ligando de uma molécula de replicase. É conhecido que muitas replicases, tais como polimerases e ligases são reguladas por fosforilaçã.o, de modo a que em formas de realização preferidas o polipéptido de acordo com a. invenção é uma cinase ou uma fosforilase. 0 poiipéptid.o de modulação pode também interagir directarnente com a replicase e modificar as suas propriedades (e. g, Tiorredoxina & poiimerase de ADN de T7, membros do replissoma, e. g. grampo, helicase, etc., com poiimerase de AON III) .

Alternativamente, o polipéptido de modulação pode exercer os seus efeitos numa replicase num modo indirecto. Por exemplo, a modulação da actividade da replicase pode ocorrer através de um terceiro corpo, cujo terceiro corpo é modifrcado pelo polipéptido de modulação, por exemplo, como descrito acima.

Além. disso, o polipéptido de modulação pode ser uma enzima, que forma uma parte da vra, que produz como um produto finai um substrato para a replicase. Nesta forma de realização, o polipéptido de modulação está envolvido na síntese de um intermediário (ou o produto finai) da via. Consequent.em.ente, a taxa de replicação (e desse modo a quantidade de ácido nucleico 53 polipéptido) codixica o aue está dependente activiaaae do polipéptido de modulação.

Por exemplo, o polipéptido de modulação pode ser uma cinase συ e e s t. á. envolvida na biossínte 3 0 de bases, desoxi rribonuc leósidos, desoxirribonucleótido s, tai s c omo dAMP, dCMP, dGMP e dTMP, difosfatos de desoxirr; íbonuci .eós: icio (tais como dADP, dCDP, d.OTP e dTDP), trif 0 S T. c. itos j Ο.Θ desoxi rribonuc 'ieósido, tais como dA.TP, dCTP, d.GTP r') 1 “ dT! TP, ou nucleó sidos, nucleótidos, tais como AMP, CMP, GMP 1 e UMP, difosf atos de nucleósido (tais como ADP, GDP, GTP e UDP) , tri los fatos de nucreósido, tais como ATP, CT1 ?, GTP ou UTP , etc. 0 polipéptido de modulação pode estar envolvido na síntese de outros intermediários na biossíntese de nucleótrdos (como descrito e bem conhecido dos livros de texto de bioquímica, tais como Stryer ou Lehninger), tai r:ibose-l-piro fosfórico, 5-f osf orríbosí 1-g.licinamida, formilglicinamida, etc. Assim, uma enzima tal como a f o s f o r r i b o s iIgli c i n ami d a s i n t e t a polipéptidos serão óbvios para métodos da invenção permitem a ; actividade catalítica melhoraLda. aomo IMP, ácido 5-fosfo-a-D- 5-fo s f o-β-D-r ibo s s i1ami n a, ^ — -i fosf orribosi1 -N- O ] poli| léptido p ode compreen der ibo sef o sfato í i)iro fosfocina se, etc . Outros 0 X P1 j rplos des ses J s espe< orali stas na técnica. ,Λ,π elecção desses polipéptidos com

Ainda noutra forma de realização, o modulador funciona para "desbloquear" um constituinte do cocktail de replicação (iniciadores, dNTP, replicase, etc.). Um exemplo de um constituinte bloqueado seria um iniciador ou dNTP com uma parte química, ligada, que inibe a replicase utilizada no ciclo de CSR, Alternativamente, o par de iniciadores utilizados seria ligado covaientemente por um agente de ligação, com clivagem do 54 polipéptido pelo Tnod.ola.dor, permitindo que ambos os iniciadores amplifiquem o seu gene na presença de repiicase suplementada. Um exemplo de agente de ligação seria um ácido nucieico de péptido (PIS!A) , Adicionalmente, concebendo um oligonucleótido grande que codifica um par de sequências inrciadoras entremeadas peia sequência de nucleótidos alvo, podem ser envolvidas novas enzimas de restrição específicas para um sitio. Como anteriormente, a taxa de replicação (e desse modo, a quantidade de ácido nucieico que codifica o polipéptido) está. dependente da actividade do polipéptido de modulação, AIternat ivamente, o moduiador pode modificar a extremidade 5' de um iniciador de modo a que os produtos de amplificação que incorporem o iniciador possam ser capturados por um agente adequado (e. g, anticorpo) e desse modo enriquecido e re-amplifiçado.

Noutra forma de realização, o âmbito da CSR pode ser ainda alargado para seleccionar polipéptidos que não são necessariamente termoestáveis. Os veículos de distribuição (e. g. E. coli) contendo construções de expressão que codificam uma forma secretável de um moduiador/repiicase de interesse são com.pa.rtimentadíza.d.os. A inclusão de um agente de indução na fase aquosa e incubação a temperatura permissiva (e. g, 37 °C) permite a expressão e secreção do moduiador/repiicase no compartimento. É então permitido tempo suficiente para o moduiador actuar em qualquer um dos modos acima mencrona.dos para facilitar a amplificação subsequente do gene que o codifica (e. g, consome um inibidor de replicação), A alteração de temperatura subsequente durante o processo de amplificação serve para libertar o compartimento de activídades enzirnáticas da célula hospedeira, (que até este ponto foi segregada da fase aquosa) e liberta o gene codificante para amplificação. 55

Assim, de acordo com ama forma de realização da invenção, proporciona-se um método de seieccionar am polipéptido envolvido numa via que possui como um produto finai um substrato que está envolvido numa reacção de replrcaçâo ("um polipéptido de via"), compreendendo o método os passos de: (a) proporcionar uma replicase; (b) proporcionar uma mistura de ácidos nucleicos compreendendo membros, codificando cada um, um polipéptido de via ou uma variante do polipéptido de via; (c) subdividir a mistura, de ácidos nucleicos em compartimentos, de modo a. que ciada compartimento compreenda um ácido nucleico membro da mistura, o polipéptido de via ou variante codificada pelo ácido nucleico membro, a. replicase, e outros componentes da via; e (d) detestar a amplificação do ácido nucleico membro pela. replicase.

Os Exemplos (em particular o Exemplo 19 e os Exemplos seguintes) demonstram a utilização da invenção na seiecçao de cinase de difosfato de nacleósido ÇCinase de ΝΌΡ) que ca.tal.iza a transferência, de um grupo fosfato de A.TP para um difosfato de desoxinucleósido para produzir um trifosfato de desoxínucleósÍGO.

Ainda noutra forma de realização, o polipéptido de modulação é tal que, consome um inibidor da actividade de replicase. Por exemplo, é conhecido que a heparina é um inibidor da actividade de replicase (pol.irnera.se) . Este método permite a seiecçao de uma heparinase com actividade aumentada, por compartimentalização de uma biblioteca de ácidos nucleicos que codificam a heparinase ou variantes desta enzima, na presença de heparina e oolimerase. As variantes de heparinase com actividade aumentada são capazes de degradar a heparina numa extensão maior, ou mais rapidamente, removendo assim a inibição da actividade de replicase no compartimento e permitindo a replicação do ácido nucleico no 56 compartimento (i, e,f o ácido nucieico que codifica a variante da heparinase) .

SSLSCÇAO DE POLI PÉPTIDOS QUE INTERAGEM

Os sistemas rnaís importantes para a selecção de interacções um chamari z-h í X.) Q (j compree ndendo proteír ia X f- undida com Ui domínio de 1 r ^ cl. Ç 3 O a AuO e uma presa-h íbrido, compreendei ΓΙΟ1 proteína Y f u r: . cl ,j. dei com um c iomini o de act i vaçã.o o.e transem ps com interac câo 0 ^ n Q\ gnato de X e Y reconst: Ltuindo o activador d· proteina -proteína são mé todos i n viv<. ) ς S θ Γ] O O O rnaís importante me Ibor desenvolvido o sistema d.0 levedura de dois hibrid. (Fields & Song, Nature (1 98 9) 340, 245-246). Neste sistema. abordage ns relacionados são for: madas proteínas de dois híbrido transcrição. Foram apresentados dois outros sistemas in vivo, em que a cadeia polipeptidica. de uma enzima é expressa em duas partes fundidas com duas protei n a s X e Y e em que a interaeçã do cog: lato X-Y reconstitui a função i de uma enzima (Karimov (1998) Proc Na t 1 Acad Sei USAr 95,5752 -6; Peiletrer (1999) Na

Biotechnol, 17,683-690) conferindo um fenótipo seleccionável na célula.

Foi Ο.Θ monstrado recentemente qu e aL polimer ' 3 S Θ 1 3 Cf P ( ade ser sepa rada de uni ííiodo ; reme] hanIre (Va i n shte í n et a / v ( 1 996) Protein Science 5, 1785) . De acordo com a invenç; :X\ cs de S t Θ modo, proporciona -se um mé todo de seieccm onar um par cle P o i i p éptidos capazes de interacç; ão estável sepa .rando a pc )Iim· e r aL s e 1 3 CJ O U qualquer en zima ou fa ictor auxiliam pa m a reacçSo da polime £. 3 S Θ v O método compreende várros passos. O primeiro passo consiste em prooorcionar um orimeiro ácido nucieico e um segundo ácido 57 nucleico. 0 primeiro á.cido nucleico codifica uma primeira proteína de fusão compreendendo um primeiro sub-domínio de uma case (ou outra, ver acimat enzima tunarda com um primeiro poiipéprído, enquanto que o segundo á.cído nucleico codifica uma segunda proteína de fusão compreendendo um segundo sub-domínio de uma replicase (ou outra, ver acima) enzima fundida com um segundo poripéptrdo. As duas proteínas de fusão são tais que a interacção estável dos primeiro e segundo sub-domínios de replicases (ou outra, ver acima) gera actividade de replicase (quer directamente ou indirectamente). Pelo menos um dos primeiro e segundo ácidos nucleícos (de um modo preferido, ambos) é proporcionado na forma de uma mistura de ácidos nucleícos codificando variantes do respectívo primeiro e/ou segundo polipéptido(s). olipéptido, de modo a que a .1 igação do pri oiipéptidos conduz à interacção estávei de u; eplicase para gerar actividade de replicase de amplificação de pelo menos um do primeiro nucleícos por uma replicase é detectado.

Finalmente, í segundo ácid.oí A mistu ra os i misturas de ácidos nucleícos são então sub-divididas em OOTfCpdl.1. ί,.Ί.ίΓιθΠ Lo s, de modo a que cada c o mp a. r 11 me nto compr *eende um primei nucleico e um segundo ácido nucieic o em ( conjunto com as respecti vas proteína de fusão codificadas pelos primeiro e segundo ácidos nucleicos. 0 ]3 X. λ. !.Γί Θ.j. X. O p O. Lípépt i d. Ο Θ β n t â o 06 i x o cl O ligar ao segundo A p :resentí ; inve Π 0 cl1 0 111' '/ Θ ΓΙÇ 3.0 com ipre c.·. vm í:í «vA- j deste modo, um sis rema c :íe sele C v ό 0 .1 n v i tro através do qu al a j r/eeons ti1 zui çã O cl d. fun ção d .e repl i case 3. 0. X. gg γ p Cj d. a a.s£ ;ocí a ç ã. O do cognato de do d. s 1 í cg andos de pc ilípépt ido o o D duz a amp Irf _L U- cl Ç cL Á ) e lig 3 Ç cL 0 do s gen c:· s cl^ O- O j_ S .L ígando 8 e 1 Um ta O SIS 00 ma in vi tro de dois hibr idos 58 é particularmente adequado para a investigação de interseções proteína-proteína a temperaturas elevadas, e. g. para a invéstigação dos protenomas de organismos termofílicos ou a engenharia de interseções altaniente estáveis. 0 sistema também pede ser aplicado ao rastreie e isolamento de compostos moleculares que promovem interaeções de cognato. Por exemplo, os compostos podem ser ligados quimicamente, quer a iniciadores ou a. dNTPs e assim seriam apenas incorporados nos amplicões se promoverem associação. De modo a evitar cruzamentos, esses compostos teriam que ser libertados apenas após a compartimentai!zaçao ter ocorrido, e* q. por acoplamento a. md.eroes.feras ou por inclusão em microesferas dissoiviveis.

SELSCÇÔSS DE PASSO ÚNICO E DE PASSO MÚLTIPLO A selecção de condições de encapsulação adequadas é desejável. Dependendo da complexidade e do tamanho da biblioteca a ser rastreada, pode ser benéfico estabelecer o processo de encapsulação, de modo a que 1 ou menos do que 1 ácido nucleico seja encapsulado por microcápsula ou compartimento. Isto irá proporcionar o maior poder de resolução. Quando a biblioteca é maior e/ou maís complexa, todavia, isto pode ser impraticável; pode ser preferível encapsular ou compartimentalizar vários ácidos nucleicos em conjunto e confiar na aplicação repetido do método da invenção para atingir a escolha da actividade desejada. Pode ser utilizada uma combinação de processos de encapsulação para obter o enriquecimento desejado.

Estudos teóricos indicam que quanto maior for o número de variantes de ácidos nucleicos criadas mais provável será que uma 59 (ver moiecuia seja crxaaa com as propriedades desejadas rereison e Oster, 19 7 9 j Theor ti 2. O.L f 81; O 4 O / w' para uma descri ção sobre como ist o de apl 1 C 3. cL repertórios de anticorpo, s) . Rec :ente mente também f oí eonfi rmado pratícarnente qu e reperto r i. o s m. a') o re s de fago-anti .corpo r ia re alidade origina .m ma. is ant.ico j-yu çj o .1. K' ·.· com melhores afrnidad .e s de ligação do que repertórios mais peq uenos (Griffiths et ai / (19 94) Embo Jf 13, 3245-60), . Para 3- S S G gurar qu e são criadas variantes raras e as; sim. são c :apazes de serem seiecci .onadas, é desejáve1 uma bibliotec a com um tarr lanho grau Assim, a utilização qg mi c u o o up s u i a. s optim iame nte peqi isnas benéfica li S nu· aescn L o a u i..' j. π ϋ / d. a .os de acordo com a invenção podem , O sU> nec· GSSãri0 s P â 1 cl a reacçâo de

Adicionalmente aos ác microcá.psu I as ou compartimentos compreender ainda componentes replicaçao ocorrer. Outros componentes do sistema podem, por exemplo, compreender aqueles que são necessários para a transcrição e/ou tradução do ácido nucleico. Estes são seleccionados para os requisitos de um srstema especifico do seguinte; um tampão adequado, um sistema in vitro de transcr ição/repli caçã.o e/ou um sistema in vitro de tradução, íactor t 0 dos /"n Q ingredie ntes necessários, 0TO , y ; imas CE y O c poli .merase de ARN , nucl eótidos, ácre :1o s nuclerc OS s ou sirr téticos ) , ARNs de 11 :ansf erência, ribí s orna s a O O to / 0 o s suosr.r atos de uma re acção de inte ress 0 de mo do i r a sele; oção do produto do ger íe modificado. a permitir

Tampão

Um tampão adequado será um em que todos os componenteí lesejados do sistema biológico esteiam activos e deste modo ir; 60 depender dos requisitos de ca.d.a sistema, de reacção específico. e/ou químicas são receitas em vários (1989) Molecular Harbor Laboratory

Tampões adequados para reacções biológicas conhecidos na técnica e são proporcionadas textos de laboratório (Sambrook et ai., cloning: a laboratory manual, Cold Spring

Press, Nova Iorque). T r a di j. ç a o 1 n vi tro A repiicase pode ser proporcionada pela expressão de um hospedeiro adequado como descrito noutro local, ou pod.e ser produzida, através de transcrição/tradução In vi tro num sistema adequado como conhecido na técnica. 0 sistema de tradução ín vítro compreenderá normalmente um extracto celular, tipicamente de bactérias (Zubay, 1973, Ãnnu Rev Genetf 7,267-87; Zubay, 1980, Methods Enzymol, 65, 856-77;

Lesley et al., 1991 J Biol Chem 266 (4) , 2632-8; Lesley, 1995 Methods Mol Biol, 37, 265-78), reticulócitos de coelho (Pelham e Jackson, 1976, Eur J Biochem, 67,247-56), ou gérmen de trigo (Anderson et al., 1 988, Methods Enzymol, 101, 635-44). Estão disponíveis comercialmente murtos sistemas adequados (por exemplo de Promega) incluindo alguns que irão permitir transcrição/tradução acoplada (todos os sistemas baeterianos e os sistemas de extracto de reticulócito e gérmen de trigo ΙΝΤίί4 de Promega). A mistura de aminoácidos utilizada pode incluir aminoácidos sintéticos se desejado, para aumentar o número possível ou variedade de proteínas produzidas na biblioteca. Isto pode ser realizado carregando os tARNs com aminoácidos artificiais e utilizando estes tARNs para a tradução in vi tro oas proteínas a serem seleccionadas (Ellman et al., 1991, 61

Methods Enzymol, 202, 301-36; Benner, 1394, Trends Bíotechnol, 12, 158-63; Mendel et al., 1995, Annu Rev Biophys Biomol Struct, 24, 435-62). Pode ser particularmente desejável a utilização de sistemas de tradução in vitro reconstituídos a partir de componentes purificados, corno o sistema PURE (Shrmizu et al ( z U 0.1.) d a 1 r. ti 2. o t e o.o. * , X 3 * /51) .

Após cada ronda de selecção o enriquecimento da mistura de ácidos nucleicos naqueles que codificam as moléculas de interesse pode ser avaliado através de reacções não c o mp artimen talrzadas de transe transcrição -tradução acoplada. A rn; num vector plasmidico adequado ti fh é produz id· o a. partir de cl o nes purificação e ensaio. ira seleccronada é clonada nes individuais para posterior re-se, para além disso, a um mé 1 .odo oara genético, assim que o á.cido nucleico ;o do gene tenha sido seieccion ado peio Claramente, o próprio á eido nucleico pode codificando o método da invenção. Cl; ser direetamente expresso por meios convencionais para produzir o produto genético. Contudo, podem ser empregues técnicas alternativas, como será óbvio para os especialistas na técnica. Por exemplo, a informação genética incorporada no produto do gene pode ser incorporada num vector de expressão adequado vector, e expressa a partir deste.

:0MPART1MENTOS

Como aqui utilizado, o termo ''compartimento" é sinónimo de 'rnicrocápsula" e os termos são utilizados indistintamente. A 62 função do compartimento é permitir a co-localização do ácido nucleico e o poiipéptido correspondente codificado pero ácido nucleico. Este é, de um modo preferido, alcançado pela capacidade do compartimento para restringir srbsraneialmente a difusão das cadeias do molde e do produto para outros compartimentos. Qualquer actividade de replicase do poiipéptido é, deste modo, restringida a ser exercida num ácido nucleico nos confinamentos de um compartimento, e não outros ácidos nucleicos noutros compartimentos, Outra função d.os compartimentos é a de restringir a difusão de moléculas geradas numa reacção química ou enzimática que alimenta ou desbloqueia a reacção de replica.ção.

Os compartimentos da presente invenção requerem, deste modo, propriedades físrcas apropriadas para permitir o trabalho da invenção.

Primeiro, para assegurar que os ácidos nucleicos e poiipéptidos não difundem entre compartimentos, os conteúdos de cada compartimento dever ser isolado dos conteúdos dos compartimentos circundantes, de modo a que exista pouca ou nenhuma troca dos ácidos nucleicos e poiipéptidos entre os compartimentos durante um período de tempo significativo.

Segundo, o método da presente invenção requer que exista um número limitado de ácidos nucleicos por compartimento, ou que todos os membros num único compartimento sejam clonais (i. e. idênticos). Isto assegura que o poiipéptido codificado por, e correspondendo a, um ácido nucleico individual será isolado de outros ácidos nucleicos diferentes. Assim, o acoplamento entre ácido nucleico e o seu poiipéptido correspondente será altamente especifico. 0 factor de enriquecimento é maior com uma média um 63 ou menos espécies de ácido nucleico cionai por compartimento, sendo a ligação entre ácido nucleico e a actividade do polípéptido codificado tão apertada quanto possível, uma vez que o polipéptido codificado por um ácido nucleico individual será isolado d. o s produtos de todos os outros ácidos nucieicos. Contudo, mesmo se a situação teoricamente óptima de, em média, um único ácido nucleico ou menos por compartimento não for utilizada, uma proporção de 5, 10, 50, 100 ou 1000 ou mais ácidos nucieicos por compartimento pode mostrar-se benéfica na seiecção a partir de uma biblioteca grande. Rondas subsequentes de seiecção, incluindo compartimentalizaçâo renovada com distribuição diferente de ácido nucleico, irá permitir seiecção mais restringente dos ácidos nucieicos. De um modo preferido, ern média existe uma única espécie cionai de ácido nucleico, ou menos, por compartimento.

Além dú.sso, cad.a com.pa.rt imento contém urn ácid.o nuclei η o ; isto significa συ e embora algu ns compartimentos pos ; s arr permanecer vazios / O. O condições são a j a s tada s de modo a q estatisticamente, cacia compartimento irá conter, pelo menos, um, e de um modo preferido, apenas um, ácido nucleico.

Terceiro, a formação e a composição dos compartimentos não deve abolir a função da maquinaria para a expressão dos ácidos nucieicos e a actividade dos polipéptidos.

Consequentemente, qualquer sistema de compartimentalização .lizada deve cumprir estes três requisitos. O sistema(s) do (s) pode variar, c leper idendo da natureza os em . cada api icaçao da. invenção, como sei: iarista na técnica. precisa dos requisitos em caaa aplicação da. .invenção, como será óbvio para um e; 64

Estão disponíveis várias tecnologias para compartimentalização, por exemplo, gás afrons (Juaregi e Varley, 1998, Bíotechnol Bioeng 59,' 171 e IlcinOpGÇOS p- té Z cLÍOaT içados (ff uanq e Schreiber, 1997, Proc. N a 11, fh., rd '.J. « .O USA, 94,25). : Para diferentes aplicações podem : s e r de se3 áveis difere; ntes tamai ahos de compartimento e química s de superfície, como discutido em maior detalhe abaixo. Por exemplo, pode ser suficiente utilizar materiais porosos que limitem a difusão como géis ou alginato (Draget et al., 1997, Int J Macrornol 21, 47} ou materiais do tipo zeóiito. Além disso, quando é realizada PCR in situ ou PCR na célula, as células podem ser tratadas com um fixador de ligação reticulada para formar compartimentos porosos permitindo a. difusão de dNTPs, enzimas e iniciadores. uma larga variedade de processos de ou microencapsulação (Benrta, S,, Ed,

Esta disponive compartimentalização (1996). "Microencapsulation: metbods md industrial appli cat i o: r·. " i * Drugs and oharmaceutical Sciences. Editado por Swarbrick, U e Nova Iorque: Mareei Dekker) e podem ser utilizados para criar os compartiment os utilizados c ie acordo com a presente invenção. De facto, foram identificados na. literatura ma is de 200 métodos de microencapsulação ou compartimentalização (Finch, C. A. (1993) Encapsulai :ion and controiled release. Spec. Publ.-R. Soc. Chem, 138,35). Estes incluem ve; s i. c u -1. a & aquosas com envelope de : nembrana, tais como vesículas lipidica s (lipossomas) (New, R.R ,Cb, Ed. (19 90 ) . Lipossomes: a practica il approach. The practical appraoch serie s. Editado por R J. C A u ood, c. a a.ames, .3, L·. oxi o.;.c 1.: Oxford

Tin.ivers.ity Press) e vesículas de α CítíU l tensioactu ao lomco (van Hal, D. A., Bouwstra, d. A. & Junginger, Η, E. (1996) . Noníoníc surfactant vesícres conaining estradiol for topical 65 applications. Em Mi croen caps ulatioxi: methods and industrial, applícatíons (Benita, S., ed>), pp. 329-347. Mareei Dekker, Nova

Iorque.) . Estas são cápsulas membranosas fechadas de bicamadas únicas ou múltiplas de moléculas montadas d.e forma não covalente, com ca.d.a bica.rn.ada separada do seu vizinho por um compartimento aquoso. No caso de lipossomas, a membrana é composta de moléculas de lipidos; estes são normalmente fosfolípidos, mas também podem ser incorporados nas membranas esteróis, tais como colesterol (New, R.R.C., Ed. (1990). Líposomes: a practical approach. The practical approach series. Editado por Rickwood, D. & Hames, B.D. Oxford: Oxford University Press). Pode ser realizada uma variedade de reacções bioquímicas catalisada por enzima, incluindo polimerização de ARN e ADN, nos lipossomas (Chakrabarti J. Mol Evol, (1994), 39, 555-9;

Oberholzer Biochem Biophys Res Cotrnun. (1995), 207,250-7;

Walde, Biotechnol Chem Biol. (1996) ,

Oberholzer Chem Biol. (1995) 2, 677-82.;

Bioeng (1998) , 57, 216-219 ; Wick & Luisi, 3, 277-85) .

Com um sistema de vesícula de membrana em envelope grande parte da fase aquosa está do lado de fora das vesículas e, deste modo, não está compartimentai!zada. Esta fase aquosa continua, deve ser removida ou os sistemas biológicos nela contidos devem ser inibidos ou destruídos (por exemplo, por digestão de ÍLcidos nuelereos com ADNase ou ARNase) de modo a que as reacções estejam limitadas à.s microcápsulas compartimentalrzadas (Luisi et. ai,, Methods Enzymol. 1987, 136, 188-216) .

Também foram demonstradas reacções bioquímicas catalisadas por enzima em compartimentos de microcápsula geradas por uma variedade de outros métodos. Muitas enzimas são activas em soluções em micelas invertidas (Bru & Walde, Eur J Biochem, 66 1991, 199, 95-103.; Bru & Walde, Biochem Mol Biol Int. 1993, 31,685-92; Creagh et a.Z, , Enzyrae Microb Technol. 1993, 15,383- 92; Haber et al1993 INCAPAZ DE ENCONTRAR; Kumar et al. , Biepnys J 1989, 55,789-792 ; Luisi, P.L, & B., S.-H. (1987). Actividade e conformação de enzimas em soluções de mi celas invertidas. Methods Enzymol 136(188), 188-216; Mao & Walde,

Biochem Biophys Res Commun 1991, 178, 1105-1112 ; Mao, Q. &

Walde, P. (1991). Os efeitos do substrato na actividade enzimática da alfa-quimiotripsina em micelas invertidas. Biochem Bi ophys Res Commun 178(3), 1105-12; Ma.o Eur J Biochem. 1992, 208, 165"70; Perez, G.M., Sanchez, F.A. & Garcia, C.F. (1992) .

Aplicação de planos de fase actíva à análise cinética de lipoxigenase em micelas invertidas. Biochem J.; Walde, P., Goto, A. , Monna.rd, P.-A., Wessicken, M. & nui s i, P. L . (1994) OparinCs rea c t. i o n s ir 0 visited: enzymatic synthesis of poiy (adenylic acid) in micelles and self- reprodu cinç vesicles. J. Aon Chem. Soc, 116 , 7541-7547; Walde, P., Han, D, & Luisi, P.L. (1993) . ''Spectroscopic and kinetic studies of lipases solubilized in reverse micelles". Biochemistry 32, 4029-34 ; Walde Eur J Biochem. 1988 173, 401-9) tais como o sistema de AOT-ísooctano-água (Menger, F.M. & Yamada, K. (1979) . J Am. Chem. Soc. 101, 6731-6734).

Também podem ser gerados compartimentos através de polimerizaçáo interfacial e complexaçao interfacial (Wha.tei.ey, T.L. (1996) Microcapsules; preparation by interfacial poiímerísatíon and interfacial compiexation and their applications. In Microencapsulation: methods and industrial applications (Benita, S., ed.), pp. 349-375. Mareei Dekker, Nova Iorque). Compartimentos de microcápsnla deste tipo podem possuir membranas rigidas, não permeáveis, ou membranas semi-permeáveis. Microcápsulas semi-permeáveis rodeadas por membranas de nitrato 67 de celulose, membranas de poliamida. e membranas de lip.id.o~ poliamida podem todas suportar reacções bioquímicas, incluindo sistemas de multienzima (Chang, Methods Enzymol. 1987, 136, 67-82; Chang, Arti/ Organs. 1992, 16, 71-4; Lim Appl Biochem

Biotechnol. 1984, 10:81-5}, Compartimentos de alginato/polilisina (Lim & Sun, Science (1980) 210,908-10), que podem ser formados sob condições muito moderadas, também se demonstraram muito biocompativeis, proporcionando, por exemplo, um método eficaz de encapsulação de células e tecidos vivos (Chang, Artif Organs. (1992) 16,71-4; Sun ASAIO J. (1992), 38,125-7).

Também podem ser utilizados sistemas de compartimentai!zação não membr anosa com base em partição de fase de um ambiente aquoso num sistema coloidai, tais como uma emulsão.

De um modo preferido, os compartimentos da presente invenção são formados de emulsões; sistemas heterogéneos de duas fases liquidas imiscíveis com uma das fases dispersas noutra como gotícuias de tamanho microscópico ou coloidai (Becher, P, (1957) Emulsions: theory and practice. Reinhold, Nova Iorque; Sherman, P, (1968) Emulsion Science. Academic Press, Londres; Lissant, K, J., ed Emulsions and emulsion technology. Surfactant Science Nova Iorque: Mareei Dekker, 1974; Lissant, K, J,, ed. Emulsions and emulsion technology. Surfactant Science Nova Iorque: Mareei Dekker, 1984}.

As emulsões podem combinação adequada de r produzidas a partir de qualquer líquidos imiscíveis. De um modo preferido, a emulsão da presente invenção possui água (contendo os componentes bioquímicos) como a fase presente na forma de gotículas divididas finamente ía fase dispersa, interna ou 68 descontínua) e o liquido hidrofóbico, imiscível a matri z em que € ;sta; b Cf 0 tícr ilas 3 cl 0 3 "LI S p 0 ] dl spersa l, contínua OU í oxtei ma) . E ssas ernnl soe V. - gua-err ι-óleo" (W/O Isto po;. tSU. L a vante age aq uosa inteira. cc )nt.e; rido as c omponentes o ϋ mp artimentalizada em gotí cuia .8 C iiscretas (a fa se ex i terna, sendo um óleo hi d 8 0 fóbíco, n ao nenhuma das componentes bioquímicas e por (um " 6 leo") COS: a cL ila \ a fase nã são d .enomir ia da q1· ae a fas i oquí mu .cas e s t. fase ii aterna ) . lontér: gerais icnt A emulsão pode ser estabilizada peia adição de um ou mais agentes de superfície activos (agentes tensioactívos). Estes agentes tensioactívos são denominados agentes emuls.ifica.ntes e act uam na i . n ter dace 3.3. .3' asar) a l 3 epa.m 3Çã emu isifican tes pode m ; águ a-em-óle O / uma c c 3 q θ D 13 8 3 β nsro a crivos a.ge ntes emi a 1 s i f i c a r- 11 e s ind .u s t r i a 1 SUI :f act ~i v~\ Έ Oui _ inc luem age ntes ten sí o ·; 3 ΐ'Ί ieo (Scl. r.ck, Ί r\ / J. y t 56 O. r-‘ y' bita.no (Spa n™ 8 0; sor ΌI L 3 Π O (Tween™ 8 (Tr íton X-l 0 0). A ut.il izac ãO d e a e água/óleo para evitar (ou, pelo menos das rases, Muitos óleos e muitos recente listou irais de 160 GO dos cruais são utilizados como

Gower, Aldershot). Oleos adequados ?os de óleo mineral branco claro e não ICI) ou t-Octilfenoxipolietoxietanol A utilização de agentes tensioactívos aniónicos também pode ser benéfico. Agentes tensioactívos adequados incluem desoxicolato de sódio e taurocolato de sódio, É particularmente preferido desoxicolato de sódio, de um modo preferido, a uma cent.raçã.o d.e 0,5% p/v g ou inferior, A i n c 1 .usão desses agentes sioactívos pode, em 3 3CpjnS CdSOS; aument ar a expressão dos dos nucleicos e/ou a actividade dos poiipé :ptÍdo s. A adição de 69 alguns agentes tensioactivos aniónicos a uma mistura de reacçao não emuisifiçada aboie compietamente a tradução. Durante a em ulsific ação, todavia, o agente tensioacti vo é transferido a pa rtvir da . fase aquosa na i nterface e a a c t i r 'ida ide é restaurada. Zí adição de um 3. Cf 0 Ή 00 0. θ Ώ S ioactivo aniónico a. s misturas a sererr emulsifiçadas assegura que as reacçôes prosseguem apenas após compartimentalização. A criação de uma emulsão requer geraimente a. apl.icaçã.o de energia mecânica para forçar as fases em conjunto. Existe uma var i edade c le vias para re airzar is ;to, as qua is var i edade d .e dispositivos rr lecân ic O S F incluin d o agi com .O barra s de ai gi fação magnét aí. ca s, a g 11 c ^ d o .1. ; 0 3 tur o ina., d .1 spos.it i pás 0 escovas) y K ρ. ·ρ (ín r~· iuindo homogene iizadores de : m q ·£ ,·-' m-estato V — / hot de V á 1 v u 1 a de a11 a pressão e hom; i.0 í z a cl eis S cl j a c o j. o r de j hélice e o) , moinhos dispositivos de ultra-sons e "emulsffreação de s: theory and practice. (1994) In Wedlock, D.u. itrol. Butterworth-Heine- i.ea. t , r·' - ,·-χ ina" (Bec her, P, (1957 ) Emu ]. cd, Nova Iorque ; Drck inson, Emulsio ns and drople t size Oxford, v ΌΙ. PP - 191-2 5 7) . >s compart dmentos p i r·, q ,·-' --Ί ν_· Ο 1 s form; eralmente estáve: is com pouca. :p f 1. do S ou ác 1. dos : : Li tp 1. sn alimente, é co: "thecido que os em emulsões água-em-óleo são cferaimente estáveis com mouca, se é que alguma, troca de d: :os entre compartimentos, várias reacçôes bioquímicas prosseguem em compartimentos de emulsão. Além disso, processos bioquímicos complicados, nomeadamente transcrição emulsão. A às escalas Emulsions; P. (1968) genética, são também activos em microcápsulas de tecnologia existe para. criar emulsões com volumes até industriais de milhares de litros (Becher, P. (1957) theory and practice. Reinhold, Nova Iorque; Sherman, 70 r\ γ·1 /-"i i.on; κ j ., ecl s Nova amuision Science. Acaaemic rress, Emulsions and emulsíon technolog_ Iorque: Mareei Dekker, 1974; Lissant, K.J., ed. Emulsions and emulsíon technology. Surfactant Science Nova Iorque: Mareei

Dekker, 1984) . ) tamanho de compartimento preterido irá variar dependende dos requi .sitos precisos de quaiq uer processo de selecçãc individual. que deve ser reali Z 3 G O de acordo c om a presente invenção. Em todos os cas< os, na"5 7íTi 'f pj i im e< quilibrio óptimo entre o tamanho d; i biblioteca ger lética, 0 8; nrrq uecimento requerido e a concentras ão reauerida dG í :ompor ientr js nos c omp a r t ime ntos individuai s para alcançar a expressã o e reactivío Ía.d.e eficientes dos polipéptidos.

Os processos de expressão podem ocorrer, quer ín situ em cada microcápsula individual ou exogenamente nas células (e. g, bactérias) ou outras formas adequadas de sub- compartímentalização. Tanto a transcrição in vitro como a transcrição-tradução acoplada se tornou menos eficiente a concentrações de ADN sub-nanomolares. Devido à necessidade de apenas um número limitado de moléculas d e ADN Θ S L 3. T 0 Π presente em cada comparti: mento, isto estabelece, deste modo, um limit' superior prático no tamanho : oossível do compart :imento no qual transcrição in v itro é util m modo prefer ido, par. expressão in situ utilizando transcrição e/ou t radução in vitro o volume médio dos compartimentos é inferior a 5,2 x 10"lb m% (correspondendo a um compartimento esférico de diâmetro inferior

Uma alternativa é compartímentalização, e. g separação aa expressão e ilizando um hospedeiro celular. 71

Para a inclusão das células (em particular células eucariotas) podem ser preferidos diâmetros de compartimento médio superiores a 10 μΜ.

Como apresentado nos Exemplos, para co-localizar o gene da polimerase e proteína codificada no mesmo compartimento de emulsão, utilizaram-se bactérias {E, coli) sobre-expressando polimerase Taq como "veículos de distribuição". Células de E. coli (diâmetro de 1-5 uM) adaptam-se rapidamente aos compartimentos de emulsão, enquanto deixam espaço para quantidades suficientes de reagentes de PCR como trifosfatos de nucleótido e iniciadores (como apresentado na Fig. 2) . O passo de desnaturação do primeiro ciclo de PCR rompe a célula bacteriana e liberta a polimerase expressa e o seu gene codificante para o compartimento permitindo que a auto-replicaçâo prossiga enquanto destrói simultaneamente as actlvidades enzimáticas bacterianas de fundo, Além disso, por analogia com estratégias de início a quente, esta "subcompartimentalização" celular previne a libertação da activiclade da polimerase a temperaturas ambiente e os produtos de amplificação não especifica resultante, A concentração eficaz de ADN ou ARN nos compartimentos pode ser aumentada artificialmente através de vários métodos que serão bem conhecidos daqueles que são versados na técnica. Estes incluem, por exemplo, a adição de químicos de exclusão de volume, tais como polietilenoglicóis (PEG) e uma variedade de técnicas de amplificação genética, incluindo transcrição utilizando polímerases de ARN incluindo as de bactérias, tais como E. coli (Roberts, 1369 Nature 224, 1168-74; Blattner e Dahlberg, 1972 Nat. New Bioi, 237,227-32; Roberts et ai,, 1975 J Biol Chem. 250,5530-41; Rosenberg et al., 1975 J Bíol Chem 12 , 4755-4764), euca 197 9 s e. g. (ften et ai., is/v d .bi.oi uiem. , 6163-6173; Maniey et al ,, 1983 Methods Enzymol. 101, 568-82) 0 bactej ilólagc > f f: a i s Cf orno T7, T3 e SP6 (Mel ton et al., 1 98 4 N u Z"' 7 /"V Acids P.es. 12 , 7035-56.); a reacção de polimerase em C 8 ci ·; Ά (PCR) (Saikl et ai., 1 98 8 Scie nce 239,487-9 1) ; amplificação de replicase ζ)β (Mieie et al., 1983 J Mol Bíol, 171, 28 1-95 , o - rhii 1 et ãl < i Q 9 ϊ Cl .ín C, hera. 37, 1482 Chet ve ri n e Spíi :in. r 995 Prog Nu cleíc á tcids Res Γι L-·' -L B. í oi 51, 225- 7 0 f Kata n a e v et ai ., 1 .9 95 .REBS Lett • * f 359, R 9- 92) ; ; a. reac ção ΘΓΓ. c Pí rj \ 0 .1 1 i g 3. S Θ d -CR) (L a ndegri :en e 3.1 . , iOb8 Sciei " c e, 241; 1077 ... Q Ο n , \j / Tõ —' v~ any, 199 1 PCR Met hods Appl • ; 1, 5- ' J. G ; / Θ S - LS tema de repl ic aç cX Ο d .e se quê: ici . 3 3 uto- sustf X Π t, cX O (Fahy et 7 «* / 391 PCR Me th o CÍ 5' Appl . i, 2 5- 3 3 ) e ampi Lific 3. C ci- O de ; desl; o c ain .0 Π 3 0 c de cad 0 J_ cl (víalker et ai,, 1392 Nucleic Acíds Res. 20, 1691-6) . Técnicas de

.cação genetica requerem crciização térmica, tais como PCR " cL' mbém po dem ser u .0 i.n vr 7 iy y' Q ou s s ã.o teriT ΙΟ Θ S t . avei s .o- -traduçãc ) 3i C : splados

Lizadas se as emulsões e a transcrição i.n vitro ou sistemas de transcrição-tradução or exemplo, os sistemas de idos podem ser preparados a partir de um organismo termoestável, tais como Therro.us aquaticus) . O aumento da concentração de á.eido nucleico locai eficaz permite que compartimentos maiores sejam utilizados eficazmente. O tamanho do compartimento deve ser suficientemente grande para acomodar todos os componentes necessários das reacções bioquímicas que são necessárias para ocorrerem no compartimento. Por exemplo, ir vitro, ambas as reacções de transcrição e reacções de t ra.nscrição-tra.d.nçã.o acoplada requerem uma concentração total de trifosfatos de nucleósido de cerca de 2 mM. 73

Por exemplo, de modo a transcrever um gene numa única molécula de ARN curta de 50G bases de comprimento, isto rria reauerer um mínimo 500 moléculas de trifosfato de nucleósido por compartimento (8,33 x 10 moles} , De modo a constituir uma solução a 2 mM, este número de moléculas deve estar contida, num compartimento de volume 4,17 x 10"iy litr :os (4,17 x IO"""''1 rrú que se iosse estérico teriam um diâr retro de 93 nm. Assim, o limite inferior pref p r i d n p ara mi crocapsui as é um diâmetro de aproximadamente 0,1 um (100 nm) • Quando se utilizam iros de e xpr essao como veicuzos de distribuição, existem requisi tos muit r', menos resurztrvos no tamanho do compartimento. Basicamente, o compartimento tem de possuir um tamanho suficiente para conter o hospedeiro de expressão, bem como quantidades de reagentes suficientes para realizar as reacçoe s requeridas. Assim, nesses casos, S tl preferidos tamanhos c le compartzment .o maiores >10 uM. Através uma escolha apropria. d. 3. do vector uti 1 isa.d.o Para expressão r-1 ! - edeiro, r cl conc entr ação d' e mo e ' s ! sompart imentos pode ser rolada at: ravés da origem do or 0 result ar num número de as (e. 9- F.j» c ':g1í : eolS (pi TC) >1C d, pl 5: 3 0 -: aO, pSClOl: 1 - De igu :.ai modo ; * concen traç ão c lo pr oduto c Io gene pode ser rolada pe la q ” tl -Λ t O. r i . idade ci t r a vé, a da r jscolha d; O pIT1 omotor de essão e protc colo de e xpre j 3 q ac í e, g o i ndi i p a o total da 0 3 3 § q ver • ; ; c;> f uga 0 O 0 roino to j De um mo d. O QJX-0 f e r j_QQ a concentração do produto do gene é tão alta quanto possível Γ 0 cl C C t ém disso, a ut ilização de c o mp a r 11 me n t o s de alimentação a alimentação '3Θ a li o s r tratos a parti;] do e> rterior (ver y et a 1, (2001 .) , FNASf 98, 4552; 01) . A a I :i mentação de s de emulsão a partir dc exterior pode permit ir dimensões ertimento <0,1 μΜ para selecçoes de r ibozima na medida 74 em que os reagentes não precisam de estar contidos na sua totalidade no compartimento. 0 tamanho das microcápsulas ou compartimentos de emulsão pode ser variado simplesmente preparando "à medida" as condições de emulsão utilizadas para formar a emulsão de acordo com os requisitos do sistema de selecção. Quanto maior for o tamanho do compart imento, maior é o volume que será necessário para encapsular uma dada biblioteca de ácido nucleico, uma vez que, em última análise, o factor limitante será o tamanho do compartimento e assim o número de compartimentos de microcápsula possível por unidade de volume. 0 tamanho dos compartimentos é seleccionado não apenas tendo em consideração os requisitos do sistema de replicação, mas também os do sistema de selecção empregue para o ácido nucleico. Assim, os componentes do sistema de selecção, tais como o sistema de modi ficação química., pode necessitar volumes de reacçâo e/ou concentrações de reagente, que não são óptimos para a replicação. Como aqui apresentado, esses requisitos podem ser acomodados por um passo de re-encapsulação secundário; além disso, eles podem ser acomodados por selecção do tamanho do compartimento de modo a maximizar a replicação e selecção como um todo. É preferida a determinação empirica do volume óptimo do compartimento e da. concentração de reagentes, por exemplo, como aqui apresentado.

Numa forma de realização altamente preferida da presente invenção, a emulsão é uma emulsão água-em-óleo. A emulsão água-em-óieo é produzida, adicionando uma fase aquosa gota a gota a uma fase oleosa na presença de um agente tensioactivo compreendendo Span 80 a 4,5% (v/v), cerca de 0,4% (v/v) de Tween 75 80 e cerca de 0,05-0,1% (v/v) de Triton X100 em óleo mineral de um modo preferido, a uma proporção de fase óleo:água de 2:1 ou 3:1. Parece que a proporção dos três agentes tensioactivos é importante para as propriedades vantajosas da emulsão, e consequentemente, a. invenção também compreende uma emulsão água.-em-óleo possuindo quantidades aumentadas do agente tensioactivo mas com substancialmente a mesma proporção de Span 80, Tween 8 0 e Triton X10Õ. Numa forma de realização preferida, o agente tensioactivo compreende 4,5% (v/v) de Span 80, 0,4% (v/v) de

Tween 80 e 0,05% (v/v) de Triton X100. A emulsão água-em-óleo é, de modo preferido, formada sob agitação constante em frasquinhos redondos de biocongelação de 2 m.L com agitação contínua a 1000 rpm durante mais 4 ou 5 minutos após adição completa da fase aquosa. Ά taxa de adição pode ser até 12 gotas/min (ca. 10 pL cada) . A fase aquosa pode incluir apenas água, ou pode compreender uma. solução tamponada possuindo componentes adicionais, tais como ácidos nucleicos, trifosfatos de nucleótido, etc. Numa forma de realização preferida, a fase aquosa compreende uma mistura de reacção de PCR como revelado noutro local neste documento, assim corno ácido nucleico, e polimerase. A emulsão água-em-óleo pode ser formada a partir de 200 qL de fase aquosa (por exemplo mistura de reacção de PCR) e 400 uL de fase oleosa como descrito acima, A emulsão água-em-óleo de acordo com a invenção tem propriedades vantajosas de estabilidade térmica aumentada. Assim, não se observam alterações no tamanho do compartimento ou evidência de coalescência após 20 ciclos de PCR, como avaliado por ditracção a laser e microscopia óptica, Isto é apresentado na Figura 2. Adicionalmente, a reacção de polimerase em cadeia prosseguiu eficientemente nos compartimentos desta composição de 76 água-em-óleo, para se aproximar das taxas observadas na solução de PCR. As dimensões médias do compartimento aquoso na emulsão água-em-óleo de acordo com a invenção são, em média, 15 pm de dimensão. Uma vez formados, os compartimentos da emulsão de acordo com a. invenção não permitem a alteração de macromoléculas como ADN e proteínas em qualquer grau significativo (como apresentado na Figura 3A). Isto é presumivelmente porque o grande peso molecular e a natureza carregada das macromoléculas eliminam a difusão ao longo da camada de agente tensioactivo hidrofóbico, mesmo a temperaturas elevadas.

ÁCIDOS NUCLSICOS

Um ácido nucleico de acordo com a presente invenção é como descrito acima. De um modo preferido, o ácido nucleico é uma molécula ou construção seleccionada a partir do grupo consistindo numa molécula de ADN, uma molécula de A.RN, uma molécula de ácido nucleico parcialmente ou totalmente artificial consistindo em bases exclusivamente sintéticas ou uma mistura de bases que ocorrem naturalmente e sintéticas, qualquer uma das anteriores ligadas a um polipéptido, e qualquer uma das anteriores ligadas a qualquer outro grupo molecular ou construção. Vantajosamente, o outro grupo molecular ou construção pode ser seleccionado a partir do grupo consistindo em ácidos nucleicos, substâncias poliméricas, particularmente esferas, por exemplo esferas de poliestireno, substâncias magnéticas, tais como esferas magnéticas, marcadores, tais como marcadores de fluoróforos ou isotóprcos, reagentes químicos, agentes de ligação, tais como macrociclos e semelhantes. 77 0 ácido nucleico pode compreender sequências reguladoras adequadas, tais como as requeridas para a expressão efrciente do produto genético, por exemplo promotores, intensificadores, sequências de iniciação de tradução, sequências de poiiadenilação, sítios de separação e semelhantes.

Os termos "isolamento", "escolha" e "selecçâo", bem como as suas variações, são aqui utilizados. Isolamento, de acordo com a presente invenção, refere-se ao processo de separação de uma entidade de uma população heterogénea, por exemplo, uma mistura, de modo a que esteja isenta de, pelo menos, uma substância com a qual está associada antes do processo de isolamento. Numa forma de realização preferida, o isolamento refere-se â purifíca.ção de uma. entidade essencia.1 mente até à. homogeneidade. A escolha de uma entidade refere-se ao processo de isolar, de um modo preferido, entidades desejadas em relação às entidades índesejadas. N o que se refere ao isolamento das entrdad.es desejadas, os termos "isolamento" e "escolha" são equivalentes. 0 método da presente invenção permite a escolha dos ácidos nucleícos desejados a partir das misturas (bibliotecas ou repertórios) de ácidos nucleícos que contêm o ácido nucleico desejado. A selecçâo é utilizada para referir o processo (incluindo o processo de escolha) de isolamento de uma entidade de acordo com uma sua propriedade particular. "Oligonucleótiáo" refere-se a uma molécula compreendida, por dois ou mais desoxirrrbonucleótidos ou ribonucieótrdos, de um modo preferido, mais do que três. 0 tamanho exacto do olígonucleótido dependerá da função ou utilização fundamental do oligonucieótido. 0 olígonucleótido pode ser derivado sinteticamente ou por clonagem. 78

Os ácidos nucleicos seieccionados de acordo com a invenção podem ser ainda manipulados. Por exemplo, os ácidos nucleicos que codificam a replicase seleccionada ou os polipéptidos que interagem são incorporados num. vector, e introduzidos em células hospedeiras adequadas para produzir Iznhas celulares transformadas que expressam o produto genético. As linhas celulares resultantes que podem ser propagadas para análise reprodutível qualitativa e/ou quantitativa do efeito (s) de potenciais fármacos que afectam o produto da função genética. Assim, o produto das células que expressam o gene pode ser empregue para a identificação de compostos, particularmente compostos de pequeno peso molecular, que modulam a função do produto genético. Assim, as células hospedeiras que expressam o produto do gene são úteis para o rastreio de fármacos e é um outro objectivo da presente invenção proporcionar um método para identificar compostos que modulam a actividade do produto genético, compreendendo o referido método expor as células contendo o gene de A.DN heterôiogo que codifica o produto, em. que as referidas células produzem produto genético funcional, em peio menos um composto ou mistura de compostos ou sinal cuja capacidade para modular a a.ctividade do referido produto do gene se deseja determinar, e depois disso monitorizar as referidas células para alterações provocadas pela referida modulação. Um tal ensaio permite a identificação de moduladores, tais como agonistas, antagonistas e moduladores alostéricos, do produto genético. Como aqui utilizado, um. composto ou sinal que modula a actividade do produto do gene refere-se a um composto que altera a actividade do produto do gene de um modo em. que a actividade do produto do gene é diferente na presença do composto ou sinal (em comparação com a ausência do referido composto ou sinal). 79

Os Θ n s ci .1. o s oe ' σ S 0 . Γ 0 1 . 0 3. .b a s 0 G0 ceiu 1 a s POQ ΘΤΠ s 0 Γ C 0 n ce bido 3 cc )nst ruin do li nha 3 ce] .uiar e s et que a expressão de uma I- mote _ < na rep órte r, 7 Θ * uma prot e ina .c _ _L o. eilm ente ens ar ave -1- í ta j como p, aal acto ia se, cLC et i Itra n sfer; ase ΐ de cl orar; .f en ic ol (C A T) O i o uci f. Θ C ; a s e , Θ 0 ;tá deper: idente d .0 pro d.u to g enét ico . Um t a. 1 en s ar o pe irmrte a deteci çâo de c omp os to 3 que m odul am o .irec tamente a f unção .o t >rod uto GO ger 10 f t; •is comc comp OS tos que anta .cjoni z am 0 rj :dutc aer iéti co, O Li co; 7VO r's' St! 0 s que nibe; n ( ou p oten ciam outr as fu n Q 0 Θ s r·' Θ 1 U lares : 1ΘΟ e s s ári d 3 o ara c í acti .vida i d.0 do produ f- genétic Ά presente invenção tamben i proporc .1.0 i j. a um método para af ect :.a r; exoqenarnente os proc • gr o c o, dependent e s ao proauto GO gene que í oc trreiti nas células. A.s > célu las hospe dei ras que produ zerri Cl prodt o do gene recombinant e, e, g. célul d 3 de mamífero. podem ser CC olocadas em contacto com um compos to de teste, e o (.:) sei J. í s) ef e .11 o (s) m iodulador (e s) podem s ; e r e i \ t a o a v a .1. i ados COI nparan d pr Ο· V· e sp OSt.C s medi .ada pe i f' produto genético na. pr 0 0 0 r-, ç 0 CZ'. ausení ria do cc rmpo sto c íe te,st e, ou rei acionando cL re 3 pi O S L cl mec ri a d ti pelo p •roo Luto qenéi ric s células de teste. O: »1 v..- élulas de cont rolo (i , e. . , cé 1 u ]. .as q.1- ae não expressam o O roduto C[01 rético ), para a pre sença do com; po sto. i útil para escolher rs termos "biblioteca", de acordo com o seu que uma biblioteca de de produtos genéticos, a partir de misturas de O método da presente invenção bibliotecas de ácidos nucleicos. Aqui, ''repertório" e "mistura" são utilizado significado comum na técnica, de modo ácidos nuclercos codifica um repertório Em gerai, as bibliotecas são construídas bibligt:

;jE

DOS N1JCLEI 80 idos nu ciei cos Θ selecção rnicr d _L ácidos nuclei; tos e possuem propriedades que facilitam a escolha, iniciai de um ácido nucieico a partir da biblioteca tilizando a presente invenção irá, na maior parte dos casos, requerer o rastreio de um grande número de variantes de ácidos nucieicos, A.s bibliotecas de ácidos nucleicos podem ser erradas numa variedade de modos diferentes, incluindo o seauinte.

Podem ser clonadas misturas de ácidos nucieicos que ocorrem natura imente, a partir d e ADN genómi ato ou ADNc: (Sami )rook et al,, Q Q 0 lv ± J '.J m i\ lolecular cloninç: a laborator y manual. Cold S íprinç Harbor Labora tory Preí 3S, Nova Iorque.}; ] por exemplo, bb bliotecas de a.n tico rpo em f; , pr.e parados por repertórios de ampi ificação de PC: R de gen . Θ S G 0 BI ti corpo de dadores imunis a.d.os ou não imunizados demonstraram ser fontes muito eficazes de fragmentos de anticorpos funcionais {Winter et al., 1994 Annu Rev Immuriol, 12 ? 4 33-5 5. r Ho ogenb oom, H.: R. ( 1997) : Trends Bi o t e cl' m o 15, An “ 7 0 ) > De s .1 .gr ί ng and optimizing 1 íbra.r- y s 0 í a :cti or : S tr atec l cc J. t 0 r CÍ0 ΠΘ rat. i n g h iqh -affi nrty an tibo d.ies . Tren cls ti iotec km D1, 15, 62 - 7 0 Hoogenbo om, H. R. , (1997; : Tr ends B 7 Qteeti n r> i 15, 62- 7G) . a b i bl iotec as de O'0 j'j s poder n ta .mbém í íer pr epar; a.d.a s coda . r .1 canci to C' cs p ^ y p por exen iplo, Sir b. th, G. P. (19 8 5) Sc i en c tb1 f 228 a 15 - 1 r P armle Y r S . F 0 S mith, G •p · (1 988) Ge n e, 73, 3 0 í ) -1 8) c ;u pa v- -j- 0 CiO genes t V' 0 '£. r por exemplo f J-jQ wman e t al., (199 I) Bi . O ch r; :ΪΓ'Χ S t' ry í 30 ,1 0832- 8} ou mis tu r a s de gene :s (ver , por exeim f Nrss im, ’β f Η o og enboo m et d.!. f (1994) Emt /O J, 13, 6 92-8) a tr de u rn oligonucreótido aleatório ou dopado rnteric bibliotecas também podem ser preparadas introduzindo mutações em ácidos i). u c 1. e -j- c o,, oa m i. o l. u r a. s d e o c .j. o. o ,, i j u o j. e .r o o s a o e a 1 o r r ame η 1 e através de uma variedade de técnicas in vivo, incluindo; utilizar "estirpes mutadoras", de bactérias tais como E, coli mutDõ (Liao et ai., (198 6) Proc Natl Acad Sei USA, 8 81

En g, 3,7 13-9; Low et al„, ut 1 ido o q ί q rpm a de ócito s B (Yela: mo s (ii L* Cd. -L. * f ções alea tórias também podem lo in vi t ro por mu.t agénicos . UV (ver Friedr oerg et ai,, (1996), J Mol Biol, anticorpo de hipermute (1395), Nature, 376, 22 ser introduzidas tanto in vivo corno in químicos, e irradiação ionizante 1935, DNA repair and mutagenesis. ASM Press, Washington D. C) , ou incorporação de análogos de bases matagénicas (Freese, 1959, J Mol. Biol., 1,87; Zaccolo et al., ¢1996), J Mol Biol, 255, 589-603). As mutações "aleatórias" podem também ser introduzidas nos genes in vitro durante a polimerizaçao, por exemplo utilizando polimerases à prova de erro (Leung et al., (1989), Techníque, 1,11-15).

Pode ser introduzida diversificação utilizando recombinação homóloga quer in vivo (Kowalczykowski et al., (1994) Microbiol

Rev, 58, 4Cd .-65 0 \X _L 11 Stemmer, (1 994) Pr oc in vitro (Stemmer, (1994), Nature, 370,389-3,;

AGENTE t d. 'ti O' '-D j o termo "agente inclui, mas não e stá o ou mol écula, em que uma moléc u 1 a o o ue ser 1. O cl. f Li ma moléc U. u. di. id .. Lócfica 0 f 0 c tora e/ou um i f ican« a o um agente, tal como r uma moléc ui a uma prot eina, um poli péptido, um l péptido. um ácido nu ícierc’ o de pe Pt ido (PNA) , um vir us, .po vi rus , um nucleót: rdo, um r rbonucieotr do, o de r um nu c lec utido, r :m análogo sintético de um nu cie ótido modificado, um ribonucleót ido .ínoáci o. o, um análog o de amí noácido, um

Como aqui utilrzado limitado a, um átom inorgânica ou orgâ.nrca ácido nucieico c biológica efector; ácido nucieico, i urna partícula do tipo um análogo sintético de u um ribonucleótido, modificado, um ; 82 aminoácido modificado, um análogo de amínoácido modificado, um esteróide, um proteoglicano, um lípido, um ácido gordo e um hidrato de carbono. Um agente pode estar em solução ou em suspensão (e. g. , na forma cristalina, colordal ou outra de partículas separadas). 0 polipéptido pode estar na forma de um monómero, dímero, oiigómero, etc., ou de contrário, num complexo.

POLIPÉPTIDO

Como aqui utilizado, os termos "péptido", "polipéptido" e "proteína" referem-se a um polímero em que os monómeros são aminoácidos e estão unidos em conjunto através de ligações peptídicas ou de persulfureto. "Polipéptido" refere-se ou a uma cadeia de aminoácidos que ocorrem naturalmente de comprimento total ou a um seu "fragmento" ou "péptrdo", tal como uma região seleccionada do polipéptido que se liga a outra proteína, péptido ou polipéptido de um modo modulável por um ligando, ou a um polímero de aminoácido, ou um seu fragmento ou péptido, que é parcialmente ou totalmente não natural. "Seu fragmento" refere-se assim a uma sequência de aminoácidos que é urna porção de um polipéptido de comprimento total, entre cerca de δ e cerca de 500 aminoácidos em comprimento, de modo preferido, cerca de 8 a cerca de 30 0, de um modo ma is preferido, cerca de 8 a. cerca de 200 aminoácidos, e de um modo ainda mais preferido, cerca de 10 a cerca de 50 ou 100 aminoácidos em comprimento. "Péptido" refere-se a uma sequência de aminoácidos curta que tem 10-40 aminoácidos de comprimento, de um modo preferido, 10-35 aminoácidos. Adicionalmente, podem ser incluídos aminoácidos não naturais, por exemplo, β-alanina, fenilglicina e homoarginina. Também podem ser utilizados aminoácidos que se encontram 83 o cr ;q /-o /-> :odifiçados geneticamente, na presente 3 c Lminoác ddc >s utilizados 11 cl presente inr isnção i r- um do (.d isórru sros ópti co s D- ou L~ . 3 CL O óme; ÇQ ] , - Adi c lonaImente, tamb iém s ;ão ú t θ Λ. S né t i .--1 /-K ri t g. em seqi •jtir l C λ. cl 3 lig ante s d. a pre sente in venção (ver Cr. O rC atola í "! r \ -1- O O O \ w -p ; ; em >_í oc. h 1" ry of Arai no a ds, Dt-.vr-vr ^ -- ides and in, ed., Mar cel Defcker, N OVi a. I o r que, 3 + Z b 7 1 iç ação a 0 Γ 501 ip iéptido" é Li ma. mc fiécu'. i a. y όθ um normaImente, que nã invenção. Todos poiipéptidos da Chemisrry fino.

Proteins, Meinsts Uma. "molécula de modo preferido, um polipéptido, proteina ou péptido, que possui a capacidade para se ligar a outro polipéptido, proteína ou péptido. De um modo preferido, esta capacidade de ligação é moduiávei por um ligando. 0 termo "sintético", como aqui utilizado, significa que o processo ou substância descrita não ocorre ordinariamente na natureza. De um modo preferido, uma substância sintética é definida como uma substância que é produzida por uma síntese ou manipulação in vitro. 0 termo "molécula" é aqui utilizado para se referir a qualquer átomo, ião, molécula, macromolécula (por exemplo polipéptido), ou combinação dessas entidades. 0 termo "ligando" pode ser utilizado indistintamente com o termo "molécula". As mo i écui as dn a c ordo com sol ução í 0 u p· adem es imo bili z acla .3 . e: ias podí dí s cret p Q CU z: r ou p Ό O Íem ser cr mo d o pi :ef ei ; 1 d.c ’ f :.: molécu poi rpép t rdo s apr :e senta. d. os bac teri óf ag os. De um modo com tl J Lnvencac ! íi icluern. br com a invenção podem estar livres em : parcialmente ou completamente podem estar presente como entidades plexadas com < 7 utr, as moléculas. De um l s d e a c o r d o corri. a invenção incluem na. superfic .1 Θ de partículas de iiS P1Γ Θ ΐ Θ 2Γ ΐ Cl O f a s moléculas de acordo íotecas de po ripé otidos aoresentadas 84 corno partes integrais das proteínas de envelope na superfície externa das partículas de bacteriófago. São conhecidos na técnica métodos para a produção de bibliotecas codificando poiipéprídos aleatorizados e pod.e;r ser aplicados na presente invenção. A escolha aleatória, pode ser total, ou parcial; no caso de escolha aleatória parcial, os codões seleccionados codificam, de um modo preferido, opções para aminoácidos, e não para codões de terminação. ΕΧΕΜΡΊ

Exemplo 1, C onstr ução de pl asm!deos de 0X0] sessão de po 1 íme. r a s θ Tã(j n grelha de le iitura aberta cia f lolimerase 'i'3,Q é a. rrpli ficada po r pc: E a oartir de ADK genórnlco de Th e nn u s a c ruati CUS ' uti1rzando os ί n i .ciadores 1 & 2, cortados com Xbal « Sal I e 1 .1 gados em pA SK7 5 {ò K β ir .ί.' a A. J. 9c:* 4 f Gene 151, 1 '>. 1 > j. ... ! ) cortado s co: tn. Xb, 3.& Ò 3.* pASi 17 5 é um vec otor de exprç issac ) que dir ige a s íntese de pr otei: nas estranhas Θ1.Γ: E h coli s ob c ί controlo ÍX. Cl tran; scricão do promotor/operador tetA. 0, s cio nes s 1n i cia dores 3, 4 act iva (poi Taq) m p s m / X' / u Jii/ JV j frc V Θ C (Strat agene] l . Os (Doubl a 4 c 19 98, Na t u i e 391 para a muta< ção uí 5 e d igest; ÍIO il0 rastreados para as inserções utmzanao os 3, 4 e ensaiando para a expressão de po lime rase Taq (ver abaixo) , 0 mutante inactivo de poi Taq construído utilizando Quickchange mutagenesis resíduos mutados são críticos para a actividade i I, 1998, Nature 391, 251; Kiefer J.R. et al, 304), Os clones resultantes são rastreados .ilizando rastreio por PCR com os iniciadores 3, diagnóstico dos crodutos com FmlI. Os clones 85 iva (ver mutantes são rastreados para. a expressão de pol Taq âDclixO) ,

Exemplo 2. Ensa.ro de Expressão e Actividade da Proteína Cél ulas TGi trans formada s são cult i vai das em 2 xT Y com 'J / -i. mg/m li de ampici1ina Para a. expressão , CU : um G 1. cl. para 0 0 'Ut.ro s ;ão d.ii.uida .s 1/l.OC i em mer o 2x1 :Y fr asco e cu . 11.1V 3 .das até uma OD60 0: ==0,5 a 37 O -Λ X- . XI 0 -Cp X 0 s s âo de r proteína é induzida pela cl cl cão de : tetracicl ina ani dra até uma c ci n c ent ", x ci ç a o finai de 0,2 pg/n iL. Ap; is ma.is 4 h o x a s < de incui ba.ção a. 2 > X O ^ a o cél. u d. as S 8 0 r 01 oolhid as por centní lugação, la vada: s urna vez, 0 ress uspe usas n um volume igual d ie tampã o de pol i mer rase Su perTa q a 1 X (KC 1 a 5: j mM, Trrs-HCl a 10 mM (pH 9,0) t Triton X--10 0 a t; f X Ά , Mc ύ ·—' ,:. ^ 1, b mM) (Ηϊ Bi oteehno! logy Ltd, Ç' arnbr ide ?e Re :rno Un i d. o) . 7\ τ' b-j célul as x ci v a cl a; 20 ib d O adrcior i a cl a s dir :ec i ramente cl uma mis t \X X" cl de re. acção PCR (2 pL por 3 0 l-i L c ie vc )lu; me cie reacç :ao) e omp reen ΙΐΘΓΊίΙϋ P x a s ni -X ο Θ o molde ( 20 ng), 1 η i c lado r; 0 s 4 a x v 8 1. μΜ cada ) , d. NTPs (a 0,25 mM) , tampão de po 1 ímer ' 8 S 0 S up )erTaq a. 1. X í 0 cobe rto com uma camad .a de óleo m dnerai, As reacç ões são incubada s dure arte 10 mi n a 9 4 °C par :a lr bertc XX' a pol :r· ± CX ‘-j cias céiu ias e dep >ois termoí siciado com 3Í ) cic : .1. o s do per.fi 1 94 o (1 m i n) , 5 a u (1 min) , 72 °C ( 2 min).

Exemplo 3. Emulsificaçao das Reacçoes Amplificadas

emuisificaçâo das reacçoes é de mistura de reacçâo de POR realizada como se segue, íplasmideo de expressão de 86 20!

Taq (200 ng) , iniciadores 3 e 4 (1 uM cada) , dNTPs (0,25 mM) , polimerase Taq (10 unidades) ) são adicionados gota a gota (12 q o tas/min) à fase o 1 < C -Q an 8 0 a. 4 f 5% (v / \ / v } Tr iton XI. 0 0 a 0 , 05 (1 000 rpm) er oos o mbridge MA) . ApÓ: s a pr ossegue Ir LJ. .í ;ante mal então trar is feridas p? (1 00 pL/tu .bo) e a PCR 94 °C (1 min ) , 60 O U in pç a] r1 n 5 min a 94 pe .1. ci cLíl,’i vti ig de um vo( du r a n r. e 2 mi natos an amplificado · á vis Li O. gé r s oe agarose ut: ex θΓί Íp 1. o o - Sanbrook. Mo .i. Θ CU λ. 3..:Γ Cif m i.ng: A 1'" 3, Cold spr ing Harb< Para a. ernu 1.; -;if: po 1imerase T '3 O f O pl asm!deo de expre 1S 8 c eosa (óleo minera; igma)) na presença de (v/v) (Srgma) e biocongelação redondos de 2 mL (Gostar, ção completa da fase aquosa, a agitação minutos. As misturas emulsificadas são rubos de PCR de parede fina de 0,5 m.L ealizada utilizando 25 ciclos do perfil min) , 72 °C (3 mm) após ama incubação aboratory Man u a 1. / Laboratory Pr ess;

As misturas de reacção são recuperadas olune duplo de éter, vórtice e centrifugação da remoção da fase de éter. O produto iiizado através de electroforese em gel em utilizando métodos convencionais (ver, por ritsch, e T. Maniatas, 1989, segunda Edição, Livros

Ias células totais aue exoressarn de Taq e polimerase Taq num cocktail de reacção são omitidos e em vez disso são adicionadas 5 X 1(1' cérulas de E. coli TG1 induzidas (contendo a polimerase Taq expressa assim como o plasmídeo de expressão) em conjunto com. o cloreto de tetrametilamónio aditivo (50 piM) , e ARNase (0,05% p/v, Roche, Reino Unido) , O número de ciclos de PCR é também reduzido para. 20, 87 amplo 4, Auto i (1) tj aç. ao d.O gene da. snto- Tot ai wt modo a. testar a ) i igacy ã.o ge Γ1 Τ'1, τ U ·; Dn-fpr iótipo duran ta "> ;3 r·» v »3· ·-' ; for a.m mistur adas (•ί Cl· lu. .1.8. S t szpres sando quer p· típc J s elvagem i (Ta q wt } OU ( f ra gmento Stof f (nas oon dições do tamp ·' 3.0 ) { 1 3 Cj sf) ( Ft C. Lawyer, • h, ,·'·/ o- uid d -d 7ip pl 2, 2 7 5-87 ( j_ 99 3} ) a uma prooc rrção c Ta a de sujeitando-as a CSR quer em solução ou em emulsão. Em solução, a Tag sf mais pequena é amplificada de um modo preferido. Contudo, era emulsão há quase exclusivamente auto-repricaçáo do gene Ta q wt de comprimento total. (Figura. 3B) * 0 número de células bacterianas é agastado de modo a que a ma.io.ria dos compartimentos de emulsão contêm apenas uma única. célula, Contudo, porque as células são distribuídas aleatoriamente entre os compartimentos, é •reavei que uma rracçao menor concenna duas ou mal s célul a s. Como compar timentos Π 3 O parecem permut ar A.DN mo Ide 1 (Figur a 3A) , a quant:! ,.da.d.e ma is peq uena de amp1i f 0 C cl Ç 3. 0 de 1 ciQ sf na emulsãc ; tem O 0 V ci v7 G dmente origem nestes compar tím entos .. Cia Lr ame nte, a S Ό. cl abundânc ia é b arxa e. como t .al, imp rov a ve irr lente 8. f Θ C tará a s selecções. I 7e fact .o, numa selecç ão de L O S te, um úr rica rond. a de C SR é st i f Ί r·' ή pl· rv te para isolar clones de Tag wt de um excess! d de I 0::’ vezes de um mutante de Tag inactivo.

Uti 1 i ..o 3 U G 0 PCR à. prova. de erro, foram ρ r e o a r a d o s g o i s epertório s de mutante S 1‘ã.Cf 31Θ 8. t. Ο Γ i O S (LI (u. P. Vartanian, M, enry, S. Wain- Hobson, Nucleic Ãcici Res . 24,262 7-2631 (1996)) ;Tl· 2 (M. Za coo lo , Ξ. Gh .erardi, J Mol Bi ol 285, 775-83 (1999) .)

Apenas 1-5% dos clones PCR, mas uma única rond 1 ou L2 são activos, como avaliado por de selecçâo de CSR para a actividade da polimerase em condições de PCR convencionais aumentou a proporção dos clones activos para 81% (Li*) e 77% (L2*).

Exemplo 5. PC.K Mutagénico

As variantes do gene itilizando dois métodos dif« da polimerase Taq são construídas entes de PCR à prova de erro. 539-603) 0 primeiro utiliza os análogos de nucleósido dPTP e (Zaccoio et al., (1996) J Mol Biol. 255,

Resumi.dam.ente, é realizada uma reacção de PCR de 3 ciclos compreendendo KC1 a 50 mM, Tris-HCl a. 10 rnM (pH 9,0), Tri tonX-100 a 0,1%, MgCI2 a 2 mM, dNTPs (500 pM) , dPTP (500 μΜ) , dLTP (500 pM) , 1 pM de ADN molde, iniciadores 8 e 9 (1 μΜ cada), polimerase Taq (2,5 unidades) num volume total de 50 pL, com o pe rlil tér: mico de 94 °C Π min. ) , 55 °C í 1 mir , \ 1 + } r 7 2 °C (5 min) . w e n tão t. r ansferida uma fracção de 2 pi, para uma η.'0dCÇ3 O GΘ PCR. de 100 pL compreendendo KCI a 50 mM, Tris-HCl a 10 mM (pH 9,0), Tr itonX-10 0 a 0,1%, MgCl 2 a 1,5 mM, dNTPs (250 pM) , iniciadores 6 Θ 7 (1 pM cada), polime rase Taq (2,5 unidade S 5 Esta reacção é ciciada 30 x com o perfil 94 °C í30 secundos) , 55 °C í30 . O produto amplificado é purifícadc em pASK75 como acima para criar ; segundos), 72 °C a partir do gel biblioteca L2. (4 minutos) e cionado dNTPí O segundo método utilrza uma combinaç

MnCl2 para introduzir erros durante a PCR. A mistura de reacçãc com O '·' eende KCI a 50 mM, Tris-HCl a 10 mM (pH Γ\ i~\ \ ;vi ’ In t;onX- -100 a c Ό ; MgClj a 2,5 m M, Mn Cl 2 a 0, 3 mM, 1 pM de ADN mo. i. G 0 / dTTP, dCT P f dGTP (todos a 1 mM), dATP ( MOO pM) inic :iadores 8 Θ 9 (1 uM cad a) e po limerase TãQ (2,5 uni dades). },] q ;· α reacção 0 C1 Lciada 89 30 x com o perfil 94 °C (30 segundos) , 55 °C (30 segundos) , 72 °C (4 minutos) , e os produtos amplificados são clonados como acima para criar a biblioteca LI.

Exemplo 6. Protocolo de Selecção

Para a selecção de polimerases activas, as reacções de PCR em emulsões sã.o efectuadas como descrito acima mas utilizando os iniciadores 8, 9. Para a selecção de variantes com termoestabilidade aumentada, as emulsões são pré-incubadas a 99 °C até 7 minutos antes dos ciclos como acima. Para selecção de variantes com actividade aumentada na presença do inibidor heparina, o ultimo é adicionado a. concentrações de 0,08 e 0,16 unidades/pL e os ciclos são efectuados como acima. Os protocolos detalhados são apresentados nos Exemplos a seguir.

Os produtos de amplif icaçã.o resultantes d.os compartimentos contendo uma polimerase activa são extraídos da emulsão com éter como anteriormente e depois purificados por extracção fenol-clorofórmio convencional. São a seguir adicionados 0,5 volumes de solução PEG/MgCÍ2 (30% v/v de PEG 800, 30 mM de MgCl2) , e após misturar, a centrifugação é realizada a 13 000 RPM durante 10 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante (contendo iniciadores e dNTPs não incorporados) é rejeitado e o precipitado ressuspenso em TE. Os produtos amplificados são depois purificados em colunas de centrifugação (Qiagen) para assegurar a completa remoção de iniciadores. Estes produtos são então reamplifiçados utilizando os iniciadores 6,7 (que são externos aos iniciadores 8 e 9) numa reacção de PCR convencional, com a excepção de que apenas são utilizados 2 0 ciclos. Os produtos reamplifiçados são purificados a partir do 90 gel e reclonados era pASK7 5 cc plaqueaclos e as colónias sãc restantes são raspados para diluídos para D06oo=0,1 e cult uno acima . Os transfo imantes são rastreai G ti 3 O 01 1 0 3 0 segue. Os 2xTY/0 f1 mg/mL de ampicilina, ivados/in; ãuzidos como ci C "j. rílci p cl T. ci

Ot.OC( repetição de selecçã.;

Exemplo 7. Protocolo de Rastreio de Gol

As colónias são picadas para uma placa de cultura de 96 poços (Gostar) , cultivadas e induzidas parar expressão como acima. Para rastreio, 2 uL de células são utilizadas numa reacção de PCR de 30 uL para testar a actividade, como acima, numa placa de PCR de 96 poços (Costar) utilizando os iniciadores 4 e 5. O gradiente de temperatura do bloco é utilizado para o rastreio de seleccionados com termoestabilidade aumentada. As reacções são pré-incubadas durante 5 minutos a temperaturas

Exempi Poiimerases

Ensaio pr :tividade Catalít: v a r ia.n do de S G 0 4 f 5 a 9 Q ° r antes dos c i c 10 s convenc lonais /•ί r-· / -v-· , jr~j aci lUci; com os ini ciac iores < i e b ou 3 e 4. Feira 0 rastm eio de por ime rases compat íve: is com h 0 ρ a x a π a, 3. heps l r i π a Θ adieio nada a u: iidade rs/30 μ: í.j dr urante 0 rastreio de ( colónias por ; PCR .1 X O for mat o de 96 poçc • e As pol a. m 0.11 a s 0 s a c l .ivas são ent aiad . a s num a v aried a de de C- 011: centra;: :ões de hepa: cina ' variando de s de 0, 0 0 7 cr 3 ,75 uni d ades/30 pL e comp crradcr ao tip 0 sei vageme ietermir iados útil izando u m substrat 3.1., ( 1990) J. Bi ol. Chem, 265 cã.0 fin. ai (25 uL) t compre ende tampa O Kcat. e Km (dTTP) homopoi imérico (Polesky 14579-91). A mistura de 91 pol i (d.A) >-> i igo (d.T \ / (500 nM rarí áve r s cle icc-3; P] dl TP (aprox i n i c i a . '.o. Cl po. r adi ção d( 5 5 pL d ? para prodi j z i r uma concen t ra.çã A.s re acçõ Θ s kl: d. 0 / com .0 no Exem.pl S cl i Z °c: e mistu .rada .s com EDTA 14 mm. Os fi i 1" t Ç) p são 1 avados e :mplo ] 0 s p d T ci .metr crnetrco X όupsi"i'3.Q (ηΤ BiOl0CJd.; s Pharmacia) , e concentrações 0,01 Ci/mmoie), A reacção fim de enzima entre aplicadas a filtros DE-81 ck actividade medida como no l são determinados utilizando o curva, convencional de Lineweaver-Burke. As experiências utilizando 50% de substrato homopolimérico reduzido não apresentara grande diferença na incorporação de dTTP pela polimerase, indicando que está presente em excesso suficiente pa.ra validar o protocolo de análise cinética utilizado.

Exemplo 9. PCR Convencional em Compartimentos Aquosos Numa

Para estabelecer quais as condições nos compartimentos aquosos presentes numa emulsão que são permxssivas para a catálise, uma mistura de reacção convencionai é emuisifiçada e O PCR é realizado. Isto leva à amplificação do gene da Taq polimerase com o tamanho correcto no plasmideo molde, com rendimentos suficientes para permitir a visualização utilizando electroforese em gel de agarose convencional.

EmuIsrfreação de E. cofu sequente PCR para. Amp .1 col.i que expressa i c.i.q e Subsequente PCR para

Polimerase 92

As células E „ col. i que expressam Taq po] .imerase são emulsífiçadas e O P(A R é realizado utilrzando ini cradores que flanqueiam a ca ssete da polimerase no vector de expressâ; emulsíficaeão de até 5 x 1.Oh cérulas (por 600 uL de /olume rc leva à formaçã o cie um. produto disce.rnive.1 3. julgar pera electrof orese eir 1 gei de agarose. As céluias s egre gam-se d Ítd 3 L 0 que as condições são da polimerase peia Tag emulsões semelhantes s s por mL (Tawfik D. & , 652) . 0 grande número permite a selecção a ; s aleatórias. mocio em compartimentos aquosos, em t adequadas para auto-amplificação do gene porimerase expressa. Estima-se que as contenham cerca de 1 X IO10 compartimente Griffiths A. D. (1998) Nature Biotech. 16 de células que podem ser emulsífiçadas partir de diversos repertórios de proteína

Exemp)

Manutenção dí

Liga·

eenotiDO

Fenótioc em

Para ser viável para um método de selecção, a maioria dos compartimentos aquosos na emulsão deve conter uma única célula, e a integridade d.os compartimentos deve ser mantida durante os ciclos térmicos, Isto é testado por inclusão nas células de emulsão contendo um molde competidor distinguível pelo seu pequeno tamanho.

As células E. coli que expressam a Taq pol imerase são co-emulsifiçadas com E. coli que expressam o fragmento Stoffel a uma proporção de um para um. 0 fragmento Stoffel é pouco activo sob as condições utilizadas em emulsão, e, deste modo, a amplif icaçã.o da sua cassete de expressão pelo mesmo par de iniciadores utilizado para auto-amplificação de Taq é o resultado da co-compartimentalização com uma célula que expressa 93 a Taq polimerase ac tiva. ou de fuga de Taq poi imerase entre compartimentos. Após PCR, ve rifíca-se que a grande maior: 1 a de produtos corresponde ao gene da Taq polimei :ase activa, vali dando assim a premissa de uma cél li .]. a por cornpa: ruir :ΘΙ1 L O O Li a. Ο V Θ .1. (ver

Fig. 2, Ghadessy et ai (2001), PNÂS, 98,4552).

Exemplo 12. Teste de Selecção de Taq polimerase Activa versus Inactiva

Para demonstrar que o método pode seleccronar variantes potencialmente raras, é co-emulsifiçado um excesso de 10° células que expressam poliraerase inactiva versas as que expressam a r-> -}·' ma activa. Após PCR e clonage m do prod uto amplifi c a d o, um ni co rastreio de expressão utili z ando um formato de 96 pc >ÇOS nd .icc ;u um enriquecimento de ICE ve zes p; ara a d o1r me r a s e activ

Exemplo 13. Evolução Dirigida de Variantes da Taq polimerase com Estabilidade Térmica Aumentada A. s poi imerases com termoestabi ( 1idade aumentada são de potencial de impor rtância prática, reduzindo a i aerda de actividac le durante o s ciclos térmicos e permitindo tem .per aturas de desnat ruracão elev; adas para a amplif :i cacao de moldes .Γ1 CO S Θ;Γ! GC. Assim, foi inrcialmente utilizado o método de selecção da invenção ] para a evolução c lirigida de variante s de Taq com termoestab ilidade aumentada. começando a l partir de bibliotecas pré-selecc i onadas (LI*, L2 *) e progres sivarnente aumentando a temperatura Θ 3. d.! .ração da desnaturação térmica ind r·' - i Após 3 rondas de s< slecçac 5, foi isolado T8 (Tabela 1), um clone Ho Tprr com uma sem: L"VÍ Cl si 11-ve: :es mais longa a 97,5 °C do Q'U0 cL enzima 94

Taq do tipo selvagem já termoestável (Tabela 2), tornando ο T8 o membro mais termoestável da famílra Pol I no registo (os clones são rastreados e marcados por um ensaio de POR. Resumidamente, 21 gL de células induzidas são adicionados a 30 gL de mistura de PCR e a. amplificação de um fragmento de 0,4 kb é ensaiada sob condições de seiecçâo (e. g. aumentando quantidades de heparina). A termoestabícidade e resistência à heparina de clones de Taq do tipo selvagem e mutantes marcados com His purificados é determinada como em (Lawyer et ai,, PCR Methods

Appl 2, 275-287 (1993); Lawer et ai., J Biol Chem 264, 6427-37 (1989) utilizando ADR de esperma de salmão activado e concentrações normalizadas de enzima). As mutações conferindo termoestabrlidade a. 18 (e a uma. maioria de mutantes menos termoestáveis) agrupam-se no domínio de exonuclease 5f-3f (Tabela 1). De facto, as variantes de truncagem de Taq polimerase (F. C. Lawyer, et ai., (1993) PCR Methods Appl 2, 275-87; W, M. Barnes, (1992) Gene 112,29-35) sem o domínio de exonuciea.se apresentam termoestabrlidade melhorada, sugerindo que pode ser menos termoestável do que o dominio principal da polimerase. A inferior termoestabrlidade do dominio da exonu.clea.se pode ter significado fu.noi.onal. (por exemplo, reflectindo uma necessidade de maior flexibilidade), como as mutações estabilizantes em T8 parecem reduzir a actividade exonuclease (aprox. 5-vezes) ía actividade de exonuclease 5' -3' é determinada essencialmente como em (Y. Xu, et ai., J Mol Biol 268, 284-302 (1997)) mas em tampão IxTaq com 0,25 raM de dKTP's e o oligonucleótido 22-mero de (Y. Xu, et ai,, J Mol Biol 268,284-302 (1997) ) marcado em 5f com Cy5 (Amersham) . A cinética do estado estacronário é medrda como em (A. H. Polesky, T. A, Steit z, N. D. Gríndley, C. M. J O VC Θ f U Si 01 Chem 265, 14579-91 (1990) utilizando o substrato homopolimérico poli(dA) 200 95 (pelo menos a (Pharmacia) e o iniciador oligo (dT) 40 a 50° baixa temperatura).

Ronda Variante de Taq T e rmoestabilidade* Resistência a heparina* 'i'ac[vít 1 1 T646 (G46V, A109P, F285L) 2x n. '..í . T788 (F 7 3 S, R205K, K219E, M236T, A6G8V) η e d. 2 T9 (F 2 7 8 L f F298S) 4x n. d. TI3 (R205K, K219E, M236T, A608V) 7x n. d. o T 8 (F7 3S, R20 5 K, K219E, M236T, E434D, A 6 0 8V} <0 f 5x 1 H32 (E 9 K, P93S, K340E, Q534R, T539A, V703A, R778K) n. d, 8x H9 4 (K225E, L294P, A.4 5 4S, L 4 61R f D5 7 8G, N583S) n. d c 32x *3 H.]. 5 {K 2 21E f F 3' 8 S V, K54 0R, D 5 7 8 G, N583S, M747R} 0 f 3x 130x coru íidera.do por PCR (reiat. i .varnente 3. con sid erado por PCR ( relati' vaasnte a i\ j. ‘ Pr·, oprieda.d.es d. os ciones selecc i. Ο Π 3 o cL 0 re lacionados atra .vés de mutaçôe xs s: são cia ssificados em r ' Θ 1 Cl C CÍ O à Taqtl] •3 0 96

Duas bibliotecas de variantes de Taq polimerase produzidas utilizando PCR propenso a erro foram expressas em Ei coli (biblioteca Ll, 8x10' clones, biblioteca L2 2x10' clones; ver Exemplo 5) e emulsifiçadas como anteriormente. A primeira ronda de PCR é efectuada paira enriquecer de variantes activas utilizando o perfil de termociclos da Taq polimerase convenciona.1 acima, apresentado. Os produtos de amplificação enriquecidos foram purificados, e reclonados para produzir bibliotecas compreendendo variantes activas (Ll*, L2*; aprox ICc clones para cada biblioteca). Um rastreio d.as bibliotecas Ll* e 1,2*, respectivamente, apresentou 81% e 77% de clones activos aleatoriamente repicados. A pressão selectiva é aplicada às bibliotecas Ll* e L2* durante a ronda seguinte de PCR por pré-incubação das emulsões a 99 °C durante 6 ou 7 minutos antes do ciclo normal de PCR. Sob estas condições, a Taq polimerase do tipo selvagem perde toda a actividade. Os produtos amplificados são enriquecidos e clonados como acima e foi utilizado um rastreio de expressão de 96 poços para seleccionar variantes activos sob condições normais de PCR, Isto produziu 7 clones da biblioteca L2* e 10 clones da biblioteca Ll* . Estes foram então rastreados quanto a termoestabilidade aumentada utilizando urn bloco de PCR com gradiente temperatura, com uma pré-incubação de 5 minutos a temperaturas de 94,5 a 99 “C antes dos ciclos convencionais. Como analisado por electroforese em gel, estavam presentes 5 clones de cada. biblioteca com termoestabilidade aumentada em comparação com o tipo selvagem. Estes mutantes foram capazes de amplificar eficientemente o alvo de 320 pb após pré-incubação a 99 °C durante 5 minutos. A enzima do tipo selvagem não apresenta 97 actividade discernível após pré-incubação a temperaturas acima de 97 °C durante 5 minutos ou mais.

Exemplo 14 . Ensaio Para a Estabilidade Térmica da Polirnerase .na ct i <r b ição t érrr moa de pc iiimerase ; S WT 0 ão Hl .s são e: fec CU 3 d O S I iuma i m i s tur < a de PCR J.j ; cc ampreendend· o tampã IX S! •jpei :Taq (HT DN pl cl S .mídico molde, 2 0 r\ lM de C- 3. da d A .TP, .ad oie i c; 3 .o i {1C 1 pM) t o po límerase * í~i. O rrt isfurai d e rea . C C c i O : b cd. O C obe r tas com r ° r send.o nov.idí a.s f ra cçoes de 5 pl L Θ 3 pó S in oSIVã1 (d ei de f i. ϊ n id os. E s t. as fracç õ Θ S mp? ío dí a reac :çãC ; de ac tív idade ; d· a 50 pL de ácidO N -tris [hi .dro ximetii- 3-ami no- ::A) ( O ί 9,5) f 1. mM de 0 -rner c ;apf .oetan o; 1 c le C c ida dAr ΓΡ, dTTP, 8 C 1GTP, 1 0 0 p.M d.0 /mn IGlí m \ - / ίΠ O ; ·- ---- :Q ] ig/mL de ; AI )N de es perma de

Os ensaios de ; purificadas com marcac convencional de 50 t Bíotech), 0,5 ng de A O.I i r , e Cei r , iiuC- (aproximadamente 5 nM)

compreendendo 25 mM propanossulfónico (TAPS) (pH 2 mM de MgCiM, 200 ( |%::o-32P] dCTP (0,05 salmão activaco molde. As reaoçoes são incubadas durante Í0 minutos a 72 °C, interrompidas por adição de EDTA {25 mM 'CA a 20% (v, / Γ , \ j ' V / / '2 % js de mor íbaç ão em F/C c ie 2 4 mm ram r emovr dos por -s finai) . Os volumes de reacção foram preenchidos até 500 pL com solução S (2 mM de EDTA, 5 0 pg/mL de ADN de esperma de salmão fragmentado) e foi adicionado 500 pL de pirofosfato de sódio ív/v) . Após 20 minul lavagens com TCA a secos foram c aontados A (National Di agnost quantidade c< onhecida iavactens) , % (v/v) , etanoi a 96% (v/v) . Os filtros m frascos de cintilação contendo Ecoscínt s) . O ensaio é calibrado utilizando uma :io dCTP marcado em solução (omitindo as 98

Exemplt com Activid 15, Evolução dirigida de Variantes de Taq Polimerase de Aumentada na Presença do Inibidor Heparina :omo indicado acima, os métodc enção podem tam) :r ut ili zados par :a c lese nvolve i r- resistê Γι O iL 3 3 um inib idor de ac t i V idade ΤΊ '7 ‘i má t i 03 * A hep ar ina é um ao. r ecoa guiante ia rgamen t e ut i ]. z za.d.o, ma s ta.: nbér: i um po tente ii li b.idor da activi .dade de PO iim erase, cr: ) d: Líicub cl' - les para r PCR a pa rti r de amo, stra; 3 c linics ), de sane xue (J, Satsangi, P, Je wel 1, K. Wel Q V", ° · F M. Bunce í >-J * J_ » il 5ell, La ncet 343, 150 9- 10 d 994 ) ) , E. mborr i a hep, ar ina po s s a ser removi d· d. 03 8 3lí! O O a a ci S de S 3. ngu Θ 3 "C..: Γ 3 V Θ S de vários Ό i’ rocessos, estes podem a:r ibos ser he parina de" O amp ]. i. c :õe; ί ri i d.ade o.e amo stras < com ol 6, 3 8 3 ) . a S Ll* e L2 dispendiosos e demorados, A disponibilidade da polimerase compatível com a heoarina deve, deste modo, melhorar grandemente rapeutícamente significati obviar a necessidade de um possível tratamento, muitc dispendioso das amostras com heparinase termoestável ,rT>' 2 . (19 9 7) Mol

As bibliotecas LI* e L2* são combinadas, e seleccionadas em emulsão quanto a polimerases activas até 0,16 unidades de heparina por ptL. Após um única ronda, foram isolados 5 clones activos no rastreio de PCR de 96 poços incorporando 0,1 unidad.es/30 p.L de reacção, com o tipo selvagem a não apresentar actividade. A titulação mostra que 4 destes clones eram activos até quatro vezes a quantidade de heparina que inibia o tipo selvagem (0,06 unidades/30 uL versus 0,015 unidades/30 p.L). O outro clone é activo até oito vezes a

Quantidade de heparina que inibia o timo selvagem 99

Utilizando selecção na presença de quantidades crescentes de heparina, isolou-se H15, uma variante funcional de Taq em PCR até 130-vezes a concentração inibidora de heparina {Tabela 2) * Intrigantemente, as mutações conferindo resistência, a heparina também se agrupam, neste caso com base nos sub-dominios dedo e polegar da polimerase, as regiões envolvidas na ligação a ADN duplexo. De tacto, a julgar a partir de uma estrutura recente de elevada, resolução de um complexo Faq-ADN (Y. Li, S. Koroiev, G. Waksman, EMBG J 17, 7514-25 (1998)) quatro em seis resíduos com mutação em H15 {K540, D578, N583, M747) contactam directamente com a cadeia do molde ou. do produto (como apresentado na Figura 7), As mutações H15 parecem ser neutrais (ou mutualmente compensadoras) uma. vez que é considerada a afinidade para o ADN duplexo (embora reduzindo presumivelmente a afinidade para a heparina) (Tabela 2) (o K0 para o ADN é determinado utilizando BIAcore. Resumídamente, o 68-mero utilizado em {M. Astatke, N. D, Grindley, C. M. Joyce, J Biol Chem 270, 1945-54 (1995)) é biotinilado na extremidade 5f e ligado a um "chip" SA sensor e a ligação de polimerases é medida em tampão ix Taq' (ver acima) a 20°C. Os valores relativos de KD são estimados através do ensaio de classificação por PCR utilizando quantidades decrescentes de molde). A base molecular exacta da inibição de heparina não é conhecida, mas os resultados sugerem fortemente a sobreposrção (e presumivelmente mutualmente exclusiva) de sítios de Irgação para o ADN e heparina no sítio activo da polimerase, dando suporte à noção de que a heparina exerce o seu efeito inibidor por mimíca e competição com o ADN duplexo paira ligação ao sitio activo. A presente observação de que a inibição da heparina é marcadamente reduzida sob condições de excesso de ADN molde, (ver (Os ciones são rastreados e classificados por um ensaio de PCR. Resumídamente, 2 uL de células induzidas foram adicionados 100 a 30 uL de mistura de PCR e a amplificação de uit fragmento de 0,4 kb foi ensaiada sob as condições de selecção (e. g. quantidades crescentes de heparína). A termoestabílidade e resistência, a heparina dos clones de Taq do tipo selvagem e mutantes marcados com His purificados foi determinada como em (F. C. Lawyer, et al., PCR Methods Ãppl 2, 275-87 (1993); F. C,

Lawyer, et al., J Bíol Chem 264, 6427-37 (1989) ) utilizando ADN de esperma de salmão activado e concentrações de enzima normalizadas, Tabela 2) parece consistente com esta. hipótese.

Tabela 2: Propriedades dos clones de Taq seleccionados C1 o n e de Taq Ti/2 (97,5 °C) (ibin) P.eSLStêACLd d heparina (n mi da de ε /to.L } m <nM"; AcaO í d_J ) Kk- dTTP (IJjM) 4cti vi da.de exc d'-3' Taxa d.e Mutaçào^ Taq- r;. d. n . d . 0, 6'v 0,8' 4, 0’ 4 3,2 n . è . 1, 1 Taq„, 1,5 90'” 0, 6” 0, 8 9, 0 45, 0 1 g 8 I 6, 7''' n , d . 0,3"" 1,2 8, 8 4 8,6 0,2 1,2 :—1 ei Cq 3" ruo" 84"' 0,19 0, 63 41,2 7,5

preparação comercial de Taq (HT Biotechnology), com marcação HiSõ N-terminal, medida, por incorporação de CTP'"2 em ADN de esperma d.e salmão, x*x sem marca, medida por ensaio d.e PCP, 1 Ta.q, valor publicado: 1 nM'"1 (i), Klenow (Cambio), 4 nM"ç, *'E. coli ADN

Pol I, valor publicado: 3,8 s-i (A. H, Polesky, T, A. Steitz, N, D. Gríndlsy, C. M. Joyce, J Biol Chem 265, 14579-91 (1990)), 2 em relação a Taqt-L-P0 selvagem, medida por ELISA de mutS (Genecheck) (P, Debbie, et al., Nucleic Acici Res 25, 4825-4829 (1997).), pfu (Stratagene): 0,2. 101

Exemplo 16: Evolução do molde em selecção de emulsão

Um resultado clássico de experiências de replicação in vitro é uma adaptação da sequência molde para uma replicação ma. is rápida (S. Spiegelman, Q. Rev. Biophys. 4, 213-253 (1971) ) . De facto, observou-se a evolução do molde através de mutações silenciosas. Ao contrário das mutações codiricantes (AT paro GC vs. GC para AT/29 vs. 16), as mutações não codificantes apresentam uma forte tendência (AT para GC vs, GC para AT/G vs , 42) para a diminuição do conteúdo GC, que se pensava geralmente que promovia uma replioação mais eficrente facilitando a separação de ca.d.eia.s e d.estabiiizando as estruturas secundárias. Para além da selecção para a adaptação, o método pode também seleccionar para adaptabilidade; í, e. as polimerases podem ter evoluído para uma taxa de auto-mutação óptima, presumivelmente superior (M. Eigen, Naturwissenschaften 58, 465-523 (1971)) . De facto, podem surgir muta.nt.es espontaneamente ern populações bacterianas assexuadas sob stresse adaptativo (F. Taddei, et al., Nature 387,700-2 (1997); P. D. Sniegowski, P. J. Gerrish, K, Ξ. Lenski, Nature 387,703-5 (1997)). Por analogia, pode arguir-se que o método pode favorecer variantes de polímerase que são mais propensas a erro e deste modo capazes de uma maior revolução adaptativa. Contudo, nenhuma das polimerases seleccionadas apresentou taxas de erro superiores (Tabela 2) . A reeombinação por eliminação e decréscimo da carça mutacional durante os ciclos do método pode aumentar as pressões seiectrvas para enzimas mais propensas a erro. 102

Exemplo 17. Ensaio de Polimerases Tolerantes a Repa.rina na toi ensa. rada .ida.' de térmica 7\ L A .Cf 0 8.0 de act i vi< d.8.CÍ0 UL de enzima Hei S cL 0 inc ubadas e a A tolerância de polimerases a heparina utilizando um método semelhante ao da estai heparina foi diluída de forma seriada num t (0-320 unidades/45 pL) e sâo adicionados mistura de PCR convencionai acima. As reacçõe incorporação é ensaiada como acima.

Exemplo 18. Seiecção de Variantes de Tãq com Capacidade Aumentada para Ex tensão a Pari. ir de um Desempa.relb.amen to de Sase o *

Os iniciadores utilizados foram Iniciador 9 (LMB388ba5WA) e iniciador 10 (8fo2WC). Esta combinação apresenta variantes de poi imerase com i: im. desemparelhamento 3' ι mrina- -pur rna (A- -G}, e um desemparelh ament o 3' pirimídina-pirimidi na (C" -C) . Estes foram os desemparelh ament os menos tolerados pela Taq p( d rim 0 C; pi (i'iU8.nCí ôt ai., 1992, Nucleic Acici Res 20(17) : roo- ’ 1 U 1 o \ ·' ) e for am pouco estendidos. O protocolo de seiecção foi essencialmente o mesmo de antes, excepto que estes dois iniciadores sâo utilizados em emulsão. O tempo de extensão for também aumentado para 8 minutos. Após duas rondas de seiecção, foram isolados 7 clones que apresentaram um aumento até 16-vezes na interrupção da extensão a partir do desemparelhamento como analisado por um ensaio de classificação de PC] R (ver Exemplo ) 2: utrl: i. zando 1 n í criadores 5 e 11) 0 normal 1 Z 8 d ΰ p 8. .0 8 8. 8. C t .1 . V1.0.8 G0 I .ti f iza.: ado o par c l.e iniciado Γ Θ s normal Estes clones foram S 100 3 0 O uentemente evitados nas bibliotecas Li* e L2* originais em conjunto com Taq do tipo 103 selvagem e o processo de selecção repetido, embora com um menor número de ciclos (10) durante a reacção de CSR. Esta ronda de selecção produziu numerosos clones, o melhor dos quais apresentou um aumento até 32-vezes na extensão do desemparelhamento como analisado por PCR (ver Exemplo 2) utilizando iniciadores 5 e 11. A incorporação de um par de base incorrecto pela Taq polímerase pode atrasar o processo de polimerização uma vez que certos desemparelhamentos (ver acima) são fracamente estendidos pela Taq. Deste modo, a Taq polimerase isolada não pode ser utilizada na amplifíca.ção de qrandes (>6 Kb) moldes (Barres) , Este problema pode ser ultrapassado suplementando a Taq com uma polímerase que possui urna actívidade de exonij.clea.se 3f-5f (e, g. polimerase Ffu) que remove as bases incorrectamente incorporadas e permite a retoma da polímerízação pela Taq. Os clones acima foram deste modo investigados quanto à sua ca.pacid.ade de realizar a amplificação de grandes fragmentos de ADN (PCR de longa distância) a partir de um molde de ADN de lambda, uma vez que não é esperado que a incorporação de uma base incorrecta abrase a polimerização, Utilizando os iniciadores 12 (LSA23) e 13 (LF046) (1 ubi cada) numa reacção de PCR de 50 ui. contendo 3 ng de ADN de lambda (New England Biolabs) , dNTPs (0,2 mM) , tampão de PCR Ix (HT Biotech) o clone Ml foi capaz de amplificar um fragmento de 23 Kb utilizando 20 repetições de um creio de amplificação de 2-passos (94 °C, 15 segundos; 68 °c, 25 minutos) . A polimerase do tipo selvagem não for C clp 3- Z de estender produtos acima de 13 Kb utilizando o mesmo tampão de reacção. As Taq (Perkin Elrner} comerciais não podem estender para além. de 6 Kb, utilizando o tampão fornecido pelo fabricante. 104

Exempl 3 Selecçã Q Uti i izan do Replic a.çao cie Sequências Aut o-Suster itada (3 SR) Para den ion strar a v .1 ciJ b i li .dade da reacçâ o 3SR em emulsão, o gen Θ G Ά T 8 ;g po 1 i.me rase f n 1 d. n d. c d. a ]. me nte am; ri i f d. cario por PCP. a par t i r de pi asmideo pare -'· ΤΊ ΐ :al (ver o Exemple * 1) util: Lzando a o ini ciador ; -10 Sí rntido dij :eeto que i dor conceb ido para incorporar um prometo Ύ- da polimera se de ARN de m ^7 J. , 11 qJ produto de PCR. É pre par a. d. a ; urna ;i ristura de i :eac ção 3 SR de 2 5 0 pL compr eendendo o gen e de Ta :g mo difiçado (5 0 ím g) , 1 8 0 uni dadí as de pol rmerase de ARK de T 7 (U SB, 63 r mi .dadí es d( transcr rptase rs íversa (HT Bio tech), i :ΝΊ 'Ps (12,5 mH) dlSi'1 Ps (1 mN 1) , MgC 1. 2 (10 mM), .í.n.i O -í. 8.d.0 Γ Taq b a. 2 T 7 (. i. n d ici ador 12; /λ J. Z 5 p: mo 1. e s ) , iniciador 88fo2 (iniciador A * 12 5 pmo' j. Θ C b) , 25 mM de T ris- -HCi (PH 8,3) , 5 0 rnM KC1 , e 2,0 mM ò ^ DTT. De St ci, 200 pL s ão em- ulsif: i. '· J- 3. dos uti Irzando o protocolo c o n vencional. 'Λ pós incub aç ão proloj aga da à te amperatura ambiente, par ece acont; b c a ;r a ampl if: icaç -8.0 d.0 C iene Taq írepres entando um gene de tamanho modelo) em emulsão, como analisado por electroforese em gel de agarose.

Para alargar ainda mais o âmbito do método, a reacção 3SR foi efectuada num extracto de transcrição/tradução in vitro (EcoPro, Novagen) . 0 gene Taq inactivo (ver Exemplo 1) foi amplificado a partir do plasmideo parental utilizando iniciadores 2 (TaqfoSal) e 12 (Taqba2T7). Foram adicionadas 100 ng (aprox. lxlO:J cópias) para preparar 100 uf da fase aquosa compreendendo extracto EcoPro ('7 0 μΕ) , metionina (4 pL) , transcriptase reversa (84 unidades, HT Biotech), iniciador 12 (Taqba2T7, 2 μΜ) , iniciador 13 (TaqfoLMB2, 2 μΜ) , dNTPs (250 μΜ) . A. fase aquosa foi emulsif içada em 4 00 p.L de fase óleo utilizando o protocolo convencional. Após incubação a 37 °C durante a norte, a emulsão for extraída utilizando o protocolo 105 cor ovenciona ]. e ci T. ó. se aquo C: d f 0.1 ainda purificad 1 G U. t d. .1. i za ndo um.a C 0 - Luna de purifica·: çâo de pc: R fOiagen ) . A comg beta i :emc ação in: LCiai dores r oi cL S S egurada pe 1 o tratam ento ce 5 uL do ei nato da co’ ί u n a com. -i- z μι. do reagent θ E :x o z. 'ap (St rataqene)„ 0 ADN pr oduz i d. o em emu . .1 s ã o por 3 SR foi Cc a.p 11 m :ado utir .izando 2 pL de el- uato da. O ϋ Luna trat ado numa l outra rea; cç ão de PCR de 5 0 pL co invencionai utilizando 2G ;s de ampliticação e os iniciadores 6 (LMB, ref 2) e 12 (Taqba217) . Comparad: a. a reacção de control. o (a r.* θ a. cção de controlo em que a trans re r s c i foi om. d. t d. d. a da z ti a a. o ci o 3SR em emulsão) , uma banda de tamai iho correcto mais int ensa pôc ie ser observada quando o s pr odutos f o r am visuali z aao s Ut i 1 izand.o electrororese err 1 de açaí o s a * .a j teací ç a o 3 S R o o de, des te modo , prosseguir no; s extrac da tran 8 Ο Z i ς; a o /1 r a d u ç ã o, per mitindo a θ v o 1. ij. c a o directa de agente i o expressa em compartimentos aquosos A Taq polimerase WT tern uma actívidade de transcripta.se reversa limitada {Perler et al., (1936) Adv Protein Chem. 48, 377-435) . Sabe-se também que as transcriptases reversas (e. g. transcriptase reversa de HIV que possui ambas as actividades de transcriptase reversa e polímerase) são consideravelmente mais propensas a erro do que outras polimerases, Isto aumenta a po b S il Alidade de que uma pc mimerase mai s pre pensa a erro (em que e 0 V J ιΟ-θίΐ zé a tolerância aumentada para um substrato não co nh.ee rido) ood.e < aoresentar a acuvidade de ; :ranscnptase reversa de TciCj MJ.; assim como 0 as a partir do s pia smide; D S 12 (ϊ Cl G iu Cl A 1 / ) e 2 (Ta c_íf o 5 a. D como acima Γ) G extra Cto ( .ie rn a excepç Ί 8.0 G0 que a D 1 i Cl A ia de for ima exóae na. I dm o mitida da mi s t ura ( ie aumentada. Os genes para variantes mutante inactívo, foram ampiifícac parentais utilizando os iniciadores e a reacção 3SR foi efectuada t r a n s c r i ç ã o /1 r a du ç a. o (N o v a gen) c c transcriptase reversa não é adiei reaccões controlo, a metionina for 106 reacção, Após 3 horas de incubação a 37 °c, a reacção foi tratada como acima e o PCR foi realizado utilizando o par de iniciadores 6 e 12 para capturar produtos sintetizados durante a reacção 3SR. Dos clones testados, o clone M4 produziu uma banda ma is intensa de tamanho correcto comparada com a reacção controlo em que os produtos foram visualizados utilizando electroforese em gel de agarose. 0 clone M4 parecia, deste modo, este resultado mostra que é possível expressar funcionalmente replicases activas in vitro. Quando acoplada a seiecção por compartimentalização, podem evoluir novas replicases.

Seiecção de Agentes que Modificam a Actividade de Replicase 0 Exemplo 19 e os seguintes Exemplos descrevem como os métodos da invenção podem ser empregues para seleccionar uma enzima que é envolvida numa. via metabólica cujo produto final é um substrato para a replicase. Estes Exemplos apresentam, um método para a seiecção de cinases de difosfatos de nucleósido (NDP cinase), que catalisa a transferência de um grupo fosfato do ATP para um d.ifosfato de desoxinucleósido pa.ra produzir urn trifosfato de desoxinucleósido (dNTP). Aqui, a enzima seleccionável (NDK) proporciona substratos para a Taq polimerase para amplificar o gene que a codifica. Este método de seiecção difere da auto-replicaçâo compartimentai!zada de uma replicase (CSR, Ghadessy e Holliger) na medida em que a replícação é um processo acoplado, permitindo a seiecção de enzimas (ácidos nucleicos e proteína) que não são elas mesmas replicases. As bactérias que expressam DDK (e contêm o seu gene num vector de expressão) são co-emulsificadas com o seu substrato (neste caso, dNDPs e ATP) em conjunto com os outros reagentes necessários para facilitar a sua amplificação (Taq polimerase, iniciadores 107 específicas para o gene ndk, e tampão) . A compartimentaiização numa emulsão água-em-óleo assegura a segregação cie variantes de bibliotecas individuais. Os clones activos proporcionam os dNTPs necessários para a Tag polirnera.se amplificar o gene ndk. As variantes com actividade aumentada proporcionam ma.is substrato para a sua própria amplificação e assim ao número de cópias pós-selecçao correlaciona-se com a actividade enzirnática com as restrições da act i vidade de polime.ra.se , A pressão selecti va adicionai provém da quantidade mínima de dNTPs necessária para a actividade de polimerase, deste modo, os clones com actividade catalítica aumentada são amplificados de modo preferido à custa de variantes fracamente activas (a sel.ecçâo é para kca,: assim como Km).

Mostrando que se pode fazer evoluir uma enzrma cujo produto alimenta a reacção de polimerase, espera-se eventualmente co-evoluir múltrplas enzimas ligadas através de urna via em que um produto da enzima, é o substrato para a próxima, A diversidade pode ser introduzida em dois ou mais genes, e ambos os genes podem ser co-transformados no mesmo hospedeiro de expressão em plasmideos ou fago. Espera-se desenvolver sistemas cooperativos de enzimas que permitem a sel.ecçâo para a síntese de substratos não naturais e sua subsequente incorporação no ADN.

Exemplo 20 Expressão Induzida de Cinase de NDP em Cérulas Bacterianas

Foi cionado arn piasm.id.eo de expressão pUCi9 contendo o fragmento de restrição EcoRI / HinàlII com a. grelha de leitura aberta da Cinase de foi preparado a partir de uma cultura de um dia para o outro e transformado na estirpe ndk-, pykA-, pykF- de 108 col í QL1 38". ?, u ma cul tura de uir ; dia t ;ara. 0 ou tro de r\ τ o s O r'i / C 1 / pUCl9n dk foi c ulti vaaa na p 21 :esença de ci oran f enrc :ol (10 ug/ mL de :once. ntr; ação final), , ampiciliní / A \ 10 0 pg /mL de con c ent. raça.o fl r\ j_ i Θ g]u ;:cose (2%) 'G ii a. a η η. θ '1 f' -18 ho ras . 7\ ,C\ cul t. ura G 0 ϋ .m d. ia par '8. G outro f o i diluida J.: . 100 em (2X1 !V / 10 μ g/m L de cloranf eni( -· / 100 ug /mL de ampi cr li na Θ C de glu c ose ) * As C-é lula? ; fc 3 r am cultiva· das aPe 'ama D.O ( '600 nm) de /_ ^ f A e .i .nduzic ias com 1P1 1G { J 1. mM de conc entração fir ial) du. v uí r-·. ;· fui 4 •q f") Ύ' a s a. 37 • AP ós indução de proteína., 8. S cél ulas t. O 21 ' a m J_ 3. V d das uma v ez em t amp âo SuperTaq (10 mM de t r Ί s-I pH 9,50 mM KC1 r r\ ^ ' 1 % de rp ^ iton X" J -00, 1,5 mM ,Ομχ jV lgCl2, HT Ei; ctechnoi logy) 0 res s usp ensas em 1/10 VG lume do mesm .o ta .rnpão, 0 núm; aro de célu.l a s Θ c iuant ificad o por a u á i ise espectro foto •métr iea com a ap.ro x 1 ma ç •ã.o de 0 . D. 600 0, 1. - ^ 1x1 0° c :é iij] .as /m.L „

Exemplo 21 Reacção da. Transferência de Fosfor.il em

Compartimentos Aquosos numa Emulsão

Para estabelecer se os difosfatos de desoxinucleósido podem ser fosforliados por NDP clna.se em tampão Taq, uma reacção de PCR convencionai é efectuada em. que os dNTPs são substituídos por dNDPs e ATP, uma molécula dadora de fosfato. A cinase de

dif o sf a to de núcleos ido é ex Ο Γ 0 s s a de coli QI Λ387 (uma esti rpe d.0 -t. i. c J. ente em nd.k e cin ia.se de pj r 'uva t:.o ae ά. cgli) como de sc rit G ΠΟ 0* j xemplo c inter ror, As i células S â O mistura idas com a mi st ura de rea cção de PCR. As céluia s lavada .s sã o adicionadas a uma : mistura de reacção de 1 ?CR (aprox 8e5 c élul, as /μΐι G0 concen traça o finai ) contendo tamp ão O U jO Q 2Γ1 a Qf inici -3.Ci.Oir es a 0, 5 pMf 10 0 μΜ de cada UNDP, ATP 109 politnerase SuperTaq (0, final, HT Biotechnology). ci 4 0 0 ρ.Μ, unidade/iiL de concentração Ά pós o rebent amento das células a 65 *C durante 10 min, a incuba ção da mista ra. de reacção durante 1 0 minutos a 37 "C, e termoc iciagem (iõ cicios de 94 °C 15 seg, mj °r sj no ·_/ w ·-- ; -> V O ·- '•J f i ^ ^ i min e 30 seg), os pro; au t o s amo1111caoo s são visualizados num gel de agarose a 1,5%/TBE convencional com brometo de etidio (Sa.mbrook) Os resultados des ta experiência demon stram que a cinase de NDP expressa pode f· osforiiar dNDPs para proporcionar polímerase : Tãq com substratos para a amplifJ L C ci Ç cl O por PCR do cr ene ndk A experiência é repetida, com o passo adicional de emulsíficação da mistura de reacção com óleo mineral e detergente como descrito acima. Descobriu-se que a cinase de NDP é activa nos compartimentos aquosos de uma emulsão

Exemplo Emulsificacão

Compartimentalizaçâo de Variantes de NDK por A mistura de emulsão original permitiu a difusão de pequenas moléculí as entre compartimentos dur; ante a termocícJ Lagerm Cc and UG-O / a j astanc io a proporção de água. par. a óleo e rninirni zando O •Q .SS rfi 1 de ter; Tiociciagem, a permuta d. O produto e si }. O S v T ci to ntre compartimentos é minimizada, resultando numa ligação mais

ap ert ada do ge nót p Q Pi po dem se Ύ- con t ro .1.0. cl f. Ϊ s po d.0 80. r po ssi vel em tis i f i c ;aç ã o, F •oss: L V1 C 0 ndi ções c íe s e 1 ecçs IO para fenótipo. Dado que as taxas de difusão or modificação da mistura de emulsão, possível ajustar condições de tampão após a nente permitindo maior controlo das i. e. aiustando ο pH com a adição de 110 ácido ου inrciando/parando reacções cora a adição de substratos ou inibidores). oa.se São a o Â. G .onac dos, gora a go t. GÍ , -L 50 pL da mistu i. r a de r eacção d.0 PCR (t a.m pã o S uperTao;f 0,5 μ iM de c a o a inici a.d.c >r, 100 p.M d.0 cad ia dND - Δ - f 0 0 uM de ATP, i j, 1 ur ridadt i/pL de polrmer aSt s Taq, 8x1 .o5 Céi alas/ Í-Íi_! U .0 QL1 387/ndk) (1 got ia/5 : seç) a 450 pL c ia fase oleo sa (61 eo mi Π θ Γ c j_ ) na presença i de 4,0 % v/v Sp an 80, 0 Δ '' ! A t V / V T w e en 8 0 e 0,0 5% r - j -r i Tr iton X-1.0 0 sob agit. ação c< instante em fra.s cos de bíc monge laçã o de fundo red ondo de 2 mL (Cc rrning) . 7\ v-. o s a 'ti O-d. O cL O da fase aque 6 ^ d j, cd a cj a a a c ól c i pros segue : durar .te ma is -J rnínut O S » reacções de emulsão são fraccionadas (100 jj.L) em tubos de PCR de parece mina e fe.rmuvc i craca, s cromo .indicado acima. A recuperação dos produtos amplificados após emuisifreação é efectuada como se segue. Após termocicragem, os produtos são recuperados por extraccao com 2 volumes de éter dietilico. vortexados, 0 centrifugados durante 10 minutos numa microcentrifuga de bancada. Os produtos de amplificação sã analisados como anteriormente.

Exemplo

Minrmizar a Act: le de Cinase de Funde

Os n í v 0 i: 3 de r ;iCt :.i vidade por ernud .si -f- η r-* a ç a o de céiulac Subs trat os f ^ :omo <: ies crito a dito sf at o de n ueie ós: Ldo nati act i vida de a P os a G Θ S Π 8 TJ. act.í vida de de c d. n a. se srgni fi expressa o de pUCl Q contendi esti ν' -Q p da ;fic í ente e m ndk d c .'j. n a s e ct G deterti mina. d. os ta mpão Ί ~aq com 1J ^ a cin ase de nhe GXI 8 U "i .ciente gene ndk é transformado numa coli QL1387. Comparada com um 111 mutante de Cl0 S cl C t r. \7 3. Ç â 0 cat a 1 . 11. ica de mx ndk (Hl17A), a natividade da cinase de fun do é determinada como sendo desprezível neste ensaio (os p r o du te is amplificados não podiam ser visua.l.i.2: ad.os por electi :of ore se em gel cie agarose) quando ndk é expressa a partir da estirpe desactivada.

Exemplo 24. Manutenção da Ligação Genótipo-Fenótipo em Emulsão. cica (NDK H 117 A) de cinase de de NDP de tioo se 1vagem em η. V O ίΐΘ Γι Q iv β 01. s t i. r: iguído i a o r NDP é co-emuisif içada com crinas quantidades iguais. 0 mutante inc um produto de amplificação ma is pequeno, uma vez que as regiões flanqueadoras 5' e 3' de ORF a jusante dos sítios de iniciação são removidas durante a construção do mutante de desactivação, 0 processo de emulsificação dá um enviusaniento completo em relação à. amplificação da cina.se acurva, como determinado por electroforese em gel de agarose.

Exemplo 25: Método para ; i genotipager α paralela de populações oaéneas de células. A abordagem envolve a compartrmentaçã.o das células em questão na emulsão (ver documento WO9303151) em conjunto com reagentes de POR, etc. e polimerase. Contudo, em vez de ligar os genes derivados de uma célula por montagem de PCR, são utilizados um (ou vários) iniciadores biotírui. lados bem como esferas de poliestireno revestidas com estreptavidina (ou qualquer outro meio adequado de ligação dos iniciadores às esferas) . Assim, os fragmentos de PCR de uma única célula são 112 transferidos para uma ánica esfera. .As esferas são misturadas, interrogadas em relação à presença de uma certa mutação ou areio utilizando sondas marcadas fluorescentemente (como descrito para "PCR Digiral") e contadas por FACS. A PCR Multiplex permite a interrogação simultânea de 10 ou talvez mais marcadores. Também podem ser escolhidas esferas únicas para sequenciar. 3. p

P

Apl reações i ΤΊ cl nem, por exerr iplo, díagn ssíntorr : á 11cos, qu .e depende da. deteccão de equeno de C é1L 11 cl s mutantes num ex cesso muito o rma i s. A van v, 3úje ;m deste método em relação ndiscut í ve .1. Podem ser ir vterroqadas oteneia .1 mente 108- IO9 células. strco de tumores um número muito grande de cérulas à citocoloração é simultaneamente

Exemplo 25: CSR de área curta

O presente exemplo refere-se à. selecção de polimerases com baixa actividade catalítica ou capacidade de processamento. A

Auto-Replícacãt )mpartimentaiizada P ) como descrito, um método de selecção de variantes de polimerase com adaptação acrescida a condições de selecção distintas. Mutantes com actividade catalítica aumentada possuem uma vantagem selectiva em relação '1 ~ ~ intermediário quele Cã que são menos 5 activos nas cc >ndi ções de f P ara muitos ob; iectívos de selec çáo (e. 9- : par Ca o sr abstrato a Iterada) e pr o v a' V 0 J. que os ao i- ongo cla via evolucionária pa .ra o no V 0 im ac tiv údad e c a t ci late ca diminuída. Por ex emplo, a .idos cir iét ic :os de poli .merase de AON I . de E. col .2 f as mutações, tais como E710A aumentaram a afinidade e incorporação de ribonucleótidos às custas de taxas catalitrcas mais baixas e menos afinidade para substratos do tipo seivagem 113 (desoxirribonucleótidos) (F,B, Perler, S, Kumar, H. Kong, Adv. em Frot, Chem. 48,377-430 (1996)), O mutante correspondente da polímerase de ADN I Taq, E615A, pode incorporar ribonucleótidos nos produtos de PCE mais eficientemente do que a polímerase de tipo selvagem. Contudo, utilizando substratos de tipo selvagem, é apenas capaz de sintetizar fragmentos curtos e não o gene da Taq de comprimento total, como analisado por electroforese em gel de agarose. Deste modo, seria difícil seleccionar esta mutação por CSR. Noutra experiência de selecçao em que a Beta-glucuronidase evoluiu numa β-galactosidase, o fenótipo desejado é Obtido apÓS várias rondas de C; ,Ο Ί - 0 C C cl O f ÍQcl S cl C"0 S 0 ci de actividade catai .1. L i. 0ri v Também se ver: meou que as van 0 π d Θ s seleccionadas na s ronda s i rr í c i a í s de selecçao são capazc 5 s de catalizar a cor 1V θ -T.’ S 8.0 de vários sn bstratos diferentes n ã o utilizados por qualque r das enz imas parentais, e a taxas catalíticas muito mais baixas (T.A. Steitz, J Bíol Chem 274, 17395-8 (1999)),

De modo a abordar o problema de ser capaz de seleccionar variantes de polimerase com baixa actividade catalitica ou capacidade de processamento, tal como pode ocorrer ao longo de uma tra j ect ó r ,i a evolucionária até um fenótipo desej ado variante de CSR, em que apenas uma pequena regiáo (uma "ár do gene sob invés' tigaçâo é esco) Lhido a 1 e a t o r i ame n t e e replic ea · ) e empregue. técnica e rererraa como uma. "CS;

Cie a z e í (spCSR), A spCSR permite que as polimerases menos actrvas ou com menor capacidade de processamento ainda fiquem enriquecidas durante a ronda de selecçao através da diminuição da vantagem seleetiva d a d. a 8. 0 S mutantes capacidade r is processamento. anteriorment Θ descri t o de a mas, porque gene inteiro altamente activo ou com elevada Sste método expande-se no método o-replicaçâo compartímentalizada, o é replicado, o método da área 114 curta é também útil, por exemplo, para investigar domíniof específicos independentes do resto da proteína.

Existem muitos modos de introduzir a dúversídade localizada num gene, entre estes estão a PCR à prova de erro (utilizando manganês ou bases sintéticas, como descrito acima para a biblioteca de poiimerase Taq) , baralhamento de ADN (C.A. Brautigam, Τ.Ά. Steitz, Curr Qpin Struct Biol 8, 54-63 (1998); Y. Li, S. Korolev, G, Waksman, EMBO J 17, 7514-25 (1998} cassete de mutagénese (E. Bedford, S. Tabor, C.C. Ríchardson, Proc Natl Acad Sei USA 94, 479-84 (1997)}, e mutagénese dirigida por

Winter, Angev·/, Li, V ;VÍ tazov , G. w a ks man, i (19 9 9) * \/\ Suzu kí, D • B cLS kín, a.d Sei USA 93, 36 Ί f1; _ C •j (1 "is 9 6 ) ) e de pé o adein entes (J .L < O /Λ c Ά o tin, Chem In t. 38 f 11 2 r, 1127 por ; imp 1 i f i. .cação ti '· •N pi a. s.m s 3 ps C', , P. I L u i s -W OJÍ em Bi 7 2, 67 7- o vai :r iment. O CG mbi na tór i;- de , K.A • Stas: tus, Pr o c λ r ív cx t 1 Acad gerar V 3. Γ 3 Cl ntes de n • j_ L· d í o 1". P C cl

oligonucleótídos degenerados (Y -oeb, L. Hood,

P. Kristensen, C (1999)}, e mutagénese aleatória total (T. Gberholzer, M. Albrizi 82 (1995)}. Pode ser utíiiza alanina (A.T. Haase, E. F. Retzí Sei USA 87,4971-5 (1990)) para para determinar que resíduos de aminoácrdos são funcronalmente importantes. ências estrutural (M.J. Em.bl.eton, G. Winter, Ne cieic Acid Res 20, 38 31-7 .D. Grr ffiths, i Va t. Biotechnol. 16, Atados bioquími oos de estudos da gene envol. v idos n a catálise. Várias regiões possíveis para como discutido em (D.S. Tawf ik. .nol. 16, i 152-656 (1998)) (as regiões

Alinhamento de sequ Goroehov, P.T. Jones, G. (1992)), (D.5. Tawfik, 652-656 (1998)), e re; poiimerase de ADN I re ligação de nucleótldos e alvo incluem as regiões J A.D. Griffiths, Na t. Bíoí 115 3, 4 v e 5 S ã 0 ta: abém refer ida 0 como o Mot i. V C Ί Li 'r-\ c, resp<: nctiva mente ί na polimerase c le ADN Taq I) • Outras regi O td 3 alvo p o s s . íveis seri; am aquelas rç :gr oes sons; srv; uda s ao loncjo de várií ís es; p 0 0 0 < di v ersas, aqu 0 1 :s im.pl icad as -Q ÚO los resulta d.0 s est ri iturai s par 3. cor;. tactar o si J. o s t ra ito de nu 0 j_ 0 óti do ou para s e r envoJ t VOCÍcL íupp r ::a táli se ou na proximidade d lo sit io activo, ou qualquer c mira r eqia o impor taro L í'i pa ra a função '.u.Cl polimerase ou iaacão ao substrat:

Durante uma ronda de seiecção, cada variante da biblioteca é necessária para replicar apenas a região da diversidade. Isto pode ser facilmente alcançável proporcionando iniciadores numa reacçáo de PCR que flanqueia cl. 1 0 Q" .1. ci G a.J. versificada. A seiecçoes de CSR seriam realizadas essencial.ment e como descrito Após a s< A·. ! ΟΡΓ1 ii ,··Λ w U- V- <_A _/ por CSR a região curta que é diversificada replicada agora < á reintroduzida no gene inicial (ou outra grela genética e. g. uma biblioteca, de mutantes do gene parental, um gene relacionado, etc,) utilizando ou sitios de restrição situados apropriadamente ou métodos de recombinação por PCR como PCR descoordenado ou Quíckchange mutagenesis, etc. 0 ciclo de spCSR pode ser repetido muitas vezes e máltiplas regiões podem ser direccionadas simultaneamente ou iterativamente com iniciadores flanqueadores, ou amplificando regiões individuais separadamente ou inclusivamente.

Para aumentar a restringência nas seiecçoes num estádio mais tardio, a spCSR é ajustável simplesmente aumentando o comprimento da sequência replicada como definido pelos iniciadores flanqueadores, até CSR de comprimento total. De facto, para ser benéfic elecção p estender ra capacidade de process o segmento replicado p unento i ra além a dc pode gene 116 cod if i pa T.‘ 3 O vector total ., u t i I i z a ndo 0 3 tra Ο Θ Cf a. 5. S 3.Ώ 3.1. ogas à i PCR (PCR iir certi da) . Ά s o C SR oode possu . i r v a.n tagens em Ύ- e ]. a ção a CSR Ia tp com pri mento to L 3 1 f não apenas quando se o Th !.S par :Γ 3 3 3· V 3 T. 1.3 .n tos de p < siimerase ? cc :;m bar X d d activrdad .es σ u capacidade de pr o ces samen to. ma também guano o se mape ra r .('iCfi O A ss discreta; s de urna P rotei na para a mu tabi 1 .1.0300/ Θ, gu em conj unção com var rimento cori foi nar torro c le a 1 anina (A, rp na a. s e , E.F. Ret zer, K. A S t. a s k; J.S, Froc iv/<3 L. .1 Ά C 3 d Sc.i LISA 87, 4 9 71~ 5 (1 9 9 0) ) para det errn inar q\: i ρ r- esiduos c{p aminoácido 0 0 funcionalmente zmp Y' +· an tes r rssa inforam í Ç 3 o pode ser út 1 s nu: n estádio ma x. s tar dio par: :a guia r aboi 'dagen s semi-r a cio Π O is, ·/ rc p 3 Γ 3. di r ecc ionar 3. diver: rs idade dos r: egi ões nã. o envolvida s em activí p 0 d ^ de polimerase c lo nuc leo. Além 0 1 C; Q , a spCSR pode SGI utr 1 j_ Z 3CÍ3 par a transplar. rtar segmentos c|p por ipéptido e ntre pol ime rases (como oom enx e r t r a de imuno glob u 1 ina por CDR} . Um. a simples troca de segmentos pode conduzir inicialmente a. polímerases fracamente activas devido aos choques estéricos e pode requerer "reformulação" para integrar segmentos funcionalmente. A reformulação pod.e ser realizada utilizando ou CSR de tamanho total (e, g, a partir de bibliotecas de mutantes existentes aleatórios) ou spCSR direccionado para regiões secundárias {''zona de Vernier" nos anticorpos) . r\ S 3 T 0 rs curtas também po< dem. estar lo ca1izadas η o s termina N- ou C- cc :;mo extensões para sequências de genes da p mlimera existentes ou como inserçõe s internas. Existem na nature precedente s p ara essas extern soei ; e inserções de modific ;ação de fenotipo. Por exemplo, t. a n t. o uma Θ X10 ]3 S 30 O O termina.! C- de pol de ADN de T5 como a ins erç ã o de ligação à tio: rredoxina er n pol de ADN de T7 SãO críticos oara s l ca pacidade de o rocessament; s nes tas 117 enzimas e permitem grandes de fagos T foram também postas outras enzimas. .cientemente os genomas do terminal N- ou C-mentar a actividade em 'ue e i as rep 1 ] pj·; 1 0jr> 0 -f- · > 30kb) . As extensõe em evic lência para au

Exemjç de Kienow 26: CSR a baixa temperatura utilizando rraqmenro 0 fragmento de Kienow for clonado a partrr do ADN genómico de E, coli no vector de expressão pASK7 5 (como com Taq) e expresso na estirpe de E. coli DHSaZl (Lutz R. &. Sujard. H. (1997), Nucleic Acids Res 25,1203). As células foram lavadas e

ressr spe nsas em Tri s a 1 0 m M, pH ‘7 ^ Foram adie: Lona das 2 x10s céiui as ress U S p Θ Π 8 3. s (20 pL) O. 200 pL de tampão de PCR de baixa tempe ;rat ura (LTP) (lakol D 3. S i i Vi .lr, R. & Lapidot, / QQO ·) Nucle ri 02. ds Res, , 27, 156 6) e emuisi -ficadas cr. smo descrito (Ghadess y e t cl .1 * {2, U Ό1), . PNâ S / 98, 4552) . 0 LTP foi '7' ·γ· T sal.O mM \ de PC.K a ba ixa 3 0 s e g, V Ί O ^ * to e os p rocha tos como descr i to (pH 7,5), L-prolina a 5,5 M, glicerol a 15% p/v, MgCla a 15 mM + iniciadores adequados (porque a prolina baixa a temperatura de fusão, os iniciadores têm que ser 4 0-meros ou mais comprrdos) e dN?P' s e emulsifiçado corno descrito. A ciclagei temperatura foi 70 °C 10 min, 50x (70 °C, 12 min) . A fase aquosa foi extraída como descri de selecção purificados foram reampiificado: (Gtacessy et a./.., (2U0i) PNAS, 98, 4o52) . V ãna s mo .q; .ç: ^ ... ; O 0 s e descr '1 tos da invençí 5 O ser: técn í r·' a, 3 Θ 371 se afa st arem inven Q cl O Ti enha sido di m c r _ V srita pref e :r idas esoç jcifica deve. variações do s métodos e sis tem, o óbvios í rara o e s d e c: Lalrsta n do âmbito da. invenção. Embora em ligação com formas de reali zaçã ser enteno .ido que a inv ençâo com 118 reivindicado não deve ser .indevidamente limitada por essas formas de realização especificas. De facto, várias modificações dos modos descritos para realizar a invenção que são óbvios para o especialisua ern biologia molecular ou campos relacionados pretendem estar dentro do âmbito das reivindicações seguintes.

i n i c i a d o r Designação Sequência (5' para 3') Iniciador 1 TaqbaXba G G C G AC T C T AGA TAA.CGAGGGC AA A A AA T G C G T GGTATGCTTCCTCTTTTTGAGCCCAAGGG Iniciador 2 TaqfoSal CvC G pg '.i.1 GC o-G-AG Γ GGiap,. G1 Ciap,. G1 C. G 1' G1 G G pG.gGiapg A. GCCAGTCCTC iniciador 3 88ba4 λ A A.. A / λ 1' C ✓ '.1. ^ pg A. '.1. λ A. C ✓ G ^ a; G G G A. A. Iniciador 4 8 3 f o2 ACCACCGAACTGCGGGTGACGCCAAGCG Iniciador 5 Taqba(ser) GGGTACGTGGAGACCCTCTTCGGCC Iniciador 6 LMB2 GTAAA.ACGA.CGGCCAGT Iniciador 7 LMB3 C .. A. G xo A..A d A. G' G Γ A. '.1. G A. C .. Iniciador 8 8 8ba4LMB3 C AG G AAAG AGC T AT G AC AAAAAT C T AG AT AACG pç C.v G' G A. A. Iniciador 9 8 8 foLMB2 G T AAAAC GACGGCCAGTACCACC GAAC T G C G G G '.i.1 Gí-íuGC G AAGG pg Iniciador 10 LMB38 8ba5 WA CAG GAA AGA GCT ATG AC A AAA ATG T .A Cd A'.l.^ ^lp^C.7 AGG GAl (deseτηρa.reIhamento A-G) Iniciador 11 8 fo 2 WC GTA AAA CG A CGG CCA GTA CCA CCG AAC TGC GGG TGA CGC GAA GCC desemparelhamento C-C) Iniciador 12 LBA. 2 3 GGAGTAGATGCTTGCTT TTCTGAGCC Iniciador 13 LFG4 6 GCTGTGGT TATCTGCATC ATCGTCTGCC

Tabela 3. Sequências de iniciador utilizadas nos Exemplos 119 iequenctaí írrnoestáveis T7-88: Sectuência nucleotíciica

€O'A€€CCÂCC^I^CÀCGC<M2TCÁAC«ôG£^TCÃCCÂCCÀCiCGGGG<3<lG.âGCC®IBOiO<lCG0TGT

ACOTCmm^G^íMGCCTCmEÂÁGí^CTCÃAtMAmMtmiGGAãlCGOimfCGl^GÍCriTG A€GC€AA€*OOÇCÇ^C^ItXCGCCACaAGGCCmCGimiSWACAAÕC^€^^G<.Ct:eGtAeG€

CGGAGeÂCTrTCCCCGOaAACfCGCCCICÃTCAAGeAGCIGGTGGAÇÇTtXrrGGGOCTG-QCGCÍíCC

I€GAGG7CCCGGGCTAt^AGG€^mCGACGT€C:i^GCCACCCTOOC€ÁAGAÁGGCíGGAAiVAG<5AG

€^CmCGÂGGTCCGCATCCTCACCGCCGACAAAGACCTriAÇ€AGÇlX^3^7tmACCmATaCíVCG

mmXACCa:GAGGGaTACCTÇA:ICáiCCC03GC€TÇ^€lTreGGAAÁAGTAC)aGCC>im<3GCí:x:G

.AÇÇAGrGGGCC-GAGiACCG^íGCCCTÓÁCiCGíKSOÂC^AGllX^ACÀACGTTCCCGGCH^rCAAGGGCA

1X^KMGACMÂG€íj<SiXMÂ<MÂGCTK?<KMCM;MCíIí^GGGÂOCCTGGAAíKX:€TCCTCGA0AAC GTGGÂCCCíGOXSAAGCGCGCGAT^C^iMGAAGAT^IXK^CGÁCÂOjíGACGATGfGiAAGClXiTCC: TGimA^IG«€.AAiXmiCGaACCmCCIXmX€^XlGAe0TGGAOTa30CÂAMGGCGf3GA^a:

GÁCCGGÇMGAGCK'1TAGGGCOlTrCfGGAGAGGCTfGAGTrPGOCÃGCCT€CTOCACGÂGri€GGC

CITCriAlAAAÇAX^CAâGGCCCTGííAíi^lAGGCCCÇCFGCjCCCCCGCClGGÁAGGGGCCTTCGTGíXC

TFlXTOlCTITÇCCGCAíXGeAGCaíATGTGGGCOSATCTiriXffiCCtTIXiGCCGCÇrxXAííGGGGGGC

CGGGTCCÂCX^GGOOt^-GAGCGTrÂ.tÂAAGtXJCTCÂGGCjACrrGAAGGAGGCGCGGGGGCITC^TC GCCAAÂG€C1XiACKXlllGfGGCCCtAAeC5GAi<lGGGCTTGGCCTCCCGCCCGQCGACCíACCCCAIXi aXOroa^mCCTGCreOACOCTm^AC^ €iAQTGGA€GGAGGAGGGGGO0GAG€GGGCCGC€CT'rrÇCGAGAGGCTCTXXXCCAACeTG‘TGGGe

CLAGGCiTGÁGOOGGAGGAGAGCXTOGXITGGGXTTACCGGGAGGTOGAGAGGCGCCITXC-GCTCíT CÍTCOCCGACAItSGAClGGC.ÀCGGÓGGTGGílCGfÒGAGí^lXjGCC^ÁTCTCAGGGCCTTGTGC.CTGíM.

GGTOGC^^GGA(mOTCCXmXJrCGA0OCCÚAGGTG1TOGCCTCTG£XXjílC€LACC€CTPCAACCT

CAACTCCCGGGACCÀGCTGGAAAGGGTC^IXniirGÁCGAGClAGCCClTCGCGC^AIXXlIÇAAGAG

GGAG.AAGAC€OGCAí\GCGGTCCA€CAGCGCXX3C^QíÍC0ÍíGGÀ.GGCCCXGCGCGAGGCCCAOCC€âT

031GGAGAAGÁTGCTGCAGlAGCGGGA£KX!GÂCX^AGCrGAAGAGCA£X:TAaATimcx;GCr{XK:C

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Clone termoestável T9: Sequê

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Clone termoestável 8 (T8):

Secruência de Aminoácidos IXHBBXíldyEeFKttBlÁEWFi^MAFVOfVlíSlK^WAK^àiAM^ííWlilAPEBYKALEIiLK.Ká, ROLLÁ^L^\XALliOL#LPFGBI>EMJ,AnJ,DFSl!fTT^^¥AEEYCM3Ê%iT^ÃQMÃM>SiM.íBAMí

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Nota: Primeiros dois aminoácidos no terminar N não sequenciados, C1one Resistente

Heparina 94: Sequência de Ácidos Nucleicos

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Clone Resistente a Heparina H94: Sequência de Aminoácidos

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!4vlíLFPRLEEMGARMLLQVHDEL¥LEAPKERMIàVARLAKEVHEGVTPLAVPLEVEVGIGEDWL SÃKE* N o t; 5 Aminoácidos do TEkMINAL N não determinados

Clones Resistente a Heparina 15: Sequência de Ácidos Nucle l'Ct>VÍ(K]CRI:Cmia::A€CACR:a3i^GG<MíXdXÍCVKmGGCaGTCTACGGCTTCGC€AÂtMGCa'CC

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CiAGGAÍK^TGGOTATTGGfGÍXCereGAarAmimAGAmGAOamGOGTGGOTCCrÃCCTC 127 TXXX3GÍXiAJDGAaAjftX3CEKjÂTCOaaGfl£T^^ CTECGCKSOICCFCfACGGCÂTOraaSOX^^^ 6CCXlA€H(KXm^raS€KXÍK?rACmX3kaA^^ CTMÂOOÂGGeCAGíMCRSCtôGGGOmaxrGGA^^ aM.OAaGGee.CKMmáÂOA.CKWGi^^ AGGCCA€CGC^GCm4CClCAl«AAOClGGCXâ.TGaTCíAAGCTÇITCCCG^GGCmiGAOGA,^ATGCí <^<K^AGGATGCfCCrnt^âGGTCCÂCGÁ€GÀGGTOGTCCTCGÂ(iecX!l€CÀÃA%eMJÂGCfCiCGGáCí

GCCOTOGa^OOGCTGOCCAAGGAGGimimAGCmGGTmATCO^lGÍKS^^fâCOCTGGAGGTG

OAGGTQGGGATAGOíKíÃCíGAClX^CIC^OCGCCAAGôAGTGÂGT lone Resistente

Heoarina 15: Seauência de Aminoácidos

FliFiFKGmíIJAX>GMffi^¥RT^ÂLK.CMAt^GWVQáXfYtmKSl^ALKBPí»PAW¥MJAKAI^Xl

IIEA¥GG¥I^GRAFCF^FFEQLM,JKESAÍD!Ll^í^^EWGYEADD¥LÁS5JiK^EICB0¥E¥KlL:ií'áíD WGSLEALO!!HL1](RI^ÀIE^Ol^J^^^l^)ÍÍ1}LAKVKlMM^V1!I^OQRE^Dij^EeUKAR£9POU^0 mJfF«':LLMFKAI^BAPTOí:PlG:AF¥®%M^BFMW:ADLLM.AAAEGGl¥HRAFlF¥KM.m.mJCl. M0y^âKDBS%CAmaLCCFròDFM!Xárai3FSOTlWG%?ARJKyMW^mAàERAál^m,FÁM LWSRIJ5GBBRLLWIAmX^RFLS.AVLA.í-aflATC3V7ÍLOVAYXRAT:.SLB¥AEEfARI,EAB¥FRLAGlíFm £NfRDQIJE&VLS^aaLMÍGrrÊríXS^ OTRy$mFNqKTálX3fMS0FNÍQSÍÍAiaMQ^

MyRVÍ'QBGRDMKTASWM>\l¥FRBAMiFL^®ÀâKXfHít5'VLWIí^AHRIíSí|ELAÍF¥EBAQAFÍM.

AMVKX^MlEBMt3yyiMLLQVHISELVLEAM'^lAEAVARBAjKEVMBGY¥MAVMJraVGÍ£IED,WLSA

Nota: 5 .Aminoácidos do terminal N não determinados

d O S lone de extensão de desemparelhamento Ml: Sequência ucleicos

TlXK3AATGCTCCmrxrOTGASCC€AAAGGCCG€G1€CltXireGliM?ASGGCCAC€ÀGCTeGCCm

<XXiCACCrr€CACGa:.CmAACJGCCCrrCACCAai40C<XíGe€AmâQOCeGTGCÃGGCGCíKTrA.CGG 128 tmcAicccccmiTTaiGceAmÁéaceFAa^ GGACllTCCCCCKTíCAACIX’GCi>Clt’Alt:,-\,-<iC^3ÂCí€TGOT£KíATCTCCTGGCíG;CTGGÇGCG€CrCGÁ C^TCCCCtGííCTÂÇijAGOOSCMGOAmTCCT^CGAGCCTGGíXAAGAAOOCGG.MMG^AGíMer

A£mO01^CGCáTCCK^CCC€CóáCAAAGGCCTrMGCAGGtt^mi:OSÂGtfâCAHX’ACGTOQT

CCACCCajÁG€l<íOmCCTCáTC4CXXC:i^€CTOC^TrTGO0AÂMGÍACGG€CfaAík«CCeA€CA eG'GOGCtmCTAC€<KIGCCCTGA€CGt1OGACGÂ0TCm4CMC^rfCCCX3G<íGtC;MGeeGA:T€ílCl

GGAGM<*4C<fGCG'á0aAAG€rrCTGGÂGGAGlffiC^GGA0GClOllAAG(X:ci^CTGMiMâOC-ItíG

AC€GÍICIGAáG<%X:G<X;AJGD30GAGAÁGA1X)GKIG^GAGÁT<^AímixnmAG€TCTCGXGGG

Al'Cl'G6O:AAGGTGCGCACCGAa:K«:X:CClO«À0GTGGAClltXíCCAAAAGGG00aAGCGO3ACJC

CKíGA.0AGGClTA<^GC!^T1^CTGCiAGAClGCrTGÁCGTrGGCÂC3CGTLXÍ1Ã^ÃÇ&AGriXLXiGOÇirrC 'Κ:Κ:ίΑΑΑΟ<ΧΑΧννΑΟ^€ΟΟΜΟΑΟβΑ0ΟΟΟΟΟ€Τ€^€€€ΟΟ€^€Κ1ΑΑΟΟΟΟΟ^11Χ3Ο'Τΰΐ$Οϋ'ΓΤΚ3 TGCnWGCKAGGGAGCGGATGl^GGCCGÃl^^

TC&iCCGG0C^C€GAGK?rrÃIAAACK%;CTGAGGGACCTGAAGQA0GCSC^GG<3CTrGTCGC€A

AAGACCTGA£AXiTTCTGGCCC:r(lAGGG/4AGCC€Tl'G0€C'rC€CGC€CGGCG:AC0ACC€C;ATGCTCC

TCGCCrrACCroOTGGAOf:tTn^CAACA€CAOC^CÇAGGiX^BlGCCC^m3GCTACaGCGGGGAGT

CtGACCTÊiAGáÂGOCGGGGGAGCGíKíCXXAXGftTCCGÀGAGGCilíITCGí^AAGóPGTÓGGGííÂGÇ?

ClTGAGGGGGÂGGÁGAGGCrCCTmiGCTimCCGíMÁGGfGfMGAGGCÇÇirnTC^ãCWTCCTG G^CACA.TGGâCCC^CGCK3GGTGCXSCCTGGACGTGGCCmi^lt:AGGGC^l^lt:GCrmGÂGGÍX5

GC^XaACAlAGÂTOlCCCGGfAXGAíSíltXGAGGlt^TCÇGCGTGGCCGGCCAOCCÇTTCAÂCCfCAAC

TCCO^GÀOCSÂGCTGOtóÂÒGGTCCKíITfCíÃCGÃGCfÀÍMÍKÍTTGeCGCCÂlGGGCAAGACGQ.AG

ÂAGÂCCGGCÁ4GCGC;fCCAGCÁfiK^0DGCCGlGCrP3ÍMjGGGO2T€CGCGÀGGCCXiACCCCATCGTG

GAG.ÂAGATCCTGGAGIAíCCCjGGAGCTCàCCAAGCTGAAGAGCACCTACATIXSACCCCTTAíCOGGAC €TCAT€CÂCGCGAGGAmGGCCíKCmmjlC^^

CmA<mGCmmTCOCAACC1XX&0áiK^imXX^^

CGGGCOAXláfCGCCXjÁGGÁGGCMTOGCTATIlGCGlSGlOOlGCiÁOMTÁGCCÂGÁlAGÃGCTCÃGG

GTCKTíSQCCCACrrírTCCOGCCIACGAelAACGI-GÃTCGGGGICrFCCAGGAGGGGCAiCKMCAIGCAC

£XKIAGÀCGGC&\GCTOGATG''nXX^t£XílTX;>CGiCGGGAGGCCG'IGGACOCÍX;TGATGCGC.GOGGCG

GGCAÃGÂCCATOAAtGiCGGGGTC^lX^rÁO^CATGTCõíKiCCÀCCXKXJTC-TCCGíiGGA.QC.TAGCC

AKJCCITÁCGAGGAGGCC&tóQCCIl^ATrGÃGCGCTÁCGTrCAGàGCTICC^AAGólGCGGGGC IAíGÂTT(£4GAAGACCCTGGA©GACAíGCAGGAGGCGGGGGTACGTGGAGACX;Cl'CTTCGGCCG€C0 CCGC1A£KíTGCCAGACC^áGA.GCAX^MjG-f0MGAQCGTGCGGGGG:G€OGO3GÂGGGCATGG€Cr

TClÀACAfGCGCGTCCÀGGGCACXÍGCCÍGíXGAOC^CÂlXyílAGCTGGCl^ÀTOGTGAÃGCTCTTCOCCA

GGCKjGÂGGÀAÂ1GâGGG0CAGGATGClTJCIl'CAGGíI^GÃOGACÕAõCTGGlt3CTCGA.GGÒDCCAA

AAOAGAGGGCCfQAGGCGGIXMíCCCGOGTGGCCAA.GGAGGTOVTGGAGGGGOfGTATCCCGlXiGCC GTQCGÕCTGGAGGTCGAGGtGGeGATAGGGGÁGGAC^mGCTCI^DCXKÍGAAGíMõmÁGPmiPGf

GCAGGCACCGCIl:GõCGTCACCCGCáGT'rcGOTCiGTTAATAA.GCrTGAC€TGTGAÀGTGAAAAATG

CCCíCACAmilWC^CATrnTlTtGTC^GCCGTnACCGC^ACircmmCGGATGTOACGCGCC

CTG1AG€CCCGCATTM.GCGCGGCGCCirGTGGI\M11'ACATCGCAGCG1XLA:PÇGO,ACACTrOCCAG 129 cmxTA<icx5amxiaTn€<KnT!^^

AMiClUrAÁATGOGCíaíK^CCriTAÊKíeGTOCC^mMiTOTrriACQSÍjáCCfCeAAOC^ÂA AAAATmAfTACK3

Clone de extensão de desemparelhamento Ml: Sequência d aminoácidos ilMIPLElPK0H^rMA1[>GHHlAYRl?BMI.JíGLTIMGBP¥QÀ¥¥í3FÂSSIA<IALKBPGDAVlWÍ:PAliA. JSM^YOGY&ydRAPimSfPRiqMI^^ IVUJK^LYCJliíSEHIllVXiHFIIGYOlFAWLWEOOLilPDQWÂIJYRMíTOP^DSllPSVÍÍfâíOEltTA&ííl,· LEEWGM^IX^^OTiSAIEH^ÍLAPMDIIvH.HWDLAK¥SI15lMIWOFÂOÍRPiJ;PEP^lAÍAMÍ^t

.ereSLLem^U.ESF^EF^WfPHaAFVGFVISEIiEPMWADLLAS.AAAM^KVmMePYKALaBL

KBAROLÍÀIÇDil^WAíJtE^Uim^DDFMi^YLEDPEiNTfPIC^ÂRRYGGEWTEmS^^SmF

A^WeslBGEESLLWLYI^VÊRl®LSÂVLAHMEAYGVKÍ4>¥AY.LRALEÍl:‘VÂEMÂM.tEABV'FS;lAGííF ^LKSllLXlLE;RVIAX>EI6IJ'ÁíGO^IÍTSK.RSTSAA¥lAiAL?AAIWVEiOLQ¥'FlEÍ.fKlJKSTYll)FÍ,Pl)L

XK^T<MJTOtK^TATA7t^X^S^FM<^OFV&Tíl(3QPKMFIAl^WI^¥VIJ^VSCP^lJRVLáKUI

GiaiMLllWQ:BG:M>IHimfASmCFCATmiAWL&mA,AKTINFO¥LY0MMm^qEI^IPYEMaAF i®Yl^SPFK¥EAWIBKTLEiQiKj 3^VÍ^APjKERAEAVAMASE¥3V4]EG^YPLAVH4S¥SVOI<M3 MKLAMVM^FIU^KM<MRML1í

WLSAKE

Nota: 2 Aminc ao; do terminal N não determinados

Clone de extensão de desemparelhamento M4: Sequência de ácido nucleicos

TqnTATdAeCCCAAGOGCOtCQTCCTCCTôGTGGACdOCXAariVCXlTCôceiACCdCACCriVXAC <K^YGAA<^CC3^ÀCTACCAGC^d<KK^dCX^TGeAa(K:<KrrcrrACCKK^TlXXKX^<SAe

ClOlÇCfCÁAGOGCCiCiAAGCyiGGGCSíMSGACGCGGlSMCGTGCTfíTriXláCGCCAAí^CCCOCYC

OTrcOCC&¥rGÁGGCCTACGGfâG®jlACAÀGGCGCK3CCGGDCC€CCA€35CCÇrOAGCJACTTTCCCCG

ÂCAACTCGCCiCTCAfCAA®iACCTGGYGSA.CCTCXtrí3C^GCtrGACCiCOC0TO3:AíiOlCCCdOO<3A

iXíAGGCOGACmCGTCCim^CAGCCTCOCCAAaAAGíSCiGGAAAACAiAaOCá^ÁCíjAGOTCCdCA

l^eTGAKOCC^CAAAGACCTTrACCAeCTCCllYCCmCGQCATCCACCtTCCTOCACX^mCKJO CíIACCTCATCAaXC^ÍjC^lT^XTlTGGGAXAAGlAtlGGCCIGAGGCGCGACCâOTGOCKXJaACm

CXlCXAmXTGA€C^GeaÀCGÂGTC€imCÂAmiTCCC«GGGimAGGGCATCOCÍí3<ÍA.GAA0ACClG

CGAÍXAAGGTTClKMAGGÃGTOeKKXiAGCCíTGClAAGCCCTCC^AAGAACXlXlGACCOÕÇTQAAO

CCCGCCAJCCGíRMGMaATaireaiCXlâCÃim4eGATCTGÃAGCTCd’CCTGGGAaX<MMMG G-TCC^AC€GAGCTaxatKÍGACiGTimACTrCCCCÃAAAe«5CGGGAGCCCdACCOiXlAGAeíGCir

MGGGCX:rrFmiaAaAGllCTIG;AGTOmXAGamxrCC;AaiâCfmXí<XCFKiraG*AAAOCO€C 130 AA<Micxxni^íi<M<K3£mxnraa€^^

AACiCfàGCCCA'IXn'<íOaCX:GATCTTCTACCCCRlGCC€CCCTCCAa0CCíCÍGOCCCsejGTCCAaXlCXCC

CC€GÂG<XjtTATAJ4AGCCCFCGOGOA€CTOAAGGACi<lCCiCG€*eGí3ÇTTCT€GCCAA,R<ACCr<3AGC

G^C^GCCCTGAGGGAÂGGCCTTOGC^TCCCGCaXTACGáCmCCCÇATCiCTOTCGCCTACCIOC

•|^0à<XOTO^CAC^<XX<XaMIGOQGTOOCCC®«SCQCXAC^acaaOGAOtGOA€OGMGAQ GCAaGC^AaTO<XCCCCCTricaMCtA®XI€mmXAàCCrOTGGCíetl4GCC¥I0A0GCiGGÁ aOAMGCjí^CCmtJaCTITACiXGGAGGmSAGAGGCGCCrrrCCGCTOfCtmmCCeACáfGGÂ

GGCCA£!XSGCKKffGCGCOTGCiMXRíCXCIARnt]AGÍ^CCfTGTO^CTOGÂG<íTGí3€CGAGGAGÂT

C«Ce^CcrçGAfâCX€GAÒOta:tOTCOTG0CaGÇ€ACCGCIlGMC€TCAACl€C€<3H3GAC€A

GCTGGAA^GGltXlXmTGÂCmGCTÂGaGCn^CCGCCÃTCGGCMOACGGAGAAGAGCGGCAA ÍKOCIOCA€CACH2ÍKX^CreTCOÍtKSi^

GCaiGTACC^GGAeXTC^CXAAGCTGAAGAGCACCOAC^TirmCCCCTfGCOSGAC^TCATCCÃOCC

CAGGAC^GeÇGC€ICa^€CC©CTmAACCAGâa^eCÃCGGC€ACGGGCAGGCTAAGIAG€TC

CGÂ'TOCCAA:CXGXXvAGÃ.GGA1XCXXG^CC^CACGCCGCTTGCíG€AOâG;GA1XCGC€G®GCC'!TCAT

CG€CGAGCMGOGiWG©iT!WrfGG1GOCCX;TeCiA€ÍA.TAG£ÍCAôÂTÂGiMiO'CJAGílGrGOtj<3€CC:A

ÇCrÇTOCGG€GACGAGAACGTGAlXÍC^XGTClTC^GGAG0GCí€GGGAÇATCCACAGGtMGACÇCC eAGCTOGArGm^GCGTCCCOCGGGAGeCCOTGGACÇCCCmATGCGCÇGOGCGGCCAAaACCAr CAACITCGGÍK^lCCTOAf^CKAlGTtX^CC^ACGGCCffiTCCX^ÀOfâAGCMGCíCíATÍSCCTfACXíACí

CiAGGQXAGOOCWCAriAÂGCGCfAGll^lXlRMCMÍTTC^AM.AGíjRRlGOGCGRIGAlXGAiMAG A0ACCTAÕAOCXOT0GTC^AGAÇCGTGaHmAGC^GCCaiAC»aXAl^G€Cn€AACATG€CCí3 m^GGãmCCGCC<K:COACCfaAmAAOCTGíXIAlXWC»AA^TCffCm:AGÒClBaA<ÍOAAÃ

TGOG0GCXÁ6GÂTGGTCC1^CAGGr€X:ACGACG,AGCTGGTCCTCíÍÂGGCCCCAAAAG-AGAòGCIOG

GÁGGC€%xrGfâ€tX.GGCTCMK-CAÂCsGAG0ííGAT<|<MG(K5GG1fGÍA1G:<GC3<O(iCCGTGÇCfX’fG<ÍÂG

GTGGAíS^jDQGGGATAGGCiGAGGACrGGCtGlOCGCCAÂGGÂGTGAGT 131

Clone de extensão de desemparelhamento M.4: Sequência d.e aminoácidos HMy<KSmAímánm>TOqiJimELVISJLGLm^¥i^YEM)PVLàSLAiaOMB3VE\^tÂl3K; DId/QLLSDIiiHV:yiFBQ\liTfAWLWEKY0:í#ad>QWABYRALTeDEam4]J\SVKGlOEim «m,AK0uvLMjagaimm^imiíXÁmots^^ W<MJGEBIOXWLYI(E¥IMLSÃYLAIÍMEAT0Yyj3Vâ¥XMJl^VMIÂmeAlWaLAíaPm

RT0MJt1TOIQTATAf6M^$0l^<^l*VEtPXJfôQ^MI^lAlEOWXlíVálíDYB^^LRVLASLSC®B

LAMTOFimEEyGAimLQ¥HPSCTimArSME^mAKiYMEQVYfLAVH^e¥©ÍGE0WiS

AKB

Nota: 6 Aminoácidos do terminal N não determinados 132

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Medicai Research Council <120> Método de Evolução Dirigida <130> P8257WO <160> 28 <170> Patentln versão 3.0

<210> 1 <211> 62 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> - sequência sintética sctctttt tgagcccaag <221> caracteristica_misc <223> Descrição da sequência artificiai (Iniciador 1) designação - TaqbaXba <400> i ggcaactcta gataacgagg gcaaaaaatg cgtggtatgc tt "60 62 <210> 2 133

<211> 43 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> caracteristica_misc sintética <223> Descrição da sequência artificial - sequência (Iniciador 2) desiqnação - TaqfoSal <4GG> 2 gcqgtgcgga gtcgactcac tccttggcgg agagccagtc ctc 43

<210> 3 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> caracteristica_misc sintética <223> Descrição da sequência artificial - sequência (Iniciador 3) , designação - 88ba4 <400> 3 aaaaatcfcag ataa.cgaggg caa 23

<210> 4 <211> 28 <212> ADN 134 <213> Sequência artificial <22 0> <221> caracteristica_misc <223> Descrição da sequência artificial - sequência sintética (Iniciador 4) , designação - 88fo2 X A A V Λ % ^ V V X* ‘ i g qgfc cjac gc ca agcg áccâcoqaac t 28"

<210> 5 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> caracteristica_misc <223> Descrição da sequência artificial - sequência sintética (Iniciador 5) , designação - Taqba(scr)

<400> S gggtaeqtgg aaaccctctt cggcc 2S"

<210> 6 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência artificial 135 <22 0> <221> característica_misc <223> Descrição da sequência artificial - sequência sintética (Iniciador 6) , designação - LMB2 <4QQ> β gtaaaacfâc qgccagt 17

<210> 7 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> caracteristica_misc <223> Descrição da sequência artificial - sequência sintética (Iniciador 7) , designação - LMB3 «00> 7 çaqqaaâcaq cfcafcgae. 17

<210> 8 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial 136 <22 0> <221> característica_misc sintética <223> Descrição da sequência artificial - sequência (Iniciador 8) , designação - 88ba4LMB3 <40G> 8 caqg&aacag ctâtgacaãa ââtctagata acgagggcaa '"'40

<210> 9 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> característica_misc sintética <223> Descrição da sequência artificial - sequência (Iniciador 9) , designação - 88fo2LMB2 <4QG> 9 gtaaâacgac ggceagtacc acegaactgc gggtgacgcc aagcg 45

<210> 10 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> 137 <221> característica_misc sintética <223> Descrição da sequência artificial - sequência (Iniciador 1

0, designação - LMB388ba5WA <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (38)..(38) <223> desemparelhamento a-g <400> 10 caqaaaâe&g ctatgacaaa aatctagata aegaggga "3Θ

<210> 11 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> caracteristica_misc sintética <223> Descrição da sequência artificial - sequência (Iniciador 1

1, designação - 8fo2WC <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (45)..(45) <223> desemparelhamento c-c 138 < 4 Ο Ο > gtaaaacgac 45 ggeeagtacc accgaactgc ;gcc aagcc

<210> 12 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> característica_misc <223> Descrição da sequência artificial - sequência sintética (Iniciador 1 2, designação - LBA23 <4Q0> 12 sttttc tc ggagtagatg 26

<210> 13 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> característica_misc <223> Descrição da sequência artificial - sequência sintética (Iniciador 1 3, designação - LF046 139 < 4 Ο Ο > 13 gctetggtts fcctgcdtcât cgtctgcc

<210> 14 <211> 2500 <212> ADN <213> Thermus aquaticus <22 0> <221> característica_misc <223> Clone termoestável T7-88 <40· ίυ:^· 14 aacçfctggta t .0* ví V ; k-' ttttgagccc aagggtcgí : cct cctggt ggaeggceac 140 eo λ caeetgcfoct 120' accgcacctt ccâcgccctg aaggqcctca ccaccagccg qtgeaggegq 180 tctacgqctt egccaagage ctcctcaagg eeetcaagga qgacgqggac gcggtqateg 240 tggtctttgã cgccaaggcc cectcetccc gccacgaggc ctacgggggg fcáoaaqgcgg 30Ó qcvqqqcccc cacgccggaf qactt fceccc çgeaaetegc cctcatcAag cragctggtgg 360 acctcstggg gctggçgcgc ctcgaggtec cgggctaçga ggcggacgac gtcctgqceã 420' gcctgqccaa gaagqcggaa aàggãgggct aegaggtceg c&tcctcace qccqaesaag 480 acctttacca gctcctttcc gaccgc&tcc scgtcetceâ ccccgagqgg tacctcatca 540 eeecggeetg gctttgqgaa aagtaoggcc tgâggcccga ccagtgggcc Cía.ctSCcgqq 600 çcctgacçqq qgâcqâgtcc gaoaacctte ccggggtcãá gggcatcgqg qâqaãgacgq §60 cgaagaagct tctggaggag tgggggagce tggaagcccfc ectcgagaae ctaqaecqge 720 tgaagcccgc catccgggag aagatcctgg cccacacgga egatctgaag ctctcctqga 780 acctggccaa ggtgcqcaeç gacctgfieçc tggaggtgga Cttcgccaaa aggcgggagc 840 eegaceggga gaggcttagg gcctfctctqg ágaçgcttga gtttggcagc etcctecâçq 900 âgttcggcct tctggaaagc qccaaggccc tggaggâggc cccctggcGc ccgccaqaáa ' 960' gggccttcgt gggetttgtg ctttcccgca aggagcccat gtgggcagat cttctggcee 1020 tggccgccgc cagggggqgc cgggtocacc gggcccccga gçcttataaa gccctcaggg acttgaagga ggcgdggggg cttctcgccâ aagacc-tgag cgttctggcc 141 1080 ctaâqqgasf X i 4 0 gqgttggcçt cçcgçcçggc gacgacccca tgctcctcgc CtacctCGtq qacccticcâ 1200 acaccacccc cgagggggtg gçççggcgct acggcgggga gtggacggsg gaqqicqgqgg 12€0 agcgggccgc cctttccgag aggetctlcg ccaacctgtg qgggaggett qagggggaga 1320 ttggctttac cgggaggtgg agaggçcçct ttccfctgte ctgscccáca 1380 tggaggccac gggggtçcgc ctggacgtgg cctatctcag ggccttgtcc ctqgagqtçtq 1440 ccgaggagat cqcccgcctc gaggccgagg tcttccgçct ggccggccac ccctfceaacc 1500 tcaact.cccg ggaccagct g gaaagggtqc: tctttgãága getàgggctt Gccgccsteg 1560 gcaagácggá gaagaccggc aagcgctçca ccagcgccge cgtcctggag occctceacq 1620 aggcccaccc catcgtggag aagatcctgc agtaccggga gctcaçcaâg ctgaaqaqea 1680 cctacattga ccccttgcog gacctcatcc accccaggac gggccgcctc cacâcccgct 1740 tcaaccagac ggccacggcc acgggcâggc taagtagctc cgateecaac ctceagaaca 1800 tccccgtc-cg caccccgctt gggeagaggã tccgcegggc cttcatcgcc gaqqaqqgqt í §60 " ggctattggt ggtoctggác tátâgcçaga tagagctcag gçtgctg g e c cacctctccg 1020 gcgacgagaa cctgatccgg gtcttcCàgg aggggcggga catccâcacg gaaaccqcça 1 §80 ' gctggatgtt cggcgtcccc çgggaggccg tggaccccct gatgcgccgg qcggecââgã 2040 ccatcaactt cggggttctc tacggcatgt cggcccaccg cctctcccag qqqctaacea 2100* tcccttacga ggaggeoDâg gccttcattg agegctactt tcágagçttc 142 cccaagqfcgc aggç-ri-qgàt tgagaagaec ctggaggagq gcaggaggcg ggggtacgtg 2160 '' '' ^ "~Vv oaciaccctct tcgg^tea ccgctaogtg ccagacctag aggcccgggt gaagagcgtg 2220 cgggaggcqg ccgageeea* ÍWecttcaae atgcccgtcc agggcaccgc cgccgaccte 2230 ' ataaagctgg ctãtmlQ** ^stcttcccc aggctggagg aaatgggggc caggatgctc £340 ' " cttcaqgtcc acg*cg*gCt gçtcetegag gccccaaaag agagggcgga ggccgtggcc 2400 cgcrctgqeca aagaggtr»t tateeeetgg ecgtgcecct ggaggtggag '24 €Ò" ' ' gtqqggatâa aqgâggactg qcfcctctqcc âaggagtgag 2500

<210> 15 <211> 829 <212> PRT <213> Thermus aquaticus <220> <221> característica_misc <223> Clone termoestável T7-88: Sequência de Aminoácidos 143 <400> 15 Mel. *€ Leu Fro Leu Phè •l·' Giu Fro Lys His His Leu Ala 20 Tyr Arg Thr Phe Sèr hrq G1 y 35 Giu Fro Va.l Gin A..1,0 40: Leu Lys 50 alá Leu Lys Giu Asp 553 Gly Ala Lys Ala Fro Sor Sor &rg 70 His Gly Arg Alá, Fro Thr 85 Fro Giu Asp

Gly Arq val Leu 10 Leu Val ÃSp 1 s Gly His 25 Ala Leu Lys Gly Leu 30 Thr Thr Vã 1 Tyr Gly Phe Ala Lys 45 Ser Leu Asp Ala Vai Ile 60 Val Val Phê Asp Giu Ala Tyr Gly 75 Gly Tyr Lys Ala 80 P.he Fro Arg Gin CSÕ y v? Lau Ala Leu 95 II© 144

Lys Glu Leu Vai Asp Léu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu. Vai Fro Gly 100 105 110 fyr Glu Ala Asp ASp Vai Leu Ala Ser Leu A1Λ Lys Lys Ala Glu Lys 115 120 125 Glu Gly Tyi? Glu Vai Arg Ile Leu Thr Alã Asp Lys Asp Leu Tyr Gin 130 135 140 Leu Leu Ser ÃSp Arg Ile uig Vai Leu. Hís Fro Glu Gly Tyr Leu Ile 145 150 .155 160 Thr Fro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro Asp Gin Trp 1.65 170 175 Ma Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn Leu Fro Gly 180 185 .190 Vai Lys Gly Ile Gly Glu Ly© Thr Ala Lys Lys Leu Leu Glu Glu Trp 195 200 205 Gly Ser Leu Glu Ala Léu Léu G ia Asn Leu Asp Arg Leu Lys Fro Ala 210 215 220 Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala Bis Thr Asp As:p Leu Lys Leu Ser Trp 215 230 23S 240 Asp Leu Ala Lys Vai Arg Thr Asp Leu Fro Leu Glu Vai Asp Phe Ala 245 2 5 0: 255 Lys Arg Arg Glu Pt O Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ai® Phe Leu Glu Arg 260 260 270 Leu Glu P.he Gly Ser Leu Leu HiS Glu Fhe Gly Leu Leu Glu Ser Fro 2 ? 5 2SÕ 285 LyS Ala Leu Glu Gl u A.la Fro Trp Fro Fro Fro Glu Gly Ala Phe vai 290 295 300 Gly Phe Vai Leu Ser Arg Lys Glu Oro Met Trp Ala. ÃSp leu Leu Ala 305 310 315 320 Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Vai Ris Arg âia Fro Glu Fro Tyr 325 330 335 Lys Ala Leu Àtq Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu Ala Lys Asp 340 345 350 Leu Ser Vai Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Fro Fro Gly .Aàp 355 360 365 Asp Pro Het Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Fro Ser Asa Thr Thr Pro 145 370

Glu Giy 385 Vai Ala. Glu Arg Ala Ala Leu Glu Gly Glu 420 Pro Leu Ser 435 Ala Asp Vai 450 .Ala fyr Ala 465 Arg Leu Glu Leu Asn Ser Arg Leu Pro Ala Ile 500 Ala Ala Vai sis Leu 1.1 a Léu 530 Gin Tyx Pro 545 Leu Pro Asp Pb.® As® Gin Thr Ast'i LéU Gin Asn 580 Arg Ala Fhe 595 Ile Ssr Glft 610 11® L i U Leu 62 S lis Arg Vai Ser Trp Ket Pire 375

Arg Arg 300 Tyr Gly Leu 4 OS Ser Glu Arg Glu Arg Léu Leu Vai Leu Ala His 440 Le u Arg Ma 4 55 Leu Ala Glu 470 Vai Phe âsp 485 Gin Leu Glu G1 y Lys Thr Glu Glu âla Leu Arg 520 Arg Glu Leu 535 Thr Leu lie 550 His Pro Ala 565 Thr Ala Thr Ile Pro Vai Arg Ala G1 y G1 u Giy 600 Leu Arg Vai 615 Leu Fhe Gin 630 Glu Gly Gly 645 Vai Pro Arg 380

Gly Glu Trp 395 Thr Leu Phe 410 Ala A.sn Trp 425 Léu Tyr Arg Hat Glu Ala Thr $er Leu Glu Vai 460 Arg Leu Ala 475 G.l y Arg Vai 4 90 Leu Phe Lys SOS Thr Gly Lys Glu Ai a His Pro Lys Leu Lys Ser 540 Arg Thr Gly 555 Arg Gly Arg 5? Õ Leu Ser Thr 585 Pro Leu Gly Trp Leu Leu Vai Ara His Leu Ser 620 Arg Asp Ile 635 His Glu. Ala 650 Vai ASp

Glu Glu Ala Gly 400 Leu Trp Giy Arg 415 Glu Vai 430 Glu Arg Gly 4 45 Vai Arg Leu Ala Glu Glu Ile .His Pro Pha A.sn 480 Asp Glu Leu 495 Gly Arg Ser 510 Thr Ser Ile 52.5 Vai Glu Lys Thr Tyr Ile Asp Léu his Thr Arg 560 Ser Ser Asp 575 Pro Gin Arg 590 Ile Arg Vai SOS Leu Asp Tyr Gly Asp Glu Asm Thr Glu Thr Ala 640 Pro Leu Het. 655 Arg 146

PiTQ Ala Ala Lys Thr 11« Asn Phe Gly Vôl Leu Tyr Gly Met Sor Ala 660 665 670 His Arg Leu Ser Gin GI u Leu Ala lie Pro Tyr Glu G .1 u Ala Glu AI a 675 6 B 0 685 Phe 11 e Glu Arg Tyr iPhe Gin Ser Phe Pro Lyô Val Arg Ala Trp 1 le 690 505 700 Glu Lye Thr leu Glu Glu Gly Arq Arg Arg Gly Tyr Val Glu Thr u 705 710 715 720 Fhe Giy Arg Arg Arq Tyr Val F r c hsp Leu Glu Ala Arg Val LVS Ser 725 730 735 Vai Arg Glu Ala Ala G1U Arg I4et Ala Fhõ Asn Hat Pro Val GIr Gly 740 745 750 Thr Ala Ala Asp Leu. Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro Arg 755 760 765 Leu Glu Glu mt Gly Ala Arg Mefc Leu Leu Gin Val His Asp Glu Lee 770 7 75 780 Vai leu Glu Ala Pr o Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala Arg Leu Ala 785 7 90 195 800 Lys Glu Vai Me I: Glu Gly Val Tyr Pr o Leu Ala Val PrO Lee Glu Val aos 810 815 Glu Vai Gly 11¾ Gly Glu Asp Irp Leu Ser Ala Lys Glu 820: 825

<210> 16 <211> 2554 <212> ADN <213> Thermus aquaticus <22 0> <221> característica_misc <223> Clone termoestável Τ9: Sequência de Ácido Nucleico 147 <22 0> <221> característica_misc <222> (2553) . . (2554) <223> "η" pode ser qualquer um de a, c, t, g <400> 16 qatgctccct ctttttgagí ccaagçgtcg cgtcctcctg gtggaeggce accacctggc 148 60 ctaccqcâcc 120 ttccacgccc tgaagggcct caccâocágc cggggggagc cggtgcaggc aqtctaegqc 180 tccgcc-Dága gcctcctcââ ggccctcaaq gaggacgggg acgcggtgat cgfcqgtottt 240 gacgcaaagg ccccctcctt ccgccacgag gcctacgggg ggfcãcaaggc qggecgggec 300 cceacgccgg aggactttce «cggcaactc gccctcatca aggagctggt qq&eetcctg 3«0 W«*OTcgc gectcgaggt cecgggcfcsc gaggcggacg açgtcctggí- caqcctggce 420 aagaaggcgg aaaaggaggg ctacgaggtc cgcatcctoa ccgccgacsa aqâcctttac 480 cagctccttt ccgaccgeat ccaogteete c&ccccgagg ggtacctcat c&ccccqqcc 540 tggctttggcj aaaagtacgg côtgaggccc gaccagtggg ccgactaccg qgccctqaco 600 ggqgaçgagt ccgacaacct tcccggggtc aâgggcâtcg gggagaagac ggegaggaag 660 cttctggsgg agtgggggag cctggaagcc ctcctcaaiga acctggascg qctqaagccc 720 gccateeggg agaag&tcct ggcccacatg gacgatctga aqctctcctg acracctgqce 780 aaggtgcgca ccgaectgcc cctggaggtg gactfccgcca aa&ggoggga aàccgâccqg 840 gagaggctta gggcctttet gfágággctt. gagcttggca gcctcctcca cq&Qtlcqqc 900 efcictggaaa gccccaaggc ccfcggaggag gcctcctggc cccegccgga agqqgcctte 960 gtgggctttg tgccttcccg caaggagççc atgtgggccg atcttctggc cctqgccgcc 1020 gccagggggg gecgggtcea ccgggccíccG gagcettata àâgccctcag aqacctgaag 1080 g&ggcgeggg ggcttctcgc ca&ag&cefcg agcgfctctgg ccctgaqgçia 149 aqaccttqac 114 0 ctcccgcccg gcfacgaçcG Gatgctectc gcctacctce tggacccttc caâcaccacc 1200 ccegaggggg tggcccggçg ctaeqgcggg gagtgqacgg aggaggcggg çgagcgggcc 1260 gccctttçcg agággctctt cgeeaaectg tçggggaggc ttgaggqggâ gqaqaqgete ' " 1320 ctttggcttt acçggqàgqt ggagaggcscc! ctttccgctg tççtggccca catqqsqgcc 1380' scgggggtqc gcçtggacgt ggcctatctc agggcet tçjt cçctggaggt ggeegaggag 1440 atcgcccgcc tcgaggocga ggtcttccge ctggcçggcc accGcttcaa cctcaactcc 1500 cgagaçcagc tggaaagggt o ç t o fc i. v g a G gagctagggc ttcccgccat cggeaaqseq "1560* gagaagaceg gcaagcgctc caceagcgcc gccgtcctgg âggcçcfeccg eqaqqeceae 1620 cecatcgtgg agaagatcct gcagtâ.ccgg gageteacca agctgaagag crscctacatt 1680 gaççccttgc çggaçctcât i. ‘v -í3 ‘w ^ Λκ- ^ Çj acgggecqcc tccacacccg ettçaaccsq 1740 acggcçacgcí ccacgggçâg gctaagtagc tcegatccca aectecagaa CâtCccçqtc 1800 cgcãccccgc tfcgggcagag gatecgcçgg gccttcatcg ccgaggaqgq gtgqctattg 1860: gtggccctgg actatagcca gatagagctc agggtgctgg cccacctete eqqoqâcgaq ' Í920 aacctgatcc gggtcileea go^gaggcgg gacatcescâ, cggagaccgc e&gcfcggatq 1880 ticggegtee cccgggaggc cgtggacece etg&tgegcc gggcggccaa gaeeatcaac 2040 ttcggggtcc totacqgcat gtcggeeaec gcctctccca ggagctagcc atcccttacg âggaggccca ggccttoatt gâgcgctaet ttcagagctt ecceaaggtg 2100 150 çgggçetggâ 2160 ttgagaaqac cctggaggag ggcaggaggc gggggtacgt ggagacecte ttcgqccqcc 2220 gccgctacgt gccagaccta gaggcccggg tgaagagcgt gcgggaggcg Qccqagcgca 2280 fcggecttxaâ catgcccgtc cagggcaccg ccgccgacct cafegaagctg qctatgqtga 2330 agctcttccc c a ggctggag gaaatggggg ccaggatgct ccttcaggtc caccjacqsofc 2400 ” t qqteCtCga ggccccaaaa gagaggge9<J aggccgtggc ccqgctggcc aaçgaqqtca 2 4 6Ò' tggsgggggt gtatcccctg gçcgtgcccc igga-ggtqga ggtggggata. qgggagqact 2520 ggctctqcgc caaggaggga gt-cgacctgo aggcagcgct tggcgtcac.c oqcaqttcqg ' 2554 tggtactggc cgtcgtttta cann <210> 17 <211> 829

<212> PRT <213> Thermus aquaticus <22 0> <221> característica_misc <223> Clone termoestável Τ9: Sequência de Aminoácidos 151

<40Q» XI mt Lêu Pro Léu Phè 01« S Pito Lys .Bis Bis Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Ser Arg ítH >? is.i.y 85 Glu Pro Vai Glá Ala 40 Leu Lys £ Λ w1· V Ma Leu Lyo (Uu Asp 55 Oly Ala 6$ Lys Pila Pro Ser Phe 7 0 Arg His

Gly Arg Và.l Leu Leu 10 Vai Asp 15 Gly His Ala Lsut Lys Gly 25 Léu 30 Tlir Thr Vai 'Tyr Gly Phe Ala 45 Lys Sèr Leu Asp Alã Vai lie Vai €0 Val Phe Asp Glu Ala Tyr Gly Gly Tyr Lys Ai a 80 152

Gly Ara Ais Pro Thr Iro Glu Asp Phe Pro Arg Gin Lèu Ala Leu lie 85 90 35 Lys Glu Leu ¥al Aap Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu Val Pro Gly 100 105 110 Tyr Glu Ala A:?p Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys Al a Glu. Lys 115 120 125 Glu Gly Tyr Glu Vai Arg lie Leu Thr Ala Asp Lye Asp Leu Tyr Gin 130 135 140 Leu Leu Ser Asp Arg lie Eis Val Leu His Pro Glu Gly Tyr Lõã Ile 145 150 155 160 Thr Pr o Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu. Arg Pro Asp Gin Trp 165 170 175 Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asa Leu Pro Gly 180 185 190 Vai Lys Gly lie Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu Glu Glu Trp 195 200 aos Gly Ser Leu (a .1U. Ala Leu Leu Ly s Asn Lau Asp Arg Leu Lys Pro Ala 210 215 220 lie Arg G1 u Lys lie Leu Ala Mra Hat Asp Asp Lau Lys Leu Ser Trp 225 230 235 240 Aãp Léu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val Asp Lhe Ala 245 250 255 .Lys Arg Arg Glu ?ro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Alâ Phe Leu Glu Arg 260 265 270 Leu Glu Leu Gly Ser Leu Leu Eis Glu ?he Gly Leu Leu Glu Ser Pro 275 280 285 Lys Ala Leu Glu Gi tl Ai ã Ser Trp Pr o pro Pro Glu Gly Ala Fbe Val 290 295 300 Gly Phé val Leu Ser Arg Lys GU Pro Mel. Trp- Ala Asp Leu Leu Ala 305 31Ò 315 320 Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val Hls Arg Ala Pro Glu Pro Tyr 325 330 335 Lys Ala Ley Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Léu Ala Lys Asp 340 345 350 Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly Asp 153 3S5 3S0 365

Asp Pro &et Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro 320 37S 380 Glu Gly Val Aid, A.rg Arq Tyr Giy Gly Glu Trp Thr Glu Glu Ala Gly 385 39Õ 395 400 Glu Arg Ala Ãla Lao Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu Trp Gly Arg 405 410 415 Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu Arg 420 425 430 Pro Leu Ser Ãlã Val Leu Ala His Mat Glu Ala Thr Gly Va 1 At: Q Leu 435 440 4 4 S Asp val. Ma Tyr Leu Arg Ala Leu. Ser Leu Glu Val Ala Glu Glu lie 430 4SS 460 Ala. Arg Leu G1 u Ala Glu Val Fbe Ãrg Leu Ala Gly His Pro Pha Asn 465 4 70 475 48Q Leu Asn Ser Arg Asp Gin Leu Glu Arg Val. Leu l?he Asp Glu Leu Gly 485 4 90 495 Leu Pro Ale lie Gly LyS Thr Glu Lys Thr Giy Lys Axq Ser Thr Ser SOO 505 5X0 A lã Mã Val Leu Glu Ala í . j. : Arq G1U A λ a His Fro Ile Val Glu Lys 515 52 ó 525 I i Leu Gin Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr lie Asp 530 535 540 Pro Leu Pro Asp Leu lie HiS Fro Arg Thr Gly Aro Leu His Thr Arg 54 S SS0 555 SCO Phe Asn uin Thr .Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp Pro 565 570 575 Asn Leu G iO. Asa lie Pro Val Aro Thr Pro· Leu Gly Gin Arg lie Arg 580 585 S 90 Aro: Ala Phè 11® Ala Glu Glu Giy Trp Leu Leu Val Ala Leu Asp Tyr 595 600 60.5 Ser Glu He Glu Léu Arg Vai Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn 610 615 €20 Leu, Ue Arg Vul Phô Glu Glu Gly Arg Aap Ile his Thr Glu Thr Ala 625 630 63 5 640 154 8ê.e fyp Met Phs Gly 645 Vai Oro Arg Arg Ala Ala :: λγ-Λ *.·*£ S- 660 Thr 11« hsn Phe Hl 3 Arg Leu 675 Ser Gin Glu Leu Ala 680 Phe Ile 690 Glu Arg Tyr Phe Gin 695 Ser 705 Lys Thr Leu Glu Glu 710 Gly Arg Phe G ly Axg Arg Ãrg: 725 Tyr Vai Pro i—í Arg Glu Ala 740 Ala Glu Axg Met Thr Ala Ala 755 Asp Leu. mt Lys Leu 760 Leu G.1.U 770 Glu Met Gly A1. a. Arg 775 Met Vai 78$ Leu Glu Ala Fto Lys 790 Glu Arg Lys Glu Vai Met Glu 805 Gly Vai Tyr Via Vai Gly 11« 820 Gly Λ V í s. A. U. Asp Trp VS Λ. Aí Ala 650 Vai Assp Pro Leu Met 655 Arg Gly 66$ Vai r.·» e νΛ Tyr (: i y Met Ser 670 Ala. 11« Pro Tyr Glu Glu 685 Ala Gin Ala Phe ?.to Lys V cl 1 700 Arg Ala Trp 11« Arg Arg G i y 715 Tyr Ussl f ‘Λνίν Glu Thr L^jí 720 Asp Lési 730 Glu Ala Arg Vai Lys 735 Ser Ala 745 Phe Asn Met Pro Vai Gin 750 Gly Ala Met Vai Lys u e ií 7 65 Phe Pro Arg Leu. Leu Glh Vai 780 His Asp Glu Leu Ai a Glu Ala 795 Vai Ala Arg Leu Ma 800 Pro Leu 810 Ala V a .1. Pro Leu Gxu 815 Vai Leu Ser Ala Lys 825

<210> 18 <211> 829 <212> PRT <213> Thermus aquaticus <22 0>

Sequência de Aminoácidos <221> característica_misc <223> Clone termoestável Τ13: 155 <4Q0> 18

c-fet Leu Pro Leu Phe Glu Pre Lys 1 S

His H.is Leu Ala fyr Arg Thr Phe 20

Ser &rq Gly 51u Pro Vai Sln Ala '35 4 0

Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly 50 55

Ala L-vs Ala Pro Ser Lhe Arg Hís 65 ' 70

Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp 9 5

Lys Glu Leu Vai Aep Leu Leu Gly 100

Tyr Slu Ala Asp Asp Vai Leu Ala 115 “ 120

Glu Gly Tyr Glu vai Arg Ik Leu 13ò 135

Leu Leu Ser Asp Arq lia H.is Vai 145 15Q

Thr Pro Ala Tr» Leu Trp Glu Lys 165

Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly 180

Vai Lys Gly Lie Gly Glu Lys Thr 195 200

Giy Ser Leu Glu Ala Leu Leu GIu 210 215 lie Ar» Glu Lys lie Leu Ala Hís 225 ‘ 230

As» Leu Ala Lys Vai Arq Thr Asp 245

Lys Are Arg GIu Pro Asp Arg Glu 260

Leu Glu Ph© Gly Ser Leis Leu Bis 273 * 280

Lys Alâ Leu Glu Glu Ala Pro Trp

Arg Vai Leu Leu Vai As» Gly 10" 15*

Ala Leu Lys Gly Leu 30 Thr Thr Tyr Gly Phs Ala Lys 4 5 Ser Leu Ala Vai íie 60 Vai Vai Phe As:; Alá Tyr 75 Gly Gly Tyr Lys Ala 80 Pro Arq 80 Gin LôU Ala Leu 85 lie Ala Arg Leu Glu Vai 110 Pro Gly Leu Ala Lys Lys Ala 125 Glu Lys Ala Asp Lys 140 Asp Leu Tyr Gin His Pro 155 Glu Gly Tyr Leu lie 160 Giv 170 Leu Arg: Pro Asp Gin 175 Trp Glu Ser Asp Asn Leu 190 Pro Gly Lys Lys Le u Leu Glu 205 Glu Trp Leu Asp Arq 220 Leu Lys Pro Ala Asp Asp 235 Leu Lys Leis Ser Trp 240 Oro 250 Leu Glu Vai Asp Phe 253 Ale Leu Arg A ia Phe Leu 270 Glu Arg Phe Gly LêU Leu Glu 28 5 Ser Pro Pro Pro Glu Gly Ala Phe Vai 156 2::90 295 300

Gly Fhé Vai Leu Ser Arq Lya Glu Oro Met Trp Ala Asp Leu Leu Ala 305 310 315 320 Leu Ala Ai ·:3 Ala Arg Gly Gly Arg Vai his Arg Ala Fro Glu Fro Tyr 32 S 330 335 Lys Ala Leu Arq .Asp Leu Lyu Glu Ala Arg Gly Leu Leu Ala Lys Asp 340 34 5 3S0 Leu Ser Vai Leu Ala Leu Arg Glu GXv Leu Gly Leu Fro Pro Gly Asp 3S5 360 363 Asp Pr o Met Leu Léu Ala Tvr Leu Léu Asp Fro Ser Asn Thr Thr Pr o 370 375 360 Glu Gly Vai Ala Arg Arq Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu Glu Ala Gly 3S5 390 395 400 01 u Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Ph.a Ala Asn Leu Trp Gly Arg 405 410 415 Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Vai Glu Arg 420 425 4.30 Pro Leu Ser Ala Vai Leu Ma His Met Glu Ala Thr Gly Vai Arg Leu 4 35 440 445 Asp Vai Ala Tyx Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Vai Alá Glu Glu Ile 450 455 460 Ala Arg Leu Glu Ala Glu 'Vai Lhe Arg Leu Ala Gly His Pr o Fhe Aan 465 470 4 ? S 480 L.au Asn Ser Arg Asp Gin Leu Glu Arg Vai Leu Phe ftssp Glu Leu Gly 435 490· m Leu Pr o Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr Ser 500 505 510 Ala Ala Vai Leu Glu Ala Leu Arq Glu Ala His Pr o lie Vai Glu Lys 515 520 525 Ue Leu Gin Tyr Arg Glu Leu fhr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr lie Asp 530 535 540 Pr O Lsu Fr o Asp Leu lie His Fro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr Arg 545 550 SSS SÊÒ Phe Asa Gin Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg: Leu Ser Ser Sèr Asp Pr o 565 570· 575 157

Th. ri Leu Gifí Asm 580 Ar g Ala ?he 595 Ile :3βϊ' Gin Ile Glu 610 L®U Ile Arg Vai 625 Ser Trp Met Fhs Arg Ala Alá Lys 6 60 His Árg 675 Ser Ε'Ηβ llm 690 (.i i ιλ Arg 0,1 u. Lys Thr Τ,Λϋ···: v> Ifs^ f ·-· v ΏΗ sa. •fcr > V Gly Arg Arg Vai Arg Glu Ala 740 Thr Ala Ala Asp 755 Leu Glu Glu Mat ? 7 0 Vã 1 Leu Glu Ala 78:5 Lyá Glu Vai Met G1 u Vai 'o 1. y 11© 820 1.1 e Oro Vai Arg Ai a Glu Glu Gly 600 L^U Arg Va i 615 Leu Phe G .1. π 630 G.lu Gly Gly 645 V 3. Pxo Arg Thr Ile Asn Phe Gin Glu Leu A..Í. iâ 680 Tyr lhe Glu 695 Ser Glu Glu 710 Gly Arg Arg Ί ^ ζ Tyr Vai Pr o ΑΙ·ϊ5. Glu Arg Met Leu Met Lys Leu 760 Gly A.1 a Arg 775 Met Pro Lys 700 Glu Arg Glu SOS f·* s , Vai Tyr Gly Glu Asp Trp

Thr 585 Pro Leu Gly Trp i.iSU Va 1 Ale Bis Leu Ser 620 Arg AS P* lie 635 ϋκξ i α >.·> -A'. Lv· G :l U Ala 650 Vai L. !«Λ nv rt.sp Gly 665 Vai IiBu Tyr 11. ê Pro T.y.r Glu. Phe Pro Lys Vai í l^U Arg Arg Gly Tyr 715 Asp Leu ^3 »4. vi Ala <*> /·. Ala 745 Phe Aso Met A-i<s Met Vai Lys Leu Leu. Glu. Vai 7 S 0 &.la Glu Ala 795 Vai Pro Τ,ήϊϊΐ l/L.. v-, 810 Ala Vai Ii@'U Ser Ala Lvs B25

Gin Arg 5 90 Ile Arg Vai Leu 605 Asp Tyr Gly Asp Glu Asn Thr Glu Thr Ala í>4 0 Pro Leu Met 655 Arg Gly Met S70 Ser Ala Glu Ara ύ 3 5 Glu AU A x" g’ A r a Trp Ile Vai Glu Thr Lau 720 Arg Vai Lys 735 Ser Pro· Vai 750 Gin Gly Leu ?he 7 65 Pro Arg His Asp Glu Leu Ala Arg Leu Ala 000 Pro Leu V, i u 815 Vai

Glu 158

<210> 19 <211> 2499 <212> ADN <213> Thermus aquaticus <22 0> <221> característica_misc <223> Clone termoestável 8(Τ8) : Sequência de Ácidos Nucleicos 159 <400> 19 tcgtqqtaeq 60 catcctcttt ttgagcccaa gggcegcgtc ctcctggtgg acggccacca cctgacctae 120 cgcaccttcc aeçccctgaa gggcctcacc aceagecggg gggagccggt qcaqqccíqtc 160 tacggcttcg ccaâgagcct cctcaaggcc ctcaaggagg acggggacgc ggtgategtg 240 gSctttgacg çcáãggcccc ctcctcccgc cacgâggcct acggggggta casqqcggqe 300 egggcecces cgccggagga ctttccccgg çaaetcgcec tcstcààggà qctgqtgqsc 360 ctcctggggc tggcgcgcct cgaggtcccg ggctacgagg cggaçgacgt cctcrsccaac 42.0 ctgqccaagâ aggcggâaaâ ggagggctat gâggtccgca tcctcaeegc eqaeaaaqac 480 ctttaccagc tcctttccga ccgcatccac gtcetceaec ecgaggggtâ cctcatcacc 540 ccggcctggc tttgggaaâa gtacgqcctg aggc.cegacc agfcgggeegs ctacçgqgcc 000 etgaccgggg acgagtcaga caaccttcce ggggtçaagg geatcgggga qàaqacggcq 600 aagaagcttc tggaggagtg ggggâgcctg gaagccctcc tcgâgàãççt agaccgqctg 720' aagcccgcca tccggçagaa gatcctggcc caeacggacg ãtctgaagct ctcctgqgac 780 ctggccaagg tgcgsaccga cctgcccctg gaggtggact tcgccaãaãg goggqagcee 840 qaeegggaga ggcttagggc etttctggag aggcttgagt ttggcagcct ectccacqag 900 ttcggccttc tggaaagcec caaggccetg gagg&ggccc cctggeceec 160 qccggaaqgg 960 gcettcgtgg gctttgtgct ttcccgcaag gagcccatqt gggccgatct tetqqcectg 1020 gcCgCcqcca ggggtggçcg ggtCCâccgg gcccccgagc cttataasgc cctc&qqqac 108 Ô" ttgaaggagg cgcgqqgqct tctçgccaaa gacctgaqcg ttctggccct saqqqaaqgc IMO cttggcctcc cgcccggcga cgâceecatg ctcctegcet acctcctgga cúcttccaac 1200 aceacecccg agggggtggc ccçfgcgctac ggcggggagt ggacggagga ggcgggggag 1260 cgggccgccè tttccg&gag gctcttcgcc aaectgtggg ggaggcttga gggggaggag 1320 ãggctccttt ggctttaccg ggaggtggat aggccccttt ccgçtgtcct qqcccaeatg 1380 gaggccacag gggtgcgcct ggãcgtggce tatctcaggg ccttgzcccz qgagqtqgcc 1440 gaggagatcg cccgcctcga ggçcgaggte fctcegectqg ccggccaccc cttcaacctc 1500 aactcceggg secagctgga aaggqtcctc tttgacgagc tagggcttcc cqccâtcgqc ' 1560 aagacggaga agaccggcaa gcgctccacc agcgocgccg tcctqgâgge cctccqcqaq 1620 gcccacccca tcgtgq&gaa gatcctgcag taccgggagc tcsccaagct gaaqaqcacc 1680 tãcattgaçc cçttgecgga cctcatccac cccággacgg gccgcctcca cacccgcttc 1740 ssceagacgg cc&cggccac gggcaggcta açfesgctceg âtcqcaacet cçagaacatC 1800 cccgtccgcá cecegcttgg gcagaggatc cgceggçcçt tcatçgecfã ggaggggtgg 1860 ctattggtgg tcetggacta tagccagsta gagctcaggg tgctggccca cctctccggc 1920 gacgagaacc tgatccgggt cttccággag gggcgggaca tcc&caogga 161 âsccgccagc tggatgttcg gcgtçccccq: qqaqcecqtg qaceceetqa tgeqçcgqqc 1980 ggccaãqacc ateaset-lcq gggttetcta cgqoatgtca creccaccgcc tcteccaggs 2040 gctaqccatc ectfcacgagg aggecoaqge ctteãttqaq cactactttc aaagcttecc 2100 caaggtqcag gcctggattg agaa.ga.ccct qgsgqaqqgc agqaagccgq qctscqtqga 2160 gaccctcttc ggccgccgcc getacqtqcc aqacctaaac acccagataa agaccatccg 2220 ggaggcggec gagegcatgg ccttcaàcat gcçcqtccaq qgcsccqceg ecqsectcat 2280 qaaqctçqet afcqgtgaaqc tcticcceag gctqqaqgaa ataqgqqcea qgatgctect 2340 tcaqgtccac yâcqsgetgg fccctcq&gqc cceaaaagag aggqagqâqg ccatqccccg 2400 gcfcggccaag gaqgtcatqg agggggtgta tcccctgqcc qtqcccctqg aqqtqaàggfc 2460 qqqqataqgg gaqgaotgge fcetoeqccaa. gqaqtgaot 2495

<210> 20 <211> 827 <212> PRT <213> Thermus aquaticus <22 0> <221> característica_misc <223> Clone termoestável 8 (T8) : Sequência de Aminoácidos <22 0> <221> característica_misc <223> Dois primeiros aminoácidos no terminal N não sequenciados 162 <40G> 20

Pro Leu Ph.e Giu Pro Lys Gly Arg Vai Leu Leu Vai Asp Gly His His 1 5 10 15 Lsu Ala Tyr Arg Thx Phc His Ãia Leu L y s Gly Leu Thr Thr Ser Arg 20 25 30 Gly 6 1 ·.; Pro Vãl Gin Ala Vãl Tyr Gly ?hs Ma Lys Ser Leu Leu Lys 35 4 0 4 5 Ά La Lsu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Vai Ile Vai Vai £%e Asp Ala Lys 50 55 60 Ala Pro Ser Ser Arg His Giu Ala Tyr Gly Gly Tyr Lys Ala Gly Arg 65 70 75 80 Ala TL Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gin Leu Ala Leu He Lys Glu 05 30 91 Leu Vai Aap Leu Leu Gly Leu. Ala Ar.··.! L‘:V.i Glu Vai Fro Gly Tyr Giu 100 105 no Ala Asp Asp Vai Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys Ala Giu Lys Glu Gly 115 120 125 Tyr G1 e Vai Arg XXs Leu Thr Ala Asp T^ys Asp L® u Tyr Gin Leu Leu 130 135 14Ó Ser Asp Arg 11® Lis Vai Leu His Pro Giu Gly Tyr Leu. lie Thr Pro 145 150 155 1Í0 Ala T r.p Lsu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Aro Fro Asp Gin. Trp Ais Asp 155 170 175 Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Sup Giu Ser Asp As π Leu Pro Gly Vai Lys 180 185 190 Gly 11® Gly Glu lys Thr Ala Lys Lys Leu Leu Giu Giu Trp Gly Ser 195 2Ò0 205 Leu Gla Ala Leis Lâti G .1. u Asb Leu Asp Arg LêU Lys Fra Ala Ue Arg 210 215 220 Giu Lys He Leu Ala His Thr Asp Asp Leu Lys Leu Ser Trp Ãsp Leu 22$ 210 235 240 Ala Lys Vai Arg Thr Asp Leu Pro Leu Giu Vai Asp Ph® Ala Lys Arg 245 250 255 Arg Giu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg A.xu Phe Leu Giu Arg Leu Glu 260 265 270 Pb a Gly Ser Leu Léu His Giu Phe Oly Leu Lea Giu Ser Pro Lys Ala 2 7 5 280 285 Leu Gla Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Giu G.ly Ala Phe Vai Gly Phs 200 2S5 300 163 val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Bet Trp Ala Asp Leu Leu Ala Leu Ai® 30 S 310 315 320 Ala M.a Arg Gly Gly Arg Val. lii ã Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Lys Ala 325 330 3.35 Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ser 340 34 5 350 val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly Asp Asp Pro 355 360 365 Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu h&p Pro Ser Asa Thr Thr Pro Glu Gly 370 375 380 Val Ãla Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Gd u Glu Ala Gly Glu Arg 385 390 395 4 00 Ala Ma Leu Ser Glu Arg Leu FLe ala Asrs Leu Trp Gly Arg Leu Glu 4 05 410 415 Gly Glu G x u Arg Leu Le u Trp Leu Tyr Arg Giu Val Asp Arg Pro Leu 420 425 430 Ser Ala Val Leu ale His Het Glu Ala Thr Gly Val Arg Leu Asp Val 435 4 40 445 Ala Tyr Leu Arg Mâ Leu Ser Leu Glu. Val Ala Glu Glu lie A i a Arg 450 455 460 Leu Gle Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Aan Leu Asa 465 470 475 480 Ser Arg Asp Gin Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu Pro 485 490 495 Ala lie Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala 500 505 510 Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala Mis Prcs Ile Vai Glu Lys lie Leu 515 5.20 S.2S Gin Tyr Arg Giu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp Pro Leu 530 535 540 Pro Asp Leu Ile His Pr o Arg Thr Gly Arg Leu His Thr Arg Pb.e ase 545 550 555 560 Gin Thr Ala Thr Ala Thr Gly àrg Leu Ser Ser Ser .Asp Pro Ãsn Leu SSS 570 575 164

Gin Asn 11* Pro Vai Arg Thr Pro Leu Gly Gin Arg lie âr<| Arg Alâ 580 585 590 Phe lie Ala G.l η Glu Gly Trp Leu Leu Vai Val Leu Aso Tyr Ser Gin 595 600 605 I l.n Glu Leu hrq "ν' ;.s- .-1. Leu Ala Mis Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu He 610 615 620 Arg Va i Ohe Qln Glu Gly Arg: Asp lie Mis Thr Glu Thr Ala Ser f rp 625 630 635 640 Met Phe Gly Vai Pro Arg Glu Ala vai Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala 64 S 650 655 Ala Lys Thr Xle Asn Phe Gly Vai Leu Tyr tjl y Met Ser Ala H.is Arg 660 665 €70 Leu Ser Gin Glu Leu Ala II è Pro Tyr Glu Glu Ala Gin Ala Phe lie 675 680 685 Glu Aro Tyr Phe Gin Ser Phe Oro Lys val Arg ãlâ Trp lie Glu Lys 690 695 7 00 Thr Leu Glu Glu Gly Arq Arg Arg Gly Tyr Val Glu Thr Leu Phe Giy 705 710 715 720 Arg Arg Arg Tyr Vai Oro Asp Leu Glu Ala Arg Val Lys Sor Val Arg 725 730 735 Glu Ala Ala Glu Atg iMet Ala Phe Âsn mz Pro Val Gin Gly Thr Ala 148 745 7SQ A lê Asp Leu &fet Ly s Leu Ala Met Vai Ly® Leu Phè Pro Arg Leu Glu 755 760 765 Glu Hst Gly Ala .Arg Mõt Leu Leu Gl n Vãl Bis ASO Glu Leu Val Leu 770 775 780 61 ã Ala Pro Lys Glu Axg Ala Glu Ala Val Ala Arg Leu Ala L.ys Glu 785 790 7 35 800 Vai Met Glu Gly Vai Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu Glu Val Glu Val 805 810 815 •Gly lie Gly 61 u Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 <210 > 21 <211 > 24 83 <212 > ADN 165 <213> Thermus aquaticus <22 0> <221> caracteristica_misc <223> Clone resistente a Heparina 94: Sequência de Ácidos Nucleicos 166 <400> 21 âtttttqaqc 60' ccaagggccg cgtcçtcctg gtggacggcc accacctggc ctaccgcacc ttccacgccc 120 tgaagggcct caccaccagc cggggqgagc cçgtgcagge ggtcfcacggc ttcqccaaqa 160 gcciccteaa ggccctcsag gaggacgggg acgeggtgat cgtggtcttt qaeqccaaqq 240 ceceetccfct ccgccacgag gcctacgggg ggtaea&ggc gggecgggec cccacqccqq 300 aggaçtttCG ceggcaactc gcccfccatca aggagetggt ggàçctçctg ggqctggcgc 360 gcctcgaggt cçcgggctaq gaggçggacg âcgtcçtggq cigqctggoc aagaaggcgg 420 aaaaggaggg ctacgaggtc cgsatcotoa ccgccgacaa agacctttac caqctccttt ' 480 ccgaecgcât ccacgtcctc caccccgaqg gçjtacctcat caccccggcc tqgctfctqgq ‘ ' 540 aaaagtacgg cctgaggccc gacc&gtfgg cegactaccg ggecctgaee ggggacgâgt 600 ccg.Ãcaacct tcccggtgtc aagggcàtcg gggagaagae ggeg&ggaag cttctgqãgq 660 agtgggggaf cctggaagcc ctCGtcàagá acetggaccg gctggâgccc gccatccgqq 720 agaagafccct ggçccacalg gacgatctqa aQctcf.ccto ggacctggcc aaqgfcgcgca 780 ccgacctgcc cctggaggfcg gacttegcea aasgcjcggga gçGcgacqgg gagagqetia ' 840 gggcctttct ggsgaqgett gagfctfcggca gcctcctcca cgagttçggc cttctgqaaa 700" gccccaaggc eccgqaggag gccccctggc ccccgccgga. aggggccfctc 167 qtagqcfcttq 960 tgctttcccg caaggèsgccc atgtgggccg stcttctggc cctqqccqcc gccaqgqqqq 1020 gccgqgtcoa çcgggccccc gsgccttata aagccctcaf ggácctgaag gaggcgcggg 1080 ggcttctcqc caaagaoctg agcgttctgg ccctgaggga aggccttggc ctceeqcccq 114 ò gcgaegaecc catgctcctc gcetsectcc tggaçccttc caacaccacc cccgaggggg 12:00 tgqcccggcg ctacqgcqçg gagtggacgg aggaggcggg ggagcgggcc qccctiticcq 1260 aqaqqctott cgccaacçtq tgggggaggc ttgsgggggâ ggagaggctc ctttqqcttt 1320 accgggaggt ggagaggcec cfcttccgctg tcctggccca catggaggec acgqggqtqe 1380 gcctggaogt gtcctatcte agggccttgt cccgggsggt ggccgaggag atcqcGçgcc 1-9 40 tcgagqccga ggtGttcogc ctggccggcc acccettcaa cctcaactcc cqgqaccagc 1500 tggaaagggt cctcttfcgac gagctagggc 11 ccogeçat eggeaagacg qaq&aqaccq 1560 gc&sgcgetc: caccagcgcc; gcçgtoctgg aggecctecg cgaqgcccac cccatcgtgq 1620 ágaagatcct gcagtaccgg gagctcacca agctgaagag çacctacatt qaccccttgc 1680 cggacctCât ccaccccagg acgggccgcc tccacacccg ctfccaaccag scgqceacqq 1740 ccacqggcag gctaagtagc tcaggtcccá acctccagag catccccgtc cqcaccccqc 1300 ttgggcagag gatccgccgg g tcateg ccgaggaggg gtggctattg qtggccctgg 1860 actatagcca gatagàgctc agggtgctgg cccacctctc cggcgaçgag aaectgatcc 1920 qggtcttcçá ggaggggcgg gacatccaca cgqagãccgc eagctggatg tfccggcgtcc ccçgggaggc cqtggacccc ctgatgcgcc gggcggcciSâ gaccatcâac 168 11cgg991cc tetacggca t 2040 gâggaggcec aggectteat 2l0ó' attgaQsaqa çrcctggaqqa 2160 cnccgctacg t gcca gacct v2220 atageettea aeatgcccgt 2280 aag et et t cc cca ggctg g a 2340 ctagtccicg agqccccaaa 2400 atggaggggg tqtatcccct 2460' tageteteeg ccaaggagtg 2483 gteggeccac cgcctctccc tgagcgctae ttteagã.get gggcaggagg cgggggtacg ag ag g c cc gg gt g a a g a. gcg ecagggcaee gcegccgaec ggaaatgggg geeaggatgc agag&gggcg gaggccgtgg ggoegtgcec ctggsggtgg att gçtage catcccttac t ccccaagg t gcgggcctgg tggsgaocct et. t oggccgc tgcgggaggc ggccgagcgc tcatgaaget. g gctatggtg teettcaggt ccacgacgag eeçggetggc caaggaggtc aggtggggát àggggaggac

<210> 22 <211> 825 <212> PRT <213> Thermus aquaticus <22 0> <221> característica_misc <223> Clone resistente a Heparina 94: Sequência de Aminoácidos <22 0> <221> caracteristica_misc <223> Nota: 5 aminoácidos do terminal N não determinados 169 <400> 22

Pbe GU; Pro Lys Giy Arg Vai Leu Leu Vâl Asp Gly His Bis Leu Ala 1| 5 10 15 Tyr Arg Thr Fhe His Ala Leu Lys Giy Leu Tbx Thr Ser Are Gly Giu 20 25 30 Lr··; Vai Gin. Ala Vai Tyr Giy Lhe Alá Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu 35 40 45 .Lys G iu Asp Gly Asp Ais Vai Tie Vai Vai Phe Asp Ala Lys Ai« Fro· 50 55 60 Ser Phe Arg His Glu Ãlâ Tyr Giy Gly Tyr Lys .Ala Gly Arg Ala Pro 65 70 7 5 80 Thr Pro Giu Asp Phe Fro Arg Giu LôU Ala Leu Ile Lys GJ.n Leu Vai 85 90 95 A$p Leu Leu. Gly Leu Ala Arg L.èu Giu Vai P ro Gly Tyr Giu Ala Asp 100 105 110 Asp Vâl Leu Ala Ser Leu Ai a Lys Lys Alâ Giu Lys Giu Gly Tyr Giu 115 120 125 Vai Arg Ile Lau Thr Alã As» Lys Asp Leu Tyr Gin Leu Leu Ser Asp 130 135 140 Arq Ile His Vai Leu ais Fro Glu •Giy Tyr Leu lis Thr Pro Ala Trp 143 150 155 160 Leu Trp Giu Lys Tyr G1 y Leu Arg Pro Asp Gin Trp A.ia Asp tyi: Arg 165 170 175 Ala Leu Thr Gly Asp G1 u Ser Asp Asri Lau Pro Gly Vai Lys Gly Ile ISO 183 190· 'o ]. y Glu Lys Thr Ala Arg Lys Lsu Lau G1U Glu Trp Giy Ser Leu Giu 195 200 SOS Ala Léu Léu Lys Asn Léu Asp Arg Léu Glu Pro Ala Ile Arg G r ϋ Lys 210 215 220 Ila Leu Ala His Asp Asp Leu Lys Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys 225 2 30 235 240 Vai Arg Thr Asp Leu Prt> Leu Giu Vai Asp Phe Alâ Lys Arg Arg Giu 245 250 255 Fr» Asp Arg Giu Arg Leu Arg Ala Ph.e Leu 0ΪΧ3 Arg Leu Giu Phe Giy 260 265 27 0 Ser Leu Leu H i s G.lu Phe Giy Leu Leu Giu Ser Pro Lys Ala Prõ Giu 27 S 28.0 285 Giu Ala Pro Trp ?xo Fro "Fro Giu Giy Ala Phe Vâl Gly Phe Vai Leu 250 235 300 170

Ser Arg Lys Glu Pro He t Trp Ala Asp Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala 30.5 310 315 320 Arg 01y Gly Arg Val His Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Lys Ala Léu Arg 32 S 330 335 Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu .Ala Lys Asp Leu Ser Val Lêu 340 34S 350 Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Oro Pro Gly Asp As·:; Pro D4et Leu 355 360 365 Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Al.a 370 375 380 Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala 385 390 395 400 Leu Ser Glu ftxg Leu Phe Ala A.sn Lsu Trp Gly Leu Glu Gly Glu 405 410 415 Glu Arg' Leu Leu frp Leu Tyr Arg Glu Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala 420 425 430 Vai Leu Ala Bis íl e L Glu Ala Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ser Tyr 435 440 443 Leu Arq Ala Leu Ser Ara Glu Val Ala Glu Glu liê Ala Arg Leu Glu 450 4 55 4 60 Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pr o Phe Asn Leu Asa Sor Arq 465 470 475 490 Asp Gin Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp· Glu Lati Gly Leu Pro Ala Ile 485 4 90 493 Gly Ly s: Thr Glu Lys The Gly Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu. 500 505 510 Glu Ala Leu Arg G.lu Ala His Pró lie Val Glu Lys Ile Leu Gin Tyr SIS 520 325 Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr lie Asp Pro Leu Pro Asp 530 535 $4 0 i.au lie Bis Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr Arg Phè Asn Gin Th r 545 .550 5 55 560 Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Gly Pro Asn Leu Glu Ser 565 570 573 lie Pro Vâl Arg Thr Pro Leu Gly Gin Arg 11 e Arg Arg Ala Fhe Ile 171 580 590 585

Ma Giu Glu Gly Trp Leu Leu Vai Ala Leu Asp Tyr Ser Gin lie Glu 595 600 605 Leu Aro Vai Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu lie Arg Vai 610 615 620 Fhe Gin (a 1U Gly Arg Asp Xle His Thr Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe €25 630 635 640 Gly Vai Pro Arg Glu Ala Vai Ãsp Pm ree Het Arg Arq Ala Ala Lys 645 €S0 6,55 Thr lie Ãsn Ph* GlV Vai Leu Tyr Giv Hei Ser Ala His Ara Leu Ser 660 665 670 Gin Glu Leu Ala lie Pro Tyr Glu Glu Ala Gin Ala Phe lie Glu Arg 615 680 685 Tyr Phe Glu Ser Phe Pro Lys Vai Mg Ala Trp lies Glu Lys Thr Leu 690 695 700 Glu GiU Gly Mg Arg Arq Gly T v.jr Vai Glu Thr Léu Phe Gly Arg Arg 705 710 715 720 Arg Tyr Vai Pro ASO Leu Glu Ala Arg Vai .Lys Ser vai Arg Glu Ala 7.2 S 730 735 Ala Glu .Arg Met Alã Phe Λ?.: n Met Pi:q Vai Gin Gly Thr Ala Ala fiiSO 740 745 75 0 Leu Mac. Lys Leu Ala Met Vai Lys Leis. Phe Pro Arq Leu Giu Glu Het 755 7 60 765 Gly Ala Mg Met Leu Leu Gin Vai His Asp Glu Leu Vai Leu Glu kl a 770 775 780 Oro Lys Glu Arg Ala Glu AI a Vai Al a Mg Leis Ala Lys Glu Vai Het 185 790 795 800 Glu Gly Vai Tyr Pro Leu Ala Vai Pro Leu Glu Vai Glu Vai Gly Ile 805 610 815 Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 <210> 23 172

<211> 2480 <212> ADN <213> Thermus aquaticus <22 0> <221> característica_misc <223> Clone resistente a Heparina 15: Sequência de Ácidos Nucleicos 173 ;4:D0> 23 ttt.qagccca ' 6- 0 agggccgcgt ectectggtg gacggccacc açctggccta ccgcaccttc eacqccctga 120 agggcctcac caccagccgg ggggagccgg tgcaggcggt cfcscggette gccaagagcc 180 tcctcaaggc cctcaaggeg gacggggacg cggtgãtcgt ggtctttgac qçeaaqqcce 240' cctccttecg ecaegaggcc tacgggggct aesaggcggg ccgggçcccc acqccqqaqg '300' açtttceccg gesseicgec etcatç&ágg agctggtgga ceteetgggg ctggcgcgcc 3 SÔ tcgãggtcsc gggctaegag gQggâcgaçg tcctggccag eetggceaag aagqcaqaâã ' 42Õ" aggagggctà cgaggtccgc atcctcaccg ccgacaaaga cctttaccag ctcctttccq 4 00 âccgcatcca cgtcctcca» cccgaggggt acctcatcac cccggcetgg çtttggqaaa 540' agtacggcct gaggcccgac cagtgggccg actacçgggc cctgaccggg gacgagtccg 600 acaacettee cggtgtcaag ggcatcgggg agaaga.dggc gâggaagçtt ctqqaqgagt èso' gggggaqççfc ggáagcççtc ctcaagaacc tggaeeggct ggagcccgcc atceqggsga 720' àgatcctggc ccacatggac gatctgaagc totcctggga cetggccaag qtqcgcaccg ?èo ãcctgcccct ggaggtggâc ttcgccaaaa ggogggagcc egaeegggag aggctfcaqqg 840 cctttctgga gaggcttgag tttggeagec tcctccacga gtfceggcett ctqgaaagcc lOQ ceaaggcdct ggaggaggcd ccctggcccç qgoeggaagg ggecttçgtg ggctttgtge tttcccgcaa ggagcccatg tgggccgatc ttctggccçt ggccgccgcc 174 960 agggggggtc 1020 gggtccaccg ggcccGcgag ecttataaag ccctcaggga cetgaaggag gcgcgggggc 1080 ttctcgccaa agacctgagc gttctggccc tgagggaagg ccttggcctc çggcçcggcq· 1140 açgaccccat getcctcgcc tâcçtçctgg acccttccaa caccaocccc gtgggggtgg 1200 cecggcgcta· cggcggggag tggaeggagg aggcggggga gcgggccgcc ctttccqaqa 1260' ggctcttcçc eaacetgtgg gggaggcttg gâggctcctt tgqctttacc 1320 gggaggtgga gaggcccefct fcecgetçtsc tggsccacat ggaggctacg qqqqtqcqOG 1380 tggaegfcgge ctâtctcagg gcqttgtccc tggaggtggç «gaggagatc gcccçcotcq '144 0 aggccgaggt cttccgcctg gccggccaco ccttcaacct caactcccgg qaccáqctgq 1500 aaagggtcct ctttgacgag ctagggefctc ccgecatcgcf eaagaqggag ãaqaccqgca 1560' agcgctccac cagcgccgcc gtcctggagg ecctecgcga ggçccacccc atcgtggaga 1620 agatcctgca giaccgggag ctcaccaggc tgaagagcac ctacattgac cccttqccqq 1680 acçtcàtccá ccccaggacg ggççgçctçc acaeccgctt eaaccagaeg qccacqqcca 1740' cgggcàggcfc aagtagctcc qgtceqaaçc tccagagcat ccccgfcccge accccqcttq 1800 gfcagaggat ccgccgggcc ttcstçgqçg aggaggggtg getattggtg gecetqqacfc 1860' atagocagat agagcteagg gtgctggccc ãdctçtccgg cgacgagaac ctqâfcccáfq 1820 tcttacagg® ggggçgggac afcccacaogg agaccgecag ctgg&tgttc gqcgtccqcc 1980 gggaggccgt ggaccccctg atgcgçcggg cggçcaagac catcaacttc 175 ggggteçtet açggcatgtc ggcccaccgc ctctcecagg agetagceat ecetfcacgag 2040 gaggccc&gg ccttçsttga gcgctacttt cagagctteq cçaàggtgcg gqcctgqail 210 Q: «agaagaccc tgqaqq&qgg caqgaacrcgg gqgtacqtgq agaccctctt eqgccqcqge 216 Ô cgctacatgc cagacctaga ggcccgggtq asqaqcqtqe gqqãgqegqc cgagcqca.qg 222 θ'' ' ’ ' ......~ " gcctfccaaca tqcccgtçca qggeaçcqce gccg&ccfcea taaâqctggc tatgqfcgaag 22Θ0 ctcttcccca qqctqgaggâ aatgggggcc sqqatqctcc ttcsqgtcca cqaeqaqetg £340 gtcctcgagg qsccaa&aga gaqggeggag geegtggccc qgcfcqgeeaa qgqggtcâtq £400 gacqgqgtgt atcccctggc egtgecettg gaggtggagg tggggatagq qgaqqãctgq 2460 c t et ccgçca aqqaqtqa q t 2480

<210> 24 <211> 827 <212> PRT <213> Thermus aquaticus <22 0> <221> característica_misc <223> Clone Resistente a Heparina 15: Sequência de Aminoácidos <22 0> <221> caracteristica_misc <223> Nota: 5 aminoácidos do terminal N não determinados 176 < 4:0 Ο > 24

Prò Leu Phe Glu Sito Lys Í5ly Arg Vai Leu L«U Vai Asp fíly Ris Mis 1. 5 1.Q " 15 Lêíí Ala Tyr Arg Thr Fh® His Ala Leu Lys Gly Leu Thr Thr Ser Arq 20 25 ' 30

Gly GIu Pro· Vai Gin Ala Vai Tyr Gly Fhe Ala Lys Ser Leu Leu Lys 35 40 45

Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Vai Ile Vai Vai Phe Asp Ala Lys

50 " 55 SO

Ala Pro Ser Fhs Arq Mis Glu Ala Tyr Gly Gly Tyr Lys Ala Gly Arg 65 20 ' 75' “ " 80'

Ala Pro Thr Pro Glu Asp Fh® Pro Arq Sln Leu Ala Leu 21a Lvs GLu 85 ' ' 90 35

Leu Vai Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arq Leu Glu Vai Pro Gly Tyr Glu 10G 105 110

Ala Asp Asp Vai Leu Ãia Ser Leu Ais Lys Lys Ala Glu Lys Glu Gly 115 120 125

Tyr Glu Vai Arq lie Leu Thr Ala Asp Lys Asp Leu Tyr Gle Lau Leu 130 135 140

Ser A-sh Arq 11« Hls Vai Leu His Pro Glu Gly Tyr Leu lie Thr Pro

14 5 " 150 15S ' ISO

Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro Asp Gin Trp Ala Asp 165 17G 175

Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Aso Asn Leu Pro GXv vai Lys 180 135 :i võ

Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arq Lys Leu Leu Glu Glu Trp Gly Ser 195 ' 200 205

Leu Glu Ala Leu Leu Lys Aon Leu Asp Arq Leu Glu Pro Ala lie Arg 210 215 220

Glu Lys Ile Leu Ala Bis mt Asp Asp Leu Lys Leu Ser Trp Asp Lsu 225 230 235 ' 240·

Ala Lys Vai Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Vai Asp Phe Ala Lys Arq 245 250 255

Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe Leu Glu .Arg Leis Glu 260 ' ’ 265 270

Phè Gly S&r Leu Leu Bis Glu Fhe Gly Leu Leu Glu Ser Pro Lys Ais 275 230 285

Leu Glu Glu Ala Fr® Trp Pr® Pro Pro Glu Slv Ala The Vai Gly Phe 290 2:95 300

Vai Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp Leu Leu Ala Leu Ala 177 305

Ala Ala Arg Gly Leu Aro Asp Leu 340 Vai Leu Ais 355 Leu Met Lee 370 Leu Ala Vai 335 Alà Arg Arg Ala Ale Leu Ser Giy Glu Glu A.c q 420 Ser Ale Vai 435 Leu Ala fvr 4 50 Leu Arg Leu 465 Glu Ala Glu Ser Arg Asp Glu Ala lie Gly Lys 500: Vai Leu GlU 515 Ala Gin Tyr 530 Arg Glu Pro Aâp S4S Leu lie bJLn. Thr Ala Thr Gin Set: lie Pr O: 580 310

Gly 325 Arg Vai His Lys Glu Ala Arg Acg Glu Gly Leu 360 Tyr Leu Leu 375 Asp Tyr Giy 330 Gly Glu Glu 405 Arq Leu Pbe Leu Leu Trp Leu Ala His Mefc G1 u 440 Ala Leu Ser 455 Leu Vai Fhe 4 70 Arg Leu Leu 485 Glu Arg Vai Thr Glu Lya Thr Leu Arg Glu Ala 520 Leu Thr Arg 535 Léu His Pro 550 Arg Thr Ala 565 Thr Gly Arg Vai Arg Thr Pro 315

Arg Ma 330 Pro Glu Gly 345 Leu Leu Ala Gly Leu Pro Pro Pro Ser Asa Thr 380 Trp Thr Glu 395 Glu Ala Asa 410 Leu Trp Tyr 425 Arg Glu Vai. Ala Thr Gly Vai Glu Vai Ala Glu 460: Ala Gly His 475 Pro Leu Pb.e 490 Asp Glu Gly 505 Lys Arg Ser His Pro lie Vai Lys Ser Thr Tyr 540 Gly Arg Leu 555 His Leu Ser 370 Ser Ser Leu 58 5 Gly Glu Arg 320

Pro Tyr Lys 335 Ala Lys Asp 350 Leu. Ser Glv 365 Aãp Asp Pro· Thr Pro Vai Gly Ala Gly Glu Arg 400 Gly Arg Leu 415 Glu Glu Àrq 43Õ Pro Leu Arg 445 Leu Asp Vai Glu Ue Ala Arg Phe Asn Leu Asn 480 Leu Gly Leu 4 35 Pro Thr Ser 510 Ala Ai la Glu 525 Lys 1 le Leu Ile Asp Pro Leu Thr Arg Phe Asn 560 Gly Pro Asn 575 Leu Ile Arq 590 Arg Ala 178

Fhe Ile Ala Glu Glu Gly Ts:p Léu Leu Vai Ala Leu Aso Tyr Ssr Gin 595 600 605 lie Glu Leu Ar g Vai Leu Ma Bis Leu. Ser Gly Asp Glu Asn Leu lie 610 615 620 &rg Vai Phê Glú Glu Gly Mg Asp lie His Thr Glu Thr Ala Ser Trp 625 63Ò 635 640 Hat Fhe Gly Vai ?ro Arg Glu Ala Vai Asp Pr o Léu Met Arg Arg Ala 645 550 655 Ala Lys Thr llé Asm Phe Gly Vai Leu Tyr Gly Met Sor Ala His Arg 660 665 670 Lee Ser Glu Glu Leu Ala lie. Pr o Tyr Glu, Glu Ale Gin Ala Phe Ile 675 680 685 Gin Arq Tyr Fhe Gin. Ser Fhe Fra Lys Vai Arg Ala Trp lie Glu Lys 690 695 700 Thr Leu Glu Glu Gly Arq Arg Arg Gly Tyr Vai Glu Thr Leu Fhe Gly 705 710 715 720 A.rq Arg M 9 Tyr Vai Pro Asp Leu Glu Ala Arg Vai Lys Ser Vai Arg 725 730 735 Gili Ma Ala Glu Arg Arg Ala Fhe Asm Mefc Pro Vai Gin Gly Thr Alá 740 745 750 Ma fep Leu Hat Lys Leu Ala Mãt Vai Lys Leu Fhe Pro Arg Léu Glu 755 7 60 765 Glu Met Giy Ma Arg Het Leu Leu Glu Vai His Asp Glu Leu Vai Leu 770 775 780 Glu Ala Pr o Lys Glu Arg Ala Glu Ala Vai Ala Arg Leu Ala Lys 61« 785 790 795 800 Vai Met Glu Gly Vai Tyr ?ro Leu Ala Vai Pro Leu Glu Vai Glu Vai 805 810 815 61 y Ilé Gly Glu ÂSp Trp Leu Ser Ala Lys G1U 820 825 <210> 25 <211> 2850 179

<212> ADN <213> Thermus aquaticus <220> <221> característica_misc <223> Clone de extensão com desemparelhamento Ml: Sequência de Ácidos Nucleicos 180 <4Ο0> >?6 'ctqcjaatact 60 oeetetittt gagcccaaag gecgcgteefc CGtggtggac ggccaccacc tggcctaceg 120 cacsttccac gccctgaagg gectcaceac cagecggggg gagccggtgc aqgegotcta 180 cggcttcgcc aagagcctcc tcaaggccct caaggaggac ggggaegcgg tqateqtgqt 240 etttgacgec aaggccccct ccttccgcca cgaggcctâc gqggggtaoa àqqegqeccq 300 ggeccecaeg ccggagg-aet ttceceggca actcfccctc atcaaggagc tqgtgqatct 360 cctggggctg gcfcfcetcg aggteccggg ct&çgâggeg gacgaexitoc tggecsqcGt 420" ggccaagaag g g g g a. a s. a g g agggctacga ggtecgcate ctçaeçgccg acsaaqqcct. 48Ò‘ ttaccagctc etttcegaec gcatccacgt cctccacccc gaggggtacc tcatcâcccc S40 ggcetggctt tggga&a agt aeggcetgag gcccgaccag tgggccgact aecergaccct SÔÒ gaecgqggac gagtccgaúa âcçttcccgg ggteaaggge ateggggaga agaegqcqâq 660 gããgettGtg gaggagt.ggg ggagectgga àgecctcctç aagaacctgg accgqjetgaa 120 gcecgçéãtc cgggagaaga tcctgqccca catggaçgat e.tg&agctcfc cctqggafcet ISO ggccaaggtg cgcaccgacc tgcccctgga ggtggacttc gccaaaaggc gggagcccga 840 ccgggagagg cttagggcct ttctggagag gcttgagttt ggcagcctce tccacgagtt 900 cggccttctg gaa.agcccca aggccctgga ggaggcccec tggccoccgc cqgaagqggc: ' 360 cttcgtgggc tttgtccttt cccgcaggaa gcccatgtgg gccgatcttc 181 tgqccctqge 1020 cgccgccagg gggggccggg tcçãçcggfc ccccgagcct tataaagçcc tç&qçgaeet 1080 çaaggaçgcg egggggcttc tcgccaa&ga octgaçcgtc ctggccetga qgq&aqgecfc Í140 tggcctcccg eccggcgacg accccatgct cetcgectac ctcctggacc cttccaacâc 1200 cscccçcgag gggqtggecc ggcgctacgg cggggagtgg acggaggagg çgggggaqcg 1260 ggccgccctt tcõgagãggç tcttcgccaa cctgtggfgg aggcttgagg gggaggagag 1320 gctccíifctgg ctttaccggç ãggtggagag gçcçctfctcc gctgtcctgg eccãcafcqqa 1380 ggccacgggg gtgçgcçtgg aegtggoeta tctfiãgggcc: ttgtoeccgg aqgiggecga 14 40 ggagatcgcc egcçtcgagg cçgaggtctt ccgcotggcc ggçescccct tcaácctcáâ 1500 ctcecíjggao cagctggaaa gggtcctctt tgácgàgcta gggcttceeg cçatcqqcáa 1560 gacggagaag accggçaagc gctccaecag cgcçgçcgt-ç ctgggggccç tccqeqaqqc 1620 ccaccccatc gtggagaaga tcctgcagia ccgggagctc accaagctga aqaqeaeqts 1680 esfctgaeccc ttâccggacc tcatccaccc caggacgggc cgcctccaca w o g ki.- O-1- á à 1740 ccagacggcc acggccacgg gcâggctaãg tagctccgat cocaaccfcec agaacatccc *1800 cgtocgcace cçgcctgggc agaggatccg ccgggectte afccgccgagg aggqgtggct 1860 attggtqgtc ctggàctàta gceagataga gctcagggtg ctggcccace tctccgqcga 1920 cgagaâcctg atcegggtct tccaggaggg gcgggacatc cácacggãga ccqccaqctq 198 0" gatgtteqgc qtCccCcggg aggcqgtgga ccccctçatg cgccgggcgg 182 eeaaqaccat 2040 caactteggg gtcetetaeg gcatgtcggc ccaccgcctc tcccaggagç taqcsatccc 2100 ttacgaggag gcGcaggcct taattgagcg ctactttcag agcttccaca aggtgcggge 2160 ctggattgsg aagaccctgg aggagggcag gaggcggggg tâcgtggãga ccctettcqg 2220 ccgccgccgc tacgtgccag a-cçtagaggc ccgggtgaag agqgtgcggg gqqcgqççga 2280 gcgçatggcc ttcaacatgc ccgtcqaggg Sáccgccgéc gacctc&tga aqctcrgctat '2340 ggtgaagetc tteeecaggc tggaggaaat gggggçcagg atgctcctfcc agqtc-çaçqa 2400 egagetggtc ctcgaggccc cáááagâgag ggcggaggcc gtggcccggc tqqccaagga 2460 ggtcatggag ggggtgtâtc ccctggecgfc gcccctggag gtggâggtgg ggatagggga 2520 ggactggçtc tcegãcaagg ãgt.gágt.cqa cctgcaggça gcgcttggcg tcacccqcaq 2580 tfccggtggtt âataagcttg acctgtgaag tgaaãâatçg cgcacafctgt qeq&catttt 2640 ttttgtctgc cgtttaccgc taetgegtca cggatctcca cgcgecctgt agcqqcqcat '2700' taagcgcggc gggtgtggfcg gttacgcgca gcgtgacegc eacaefctgcc agcgccctaq '2760 cgcccgctcc tttcgctttc tcccetteet ttctcgccac gttcgecggc tttccccqtc 2820 aagçtctaaa tçggggqctc cctttagqgg ttcccgattt agtgcfcfctta cgggacctcg aacccaaaaa afctgstt&gg 2850 <210> 26 <211> 830 183

<212> PRT <213> Thermus aquaticus <22 0> <221> característica misc <223> Clone de extensão com desemparelhamento Ml: Sequência de Aminoácidos <22 0> <221> característica_misc <223> Nota: 2 aminoácidos do terminal N não determinados 184 <400> 26

Gly mt Leu Pr o Leu Phe Glu Pr o Lys Gly Arg vai Leu Leu Vai Asp 1 5 10 15 Gly Mis Bis Leu Ala Tyr Ârg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly Leu Thr 20 25 30 Thr Sê t: Arcj Gly Guu Pr o Vâl Gin Ala Vai Tyr Gly Phe Ma Lys Ser 35' 40 45 LêU ÍMU Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly A.ãp Ala Va.l lie Vai Vai Pllê 50 58 íj 0 asp Ãia Lys Ala Pxo Ser Phe Arg Híb Glu Ala Tyr Gly Gly Tyr Lys 65 70 75 80 Alã a l Arg Ale Pr o Thr Peo Glu A.sp Phe Pro Arg Gin Leu Ala Leu 85 90 95 lis Lys Glu Leu Vai Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu Vâl Pre 100 105 110 Gly Tyr Glu Ais A-sp Asp Vai Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys AI a Glu 115 120 125 Lys Glu Gly Tyr Glu Vai Arg lie Leu Thr Ala Asp Lys Gly Leu Tyr 130 135 140 Gin Leu Leu Ser Asp Arg lie HlS Vai Leu His Pro Glu Gly Tyr Leu 145 ISO 155 160 lie Thr Lr Cf Ala Tm Leu Trp ele Lys Tyr Gly Leu Arg Pro Asp Gin 165 170 175 Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp xAsn Leu Pro 180 185 190 Gly Vai Lys Gly lie Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu Glu Glu 195 200: 205 Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Ãrg Leu Lys Pro *1 ·ΐ ^ ΐί À l;· 2X5 220 185

Ala. Xle Axg Gl» Lys lie Leu Ala His Het Asp Asp Leu Lys Leu Ser 225 ‘ '230 235 240

Trp Asp Leu Alá Ala Lys Arg Arg 2 c 0 Ar q Leu Glu 275 Phe Fr o Lys 200 Ala Leu Vai 305 Gly Phs Vai Ala Leu Ala Ala Tyr Lys Ala Leu 340 Asp Leu Ser 355 Vai Asp Asp 370 Pro Met Pr© 385 Glu eiy vai Gly GXu Ar g Ala. Arg Leu 01a Gly 420 •Arg Pro Leu 435 Ser Leu Asp 4 50 Vai Ala íle 465 Ala Arg Leu Asm Leu Aso Ser

Lys 245 Vai Arg Thr 01 u pro Asp Arg Gly Ser Leu Leu 280 Giu Glu Ala 295 Pro Leu Ser 310 Arg Arg Ala. 3:25 Arg Gly Gly Arg Asp Leu Lys Leu Ala Leu Arg 360 Leu Leu Ala 37S Tyr Ala Arg 390 Arg Tyr Ala 405 Leu Ser Glu Giu Glu Arg Leu Ala Vai Leu Ala 440 Tyr Leu Arg 455 ftla Glu Ala 470 Glu Vai Arg 485 Asp Gin Leu

Asp Leu 250 Pro Leu Glu 265 &rg Leu Arg His Glu Phe Gly T rp Pro Fr O; Pro .300 Glu Pro Ket 315 Trp Arg Vai 330 His Arg Glu 345 Alá Arg Gly Glu Gly Leu. Gly Leu Leu Aep Pro 38:0 Gly Gly Giu 395 Trp Arg Leu 410 Phe. Ala Leu 425 T rp Leu Tyr His Met Glu Ala Leu Ser Leu G1 ti 4 60 Phe Arg Leu 475 Ala Glu Arg 49Ô Vai Leu

Glu Vaí Asp Phe 255 Ala Phe Leu Glu 270 Leu Leu Glu Ser 28S Glu Gly Ala Phe Ala Asp Ls a Leu 320 Ala Pro Giu Pro 335 Leu Leu Ala Lys 350: Leu Pro Pro Gly 365 Ser Asn Thr Thr Tlu Glu Glu Ar â 400 A$n Leu. Tm Gly 415 Arg Glu. Vai Giu 4 30 Thr Gly Vai Arg 445 Vai Ala Glu Glu Gly His Pro Phe 480 Phe ftsp Glu Leu 4 35 186

Giy Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ssr Thr 500 SOS 510 Ser Ala Ala Vai Leu Gly Ma Leu Arg GiU Ala His Pro Ile Vai Glu 515 520 52 5 Lys Ile Leu Gin Tyr Arg :G iu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile 530 535 540 âs» Pm Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr 545 55 Q 555 560 Arg Phe Asn Gin Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp 565 570 57 5 Pr o Asn Leu Gin Asn Ile Pro Vai Arg Thr Pro Leu Gly Glu Arg lie 580 585 590 Arg Arg Ala Phs 11® Ala Gru Glu Gly Irp Le\i Leu Vai Vai Leu Asp 505 600 605 Tyr Ser 6 i I; lie Glu Leu Arq Vai Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu 610 615 620 Âsn Leu Ile &.rq Vai Phe Gin Glu Gly Arg Asp lie His Thr Glu Thr 625 630 635 640 Ala Ser Trp Met Phe Gly Vai Pro Arg Glu Ala Vai, Asp Pro Leu. Met 645 650 655 Arg Arg Ala Ά.Ι. a Lys Thr lie Mn Phe Gly Vai Leu Tyr Gly Met Ser 660 665 670 Ala His Arg Leu Ser Glu Glu Leu Ala lie Pro Tyr Glu G .1 u A i. a Gin 675 600 685 hU Phe lie 6.Lu Arg Tyr Phe Gin Ser Phe Pro Lys Vai /«O Ala Trp Ê9Ô 695 700 Ile Glu Lys Thr Leu Gl u Glu Giy Arg Arg Arg Gly Tyr Vai Glu Thr 705 710 715 720 Leu Fhe Gly Arg Arg Arg Tyr Vai Pro Asp Leu Glu Ala Arg Vai Lys 725 730 735 Ser Vai Arg Gly Ala Ais Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Vai Gin 740 74 S 750 Gly Thr Ala ·! ’Ci Asp Leu Hei Lys Leu Ais Met Vai Lys Leu Phe Pro 755 7 60 765 <U.t. Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Glu Vai His Asp vj ‘.3'. *.4» 187

Leu Vai Le 785 x Glu Ala Pr o Lya Giu 790 Arq A1a Glu A1a 195 Vai Ala Arq Leu 800 Ala Lys Glt i Vai :LV'; rri Í!. 805 Glu Gly Vai Tyr Pro Leu Ala 810 Vâ 1 Pro Leu Glu 815 Vai 6iu Vai . G1 y 820 Ile Giy Glu Asp Trp 825 Lêu Sêr Ala Glu 830

<210> 27 <211> 2484 <212> ADN <213> Thermus aquaticus <22 0> <221> característica_misc <223> Clone de extensão com desemparelhamento M4: Sequência de ácidos nucleicos 188 <400> 27 tçtttatgaq 60 áccaagggcc gcgtcctcct ggtggacçgç caccacetgg cctãcçgcac CttCCâCQCC 120 etgaagggcc tcaccaccag ecggggggag coggtgcagg cggtctacgg cttegccãaq ião agcctcctca aggceetcaa ggagggcggg çacgcggtga tcgtggtctt tqacqccaac? 240 gccecctcct tcccceatga ggeefcacggg gggtacaagg cgggcegggc ccccacqcca 300' gaggactttc cccgâcaacfc cgçcctcãtc aaggggctgg tggacctcct gqqqctqacç 360 Ggcçtçfâgg tcccgggcta cgaggcggas gacgtcctgg ccagcctggc csagàaggcq 4 20 gâââagg&gg gctacgaggt ccgcatcctc accgcegaea aagaccttta ccaqctcctt 480 teegaeegea tccãcgtcct çcáccccgag gggtâcctca tcacceeggc çfcgqçttfcgq 540 g&aaagtacg gcctgaggcc cgâccagtgg gcçgactacc gggccctgac cgqgqacgag 600 tccgacaacc ttcccggggt caagggcatc ggggagaaga cggcgaggaa 189 sícttctaqaq 660 gagtgfggga gcctggãâgc cctcctcaag aacctggacc ggctgaagcc cgccatccgc? 720: gagaagatcc tggcccacat ggacgatctg asgctcfccct gggaccgggc caaggtgcgc 780 accgacctgc çcctggaggt ggscttçgce aaaaggcggg agcccgaccg gga.gâqgctt 8 4 0 agggcctfctc tggagaggct tgagtttggc: agcctcctcc acgagttcgg ccttctaqaa 900 agccccaagq ccçtggagga ggccccctgq cececçecgg aaggggcctt catgagctfcfc. 860 gtgctttccc gesaggagçc catgtgggoc gatcttctag ccctggccge cgceaqgqgq 1020 ggccgggtcc accgggcccc cgagccttat aaagccctcg gggacefcgaa qqagqeqcgq 1080 çggcttcfccg ecaaagacst gâgcgttetg gccetgaggg aaggccttgg C’ v.· C- C.· L;'L·· U40 gacgaogace ceatgçtçct cgcctaecte ctggqccctt coaacsccac dccçqaaqgg 1209 gtggcecgge gçtacggcgg ggagtggacg gagqaggcag ggqagcggge egecctttec 1260 ga.gaggctct. tcgccaacct gtgggggagg ettgagsggg aggaasggct cctttggett 1320 taccggqagq tggagaggcc cctttccgct gtcctggccc acatggaggc eaGqqqqqtq 1380 egcetqgacg igçcçtatct cagggccttg tccctggagg tgçccgagga gatogcocgc 1440 ctcgaggccg aggtcttccg cctggccggc caccecttca acctcaactc ccgqqaccao 1503 ctggaaaggg tcctctttgs egsgctaggg o!: tcccgcca tcgqcaagac qqaqaaqaec 1560' qgcaagcgct ccaceagegc cgccgtcctg ggggccctcc gcgaggceca ccccatcgtq 1620. gagaagatcc Igcagtaccg ggageteacc aâgctgaaga gcacctacat tgaccecttg ccggacctca fcccaccccag gacgggccgc ctcçacaccc gcttcââcca 190 1680 ,ac,|ccac9 gcoâC9>„ca gg„taagtag ocgacscog cttgggCiigs ,wâ£oegC(,g «a«at*gec agatagaget c8W<;Cttoo aggaggggcg ywfccggcgt-c ccccgggaqq cccrtqoaccc; 1980 ' * cttcggggtc ctctãcggea tqtcqqecca 2040 " cgaggaggcc caggccttca ttaagcgcta 2100 gattgsqa&q acectgqaqg aqçqcagqag 2160 cegccqctac gtgccagacc taaaqgceeg 2220 catgsccitc aae-afcgcceg tccaggqiac 2280 qa*gctcttc cccaggctgg aggaaatggg 2340 actgatcctc gaggccccaa aagagagqgc: 2400 catgqagggg gtgtatcccc tggccgtgcc 2460 ctoqctctcc gccaaggsgfc gagt 2484 etccgatcee aacçfcccaga goatccccqt ggccttcata qccqaggagg ggtqgctatt: cagggtgctg gcccacctct ccggcgacqs ggacatccac acggagaccg cc&gctggat ccfcgatgogc cgggeggcca âgaecatcaa ecgestetec caggagçtag «catccctta ctttcagagc ttccccaagg tgcgggcetg gcgggggfcac gtggagacec tottoggeeg ggtgaagagc gtgcgggagc cggceq&gcg cqççgçcgaç c t catga *-"9 9 c ^ 99 £ ggccaggátq ctcctfccatfS tccacgacga ggaggccgtg gcceqgctg9 ccaaqgaggt cctggaggtg gaçgtgggg** taggggagga

<210> 28 <211> 826 <212> PRT 191 <213> Thermus aquaticus <22 0> <221> característica_misc <223> Clone de extensão com desemparelhamento M4: Sequência de aminoácidos <22 0> <221> característica_misc <223> Nota: 6 aminoácidos do terminal N não determinados 192

<400> 2S

Leu Tyr Glu Pr o Lys Gly Arg Vai Leu Leu Vai Asp Gly His HlS Leu I 5 10 15 Ala Tyr Ârg Thr Phé Mis Ala. Leu. Lys Gly Leu Thr Thr Ser Arg G1 y 20 25 30 Giu Fro Vai Gin Ala Vai Tyr Gly Fhe Ala Lys Ser Leu Leu Lys Ala 35 40 45 Leu Lys Giu Gly Gly Asp Ala Vai Ile Vai Vai Fhe Aâp Ala Lys Ala 50 55 60 Fro Ser Pha Fro His Glu Ala Tyr Gly Gly Tyr Lys Alá Gly Arg Ala € Ε 70 75 80 ργο Thr Fro Glu Asp Ph.e Pro Arg Gin Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu 05' 90 95 Vai Asp Léu Leu Gly Léu Thr Arg Leu Glu Vai Fro Gly Tvr Glu Ala 100 105 1Í0 Asp Aâp Vai Leu Ala Sèr Leu Ala Lys Lys Ala Glu Lys Glu Gly Tyr 115 120 125 Giu Vai Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp Leu Tyr Gin Leu Leu Ser 130 135 14 D ãsp Arg He Ris Vai Leu. His Pro Giu Gly Tyr Leu Ile Thr Pro Ma 14 5 150 155 160 Trp Leu Trp Glu. Lys Tyr Gly Leu Arg Fro Asp Gin Trp Ala Aop Tyr 165 170 175 hi'q Ma Leu Thr Gly As p Glu Ser Asp Asn. Leu Fro Gly Vai Lys Gly 180 185 190 Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg LyS Leu Leu Glu Glu Trp Gly Ser Leu 195 200 205 Giu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu Lys Pro Ala I lê Arg Glu 210 215 220 193

Lys? Ile Lee Ma Sis fist Asp Àsp Leu Lys Leu Ser Trp Asp Arg Ala 225 230 235 240 Lys Vsi Arg Thr Asp Leu Pra Leu G1« Vai Asp V-:ç Ala Lys Arg Arg 245 250 25.5 S.l.u pro Asp ârg GLU Arg Leu Arg Ala Fhé Leu Glu Mg Leu Glu Fha 260 265 270 Gly Sor Leu Leu His Glu Pha G r y J.eu Leu Glu Ser Pro Lys Ala Leu 275 230 285 ôlu Glu Ais Pro "Trp Pro Pro Pro Glu Gly Ala Phe Vai Gly Phe Vai 280 2 OS 300 Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp Leu Leu Ala Leu Ala Ais 305 310 315 32.0 Ala A?::; Gly Gly Arg Vai His Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Lys Ala Leu 325 330 335 Gly Arp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ser val 340 345 350 Lais Ala Leu .Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro Pro Asp Asp Asp Pro Ket 355 360 365 Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Aon Thr Thr Pro Glu ίρ .i Y Val 370 375 380 Ma Arg Arg Tyx Gly Gly Glu Trp Thr Glu L1 y. Ala Gly Glu Arg Ala 385 390 395 400 Ma Lèu Ssr Glu Ãig Leu Phe Ai a hsn Lèu Trp Gly Arg Leu Glu Gly 405 410 415 Glu Glu Leu Leu Trp Leu Tyr Ara Gl u Vai Glu Arg Pro Leu Ser 420 425 430 A Ia Vai Leu Ala His Ker Glu Ala Thr Gly vai Arg Leu As d Vai Ala 435 443 445 fyr Lea Arg Ala Leu Ser Leu Glu Vai Ala Glu Glu Ile Ala Arg Lsu 450 455 460 Glu Ala Glu Vai Pba Axg Leu Ala Gly HÍS Pro Fha A$n Leu Ass Ser 465 470 475 480 Arg Asp Gin Leu Glu Arg Vai Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu Pro Ala 485 490 4 95 11® Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val SOO 505 510 194 0 v«l Gl y Ala 515 Leu Tyr Arq 530 a i u Leu hsp Leu 545 Ile His Thr Ala Thr Ala Ser Ue Pro Vai. 580 Ile Ala Glu 595 Glu SIu Leu 610 àrg vai Vai 6.25 Phe Gin G1.U Phe Gly Vai Pxo Lys Thr lie Asn €60 Ser Gin Glu 675 Leu Arq ?yr 690 Phs Gin Leu 705 Glu Glu. Gly A.rg Arg Tyr Vai Pro .Ala uru Ar 5 740 Asp Leu Het 755 Lys Het Gly 1"? A f f V Ala Arg

Arg Glu Ala Sis 520 Thr Lys Leu 535 Lys Pro Arq 550 Thr Gly Thr 5 65 Gly Arg Lsu Arg Thr Pro Leu Gly Trp Leu Leu 6Q0 Leu Ala Hí 3 615 Leu Gly A.rg 630 Asp lie Ar cj 645 Glu Alá Vai Phe Gly Vai Leu Ala Ile Pro Tyr 687 Ser Phe Pro S95 Lys Arg Ara 710 Arg Gly Pro 725 Aap Leu Glu Met Ala Phe A.s.n Leu Ala Met ¥al 760 Het Leu Leu 775 Gin

Pro lie Vai Glu Ser Thr Tyr Ile 540 Arg Leu Hls Thr 555 Ser Ser Ser Asp 570 Gly Gin Arg lie 585 Vai Ala Léu Asp Ser Gly Asp Glu 620 HiS Thr Glu Thr 635 Asp Pro Leu Met 650 Tyr Gl y Nefc Ser 665 Gin Glu Ala G i.n Vai Arcj Ala Trp 700 Tyr Vai Glu Thr 715 Ma. Arq Vai Lys 730 mt Pro Vai Gin 745 Lys Leu Phe Pro Vai His Asp Glu 780

Lys 5.25 Ile Leu Gin ÂSP Pro Leu Pro Arg Phe Asn Gin 560 Pro Asn Leu 57 5 Gin Arg Arg ISO Ala Phe Tyr 605 Ser Gin Ile Asn Lsu Xle Arg Ala Ser Trp Met 640 Arg Atg Ala 655 Ala Ala His 670 Arq Leu Ale 685 Phe Ile Lys Ile Glu Lys Thr Leu Phe Gly Arq 720 Ser Vai Arg 735 Glu Gly Thr 750 Ala Ala. Arq 765 Leu Glu Glu Leu Vai. Leu Glu 195 A1. íâ 785 Pro Lys Glu Arq ÁX a L i U: ΑΧΟ. V" : -? CS Λ * j· V1 a l Ala Àrg Lau 795 . Ala Lys Glu Vai 800 Met SXu Giy Vai Tyr 805 Pr o Lèu Ala Vi ai Pro 810 Leu Glu Vai Glu Vai Giy SIS lio Giy- Glu Asp 820 Trp Leu Le.l Ae z1 8: Ϋ& Glu IS Li sboa.f 27 de D; a zern.br o de 2 0 06 196

Claims (10)

1. rsfít Tt ί'Τ'&'ίΠ ΤΛΛ ΛΑΪ3 £< REIvXNDXCAÇOEE Mét o do de ρ Θ J ..eccionar urna enzi ma qu e é capa ·;/ C"\ Cl· amplificar cl C .1 do nucl & d f'' o a ρ art i . .0 G 0 um. m LOl CÍ0 y compreen idendo os passos de: (a.) prop ;Q rc ionar uma mi st .u r a de .dos nucleicos com preendendo membros que coda. f i cam um.a enzi .ma qi ie é capaz cle amplifi C :ar o a c :ido nu cr eico a par :t ir de n m mor de, on uma var rante d .a Θ nzima (Ό) subd. i V 11 d. ir a mi st . Li.:, α c ie áci ri s nu cl eicos em rnrc rocápsu 1 d S f da for: rua a Q“! η Cl· Cc ^ r\ n v.: mi c o zocáp sul a compreenda um membro de ácid .0 n 1 d £· i ^ d CO d .a mis tura em conju into com a enz ima ou V 3dJC iante codific; rda ρ el o rm smbrí o ácido nucleico; (c) permitir que ocorra a replicaçao do ácido nucleico; e (d) detectar a replicaçao do membro de ácido nucleico pela enzima - Método de seleccíonar um agente capaz de modificar a actividade de uma enzima que é capaz de amplificar ácido nucleico de um. molde, compreendendo o método os passos de: (a) proporcionar uma enzima que é capaz de amplificar o ácido nucleico a partir de um molde; (b) proporcionar uma mistura de ácid.os nucleicos compreendendo membros que codificam um ou mais agentes candidatos; 1 (c) subdividir a mistura de ácidos nucleicos em microcápsulas, de modo a que cada microcápsula . compree uida um membro de ácido nucleico da mistura, se Π G O G agente codificado pelo me vnbro de ácido m icleico, e a θ n z d.rns. / Θ (d) detectar a replicação do ácido nucleico membro pela enzima - Método de acordo com a Reivindicação 2, em que o agente é um promotor de actrvidade da enzima. ou 3, em que o agente uma. cinase ου uma sobre a enzima para Método de acordo com a Reivindicação 2 é uma enzima, de um modo preferido fosforiiase, que é capaz de actuar modificar a sua actividade. Método de acordo com. a Reivindicaçã.o 2 ou 3, em que o agente é um polipéptrdo envolvrdo numa via metabólica, possuindo a via, como um produto final, um substrato que está envolvido numa reacção de replicação de ácido nucleico* Ò c Método de acordo o o 0 a Reivindicação 2 ou 3, em que o agente é um ροΐίϊ: >éptido cau >az de produzir um substrato ou consumir um. inibido r numa rea ccão de replicação de ácido nu cl .erco, '"7 Método de acordo com a Reivindicação 2 ou 3, em que o agente 0 um o· oiipéptido capaz de modil icar um iniciador nuc. r e o 1,o -í co ou suostrato de trifos fato 06 núcleos ido ut i 11zado numa. reacção de . oepli caçã.o d .e ác.iu lo n ucleico de mooo que 2 a) a sua extremidade 3' torna-se extensível; ou iViy + odo de acordo c o;n que 0 pro cessamentc rep licação total cu de j/;e u odo de acordo c ora que o proc ressamen to qualquer reivindicação anterior, em io á.cido nucieico membro constitui a seamento ís) do referido membro. rei vi r·. /-d ·; r'' ya anterior, ein b) 11Ift 0 "P O '£ Ç 0 C ) 0.0 substrato riçada ao . ini cra dor nuc :1 eotí dí co O Li t r i.f osf ate 1 '00 nucleósido é modifícvj a. d. a G6 modo a periri Itr r 0 detecção OU captura d o produto 0 nex o do i d. c d. a ca o r nuc deotídreo incc )rporado ou trifosfato de nu cieósid LO uma reacção de preenchimento de uma extremidade protuberante 5', pendente do referido membro ou uma extensão de uma extremidade 3' do referido membro. Método de c·. C- '· amplificação 1 Q0 mordo com reivinan em ronda de replicação de ácido nucleicí • Método de acordo replicação de á exDonencial. reivindicação 10, em que a iucleícos é uma amplificação .2, Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a reacção < ie repl _L C 0 Ç 0 O 0 uma reacção de polimerase em cadeia (PCR), uma reacção de transcrípuase reversa- polimerase em c ra.de i. a. (RT-PCR) , uma PCR interna, urna reacção de liga.se em c 0d0 -i- 0 (LCR), um sis tema de a.mpli f d.ca.ção com o 0 s 0 n 0 t. ir 0 π s criçãe (TAS), u ;ma replicação de sequência sustentável (3SR), NASBA, uma reacção de amplificação 3 mediada por transcrição (TMA) , ou ama amplificação por deslocamento de cadeia (3DA).
2. 3, Método de acordo com a reivindicação 1, em. que o número de cópias pós-amplificação do ácido nucleico membro é substancialmente proporcional à actividade da enzima.
3. 4. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o número de cópias pós-amplificação do ácido nucleico membro é substancialmente proporcional à actividade do agente.
4. 5. Método de acordo com qualqu er das rervindict ições 3 a 5 , em que o r número de cópi as pós -amplificação do â r i π n i nucleico membro é substancia 1mente proporcional a afinic jade de liga ç ci o e/ou cinética dos pr 'ímeiro e segundo polipép- tidos. Método de acordo com c rualq uer das reivindicações precedentes, em que a repl .. icaç a. o do a. c.r go nucistco e detectada por membro, ensaio do númei :o de copias do ácido nucleico • Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em qn e a replicação do áci do nucleico é detectada por ensaio do número de cópias de segmentos do ácido nucleico membro. Q d' o Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em qu e a repl 1C cl Ç 3.0 CÍ O cl ϋ 1 .do nucle ico é detectada por ensaio ti d. oresença de marcação "io ácido n u cIe i c o membro. q _ Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 CL 15, em gu e a repl icaçao do ácido nucle ico é detectada por 4 determinação da actividade de um polipéptido codificado pelo ácido nucleíco membro.
5. 20. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que as condições na microcápsula. sã.o ajustadas para seleccíonar uma enzima ou um agente sob estas condições.
6. 21. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o polipéptido é proporcionado a partir do ácido nucleico por transcrição e tradução in vitro.
7. 22 . Método de acordo com qualquer reivindicação a.n terior, em que o acioo nuc.; . Θ 1 C 0 membro é incorporado num vector Θ i n t r o du z i d o n u m a cé.l .ula hospedeira para expressar polipéptíd
8. 23. Método da reivindicação 22, comj: xreen dendo a expressão do POllpépt. ido a partir do vector.
9. 24 . Método de acorde ) com qualquer reivindicação anterior, em que as microcáps ;u las compreendem mic ro c áp s ula ís aquosas de uma emu isão água- em-óleo,
10. 25. Método de acordo com a Reivindicação 24, em que a emulsão água-em- -óleo e proauziaa por emulsi: f icaça.o de uma fase aquosa com u .ma rase de óleo e um agente tensioactivo compreer idendo 4,5% v/v d< a SpanSO, 0, 4% v/v de TweenSO e 0,1% v. /v de Triton XI 0 0, o u um agente tensioactivo compreer 'idendo SpanS 0, TweenSO iC: lTl riton X100 substa.ncia.lmente nas mesmas proporções. Lisboa, 27 de Dezembro de 2006 5