JP5997691B2 - 酵素 - Google Patents

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Description

生命の多様性は、概して、２つのポリマー：ポリペプチド（つまりタンパク質）及びポリヌクレオチド（核酸）の多用途性に基づく。生物系における情報記憶及び情報伝達は、概して、たった２つのタイプの核酸、ＤＮＡ及びＲＮＡに基づいている。核酸は、特に、遺伝情報をコードするそれらの能力以上に特有の特性を示し、これは、それらを、化学、バイオテクノロジー、ナノテクノロジー、及び医学における重要なツールにしている。核酸はまた、治療薬としても莫大な可能性を有するが、血清／ヌクレアーゼ安定性に乏しいなどのような、ＤＮＡ及びＲＮＡの化学的性質による固有の全身性の制約を受ける。
系統的化学研究は、ＤＮＡ及びＲＮＡが生物の遺伝子系において分子的基盤を果たすことを可能にしている、決定的な化学的及び物理化学的パラメーターを明らかにし始めた。非天然核酸塩基を含む核酸の化学構造に対する変化（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）は、情報記憶のための分子決定因子を調査するために使用されてきた。代わりの骨格連結（非特許文献４）及びリボフラノース同族体（非特許文献５、非特許文献６）についての合成物質の探索が行われ、核酸の特性、構造、及び立体構造に対する、骨格の化学的構造及び／又は糖（若しくは等価物）化学の重大な影響を明らかにした。決定的に、化学的性質の小さなサブセットのみが、ＤＮＡ又はＲＮＡとの効率的な対形成を通してクロスポリマー情報伝達を可能にし、これは、現存する生物学的対象（biology）とクロストークが可能な合成遺伝子系の形成のための必要条件となる。しかしながら、ハイブリダイゼーションが必ずしも情報の内容を維持するわけではないので、クロスハイブリダイゼーション実験のみでは、所与の化学的性質が遺伝子系として果たす能力を決定的に決定することはできない。
情報記憶、情報伝達、及び進化のための潜在的な遺伝子ポリマーの可能性についてのより徹底的な検査は、複製のシステムを必要とする。原理的に、人工ポリマーは、化学的に合成及び複製され得るが、非酵素的ポリメリゼーションは、通常、非効率的で、かつ誤りがちであり（非特許文献７）、したがって、特殊な化学的性質を使用する、モノヌクレオチド（非特許文献８）又は短いオリゴマー（五量体）ユニット（非特許文献９）のポリメリゼーションにおける著しい進歩にもかかわらず、汎用のアプローチとして魅力がない。ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼを使用する酵素的ポリメリゼーションは、可能性として強力であるが、天然ポリメラーゼの密接な基質特異性によって制限される。ポリメラーゼ基質特異性の決定因子を理解し（非特許文献１０）、基質スペクトルが拡張されたポリメラーゼを作る（非特許文献１１、非特許文献１２）にあたっての著しい進歩にもかかわらず、ほとんどの非天然ヌクレオチド類似体は、合成及び／又は逆転写のための鋳型として、全置換の状態で、不十分なポリメラーゼ基質のままであった。
ＤＮＡ及びＲＮＡは、単に、生物の遺伝情報の宝庫であるだけではない。それらはまた、優れた特性を有する特有のポリマーでもある：それらは、十分に定義された規則に従って結合し、定められた幾何学的配置の、多様なナノ構造に構築され得、リガンドに結合し、かつ化学的反応を触媒するように進化することができ、空間中に化学基を配置するための超分子足場として果たすことができる。
アプタマーは、いくつかの臨床設定において抗体に匹敵する可能性を有する、明確な構造をもつ一本鎖核酸に基づく有望なクラスの生体分子治療薬である。広いスペクトルのＲＮＡ及びＤＮＡベースのアプタマーの両方が、記載されており、広範囲の標的に対して向けられ、いくつかのものは、現在、臨床試験を受けており、それらの可能性をはっきり示している。しかしながら、ＲＮＡ又はＤＮＡなどのような天然核酸に基づく試薬は、インビボの安定性及び／又は生物学的利用率などのような、臨床試薬及び治療薬についての多くの望ましい特性に関して、欠点を有する。原理的に、アプタマーは、医薬品化学アプローチによって安定化されてもよく（選択後）、このアプローチは、Macugenによって検証されており、第１のアプタマーベースの薬剤は、黄斑変性の治療について承認されている。しかしながら、選択後修飾は、アプタマー構造及び標的相互作用を改変する及び／又は弱め得る、アプタマー特異性を修飾するかもしれず、これは問題となる。
広範囲の修飾ヌクレオチドは、非天然の化学的性質を含むアプタマーを生成するためにＳＥＬＥＸにおいて使用されてきた。これらの修飾のうちのいくつかは、ヌクレアーゼ抵抗性及び安定性の増加などのように、選択されるアプタマーに対して望ましい特徴を与えるが、また、毒性及びタンパク質との非特異的な相互作用の増加などのような欠点をも有する。
オルソゴナリティー（つまり細胞性の機構との相互作用／干渉の欠如）及び結果として生じる毒性の欠如、ヌクレアーゼ抵抗性の増加、並びに他の可能性として望ましい特性は、より根本的に作られた核酸の使用から原理的に生じ得る。しかしながら、アプタマー分野に対するそれらの適用は、そのような核酸の設計及び合成の両方並びにそれらの合成、複製、及び進化のための特注のポリメラーゼの生成を必要とする。そのような試薬及びポリメラーゼが当技術分野において存在しないのは問題となる。
多くの新規な核酸構造は、オルソゴナリティーの増加を期待して構築されてきた。ここでの課題は、同時にそれと連絡する能力を維持しながら、細胞性の遺伝子機構との最小限の相互作用／干渉に至る足場を設計することである。重要な達成は、遺伝アルファベットを拡張し（情報のオルソゴナリティー）、核酸塩基の構造又はサイズを改変する（立体的なオルソゴナリティー）試みを含む。しかしながら、これらの場合のそれぞれにおいて、細胞性の毒性及び／又は情報の特異性についての問題が残る。
化学的にオルソゴナルな核酸に向けた異なったアプローチは、主鎖の修飾を含むが、情報核酸塩基をそのままにしておく。標準的なリボフラノースの他のペントース（又はヘキソース及びテトロース）との交換は、実際、らせん立体構造並びに二重鎖の安定性及び形成に対して劇的な効果を有し得る。
非特許文献１ 非特許文献２ 非特許文献３ 非特許文献４ 非特許文献５ 非特許文献６ 非特許文献７ 非特許文献８ 非特許文献９ 非特許文献１０ 非特許文献１１ 非特許文献１２
ある種のオルソゴナル核酸は、当技術分野において知られている。これらは、天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡとは構造的に異なるように、オルソゴナル核酸の化学的性質に基づいている。オルソゴナル核酸の１つの例は、ヘキシトール（ＨＮＡ）に基づくものである。他の例は、シクロヘキセニル（ＣｅＮＡ）ヌクレオチドに基づくものである。しかしながら、現在まで、そのようなオルソゴナル核酸は、化学的に産生することができるのみであった。これは、生物学的に有用な長さのポリマーの生産が非常に必要とされており、高価であることを意味している。
本発明は、オルソゴナルヌクレオチドをオルソゴナル核酸ポリマーに重合することができる核酸ポリメラーゼを提供する。発明者らは、オルソゴナルポリメラーゼ活性を有する個々のポリメラーゼ酵素を生成し、選択した。それらの研究の結果として、発明者らは、オルソゴナルヌクレオチドに対するポリメラーゼ活性を決定し、その操作を可能にする、ポリメラーゼにおける特異的な領域及びパッチを明らかにした。本発明は、これらの驚くべき発見に基づく。
したがって、一態様では、本発明は、ＤＮＡヌクレオチドポリマー鋳型から非ＤＮＡヌクレオチドポリマーを産生することができる核酸ポリメラーゼであって、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも３６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
当該アミノ酸配列は、ｔｈｕｍｂ領域の１又は２以上の残基で、配列番号１のアミノ酸配列に比べて変異しており、当該残基は、アミノ酸６５１〜６７９（パッチ１０Ａ）から選択され、
当該アミノ酸配列は、残基Ｅ６６４で、配列番号１のアミノ酸配列に比べて変異している、核酸ポリメラーゼを提供する。
適切には、当該非ＤＮＡヌクレオチドポリマーは、ＲＮＡポリマーであり、当該アミノ酸配列は、残基Ｙ４０９で、配列番号１のアミノ酸配列に比べて変異している。適切には、非ＤＮＡヌクレオチドポリマーがＲＮＡポリマーである場合、ポリメラーゼは、変異Ｙ４０９Ｎ又はＹ４０９Ｇを含む。適切には、非ＤＮＡヌクレオチドポリマーがＲＮＡポリマーである場合、ポリメラーゼは、変異Ｅ６６４Ｋ又はＥ６６４Ｑを含む。適切には、非ＤＮＡヌクレオチドポリマーがＲＮＡポリマーである場合、ポリメラーゼは、変異Ｙ４０９Ｎ及びＥ６６４Ｑ（ＴｇｏＴ Ｙ４０９Ｎ Ｅ６６４Ｑ； ＴＮＱ）を含む。適切には、非ＤＮＡヌクレオチドポリマーがＲＮＡポリマーである場合、ポリメラーゼは、変異Ｙ４０９Ｇ及びＥ６６４Ｋ（ＴｇｏＴ Ｙ４０９Ｇ Ｅ６６４Ｋ； ＴＧＫ）を含む。適切には、当該ポリメラーゼは、変異Ｙ４０９Ｇ及びＥ６６４Ｋを含む。他の態様では、本発明は、ＲＮＡヌクレオチドポリマーを作製するための方法であって、上記に記載される核酸ポリメラーゼとＤＮＡ鋳型を接触させるステップ及びポリメリゼーションさせるためにインキュベートするステップを含む方法に関する。
他の態様では、本発明は、上記に記載される核酸ポリメラーゼであって、ＤＮＡヌクレオチドポリマー鋳型からＨＮＡヌクレオチドポリマーを産生することができ、配列番号１２のアミノ酸６５１〜６７９（パッチ１０Ａ）に相当するアミノ酸配列を含む核酸ポリメラーゼに関する。適切には、当該ポリメラーゼは、ＤＮＡヌクレオチドポリマー鋳型からＨＮＡヌクレオチドポリマーを産生することができ、当該ポリメラーゼは、配列番号１２に相当するアミノ酸配列を含む。他の態様では、本発明は、ＨＮＡヌクレオチドポリマーを作製するための方法であって、上記に記載される核酸ポリメラーゼとＤＮＡ鋳型を接触させるステップ及びポリメリゼーションさせるためにインキュベートするステップを含む方法に関する。
他の態様では、本発明は、ＨＮＡヌクレオチドポリマーをＤＮＡヌクレオチドポリマーに逆転写することができる核酸ポリメラーゼであって、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも３６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
当該アミノ酸配列は、残基Ｉ５２１で、配列番号１のアミノ酸配列に比べて変異している、核酸ポリメラーゼに関する。適切には、当該ポリメラーゼは、Ｉ５２１Ｌ、Ｉ５２１Ｐ、及びＩ５２１Ｈからなる群から選択される変異を含む。適切には、当該ポリメラーゼは、変異Ｉ５２１Ｌを含む。
適切には、当該ポリメラーゼは、変異Ａ４８５Ｌをさらに含む。
適切には、当該ポリメラーゼは、変異Ｖ９３Ｑをさらに含む。
適切には、当該ポリメラーゼは、変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａをさらに含む。
他の態様では、本発明は、上記に記載される核酸ポリメラーゼであって、当該非ＤＮＡポリマーは、ＨＮＡポリマーであり、当該ポリメラーゼは、変異Ｉ５２１Ｌを含み、当該ポリメラーゼは、変異Ａ４８５Ｌをさらに含み、当該ポリメラーゼは、変異Ｖ９３Ｑをさらに含み、当該ポリメラーゼは、変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａをさらに含む、核酸ポリメラーゼに関する。
他の態様では、本発明は、ＤＮＡヌクレオチドポリマーを作製するための方法であって、上記に記載される核酸ポリメラーゼとＨＮＡ鋳型を接触させるステップ及びポリメリゼーションさせるためにインキュベートするステップを含む方法に関する。
他の態様では、本発明は、上記に記載されるポリメラーゼをコードする核酸に関する。
他の態様では、本発明は、上記に記載される核酸を含む宿主細胞に関する。
他の態様では、本発明は、
（ｉ）請求項１、５、又は６のいずれかに記載のＤＮＡヌクレオチドポリマー鋳型からＨＮＡヌクレオチドポリマーを産生することができる核酸ポリメラーゼ及び
（ii）ＨＮＡヌクレオチドポリマーを、請求項８〜１４のいずれかに記載のＤＮＡヌクレオチドポリマーに逆転写することができる核酸ポリメラーゼを含む系に関する。
他の態様では、本発明は、ＤＮＡヌクレオチドポリマー鋳型から非ＤＮＡヌクレオチドポリマーを産生することができる核酸ポリメラーゼであって、
配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも３６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
当該アミノ酸配列は、ｔｈｕｍｂ領域の１又は２以上の残基で、配列番号１のアミノ酸配列に比べて変異しており、
当該残基は、
（ｉ）アミノ酸６５１〜６７９（パッチ１０Ａ）又は
（ii）アミノ酸７３４〜７６５（パッチ１２）
から選択される、核酸ポリメラーゼを提供する。
適切には、当該アミノ酸配列は、
（ｉ）アミノ酸６５１〜６７９（パッチ１０Ａ）
から選択される１又は２以上の残基で、配列番号１のアミノ酸配列に比べて変異している。
適切には、当該ポリメラーゼは、ＤＮＡヌクレオチドポリマー鋳型からＨＮＡヌクレオチドポリマーを産生することができ、
当該ポリメラーゼは、配列番号１２、１３、１４、若しくは１５のいずれかのアミノ酸６５１〜６７９（パッチ１０Ａ）に相当するアミノ酸配列を含む及び／又は
当該ポリメラーゼは、配列番号１６、１７、若しくは１８のいずれかのアミノ酸７３４〜７６５（パッチ１２）に相当するアミノ酸配列を含む。
適切には、当該ポリメラーゼは、ＤＮＡヌクレオチドポリマー鋳型からＨＮＡヌクレオチドポリマーを産生することができ、当該ポリメラーゼは、配列番号１２に相当するアミノ酸配列を含む。
適切には、当該ポリメラーゼは、ＤＮＡヌクレオチドポリマー鋳型からＣｅＮＡヌクレオチドポリマーを産生することができ、
当該ポリメラーゼは、配列番号３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０のいずれかのアミノ酸６５１〜６７９（パッチ１０Ａ）に相当するアミノ酸配列を含む及び／又は
当該ポリメラーゼは、配列番号１１のいずれかのアミノ酸７３４〜７６５（パッチ１２）に相当するアミノ酸配列を含む。
適切には、当該ポリメラーゼは、ＤＮＡヌクレオチドポリマー鋳型からＣｅＮＡヌクレオチドポリマーを産生することができ、当該ポリメラーゼは、配列番号５又は配列番号６に相当するアミノ酸配列を含む。
適切には、当該ポリメラーゼは、変異Ｅ６６４Ｑを含む。
適切には、当該ポリメラーゼは、ＤＮＡヌクレオチドポリマー鋳型からＲＮＡヌクレオチドポリマーを産生することができ、当該ポリメラーゼは、変異Ｅ６６４Ｑを含む。
適切には、当該ポリメラーゼは、変異Ａ４８５Ｌをさらに含む。
適切には、当該ポリメラーゼは、変異Ｖ９３Ｑをさらに含む。
適切には、当該ポリメラーゼは、変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａをさらに含む。
他の態様では、本発明は、非ＤＮＡヌクレオチドポリマーを作製するための方法であって、上記に記載される核酸ポリメラーゼとＤＮＡ鋳型を接触させるステップ及びポリメリゼーションさせるためにインキュベートするステップを含む方法に関する。適切には、ＤＮＡ鋳型から当該ポリマーを解離するために又はポリマーを解放するためにＤＮＡ鋳型を除去するために、適したステップ（複数可）が、合成に続いてもよい。
他の態様では、本発明は、少なくとも５０のヌクレオチドを含む非ＤＮＡヌクレオチドポリマーに関する。適切には、当該非ＤＮＡヌクレオチドポリマーは、ＨＮＡ又はＣｅＮＡを含む。
他の態様では、本発明は、上記に記載される方法によって得られる非ＤＮＡヌクレオチドポリマーに関する。
他の態様では、本発明は、非ＤＮＡヌクレオチドポリマーをＤＮＡヌクレオチドポリマーに逆転写することができる核酸ポリメラーゼであって、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも３６％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
当該アミノ酸配列は、Ｉ５２１及びＹ３８８から選択される１又は２以上の残基で、配列番号１のアミノ酸配列に比べて変異している核酸ポリメラーゼに関する。
適切には、当該非ＤＮＡポリマーは、ＨＮＡポリマー又はＣｅＮＡポリマー又はＲＮＡポリマーである。
適切には、逆転写が可能な当該ポリメラーゼは、Ｉ５２１Ｌ、Ｉ５２１Ｐ、及びＩ５２１Ｈからなる群から選択される変異を含む。適切には、当該ポリメラーゼは、変異Ｉ５２１Ｌを含む。
適切には、逆転写が可能な当該ポリメラーゼは、Ｙ３８８Ｖ、Ｙ３８８Ｒ、Ｙ３８８Ｈ、Ｙ３８８Ｎ、及びＹ３８８Ｔからなる群から選択される変異を含む。
適切には、逆転写が可能な当該ポリメラーゼは、変異Ａ４８５Ｌをさらに含む。
適切には、逆転写が可能な当該ポリメラーゼは、変異Ｖ９３Ｑをさらに含む。
適切には、逆転写が可能な当該ポリメラーゼは、変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａをさらに含む。
適切には、当該非ＤＮＡポリマーは、ＨＮＡポリマーであり、逆転写が可能な当該ポリメラーゼは、変異Ｉ５２１Ｌを含み、当該ポリメラーゼは、変異Ａ４８５Ｌをさらに含み、当該ポリメラーゼは、変異Ｖ９３Ｑをさらに含み、当該ポリメラーゼは、変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａをさらに含む。
他の態様では、本発明は、上記に記載されるポリメラーゼをコードする核酸に関する。
他の態様では、本発明は、上記に記載される核酸を含む宿主細胞に関する。
他の態様では、本発明は、特定の所定の特徴を有する非ＤＮＡヌクレオチドポリマーをスクリーニングするための方法であって、上記に記載される候補非ＤＮＡヌクレオチドポリマーを調製するステップ及び当該特徴について当該非ＤＮＡヌクレオチドポリマーをアッセイするステップを含む方法に関する。
他の態様では、本発明は、非ＤＮＡヌクレオチドポリマー鋳型からＤＮＡポリマーを作製するための方法であって、上記に記載される核酸ポリメラーゼと当該鋳型を接触させるステップ及びポリメリゼーションさせるためにインキュベートするステップを含む方法に関する。
他の態様では、本発明は、医薬を作製するための方法であって、上記に記載される非ＤＮＡヌクレオチドポリマーを調製するステップを含む方法に関する。
他の態様では、本発明は、
（ｉ）上記に記載されるＤＮＡヌクレオチドポリマー鋳型から非ＤＮＡヌクレオチドポリマーを産生することができる核酸ポリメラーゼ及び
（ii）非ＤＮＡヌクレオチドポリマーを上記に記載されるＤＮＡヌクレオチドポリマーに逆転写することができる核酸ポリメラーゼを含む系に関する。
他の態様では、本発明は、
（ｉ）上記に記載される多様なＤＮＡヌクレオチドポリマー鋳型のレパートリーから多様な非ＤＮＡヌクレオチドポリマーのレパートリーを産生することができる核酸ポリメラーゼ、
（ii）１）特定の標的への結合又は２）特定の化学的反応の触媒作用などのような所望の機能についての、多様な非ＤＮＡヌクレオチドポリマーの上記のレパートリーの選択又はスクリーニング、
（iii）所望の表現型（結合又は触媒作用）を有する、選択される非ＤＮＡヌクレオチドポリマーを、上記に記載されるＤＮＡヌクレオチドポリマーに逆転写することができる核酸ポリメラーゼを含む系に関する。
生物学における情報記憶及び情報伝達は、たった２つのタイプの核酸、ＤＮＡ及びＲＮＡに基づいている。しかしながら、それらの普及が、環境（「歴史的な偶然」）、生命の起源で課された制約の反映又はリボフラノースベースの核酸の化学的代替物が限られていることのいずれの結果であるかは知られていない。本明細書で、発明者らは、自然界において見出されない化学的に単純な核酸構造である１，５アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）に基づく人工遺伝子系の開発を記載し、この系の遺伝及び進化に対する能力を実証する。ポリメラーゼの進化及び設計を使用して、発明者らは、ＤＮＡ鋳型ＨＮＡポリメラーゼ及びＨＮＡ逆転写酵素の両方を作った。ともに、これらは、ＤＮＡからＨＮＡへ、そしてＤＮＡに戻る、遺伝情報の効率的な伝達を可能にし、ＲＮＡウイルス複製に匹敵する１．４×１０−２の正確性の総計を有するＨＮＡベースの遺伝を確立する。発明者らは、ＲＮＡ標的（ＨＩＶ−ＴＡＲ）に対して特異的な全ＨＮＡアプタマーの新規の選択によって、この新しい合成遺伝物質の進化をさらに実証する。発明者らの結果は、完全に非天然の系によって、遺伝及び進化の両方をもたらすことができることを示し、リボフラノースベースの核酸に基づいて構築されることとなる、生命にとって必須で機能的な命令はないことを示唆する。
本発明は、オルソゴナル核酸の化学的性質を使用する、第３のタイプの遺伝物質に基づく人工遺伝子系の設計及び構築、特に、新しい、配列が定められた核酸ポリマーの鋳型合成、複製、及び進化のための進化したポリメラーゼに関する。
そのような系は、診断、予後、及び治療法としての可能性のある適用と共に、新しい核酸ポリマーの合成、複製、及び進化のための技術を可能にする手掛かりとなる。治療上の適用に関して、ＤＮＡ及びＲＮＡの化学的性質において固有の全身性の制約のうちのいくつかを検討することもまた有望である。
発明者らは、本発明を例証するために例示的な主鎖構造として２つの非天然核酸構造、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ，Hexitol nucleic acid）及びシクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ，Cyclohexenyl nucleic acid）を選択した。ＨＮＡ及びＣｅＮＡのヌクレオチドは、天然に存在するキナーゼに対して非常に弱い基質であり、したがって、細胞に対して無毒性である。ＨＮＡ及びＣｅＮＡポリマーは、天然に存在するヌクレアーゼに対する基質ではなく、そのため、ＤＮアーゼによってもＲＮアーゼによっても分解されない。ＨＮＡ及びＣｅＮＡの両方は、ヌクレアーゼ分解に対して十分に抵抗性であり、ＤＮＡ又はＲＮＡの修飾酵素に対する基質ではないと思われる。有意には、それらは、ヌクレオチドとして細胞に対して無毒性であり、細胞性の複製、転写、及び翻訳機構によって基質として認識されないと思われる。同時に、それらは、遺伝情報の伝達のための本質的な特性である、ＤＮＡ及びＲＮＡと配列特異的な二重鎖を形成する能力を決定的に保持する。ＨＮＡは、標準的なＡ又はＢ型構造ヘリックスとは異なる二重鎖構造を形成することが知られており（また、ＣｅＮＡは、そのように予測され）、これは、新しい機能の可能性を有する新しいアプタマーの立体構造及び構造モチーフの形成を可能にし得る。ＨＮＡ単量体（長命の治療薬の最終的な分解から生じるかもしれない）は、細胞に対して無毒性であることが示されてきた。そのため、ＨＮＡ及びＣｅＮＡは、オルソゴナル遺伝子系の構築及びアプタマーなどのような核酸治療薬の単離に応用するための理想的なスペクトルの特性を兼ね備える。
適切には、ＨＮＡポリメラーゼの適用については、本発明のポリメラーゼは、「６Ｇ１２」について示される変異を含む。
適切には、ＲＮＡポリメラーゼの適用については、本発明のポリメラーゼは、「Ｄ４Ｎ３」などのような「Ｄ４」について示される変異を含む。特に、これは、「Ｄ４Ｎ３」においてＹ４０９ＮであるＹ４０９変異を含む。
適切には、本発明のＣｅＮＡポリメラーゼ適用については、ポリメラーゼは、「Ｃ７」又は６Ｇ１２について示される変異を含む。
本発明の多数のポリメラーゼが、複数のオルソゴナル核酸に対して活性を示すことが十分に理解されるであろう。例えば、１つの酵素は、ＲＮＡ逆転写酵素及びＨＮＡ逆転写酵素活性の両方を示すことができる。その酵素が完全な校正機能を有する場合、ＨＮＡ逆転写酵素として適していそうにないが、ＲＮＡ逆転写酵素としては適したままである。
本発明に従って有用な酵素と考えられるために（つまり、特定される機能を有することができると考えられるために）、本発明のポリメラーゼ又は逆転写酵素は、長さが少なくとも１４のヌクレオチド、適切には、長さが少なくとも１５のヌクレオチド、より適切には、長さが４０のヌクレオチド、最も適切には、長さが少なくとも５０のヌクレオチドのポリマーを産生できるものであるべきである。
長さが少なくとも５０のヌクレオチドのポリマーの合成について最もストリンジェントな基準に従って、ポリメラーゼＣ７及び６Ｇ１２は、ＲＮＡに対して作用すると見なされなくてもよく、ポリメラーゼＤ４及びＣ７は、ＨＮＡに対して作用すると見なされなくてもよい。したがって、本発明のポリメラーゼが、特定のタイプのオルソゴナル核酸のためのものである又はそれに対して特異的であるとして説明される場合、それらがポリマー又は少なくとも４０のヌクレオチド、適切には、長さが少なくとも５０のヌクレオチドを一貫して産生することができることが期待されることが理解されるはずである。
典型的に、最も小さなアプタマー又はリボザイムは、フォールドするためにおよそ４０のヌクレオチドの配列を必要とする。より適切には、小さなアプタマー又はリボザイムはまた、ポリメラーゼ結合のための少数の余分なヌクレオチドを含み、そのため、適切には、長さが少なくとも約５０のヌクレオチドである。アプタマースクリーニングの適用のために、典型的な好ましい最小の長さは、そのため、５０のヌクレオチドである。
定義
用語「含む（comprises）」（含む（comprise）、含む（comprising））は、当技術分野におけるその通常の意味を有する、つまり、明示される特徴又は特徴の群が含まれるが、用語が、いかなる他の明示される特徴又は特徴の群も、同様に存在することから除くわけではないことが理解されたい。
本明細書において使用されるように、逆転写酵素又は「逆転写酵素活性」という用語は、非ＤＮＡポリマー鋳型からのＤＮＡポリマーの生産を指す。したがって、非ＤＮＡ鋳型がＲＮＡを含む場合、用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有する。文脈から明らかであるように、多数の態様及び実施形態において、本発明は、例えばＲＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、又は他のそのような非ＤＮＡ鋳型であってもよい非ＤＮＡポリマー鋳型からＤＮＡポリマーを生産する意味の逆転写酵素活性に関する。したがって、逆転写酵素は、古典的に、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと見なされてもよい。他の非ＤＮＡヌクレオチドポリマーについては、用語「逆転写酵素」は、鋳型核酸がもちろん変更されてもよい以外は、同じ全体的な意味を有する。例えば、ＨＮＡに対する逆転写酵素は、ＨＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを意味し、ＣｅＮＡに対する逆転写酵素は、ＣｅＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを意味する。
非ＤＮＡヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド以外のヌクレオチドを意味する。例えば、それは、ＲＮＡポリマーを作製するために使用されてもよい通常のリボヌクレオチドを意味してもよい。その代わりに、それは、ヘキシトール（ＨＮＡ）ヌクレオチド又はシクロヘキセニル（ＣｅＮＡ）ヌクレオチド又は他のそのようなヌクレオチドポリマーなどのような、任意の他の種類の非ＤＮＡヌクレオチドを意味してもよい。最も適した非ＤＮＡヌクレオチド又はポリマーはまた、非ＲＮＡヌクレオチド又はポリマーでもある、つまり、最も適切には、非ＤＮＡポリマーは、ＸＮＡ又は３ＮＡ（ＨＮＡ又はＣｅＮＡなど）であってもよい。
適切には、本発明は、全く新しいポリマー、つまりオルソゴナル核酸の生産に関する。目標は、従来のＤＮＡポリマーにおいてコードされる情報と同じ、そのポリマーにおいてコードされる情報を保つことである。例えば、第５の塩基を含むこと又は４つの従来の塩基以上に遺伝アルファベットを拡張することは本発明の目的ではないが、所望される場合、当業者によってこのように本発明を適用することができる。適切には、本発明のポリマーは、それらの情報内容の点から従来のＤＮＡポリマーと同じ４つの塩基を示す。
オルソゴナル核酸は、非ＤＮＡ核酸である。例として、本明細書において記載されるＨＮＡ又はＣｅＮＡを含む。これらの非ＤＮＡ核酸は、文脈から明らかであるように、時に「３ＮＡ」又は「ＸＮＡ」と呼ばれる。適切には、オルソゴナル核酸は、ＨＮＡ又はＣｅＮＡである。最も適切には、オルソゴナル核酸は、ＨＮＡである。ＨＮＡは、本明細書において説明されるオルソゴナル核酸のうちで最も実験的に扱いやすいので、特に好都合である。
ポリメラーゼ
原理的に、本発明のポリメラーゼは、操作者の選択により、出発ポリメラーゼ又は「ポリメラーゼ主鎖」の対応する部位に本明細書において記載される特異的な変異を導入することによって作製されてもよい。このように、その出発ポリメラーゼの活性は、本明細書において記載されるオルソゴナル活性をもたらすために修飾されてもよい。
ポリメラーゼ主鎖は、よく知られているｐｏｌＢ酵素ファミリーの任意のメンバーであってもよい（配列番号１の例示的な真の野生型ＴｇｏＴ配列とわずか３６％の同一性を示すｐｏｌデルタバリアントを含む）。より適切には、ポリメラーゼ主鎖は、ウイルスポリメラーゼを除く、よく知られているｐｏｌＢ酵素ファミリーの任意のメンバーであってもよい。より適切には、ポリメラーゼ主鎖は、配列番号１に対して少なくとも３６％、適切には、少なくとも５０％、適切には、少なくとも６０％、適切には、少なくとも７０％、適切には、少なくとも８０％の同一性を有する、よく知られているｐｏｌＢ酵素ファミリーの任意のメンバーであってもよい。８０％の同一性レベルでは、本発明は、適切には、古細菌サーモコッカス及び／又はパイロコッカス属由来のｐｏｌＢ酵素を包含する。好ましい実施形態では、適切には、ポリメラーゼ主鎖は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する。
他のポリメラーゼ主鎖を使用する場合、当技術分野においてよく知られており、かつ上記に述べられるように、変異は、等価な位置に移動する。例えば、例示的なポリメラーゼ６Ｇ１２に関して、以下の表は、代替の主鎖への変異の移動がどのように実行されてもよいかを示す。表は、Ｐｏｌ６Ｇ１２の変異及び他のＰｏｌＢにおける構造的に等価な位置を示す。Ｐｏｌ６Ｇ１２において見つけられる変異は、野生型Ｔｇｏの基礎的な配列に対して示す。他のよく研究されているＢ−ファミリーポリメラーゼにおける構造的に等価な残基を示す。等価な位置にマッピングされなかった残基は、Ｎ．Ｄ．と示す。
Figure 0005997691
最も適切には、ポリメラーゼ主鎖は、古細菌サーモコッカスＴｇｏＴ ｐｏｌＢであり、真の野生型配列は、配列番号１において示されるとおりである。これは、参照配列として果たし、本発明の好ましい実施形態は、この配列に関して記載される。
参照配列
ポリメラーゼの特定のアミノ酸残基が数値アドレスを使用して指される場合、ナンバリングは、配列番号１の真の野生型ＴｇｏＴ ｐｏｌＢアミノ酸配列（又はそれをコードする核酸配列）に関してなされる。
これは、所望の残基を位置づけるために、当技術分野においてよく理解されるように使用される。これは、必ずしも、厳密なカウント作業だとは限らず、情況に注意を払われなければならない。例えば、所望のタンパク質の長さがわずかに異なる場合、Ｅ６６４（例えば）に対応する、その配列における正確な残基の位置の決定は、所望の配列の６６４番目の残基を単に採用するのではなく、配列をアライメントし、等価な又は対応する残基を選ぶことを必要としてもよい。これは、当業者の範囲内に十分にある。
変異は、言及される残基、モチーフ、又は領域の置換又は切断又は欠失を指してもよい。好ましくは、変異は、置換を意味する。したがって、明確に又は文脈によって他に示されない限り、「変異」は、本明細書において言及されるアミノ酸の置換を指すようにとられてもよい。
変異は、例えば、変異配列を有するポリペプチドの合成によって、ポリペプチドレベルで達成されてもよく、又は例えば、変異配列をコードする核酸を作製することによって、ヌクレオチドレベルで達成されてもよく、この核酸は、変異ポリペプチドを産生するように、続いて翻訳されてもよい。所与の変異部位に対する置換アミノ酸としてアミノ酸が特定されない場合、デフォルトとしてアラニン（Ａ）が使用されてもよい。適切には、特定の部位（複数可）で使用される変異は、本明細書において説明されるとおりである。
断片は、適切には、長さが少なくとも１０のアミノ酸、適切には、少なくとも２５のアミノ酸、適切には、少なくとも５０のアミノ酸、適切には、少なくとも１００のアミノ酸、又は適切には、所望のポリメラーゼポリペプチドの大部分、つまり３８７以上のアミノ酸、適切には、少なくとも５００のアミノ酸、適切には、少なくとも６００のアミノ酸、適切には、少なくとも７００のアミノ酸、適切には、ＴｇｏＴ ｐｏｌＢ配列の全７７３のアミノ酸である。
配列変異
本発明のポリメラーゼは、本明細書においてより詳細に記載される重要な変異に加えて、野生型配列に比べて配列変化を含んでいてもよい。特に、本発明のポリメラーゼは、本明細書において記載されるポリメラーゼの機能又は作用を著しく損なわない部位に配列変化を含んでいてもよい。
ポリメラーゼ機能は、その機能が抑止されていない又は著しく改変されていないことを検証するために、実施例の部においてなどのように記載されるように、ポリメラーゼを作動させることによって容易に試験されてもよい。
したがって、ポリメラーゼが本明細書において説明されるように容易に試験することができるその機能を保持することを考慮すれば、配列変異は、野生型参照配列に関してポリメラーゼ分子においてなされてもよい。
保存的置換は、例えば下記の表に従ってなされてもよい。第２のカラムにおける同じブロックにおける、好ましくは第３のカラムにおける同じ行のアミノ酸は、互いに置換されてもよい。
Figure 0005997691
どのような変異、置換、又は他のそのような変化が野生型配列に関してなされてもよいかを考慮する際には、ポリメラーゼの機能の保持が優先する。典型的に、保存的アミノ酸置換は、機能に悪影響を及ぼす可能性がそれほどないであろう。適切には、本発明のポリメラーゼは、説明される以外は、保存的アミノ酸置換によってのみ野生型配列から変化している。
配列相同性／同一性
配列相同性も、機能的な類似性（つまり、類似する化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の点から考慮することができるが、本明細書との関連において、配列同一性の点から相同性を表現することが好ましい。
配列比較は、眼によって、又はより通常では、容易に入手可能な配列比較プログラムの援助によって行うことができる。これらの公的に、また市販で入手可能なコンピュータープログラムは、２つ以上の配列の間の相同性パーセント（同一性パーセントなど）を計算することができる。
同一性パーセントは、連続する配列にわたり計算されてもよい、つまり、一方の配列は、他方の配列とアライメントされ、一方の配列におけるそれぞれのアミノ酸は、他方の配列における対応するアミノ酸と直接、同時に１つの残基が比較される。これは、「ギャップなし（ungapped）」アライメントと呼ばれる。典型的に、そのようなギャップなしアライメントは、比較的短い数の残基（例えば５０未満の連続するアミノ酸）にわたってのみ実行される。
これは非常に単純で一貫した方法であるが、例えば、別の方法では同一となる対の配列において、ある挿入又は欠失が、次のアミノ酸残基をアライメント不能にし、したがって、グローバルアライメント（全配列にわたるアライメント）が実行される場合、可能性として、相同性パーセント（同一性パーセント）における大きな低下をもたらすことを考慮に入れない。したがって、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性（同一性）スコアに不当にペナルティーを科すことなく、可能性のある挿入及び欠失を考慮に入れる最適なアライメントをもたらすように設計される。これは、配列アライメントにおいて局所的な相同性／同一性を最大限にすることを試みるために「ギャップ」を挿入することによって達成される。
これらのより複雑な方法は、アライメントにおいて生じるそれぞれのギャップに「ギャップペナルティー」を割り当て、同数の同一のアミノ酸について、できるだけ少数のギャップを有する配列アライメント−２つの比較配列の間のより高度な関連性を示す−は、多くのギャップを有するものよりも高度なスコアを達成するであろう。ギャップの存在について比較的高度なコスト及びギャップにおけるそれぞれの続く残基に対してより小さなペナルティーを課す「アフィンギャップコスト（affine gap cost）」が、典型的に使用される。これは最も一般に使用されるギャップスコアリングシステムである。高度なギャップペナルティーは、もちろん、より少数のギャップを有する最適化されたアライメントをもたらすであろう。ほとんどのアライメントプログラムは、ギャップペナルティーが修正されるのを可能にする。しかしながら、配列比較のためにそのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、GCG Wisconsin Bestfitパッケージ（以下を参照されたい）を使用する場合、アミノ酸配列に対するデフォルトギャップペナルティーは、ギャップに対して−１２であり、それぞれのエクステンションに対して−４である。
そのため、最大の相同性パーセントの計算は、第１に、ギャップペナルティーを考慮する最適なアライメントの生成を必要とする。そのようなアライメントを実行するのに適したコンピュータープログラムは、GCG Wisconsin Bestfitパッケージである（University of Wisconsin, U. S. A; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387）。配列比較を実行することができる他のソフトウェアの例は、BLASTパッケージ、FASTA（Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410）、及び比較ツールのGENEWORKSスーツを含むが、これらに限定されない。
最終的な相同性パーセントは、同一性の点から測定することができるが、アライメントプロセスはそれ自体、全か無かの対比較に基づかない。その代わりに、化学的類似性又は進化論的な距離に基づいてそれぞれの対での比較にスコアを割り当てるスケールド類似性スコアマトリックス（scaled similarity score matrix）が、一般に使用される。一般に使用されるそのようなマトリックスの例は、BLOSUM62マトリックス−プログラムのBLAST suiteのためのデフォルトマトリックスである。GCG Wisconsinプログラムは、一般に、公的なデフォルト値か、又は提供される場合には、特注のシンボル比較表かのいずれかを使用する。GCGパッケージのための公的なデフォルト値又は他のソフトウェアの場合には、BLOSUM62などのようなデフォルトマトリックスを使用することが好ましい。一旦ソフトウェアが最適なアライメントを生成したら、相同性パーセント、好ましくは配列同一性パーセントを計算することが可能である。ソフトウェアは、典型的に、配列比較の一部としてこれを行い、数的な結果を生成する。
適切には、同一性は、本明細書において開示される適切なポリペプチド配列（複数可）、最も適切には、完全長前駆体である、配列番号１の「真の野生型」ＴｇｏＴ ｐｏｌＢ配列と少なくとも４００又は５００好ましくは６００、７００、又はそれ以上のアミノ酸にわたりアミノ酸レベルで評価される。
適切には、相同性は、非本質的な隣接する配列ではなく、タンパク質機能にとって本質的であることが知られている配列の１又は２以上のそれらの領域を基準にして考慮されるべきである。遠縁生物由来の相同な配列を考慮する場合、これは、とりわけ重要である。
保存領域を考慮する場合、適切には、配列番号１及びｐｏｌＢ酵素ファミリーのｐｏｌデルタメンバーの両方に共通の残基の３６％は、他に説明されない限り、本発明のポリペプチドにおいて適切には変異されない、可能性として重要な残基であると考えられる。したがって、適切には、本発明のポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも３６％の同一性を有し、適切には、当該少なくとも３６％の同一性を構成するアミノ酸残基は、配列番号１及びｐｏｌＢ酵素ファミリーのｐｏｌデルタメンバーの間で同一であるものに対応するアミノ酸残基を含む。適切には、本発明のポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも３６％の同一性を有し、ｐｏｌＢ酵素ファミリーのｐｏｌデルタメンバーに対して少なくとも３６％の同一性を有する。
同じ考慮は、核酸ヌクレオチド配列に当てはまる。
本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、組換え複製可能ベクターの中に組み込むことができる。ベクターは、適合する宿主細胞において核酸を複製するために使用されてもよい。したがって、さらなる実施形態では、本発明は、複製可能ベクターの中に本発明のポリヌクレオチドを導入し、適合する宿主細胞の中にベクターを導入し、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を成長させることによって、本発明のポリヌクレオチドを作製するための方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収されてもよい。適した宿主細胞には、大腸菌などのような細菌を含む。
好ましくは、ベクター中の本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞によってコード配列の発現をもたらすことができる制御配列に作動可能に連結される、つまり、ベクターは、発現ベクターである。用語「作動可能に連結される」は、記載される構成成分が、それらの意図される様式でそれらが機能するのを可能にする関係にあることを意味する。コード配列に「作動可能に連結される」調節性配列は、コード配列の発現が制御配列に適合した条件下で達成されるようにライゲーションされる。
本発明のベクターは、本発明のタンパク質の発現をもたらすために、記載される適した宿主細胞の中に形質転換されてもよい又はトランスフェクトされてもよい。このプロセスは、タンパク質をコードするコード配列のベクターによる発現をもたらすための条件下で、上記に記載される発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養するステップ及び任意選択で、発現タンパク質を回収するステップを含んでいてもよい。
ベクターは、例えば、複製開始点、任意選択で、当該ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター、及び任意選択で、プロモーターの制御因子が提供されたプラスミド又はウイルスベクターであってもよい。ベクターは、１又は２以上の選択マーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合にはアンピシリン抵抗性遺伝子を含有していてもよい。ベクターは、例えば、宿主細胞をトランスフェクトする又は形質転換するために使用されてもよい。
本発明のタンパク質をコードする配列に作動可能に連結される制御配列は、プロモーター／エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む。これらの制御配列は、発現ベクターがその中で使用されるように設計される宿主細胞と適合するように選択されてもよい。プロモーターという用語は、当技術分野においてよく知られており、ミニマルプロモーターから上流エレメント及びエンハンサーを含むプロモーターに及ぶサイズ及び複雑性の核酸領域を包含する。
タンパク質の発現及び精製
本発明のタンパク質は、例えば下記及び実施例において記載されるように、組換え手段によって典型的に作製される。しかしながら、それらはまた、固相合成などのような、当業者らによく知られている技術を使用する合成手段によって作製されてもよい。本発明のタンパク質はまた、例えば、抽出及び精製を支援するために融合タンパク質として産生されてもよい。融合タンパク質パートナーの例は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合及び／又は転写活性化ドメイン）、並びにβ−ガラクトシダーゼを含む。融合タンパク質配列の除去を可能にするために、融合タンパク質パートナー及び所望のタンパク質配列の間にタンパク分解性切断部位を含むこともまた、好都合であろう。明らかに、選択される融合タンパク質は、本発明のポリメラーゼの機能を妨げてはならない。
適切には、本発明のポリメラーゼは、本発明のポリメラーゼが、本明細書において述べられるように、その熱安定性特性に基づいて及び／又は単純なよく知られている精製手法を使用して好都合に精製されてもよいので、精製のためのいかなる配列にも融合されない。
本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、本発明のタンパク質を発現するために使用されてもよい。宿主細胞は、本発明のタンパク質の発現を可能にする、適した条件下で培養されてもよい。本発明のタンパク質の発現は、それらが絶えず産生されるように恒常的であってもよい又は誘発性で、発現を開始するために刺激を必要としてもよい。誘発性の発現の場合には、タンパク質産生は、例えば、培養培地に対する誘発因子物質、例えばデキサメタゾン又はＩＰＴＧの追加によって、必要とされる場合に開始することができる。
本発明のタンパク質は、酵素的、化学的、及び／又は浸透圧溶解による、並びに物理的破壊を含む当技術分野において知られている様々な技術によって宿主細胞から抽出することができる。
ポリメラーゼ変異体
発明者らは、オルソゴナルポリメラーゼ機能を提供するために変えられてもよい、ポリメラーゼ酵素の新しい領域を同定した。ポリメラーゼ酵素の従来の構造モデルを参照すると、同定されているパッチは、酵素の「ｔｈｕｍｂ」部分に位置する。承認されているモデルでは、ポリメラーゼは、酵素の構造によって定められる中央の空間を通過するＤＮＡ「ロッド」のまわりに広がる右「手」と考えられている。記載されるオルソゴナルポリメラーゼ機能を提供するために変化させてもよい発明者らが教示する酵素の領域は、酵素の「ｔｈｕｍｂ」部分である。より詳細には、それは、ＤＮＡ「ロッド」が酵素の「手」を通り過ぎる出口点のｔｈｕｍｂの部分である。
発明者らが変化させるべきであると教示する酵素の領域は、「ｔｈｕｍｂ」領域である。ｔｈｕｍｂ領域は、酵素の単一の三次元部分に相当する。しかしながら、この単一の三次元ｔｈｕｍｂ構造は、アミノ酸配列の、離れた直鎖状の部分に相当する。この直鎖状の部分内で、オルソゴナルポリメラーゼ機能を特定する２つのパッチが、同定される。これらの２つのパッチは、パッチ１０Ａ及びパッチ１２と呼ばれ、下記により詳細に説明される。
パッチ１０Ａ
パッチ１０Ａは、配列番号１のアミノ酸６５１〜６７９に相当する。このパッチにおける変異は、少なくともＲＮＡ、ＣｅＮＡ、又はＨＮＡに対するオルソゴナルポリメラーゼ活性を提供することができる。パッチ１０Ａは、本明細書において記載される最も重要なパッチと考えられる。
パッチ１０Ａ内には、特別に重要なモチーフがあり、これは、アミノ酸６６２〜６６６の小さなベータシート領域である。この領域は、核酸主鎖の近くの空間を占め、とりわけ、ポリメラーゼ（複数可）がＲＮＡを産生するように作用するように適切に変異している。特に、残基Ｅ６６４は変異させるのに適しており、例えばＥ６６４Ｑ又はＥ６６４Ｋが、とりわけＥ６６４Ｋが最も好ましい。この変異体は、ＲＮＡ産生にとりわけ適している。
６６２〜６６６領域（特にＥ６６４）は、ＲＮＡポリメラーゼにとってとりわけ重要であるが、効果は、ＲＮＡポリメラーゼに限られない。例えば、Ｅ６６４位は、Ｃ７（配列番号５；優れたＣｅＮＡ ｐｏｌ活性）及び６Ｇ１２（配列番号１２；優れたＨＮＡ ｐｏｌ活性）の両方において変異している。したがって、適切には、本発明のオルソゴナルポリメラーゼは、Ｅ６６４ＱなどのようなＥ６６４変異を含む。
ＲＮＡポリメラーゼについては、適切には、Ｙ４０９ＮなどのようなＹ４０９変異が含まれ、これは、パッチ１０Ａの外側に位置する。これは、ＲＮＡ ｐｏｌ活性を増加させるという長所を有する。
パッチ１２
パッチ１２は、配列番号１のアミノ酸７３４〜７６５を含む。パッチ１２の変異は、少なくともＨＮＡ又はＣｅＮＡに対するオルソゴナルポリメラーゼ活性を提供することができる。パッチ１２は、重要であるが、パッチ１０Ａほど重要でないと考えられてもよい。
適切には、変異は、パッチ１２及び１０Ａの一方又は他方又は両方になされてもよい。一方のパッチのみが変異させられる場合、適切には、それは、パッチ１０Ａである。
理論によって束縛されることを望むものではないが、これらのパッチにおける最良の変異は、それが、もはや、酵素からのヌクレオチドポリマーの出口でその門番の機能を実行しないように、この領域の「ｔｈｕｍｂ」構造を改変するものであると考えられる。これらのタイプの変異をなすことによって、酵素の天然の「フィルタリング」機能は、改変され又は不能になり、それによって、好都合に、酵素をより乱雑にし、オルソゴナル核酸ポリマーをより産生することができるようにすると考えられる。
さらなるポリメラーゼ変異は、提供される特異的で代表的な配列において見い出されるが、これは、重要なｔｈｕｍｂドメインパッチ１０Ａ及び１２の外部にある。これらは、配列表において示される本発明のポリメラーゼ（複数可）についての代表的な配列（複数可）を、配列番号２において示される好ましい主鎖ポリペプチドと比較し、パッチ１０Ａ（アミノ酸６５１〜６７９）及びパッチ１２（アミノ酸７３４〜７６５）において生じる変異を無視することによって定められてもよい。このプロセスによって同定される、結果として生じる変異は、それぞれ、本発明のポリメラーゼ（複数可）に含まれていてもよい、さらに最適化した変異である。
代表的なＰｏｌ６Ｇ１２によるＨＮＡ合成にとって重要なのは、典型的に、多くのＰｏｌＢ ａｐｏ構造（例えば２ＪＧＵ（非特許文献２７）、１Ｑ８Ｉ、１ＱＨＴ（非特許文献２８）、１ＷＮＳ（非特許文献２９））では明白でないが、大腸菌ｐｏｌ II三元複合体（３ＭＡＱ）（非特許文献３０）で決定される、ポリメラーゼｔｈｕｍｂサブドメインの可動性領域（Ｔｇｏ：Ｇ５８６〜Ｔ７７３）における変異である。構造的に、この領域は、エキソヌクレアーゼドメインに近位の表面に沿ってｔｈｕｍｂを横断し、＋３〜＋７の新生鎖と密接に接触する。発明者らは、この構造領域が伸長チェックポイントとして果たし、進化性のＨＮＡ合成を可能にするためにＰｏｌ ６Ｇ１２における変異によって再構築されたことを仮定する。実際、同じモチーフにおける他の変異は、他の非同起源の核酸ポリマーの進化性の合成を可能にし（ＣＣ、ＶＢＰ、ＰＨにより投稿準備中）、このポリメラーゼ領域についての一般的な特異性機能を示す。Ｐｏｌ６Ｇ１２の他の変異（Ｖ５８９Ａ、Ｉ６１０Ｍ、Ｅ６６４Ｑ、Ｑ６６５Ｐ、Ｒ６６８Ｋ、Ｔ６７６Ｒ、及びＡ６８１Ｓ）のうちのいくつかのものは、新生鎖の近くのポリメラーゼの内部表面のまわりに密集する。これらの変異は、非標準的なＨＮＡ・ＤＮＡハイブリッドの順応を可能にするためのポリメラーゼの二重鎖結合「ファンネル（funnel）」をさらに作り変えるであろう。
逆転写酵素変異体
本発明のポリメラーゼは、逆転写酵素活性をそれに与えるために変異させてもよい。言いかえれば、本発明のポリメラーゼは、オルソゴナル核酸鋳型からのＤＮＡポリマーの生産を可能にするように変異させてもよい。
適切には、オルソゴナル逆転写酵素活性をもたらすために、本発明のポリメラーゼは、Ｉ５２１及び／又はＹ３８８で変異している。
より短い適応性のある経路が、発明者らをＨＮＡ−ＲＴに導いた。関連するｐｏｌＢファミリーポリメラーゼＰｆｕにおけるＲＮＡ−ＲＴ活性と関連することが以前に同定された残基であるＬ４０８は、高度にスコア化されなかったが、ＳＣＡは、協調的変異（covariation）ネットワークへの明らかな関与を有する４つの近位の残基を同定し、これらのうちのたった１つの変異（Ｉ５２１Ｌ）が、有意なＨＮＡ逆転写酵素活性を有するポリメラーゼをもたらした。驚いたことに、Ｉ５２１は、ＨＮＡ鋳型鎖の近くに位置しておらず、むしろ、プライマー鎖３’末端の近位にあるポリメラーゼ活性部位において、保存Ｃ−モチーフにおける残基５４０〜５４２（ＤＴＤモチーフ）上に収まっている。したがって、Ｉ５２１Ｌ変異は、ＨＮＡ鋳型鎖とのポリメラーゼの相互作用を直接改変しないかもしれないが、むしろ、生産的な伸長を可能にするために新生鎖３’末端の位置を変えることによって、ＨＮＡ鋳型に対するＲＴ活性を促進する。
上記に記載される変異に特異的な長所は、それらが、維持されるポリメラーゼの校正機能により、ＲＮＡ鋳型からのＤＮＡ核酸の産生において変異ポリメラーゼを使用するのを可能にすることである。言いかえれば、本発明の逆転写酵素変異体は、鋳型としてＲＮＡを用いて使用されてもよいが、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼは、損なわれていない（例えば、野生型残基などのような機能的な残基として少なくともＤ１４１及びＥ１４３を残す）。これは、優れた結果、例えば、従来のトランスクリプターゼ酵素よりも１又はさらに２桁大きな正確性をもたらす。
ＨＮＡ又はＣｅＮＡなどのような他のオルソゴナル核酸鋳型に対する最適な活性は、ポリメラーゼの校正／エキソヌクレアーゼ機能が、例えばさらなる変異によって阻害される又は除去されることを必要としてもよいことに注意されたい。特に、鋳型がＨＮＡである場合、ポリメラーゼの校正／エキソヌクレアーゼ機能は、不活性化されているべきである。
酵素の逆転写酵素活性は、さらに最適化されてもよい。例えば、ＲＮＡが鋳型である場合に、活性を増強するために本発明の変異と組み合わせてなされてもよい、多くの知られている変異がある。例えば、好ましいＤ４Ｎ３ポリメラーゼのアスパラギン変異は、鋳型としてＲＮＡを使用する場合、活性を増強するためになされてもよい。
主鎖変異
本発明の酵素が非ＤＮＡポリメラーゼであるか又は逆転写酵素であるかに関わらず、主鎖ポリペプチドに好都合になされてもよい多くの変異がある。
あるそのような変異は、配列番号１のＡ４８５位の「therminator」変異体（New England Bio Labs社）である。適切には、主鎖は、Ａ４８５ＬなどのようなＡ４８５変異を有する。これは、非天然基質の組み込みを増強するという長所を有する。
他のそのような変異は、配列番号１のＶ９３位である。適切には、主鎖は、Ｖ９３ＱなどのようなＶ９３変異を有する。これは、例えば鋳型がウラシルを含む場合に生じ得る先読み停止を不能にするという長所を有する。
他のそのような変異は、配列番号１のＤ１４１位及びＥ１４３位である。適切には、主鎖は、Ｄ１４１ＡなどのようなＤ１４１変異を有し、適切には、主鎖は、Ｅ１４３ＡなどのようなＥ１４３変異を有し、最も適切には、主鎖は、Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３ＡなどのようなＤ１４１及びＥ１４３の変異の両方を有する。これは、酵素のエキソヌクレアーゼ機能を無効にするという長所を有する。これは、さらに、非天然基質の組み込みを増強する。
言及される変異は、相互に適合性である、言いかえれば、本発明のポリペプチドは、同じポリペプチドにおいてそれぞれの主鎖変異を有していてもよい。この例は、配列番号２にある。これは、時に、「野生型」配列と呼ばれ、本発明の変異が導入されてもよい出発ポリメラーゼ主鎖の優れた例と見なされてもよい。したがって、適切には、好ましい主鎖変異Ｖ９３Ｑ、Ａ４８５Ｌ、Ｄ１４１Ａ、及びＥ１４３Ａの４つすべてが、本発明のポリペプチド中に存在する。
厳密な意味では、もちろん、それが主鎖においてこれらの４つの変異を既に有するので、配列番号２の配列が真の「野生型」でないことに注意されたい。参照の容易さのために、真の野生型配列は、配列番号１として示し、この配列は、明確にするために本明細書において「真の野生型」と呼ぶ。
他の従来の変異は、ポリメラーゼ／逆転写酵素に適用されてもよい。さらに、他の最適化する変異は、必要に応じてなされてもよい。
切断
本発明の全体的に完全長のポリメラーゼ酵素の切断は、所望される場合、なされてもよい。適切には、完全長ポリメラーゼポリペプチドは、添付の配列表において示されるように、完全長ＴｇｏＴポリメラーゼ１〜７７３などのように、主鎖ポリペプチドとして使用される。使用されるいかなる切断も、活性について注意深くチェックされるべきである。これは、本明細書において記載されるように、酵素（複数可）をアッセイすることによって容易に行われてもよい。
精製
本発明のポリメラーゼは、好都合に、熱安定性である。従来の（非熱安定性の）宿主株においてこれらのポリメラーゼを発現させることによって、精製は、好都合に、単純化される。例えば、本発明のポリメラーゼが従来の非熱安定性宿主細胞において発現される場合、単純に、宿主細胞を９９℃まで加熱し、その後に細胞破片の遠心性の除去を行うことによって、およそ９０％の純度が得られ得る。高純度レベルは、例えば、宿主細胞の熱処理可溶性分画をイオン交換及び／又はヘパリンカラム精製にかけることによって容易に得られ得る。
適切には、本発明のポリメラーゼは、いかなる他のポリペプチドにも融合されない。
適切には、本発明のポリメラーゼは、いかなるさらなるポリペプチド又は融合物によってもタグ付けされない。
説明される特定のパッチに向けられる変異は、ポリメラーゼの機能の損失を伴わない、広範囲のアミノ酸のいずれかへの置換であってもよいことは、本発明の長所である。定められるパッチは、アミノ酸変化に非常に耐性がある。
正確性
十分な正確性がオルソゴナル核酸ポリマーの正確な産生（又は複製）のために維持されることは、明らかに重要である。適切には、本発明のポリメラーゼは、少なくとも９５％の正確性を保持する。正確性（エラー閾値）は、重合されたヌクレオチドの数で割った、導入されたエラーの数として得られてもよい。言いかえれば、１％のエラー率は、重合される１００のヌクレオチドごとの１つのエラーの導入に等しい。実際、本発明のポリメラーゼは、これよりも非常によい正確性に達する。５％以下のエラー率は、本発明のポリメラーゼについての最小の有用な正確性レベルと見なされ、適切には、本発明のポリメラーゼは、４％以下、適切には３％以下、適切には２％以下、適切には１％以下のエラー率を有する。
特に指定のない限り、正確性は、正確性の総計（例えばＤＮＡ−３ＮＡ−ＤＮＡ）として評価されてもよく、これは、したがって、２つの変換事象（ＤＮＡ−３ＮＡ及び３ＮＡ−ＤＮＡ）を包含し、数値は、適宜、調整される又は解釈されるべきである。
区画化自己複製技術（Compartmentalised self-replication technology）
定向進化及び区画化自己複製の技術は、英国特許出願第９７１４３００２号及び第９８０６３９３６号及び第０１２７５６４３号において詳述されている。これらの文書は、参照によって本明細書において組み込まれる。
発明者らは、区画化自己タギング（compartmentalised self tagging）の方法を修飾し、驚いたことに、本明細書において定義されるように、基質範囲の拡張を示したＤＮＡポリメラーゼを作製した。
区画化自己タギングの方法のさらなる詳細は、全般に、下記に示される。本明細書においてＨＮＡ又はＣｅＮＡについて例示されるものなどのようなオルソゴナル核酸ポリマーを合成するための能力の増強を示す（それらが由来するポリメラーゼと比較して）ポリメラーゼの選択において特に重要であるのは、区画化自己タギング法が修飾されたということである。これらの修飾は、下記に詳述される。
（ｉ）マイクロカプセル
本発明のいくつかの適用において使用されるマイクロカプセルは、本発明の作業を可能にする適切な物理的特性を必要とする。
第１に、核酸及び遺伝子産物がマイクロカプセルの間で拡散し得ないことを保証するために、それぞれのマイクロカプセルの内容物は、周囲のマイクロカプセルの内容物から分離されていなければならず、実験のタイムスケールにわたりマイクロカプセルの間で核酸及び遺伝子産物の交換は全く又はほとんどない。
第２に、本発明のマイクロカプセル法は、マイクロカプセル当たり限られた数の核酸のみがあることを必要とする。これは、個々の核酸の遺伝子産物が他の核酸から分離されるであろうということを保証する。したがって、核酸及び遺伝子産物の間の共役は、高度に特異的であろう。濃縮係数は、マイクロカプセル当たり平均して１以下の核酸が最も優れており、個々の核酸の遺伝子産物が他のすべての核酸の産物から分離されるので、核酸及びコード遺伝子産物の活性の間の連結は可能な限り密接である。しかしながら、たとえ、マイクロカプセル当たり平均して１以下の核酸という理論上最適な状況が使用されなくても、マイクロカプセル当たり５、１０、５０、１００、又は１０００以上の核酸の比は、大きなライブラリーを選別するのに有益であることが証明されるだろう。異なる核酸分布を有する新たなカプセル化を含む選別の続くラウンドは、核酸のよりストリンジェントな選別を可能にするであろう。好ましくは、マイクロカプセル当たり１以下の核酸がある。
第３に、マイクロカプセルの形成及び組成は、機構の機能、核酸の発現、及び遺伝子産物の活性を消滅させてはならない。
したがって、使用されるいかなるマイクロカプセル化系も、これらの３つの必要条件を満たさなければならない。適切な系（複数可）は、当業者に明らかであるように、本発明のそれぞれの適用における必要条件の正確な性質に依存して変化してもよい。
種々様々のマイクロカプセル化手順が、利用可能であり（Benita, 1996を参照されたい）、本発明に従って使用されるマイクロカプセルを生成するために使用されてもよい。実際、２００を超えるマイクロカプセル化法が、文献（Finch, 1993）において同定されている。
これらは、脂質小胞（リポソーム）などのような膜に包まれた水性小胞（New, 1990）及び非イオン性界面活性剤小胞（van Hot et al., 1996）を含む。これらは、非共有結合で構築された分子の単一の又は複数の二重層の閉じた膜状のカプセルであり、それぞれの二重層は、水性のコンパートメントによってその隣のものから分離されている。リポソームの場合には、膜は、脂質分子から構成され、これらは、通常リン脂質であるが、コレステロールなどのようなステロールもまた、膜の中に組み込まれてもよい（New, 1990）。ＲＮＡ及びＤＮＡポリメリゼーションを含む様々な酵素触媒生化学反応は、リポソーム内で実行することができる（Chakrabarti et al., 1994; Oberholzer et al., 1995a; Oberholzer et al., 1995b; Walde et al., 1994; Wick & Luisi, 1996）。
膜に包まれた小胞系により、水相の多くは小胞の外側にあり、そのため、区画化されていない。反応がマイクロカプセルに制限されるように、この連続的な水相は、除去されるべきである又は生命システムは、阻害される若しくは破壊されるべきである（例えばＤＮアーゼ又はＲＮアーゼを用いる核酸の消化によって）（Luisi et al., 1987）。
酵素触媒生化学反応もまた、様々な他の方法によって生成されたマイクロカプセルにおいて実証されている。ＡＯＴ−イソオクタン水系（Menger & Yamada, 1979）などのような多くの酵素が、逆ミセル溶液において活性である（Bru & Walde, 1991; Bru & Walde, 1993; Creagh et al., 1993; Haber et al., 1993; Kumar et al., 1989; Luisi & B., 1987; Mao & Walde, 1991; Mao et al., 1992; Perez et al., 1992; Walde et al., 1994; Walde et al., 1993; Walde et al., 1988）。
マイクロカプセルはまた、界面ポリメリゼーション及び界面複合体形成によって生成することができる（Whateley, 1996）。この種のマイクロカプセルは、強固な非透過性の膜又は半透過性の膜を有することができる。硝酸セルロース膜、ポリアミド膜、及び脂質ポリアミド膜が境界をつける半透過性のマイクロカプセルはすべて、多酵素系を含む生化学反応を支援することができる（Chang, 1987; Chang, 1992; Lim, 1984）。非常に穏やかな条件下で形成することができるアルギン酸／ポリリシンマイクロカプセル（Lim & Sun, 1980）はまた、非常に生体適合性であることも証明されており、例えば、生きている細胞及び組織をカプセル化する有効な方法を提供する（Chang, 1992; Sun et al., 1992）。
エマルションなどのようなコロイド系における水性環境の相分割に基づく非膜状マイクロカプセル化系もまた、使用されてもよい。
好ましくは、本発明のマイクロカプセルは、エマルション；微視的又はコロイド状のサイズの液滴として他方において分散した相のうちの１つとの、２つの不混和性の液相の不均一系から形成される（Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984）。
（ii）エマルション
エマルションは、不混和性の液体の任意の適した組み合わせから産生されてもよい。好ましくは、本発明のエマルションは、細かく分けられた液滴の形態で存在する相（分散相、内相、又は不連続相）としての水（生化学的構成成分を含有）及びこれらの液滴が浮遊するマトリックス（非分散相、連続相、又は外相）としての疎水性で不混和性の液体（「油」）を有する。そのようなエマルションは、「油中水型」（Ｗ／Ｏ）と呼ばれる。これは、生化学的構成成分を含有する水相全体が離散性の液滴（内相）において区画化されるという長所を有する。疎水性油である外相は、一般に、生化学的構成成分のどれも含有しておらず、よって不活性である。
エマルションは、１又は２以上の表面活性剤（界面活性剤）の追加によって安定させてもよい。これらの界面活性剤は、乳化剤と呼ばれ、相の分離を防ぐために（又は少なくとも遅延させるために）水／油界面で作用する。多くの油及び多くの乳化剤は、油中水型エマルションの生成のための使用することができ、最近の編集物は、１６，０００を超える界面活性剤を列挙し、これらの多くが乳化剤として使用されている（Ash and Ash, 1993）。適した油は、軽白色鉱油（light white mineral oil）並びにソルビタンモノオレエート（Span（商標）80；ICI社）及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Tween（商標）80；ICI社）及びTriton-X-100などのような非イオン性界面活性剤を含む（Schick, 1966）。
陰イオン界面活性剤の使用もまた、有益であろう。適した界面活性剤は、コール酸ナトリウム及びタウロコール酸ナトリウムを含む。好ましくは０．５％ｗ／ｖ以下の濃度のデオキシコール酸ナトリウムが、特に好ましい。そのような界面活性剤の混入は、いくつかの場合には、核酸の発現及び／又は遺伝子産物の活性を増加させることができる。非乳化反応混合物に対するいくつかの陰イオン界面活性剤の追加は、翻訳を完全に停止する。しかしながら、乳化の間に、界面活性剤は、水相から界面に移動し、活性は修復される。乳化されることとなる混合物に対する陰イオン界面活性剤の追加は、反応が区画化の後にのみ進行することを保証する。
エマルションの生成は、一般に、複数の相を強制的に一緒にするために力学的エネルギーの適用を必要とする。撹拌機（磁気撹拌棒、プロペラ、及びタービン撹拌機、パドルデバイス、並びに泡立て器など）、ホモジナイザー（ローター固定子ホモジナイザー、高圧バルブホモジナイザー、及びジェットホモジナイザーを含む）、コロイドミル、超音波、並びに「膜乳化」デバイス（Becher, 1957; Dickinson, 1994）を含む、様々な機械的なデバイスを利用する、これを行うための様々な方法がある。
油中水型エマルション中で形成される水性マイクロカプセルは、一般に、安定しており、マイクロカプセルの間の核酸又は遺伝子産物の交換は、たとえあったとしても、わずかである。さらに、発明者らは、いくつかの生化学反応が、エマルションマイクロカプセル中で進行することを実証した。さらに、複雑な生化学的プロセス、特に遺伝子転写及び翻訳もまた、エマルションマイクロカプセル中で活性である。何千リットルの工業規模まで大量のエマルションを生成するための技術が存在する（Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984）。
好ましいマイクロカプセルサイズは、本発明に従って実行されることとなる任意の個々の選択プロセスの正確な必要条件に依存して変化するであろう。すべての場合において、遺伝子産物の効率的な発現及び反応性を達成するのに、個々のマイクロカプセルにおける、遺伝子ライブラリーサイズ、必要とされる濃縮、及び構成成分の必要とされる濃度の間に最適なバランスがあるであろう。
本発明の方法を実行する場合に使用されるエマルション（複数可）の詳細は、実施例において提供される。
（iii）マイクロカプセル内の発現
発現のプロセスは、本発明によって提供される、それぞれの個々のマイクロカプセル内で通常、生じる。インビトロの転写及び共役転写−翻訳の両方は、ナノモル以下のＤＮＡ濃度でそれほど効率的でなくなる。限られた数のＤＮＡ分子のみがそれぞれのマイクロカプセル中に存在するという必要条件のために、そのため、これは、可能なマイクロカプセルサイズに基づいて実践的な上限を設定する。好ましくは、マイクロカプセルの平均体積は、５．２×１０−１６ｍ３未満（１０μｍ未満の直径の球状マイクロカプセルに相当する）、より好ましくは６．５×１０−１７ｍ３未満（５μｍ）、より好ましくは約４．２×１０−１８ｍ３（２μｍ）、理想的には約９×１０−１８ｍ３（２．６μｍ）である。
マイクロカプセルにおいて有効なＤＮＡ又はＲＮＡ濃度は、当業者らによく知られているであろう様々な方法によって人工的に増加させてもよい。これらは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのような体積排除化学物質の追加並びに大腸菌などのような細菌（Roberts, 1969; Blattner and Dahlberg, 1972; Roberts et al., 1975; Rosenberg et al., 1975）、真核生物、例えば（Weil et al., 1979; Manley et al., 1983）、並びにＴ７、Ｔ３、及びＳＰ６などのようなバクテリオファージ（Melton et al., 1984）由来のものを含むＲＮＡポリメラーゼを使用する転写；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Saiki et al., 1988）；Ｑβレプリカーゼ増幅（Miele et al., 1983; Cahill et al., 1991; Chetverin and Spirin, 1995; Katanaev et al., 1995）；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Landegren et al., 1988; Barany, 1991）；並びに自家持続配列複製系（Fahy et al., 1991）及び鎖置換増幅（Walker et al., 1992）を含む様々な遺伝子増幅技術を含む。エマルション及びインビトロの転写又は共役転写−翻訳系が熱安定性である場合、ＰＣＲ及びＬＣＲなどのような熱サイクルを必要とする遺伝子増幅技術でさえ使用することができる（例えば、共役転写−翻訳系は、サームス・アクアティクス（Thermus aquaticus）などのような熱安定性生物から生成することができる）。
有効な局所的核酸濃度を増加させることによって、より大きなマイクロカプセルを有効に使用することができる。これは、約５．２×１０−１６ｍ３（直径１０ｕｍの球体に相当する）のマイクロカプセル体積に対する好ましい実践的な上限を可能にする。
マイクロカプセルサイズは、起こる必要のある生化学反応の必要とされる構成成分をすべてマイクロカプセル内に収容するのに十分に大きくなければならない。例えば、インビトロで、転写反応及び共役転写−翻訳反応の両方は、合計約２ｍＭのヌクレオシド三リン酸濃度を必要とする。
例えば、長さが５００塩基の単一の短いＲＮＡ分子に遺伝子を転写するために、これは、マイクロカプセル当たり最低５００分子のヌクレオシド三リン酸（８．３３×１０−２２モル）を必要とするだろう。２ｍＭ溶液を構成するためには、この分子数が、体積４．１７×１０−１９リットル（４．１７×１０−２２ｍ３、球状である場合、９３ｎｍの直径を有するであろう）のマイクロカプセル内に含有されなければならない。
さらに、特に翻訳を伴う反応の場合には、翻訳が生じるのに必要なリボソームは、それ自体、直径がおよそ２０ｎｍであることに注意されたい。よって、マイクロカプセルについての好ましい下限は、およそ１００ｎｍの直径である。
そのため、マイクロカプセルの体積は、好ましくは、０．１〜１０ｕｍの直径の球体に相当する約５．２×１０−２２ｍ３〜５．２×１０−１６ｍ３、より好ましくは、約５．２×１０−１９ｍ３〜６．５×１０−１７ｍ３（１ｕｍ〜５ｕｍ）である。約２．６ｕｍの球体の直径が、最も好都合である。
区画（２．６ｕｍの平均径の液滴）の好ましい寸法が、細菌に密接に似ていることは、偶然ではなく、例えば、大腸菌属は、１．１〜１．５×２．０〜６．０ｕｍの桿菌であり、アゾトバクター属は、１．５〜２．０ｕｍの直径の卵形の細胞である。ダーウィン的進化は、その最も単純な形態では、「一遺伝子型一表現型」のメカニズムに基づく。単一の区画化された遺伝子又はゲノムの濃度は、２ｕｍの直径の区画における０．４ｎＭから、５ｕｍの直径の区画における２５ｐＭに低下する。原核生物の転写／翻訳機構は、約１〜２ｕｍの直径の区画において作動するように進化してきており、単一の遺伝子は、およそナノモルの濃度である。２．６ｕｍの直径の区画における単一の遺伝子は、０．２ｎＭの濃度である。この遺伝子濃度は、効率的な翻訳に十分に高い。そのような体積における区画化はまた、たとえ遺伝子産物の単一の分子のみが形成されても、それが約０．２ｎＭ存在することをも確実にし、これは、遺伝子産物が核酸自体の修飾活性を有することになっている場合、重要である。マイクロカプセルの体積は、したがって、本発明の方法において、核酸／核酸の転写及び翻訳のための必要条件だけではなく、遺伝子産物に必要とされる修飾活性もまた忘れないで選択されるべきである。
エマルションマイクロカプセルのサイズは、選択系の必要条件に従ってエマルションを形成するために使用されるエマルション条件を調整することによって単純に変化させてもよい。最終的に、制限因子はマイクロカプセルのサイズ、したがって、単位体積当たり可能なマイクロカプセルの数となるので、マイクロカプセルサイズが大きいほど、所与の核酸／核酸ライブラリーをカプセル化するのに必要とされるであろう体積は大きい。
マイクロカプセルのサイズは、転写／翻訳系の必要条件だけではなく、核酸／核酸構築物のために用いられる選択系の必要条件を考慮して選択される。したがって、化学的修飾系などのような選択系の構成成分は、転写／翻訳に最適でない反応体積及び／又は試薬濃度を必要としてもよい。本明細書において記載されるように、そのような必要条件は、二次再カプセル化ステップによって提供されてもよく、さらに、それらは、全体として、転写／翻訳及び選択を最大限にするようにマイクロカプセルサイズを選択することによって提供されてもよい。例えば本明細書において記載される最適なマイクロカプセル体積及び試薬濃度の経験的な決定が、好ましい。
本発明に従う「核酸」は、好ましくは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、合成の塩基のみ若しくは天然に存在する塩基と合成の塩基の混合物からなる、部分的に若しくは全体的に人工的な核酸分子からなる群から選択される分子又は構築物である。前述のもののいずれか１つは、ポリペプチドに連結されてもよい。
核酸の核酸部分は、遺伝子産物の効率的な発現に必要とされるもの、例えばプロモーター、エンハンサー、翻訳開始配列、ポリアデニル化配列、スプライス部位、及びその他同種のものなどのような適した調節性配列を含んでいてもよい。
（iv）産物選択
本発明の方法を実行するための好ましい方法の詳細は、実施例において提供される。しかしながら、当業者らは、示される実施例が非限定的であり、産物選択のための方法は、より一般的な用語で下記に説明されることを十分に理解するであろう。
リガンド又は基質は、当業者らに明らかであろう様々な手段によって核酸につなぐことができる（例えばHermanson, 1996を参照されたい）。本発明の方法によれば、リガンド又は基質は、「検出作用物質標識」、好ましくは、色素標識ヌクレオチド類似体、特に、Ｃｙ３ＣＴＰ及び／又はＣｙ５ＣＴＰである。
選別は、優先的な分離、増幅、又は検出作用物質標識核酸の存続を可能にする任意の方法によるものとすることができる。例として、結合（例えばDynabeads（商標）を使用する磁気分離に基づく技術を含む）による及び分解に対する抵抗による（例えば制限エンドヌクレアーゼを含むヌクレアーゼによる）選択を含む。
反応がすべて停止され、マイクロカプセルが組み合わせられる場合、選択される、活性な作られたポリメラーゼをコードする核酸は、「検出作用物質標識」と結合する又は特異的に反応する抗体又は他の分子を使用して濃縮することができる。基質及び産物の両方が、検出作用物質標識を有するが、活性遺伝子産物をコードする核酸のみが同時精製されるであろう。
用語「単離する」、「選別する」、及び「選択する」並びにその変形は、本明細書において使用される。本発明による単離は、不均一な集団、例えば混合物からある要素を分離するためのプロセスを指し、その結果、それは、それが単離プロセスの前に関連した、少なくとも１つの物質が実質的に、好ましくは完全にない。好ましい実施形態では、単離は、要素の精製、本質的には、均一性を指す。要素の選別は、望ましくない要素に対して、所望の要素を優先的に単離するプロセスを指す。これが所望の要素の単離に関する限り、用語「単離する」及び「選別する」は、等しい。本発明の方法は、所望の核酸を含有する核酸のプール（ライブラリー又はレパートリー）からの所望の核酸の選別を可能にする。選択は、その特定の特性に従って要素を単離するプロセス（選別プロセスを含む）を指すために使用される。
本発明を使用する核酸ライブラリー（例えば変異体Ｐｆｕライブラリー）からの核酸の最初の選択は、ほとんどの場合、多くのバリアント核酸のスクリーニングを必要とするであろう。核酸のライブラリーは、以下を含む様々な異なる方法において作製することができる。
天然に存在する核酸のプールは、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡからクローニングすることができ（Sambrook et al., 1989）、例えば、Ｔｇｏ又は他のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅レパートリーによって作製される変異体Ｔｇｏライブラリー又は他のＤＮＡポリメラーゼライブラリーは、ＤＮＡポリメラーゼ断片の非常に有効な供給源であることが証明されている。さらなる詳細は、実施例において示される。
遺伝子のライブラリーはまた、ランダム化又はドープ合成オリゴヌクレオチドによって、遺伝子のすべて（例えばSmith, 1985; Parmley and Smith, 1988を参照されたい）若しくは一部（例えばLowman et al., 1991を参照されたい）又は遺伝子のプール（例えばNissim et al., 1994を参照されたい）をコードすることによって作製することができる。ライブラリーはまた、大腸菌ｍｕｔＤ５などのような細菌の「ミューテーター株」を使用することを含む、インビボの様々な技術によって「ランダムに」核酸又は核酸のプールの中に変異を導入することによって作製することができる（Liao et al., 1986; Yomagishi et al., 1990; Low et al., 1996）。ランダム変異はまた、化学的変異誘発物質及びイオン化若しくはＵＶ照射（Friedberg et al., 1995を参照されたい）又は変異誘発塩基アナログの組み込み（Freese, 1959; Zaccolo et al., 1996）によってインビボ及びインビトロの両方で導入することもできる。「ランダム」変異はまた、例えば誤りがちなポリメラーゼを使用することによってポリメリゼーションの間にインビトロで遺伝子の中に導入することができる（Leung et al., 1989）。さらなる多様化は、インビボで（Kowalczykowski et al., 1994を参照されたい）又はインビトロで（Stemmer, 1994a; Stemmer, 1994b））相同組換えを使用することによって導入することができる。
（Ｖ）マイクロカプセル／選別
上記に記載される核酸に加えて、本発明によるマイクロカプセルは、選別プロセスが起こるのに必要とされるさらなる構成成分を含むであろう。系の他の構成成分は、例えば、核酸の転写及び／又は翻訳のために必要なものを含むであろう。これらは、以下から特定の系の必要条件に対して選択される；適した緩衝剤、必要な成分、酵素、及び補助因子をすべて含有するインビトロ転写／複製系及び／又はインビトロ翻訳系、ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、核酸（天然又は合成）、転移ＲＮＡ、リボソーム及びアミノ酸、並びに修飾遺伝子産物の選択を可能にするための所望の反応の基質。
適した緩衝剤は、その中で生物系の所望の構成成分がすべて活性であるものであり、そのため、それぞれの特定の反応系の必要条件に依存するであろう。生物学的及び／又は化学的反応に適した緩衝剤は、当技術分野において知られており、作り方は、Sambrook et al., 1989などのような様々な実験用のテキストにおいて提供されている。
インビトロ翻訳系は、通常、典型的に細菌（Zubay, 1973; Zubay, 1980; Lesley et al., 1991; Lesley, 1995）、ウサギ網状赤血球（Pelham and Jackson, 1976）、又はコムギ胚芽（Anderson et al., 1983）由来の細胞抽出物を含むであろう。共役転写／翻訳を可能にするいくつかを含む、多くの適した系が、市販で入手可能である（例えばPromega社から）（Promega社からの細菌系及び網状赤血球及びコムギ胚芽ＴＮＴ（商標）抽出物系すべて）。使用されるアミノ酸の混合物は、ライブラリーにおいて産生されるタンパク質の可能な数又は種類を増加させるために、所望の場合、合成アミノ酸を含んでいてもよい。これは、人工的なアミノ酸をｔＲＮＡに負荷させ、選択されることとなるタンパク質のインビトロの翻訳のためにこれらのｔＲＮＡを使用することによって達成することができる（Ellman et al., 1991; Benner, 1994; Mendel et al., 1995）。
選択のそれぞれのラウンドの後に、興味のある分子をコードするものについての核酸のプールの濃縮は、非区画化インビトロ転写／複製又は共役転写−翻訳反応によってアッセイすることができる。選択されたプールは、適したプラスミドベクターの中にクローニングされ、ＲＮＡ又は組換えタンパク質は、さらなる精製及びアッセイのために個々のクローンから産生される。
（Vi）マイクロカプセル同定
マイクロカプセルは、iii部（マイクロカプセル選別）において記載されるように、マイクロカプセルの表面自体に生じる若しくは現れる、又は外側から検出可能である、所望の遺伝子産物によって誘発される変化によって同定されてもよい。この変化は、同定された場合、区画内の遺伝子の修飾を引き起こすために使用される。本発明の好ましい態様では、マイクロカプセル同定は、マイクロカプセル内のルミネセンス、リン光、又は蛍光に至る反応から結果として生じる、マイクロカプセルの光学的特性における変化に依存する。マイクロカプセル内の遺伝子の修飾は、ルミネセンス、リン光、又は蛍光の同定によって引き起こされるであろう。例えば、ルミネセンス、リン光、又は蛍光の同定は、核酸の修飾に至る、光子（又は他の粒子若しくは波）による区画の照射を引き起こすことができる。類似する手順は、細胞の急速な選別について以前に記載されている（Keij et al., 1994）。核酸の修飾は、例えば、感光性保護基によってケージ化された分子「蛍光検出作用物質標識」を核酸につなぐことから、結果として生じてもよく、適切な波長の光子による照射は、ケージの除去に至る。後に、マイクロカプセルはすべて組み合わせられ、核酸は、ある環境にともにプールされる。所望の活性を示す遺伝子産物をコードする核酸は、「蛍光標識」と特異的に結合する又は特異的に反応する分子を使用して、アフィニティー精製によって選択することができる。
（Vi）多重ステップ手順
転写／複製及び／又は翻訳並びに選択のすべてのプロセスがある単一のステップで進行し、すべての反応が１つのマイクロカプセルにおいて起こる必要がないことも、本発明に従って十分に理解されるであろう。選択手順は、２以上のステップを含んでいてもよい。第１に、核酸ライブラリーのそれぞれの核酸の転写／複製及び／又は翻訳は、第１のマイクロカプセルにおいて起こってもよい。次いで、遺伝子産物はそれぞれ、それをコードした核酸（同じマイクロカプセル中に存在する）に連結される。次いで、マイクロカプセルは、壊され、それらのそれぞれの遺伝子産物に付加された核酸は、精製されてもよい。その代わりに、核酸は、カプセル化に依存しない方法を使用して、それらのそれぞれの遺伝子産物に付加することができる。例えばファージディスプレイ（Smith, G.P., 1985）、ポリソームディスプレイ（Mattheakkis et al., 1994）、ＲＮＡ−ペプチド融合物（Roberts and Szostak, 1997）、又はｌａｃリプレッサーペプチド融合物（Cull, et al., 1992）。
手順の第２のステップにおいて、その遺伝子産物に付加された精製核酸はそれぞれ、選択されることとなる、反応の構成成分を含有する第２のマイクロカプセルの中に入れられる。次いで、この反応は開始される。反応の終了後に、マイクロカプセルはまた、壊され、修飾核酸が選択される。多くの個々の構成成分及び反応ステップが含まれる複雑な多段階反応の場合には、１又は２以上の介在ステップは、遺伝子産物の生成及び核酸へのそれの連結の最初のステップ並びに核酸における選択可能な変化を生成する最終的なステップの間に実行されてもよい。
（Vii）増幅
上記の構成すべてにおいて、核酸中に含まれる遺伝物質は、増幅されてもよく、プロセスは、反復性のステップにおいて繰り返されてもよい。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（Saiki et al., 1988）によるもの又はＱβレプリカーゼ増幅（Cahill, Foster and Mahan, 1991; Chetverin and Spirin, 1995; Katanaev, Kurnasov and Spirin, 1995）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Landegren et al., 1988; Barany, 1991）、自家持続配列複製系（Fahy, Kwoh and Gingeras, 1991）、及び鎖置換増幅（Walker et al., 1992）を含む様々な遺伝子増幅技術を含む様々な他の遺伝子増幅技術のうちの１つを使用することによるものであってもよい。
図は、以下の実施例の部において個々に記載される。
本発明は、ここでは、例として記載される。これらの例は、例証であるように意図され、添付の請求項を限定するようには意図されない。
［実施例１］
ＸＮＡ合成のための新しいハイスループットスクリーニング系の開発
有効な計量可能なスクリーニングは、個々のクローンを試験し、かつ集団から活性が改善されたクローンを選択するための本質的なステップである。Ong and colleagues（J. L. Ong, D. Loakes, S. Jaroslawski, K. Too, P. Holliger, Journal of Molecular Biology 361, 537 (Aug, 2006)）によって開発されたポリメラーゼＥＬＩＳＡエンドポイントアッセイを、図１Ａに要約する。基本的に、ビオチン化プライマー−鋳型ヘアピンの伸長は、ＥＬＩＳＡを通して検出することができる標識ヌクレオチド（例えばジゴキシゲニン標識ＵＴＰ）の組み込みに至る。ヘアピン配列は、検出可能なシグナルに必要とされる最小のポリメラーゼ活性を調整するために改変することができ（標識ヌクレオチドの前に組み込み）、標識ヌクレオチドの組み込みは、ポリメラーゼ活性に関連づけられる。アッセイの重要な限界は、活性が、標識ヌクレオチドの組み込みに相関するということであり、これは、例えば、正確性が低いポリメラーゼ又は鋳型非依存性の伸長の場合には、ポリメラーゼ活性に相関していないかもしれない。
図１は、非天然核酸の組み込みをモニターするために開発されたポリメラーゼＥＬＩＳＡエンドポイントアッセイ（Ａ）及び２ステップポリメラーゼ活性ＥＬＩＳＡ（Ｂ）の略図を示す。
ポリメラーゼＥＬＩＳＡエンドポイントアッセイは、様々な結果の、ＣＳＲの第２ラウンドにおいて選択したＡモチーフＴｇｏＴ変異体をスクリーニングするために使用した（単一ヌクレオチド及びジヌクレオチド置換の選択の両方）。多くの変異体は、第１のｄＵＴＰ−ＤＩＧの前に１０のＣｅＲＴＰの組み込みを必要としたヘアピンを使用するアッセイによって同定した。しかしながら、プライマー伸長反応を用いるさらなるスクリーニングは、単離変異体のほとんどが、野生型ＴｇｏＴと同等の活性を有さず、４０の単離変異体のうち、３つだけが、活性の改善を示したことを示した。
可能な説明は、標識ヌクレオチドの組み込みが、それがＰｏｌＡタイプ（例えばＴａｑ）における活性に相関するように、ＰｏｌＢタイプポリメラーゼ（例えばＴｇｏＴ）において同様に活性に相関しないということである。ＰｏｌＢ酵素のより協調的な触媒部位又は使用されている非天然ヌクレオチドは、標識ヌクレオチドの組み込みを促進し、所望のポリメラーゼ活性に相当しないＥＬＩＳＡにおけるより高度なシグナルに至るかもしれない。
さらに調査した、ある選択肢は、検出ステップから伸長ステップを分離することであった。図１Ｂにおいて記載されるように、既知の鋳型に対するポリメラーゼ伸長は、検出することができる配列特異的なプローブの結合を通して伸長産物を評価することを可能にする。２ステップアッセイは、エンドポイントアッセイに対して多くの長所を有し、第１に、正確性が低い酵素は、配列ミスマッチがプローブ結合親和性、すなわちシグナルを低下させるので、ペナルティーを科される。第２に、選択圧は、単一の鋳型におけるプローブの選択によって調整し（例えば、図１Ｂにおいて示される青色のプローブは、赤色のものよりも結合のためにより長い伸長を必要とする）、したがって、単一のプライマー−鋳型組み合わせの有用性の範囲を増加させることができる。第３に、２ステップアッセイは、ＥＬＩＳＡによって同定された候補をさらに検証するために一緒に実行することができるプライマー伸長アッセイと適合性がある。
ステップの数（１〜８として図１Ｂにおいて示される）は、安定しており、確実に再現することができるアッセイを得るために標準化した又は最適化した。ヌクレオチド濃度（特に非天然ヌクレオチドについての）、プライマー／鋳型比、ポリメラーゼ濃度、及び伸長条件はすべて、アッセイに最適な範囲を決定するために調査した（ステップ１及び２）。鋳型変性（ステップ４）は、ストレプトアビジンをコーティングしたマトリックスへの伸長分子の結合（ステップ３）の後に、希釈水酸化ナトリウム及び尿素溶液の両方を用いて化学的に得ることに成功した。水酸化ナトリウムを用いる変性は、試みた他の方法よりも実質的に効率的であり、バックグラウンドの増加に至らなかった。プローブ結合及び続くＥＬＩＳＡステップは、標準化した。アッセイの感度は、評価し、図２に示す；０．１％ほどの伸長産物を検出することができた。
図２は、２ステップのポリメラーゼ活性ＥＬＩＳＡの感度の図を示す。完全に伸長した鋳型は、ＥＬＩＳＡシグナルを得るために必要とされる伸長プライマーの最小の画分を決定するために、非伸長プライマー中で希釈した。バックグラウンドは、シグナルから引き、検出することができる伸長プライマーの最小の画分が約０．１２％であることを示唆した。
あらかじめ伸長したプライマーからの希釈液を用いて実行した類似する実験はまた、高レベルのプローブ結合を可能にする伸長が、１ｆｍｏｌまでの伸長産物を検出するのに十分な感受性があることをも示唆する（データ示さず）。より低レベルのプローブ結合をもたらす短い伸長は、期待されるように、同じ検出範囲を有していなかった。
２ステップポリメラーゼ活性ＥＬＩＳＡを用いて実行した、スクリーニングに成功した結果を図３に示す。それらは、Ａ及びＢモチーフＣＳＴ選択を指し、強力なスクリーニングツールとしてアッセイを検証するために役立った。
図３は、２ステップポリメラーゼ活性ＥＬＩＳＡからの典型的な結果のグラフ及び写真を示す。ＥＬＩＳＡスクリーニングから得られた値は、プライマー伸長アッセイと明らかに相関する（対数近似曲線；Ｒ２＝０．９４）。野生型は、赤色で示す。
典型的な反応は、以下のように実行する：ビオチン化プライマー（蛍光標識プライマーは直接的であり、検出が必要とされる）を含有するアニーリング主反応、過剰量の鋳型（通常４：１）、ヌクレオチド（１００μＭを超える終濃度で最適な結果）、及びポリメラーゼ緩衝剤は、プライマーアニーリングを可能にするために作製し、加熱し、冷却した。残りの反応成分（酵素、余分な緩衝剤、又は追加のサプリメント）を追加し、反応を実行した（単一の伸長サイクルとして又はＰＣＲと似たサーモサイクリングを用いて）。反応時間は、活性の酵素のレベル及び所望のスクリーニングストリンジェンシーに従って調整する。１０μｌの反応をそれぞれ、ストレプトアビジンによりコーティングしたウェル（１００μｌ ＰＢＳＴ＋１０μｌ反応＋９０μｌ ＰＢＳＴ）に移動し、３０分間、室温でインキュベートする。上清は廃棄し、それぞれのウェルは、ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を補足したリン酸緩衝食塩水）を用いて３度洗浄する。緩衝剤は除去し、プレートは、３０秒間、１００ｍＭ ＮａＯＨ中でインキュベートする。ウェルは、１００μｌ ｍＭ ＮａＯＨを用いて１回、２回目にＰＢＳＴを用いて洗浄する。ＰＢＳＴは、除去し、２００μｌのプローブ溶液（終濃度０．２μＭまでＰＢＳＴ中で希釈）は、それぞれのウェルに追加し、３０分間、室温でインキュベートする。ウェルは、ＰＢＳＴを用いて３度洗浄し、プローブに対する抗体を追加する。次いで、反応は、標準的なＥＬＩＳＡとして進行する。
［実施例２］
ＸＮＡ合成のための選択系の開発：
ＣｅＮＡ又はＨＮＡシンテターゼを単離するのに適した選択系の開発は、選択自体と並行して実行した。したがって、この部は、シンテターゼを選択するための系の開発及び試みの失敗に注目する。ＨＮＡシンテターゼの選択の成功は、続く部において記載する。
最初に、選択は、短いパッチの区画化自己複製（ｓｐＣＳＲ，short-patch compartmentalised self-replication）（J. L. Ong, D. Loakes, S. Jaroslawski, K. Too, P. Holliger, Journal of Molecular Biology 361, 537 (Aug, 2006)）；発明者らの研究所において以前に開発した技術によって試みた。しかし、このアプローチは、非生産的であることが証明された。
したがって、第２の選択方法：区画化自己タギング（ＣＳＴ，compartmentalised self-tagging）を開発した。複製が組み込みから切り離されるので、ＣＳＴは、選択障害の低下により、成功したシンテターゼを単離する可能性が高い。さらに、選択されている遺伝情報は、全体を通してＤＮＡとして残り、回収に成功する可能性が高い。
ＣＳＴの基本原理が記載されている。選択条件及び方法自体のさらなる最適化は、図４において要約される、新バージョンのＣＳＴ戦略（ＣＳＴ２．０）の開発に至った。その従来品におけるように、短いビオチン化プライマーは、変異体ポリメラーゼをコードするプラスミドを標的にするために使用される。エマルションにおいて、ポリメラーゼは、プライマーを伸長し、反応中に供給される修飾ヌクレオチドを組み込む−ＣｅＮＴＰ（又はｈＮＴＰ）組み込みにより効果のあるポリメラーゼは、より不十分な変異体よりもプライマーをさらに伸長する。プラスミドは、ビオチン化プライマーを通して回収し、非特異的なプラスミド又は不十分に結合したプラスミドを除去するために洗浄する。結果として生じたプラスミド集団は、反応条件下でプライマーをより効率的に伸長することができるポリメラーゼをコードするプラスミドについて濃縮される。それらは、増幅し、クローニングし、続く選択ラウンドのための開始集団として使用することができる。
図４は、区画化自己転写（ＣＳＴ，compartmentalised self-transcription）の略図を示す。本文に記載されるように、ＤＮＡビオチン化プライマーは、ＣｅＮＴＰ及びｈＮＴＰの組み込みに、より効果のあるポリメラーゼを単離するために使用した。
２つのバリエーションの間の重要な差異は、選択されるプライマー（特異的ではなくランダム、不十分なバインダーではなく安定したバインダー）及び下流の試料プロセシング（３７℃でのインキュベーションではなくホルムアミド洗浄）にある。方法におけるこれらの変化は、観察された改善の手掛かりとなった。
ＣＳＴ実験の単純なインシリコモデルは、全回収ＤＮＡの増幅が、クローンの改善がまれであったライブラリーについての活性と相関する必要がなかったことを示唆した。一度、修飾がすべて組み込まれたら、例えば、野生型及び不活性フレームシフト変異体を比較するモデル選択は、修飾前よりも３倍不十分な濃縮をもたらした（観察された以前の３０倍ではなく１０倍のｗｔの濃縮）。しかし、それは、効率的な選択が野生型よりも高い活性レベルを必要としていた場合に期待されるであろう。
１０Ａモチーフライブラリー（Ｎ６プライマーを使用するｈＮＴＰ選択）に対する単一ラウンドの選択を実行し、多くの個々のクローンをｈＮＴＰ活性について評価した。表２において要約される結果は、図６において示されるように、選択が実際起こり、多くの改善されたポリメラーゼが単離されたことを確認した。
Figure 0005997691
［実施例３］
ＤＮＡポリメラーゼライブラリー設計
最初に、ポリメラーゼ活性部位をなす３つの保存モチーフ：Ａ、Ｂ、及びＣモチーフを標的にしてＴｇｏＴ及び９°ＮＴポリメラーゼの両方における３つのライブラリーを作製した。ライブラリーは、領域において利用可能な任意の系統学的多様性（phylogenetic diversity）並びに機能的に重要な残基（例えば触媒アスパルテート）以外における低レベルの変異を包含するように試みた。Ｐｆｕにおける類似するライブラリーは、Ｃｙ標識ヌクレオチドの組み込み及び複製が可能なポリメラーゼを単離するために使用するのに成功している（N. Ramsay et al., J Am Chem Soc 132, 5096 (Apr 14, 2010)）。
３つのモチーフが、ポリメラーゼの活性部位及び入って来るヌクレオチドのポケットを裏打ちするが、それらの最適化が、進化性のポリメラーゼを得るのには十分になり得なかったことは明らかであった。その結果として、変異を導入するための類似するアプローチを使用して、さらなるライブラリーを設計した（添付のｐｐｔファイルにおいて詳述）。
ＰｏｌＢファミリーの２つのポリメラーゼのみが、ＤＮＡと共に現在までに結晶化されており（進化性の立体構造で）−図５Ａ及び５Ｃにおいて示されるようにＲｂ６９（M. C. Franklin, J. Wang, T. A. Steitz, Cell 105, 657 (Jun 1, 2001)）及び最近ではｐｈｉ２９（A. J. Berman et al., EMBO J 26, 3494 (Jul 25, 2007)）ポリメラーゼ−配列アライメントのみでは、多様化のための他の候補領域を同定するのに十分ではなかったので、３つのポリメラーゼ（ｐｈｉ２９、Ｒｂ６９、及びＴｇｏ）の構造的アライメントは、多様化のための他の可能な領域を同定するために使用した。
最初のプライマー伸長反応は、ＴｇｏＴが、停止前に、シクロヘキセニルヌクレオチドの後に天然ヌクレオチドを効率的に組み込むであろうということを同定した。よって、調査するためのさらなる残基は、Ｒｂ６９ポリメラーゼ構造のプライマー鎖における＋１の組み込みの１０Å以内にすべての残基を位置づけることによって同定した。次いで、その探索において同定した水分子は、さらなる５Åの範囲を探索するために使用した。Ｒｂ６９構造上で同定した残基は、入手可能なＴｇｏ構造にマッピングした。９つのパッチが、新生ヘリックスの近くにあると期待されるＴｇｏ配列において同定された。さらに２つのパッチが、Ｒｂ６９及びＴｇｏのｔｈｕｍｂ構造の構造的比較によって同定された。次いで、同定されたモチーフは、それらの位置を確認するためにｐｈｉ２９にマッピングし、ｔｈｕｍｂモチーフ以外（ｐｈｉ２９は構造的に異なるｔｈｕｍｂを有する）は、マッピングに成功した。
結果として生じた１１のパッチは、図５Ｄ及び５Ｅにおいて示される、さらなる１８のライブラリーを設計するためのベースとして使用した。
図５は、Ｒｂ６９（Ａ）、Ｔｇｏ（Ｂ）、及びｐｈｉ２９（Ｃ）ポリメラーゼ構造を示す。Ｎ末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメイン、及び他のドメインは、すべて淡黄色で示す。Ｐａｌｍサブドメインは、桃色、ｆｉｎｇｅｒサブドメインは、灰色、ｔｈｕｍｂドメインは、水色で示す。もとのライブラリーにおける３つの保存ポリメラーゼモチーフ標的は、赤色で示し、Ｔｇｏ配列（Ｄ）において強調表示する。新しいライブラリーは、Ｔｇｏ構造で示し、Ｔｇｏ配列（Ｄ）において下線を引く。３つの最初に入手可能なライブラリーは、赤色で下線を引く。ライブラリー１０Ａ及び１２は青色で示す。
多様性は、ライブラリーを生成するために使用するプライマーのオリゴヌクレオチド合成を通して導入した（添付のｐｐｔファイルを参照されたい）。典型的な増幅反応（１００μｌ）は、メーカーによって推奨される条件を使用するRoche's Expand High Fidelity及び発明者らの野生型プラスミドＤＮＡを用いて実行する。ＰＣＲは、「タッチダウン」反応として実行する（アニール温度はそれぞれの伸長サイクルの後に低下した）。プライマーがBsaI部位の下流に小さなオーバーラップを有するので、それは、全プラスミドが増幅され、BsaI（NEB社）及びDpnI（NEB社）制限反応及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（NEB社）との続くライゲーションの後に、シームレスにクローニングされるのを可能にする。反応はすべて、メーカーの推奨に従って実行した。第１のラウンドライブラリーについては、ｐｈｉ２９（NEB社）を使用するさらなる増幅ステップは、プライマーとしてのＮ６オリゴ及びメーカーによって推奨される反応条件を使用して実行した。
発明者らが「野生型」と呼び、すべての合成ライブラリーのベースをなすポリメラーゼが、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）から単離されるようなポリメラーゼ遺伝子中に存在しない、存在する多くの変異を有することに注目することは重要である。発明者らの「野生型」は、４つの変異を含む：Ｖ９３Ｑ（ウラシルが鋳型上で検出される場合に失速を引き起こすポリメラーゼ先読み機能を低下させるために導入）（M. J. Fogg, L. H. Pearl, B. A. Connolly, Nat Struct Biol 9, 922 (Dec, 2002)）、Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａ（３’→５’エキソヌクレアーゼドメインを不活性化するために導入）（C. M. Joyce, V. Derbyshire, Methods Enzymol 262, 3 (1995)、L. Blanco, A. Bernad, M. Salas, Gene 112, 139 (Mar 1, 1992)、A. Bernad, L. Blanco, J. M. Lazaro, G. Martin, M. Salas, Cell 59, 219 (Oct 6, 1989)）、並びにＡ４８５Ｌ（Therminatorとして市販で入手可能であるが、Ｂ−ファミリーポリメラーゼにおける非天然基質の組み込みを改善することが示されている）（A. F. Gardner, W. E. Jack, Nucleic Acids Research 27, 2545 (Jun 15, 1999)）。
一度ＰＣＲによって合成されたら、ライゲーションしたプラスミドを形質転換し、クローンの小さな試料（ライブラリー当たり１０〜３０のクローン）は、同一性を確認し、かつライブラリー多様性を推定するために、配列決定した。遺伝子の完全性（ｄＮＴＰ組み込み活性及び配列決定結果）並びにライブラリー多様性が高度であることが推定されたら、大規模形質転換は、残りのプロジェクトのために使用するライブラリーを作製するために実行した。
［実施例４］
ＨＮＡ／ＣｅＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ活性が増強したクローンの選択
図６は、モチーフ１０Ａ及びモチーフ１２ライブラリーに対する単一のＣＳＴラウンドの後に単離された、改善されたポリメラーゼの例を示す。
それらのｄＮＴＰ組み込み活性について標準化したすべての入手可能なライブラリーの粗製溶解物は、どのライブラリーが可能性のあるシンテターゼを収容する最も高度な可能性を有したかを同定するために使用した。選択は、それらのライブラリーにおいて実行した。
単一のラウンド選択は、ＣｅＮＴＰ及びｈＮＴＰの組み込みの両方についてモチーフライブラリーＢ−、８、９、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１、及び１２において実行した。小規模スクリーニングは、モチーフ８、１０Ａ、及び１２に対して実行した。ＣｅＮＴＰ組み込み改善は検出されたが、ｈＮＴＰ改善は実質的により高度であった。それらの結果は、ＣＳＴがシンテターゼ選択に適していたことを確認した。
ＨＮＡ及びＣｅＮＡの両方に対して組み込みパラメーターが改善された変異体を単離し（配列を含有する添付ファイルを参照されたい）、ＣＳＴ２．０アプローチを検証し、ＣＳＴ選択のさらなるラウンドを、結果として生じる１０Ａライブラリーに対して実行した。ＣＳＴ選択はまた、ＲＮＡを合成する際に野生型ＴｇｏＴよりも優れ得る酵素を単離するために、１０Ａモチーフライブラリー（立体的ゲート（steric gate）変異体Ｙ４０９Ｎとの関連において作製）に対しても実行した（実施例７〜１２を参照されたい）。
［実施例５］
ＣｅＮＡ及び／又はＨＮＡの進化性の合成のためのポリメラーゼの設計及び進化
改善された変異体が異なるモチーフライブラリーから単離されたので、発明者らは、同定されている変異が相加的なものとなり得るかどうかを調査した。そのために、発明者らは、８つの可能性のあるキメラを得るために、２つのモチーフ１２変異体及び４つのモチーフ１０Ａ変異体を交差させた。
変異体活性は野生型活性を常に超えたが、有意な増加はキメラのうちのどれによっても獲得されなかった。これは、モチーフ１０Ａ及びモチーフ１２における変異がポリメラーゼにおいて類似する機能を標的にし、よって、１０Ａ／１２キメラは、活性におけるいかなる増加にも至らないことを示唆する。
調査した他の可能性は、交差基質活性であった。ＣｅＮＴＰ又はｈＮＴＰ組み込みに対する選択は、ｈＮＴＰ及びＣｅＮＴＰについて類似しているかもしれない、修飾核酸構造を認識する酵素の能力を改変するかもしれない。活性における増加は、ＣｅＮＴＰ組み込みに対してｈＮＴＰ選択変異体について観察されなかったが、相補的な実験（ＣｅＮＴＰ選択酵素によるｈＮＴＰ組み込み）は、図７において示されるように、さらに高度なｈＮＴＰ活性を有する多くのクローンを同定した。したがって、ＣｅＮＴＰを使用する選択は、オルソゴナルポリマーを合成することができるポリメラーゼの進化のためのより強力な選択圧をもたらした。
図７は、清澄化した細菌溶解物を使用する、ＣｅＮＴＰ選択（Ｃ１、Ｄ４、Ｃ７、及びＧ１１）並びにｈＮＴＰ選択（Ｅ６、Ｂ１２、Ｈ１２）変異体ポリメラーゼによるｈＮＴＰ組み込みを図示する写真を示す。１時間の全伸長時間。ＤＮＡ鋳型の長さは、５７の組み込みを可能にする。
同様に、単離変異体はまた、ｒＮＴＰ（リボヌクレオチド）組み込みについても試験した。ｒＮＴＰ組み込みを非常に低下させるすべての選択されたポリメラーゼにおけるＹ４０９立体的ゲート（A. F. Gardner, W. E. Jack, Nucleic Acids Research 27, 2545 (Jun 15, 1999)）の存在にもかかわらず、Ｄ４は、図８において示されるように、ｒＮＴＰの相当な組み込みを示した。その活性のために、Ｄ４は、さらなる特徴付けのため、及びＤＮＡ依存性の進化性ＲＮＡポリメラーゼを単離する目的でさらなる多様化のための出発点として果たすために、単離した（実施例７を参照されたい）。
１８の単離モチーフ１０Ａ変異体の配列分析は、局所的なタンパク質構造の維持に関与するための残基及び伸長するプライマーリン酸主鎖の非常に近くにある可能性がある、したがって機能的に重要な可能性のある残基（ＲＢ６９ ｐｏｌＢとの構造的アライメントに基づく）を標的にする、導入された多様性内に変異の２つのクラスターを同定した。
［実施例６］
進化性のＨＮＡポリメラーゼ：６Ｇ１２
ＣＳＴの第２のラウンド（ＣｅＮＴＰ選択）は、ライブラリー活性に対するさらなる選択ラウンドの効果を調査するために、１０Ａモチーフライブラリー（最初にＣｅＮＴＰにより選択）に対して実行した。あるスクリーニングは、有意な交差基質（ｈＮＴＰ）活性をも示した、ＣｅＮＴＰ組み込み潜在能力が改善した（第１のラウンドにおいて同定されたすべての変異体よりもわずかに効果のある）変異体を同定した：６Ｇ１２。
Figure 0005997691
選択されたモチーフの外部に位置する６つを含む合計１４の変異が６Ｇ１２において収集された。変異はすべて、ＲＢ６９構造にマッピングした場合、図９において示されるように、新生プライマー鎖と密接に接触するポリメラーゼの内部表面を裏打ちする。
図９は、Ｔｇｏ（Ａ）及びＲＢ６９（Ｂ）構造にマッピングした６Ｇ１２変異を示す。６Ｇ１２において同定された変異はすべて、Ｔｇｏ構造（赤色の球体）上にマッピングし、構造的アライメントは、ＲＢ６９における等価な残基を同定するために使用した。同定された変異はすべて、ｔｈｕｍｂドメイン（青色）内に位置し、ほとんどが、新生プライマー鎖と接触する内部タンパク質表面に位置する。
６Ｇ１２変異はそれぞれ、そのＨＮＡシンテターゼ活性に対するそれぞれの変異の寄与を決定するために、復帰させて、ＴｇｏＴに戻した。試験した復帰変異のうちの２つは、ＨＮＡ組み込み活性の改善を示し、試験した残りの１１の変異は、活性における小さな減少をもたらしたが、ＴｇｏＴレベルを超える活性を保持した。
図１０は、様々な鋳型に対する６Ｇ１２復帰点変異体ｈＮＴＰ組み込み活性を示す。ポリメラーゼ活性は、ｄＮＴＰに対して標準化し、これまでに得られた変異体はすべて、それらのｈＮＴＰ組み込み活性について評価した。変異Ｋ６０９及びＱ６６４Ｅは、ポリメラーゼ活性に寄与するように思われないが、他のすべての変異は、改善されたＨＮＡシンテターゼ表現型に対して相加的であるように思われる。
活性の点では、６Ｇ１２はまた、現在までに単離された他のすべてのポリメラーゼよりも優れており、ポリメラーゼ活性を増加させることが知られているＭｎ＋２イオンの非存在下においてでさえ（いくらかの正確性の損失で）、より長いｔＲＮＡ鋳型の合成を可能にした。活性における差を図１１に示す。
図４は、部分的に精製された変異体ポリメラーゼによる、ｔＲＮＡ鋳型に対するｈＮＴＰ組み込みを示す。２つの変異体（６Ｇ１２及びＣ７）は、ｈＮＴＰにおいてｔＲＮＡ遺伝子を合成することができるかどうかを試験するために使用した。より短い鋳型により観察されるように、６Ｇ１２は、特にＭｎ＋２の非存在下において、Ｃ７（ＣＳＴ選択の単一ラウンドから単離）よりも非常に優れていた。プライマーのほぼ１００％は、２時間で、完了まで伸長した。
ＨＮＡは、反応緩衝剤（ThermoPol緩衝剤−NEB社）中に、１００ｐｍｏｌ標識プライマー、過剰量の鋳型（２：１）、修飾ヌクレオチド、及び０．５ｍＭマンガンを含有する１００μｌ反応において精製６Ｇ１２により典型的に合成した。ポリメラーゼを伴わない反応は、プライマーアニーリングを可能にするために加熱し、冷却し、ポリメラーゼを追加し、次いで、反応は、３サイクルのＰＣＲ（５０℃で９０分、６５℃で９０分、９４℃で１分）として実行した。
［実施例６ａ］
６Ｇ１２ ＨＮＡ合成の正確性
発明者らは、ｈＮＴＰのうちの各１つを欠く伸長反応を実行することによって、６Ｇ１２によるＨＮＡ合成の正確性を調査した。図１２において示されるように、４つのｈＮＴＰがすべて存在しない限り、完全長産物は得られなかった。図１２は、６Ｇ１２による、４つの利用可能なｈＮＴＰのうちの３つを用いるＨＮＡ合成を示す。ヌクレオチドのいずれか１つの非存在下において、６Ｇ１２は、進化性のＨＮＡ合成ができない。これは、６Ｇ１２が、４つすべてのｈＮＴＰの非存在下においてＨＮＡポリマーを合成することができない好適な正確性を有する鋳型依存性のポリメラーゼであることを示す。
６Ｇ１２の正確性のさらなる指標は、６Ｇ１２が最終的に単離されたＥＬＩＳＡスクリーニング（実施例１）に由来する。それは、ＨＮＡポリマーの合成及び相補的オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによるその検出を含む。ＥＬＩＳＡにおける検出は、したがって、所望のポリマーの正確な合成に依存している。
６Ｇ１２の正確性についてのよりストリンジェントでより定量的な手段は、５２１Ｌ（ＨＮＡ ＲＴ）に関連して得られ（実施例を参照されたい）、エラー率の総計（つまり６Ｇ１２によるＨＮＡ合成、その後に続く、ＨＮＡからの５２１Ｌ ＤＮＡ合成、その後に続く、Ｔａｑによる回収ＤＮＡの増幅）が、塩基対当たり、７×１０３エラー未満であることを示唆した（実施例を参照されたい）。
実施例１〜６に対する参考文献：
1. J. L. Ong, D. Loakes, S. Jaroslawski, K. Too, P. Holliger, Journal of Molecular Biology 361, 537 (Aug, 2006).
2. N. Ramsay et al., J Am Chem Soc 132, 5096 (Apr 14, 2010).
3. M. C. Franklin, J. Wang, T. A. Steitz, Cell 105, 657 (Jun 1, 2001).
4. A. J. Berman et al., EMBO J 26, 3494 (Jul 25, 2007).
5. M. J. Fogg, L. H. Pearl, B. A. Connolly, Nat Struct Biol 9, 922 (Dec, 2002).
6. C. M. Joyce, V. Derbyshire, Methods Enzymol 262, 3 (1995).
7. L. Blanco, A. Bernad, M. Salas, Gene 112, 139 (Mar 1, 1992).
8. A. Bernad, L. Blanco, J. M. Lazaro, G. Martin, M. Salas, Cell 59, 219 (Oct 6, 1989).
9. A. F. Gardner, W. E. Jack, Nucleic Acids Research 27, 2545 (Jun 15, 1999).
以下の実施例は、進化性のＨＮＡ及び／又はＣｅＮＡポリメラーゼの単離を目的としたＣＳＴ選択実験からの進化性のＲＮＡポリメラーゼについての単離に関する。
［実施例７］
Ｄ４における立体的ゲート残基Ｙ４０９の変異は進化性の高正確性ＲＮＡポリメラーゼをもたらす
Ｄ４は、Ｔｇｏ、超好熱性古細菌サーモコッカス・ゴルゴナリウス由来の複製ＤＮＡポリメラーゼに由来する。開始遺伝子（ＴｇｏＴ）は、非天然基質の組み込みを増強するために、先読み停止（Ｖ９３Ｑ）及びエキソヌクレアーゼドメイン（Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ）を不能にするための変異並びにTherminator変異（Ａ４８５Ｌ）を有した。決定的に、それはまた、ｔｈｕｍｂドメイン（残基５８６〜７７３）（モチーフ１０Ａ）の領域における、非天然基質の処理能力に対して決定的であるように思われる８つの変異のクラスターを含む。
しかしながら、Ｄ４における立体的ゲート残基はなお損なわれておらず、ｒＮＴＰの組み込みを非常に妨げる。ＲＮＡポリメラーゼ活性を改善するために、立体的ゲート（ＴｇｏにおけるＹ４０９）を変異させ、様々な変異体を調査した（図１３ａ、ｄ）。
図１３（ａ）立体的ゲート設計。入って来るｒＮＴＰの２’ＯＨは、明らかに、チロシンの立体的ゲートと衝突するように見え得る。これは、ロイシン、アスパラギン、又はセリンへの変異によって緩和される。（ｂ）１０５アミノ酸長の産物を作製するための８７の組み込みを必要とする酵母ＹｔＲＮＡの伸長。反応条件：３μｌの最終的な体積中１×Thermopol緩衝剤、１．８ｐｍｏｌプライマー、３．６ｐｍｏｌ鋳型、２ｍＭ ｒＮＴＰ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．１５μｌ 精製Ｄ４Ｎ３。サーモサイクリング：１分間９４℃、５分間５０℃、５分間６５℃、１０秒間９４℃、５分間５０℃、５分間６５℃で、２０分間伸長時間をなす。（ｃ）Ｄ４Ｎ３によるＤＮＡ及びＲＮＡプライマー伸長の比較。反応は方法において示されるように実行した。（ｄ）Ｄ４における立体的ゲートを修飾する効果を実証する、全ｒＮＴＰ置換を用いるプライマー伸長。アスパラギン（Ｙ４０９Ｎ）への立体的ゲート残基の変異は、Ｄ４Ｎ３、例えば酵母ＹｔＲＮＡを含む８７ｎｔまでのＲＮＡを進化性に合成するための著しい能力を有する変異体ポリメラーゼをもたらした（図１３ｂ）。さらに、Ｄ４Ｎ３は、ＤＮＡ及びＲＮＡプライマーの両方を伸長することができる（図１３ｃ）。
ＲＮＡポリメラーゼが、最適な活性のためにＤＮＡポリメラーゼよりも高度なＭｇ２＋及びＮＴＰ濃度を多くの場合必要とするという観察の後に、発明者は、ｒＮＴＰ及びＭｇ２＋濃度の両方を故意に変えた。最適化した条件は、Ｄ４Ｎ３によるＲＮＡ合成の処理能力及び速度並びに産物収率を有意に改善し、ここでは、Ｄ４Ｎ３は、２０分間未満で８７アミノ酸長のｔＲＮＡを合成することができた（図１３ｂ）。
ポリメラーゼ機能の決定的なパラメーターは、正確性である。Ｄ４Ｎ３がＤＮＡ鋳型鎖をＲＮＡに正確にコピーしたかどうか調査するために、発明者は、標準的な方法を使用してポリＡテーリング及びＲＴ−ＰＣＲ（Superscript II）によってＤ４Ｎ３転写物をクローニングした。配列決定は、正確性の総計を明らかにし（Ｄ４Ｎ３によるＲＮＡ合成、Superscript IIによる逆転写、及びＰｌａｔｉｎｕｍ ＴａｑポリメラーゼによるＰＣＲの３０サイクルを含む）、１３００を超える組み込みにおける合計１３のエラー又はおよそ１０−２のエラー率の総計をなす、６９塩基を超える１９の読み取りにわたる４つの点変異及び７つの欠失のみを伴った。
［実施例８］
Ｄ４の立体的ゲートの異なる変異は、他の２’修飾ＮＴＰの組み込みを可能にする
２’修飾ヌクレオチドは、天然ＲＮＡにおいて広く生じ、いくつかの機能（例えばリボソーム機能、好熱性ｒＲＮＡの熱安定性）にとって重要である。それらはまた、ＲＮＡｉ及びアプタマーなどのような核酸治療薬におけるものを含む、多くの興味ある生物工学的な適用を有し、それらは、効力及び血清安定性を増強する。しかしながら、多数が、天然に存在するＲＮＡポリメラーゼに対する不十分な基質である。
発明者らは、Ｄ４Ｎ３活性部位のモデリングの第２のラウンドを実行し、よりかさ高い２’修飾（例えばＯ−メチル）を収容するのに最適なものとしてアラニン、グリシン、又はセリンを示唆した。
より小さなアラニン及びグリシン変異は、実際、２’アミノ−ＡＴＰ、２’アラ−ＡＴＰ、２’アジド−ＡＴＰ、及び２−Ｏ−メチル−ＡＴＰの組み込みの改善を可能にした（図１４）。
図１４−２’修飾ＡＴＰを用いるプライマー伸長。Ｄ４の立体的ゲート（Ｙ４０９）のさらなる修飾は、様々な基質の野生型よりも効果のある組み込みを可能にする。これは、立体的ゲートが、小さく中性の残基への変異によって単純に除去されるものとは対照的に、基質に従って最適化することができることを示唆する。Trilink Biotechnologies社（www. trilinkbiotech. com）からの構造
完全なＣｅＴｅｍｐＮ鋳型（１３Ａｓを含む５７の組み込み）は、２’アラ−ＡＴＰ及びＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰを用いて合成した。
これは、Ｄ４Ｎ３及びその誘導体が、ＲＮＡ（又はＤＮＡ）に２’修飾ＮＴＰ（特にアラビノ誘導体）を組み込む能力が改善され得ることを示唆する。
［実施例９］
モチーフ１０Ａにおける単一の点変異のみがＤ４Ｎ３処理能力に必要である
立体的ゲートを修飾するのみでは、進化性のＲＮＡポリメラーゼをもたらさないので、発明者らは、１０Ａモチーフにおける変異が進化性のＲＮＡ合成にとって決定的であるに違いないと結論付けた。
Ｄ４は、モチーフ１０Ａにおいて野生型Ｔｇｏと比較して８つの変異を有し、Ａモチーフにおいて散在性のＬからＰへの変異を有する。野生型への、１０Ａ領域における８つの変異した位置のそれぞれを復帰させるための個々の点変異は、６６４位を除いて、ＲＮＡ合成に対して効果がほとんどなく、この復帰は、活性における劇的な低下をもたらした（図１５ａ）。これは、単一の変異Ｑ６６４Ｅが主として進化性のＲＮＡ合成を可能にする役割を担うことを示唆した。この仮説を試験するために、発明者は、変異した立体的ゲートを有するＴｇｏＴ Ｙ４０９Ｎの中にこの変異を導入し、新しいポリメラーゼ（ＴＮＱ）を得た。実際、この単一の変異Ｑ６６４Ｅは、ポリメラーゼＴＮＱに、Ｄ４Ｎ３より優れたＲＮＡポリメリゼーション能力を与えるのに十分であることを証明した（図１５ｂ）。図１５−全ｒＮＴＰ置換を用いるプライマー伸長反応。（ａ）１０Ａ逆変異：ＴｇｏＴ、アスパラギンに変異させた立体的ゲートを有するＴｇｏＴ（ＴｇｏＴ Ｙ４０９Ｎ）、アスパラギンの立体的ゲートを有するＤ４（Ｄ４Ｎ３）、野生型の立体的ゲートを有するＤ４（Ｄ４）、及びＤ４ １０Ａ領域における変異を復帰させて、野生型に戻す点変異。（ｂ）Ｑ６６４正変異。左から右に、野生型の立体的ゲート及びＱ６６４Ｅ変異を有するＴｇｏＴ（ＴｇｏＴ Ｙ４０９ Ｑ６６４Ｅ）、アスパラギンの立体的ゲート及びＱ６６４Ｅ変異を有するＴｇｏＴを有する２つのレーン（ＴｇｏＴ Ｙ４９０Ｎ、Ｑ６６４Ｅ ９及び１０）、野生型の立体的ゲート（Ｄ４）及びアスパラギンの立体的ゲート（Ｄ４Ｎ３）を有するＤ４、並びにＴｇｏＴ。反応は、方法において示されるように実行した。（ｃ）Ｔｇｏ及びＤ４における１０Ａ配列。ナンバリングはＴｇｏに従う。
［実施例１０］
熱安定性ＲＮＡポリメラーゼ（ＴＮＱ）によるＲＮＡプライマー依存性のｔＲＮＡ合成
ＹｔＲＮＡは、余分な２ｍＭ ＭｇＳＯ４（合計４ｍＭ）及び０．６２５ｍＭの各ｄＮＴＰを補足したNEB社 ThermoPol緩衝剤の存在下において、精製ＴＮＱ（ＴｇｏＴ／Ｙ４０９Ｎ／Ｅ６６４Ｑ）を使用して合成した。２０ｍｌの反応は、１０ｐｍｏｌ ＦＩＴＣ標識ＲＮＡプライマー、２０ｐｍｏｌ ＤＮＡ鋳型、及び１：１０希釈の１．５ｍｌ 精製酵素を含有した。サイクリング条件：
Figure 0005997691
５ｕｌの簡潔な伸長（理論上２．５ｐｍｏｌのプライマーを含有）を、１３％アクリルアミド／８Ｍ尿素／１×ＴＢＥゲル上で実行した（図１６を参照されたい；図１６は写真を示す）。
これは、２×５分間の伸長サイクルが完全長ｔＲＮＡを合成し、１１７のｒＮＴＰ組み込みを必要とするのに十分であり、産物が、ｒＮＴＰの非存在下において生成されないことを実証する。
反応の残りは、イソプロパノール沈殿し、ペレットにし、３ｍｌ Turbo ＤＮアーゼを含有する１００ｍｌ １×Turbo ＤＮアーゼ緩衝剤に再懸濁し、酸フェノール：クロロホルム抽出及び第２のイソプロパノール沈殿の前に、３７℃で９０分間、インキュベートした。今回は、ペレットは、QIAGEN社 RNeasyキットからの１００ｍｌ ｄＨ２Ｏ、１００ｍｌイソプロパノール、及び１００ｍｌ ＲＬＴ緩衝剤中に懸濁し、ＲＮＡは、メーカーの指示に従って精製した。純粋なＲＮＡは、３０ｍｌの提供されたヌクレアーゼなしの水において溶出し、２ｍｌは、SuperScript OneStep RT-PCR System（Invitrogen社）及びTranscriptor One-Step RT-PCRキット（Roche社）の両方を用いてＲＴ−ＰＣＲのために使用した。
１５０ｂｐの期待される産物のサイズは、２×５分間の伸長サイクルがｔＲＮＡを合成し、１１７のｒＮＴＰ組み込みを必要とするのに十分であるＰＡＧＥ結果を確認する。
［実施例１１］
熱安定性ＲＮＡポリメラーゼ（ＴＮＱ）によるタンパク質をコードする遺伝子（ＧＦＰ）のｍＲＮＡの合成
７４８のｒＮＴＰ組み込みを必要とするＧＦＰ遺伝子は、ｍ６ＧＦＰコードプラスミドから作製した一本鎖ＤＮＡ鋳型からＴＮＱ（ＴｇｏＴ／Ｙ４０９Ｎ／Ｅ６６４Ｑ）を使用して合成した。鋳型は、１つのビオチン化プライマー及び１つの非ビオチン化プライマーを使用して調製し、両方の鎖を捕捉し、所望の鎖は、０．１Ｍ ＮａＯＨを使用して洗浄した。図１７を参照されたい。図１７は写真を示す。
合成は、０．６２５ｍＭの各ｒＮＴＰ、５ｐｍｏｌ ＦＩＴＣ標識ＲＮＡプライマー、９．９ｐｍｏｌ ｓｓＤＮＡ鋳型、４ｍＭ Ｍｇ２＋の最終濃度を与える、２ｍＭ ＭｇＳＯ４を補足したNEB社 ThermoPol緩衝剤中に１：１０希釈された酵素０．７５ｍｌを含有する１０ｍｌ反応液において実行した。サイクリング条件：
Figure 0005997691
合成の後に、反応をイソプロパノール沈殿し、ペレットを、２ｍｌのTurbe ＤＮアーゼを含有する４８ｍｌ １×Turbo ＤＮアーゼ緩衝剤において懸濁した。３７℃での６０分間のインキュベーションの後に、ＲＮＡは、酸フェノール：クロロホルム抽出し、再度、イソプロパノール沈殿させた。ペレットは、QIAGEN社RNeasyキットからの１００ｍｌ ｄＨ２Ｏ、１００ｍｌイソプロパノール、及び１００ｍｌ ＲＬＴ緩衝剤中に懸濁し、ＲＮＡは、メーカーの指示に従って精製した。純粋なＲＮＡは、３０ｍｌの提供されたヌクレアーゼなしの水に溶出した。陽性対照反応は、ｄＮＴＰを用いて実行し、ＤＮアーゼ処理も、RNeasy精製もしなかった。それは、QIAGEN社 QIAquick PCR精製カラムのみを使用して精製し、同じ水の同じ体積（３０ｍｌ）中に溶出した。２．５ｍｌの精製ＲＮＡは、５００ｂｐ断片を生成するための内部ＲＴプライマー及び完全長ＧＦＰ遺伝子を生成するための第２のプライマーセットを使用して、SuperScript OneStep RT-PCR System（Invitrogen社）を使用し、ＲＴ−ＰＣＲの鋳型として使用した（図１８を参照されたい）。図１８は写真を示す。
ポリメラーゼ機能の決定的なパラメーターは、正確性である。ＴＮＱがＤＮＡ鋳型鎖をＲＮＡに正確にコピーしたかどうか調査し、ＲＮＡ合成のその正確性をＤ４Ｎ３（及び他のＲＮＡポリメラーゼ）と比較するために、発明者らは、TOPO cloning kit（Invitrogen社）を使用して、完全長＋ｒＮＴＰ及び＋ｄＮＴＰレーンをクローニングした。結果として生じるコロニーの大部分は明らかに緑色であり、ＲＮＡ合成に由来する９つのランダムコロニーの配列決定及びＲＴ−ＰＣＲは、Ｄ４Ｎ３より優れた、約１０−３（６７３２の配列決定した塩基において５つの単一の塩基誤組み込み及び１つの挿入）の優れた正確性の総計を確認した（Ｄ４Ｎ３によるＲＮＡ合成、Superscript IIによる逆転写、及びＰｌａｔｉｎｕｍ ＴａｑポリメラーゼによるＰＣＲの３０サイクルを含む）。
［実施例１２］
ＲＮＡポリメリゼーションに対する改善された第２のゲート変異
１０Ａ領域（Ｅ６６４Ｑ）における単一の点変異のみが進化性のＲＮＡ合成のために必要であったという発見の後に、その位置及びその隣接する残基（Ｅ６６２、Ｙ６６３、Ｅ６６４、Ｑ６６５）の両方を個々にＮＮＳコドンを使用して多様化した。２×９６ウェルプレートを、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、実験当たりの単一の残基に対する限られた多様性は、２０の可能性のあるアミノ酸のうちのいずれかを失う可能性が低かったことを意味した。典型的なＥＬＩＳＡ結果を図１８に示す。
陽性のヒットを配列決定し、以下の変異は、進化性のＲＮＡ合成を可能にすることが分かった。
Figure 0005997691
徹底的な調査は、まだ実行していないが、Ｅ６６４の変異は、ＲＮＡポリメリゼーションに対して最も大きな効果を有し、Ｅ６６４Ｋは、かなりの差によって最も有効であるように思われる（図２０）。
［実施例１３］
ＣＳＴ ２．０アプローチ
区画化自己転写（ＣＳＴ，compartmentalised self-transcription）アプローチ：ＣＳＲにおけるように、区画化は、異なる遺伝子型を単離する。ビオチン化ＤＮＡプライマーを、インビトロプライマー伸長反応において使用し、したがって、遺伝子型を表現型に対して関連づける。プラスミドに結合したプライマーは、ストレプトアビジンコーティングされた常磁性ビーズを使用して、回収し、単離する。理想的には、プライマーは、伸長しない限り、有効なプラスミド捕捉には短すぎる。伸長及びプロセシング条件は、選択圧を調整するために適合させることができる。回収されたプラスミドは、増幅し、続くラウンドの開始集団として使用する。
区画化自己転写。短いビオチン化ＤＮＡプライマー（Ａ）は、エマルション（Ｂ）中でそれを伸長することができる酵素を選択するために使用する。ＣｅＮＡシンテターゼを選択するためのＣＳＲに対するＣＳＴの最も重要な長所は、選択した遺伝情報が、反応の全体にわたってＤＮＡとして残るということであり、したがって、ＣＳＲ方法、プルスルー（pull-through）の大きな限界のうちの１つを避ける。ＣＳＴにおける選択圧は、ＣＳＲにおける選択圧よりも実質的に低く、発明者らは、それによって、全ＣｅＮＴＰ及びＨＮＴＰ置換を用いるＣＳＴ選択を実行することができた。モデル実験（野生型対フレームシフト変異体）から得られる濃縮推定値は、選択の１ラウンド当たり３０倍の改善を得ることが可能であることを示唆する。系の選択パラメーターのうちのいくつかは、選択をさらに増加させるために最適化してもよい。
プロトコール：
水相（１５０ｕｌ）：
Thermopol緩衝剤（１０×） １５ｕｌ
５０％グリセロール ３０ｕｌ
ＭｎＣｌ２（３０ｍＭ） ５ｕｌ
ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ） ３ｕｌ
プライマー（ＢＣ３６Ｎ６−５０ｕＭ） １ｕｌ
ホルムアミド ３ｕｌ
ＤＴＴ（１００ｍＭ） １．５ｕｌ
ＢＳＡ（１０ｍｇ ｍｌ−１） １．５ｕｌ
ヌクレオチド（各２．５ｍＭ） ８ｕｌ
細胞＋水 ８２ｕｌ
−−−−−−
１５０ ｕｌ
Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ油相 ６００ｕｌ
すべて、５ｍｍ鋼ベアリングを有する２ｍｌチューブ中。
誘発したライブラリー細胞を、ＣＳＲにおけるように調製する。手短かに言えば、１ｍｌの培養物を低速度遠心分離によって収集し、１ｍｌの１×Ｐｏｌ緩衝剤中に再懸濁した。プロセスは、最初に５００ｕｌ、最終的に２００ｕｌまで懸濁体積を低下させて繰り返す。細胞数は、１：５０希釈のＡ５９５から推定する。２Ｅ８（２×１０８）細胞を選択反応当たりに使用する。
エマルションは、標準的な条件を使用してtissuelyser中で調製し（１０”＠１５Ｈｚ、７”＠１７Ｈｚ）、必要に応じてＰＣＲチューブに移動する。
全シクロヘキセニル置換を用いる第１のラウンド選択のために合成Ｔｇｏライブラリーに対するＢＣ３６Ｎ８についての成功した伸長条件：
Figure 0005997691
次いで、反応を４℃に保つ（このステップは任意選択であってもよい）。
エマルションは、ＥＢＳ及び飽和ヘキサノール（およそ１００ｕｌ ＴＢＴ２及び１０００ｕｌヘキサノール）を用いて壊した。相を分離するために遠心１０’＠１３，０００ＲＰＭ。１ｍｌのヘキサノール／油相を除去し、７００ｕｌのヘキサノールを追加し、界面を再懸濁し、遠心分離によって再分離する。
ＤＮＡは、イソプロパノール沈殿によって回収し（１：１０Ｖ ３Ｍ ＮａＯＡｃ、１ｕｌグリコーゲン、２Ｖイソプロパノール、−２０℃で一晩）、１００ｕｌ ＴＢＴ２中に再懸濁する。
２５ｕｌのＤＮＡ溶液を４７５ｕｌのＴＢＴ２に追加し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ１００に追加する。カラムは、ＤＮＡ溶液をフィルターにかけるために４０分間、２０００ＲＰＭで回転させる。およそ２５〜５０ｕｌを回収し、ＢＷＢＳ中のあらかじめブロックしたＭｙＯｎｅ Ｃ１ビーズ（試料当たり１０ｕｌ）に追加する。
＊ビーズ調製及び洗浄ステップ＊
反応当たり１０ｕｌビーズ
洗浄（５００ｕｌ）：１×ＢＷＢＳ
１×ＴＢＴ２
１×ＢＷＢＳ
ＢＷＢＳ中のビーズをブロックするために緩やかな撹拌下で室温で１時間インキュベートする。
２０ｕｌ ＢＷＢＳ中に再懸濁する。
２０ｕｌビーズを、およそ２５ｕｌのＹＭ１００精製プラスミドに追加し、さらなる４００ｕｌのＢＷＢＳを追加する。室温でオーバーヘッドローテータにおいて一晩（少なくとも２時間）、捕捉する。
ビーズは、Kingfisher mLロボット及びＣＳＴプログラム（Kingfisher mLプロトコールにおいて詳述）を使用して精製する。
１ｕｌビーズは、プルスルーの鋳型として使用することができる（２０ｕｌ反応の希釈系列として使用するとよい；１．８ｋｂの産物について約２５サイクル）。ビーズからのＤＮＡの直接的な増幅はまた、ｐｈｉ２９（ｐｈｉ２９プロトコールにおいて詳述）を用い、２ｕｌビーズを使用して達成することができる。
［実施例１４］
ＨＮＡ／ＲＮＡの進化性の逆転写のためのポリメラーゼの設計
現在までに、ＲＮＡ逆転写が可能なＢ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼについてのただ一つの報告がある（米国特許出願公開第２００３／０２２８６１６号明細書）。それは、高度に保存された残基（Ｌ４０８）についてのポリメラーゼ活性部位（Ａモチーフ）に対する変異が、ＲＮＡ鋳型からＤＮＡ合成することができるポリメラーゼ変異体を生成することを報告する。報告された変異体は、ＨＮＡ−ＲＴ活性について試験したが（発明者らのＴｇｏＴ「野生型」バックグラウンドに対して）、不成功に終わり、ＨＮＡオリゴマーに対する有意なＤＮＡ合成は、ＴｇｏＴ活性と適合性の一連の温度（５０℃〜６５℃）での２時間の伸長の後にポリメラーゼ活性ＥＬＩＳＡによって検出されなかった。
方法は、配列保存だけでなく配列協調的変異にも基づいて、大きなタンパク質アライメントから情報を得るために報告された：統計カップリング分析（ＳＣＡ，statistical coupling analysis）（S. W. Lockless, R. Ranganathan, Science 286, 295 (Oct 8, 1999)）。ＳＣＡがまた、タンパク質内のアロステリック情報伝達を同定するためにも使用することができることが提唱された（G. M. Suel, S. W. Lockless, M. A. Wall, R. Ranganathan, Nat Struct Biol 10, 59 (Jan, 2003)、N. Halabi, O. Rivoire, S. Leibler, R. Ranganathan, Cell 138, 774 (Aug 21, 2009)）。
ポリメラーゼにおいてアロステリックネットワークがあり、それらがポリメラーゼ機能に影響を与え得るという仮定に取り組みながら、発明者らは、鋳型分子の性質に関してポリメラーゼ−鋳型−プライマー複合体において利用可能な「情報」がある場合、ポリメラーゼ機能と相関する活性部位に近い又はそれから遠い残基を同定するためにＳＣＡを使用することが可能であるはずであると仮定した。６００のＢ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼに対して手動で生成した構造的アライメントから開始して、ＳＣＡは、ポリメラーゼ内の可能性のあるアロステリックネットワークを同定するために使用した。不運にも、残基４０８の高度な保存は、ＳＣＡにおいてそれを含むことができなかったことを意味した。しかしながら、「情報」が送り手及び受け手の間で物理的に運ばれなければならないので、発明者らは、４０８の物理的に近くにある、ＳＣＡによって同定された残基が、鋳型認識に関与するアロステリックネットワークの一部であるかもしれないと仮定した。
その関連において、１ＴＧＯ構造における残基４０８のまわりの５Åのシェルを選択し、ＳＣＡによって同定された残基をランダム変異誘発のために選択した。このアプローチは、「鋳型情報伝達」に関与する可能性のある部位として、残基４０５、４０８、５２０、５２１、及び５７５を同定した。
図２５：残基Ｌ４０８、保存ポリメラーゼモチーフ、及び可能性のある「情報」残基を同定するために使用した５Åシェル。
図２６：４０８のまわりのÅシェル内のＳＣＡによって同定された残基。最初に、保存的アプローチは、これらの部位のそれぞれにおいて可能性のある変異の限られたセットを導入して試みた（主として疎水性及び芳香族化合物）。変異は、標的にした位置にＮＷＣをコードするプライマーを使用してｉＰＣＲによって導入した。プライマーは、BsaI部位の下流に小さなオーバーラップを有するように設計した。メーカーの推奨に従ってRoche社のExpand High Fidelityを使用して、全プラスミドを増幅し、BsaI及びDpnI制限消化し、続いて、形質転換前にＴ４ ＤＮＡにライゲーションした。
多くの変異体を単離し、確立されたポリメラーゼ活性ＥＬＩＳＡスクリーニングを使用して、ＨＮＡ−ＲＴ活性についてスクリーニングした。低レベルのＨＮＡ−ＲＴ活性は、Ｙ５２０Ｆ及びＬ５７５Ｖ変異体並びに５２１位で変異させた多くの候補において検出された。
得られた結果を考慮して、残基５２１は、ＮＮＳを含有するプライマーによってコードされる変異体と共に、より徹底的にスクリーニングした。続くスクリーニングの結果は、表１に要約する。
Figure 0005997691
Ｉ５２１Ｌ変異体は、反応条件のさらなる特徴付け及び最適化のため、並びにそのような変異体もまたＲＮＡ−ＲＴ活性を有していたかどうかを調査するために選んだ。
図２７：ＨＮＡ ＲＴ活性のための５２１変異体のプライマー伸長スクリーニング。活性を標準化した（ｄＮＴＰ）粗製溶解物を、５２１変異体の選択のＨＮＡ ＲＴ活性を試験するために使用した。実験条件下で、５２１Ｌ及び５２１Ｐは、完了までＨＮＡ鋳型を合成することができる唯一のポリメラーゼであった。精製５２１Ｌは、TritonX-100（０〜５％）及び無関係なＲＮＡ（０．０１〜３μｇ／μｌ）を含む多くの添加剤によって抑制することができた、かなりの鋳型非依存性の活性を示した。
図２８：ｔＲＮＡ遺伝子に基づいてＨＮＡ鋳型からＤＮＡを合成するＨＮＡ ＲＴ反応（１０３塩基鋳型、ＨＮＡに対する７６ｄＮＴＰの組み込み）。ＨＩＶ ＲＴ（ＡＢ）、スルホロブス・アイスランディカス（Sulfolobus islandicus）ＤＮＡポリメラーゼIV（NEB社）−いくらかのＨＮＡ ＲＴ活性を有するＹファミリーポリメラーゼ、及び５２１Ｌ変異。反応は、４時間、単一の伸長サイクル＠６５℃として実行した。５２１Ｌがいくらかの鋳型非依存性の活性を示すので、鋳型対照は反応に含めなかった。「伸長なし」は、６Ｇ１２を伴わない反応を鋳型ＤＮＡキャリーオーバーのバックグラウンド対照として使用した、ＨＮＡ合成反応を指す。
［実施例１５］
ＤＮＡからＨＮＡへの、またＨＮＡからＤＮＡに戻る情報伝達
６Ｇ１２はＤＮＡ鋳型からＨＮＡへの情報の移動を可能にしたが、そのステップのみでは、限られた効果しかない。非天然ＤＮＡ類似体ポリマー（ＴＮＡ及びＰＮＡ）を、フォワード合成のみから機能についてどのように選択することができるかについての報告がある（J. K. Ichida et al., J Am Chem Soc 127, 2802 (Mar 9, 2005)、Y. Brudno, M. E. Birnbaum, R. E. Kleiner, D. R. Liu, Nat Chem Biol 6, 148 (Feb, 2010)）。しかしながら、そのような系が強力な遺伝子型−表現型連結をもたらすであろう（正確性の情報が限られるので）という、又はそれらの成分が相当な大きさの分子が合成されるのを可能にするであろうという証拠はほとんどない。
したがって、５２１Ｌは、それが、ＨＮＡからＤＮＡに戻る情報復旧を可能にするのでプロセスの手掛かりとなる。サイクルが完了すると、２つの酵素の総計の正確性を評価し、SELEXによって機能の選択を始めることができるようになる（C. Tuerk, L. Gold, Science 249, 505 (Aug 3, 1990)）。これが発明者らの系を用いて可能であったことを証明するために、発明者らは、６Ｇ１２を使用してｔＲＮＡ分子をＨＮＡに合成し、５２１Ｌを使用して、コードされた情報をＤＮＡに戻して回復させた。
多くの制御及びプロセスは、系によってＨＮＡ合成ステップを回避することができる可能性を最小限にするために導入した。重要なステップを下記に要約する：
−鋳型／プライマーミスマッチ：以前に報告されるように（J. K. Ichida, A. Horhota, K. Zou, L. W. McLaughlin, J. W. Szostak, Nucleic Acids Res 33, 5219 (2005)）、ミスマッチは、得られたＤＮＡの配列決定の際に、配列決定分子の起源を決定することができるように、鋳型の中に導入した、つまり、それは、もとの鋳型配列ではなくプライマー配列を含有しているはずである。
−プライマーオーバーハング：もとの鋳型よりも長いプライマーは、回収したＤＮＡの増幅のためにプライマーアウトネスティング（outnesting）を可能にするために使用した。これは、どの分子が回収されるかに関して特異性を増加させる。
−鎖依存性の反応：ＤＮＡテールの鋳型非依存性の追加もまた、さらなる増幅前に正確な鎖を選択するために使用した。
−ＤＮアーゼ及びエキソヌクレアーゼ処理：これらの酵素の組み合わせは、できるだけ多くのもとの鋳型が６Ｇ１２合成の後に分解されることを保証するために使用した。偽陽性結果を起こし得る非伸長ＲＴプライマーを除去するために、エキソヌクレアーゼは、５２１Ｌ反応の後にもう一度使用した。
−陰性対照：フォワード合成を実行した反応（６Ｇ１２なし）、ＲＴを実行しなかった反応（５２１Ｌなし）、及びその組み合わせを、回収された分子の起源を確実にするために使用した。さらに、反応ステップはすべて、変性ゲル電気泳動によってモニターした。
図２９：ＤＮＡからＨＮＡへの、また、ＤＮＡに戻る情報伝達。ｔＲＮＡ遺伝子をコードし、特異的タグが側面に位置するＤＮＡ鋳型は、６Ｇ１２を用いてＨＮＡ分子を合成するために使用した。その反応は、ＨＮＡ精製前にＤＮアーゼ及びＥｘｏＳＡＰ−ＩＴを用いて処理した。次いで、ＨＮＡは、５２１Ｌを用いるＲＴ反応において鋳型として使用した。反応は、１つのアウトネステッド（outnested）タグ（もとの鋳型中に存在しない）及びプライマーとしてフォワード合成において使用したプライマーを使用するＰＣＲによる増幅前にExoSAP-ITを用いてもう一度処理した。プライマーのみの対照及びＰＣＲのための鋳型なしの対照を実行し、明白な増幅は観察されなかった（データ示さず）。反応は、２０サイクル実行した。
異なる情報回復戦略もまた、図２５に類似する結果を得た。そのアプローチにおいて、フォワード合成（６Ｇ１２）は、ＤＮアーゼ処理し、ＨＮＡは、ＲＴステップ（５２１Ｌ）前に精製した。ＨＮＡ鋳型からのＤＮＡ合成は５２１Ｌを用いて実行し、図２４に示す。典型的な５２１Ｌ反応（５０μｌ）は、１×ThermoPol緩衝剤（NEB社）中、等濃度の標識プライマー及びＨＮＡ鋳型を使用して実行した。プライマー鋳型複合体をアニールした後に、５２１Ｌを追加し、４時間６５℃で反応を実行した。ＲＴ反応を精製し、ターミナルトランスフェラーゼ（NEB社）反応は、合成ＤＮＡにポリｄＡテールを追加するためにメーカーの推奨に従って実行した。
テールのあるＤＮＡ分子は、変性ゲルを使用してゲル精製し、ＤＮＡは、Superscript II ＲＴ−ＰＣＲ（Invitrogen社）、標識ポリ−ｄＴプライマー、及びＲＴを開始するために使用した同じプライマーを使用して、増幅に成功した。Superscript（中温性の逆転写酵素）ステップは、増幅産物を得るために必要とされたが、酵素が有意なＨＮＡ−ＲＴ活性を有していないことを考慮すれば、低温（ポリ−ｄＴプライマーの低融解温度による）でプライマー伸長が可能であり、中程度の鎖置換（strand displacing）能力を有する酵素が、続いて熱安定性ポリメラーゼによって増幅されるのに十分なＤＮＡを生成するために必要とされたと考えられる。
得られた増幅産物は、精製し、TOPO-TA（Invitrogen社）クローニングした。単離した変異体は、ＰＣＲによってスクリーニングし、配列決定に送った。配列決定の結果は、（フォワード合成）プライマー／鋳型ミスマッチが存在したことを示し、表２において示されるように２つの酵素の正確性の総計の第１の手段を提供した。
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［実施例１６］
熱安定性ＲＴへのプルーフリーディングの再導入
先に記載されたように、発明者らの「野生型」酵素は、ポリメラーゼのプルーフリーディング機能にとって重要である、３’→５’エキソヌクレアーゼドメインを不活性化する２つの変異（Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａ）を含む、４つの変異をその真の野生型に対して実際に有する。
５２１Ｌにも存在するＤ１４１Ａ及びＥ１４３変異は、発明者らが５２１Ｌ ＲＴ機能に対する効果を調査したように、復帰させて、それらの野生型に戻した。５２１Ｌ（ｅｘｏ＋）への５２１Ｌ変異は、先に記載されたようにｉＰＣＲによって実行した。
期待されるように、エキソヌクレアーゼ活性の再導入は、ＨＮＡに対する酵素の観察されたＲＴ活性を低下させた。しかしながら、それは、酵素のＲＮＡに対するＲＴ活性を改善した。実際、図２６において示されるように、５２１Ｌ（ｅｘｏ＋）は、ＲＮＡ鋳型からのＤＮＡ合成について５２１Ｌよりも優れていた。
図２１０：ＴＮＱによってＲＮＡとして合成されたｔＲＮＡ遺伝子に対して実行したＲＴ反応のＰＣＲ増幅。２つのＲＮＡ合成伸長時間を使用した（それぞれ、５’又は２０’の２サイクル）。ＲＮＡは、さらなる精製ステップ（RNeasy； Qiagen社）を用いて図２５において記載されるように精製した。ＲＴ反応は、５２１Ｌ及び５２１Ｌ（ｅｘｏ＋）を用いて実行した。反応は、１つのアウトネステッド（outnested）タグ（もとの鋳型中に存在しない）及びプライマーとしてフォワード合成において使用したプライマーを使用するＰＣＲによる増幅前にＥｘｏＳＡＰ−ＩＴを用いてもう一度処理した。反応は、３０サイクル実行した。
［実施例１７］
ＨＮＡ／ＲＮＡの進化性の逆転写のためのポリメラーゼのさらなる設計
入手可能な他のＰｏｌＢ構造、特に、ＲＢ６９の三元複合体（M. C. Franklin, J. Wang, T. A. Steitz, Cell 105, 657 (Jun 1, 2001)）の検査により、Ｉ５２１に等価な残基（Ｌ５９４）は、鋳型、プライマー、及びヌクレオチドがすべて活性部位に存在する場合に、触媒ステップで、Ｌ４０８に等価な残基（Ｌ４１５）から５Åよりもさらに遠いことを示唆した。
これは、ＳＣＡ「情報伝達」パラダイム内の２つの可能性を高めた：４０８及び５２１の間の情報伝達はポリメラーゼサイクルにおけるこのステップで生じない、又は、情報は未同定の中間残基によって伝えられる。他の明らかな可能性は、ＳＣＡフレームワークが有効でないということである。
それらの仮説を試験するために、５Åシェルの中心としてＩ５２１残基を使用してＩ５２１を同定した同じアプローチを採用した。多くの残基は、またＳＣＡを通して同定されたＩ５２１からその距離内で同定された。しかしながら、ＳＣＡを試験するために、発明者らは、ＳＣＡにおいて存在しなかった残基：Ｙ３８８、Ｇ５１７、及びＴ５４１に発明者らの探索を集中させた。
５２１に類似するスキャニングアプローチは、標的位置にＮＮＳを含有するプライマーを用いてｉＰＣＲによって生成した変異体ライブラリーと共に採用した。個々の変異体は、単離し、ＲＴ活性をスクリーニングするために使用した。
残基Ｇ５１７及びＴ５４１は、高度に保存された残基（９６％を超える同一性）であり、Ｔ５４１は、触媒ステップに関与する２つのアスパルテート残基が側面に位置する。期待されるように、それらの位置でのスクリーニングにより、野生型以上のＨＮＡ ＲＴ活性を有する酵素は得られなかった。
［実施例１８］
残りの残基（Ｙ３８８）は、非常に不十分に保存されており、これは、おそらくＳＣＡにおけるその不在を説明する。興味深いことには、残基３８８での多くの異なる側鎖は、ＨＮＡ ＲＴ活性を示した：（Ｖ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｔ）。これらは、それらの潜在能力及び５２１Ｌバックグラウンドにおけるそれらの潜在能力を評価するためにここでさらに特徴付ける。残基３８８は、ポリメラーゼ正確性及び処理能力に影響を与えることが報告されたモチーフ：ＹＸＧＧ／Ａのすぐ下流にある（V. Truniger, J. M. Lazaro, M. Salas, L. Blanco, EMBO J 15, 3430 (Jul 1, 1996)、K. Bohlke et al., Nucleic Acids Res 28, 3910 (Oct 15, 2000)）。
それらの結果を考慮して、ＲＴ活性における可能な改善を同定するためのＳＣＡの予測の使用に関して疑問が生じる。Ｙ３８８が方法の通例の実行によって同定されない偽陰性となり得るが、それは、また、より単純な仮説が効果を現すことも示唆するかもしれない：触媒部位から一定の距離の範囲内の残基（特に、Ｃモチーフ中央の三連構造ＤＴＤ）は、ポリメラーゼ機能、この場合、ＨＮＡ ＲＴ活性をわずかに改変するために変異させることができる。
実施例１４〜１８に対する参考文献：
1. S. W. Lockless, R. Ranganathan, Science 286, 295 (Oct 8, 1999).
2. G. M. Suel, S. W. Lockless, M. A. Wall, R. Ranganathan, Nat Struct Biol 10, 59 (Jan, 2003).
3. N. Halabi, O. Rivoire, S. Leibler, R. Ranganathan, Cell 138, 774 (Aug 21, 2009).
4. J. K. Ichida et al., J Am Chem Soc 127, 2802 (Mar 9, 2005).
5. Y. Brudno, M. E. Birnbaum, R. E. Kleiner, D. R. Liu, Nat Chem Biol 6, 148 (Feb, 2010).
6. C. Tuerk, L. Gold, Science 249, 505 (Aug 3, 1990).
7. J. K. Ichida, A. Horhota, K. Zou, L. W. McLaughlin, J. W. Szostak, Nucleic Acids Res 33, 5219 (2005).
8. M. C. Franklin, J. Wang, T. A. Steitz, Cell 105, 657 (Jun 1, 2001).
9. V. Truniger, J. M. Lazaro, M. Salas, L. Blanco, EMBO J 15, 3430 (Jul 1, 1996).
10. K. Bohlke et al., Nucleic Acids Res 28, 3910 (Oct 15, 2000).
［実施例１９］
ＤＮＡからＣｅＮＡへの、またＣｅＮＡからＤＮＡに戻る情報伝達
前の実施例に類似して、ＤＮＡ鋳型からの遺伝情報は、単離ポリメラーゼを使用してＣｅＮＡ分子に運ばれ、回復することができる。
フォワード合成（ＤＮＡ→ＣｅＮＡ）は、６Ｇ１２について先に記載されるものに非常に類似する条件でＣ７を用いて実行した。典型的な反応は、１μＭプライマー及び鋳型及び適したＣｅＮＴＰ濃度（３０〜５００μＭの各ヌクレオチド）を有するThermoPol緩衝剤（NEB社）中で実行した。反応は、Ｂ−ファミリー熱安定性ポリメラーゼと適合性の一連の温度で実行することができた。６Ｇ１２のように、Ｃ７もまた、ＤＮＡ及びＲＮＡプライマーの両方から非天然核酸合成を開始することができる（図２７）。
図２７：Ｃ７によるＣｅＮＡ合成（変性条件下でのＰＡＧＥ）。ＲＮＡ及びＤＮＡプライマーの両方は、ＤＮＡ鋳型の末端までＣ７及びＣｅＮＴＰを使用して伸長することができる（５７の組み込み）。
６Ｇ１２及びＨＮＡを用いる反応に類似して、多くのステップ（上記の対応する実施例において記載される）は、いかなるもとのＤＮＡ鋳型も持ち越されず、プライマー合成分子とあらゆる可能性のあるキャリーオーバーを区別することができることを確実にするために導入した。
５２１ＬがＲＮＡ及びＨＮＡに対するＲＴ活性を既に示したように、それは、ＣｅＮＡに対して使用されることとなる明白な候補であった。ＨＮＡのように、ＤＮアーゼ処理し、精製したフォワード合成は、図２８において示すＲＴ反応のための鋳型として使用した。
図１１８：Ｃ７合成ＣｅＮＡ鋳型を使用する５２１Ｌを用いるＤＮＡ合成。鋳型の末端への伸長は、Ｃ７合成鎖の両方について観察することができるが、ＲＮＡプライマーから生成したＣｅＮＡ鋳型は、ＤＮＡプライマーのものよりも明らかに優れていた。ＣｅＮＡ鋳型からの５２１ＬによるＤＮＡ合成は、ＲＮＡ、ＨＮＡ、及びＣｅＮＡ ＲＴとしての５２１Ｌの確認に成功した。典型的なＣｅＮＡ−ＲＴ ５２１Ｌ反応（５０μｌ）は、１×ThermoPol緩衝剤（NEB社）中、等濃度の標識プライマー及びＣｅＮＡ鋳型を使用して実行した。プライマー−鋳型複合体をアニールした後、５２１Ｌを追加し、反応は、６５℃で４時間の伸長ステップを用いて４サイクルＰＣＲとして実行した。
［実施例２０］
特異的で例示的な配列
本実施例における名称が配列表においてインデックスを付けたクローン名であり、アミノ酸を示すものではないことに注意されたい（例えば、Ｃ７＝クローンＣ７、位置７でのシステインを示すものではない）。
ＣｅＮＴＰ組み込みのために選択されるポリメラーゼ：
モチーフ１０Ａ：Ａ１、Ｃ１、Ｃ７、Ｄ４、Ｅ８、Ｇ３、Ｈ２、ＮＣ１１
モチーフ１２：Ｇ１１
ＨＮＴＰ組み込みのために選択されるポリメラーゼ：
モチーフ１０Ａ：６Ｇ１２、Ｅ３、Ｅ６、Ｈ６
モチーフ１２：Ｂ１１、Ｂ１２、Ｈ１２
発明者らの野生型：ＴｇｏＴ
真の野生型：Ｔｇｏ＿ｗｔ
［実施例２１］
ＨＮＡベースの遺伝子系
発明者らは、遺伝情報コード及び解読を検討しようとした。おおまかに、発明者らは、完全に非天然の構成成分から遺伝及び進化の両方を支援する人工的な遺伝子系を構築することができるかどうかについて考えた。最小限に、そのような系は、ＤＮＡ又はＲＮＡとのクロストークが可能な化学的フレームワーク（ＸＮＡ）、ＸＮＡ合成のための手段（つまり、ＤＮＡからＸＮＡに天然遺伝情報を運ぶためのＤＮＡ鋳型ＸＮＡポリメラーゼ）、及びＸＮＡを解読するための手段（つまりＸＮＡ逆転写酵素）を必要とする。発明者らは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方とクロスハイブリダイズするそれらの能力、それらのヘリックス形成特性、それらの化学的安定性、並びにヌクレオシド及びオリゴマーの両方としてのそれらの低毒性のために、望ましい物理化学的特性を有する可能性のあるＸＮＡとしてＨＮＡ（１，５アンヒドロヘキシトール核酸）及びＣｅＮＡ（シクロヘキセニル核酸）を同定した（図２９ａ）（Vandermeeren, M. et al. Biological activity of hexitol nucleic acids targeted at Ha-ras and intracellular adhesion molecule-1 mRNA. Biochem Pharmacol 59, 655-663, doi:S0006-2952(99)00367-6 [pii] (2000)）。しかしながら、ＨＮＡ（ｈＮＴＰ）及びＣｅＮＡ（ｃｅＮＴＰ）の両方の三リン酸は、市販で入手可能なポリメラーゼ（Vastmans, K., Froeyen, M., Kerremans, L., Pochet, S. & Herdewijn, P. Reverse transcriptase incorporation of 1,5-anhydrohexitol nucleotides. Nucleic Acids Res 29, 3154-3163 (2001)、Kempeneers, V., Renders, M., Froeyen, M. & Herdewijn, P. Investigation of the DNA-dependent cyclohexenyl nucleic acid polymerization and the cyclohexenyl nucleic acid-dependent DNA polymerization. Nucleic Acids Res 33, 3828-3836, doi:33/12/3828 [pii] 10.1093/nar/gki695 (2005)）及び遺伝子操作したポリメラーゼの発明者らの組織内のレパートリーの両方に対して、不十分な基質であることが証明された（図３８）。発明者らのスクリーニングは、ＨＮＡ／ＣｅＮＡポリメラーゼ進化のための最も有望な出発点として超好熱性古細菌サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｇｏ）から複製ポリメラーゼのバリアントを同定した（３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ）、ウラシル停止機能（Ｖ９３Ｑ）を欠き、Ａ４８５Ｌ（「Therminator」変異）を含む）。これ以降ＴｇｏＴと呼ばれるこのポリメラーゼは、様々な鋳型に対して６つの連続ｈＮＴＰ（及びｃｅＮＴＰ）まで重合することができる。
ｈＮＴＰ又はｃｅＮＴＰを利用する際にＴｇｏＴでさえ活性が不十分であることは、ポリメラーゼ遺伝子操作の確立された方法の適用を妨げた（Sweasy, J. B. & Loeb, L. A. Detection and characterization of mammalian DNA polymerase beta mutants by functional complementation in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 4626-4630 (1993)、Ghadessy, F. J., Ong, J. L. & Holliger, P. Directed evolution of polymerase function by compartmentalized self-replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 4552-4557 (2001)、Xia, G. et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 6597-6602, doi:10.1073/pnas.102577799 99/10/6597 [pii] (2002)）。そのため、発明者らは、進化性のＨＮＡ又はＣｅＮＡ合成の可能なポリメラーゼの発見を可能にするために、区画化自己タギング（ＣＳＴ）と呼ばれる新しい高度に感受性の選択戦略を開発した。ＣＳＴは、正のフィードバックループに基づき、それによって、ポリメラーゼは、準安定性のビオチン化オリゴヌクレオチドの伸長によってそれ自体のコード遺伝子にタグを付ける。伸長は、オリゴヌクレオチド−プラスミド複合体を安定化し、プラスミド当たり３〜６の組み込み事象の感受性を有する活性なポリメラーゼをコードするプラスミドの選択的な捕捉を可能にする（図２９ｂ）。重要なことには、ＣＳＴは、自己複製から選択を切り離し、したがって、シンテターゼの回収は、合成ポリマーについての逆転写酵素の利用可能性に依存性ではない。
多様化したＨＮＡ及び／又はＣｅＮＡポリメラーゼ活性の発見を促進するために、発明者らは、ＴｇｏＴの２２の別々の変異誘発ライブラリーを生成した。多様性は、系統発生多様性及び５〜１０％のランダム変異（保存位置に）を含み（図３７）、関連するＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼの三次複合体構造においてモデル化される新生ＤＮＡ鎖及びその水和殻の１０Å内に位置する短い配列モチーフ（１０〜２４アミノ酸）に集中した（Franklin, M. C., Wang, J. & Steitz, T. A. Structure of the replicating complex of a pol alpha family DNA polymerase. Cell 105, 657-667, doi:S0092-8674(01)00367-1 [pii] (2001)、Wang, J. et al. Crystal structure of a pol alpha family replication DNA polymerase from bacteriophage RB69. Cell 89, 1087-1099, doi:S0092-8674(00)80296-2 [pii] (1997)）。
発明者らは、最初に、２２のＴｇｏＴライブラリーのそれぞれに対してＣＳＴ選択を別々に実行し、ポリクローナルプライマー伸長による選択の前後にそれらのｈＮＴＰ及びｃｅＮＴＰ組み込み潜在能力をスコアリングした（示さず）。このスクリーニングは、ポリメラーゼ構造上にマッピングした場合（図２９ｃ）、ＨＮＡ／ＣｅＮＡポリメラーゼ活性のための重要な構造モチーフが、ポリメラーゼ活性部位ではなく、プライマー３’末端から２０Åを超える、ポリメラーゼｔｈｕｍｂドメインにおけるプライマー−鋳型二重鎖相互作用界面の周辺に位置したことを明らかにした（Ｐｏｌ II（３ＭＡＱ）及びＲＢ６９（１ＩＧ９）の両方において）。そのため、発明者らは、これらの領域にＣＳＴ選択をさらに集中した。発明者らは、ＣＳＴの２つのラウンドを実行し、伸長産物の固相捕捉及び伸長プライマーの６０ｆｍｏｌ未満の感受性を有する特異的な標識プローブに対するハイブリダイゼーションを介してのそれらの検出に基づいて、新しいハイスループットポリメラーゼ活性アッセイ（ＰＡＡ）を使用して、選択したポリメラーゼをスクリーニングした（図３３）。ラウンド２のクローンのＰＡＡスクリーニングは、ＣＳＴの急速な適応が、実質的なＨＮＡポリメラーゼ活性に対してポリメラーゼ集団を選択することを明らかにした。それらのうちの１つ、Ｐｏｌ６Ｇ１２（ＴｇｏＴ：Ｖ５８９Ａ、Ｅ６０９Ｋ、Ｉ６１０Ｍ、Ｋ６５９Ｑ、Ｅ６６４Ｑ、Ｑ６６５Ｐ、Ｒ６６８Ｋ、Ｄ６６９Ｑ、Ｋ６７１Ｈ、Ｋ６７４Ｒ、Ｔ６７６Ｒ、Ａ６８１Ｓ、Ｌ７０４Ｐ、Ｅ７３０Ｇ）は、著しい一般的なＨＮＡポリメラーゼ活性を示し、例えばｔＲＮＡ遺伝子などのような、意味のある遺伝情報をコードするのに十分に長いＨＮＡの進化性の及び定量的合成を可能にした。Ｐｏｌ６Ｇ１２を使用して、発明者らは、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ｔＲＮＡＡｌａ及びｔＲＮＡＰｈｅ並びに大腸菌ｔＲＮＡ ｓｕｐＥの複数のそのようなｔＨＮＡを容易に合成し（図３０ａ）、ＤＮＡ依存性のＨＮＡポリメラーゼとしてＰｏｌ６Ｇ１２を確立した。
天然核酸は、ＲＮＡの場合には逆転写酵素（ＲＴ）などのような鋳型ポリメラーゼの作用によって解読することができる。ＨＮＡポリマーを解読する手段がなければ、ＨＮＡ合成（遺伝子サイレンシングにおける適用のためにｓｓＨＮＡオリゴマーの大量生産のための可能性として有用であるが）は、ＤＮＡから運ばれる遺伝情報がＨＮＡにおいて閉じ込められたままとなるので、「行き止まり」となり、分析及び進化の両方を妨げる。しかしながら、利用可能なポリメラーゼのどれも、ＨＮＡ ＲＴ活性を示さなかった。そのため、発明者らは、親ポリメラーゼＴｇｏＴにおいて新規のＨＮＡ ＲＴを開発することに決めた。逆転写酵素活性（ＲＮＡ鋳型から）は、Ｌ４０９の変異に際して関連するＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼにおいて記載されている（Arezi, B., Hogrefe, H., Sorge, J. A. & Hansen, C. J. DNA Polymerase mutants with reverse transcriptase activity. United States of America patent US 2003/0228616 A1 (2003)）。発明者らは、それが、ＲＮＡ様Ａ型立体構造に対するＨＮＡの傾向によると仮定した。ＨＮＡ−ＲＴ活性は、ＲＮＡ ＲＴの構造の近くに見出されるかもしれない。しかしながら、ＴｇｏＴにおける等価なＬ４０８の変異は、弱いが検出可能なＨＮＡ−ＲＴ活性を有するバリアントのみが得られた。そのため、発明者らは、Ｌ４０８（ｐｏｌＢファミリーにおける高度に保存された残基）の構造的及び機能的な関連をより詳細に調査することに決めた。発明者らは、鋳型認識に関与する可能性のあるアロステリック相互作用ネットワークの一部として、Ｌ４０８の近くで、位置的な協調的変異（covariation）を発見するために、系統発生における配列変異の対での位置的な相関をスコアリングする統計アプローチである統計相関分析（ＳＣＡ）を使用した。ＳＣＡは、機能的なアミノ酸ネットワークの推測を可能にすることが示唆され、選択された変異に合理的説明を与え（Loakes, D., Gallego, J., Pinheiro, V. B., Kool, E. T. & Holliger, P. Evolving a polymerase for hydrophobic base analogues. J Am Chem Soc 131, 14827-14837, doi:10.1021/ja9039696 (2009)、Lockless, S. W. & Muir, T. W. Traceless protein splicing utilizing evolved split inteins. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 10999-11004, doi:0902964106 [pii] 10.1073/pnas.0902964106 (2009)）、タンパク質設計を支援する（Russ, W. P., Lowery, D. M., Mishra, P., Yaffe, M. B. & Ranganathan, R. Natural-like function in artificial WW domains. Nature 437, 579-583, doi:nature03990 [pii] 10.1038/nature03990 (2005)）ために以前に適用された。ＧｅｎＢａｎｋにおいて委託されたＰｏｌＢファミリー遺伝子内の配列変異は、高度すぎて、ＳＣＡのために十分に正確なアライメントを提供することができないことが分かった。そのため、発明者らは、ＳＣＡのための入力として構造的アライメントに基づいて、６７１の非冗長ＰｏｌＢ配列の手で生成したデータセットを編集した。ＳＣＡのヒットのランダム変異（Ｆ４０５、Ｙ５２０、Ｉ５２１、Ｌ５７５）及び４つのミニレパートリーのＰＡＡスクリーニングは、ＤＮＡへのｔＨＮＡ ｓｕｐＥ（上記参照）の逆転写によって実証されるように、一般的な進化性のＨＮＡ ＲＴとしてＴｇｏＴ：Ｉ５２１Ｌ（ＲＴ５２１）を同定した（図３０ｂ）。
ＨＮＡを合成し、逆転写する両方の能力は、発明者らがＤＮＡとＨＮＡ間の情報伝達の正確性を決定することを可能にした。発明者らは、Ｐｏｌ６Ｇ１２によってＨＮＡに変換され、ＲＴ５２１によってＤＮＡに戻る大腸菌ｔＲＮＡ ｓｕｐＥのクローニング及び配列決定によって、エラー率の総計（ＨＮＡ合成及びＨＮＡ逆転写の両方のエラー率の合計）を決定した。ＰＣＲの３０サイクルの寄与率を修正して、発明者らは、８．３×１０−３誤組み込み率の総計及び５．２×１０−３のｉｎｄｅｌ（挿入／欠失）率の総計を得た。個々のエラー率（同一のＲＮＡ鋳型の逆転写から推定するＲＴ５２１の正確性）のディコンボリューションにより、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ｒｅｆ）のエラー率と同等であるＰｏｌ６Ｇ１２について８×１０−３（及びＲＴ５２１について１．２×１０−３）の正確性が得られる（ＳＩ 図１）。変異ホットスポットの検査は、最初の５つの組み込み事象において変異の著しいクラスタリング（全体の３０％を超え、ｉｎｄｅｌの７０％を超える）を示す。誤りがちな開始からより高度な正確性の進化性のモードへのこの推移についての機構的な原因は、現在不明瞭であるが、ＲＮＡプライマー排除に際して、ＲＮＡ−ＤＮＡからＨＮＡ−ＤＮＡハイブリッドへの立体構造推移の効果を含んでいてもよい。そのため、完全に合成のＨＮＡプライマーの将来の使用は、エラー率を有意に低下させるかもしれない。
変異スペクトルの総計の検査は、塩基互変異性によりすべてのポリメラーゼについて一般に観察されるＡ／Ｇ、Ｃ／Ｔ塩基転位型変異を主に明らかにする。しかしながら、発明者らはまた、Ｐｏｌ６Ｇ１２による鋳型ｄＴの向かい側のｈＧ誤組み込みを示す、珍しく優位なＴ／Ｇ転換をも観察する（又はＲＴ５２１による鋳型ｈＣの向かい側のｄＡ）。
ともに、ＨＮＡポリメラーゼＰｏｌ６Ｇ１２及びＲＴ５２１ ＨＮＡ ＲＴは、ＨＮＡベースの遺伝に基づいて構築される合成遺伝子系を確立する。
［実施例２２］
ＨＮＡアプタマーに対する本発明の適用
次に、発明者らは、そのようなＨＮＡベースの合成遺伝子系もまたダーウィン的進化を支援し得るかどうかについて考えた。そのため、発明者らは、ＨＮＡアプタマーについてインビトロ選択実験を開始した。ＤＮＡ及びＨＮＡの間の並びに戻りの情報伝達の正確性の総計は、長さが１００ｎｔを超えるＨＮＡ配列の選択と容易に適合性であるはずである（Ichida, J. K., Horhota, A., Zou, K., McLaughlin, L. W. & Szostak, J. W. High fidelity TNA synthesis by Therminator polymerase. Nucleic Acids Res 33, 5219-5225, doi:33/16/5219 [pii] 10.1093/nar/gki840 (2005)）が、分子標的の特異的認識が可能な安定した三次元構造にフォールドするｓｓＨＮＡオリゴマーの能力は未知であった。そのため、発明者らは、最初に、ＤＮＡ及びＲＮＡアプタマーの両方が以前に単離されたＨＩＶ ＴＡＲ（トランス活性化応答）ＲＮＡである、十分に特徴付けられた核酸標的に対するＨＮＡアプタマーを選択した（Boiziau, C., Dausse, E., Yurchenko, L. & Toulme, J. J. DNA aptamers selected against the HIV-1 trans-activation-responsive RNA element form RNA-DNA kissing complexes. J Biol Chem 274, 12730-12737 (1999)、Duconge, F. & Toulme, J. J. In vitro selection identifies key determinants for loop-loop interactions: RNA aptamers selective for the TAR RNA element of HIV-1. RNA 5, 1605-1614 (1999)）。ＨＮＡ ＴＡＲバインダーは容易に進化したが、ＲＮＡ又はＤＮＡアプタマーと異なり、「ｋｉｓｓｉｎｇ ｌｏｏｐ」相互作用を介してＴＡＲに結合するように思われなかった。ＨＮＡ抗ＴＡＲアプタマーの相互作用のマッピングは、ＴＡＲステム及び非対称性バルジを標的にする又は結合のためにループ及びバルジの両方を必要とする２つのクレードを明らかにした（図３２）。以前に最適化されたＲＮＡアプタマーよりもわずかに低い親和性であるにもかかわらず（たいていはゆっくりとしたｋｏｎ速度による）、ＨＮＡ抗ＴＡＲアプタマーは、ＴＡＲ ＲＮＡとのＨＩＶ ＴＡＴ（転写のトランス活性化因子）タンパク質の相互作用の阻害でより有効であることが証明された。
本明細書において記載される合成遺伝子系は、探索のための、以前には到達できなかった新しい配列空間への合成ルートを提供する。本発明は、この「ＨＮＡ空間」が新しい表現型と共にどのように占めるかを調査するために使用されてもよく、少なくとも特異的リガンド結合を示すＨＮＡアプタマーは容易に発見されるように思われる。選択が広範囲の標的に広く適用される場合、そのようなＨＮＡアプタマーは、ヌクレオシド及びオリゴマーの両方として頑健な化学的安定性及び低毒性を提供する非同起源の化学的構造により大きな生物工学的及び治療用の潜在能力を有していてもよい。
そのような合成遺伝子系は、診断及び治療効果における適用のための特注の化学的性質を有する、新しい受容体及び触媒の豊富な供給源をもたらすはずである。
実施例２１〜２２についての図面の説明
図２９：人工的な生体高分子の合成のためのポリメラーゼの定向進化。（ａ）デオキシリボース（ＤＮＡ）、１，５アンヒドロヘキシトール（ＨＮＡ）、及びシクロヘキセニル（ＣｅＮＡ）核酸の構造。（ｂ）区画化自己タギング（ＣＳＴ）。油中水型エマルションは、ポリメラーゼ及びそれらの遺伝子型が、標識プライマー及び修飾ヌクレオチドを含有する反応において単離されることを可能にする。修飾ヌクレオチドを組み込むことができるポリメラーゼによるプライマーの伸長は、プライマー結合を安定化し、それら自体のコードプラスミドにタグを付け、それらの遺伝情報が回収されるのを可能にする。（ｃ）野生型（１ＴＧＯ）及び関連する大腸菌ｐｏｌ II（３ＭＡＱ）の三元複合体にマッピングした、ランク付けしたライブラリーポリクローナル活性を示すヒートマップ。ポリメラーゼｔｈｕｍｂを標的にするライブラリーは、選択の単一の一ラウンド後に最も高度な基本の活性及び最良の改善を示した。
図３０：ＨＮＡシンテターゼ（Ｐｏｌ６Ｇ１２）及び一本鎖ＨＮＡ特性。（ａ）構造的に等価な大腸菌ｐｏｌ II（３ＭＡＱ）残基にマッピングされたＰｏｌ６Ｇ１２変異。赤色で示すＰｏｌ６Ｇ１２において同定された１４の変異のうちの１１は、ｐｏｌ II三元複合体にマッピングすることができ、それらのほぼ半分は、緑色で示す新生ＨＮＡ鎖の近くにクラスタリングする。（ｂ）精製野生型酵素は、６つの組み込み以上にＨＮＡをあまり合成しないが、精製Ｐｏｌ６Ｇ１２は、示される大腸菌アンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子などのようなＨＮＡを定量的に合成することができる。（ｃ）一本鎖ＨＮＡは試験したすべてのヌクレアーゼに不応性であり、酸性環境においてＤＮＡよりも実質的に抵抗性である（ｄ）。それらの条件下でのＨＮＡの半減期（ｔ１／２ＨＮＡ＝３４７分、Ｒ２＝０．８９９）は、ＤＮＡ（ｔ１／２ＤＮＡ＝４３．３分、Ｒ２＝０．９７５）よりもほぼ８倍高度である。
図３１ ＨＮＡ逆転写酵素及びＨＮＡ遺伝子系の正確性。（ａ）ＲＴ５２１は、６Ｇ１２によって合成された大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子（追加のタグを有する）などのようなｓｓＨＮＡ鋳型からＤＮＡを定量的に合成することができる（ＮＡ：ＲＴのみの対照）。（ｂ）Ｔｇｏ Ｉ５２１に対する構造的に等価な残基を大腸菌ｐｏｌ IIにおいて示す（赤色）。三元複合体において、それは、ポリメラーゼの保存活性部位モチーフと密接に接触している（Ａ−モチーフはオレンジ色；Ｃ−モチーフは青色）。新生ＤＮＡ鎖（紫色）及びＨＮＡ鋳型（緑色）を示す。（ｃ）６Ｇ１２によってＤＮＡからＨＮＡに運ばれた情報は、塩基当たり１２．２×１０−３のエラー率の総計で、ＲＴ５２１によって復旧させ、ＤＮＡに戻すことができる（ＮＰ：プライマーを用いないで実行したＨＮＡ合成；ＮＴ：鋳型なしのＰＣＲ対照）。示すエラープロファイルは、期待されるＨＮＡ鎖を指す。より詳細については、補助情報を参照されたい。
図３２：ＨＮＡアプタマー特異性及びＨＩＶ−ＴＡＴ結合阻害。（ａ）ＴＡＲ及び修飾ＴＡＲ ＲＮＡ標的に結合するアプタマーのＥＬＩＳＡ検出。Ｒ０６は、ＴＡＲに対して報告されたＲＮＡアプタマーであり、ＨＮＡ−ＧＡは、以前に報告されたＨＮＡアプタマーである。Ｔ５Ｓ８−７及びＴ４Ｓ８−１４は、以前に報告されたミニＴＡＲ（標的Ａ）に対する結合について選択された（Kolb, G. et al. Hexitol nucleic acid-containing aptamers are efficient ligands of HIV-1 TAR RNA. Biochemistry 44, 2926-2933, doi:10.1021/bi048393s (2005)）。ＬＴＳ１９−７は、ＴＡＲのより長いバージョンに対して選択された（標的Ｈ）。標的（オレンジ色）の異なる領域のスクランブル又はそれらのすべての除去（標的Ｆ及びＧ）は、Ｔ５Ｓ８−７が、完全な非修飾標的のみに結合する真のアプタマーであることを確認する。（ｂ）ＴＡＴアプタマーミニＴＡＲ結合競合アッセイ。固定ミニＴＡＲに対するＴＡＴ結合の免疫検出は、ＴＡＴ結合を阻害するのに必要とされるアプタマー濃度を推定するために使用した（ＩＣ５０）。ＨＮＡアプタマーＴ５Ｓ８−７（ＩＣ５０＝１．９ｎＭ（ＣＩ９５％ １．３〜２．８ｎＭ））は、もとのＲＮＡ Ｒ０６（ＩＣ５０＝３１３ｎＭ（ＣＩ９５％ １６６〜６７５ｎＭ））よりも１００倍の低い濃度でＴＡＴにとって代わることができる。
図３３ ＨＮＡ遺伝子系のエラースペクトル及びエラー率。（ａ）もとの鋳型として大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子を使用する一連のＨＮＡ合成及び逆転写の後に１９７４の配列決定塩基から照合された誤組み込み、欠失（塗りつぶしの三角形）、及び挿入（白抜きの三角形）。ＲＮＡ合成プライマーは青色で示し（アウトネスティングタグは太字上付き文字で示し、合成ミスマッチは赤色で示す）、エラーは、ＨＮＡ合成鎖にマッピングする。ｈＮＴＰ組み込みの数を示す。逆転写プライマーは、緑色で示す（ＲＴミスマッチは赤色で、アウトネスティングタグは太字で示す）。（ｂ）ＨＮＡ及びＤＮＡ合成についてＰｏｌ６Ｇ１２及びＲＴ５２１について決定されたエラー率の総計及び個々のエラー率。モード詳細については、副教材及び方法を参照されたい。
図３４：ＤＮＡ〜ＨＮＡ〜ＤＮＡ：使用した方法の図。開始ＤＮＡ鋳型は、ＨＮＡのプライマー非依存性の合成を最小限にするために短いポリｄＡテールを含有したが、合成プライマーは、プライマー依存性の産物が同定されるのを可能にするために鋳型に対してアウトネスティングタグ及びミスマッチの両方を含有した。フォワード合成は、物質及び方法において記載されるようにＰｏｌ６Ｇ１２を用いて実行し、合成なしの対照（ヌクレオチド又は酵素なし）及びプライマーなしの対照（プライマー非依存性のＨＮＡ合成が進行するのを可能にする）を含んだ。ＨＮＡ合成後に、鋳型はTurbo ＤＮａｓｅＩを用いて除去し、反応はＤＮＡ断片及び非伸長プライマーを除去するために精製した。ＲＴ５２１を用いて実行したＲＴ反応は、次いで、さらなるミスマッチ及びアウトネスティングタグを含有するＤＮＡプライマーにより設定した。反応はＲＴ後に精製し、断片はＰＣＲによって増幅した（プライマーとしてアウトネスティングタグを使用）。アウトネスティングタグは、フォワード及びリバース合成アウトネストの両方を含有するＤＮＡ断片のみ、つまり、成功したＲＴに続いて成功したプライマー依存性の合成によって生成された断片が、増幅されることを保証する。次いで、クローニングされた断片は、得られたＤＮＡがＨＮＡ中間を介してもとのＤＮＡ鋳型に由来するに違いないことを確実にするために、２つの導入されたミスマッチについてチェックする（図３１ｃにおいて示されるように）。
図３５：ＰｏｌＢ及び５２１ネットワークの統計カップリング分析（ＳＣＡ）。（ａ）６７１の非冗長Ｂ−ファミリーポリメラーゼの手で生成した配列アライメントは、ポリメラーゼ内のアロステリックネットワークを同定するための対の協調的残基を同定するために、ＳＣＡにおいて使用した。得られた協調的変異値の分布は、対数正規分布（μ＝−１．７４９、σ＝０．８０８）に適合させた。第９９パーセンタイル（ｋＴ＊＞１．９６４）以上の値は、有意であると考えられ、ＰｏｌＢアロステリックネットワークを確立するために使用した。高度に有意な残基（ｋＴ＊＞２．４）は、ＳＣＡ（シアン）において含むことができなかった保存残基と一緒に、Ｔｇｏ（１ＴＧＯ）ａｐｏ構造（オレンジ色）上にマッピングして示す。（ｂ）関連する大腸菌ｐｏｌ II（３ＭＡＱ）において示すＳＣＡの結果−ＳＣＡ及び保存残基は、（ａ）のように示し、プライマー鎖は緑色で、鋳型は紫色で示す。（ｃ）使用したアライメントにおいてＩ５２１と協調的変異することが同定された残基の階層クラスタリング。
図３６：ポリメラーゼ活性ＥＬＩＳＡ（ＰＡＥ）。（ａ）ＰＡＥの原理。プライマー伸長反応は、ストレプトアビジンでコーティングした固体表面上に伸長産物を固定するために使用することができるビオチン化プライマーを使用して実行する。もとの鋳型は、熱又はアルカリ処理によって除去し、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−標識プローブは、伸長産物に結合する。次いで、ＤＩＧ標識は、伸長の免疫検出において使用する。（ｂ）小さく、単一の残基で、部分的な適用範囲のライブラリー（ＮＷＣとしてコード）からの個々の分離株は、化学的に合成されたＨＮＡ鋳型に対するＤＮＡ合成のために、ＰＡＥを用いてスクリーニングした。残基４０８及びその空間的近辺（４０５、５２０、５２１、及び５７５）における有意なＳＣＡ残基は、残基５２１及び５７５において同定された有意な活性を用いて最初に調査した。あらかじめ伸長した対照は、マゼンタ（＋７）及び緑色（＋９）並びに野生型ＴｇｏＴ（赤色）で示す。いくつかのＨＮＡ ＲＴ活性は、ＴｇｏＴ並びに５２１及び５７５変異体を用いて観察されるが、５２１だけが、ＨＮＡのより長いストレッチに対してＤＮＡを合成することに成功する。
図３７：変異誘発ライブラリー。多様性について標的にした残基は、Ｔｇｏ（ａ）及び大腸菌ｐｏｌ II（ｂ）主鎖上に青色（表面表示）で示す（白色の図）。交互の色の個々のライブラリーをＴｇｏＴ配列（ｃ）に対して示す。ポリメラーゼｐａｌｍ（モチーフ４、Ａ−、Ａ、Ａ＋、６−、６＋、Ｃ、Ｃ＋、及び７）、ｆｉｎｇｅｒ（モチーフ５、Ｂ−、Ｂ）、並びにｔｈｕｍｂ（モチーフ８、９、１０Ａ、１０Ｂ、１１、及び１２）サブドメインに加えた、エキソヌクレアーゼドメイン（モチーフ１及び２）並びにヘリックス間ドメイン（モチーフ３及び４）のライブラリー標的部分。
図３８：非天然ヌクレオチドの基本の組み込み。きれいにしたポリメラーゼ溶解物は、入手可能な「野生型」、キメラ、及び遺伝子操作ポリメラーゼによってＴｅｍｐＴ鋳型（TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA）に対するＣｅＡＴＰの組み込みを試験するために使用した。「野生型」ポリメラーゼは、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）（Ｔｇｏ）、サーモコッカス種９°Ｎ−７（９°Ｎ）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）（Ｖｅｎｔ）、及びパイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）（Ｐｆｕ）は、ウラシル停止（Ｖ９３Ｑ又は等価物）及びエキソヌクレアーゼ（Ｄ１４１ＡＥ１４３Ａ）活性を欠く。「Therminator」変異（Ａ４８５Ｌ）（Gardner, A. F. & Jack, W. E. Determinants of nucleotide sugar recognition in an archaeon DNA polymerase. Nucleic Acids Research 27, 2545-2553 (1999)）を含むバリアントはＴ（例えばＴｇｏＴ）と標識し、蛍光標識ヌクレオチドの組み込みを改善することが決定された変異を有するバリアント（Ramsay, N. et al. CyDNA: synthesis and replication of highly Cy-Dye substituted DNA by an evolved polymerase. J Am Chem Soc 132, 5096-5104, doi:10.1021/ja909180c (2010)）はＥ１０と標識する。キメラは、エキソヌクレアーゼポリメラーゼとして示す（つまり、Ｐｆｕ−Ｔｇｏは、Ｔｇｏのポリメラーゼドメインに対するＰｆｕのエキソヌクレアーゼドメインのキメラである）。
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［実施例２３］
ＨＮＡ分子に結合するＤＮＡプライマーの改善
塩基組成、特にプリン及びピリミジンバイアスは、ＨＮＡ／ＤＮＡ融解温度に強力な影響を有する（Boudou, V., et al., Base pairing of anhydrohexitol nucleosides with 2,6-diaminopurine, 5-methylcytosine and uracil asbase moiety. Nucleic Acids Res, 1999. 27(6): p.1450-6）。これらのバイアスを利用することによって、ＨＮＡに結合することが可能なＤＮＡプライマーを設計し、５２１型ポリメラーゼによって伸長が成功するようにすることは可能である（ＨＮＡ ＲＴ）。
最初に、３つのＤＮＡプライマー配列を、知られているＨＮＡ分子（ＤＮＡ鋳型から合成されることとなる）に対して試験した（Ｔｅｓｔｂｉｎｄ３）：
Figure 0005997691
ＮＡＰｆｄ（以前に記載；結合部位は下線を引いて上記に示す）２’ＯＭｅ ＲＮＡプライマーは、３つの試験プローブすべてに対する結合部位を含むＨＮＡ分子を合成するために使用する。合成されたＨＮＡは、TURBO ＤＮアーゼ合成反応をＰＡＧＥ精製することによって単離し（記載されるように）、プライマー結合実験は、図３９に示されるように、様々な条件において実行した。
図３９：精製ＨＮＡ分子に結合するＤＮＡプライマー。ｒＲＥＶｆｄは、ＨＮＡ合成において使用されるｆｄタグに相補的なＲＮＡプライマーであり、プライマー結合についての内部標準として使用した。１ｐｍｏｌのＨＮＡを、１ｐｍｏｌのＤＮＡプライマー結合を試験するために使用した。非効率的であったが、プライマーは、ＨＮＡ、特にＴｅｓｔ７及びＴｅｓｔ８に明らかに結合することができる。さらなる作業をＴｅｓｔ７に集中した。
組成にバイアスがかかったＨＮＡ分子にＤＮＡプライマーが結合することができるということを考慮して、発明者は、同様の結果を有するバイアスがない鋳型（ＴｅｍｐＮｐｕｒｉｎｅ： CCTAGTTCTTCCTCTTCCCGATGCTGGACCAGATAAGCACTTAGCCACGTAGTGCTGTTCGGTAATCGATCTGGCAAACGCTAATAAGG）に対するｔｅｓｔ７について実験を繰り返した。ＨＮＡに結合するＤＮＡプライマーは、ＤＮＡ上の５’オーバーハングによって影響されなかった。プライマー結合を得るのに成功したので、発明者らは、原理証明としてプライマー依存性のＲＴを実行した。
図４０：プライマー依存性のＨＮＡ ＲＴ。ＦＩＴＣ標識ＨＮＡ（赤色）は、Ｃｙ５標識Ｔｅｓｔ７プライマー（緑色）を使用して、ＲＴ５２１を用いて実行したＲＴについての鋳型として使用した。完全長産物は、６５℃で４時間の伸長後に、使用したＲＴ５２１の両方の濃度について観察することができた。これらの結果は、ＲＴ反応から、続くＰＣＲによって確証された。適切なＲＴ産物を得たので、発明者らは、知られている配列（ＴｅｍｐＮｐｕｒｉｎｅ）の分子における系の検出限界を調査した。ＲＴ産物（２倍のｏｕｔｎｅｓｔアプローチを使用して）のＰＣＲ検出は、０．２５ｐｍｏｌ ＨＮＡを用いて実行されたＲＴまでＲＴ５２１がＨＮＡ ＲＴ産物を検出するかもしれないことを示唆した。さらに、他のヌクレオチドの化学的性質（例えばＬＮＡ、２’ＯＭｅ−ＲＮＡ）を有するＤＮＡプライマーを加えることを含むプライマーの最適化を実行している。しかしながら、代替物は、ＲＴ酵素自体をさらに改善するものであった。
［実施例２４］
ＨＮＡ／ＲＮＡの進化性の逆転写のためのポリメラーゼのさらなる設計
ＲＮＡポリメラーゼの設計との関連において記載されるＥ６６４Ｋ変異は、プライマー鋳型複合体に対するポリメラーゼの親和性を増加させるために決定した。ＨＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが実質的にねじれたヘリックスを起こすと期待されるので、この鋳型に対するＲＴ５２１の親和性を増加させることはＨＮＡ逆転写を改善するであろう。
ｉＰＣＲは、ＲＴ５２１関連でＥ６６４Ｋ変異を導入するために使用し、両方の酵素は、上記に記載されるＴｅｍｐＮｐｕｒｉｎｅ系を使用して、ＨＮＡ ＲＴ−ＰＣＲについて並行して試験した。
図４１：ＲＴ５２１及びＲＴ５２１Ｋ（ＲＴ５２１＋Ｅ６６４Ｋ変異）を比較するＨＮＡ ＲＴ−ＰＣＲ。ＲＴ−ＰＣＲの感受性は、１ｐｍｏｌ及び続く２倍希釈系列の反応において入力ＨＮＡ鋳型を滴定することによって決定した。ＨＮＡについては、ＲＴ５２１Ｋは、少なくとも６０倍改善された検出限界を得るように思われる。対照は、ＰＣＲについての鋳型なし（ＮＴ）、ＲＴについての鋳型なし（ＮＴＲＴ）、及びＲＴステップを用いないで実行した反応（ＮｏＲＴ）を含んだ。
検出の感受性を増加させるためにインネステッド（in-nested）ＰＣＲを使用して類似する実験を実行することにより、５２１Ｋを用いて実行したＲＴステップへの入力ＨＮＡの９アトモルまでの単一のＨＮＡ配列の明らかな増幅を得た。これは、検出限界であると期待されず、さらなる反応最適化がさらに感受性を改善することが期待されるであろう。
重要なことには、Ｔｅｓｔ７は持ち運び可能であり、図４２において示されるＡｐＬｉｂ５（CCCTAGTTCTTCCTCTTCCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGAACAGCACTACCTtTTGGCAAACGCTAATAAGGGGTCCTAAAAAAAAA）などのような縮重ライブラリーを含む他の鋳型に対して使用することができる。
図１２２：実施例２において記載される同じ二重のアウトネストアプローチを使用する縮重Ｎ４０ライブラリーからのＨＮＡ ＲＴ−ＰＣＲ。フォワード合成は、Ａｐｌｉｂ５鋳型に対してＮＡＰｆｄ ２’ＯＭｅを用いて実行し、ＲＴは、１ｐｍｏｌ ＨＮＡに対してＬＭＢ３＋Ｔｅｓｔ７プライマーを用いて実行した。続くＰＣＲは、２５サイクルについてＮＡＰ及びＬＭＢ３＋を用いて実行した。鋳型なしの対照をＰＣＲについて含み（ＮＴ）、ＲＴなしの対照もまた、実行した（−）。
［実施例２５］
ＲＮＡポリメラーゼ
ＤＮＡポリメラーゼ基質特異性は、ゲノムの完全性にとって決定的であり、現在のパラダイムは、立体的ゲート変異によって例示されるように、それが活性部位によってもっぱら決定されるということである。そのような変異は、数桁、すべてのファミリーからのＤＮＡポリメラーゼによるＮＴＰの組み込みを増加させるが、進化性のＲＮＡポリメラーゼをもたらさない。実際、ほとんどの修飾ＤＮＡポリメラーゼは、印象的な組み込み効率にもかかわらず、６〜７のＮＴＰ組み込み後に失速する。Ｂ−ファミリーポリメラーゼ（Ｔｇｏ）のｔｈｕｍｂドメインへの集中を通して、発明者らは、この伸長のブロックを軽減する新生鎖のすぐ近くの点変異を同定した：「第２のゲート」。古典的な立体的ゲート変異（Ｙ４０９Ｇ）と組み合わせたＴｇｏ（Ｅ６６４Ｋ）の第２のゲートの変異は、ＴＧＫ：ＤＮＡ足場から遺伝子操作された第１のプライマー依存性熱安定性ＲＮＡポリメラーゼをもたらす。ＴＧＫは、１分未満でｔＲＮＡ遺伝子を合成することができ、わずか１時間で１．７ｋｂルシフェラーゼ遺伝子を合成することができる。
さらに、Ｅ６６４Ｋ変異は、立体的ゲート変異の非存在下においてでさえ損傷乗り越え合成を可能にする。「第２のゲート」は、したがって、ＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼへの進化論的な経路において決定的な欠けているステップを特定し、活性部位に対して遠位の、ポリメラーゼ基質特異性の新しい合成後決定因子を定義し、複製正確性及びポリメラーゼ基質拡張の両方に関する研究においてさらなる調査に値する領域としてｔｈｕｍｂドメインを確立する。
ＤＮＡポリメラーゼ基質特異性は、ゲノム安定性及びバイオテクノロジーにおける適用にとって最も重要であり、一般に、ポリメラーゼ活性部位の幾何学的配置及び化学的性質によってもっぱら決定されることが想定される。しかし、ヌクレオチド基質の高度に効率的な組み込みは、ＤＮＡポリメラーゼの活性部位における「立体的ゲート」残基の変異によって例示されるように、必ずしも核酸ポリマーの進化性の合成をもたらさない。そのような変異は、数桁、ＮＴＰ組み込みの触媒効率を増加させるが、結果として生じるポリメラーゼはなお、進化性のＲＮＡ合成ができないままである。本明細書で、発明者らは、プライマー３’末端から２５Åのポリメラーゼｔｈｕｍｂドメインに位置する、決定的な二次特異性決定因子（「第２のゲート」）の発見を記載する。Ｔｇｏ、Ｔ．ゴルゴナリウスからの複製ＤＮＡポリメラーゼにおけるこの第２のゲート残基（Ｅ６６４Ｋ）の変異は、古典的な立体的ゲート変異（Ｙ４０９Ｇ）と一緒に、進化性、熱安定性、プライマー依存性ＲＮＡポリメラーゼを得、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに匹敵する正確性で、長さが１．７ｋｂまでのタンパク質コードｍＲＮＡを合成することができる。「第２のゲート」は、ＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼへの進化論的な経路において決定的な欠けているステップを特定し、活性部位に対して遠位の、ポリメラーゼ基質特異性の新しい合成後決定因子を定義する。
ポリメラーゼ基質特異性を理解するにあたっての著しい進歩にもかかわらず、ＤＮＡポリメラーゼ足場からの進化性のＲＮＡポリメラーゼの遺伝子操作は、わかりにくいことが証明されている。ＤＮＡポリメラーゼの活性部位における「立体的ゲート」残基の変異は、ＮＴＰ組み込みの触媒効率を増加させるが、結果として生じるポリメラーゼは、進化性のＲＮＡ合成ができないままである。本明細書で、発明者らは、プライマー３’末端から２５Åのポリメラーゼｔｈｕｍｂドメインに位置する、決定的な二次決定因子（「第２のゲート」）の発見を記載する。Ｔｇｏ、Ｔ．ゴルゴナリウスからの複製ＤＮＡポリメラーゼにおけるこの第２のゲート残基（Ｅ６６４Ｋ）の変異は、古典的な立体的ゲート変異（Ｙ４０９Ｇ）と一緒に、第１の進化性、熱安定性、プライマー依存性ＲＮＡポリメラーゼを得、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに匹敵する正確性で、長さが１．７ｋｂまでのタンパク質コードｍＲＮＡを合成することができる。この「第２のゲート」は、ＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼへの進化論的な経路において決定的な欠けているステップを特定し、活性部位に対して遠位の、ポリメラーゼ基質特異性の新しい合成後決定因子を定義する。
ＤＮＡポリメラーゼは、ゲノムの正確な複製及び維持を通して遺伝情報の伝達を可能にし、したがって、すべての生物に最も重要である。ゲノム複製は、ポリメラーゼ正確性を確実にし、ゲノムの中への組み込みから非同起源の及び／又は損傷を受けたヌクレオチドを除くために、高度な基質認識メカニズムを必要とする。ヌクレオチド化学的性質に加えた詳細な構造的検査は、ポリメラーゼ活性部位が非同起源のヌクレオチドの化学的性質及び幾何学的配置から同起源のものをどのように区別し得るかについての分子メカニズムを明らかにし始めた。ゲノムの中への組み込みからのリボヌクレオチドの排除が、ＤＮＡベースのゲノムの完全性にとって特に重要である。リボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）は、リボフラノース環上の２’−ヒドロキシル（−ＯＨ）の存在によってのみデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）と異なり、同起源のｄＮＴＰの１００倍まで上回る濃度で細胞中に存在する。ＤＮＡポリメラーゼは、それらの活性部位及びよってゲノムからＮＴＰを除くが、ゲノム安定性及び修復についての有意な関連と共に、組み込みが検出可能な程度まで生じることが最近示された。この問題は、３’ホスホジエステル結合に対するリボースの近接する２’ＯＨの求核攻撃による、ＲＮＡの自発的な分解を加速することによって高温がゲノム不安定性をさらに増加させるので、好熱生物にとってさらに深刻である。
したがって、ＤＮＡポリメラーゼは、新生鎖の中にＮＴＰ組み込みを防ぐ例外的に有効なメカニズムを使用する；単一残基、「立体的ゲート」は、入って来るヌクレオチドの２’位の化学的性質のストリンジェントな立体的な制御を行う。立体的ゲート残基は、すべての複製（Evans, R.J., et al., Structure of PolC reveals unique DNA binding and fidelity determinants. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(52): p. 20695-700、Bonnin, A., et al., A single tyrosine prevents insertion of ribonucleotides in the eukaryotic-type phi29 DNA polymerase. J Mol Biol, 1999. 290(1): p. 241-51、Yang, G., et al., A conserved Tyr residue is required for sugar selectivity in a Pol alpha DNA polymerase. Biochemistry, 2002. 41(32): p. 10256-61、Gardner, A.F. and W.E. Jack, Determinants of nucleotide sugar recognition in an archaeon DNA polymerase. Nucleic Acids Res, 1999. 27(12): p. 2545-53）（ｐｏｌＢ、ｐｏｌＣ）及び修復（Astatke, M., et al., A single side chain prevents Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) from incorporating ribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998. 95(7): p. 3402-7、DeLucia, A.M., N.D. Grindley, and C.M. Joyce, An error-prone family Y DNA polymerase (DinB homolog from Sulfolobus solfataricus) uses a 'steric gate' residue for discrimination against ribonucleotides. Nucleic Acids Res, 2003. 31(14): p. 4129-37、Jarosz, D.F., et al., A single amino acid governs enhanced activity of DinB DNA polymerases on damaged templates. Nature, 2006. 439(7073): p. 225-8、Brown, J.A., et al., A novel mechanism of sugar selection utilized by a human X-family DNA polymerase. J Mol Biol, 2010. 395(2): p. 282-90）（ｐｏｌＡ、ｐｏｌＹ、ｐｏｌＸ−Ｐａｌ Ｍｕの可能な例外を有する（Ruiz, J.F., et al., Lack of sugar discrimination by human Pol mu requires a single glycine residue. Nucleic Acids Res, 2003. 31(15): p. 4441-9））ポリメラーゼファミリー並びに逆転写酵素（Gao, G., et al., Conferring RNA polymerase activity to a DNA polymerase: a single residue in reverse transcriptase controls substrate selection. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997. 94(2): p. 407-11、Cases-Gonzalez, C.E., M. Gutierrez-Rivas, and L. Menendez-Arias, Coupling ribose selection to fidelity of DNA synthesis. The role of Tyr-115 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. J Biol Chem, 2000. 275(26): p. 19759-67、Entin-Meer, M., Z. Sevilya, and A. Hizi, The role of phenylalanine-119 of the reverse transcriptase of mouse mammary tumour virus in DNA synthesis, ribose selection and drug resistance. Biochem J, 2002. 367(Pt 2): p. 381-91、Boyer, P.L., et al., Analysis of mutations at positions 115 and 116 in the dNTP binding site of HIV-1 reverse transcriptase. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(7): p. 3056-61）（ＲＴ、表Ｓ１ 図５２）において同定されている。したがって、それは、生物の３つのドメインすべてからすべてのポリメラーゼにおいて見出され、その普遍的な重要性を証明する。最初にモロニーマウス白血病ウイルスＲＴの構造的検査によって発見され（Gao, G., et al., Conferring RNA polymerase activity to a DNA polymerase: a single residue in reverse transcriptase controls substrate selection. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997. 94(2): p. 407-11）、大腸菌（ｐｏｌＡ−ファミリーポリメラーゼ）由来のＤＮＡポリメラーゼＩにおいてより徹底的に調査されたように（Astatke, M., N.D. Grindley, and C.M. Joyce, How E. coli DNA polymerase I (Klenow fragment) distinguishes between deoxy- and dideoxynucleotides. J Mol Biol, 1998. 278(1): p. 147-65）、このメカニズムは、非常に有効であり、より小さな側鎖を有するアミノ酸残基に立体的ゲートを変異させることは、数桁、ＮＴＰ組み込みに対する識別を低下させることができる（Bonnin, A., et al., A single tyrosine prevents insertion of ribonucleotides in the eukaryotic-type phi29 DNA polymerase. J Mol Biol, 1999. 290(1): p. 241-51、Yang, G., et al., A conserved Tyr residue is required for sugar selectivity in a Pol alpha DNA polymerase. Biochemistry, 2002. 41(32): p. 10256-61、Gardner, A.F. and W.E. Jack, Determinants of nucleotide sugar recognition in an archaeon DNA polymerase. Nucleic Acids Res, 1999. 27(12): p. 2545-53、Astatke, M., et al., A single side chain prevents Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) from incorporating ribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998. 95(7): p. 3402-7、DeLucia, A.M., N.D. Grindley, and C.M. Joyce, An error-prone family Y DNA polymerase (DinB homolog from Sulfolobus solfataricus) uses a 'steric gate' residue for discrimination against ribonucleotides. Nucleic Acids Res, 2003. 31(14): p. 4129-37、Jarosz, D.F., et al., A single amino acid governs enhanced activity of DinB DNA polymerases on damaged templates. Nature, 2006. 439(7073): p. 225-8、Brown, J.A., et al., A novel mechanism of sugar selection utilized by a human X-family DNA polymerase. J Mol Biol, 2010. 395(2): p. 282-90、Gao, G., et al., Conferring RNA polymerase activity to a DNA polymerase: a single residue in reverse transcriptase controls substrate selection. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997. 94(2): p. 407-11、Cases-Gonzalez, C.E., M. Gutierrez-Rivas, and L. Menendez-Arias, Coupling ribose selection to fidelity of DNA synthesis. The role of Tyr-115 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. J Biol Chem, 2000. 275(26): p. 19759-67、Entin-Meer, M., Z. Sevilya, and A. Hizi, The role of phenylalanine-119 of the reverse transcriptase of mouse mammary tumour virus in DNA synthesis, ribose selection and drug resistance. Biochem J, 2002. 367(Pt 2): p. 381-91、Boyer, P.L., et al., Analysis of mutations at positions 115 and 116 in the dNTP binding site of HIV-1 reverse transcriptase. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(7): p. 3056-61、Astatke, M., N.D. Grindley, and C.M. Joyce, How E. coli DNA polymerase I (Klenow fragment) distinguishes between deoxy- and dideoxynucleotides. J Mol Biol, 1998. 278(1): p. 147-65、Brown, J.A. and Z. Suo, Unlocking the sugar "steric gate" of DNA polymerases. Biochemistry, 2011. 50(7): p. 1135-42）。
しかしながら、一般に立体的ゲート残基の変異がＤＮＡポリメラーゼをＮＴＰ組み込みについて自由にしているが、そのような変異は、それら自体、伸長ＲＮＡオリゴマーの合成を可能にしない。ＤＮＡポリメラーゼからのＲＮＡポリメラーゼの遺伝子操作は、合理的な設計（Yang, G., et al., A conserved Tyr residue is required for sugar selectivity in a Pol alpha DNA polymerase. Biochemistry, 2002. 41(32): p. 10256-61）、インビトロ若しくはインビボスクリーニング（Patel, P.H. and L.A. Loeb, Multiple amino acid substitutions allow DNA polymerases to synthesize RNA. J Biol Chem, 2000. 275(51): p. 40266-72、Staiger, N. and A. Marx, A DNA polymerase with increased reactivity for ribonucleotides and C5-modified deoxyribonucleotides. Chembiochem, 2010. 11(14): p. 1963-6）及びファージディスプレイによる定向進化（Xia, G., et al., Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(10): p. 6597-602）、又は区画化自己複製（Ong, J.L., et al., Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol, 2006. 361(3): p. 537-50）を使用して試みられてきた。これらの努力はＮＴＰを効率的に組み込むＤＮＡポリメラーゼを得たが、ｎ＋６でほとんどが失速し、どれも、５８のヌクレオチド組み込みよりも長いＲＮＡオリゴマーを合成することができず、これでさえ、典型的に、長いインキュベーション時間（数時間）、高度なポリメラーゼ濃度、及び変異誘発金属イオン（Ｍｎ２＋）を必要とする（Patel, P.H. and L.A. Loeb, Multiple amino acid substitutions allow DNA polymerases to synthesize RNA. J Biol Chem, 2000. 275(51): p. 40266-72、Staiger, N. and A. Marx, A DNA polymerase with increased reactivity for ribonucleotides and C5-modified deoxyribonucleotides. Chembiochem, 2010. 11(14): p. 1963-6、McCullum, E.O. and J.C. Chaput, Transcription of an RNA aptamer by a DNA polymerase. Chem Commun (Camb), 2009(20): p. 2938-40、Shinkai, A., P.H. Patel, and L.A. Loeb, The conserved active site motif A of Escherichia coli DNA polymerase I is highly mutable. J Biol Chem, 2001. 276(22): p. 18836-42）。したがって、発明者ら（Ong, J.L., et al., Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol, 2006. 361(3): p. 537-50）及び他の人たち（Astatke, M., et al., A single side chain prevents Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) from incorporating ribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998. 95(7): p. 3402-7、Brown, J.A. and Z. Suo, Unlocking the sugar "steric gate" of DNA polymerases. Biochemistry, 2011. 50(7): p. 1135-42）は、活性部位における立体的ゲート残基とは別に、進化性のＲＮＡ合成を中断する少なくとも１つの他の決定的な決定因子がＤＮＡポリメラーゼ構造中にあるに違いないと推論した。実際、ＤＮＡポリメラーゼフレームワークからの進化性のＲＮＡポリメラーゼの進化は、天然の先例があるように、可能であるに違いない。構造的及び系統発生的証拠は、広く使用されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが属する、ミトコンドリア及びＴ−ｏｄｄバクテリオファージの単一サブユニットＲＮＡポリメラーゼ（ｓｓＲＮＡＰ）が、原始ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼに由来することを示唆する（Delarue, M., et al., An attempt to unify the structure of polymerases. Protein Eng, 1990. 3(6): p. 461-7、Moras, D., Two sisters and their cousin. Nature, 1993. 364(6438): p. 572-3、Sousa, R., Structural and mechanistic relationships between nucleic acid polymerases. Trends Biochem Sci, 1996. 21(5): p. 186-90、Cermakian, N., et al., On the evolution of the single-subunit RNA polymerases. J Mol Evol, 1997. 45(6): p. 671-81）。２つのファミリー由来のポリメラーゼは広く分かれており、知られている現存する「ミッシングリンク」はないが、ＲＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼを関連づける適応性のある経路があるに違いない。
本明細書で、発明者らは、プライマー３’末端から２５Åの、Ｔ．ゴルゴナリウスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｇｏ）のｔｈｕｍｂドメイン中に位置するポリメラーゼ基質認識の決定的な決定因子の発見及び特徴付けを記載する（図４３）。それは、立体的ゲート変異と組み合わせられた場合、ＲＮＡポリメリゼーションについて合成ブロックを軽減する単一変異を含み、ＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチドプライマーから開始された、たった１時間で長さが１．７ｋｂを超えるｍＲＮＡの合成を可能にする。ｔｈｕｍｂ変異及び立体的ゲート変異は、ＲＮＡポリメラーゼ活性にとって必要十分であり、したがって、ＤＮＡポリメラーゼからＲＮＡポリメラーゼへの最小の適応性のある経路を定義する。最終的に、この変異は、ポリメラーゼ基質スペクトルを拡張し、化学的に修飾されたＲＮＡの進化性の合成及び損傷乗り越え合成（ＴＬＳ）を可能にし、したがって、活性部位から遠いポリメラーゼ基質特異性の新しい合成後チェックポイントを正確に決定する。
材料及び方法
ＤＮＡオリゴヌクレオチドはすべて、Sigma社、IDT社、Eurogentech社、又はMWG Eurofins社からのものとし、ＲＮＡオリゴヌクレオチドはすべて、Dharmacon社又はIDT社からのものとした。使用したｄＮＴＰはすべて、Roche社（Roche Diagnostics GmbH社、Ｇｅｒｍａｎｙ）、GE社（GE Healthcare Life Sciences社、ＵＫ）、又はAgilent社（Agilent Technologies Inc社、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）からのものとした。使用したＮＴＰはすべて、Roche社からのものとした。２’フルオロ及び２’アジドｄＮＴＰは、（Trilink Biotechnologies Inc社、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）からのものとし、２’ヨード−ｄＡＴＰは、Jena Bioscience社（Jena Bioscience GmbH社、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのものとした。
ＤＮＡ操作、タンパク質発現、及び精製
ＤＮＡ操作及び小規模の発現はすべて、NEB社 １０□□細胞において実行した（New England Biolabs Inc.社、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）。ＴｇｏＴ及びすべての変異体は、ｐＡＳＫ７５において維持した。大規模発現及び精製は、BL21 CodonPlus-RIL（Agilent Technologies社）又はNEB社 T7 Express LysY（NEB社）を使用した以外は記載されるとおりとし（Ramsay, N., et al., CyDNA: synthesis and replication of highly Cy-dye substituted DNA by an evolved polymerase. J Am Chem Soc, 2010. 132(14): p. 5096-104）、培養物は、３７℃で４時間誘導し、透明溶解物は、6/10 Hi-Prep Heparin FFカラム上にロードする前にＤＥ５２陰イオン交換樹脂（Whatman Inc社、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）であらかじめきれいにした。０．７〜０．８Ｍ ＮａＣｌで溶出したポリメラーゼはすべて、２×Vent storage bufferでフィルター透析し（Amicon Ultra Centrifugal Filters 50K；Millipore社、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、５０％グリセロール中に保存した。変異体は、NEB社 １０□細胞（NEB社）から典型的に発現させ、熱処理によって溶解し、１×Thermopol buffer（NEB社）中に保存し、清澄化した１０×溶解物として活性をスクリーニングした。
点変異は、Expand Hi-Fidelity PCR System（Roche社）又はHerculase II（Agilent Technologies社）を使用して、ｉＰＣＲによって導入し、Xbal及びBsu361を用いてＴｇｏＴ及びＤ４を切断し、消化物をゲル精製し、適切な断片をライゲーションすることによってＴｇｏＴに導入したＬ４０３Ｐ以外は、BsaI（NEB社）消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（NEB社）を用いてライゲーションし、発現前に変異の存在を確認するために配列決定し、ＴｇｏＴ Ｌ４０３Ｐ及びＤ４ Ｐ４０３Ｌを生成した。
区画化自己タギング（ＣＳＴ）
Ｄ４は、（ＶＰ、ＣＣ、ＰＨにより投稿準備中）において記載されるようにＣＳＴ選択の第１のラウンドから単離した。
プライマー伸長
スクリーニング（変異体ポリメラーゼ又は新しい基質との活性についての）のためのプライマー伸長は、２倍の過剰量の鋳型と共に１〜１０ｐｍｏｌプライマーを含有する３〜５□ｌ反応において実行した。通常、５’ビオチン、５’ＦＩＴＣ、５’Ｃｙ３、５’Ｃｙ５を有する、又は５’ＦＩＴＣ−ｄＴ−ビオチンにより二重標識したＤＮＡ又はＲＮＡにおけるプライマーＦＤ（5’-CCCCTTATTAGCGTTTGCCA-3’）は、０．２５〜０．７５ｍＭの各ＮＴＰを有し、ある種の立体的ゲート変異体の場合にはＭｇＳＯ４を補足した１×Thermopol緩衝剤（NEB社）において、ＴｅｍｐＮ（5’-CTCACGATGCTGGACCAGATAAGCACTTAGCCACGTAGTGCTGTTCGGTAATCGATCTGGCAAACGCTAATAAGGGG-3’）を伸長するために使用した。典型的な伸長プロトコールは、１０秒９４℃、１分５０℃、１０分６５℃の２サイクルとした。時間的経過について、２ｐｍｏｌ ＲＮＡプライマーＹｔＲＨＮＡ２ＨＮＡ２（5’FITC-CAGGAAACAGCTATGACAAATGGTGGTGGGG-3’；下線を引かれた部は鋳型結合部位である）は、３０秒間９４℃まで加熱し、０．１Ｃ／秒で４℃まで冷却することによって、１×Thermopol、＋３ｍＭ ＭｇＳＯ４、２．５ｍＭ ＮＴＰ（０．７５ｍＭの各ＮＴＰ）において反応当たり４ｐｍｏｌ鋳型ｔＲＮＡｔｅｍｐ１（5’-GGTGGGGTTCCCGAGCGGCCAAAGGGAGCAGACTCTAAATCTGCCGTCATCGACTTCGAAGGTTCGAATCCTTCCCCCACCACCA-3’、ＧＩ：１７４４７０に基づく）にアニールした。酵素は、氷上で追加し、反応は、２Ｖ ９８％ホルムアミド／１０ｍＭ ＥＤＴＡによりクエンチし、１５％アクリルアミド／８Ｍ尿素ＰＡＧＥ上で分離する前に６５℃でインキュベートした。
ポリメラーゼ活性アッセイ（ＰＡＡ）スクリーニング
ポリメラーゼ活性アッセイ（ＰＡＡ）スクリーニングは、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識プローブオリゴヌクレオチドを含有する１０□ｌ ８Ｍ尿素／１０ｍＭ ＥＤＴＡを、ビオチン化プライマーを使用するプライマー伸長の後に、反応ミックスに追加し（プライマー伸長に関しては、典型的に、５ｐｍｏｌ ５’ビオチンＦＤ及び１０ｐｍｏｌ ＴｅｍｐＮを含有する５□ｌ反応）、２分間６５℃でインキュベートした以外は、記載されるように実行した（ＶＰ、ＣＣ、ＰＨにより投稿準備中）。この熱い混合物は、９６ウェルＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌプレート（Roche社）中の２００□ｌのあらかじめ冷却したＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．１％Tween-20）に追加し、プローブは、ビオチンをプレートに結合させながら、伸長プライマーにハイブリダイズさせた。プレートは、共に、ＰＢＳ−Ｔ中への液浸によって３回洗浄し、プローブは、抗ジゴキシゲニンＰＯＤ Ｆａｂ断片（Roche社）及びUltra-TMB ELISA基質（Thermo Scientific社、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を使用して検出した。
タンパク質濃度アッセイ
精製タンパク質濃度は、NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels（Invitrogen Ltd社、ＵＫ）上での分離、SYPRO orange（Sigma-Aldrich社、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）を用いる染色、並びにTyphoon TRIO及びImageQuantによる定量を介してアッセイした。既知濃度（Ｔｈｅｒｍｏ）のＢＳＡ標準物質から生成した標準曲線は、ポリメラーゼ濃度を導き出すために使用した。
ＧＦＰ及びルシフェラーゼ鋳型調製及び合成
鋳型は、１つのビオチン化プライマー及び１つの非ビオチン化プライマーと共にHerculase II（Agilent Technologies社）を使用してＰＣＲによってＧＦＰについてｍＧＦＰ６（Haseloff, J., GFP variants for multispectral imaging of living cells. Methods Cell Biol, 1999. 58: p. 139-51）又はルシフェラーゼＴ７対照ＤＮＡ（Promega社＃Ｌ４８２Ａ）から調製した。この方法は、特有のフォワードプライミング部位の導入を可能にし、QIAquick（Qiagen NV社、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）精製ＰＣＲ産物を適切な体積の常磁性ビーズ（DynaBeads MyONE Streptavidin C1、Invitrogen社）に結合させることによって一本鎖ＤＮＡ鋳型の生成を可能にした。所望の鎖は、３７℃で２０ｍＭ又は１００ｍＭ ＮａＯＨを使用して溶出させ、等しい体積の３Ｍ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．５において中和し、イソプロパノール沈殿した。
フォワード合成は、１×Thermopol（NEB社）、＋３ｍＭ ＭｇＳＯ４、２．５ｍＭ ＮＴＰ（それぞれ０．７５ｍＭ）、それぞれの１０ｐｍｏｌ〜７０ｐｍｏｌに変化する１：１のプライマー：鋳型比、及び１５０ｎＭ ＴＧＫからなる５０□ｌ反応において、ＲＮＡプライマーＬ３Ｔ３２からとした（5’TYE665-C5’-AGGAAACAGCTATGACAAACAAGGTAGTGCTGTTCGtggga-3’；鋳型結合部位に下線を引き、配列の５’は、ＰＣＲのためにアウトネストを導入する）。伸長は、１０秒９４℃、１分５０℃、１時間６５℃の２サイクルとし、合計２時間の伸長を行った。ＤＮＡ鋳型は、TURBO ＤＮアーゼ（Applied Biosystems/Ambion社、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）処理によって消化し（１×TURBO ＤＮアーゼ緩衝剤を追加した反応ミックスにおいて３７℃で１時間、８Ｕ）、ＲＮＡは、RNeasy column（Qiagen社）上で精製した。
精製ＲＮＡの逆転写は、ルシフェラーゼについてのプライマーＧＢ１ｌｕｃｆｏ（5’-GAAATGGTAAGGCAAATACGGTTACAATTTGGACTTTCCG-3’；鋳型結合部位に下線を引き、配列の５’は、ＰＣＲのためにアウトネストを導入する）又はＧＢ１ＧＦＰｆｏ（5’-GAAATGGTAAGGCAAATACGGCTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATG-3’；鋳型結合部位に下線を引き、配列の５’は、ＰＣＲのためにアウトネストを導入する）を用い、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ ＲＴ（Roche社）を使用して実行し、ｃＤＮＡは、プライマーＬＭＢ３＋（5’CAGGAAACAGCTATGACAAA-3’）及びＮＡＰ（5’-CAGTATCGACAAAGGA-3’）を用いてＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ（Roche社）を使用して、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物は、TOPO TA Cloning Kit For Sequencing（Invitrogen社）を使用して、ｐＣＲ４．１の中にＴＯＰＯクローニングし、コロニーから配列決定した。共に、合成され、逆転写されたとして配列を同定することができるように、フォワード合成及びＲＴプライマーの両方は、ミスマッチを導入した。エラー率は、Roche社によって提供されるＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒエラー率（１．９８×１０−５）を使用し、先のようにＴａｑエラー率を想定して計算した（ＶＰ、ＣＣ、ＰＨにより投稿準備中）。
ＴＧＫ合成ＲＮＡの合成及びインビトロ翻訳
シャインダルガルノ配列（下線を引く）をコードするプライマーＬ３ＳＤＧＦＰｂａ（5’ビオチン-CAGGAAACAGCTATGACAGGAGGAGCGAGATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC-3’）を使用する以外、ｓｓＤＮＡ鋳型は、上記のように記載した。プライマーＲＮＡ Ｌ３ＡＧＧ（5’-CAGGAAACAGCTATGACAGG-3’）は、１０秒９４℃、１分５０℃、１５分６５℃の２サイクルについて上記に記載されるようにＲＮＡ合成のために使用し、合計３０分の伸長を行い、先に記載されるように精製した。ＩＶＴは、３□ｌのFluoroText GreenLys in vitro Translation Labelling System（Promega社）を補足したPURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit（NEB社）に直接追加した１．４□ｇ ＲＮＡを使用して実行し、NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Gel（Invitrogen社）での分析前に３７℃で２時間インキュベートした。
電気泳動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
ＤＮＡ：ＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡについての変異体Ｔｇｏポリメラーゼの親和性は、１×Thermpol緩衝剤（NEB社）、２５０ｆｍｏｌプライマーＫＯ、２．５ｎｍｏｌ ＴｅｍｐＫ４、１ｍＭ EDTA、１Ｕ RNasin（Promega社）、及び０．０２〜１．２５ｕＭポリメラーゼを含有するＳｕｌ反応混合物において、ＤＮＡ又はＲＮＡの５’ＦＩＴＣ標識プライマーＫ０（5’-GCACGGCAGCACGTG-3’）及び鋳型ＴｅｍｐＫ４（5’ビオチン-ACTGCGATGACTGTACTCGTCTAGTAGCACTGCACGTGCTGCCGTGC-3’）を使用してアッセイした。反応は、混合し、３０秒間９４℃まで加熱し、あらかじめ冷却した６％ＴＢＥゲル（Invitrogen社）上にロードする前に４℃まで０．１℃／秒で冷却し、あらかじめ冷却した１×ＴＢＥで１００Ｖで１時間、実行した。バンドは、Typhoon Trio及びImageQuantを使用して定量化し、シフトは、MatLab（The MathWorks Ltd社）を使用してy = (Bmax*x)/(Kd+x)に適合させた。
ポリメラーゼ処理能力及び障害バイパスアッセイ
４８塩基長ＤＮＡ鋳型、5’-TCG-ATA-CTG-GTA-CTA-ATG-ATT-AAC-GAA-YXA-AGC-ACG-TCC-GTA-CCA-TCG-3’、ＹＸ＝ＴＴ、ＴＴ−ＣＰＤ（ｃｉｓ−ｓｙｎシクロブタンピリミジン二量体）又はＴＡｂ（Ａｂ脱塩基部位）及び１６塩基長ＤＮＡプライマー（5’-TGG-TAC-GGA-CGT-GCT-T-3’）又はＲＮＡプライマー（5’-UGG-UAC-GGA-CGU-GCU-U-3’）は、プライマー伸長実験において使用した。プライマー、未損傷かつ脱塩基部位を含有する鋳型は、Lofstrand Laboratories社（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）によって合成した。ＣＰＤ含有鋳型は、Phoenix Biotechnologies社（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）によって合成した。オリゴヌクレオチドはすべて、使用前にゲル精製した。プライマーは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを使用して、５’末端標識した。ＤＮＡ基質は、１．５：１モル比で３２Ｐ標識プライマーを用いてＤＮＡ鋳型をアニールすることによって調製した。ハイブリダイゼーションは、１００℃で、１０分間、アニーリング緩衝剤において必要とされる混合物を加熱し［５０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ８）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０μｇ ｍｌ−１ ＢＳＡ、１．４２ｍＭ ２−メルカプトエタノール］、その後、約２時間、室温まで徐冷することによってすることによって達成した。アニーリング効率は、９５％を超えていた。
標準的な反応は、１×Thermopol緩衝剤において６５℃で４分間、実行し、１０ｎＭ ＤＮＡ鋳型（プライマー末端として発現）、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ又はＮＴＰ混合物、及び適切なｎＭのＴｇｏＴ、ＴＧＥ、ＴＹＫ、又はＴＧＫを含有した。酵素処理能力を分析するために、反応は、「シングルヒット」条件を確実にするために、ポリメラーゼに対して、多量のモル過剰量のＤＮＡ鋳型を用いて実行した。反応は、９０％ホルムアミド中５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％キシレンシアノール、及び０．１％ブロモフェノールブルーを含有する１用量のホルムアミドローディング色素溶液と混合することによって終了させた。ゲル上にロードする前に、反応は、１０分間１００℃で加熱することによって変性させ、２分間、氷上に直ちに移動させた。産物は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（８Ｍ尿素、１５％アクリルアミド、２０００Ｖで３時間）によって決定し、次いで、Fuji image analyser FLA-3000及びMultiGauge softwareを使用して可視化し、定量化した。鋳型位置１〜１４についての終了可能性（割合として表現）は、その位置及びすべてのより長い産物の強度によって割った、特異的な位置でのバンド強度として計算した（Kokoska, R.J., S.D. McCulloch, and T.A. Kunkel, The efficiency and specificity of apurinic/apyrimidinic site bypass by human DNA polymerase eta and Sulfolobus solfataricus Dpo4. J Biol Chem, 2003. 278(50): p. 50537-45）。
ＲＮＡ合成の改善を可能にするポリメラーゼ領域の同定
新しい非天然核酸ポリマーを合成することができるポリメラーゼを記載する。標準的なリボフラノース環が代替の構造、例えば６員１，５アンヒドロヘキシトール環（ヘキシトール核酸、ＨＮＡ）と交換されているこれらのいくつかは、Ａ様の（ＲＮＡ様の）らせん立体構造を示す（Herdewijn, P., Nucleic acids with a six-membered 'carbohydrate' mimic in the backbone. Chem Biodivers, 2010. 7(1): p. 1-59、Lescrinier, E., et al., Solution structure of a HNA-RNA hybrid. Chem Biol, 2000. 7(9): p. 719-31）（図４３）。この立体構造類似性を考慮すれば、発明者らは、ＲＮＡポリメラーゼ活性についてＨＮＡ合成（ＶＰ、ＣＣ、ＰＨにより投稿準備中）について遺伝子操作した変異体ポリメラーゼを試験することに決めた。これらのポリメラーゼのうちの１つ（Ｄ４）は、ＲＮＡポリメラーゼ活性の増強を示し、本明細書において記載される作業の出発点となる。
Ｄ４は、超好熱性古細菌サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｇｏ）の複製ＤＮＡポリメラーゼのバリアントに由来し、これは、ウラシル停止（Ｖ９３Ｑ（Fogg, M.J., L.H. Pearl, and B.A. Connolly, Structural basis for uracil recognition by archaeal family B DNA polymerases. Nat Struct Biol, 2002. 9(12): p. 922-7））及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ）を不能にするために追加の変異並びに非天然基質の組み込みを増強するための「Therminator」（Gardner, A.F. and W.E. Jack, Acyclic and dideoxy terminator preferences denote divergent sugar recognition by archaeon and Taq DNA polymerases. Nucleic Acids Res, 2002. 30(2): p. 605-13）変異（Ａ４８５Ｌ）を有する。この変異体ポリメラーゼ（これ以降ＴｇｏＴと呼ぶ）は、バックグラウンドレベル以上のＲＮＡポリメラーゼ活性を示さず、ＴｇｏＴによるＲＮＡ合成は、ＤＮＡプライマーから６〜７つの組み込み後に失速し、ＲＮＡプライマーからはない。対照的に、Ｄ４は、同じ条件下で、２０ｎｔを超えて、ＤＮＡ及びＲＮＡプライマーの両方を伸長する（図４３）。Ｄ４における機能のこの獲得は、ポリメラーゼｔｈｕｍｂドメインにおける８つの変異（Ｐ６５７Ｔ、Ｅ６５８Ｑ、Ｋ６５９Ｈ、Ｙ６６３Ｈ、Ｅ６６４Ｑ、Ｄ６６９Ａ、Ｎ６７１Ｋ、Ｉ６７６Ｔ）のクラスター及びポリメラーゼＡモチーフにおける単一の変異（Ｌ４０３Ｐ）を含むＴｇｏＴ足場に対するさらなる９つの変異によって達成される。
立体的ゲートの変異は進化性のＲＮＡポリメリゼーションさせる
発明者らは、とりわけ活性部位に対して遠位にある８つの変異の、ＲＮＡポリメラーゼ表現型に対するこれらの変異の機能をよりよく理解することを目的とした。より自由な活性部位との関連におけるＲＮＡポリメラーゼ活性に対するそれらの寄与を決定するために、発明者らは、Ｄ４の中に立体的ゲート変異を導入した。Ｂファミリー（ｐｏｌＢ）ポリメラーゼに対する以前の研究は、立体的ゲート残基として保存チロシン（Ｔｇｏ：Ｙ４０９）を同定した。Ｙのより小さな残基との交換は、１０３倍を超えて、ＮＴＰ／ｄＮＴＰ識別を低下させ、進化性のＲＮＡ合成をなお可能にしないことが知られている（Bonnin, A., et al., A single tyrosine prevents insertion of ribonucleotides in the eukaryotic-type phi29 DNA polymerase. J Mol Biol, 1999. 290(1): p. 241-51、Yang, G., et al., A conserved Tyr residue is required for sugar selectivity in a Pol alpha DNA polymerase. Biochemistry, 2002. 41(32): p. 10256-61、Gardner, A.F. and W.E. Jack, Determinants of nucleotide sugar recognition in an archaeon DNA polymerase. Nucleic Acids Res, 1999. 27(12): p. 2545-53）。しかしながら、Ｙ４０９はまた、金属イオン配位及び生産的なヌクレオチド位置決めに関与するとも考えられており、発明者らは、「ｎｕｌｌ」変異（例えばＡなどのような小さな側鎖アミノ酸への）が、全体的なポリメラーゼ機能及び正確性に悪影響を及ぼすかもしれないことを懸念していた（Blasco, M.A., et al., Phi 29 DNA polymerase active site. Mutants in conserved residues Tyr254 and Tyr390 are affected in dNTP binding. J Biol Chem, 1992. 267(27): p. 19427-34、Yang, W., J.Y. Lee, and M. Nowotny, Making and breaking nucleic acids: two-Mg2+-ion catalysis and substrate specificity. Mol Cell, 2006. 22(1): p. 5-13、Kirouac, K.N., Z. Suo, and H. Ling, Structural mechanism of ribonucleotide discrimination by a Y-family DNA polymerase. J Mol Biol, 2011. 407(3): p. 382-90）。古細菌Ｂ−ファミリーポリメラーゼが三元複合体として現在まで結晶化されていないので、発明者らは、活性部位の幾何学的配置を緩めないようにするために十分な大きさを維持しながら入って来るＮＴＰとの立体的な衝突を軽減するアミノ酸側鎖を見出すために相同なｐｏｌＢ ＲＢ６９（ＰＤＢ：ＩＱ９Ｙ、（Freisinger, E., et al., Lesion (in)tolerance reveals insights into DNA replication fidelity. EMBO J, 2004. 23(7): p. 1494-505））を使用して、インシリコモデリングを実行した。発明者らは、Ｙの中程度のサイズの側鎖（例えばＳ、Ｌ、Ｎ）との交換が、Ｄ４バックグラウンドにおいてＲＮＡポリメラーゼ活性を改善することを発見した。実際、Ｄ４環境の中へのＹ４０９Ｎ変異の導入は（Ｄ４：Ｙ４０９Ｎ、これ以降Ｄ４Ｎと呼ぶ）、２０分間、６５のヌクレオチド組み込みからなるｔＲＮＡ（大腸菌ｓｕｐＦ ｔＲＮＡＴｙｒ）遺伝子を合成することができる高度に有能なＲＮＡポリメラーゼを得たが、「野生型」ポリメラーゼＴｇｏＴの中に導入された同じ変異（ＴｇｏＴ：Ｙ４０９Ｎ、ＴＮ）のみでは、ＲＮＡポリメラーゼ活性をわずかに改善した（図４４）。そのため、発明者らは、Ｄ４ポリメラーゼにおける変異のうちのいくつか（又はすべて）が、単純な立体的ゲート変異体ポリメラーゼにおける合成ブロックを軽減し、より長いＲＮＡオリゴマーの合成を可能にすることを担ったことを結論付けた。
ｔｈｕｍｂドメインにおける単一の点変異は進化性のＲＮＡ合成にとって決定的である
Ｙ４０９Ｎ立体的ゲート変異に関連するＤ４における９つの変異が進化性のＲＮＡ合成を可能にしたことが確立されたので、発明者らは、ＲＮＡ合成へのＤ４Ｎにおける異なる変異の寄与を決定しようとした。この目的のために、発明者らは、野生型に個々のＤ４Ｎ変異を復帰させて、ＲＮＡ合成に対する効果を決定した。ｔｈｕｍｂドメイン変異の復帰は、著しいパターンを明らかにした：８つの逆変異（Ｄ４Ｎ：Ｔ６５７Ｐ、Ｑ６５８Ｅ、Ｈ６５９Ｋ、Ｈ６６３Ｙ、Ａ６６９Ｄ、Ｋ６７１Ｎ、Ｔ６７６Ｉ）のうちの７つは、ＲＮＡポリメラーゼ活性を低下させなかったが、野生型への１つの特異的な残基の復帰（Ｄ４Ｎ：Ｑ６６４Ｅ）は、進化性のＲＮＡ合成に対して劇的な陰性の効果を有した（図４４）。実際、復帰変異体Ｄ４Ｎ Ｑ６６４Ｅは、親ポリメラーゼＴｇｏＴと本質的に同じレベルのＲＮＡポリメラーゼ活性を示し、他の８つの変異の存在にもかかわらず、ポリメラーゼが、６つのＮＴＰ組み込み以上にプライマーを伸長することを不可能にした。これはまた、Ａモチーフ変異、Ｌ４０３Ｐが進化性のＲＮＡポリメラーゼ活性の一因とならないことを示唆し、実際、それは、変異立体的ゲートの存在下においてＮＴＰ組み込みに有害である（図４９）。
他のＤ４変異の関連がないこの重要な変異の効果を決定するために、発明者らは、ＴｇｏＴフレームワークの中に新規の立体的ゲート変異Ｙ４０９Ｎと一緒にＥ６６４Ｑフォワード変異を導入した。結果として生じるＴｇｏＴポリメラーゼ二重変異体ＴＮＱ（ＴｇｏＴ：Ｙ４０９Ｎ、Ｅ６６４Ｑ）は、立体的ゲート変異体ＴＮ（ＴｇｏＴ Ｙ４０９Ｎ）及びもとのＤ４Ｎポリメラーゼの両方と比較して優れたＲＮＡポリメラーゼ活性を示した。これらの結果は、Ｅ６６４Ｑ変異が進化性のＲＮＡ合成にとって必要十分であることを示す。ＤＮＡポリメラーゼは、立体的ゲートが変異している場合でさえ、進行性のＲＮＡ合成を行うことができないので（以前に（Astatke, M., et al., A single side chain prevents Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) from incorporating ribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998. 95(7): p. 3402-7、Patel, P.H. and L.A. Loeb, Multiple amino acid substitutions allow DNA polymerases to synthesize RNA. J Biol Chem, 2000. 275(51): p. 40266-72、Staiger, N. and A. Marx, A DNA polymerase with increased reactivity for ribonucleotides and C5-modified deoxyribonucleotides. Chembiochem, 2010. 11(14): p. 1963-6、Xia, G., et al., Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(10): p. 6597-602、Ong, J.L., et al., Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol, 2006. 361(3): p. 537-50）及びＴＮの実施例において本明細書で示されるように）、発明者らは、Ｅ６６４が、通常ＲＮＡオリゴマーの合成を防ぐＤＮＡポリメラーゼ構造における第２のチェックポイントを形成する（又はその決定的な部分である）ことを結論付ける。この「第２のゲート」の残基Ｅ６６４の変異は、チェックポイントを不能にし、合成のブロックを軽減し、立体的ゲート残基Ｙ４０９の変異と一緒に、二重変異体ポリメラーゼＴＮＱにおける進化性のＲＮＡ合成を可能にし、これは、１０分間未満で、６５ヌクレオチドｓｕｐＦ ｔＲＮＡ遺伝子を合成することができる（図４４）。
進化性のＲＮＡ合成についてのポリメラーゼ最適化
Ｅ６６４の変異が進化性のＲＮＡ合成を可能にする際に重要な役割を果たすことを確立したので、発明者らは、最適な「第２のゲート」残基を同定するためにＴＮにおける６６４位をランダム化した。発明者らは、プライマー伸長産物の捕捉及び特異的アンチセンスプローブへのハイブリダイゼーションを介してのそれらの定量に基づいて、新しいハイスループットポリメラーゼ活性アッセイ（ＰＡＡ）を使用して、ＲＮＡポリメラーゼ活性の増強についてスクリーニングした。ＰＡＡスクリーニングは、ＲＮＡポリメラーゼ活性を促進するいくつかの変異を同定し（Ｅ６６４ Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ）、リシン（Ｅ６６４Ｋ）が非常に有効であることを証明した（図４９）。実際、新しい二重変異体ポリメラーゼＴＮＫ（ＴｇｏＴ：Ｙ４０９Ｎ Ｅ６６４Ｋ）は、以前のベンチマークポリメラーゼ（ＴＮＱ）と比較して有意に改善されたＲＮＡポリメラーゼ活性を示した。
この戦略の成功の後に、発明者らは、Ｅ６６４Ｋ変異との関連において４０９位をランダム化し、類似性のＰＡＡスクリーニングを実行した。これは、いくつかの有望な変異（Ｙ４０９ Ａ、Ｇ、Ｐ）を同定し、これらのうち、Ｇ及びＰが非常に好都合であることを証明した（図４９）。発明者らは、Ｙ４０９Ｇ変異を選び、Ｅ６６４Ｋとそれを組み合わせて、新しいＴｇｏＴ二重変異体ポリメラーゼＴＧＫ（ＴｇｏＴ：Ｙ４０９Ｇ Ｅ６６４Ｋ）を生じさせた。ＴＧＫは、３０秒未満でｓｕｐＦ ｔＲＮＡ遺伝子の定量的合成が可能である例外的に活性なＲＮＡポリメラーゼであることを証明した（図４４）。Therminator変異のみでは、進化性のＲＮＡポリメラーゼ表現型をもたらさないが、野生型（Ｌ４８５Ａ）へのＴＧＫにおけるTherminator変異の復帰は、それほど有能でないＲＮＡポリメラーゼ（図４９）をもたらした（Staiger, N. and A. Marx, A DNA polymerase with increased reactivity for ribonucleotides and C5-modified deoxyribonucleotides. Chembiochem, 2010. 11(14): p. 1963-6、McCullum, E.O. and J.C. Chaput, Transcription of an RNA aptamer by a DNA polymerase. Chem Commun (Camb), 2009(20): p. 2938-40）。
発明者らは、野生型ポリメラーゼにおいてＲＮＡ合成を阻害するＢ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼ構造には２つの重要な位置があり、両方の変異が進化性のＲＮＡポリメラーゼの遺伝子操作にとって重要であることを結論付ける。一方の立体的ゲート残基（Ｙ４０９）は、活性部位にあり、立体排除によってＮＴＰの組み込みを防ぎ、したがって、活性部位における最大の立体的な可動性を提供するためにＧに最も変異させられる。他方、「第２のゲート」残基（Ｅ６６４）は、より長いＲＮＡオリゴマーの合成をブロックし、最もＫに変異させられ、この位置で静電的荷電を逆転させる。
遺伝子操作したＲＮＡポリメラーゼＴＧＫを使用する、タンパク質コードし、機能的にされたｍＲＮＡの合成
ｔＲＮＡ合成におけるＴＧＫの著しい活性によって促進されて、発明者らは、実質的により長いＲＮＡを生成するようにＴＧＫに挑んだ。発明者らは、最初に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする７４８のヌクレオチドｍＲＮＡの合成を試験した。驚いたことに、ＴＧＫは、アガロースゲル電気泳動、ＲＴ−ＰＣＲ、及び配列決定によって判断されるように、１０分間未満で、完全長ＧＦＰ ＲＮＡを生成した（図４５）。合成されたＧＦＰ ｍＲＮＡは、インビトロ翻訳抽出物において正確なサイズの２６．８ｋＤａのタンパク質産物の合成を指示し（図４５）、クローニングした場合、緑色蛍光大腸菌コロニーが得られた（示さず）。発明者らはまた、ホタル（Ｐ．ピラリス（P.pyralis））ルシフェラーゼをコードする非常に長い１，６９１ヌクレオチドｍＲＮＡの合成を検査した。なおまた、ＴＧＫは、完全長産物のアガロースゲル電気泳動、ＲＴ−ＰＣＲ、及び配列決定によって判断されるように、完全長ルシフェラーゼＲＮＡを生成し、このより困難なＲＮＡの合成について１時間を必要とした（図４５）。
発明者らは、ＲＮＡ合成に由来するＰＣＲ産物を明白に同定する特有のミスマッチを含むフォワード合成及びリバース転写プライマーの両方を使用して、２ステップＲＴ−ＰＣＲプロトコール（下記）により、ＴＧＫによってＲＮＡ合成の正確性を決定した。ルシフェラーゼｍＲＮＡの８．２ｋｂの配列データの分析は、５．５×１０−４の誤組み込み率を明らかにし、これは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのエラー率（２．１×１０−４）及びｄＮＴＰとのＴｇｏＴの正確性（７．５×１０−３、図４４）と同等である。
第２のゲート機能の機構的な態様
ＲＮＡ合成について立体的ゲート残基を変異させる効果がかなり詳細に調査され、そのメカニズムは、構造的及び生化学的データを使用して合理的説明を与えられているが（Brown, J.A. and Z. Suo, Unlocking the sugar "steric gate" of DNA polymerases. Biochemistry, 2011. 50(7): p. 1135-42）、進化性のＲＮＡ合成に対する「第２のゲート」変異の著しい効果についてのベースは、現在不明瞭である。発明者らは、そのメカニズムをよりよく理解しようとして、第２のゲート機能の決定的なパラメーターを決定しようとした。この目的のために、発明者らは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びキメラプライマーを用いるそれらのＲＮＡポリメラーゼ活性及び処理能力について、ＴＧＫ及び親ポリメラーゼＴｇｏＴだけでなく、中間ＴＹＫ（ＴｇｏＴ Ｅ６６４Ｋ）及びＴＧＥ（ＴｇｏＴ Ｙ４０９Ｇ）もまた検査した。
示されるように、ＴＧＫは、ＮＴＰを用いて、ＤＮＡ及びＲＮＡプライマーの両方を効率的に及び進化性に伸長することができる。対照的に、ＴｇｏＴは、ＲＮＡプライマー（高度に強制的な条件下を除いて）を伸長することができず、ＤＮＡプライマーから６番目のＮＴＰ組み込みの後に強力な伸長終了を示す。６つのリボヌクレオチドのストレッチを越えた伸長に対する根本的なブロックがあると思われる。１（又は２以上）の３’末端ＮＭＰを含むＤＮＡ−ＲＮＡキメラプライマーを使用する場合、一度、６ＮＭＰのストレッチに達すれば、なおまた強力な終了がある（つまり、１つの末端ＮＭＰを有するプライマーの伸長は、さらなる５つのＮＭＰの組み込みの後に失速し、６末端ＮＭＰを有するプライマーは、伸長しない、図４６）。その修飾活性部位にもかかわらず、ＴＧＥはまた、ｎ＋６で強力な終止を示す（図５１）。これは、第２のゲート変異がこの合成ブロックを克服し、進化性のＲＮＡ合成を可能にするのに決定的であることを示唆する。
第２のゲートはまた、ポリメラーゼ基質特異性の他の態様を制御するように思われる。ＴＧＫ及びＴＹＫの両方（ＴｇｏＴ及びＴＧＥではない）は、損傷乗り越え合成（ＴＬＳ、図４６）が可能であり、鋳型脱塩基部位及びシクロピリミジン二量体の両方を回避する（ＣＰＤ、図４６）。したがって、ＴＬＳは、鋳型障害から２５Åに位置づけられる変異によって制御されるように思われる。
したがって、発明者らは、ＤＮＡポリメラーゼのｔｈｕｍｂサブドメインが新生ＤＮＡ二重鎖と多くの重要な相互作用をなすことを実証する（Swan, M.K., et al., Structural basis of high-fidelity DNA synthesis by yeast DNA polymerase delta. Nat Struct Mol Biol, 2009. 16(9): p. 979-86、Wang, M., et al., Insights into Base Selectivity from the 1.8 A Resolution Structure of an RB69 DNA Polymerase Ternary Complex. Biochemistry, 2011. 50(4): p. 581-90）。ポリメラーゼ機能についてのこの決定的な領域における変異は、正確性、処理能力、及びＤＮＡ結合親和性における減少を引き起こし得、ゲノム不安定性及び疾患に関係してきた（Kirchner, J.M., H. Tran, and M.A. Resnick, A DNA polymerase epsilon mutant that specifically causes +1 frameshift mutations within homonucleotide runs in yeast. Genetics, 2000. 155(4): p. 1623-32、Kokoska, R.J., et al., Increased rates of genomic deletions generated by mutations in the yeast gene encoding DNA polymerase delta or by decreases in the cellular levels of DNA polymerase delta. Mol Cell Biol, 2000. 20(20): p. 7490-504、Stocki, S.A., R.L. Nonay, and L.J. Reha-Krantz, Dynamics of bacteriophage T4 DNA polymerase function: identification of amino acid residues that affect switching between polymerase and 3' --> 5' exonuclease activities. J Mol Biol, 1995. 254(1): p. 15-28、Kasiviswanathan, R., et al., Disease mutations in the human mitochondrial DNA polymerase thumb subdomain impart severe defects in mitochondrial DNA replication. J Biol Chem, 2009. 284(29): p. 19501-10、Loh, E. and L.A. Loeb, Mutability of DNA polymerase I: implications for the creation of mutant DNA polymerases. DNA Repair (Amst), 2005. 4(12): p. 1390-8）。本明細書で、発明者らは、複製ポリメラーゼのｔｈｕｍｂドメイン内の重要な合成後基質特異性チェックポイントを発見した。変異によるその不活性化は、非同起源の核酸の合成及び鋳型障害のバイパスに対するブロックを解放する。立体的ゲート残基の変異と一緒に、この「第２のゲート」変異は、ＤＮＡポリメラーゼを、業界基準Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに匹敵する正確性により数秒で１００塩基長ＲＮＡの及び数分〜数時間で１．７ｋｂまでのタンパク質コードｍＲＮＡの合成が可能である、プライマー依存性のＲＮＡポリメラーゼに変換する。
ポリメラーゼｔｈｕｍｂドメインに位置する合成物質チェックポイントの存在は、短いオリゴマー（典型的にｎ＋６）の合成後の伸長の終了及び新生ＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖のモデリング（Ong, J.L., et al., Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol, 2006. 361(3): p. 537-50）を含む複数の方針の証拠に基づいて、発明者ら及び他の人たちによって予測された（Astatke, M., et al., A single side chain prevents Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) from incorporating ribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998. 95(7): p. 3402-7、Brown, J.A. and Z. Suo, Unlocking the sugar "steric gate" of DNA polymerases. Biochemistry, 2011. 50(7): p. 1135-42、Xia, G., et al., Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(10): p. 6597-602、Ong, J.L., et al., Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol, 2006. 361(3): p. 537-50）。実際、Ｄ４における９つの変異のうちの８つ（Ｐ６５７Ｔ、Ｅ６５８Ｑ、Ｋ６５９Ｈ、Ｙ６６３Ｈ、Ｅ６６４Ｑ、Ｄ６６９Ａ、Ｎ６７１Ｋ、Ｉ６７６Ｔ）は、ｔｈｕｍｂドメインの中心で、ｎ＋６のあたりの新生鎖と密接に接触する配列セグメント（Ｐ６５７〜Ｔ６７６）に位置する。スクリーニング及び部位特異的変異誘発の反復サイクルを使用して、発明者らは、単一の残基（Ｅ６６４）まで決定的な機能的な決定因子を限定し、この変異は、進化性のＲＮＡポリメラーゼ活性にとって必要で、十分であることを証明した。発明者らが「第２のゲート」と呼んだこの重要な残基は、陽性に荷電したリシン（Ｅ６６４Ｋ）に最も有効に変異させられるが、無電荷グルタミン（Ｅ６６４Ｑ）への変異は、著しいＲＮＡポリメラーゼ活性を既に提供している。この傾向は、新生鎖の近くに位置する親のＥ６６４の負電荷が、ＲＮＡ合成を阻止するためのその機能の重要な構成成分であるかもしれないことを示唆する。
立体的ゲート機能は、入って来るヌクレオチドに対する２’ＯＨの立体排除に基づく（Brown, J.A. and Z. Suo, Unlocking the sugar "steric gate" of DNA polymerases. Biochemistry, 2011. 50(7): p. 1135-42、Kirouac, K.N., Z. Suo, and H. Ling, Structural mechanism of ribonucleotide discrimination by a Y-family DNA polymerase. J Mol Biol, 2011. 407(3): p. 382-90）。しかしながら、第２のゲート機能の機構的なベースは、現在明らかでなく、幾何学的な制御以外のメカニズムを含むかもしれない。実際、ＲＮＡ合成における改善のうちのいくつかは、電気泳動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によって決定されるように、第２のゲート変異によって媒介されるＤＮＡ：ＤＮＡ及びＤＮＡ：ＲＮＡプライマー鋳型二重鎖の両方についての親和性における３〜１０倍の増加によって引き起こされるかもしれない。第２のゲート残基Ｅ６６４の変異は、新生鎖リン酸主鎖に近いポリメラーゼｔｈｕｍｂドメインにおける反発的な負電荷を除去し、これは、プライマー鋳型二重鎖への親和性を増加させるかもしれない。しかしながら、Ｅ６６４変異を欠くポリメラーゼ（ＴｇｏＴ、ＴＧＥ）におけるｎ＋６での著しい終了は、強くメカニズムに対する第２の幾何学的な構成成分を示唆する。
立体的モデルの製剤は、古細菌Ｂ−ファミリーポリメラーゼの三次複合体の構造が現在ないという事実によって妨げられる。既存のＢ−ファミリーポリメラーゼ構造において、ポリメラーゼｔｈｕｍｂドメイン配列における決定的な領域は、古細菌配列と異なり（Swan, M.K., et al., Structural basis of high-fidelity DNA synthesis by yeast DNA polymerase delta. Nat Struct Mol Biol, 2009. 16(9): p. 979-86、Franklin, M.C., J. Wang, and T.A. Steitz, Structure of the replicating complex of a pol alpha family DNA polymerase. Cell, 2001. 105(5): p. 657-67、Wang, F. and W. Yang, Structural insight into translesion synthesis by DNA Pol II. Cell, 2009. 139(7): p. 1279-89、Liu, S., et al., Crystal structure of the herpes simplex virus 1 DNA polymerase. J Biol Chem, 2006. 281(26): p. 18193-200、Savino, C., et al., Insights into DNA replication: the crystal structure of DNA polymerase B1 from the archaeon Sulfolobus solfataricus. Structure, 2004. 12(11): p. 2001-8）、類似性による比較を不確実にしている。そのため、発明者らは、密接に関連する古細菌ｐｏｌＢ Ｐｆｕの変異体の二次複合体の構造（S. Wynne, PH, A. Leslie、非公開の結果）及びＤＮＡ鋳型上の新生ＲＮＡ鎖をモデル化するためのより異なるＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼの三次複合体構造（Wang, M., et al., Insights into Base Selectivity from the 1.8 A Resolution Structure of an RB69 DNA Polymerase Ternary Complex. Biochemistry, 2011. 50(4): p. 581-90）（ＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖のＮＭＲ構造に基づく（ＰＤＢ：１ＥＦＳ（Hantz, E., et al., Solution conformation of an RNA--DNA hybrid duplex containing a pyrimidine RNA strand and a purine DNA strand. Int J Biol Macromol, 2001. 28(4): p. 273-84）、図４７）を使用した。両方の場合において、発明者らは、第２のゲート残基Ｅ６６４（ＲＢ６９：Ｓ７８３）の近く（７Å）にポリメラーゼｔｈｕｍｂドメインとのＲＮＡ鎖のｎ＋６位のあたりの衝突を観察した。
ｔｈｕｍｂドメインとのＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖の不十分な幾何学的な相補性は、ポリメラーゼ活性部位における非常によい適合と対照をなす。実際、Ａファミリー及びＸファミリーＤＮＡポリメラーゼの三次複合体の構造は、活性部位中の及びその近くの好ましい糖のひだはＣ３’−エンドであり、プライマー鋳型二重鎖（ｎ＋３まで）のらせん立体構造はＡ様であるが、プライマー鋳型二重鎖がｔｈｕｍｂドメインと相互作用するので、同起源のＢ−ＤＮＡへの立体構造スイッチを受け、ポリメラーゼを出ることを示す（Kiefer, J.R., et al., Visualizing DNA replication in a catalytically active Bacillus DNA polymerase crystal. Nature, 1998. 391(6664): p. 304-7、Pelletier, H., et al., Structures of ternary complexes of rat DNA polymerase beta, a DNA template-primer, and ddCTP. Science, 1994. 264(5167): p. 1891-903、 Li, Y., S. Korolev, and G. Waksman, Crystal structures of open and closed forms of binary and ternary complexes of the large fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase I: structural basis for nucleotide incorporation. EMBO J, 1998. 17(24): p. 7514-25）。この立体構造スイッチは、ポリメラーゼ特異性において役割を果たすことが以前に観察されており、それによって、Ｇ−Ｔミスマッチの組み込み及び伸長についての構造的観察は、鋳型鎖を通して活性部位に「伝えられ」、ポリメラーゼの停止を促進したミスマッチによるＡからＢ型への構造推移の破壊を明かした（Johnson, S.J. and L.S. Beese, Structures of mismatch replication errors observed in a DNA polymerase. Cell, 2004. 116(6): p. 803-16）。ｔｈｕｍｂドメインにおける第２のゲートチェックポイント及びポリメラーゼ活性部位の間のそのような合成後クロストークは、同様に、ＲＮＡ合成において観察されるｎ＋６での停止を媒介するかもしれない。そのため、第２のゲートチェックポイントは、新生核酸二重鎖、おそらく非同起源のらせん立体構造の出現する特徴を検出するかもしれない。
最も有効な第２のゲート変異（Ｅ６６４Ｋ）が側鎖のかさの除去ではなく電荷反転をもたらすという事実は、Ｅ６６４が単純な立体的な妨害としてそれ自体機能しないことを示唆する。実際、発明者らのモデルにおけるｎ＋６での立体的な衝突は、残基Ｅ６６４と直接生じない。むしろＥ６６４が、静電気の「舵」として作用し、ｔｈｕｍｂドメインによるらせんパラメーターの読み出しを可能にするように新生鎖を操縦するかもしれない。その代わりに、Ｅ６６４の変異は、ｔｈｕｍｂドメインの構造的再構成に至り、それを、非Ｂ型構造核酸に対してより自由にしてもよい。いずれの場合も、第２のゲート残基の変異は、ポリメラーゼｔｈｕｍｂドメインが一連のらせん立体構造を収容するのを可能にするであろう。したがって、ＴＧＫの緩やかな基質特異性及び障害バイパス能力は、活性部位における新生及び鋳型鎖の位置決めの幾何学的な制御の緩和から生じ、非同起源の二重鎖立体構造の遭遇に際してポリメラーゼ伸長の停止を防ぐであろう。
サーモコッカス目のｐｏｌＢファミリーメンバーの間で高度に保存されているが第２のゲート残基６６４（又は等価物）の同一性は、ｐｏｌＢファミリーのより遠縁のメンバーの間で変化する。しかし、Ｓ．セレビシエ Ｐｏｌのデルタ及び大腸菌Ｐｏｌ IIの両方における三次複合体の構造は、ｔｈｕｍｂドメインにおけるその構造的付近において少なくとも１つの広範囲の保存を示す。そのため、より広いｐｏｌ８ファミリーにおいて（実際、他のファミリーにおいて）類似する「第２のゲート」チェックポイントが存在することは可能であるように思われるが、ポリメラーゼファミリーの間で変化する立体的ゲート残基に対する類似性において（表ＳＩ−図５２）、異なる形態で実現されるかもしれない。
ゲノムからのＲＮＡの排除は、Ｓ．セレビシエのような中温性の生物におけるゲノム安定性にとって重要であり（Nick McElhinny, S.A., et al., Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nature Chemical Biology, 2010. 6(10): p. 774-81）、好熱性生物にとってさらに高度に重要であるかもしれない。しかしながら、ＴＬＳに対する第２のゲート変異の著しい効果は、それがＲＮＡ合成の予防をしのぐ生物学的機能を有しているかもしれないことを示唆する。これらは、同じクラスの古細菌ポリメラーゼにおける、鋳型ウラシル及びヒポキサンチンの先読み認識を反映する誤組み込み及び／又はＤＮＡ損傷のリードスルーの合成後認識を含むかもしれない（Firbank, S.J., et al., Uracil recognition in archaeal DNA polymerases captured by X-ray crystallography. J Mol Biol, 2008. 381(3): p. 529-39）。
ＴＧＫは、熱安定性、最も重要なことには、オリゴヌクレオチドプライマーからＲＮＡ合成を開始する能力を含む、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのような単一サブユニットのＲＮＡＰといくつかの可能性として有用な方法において異なる。遺伝子操作されたポリメラーゼＴＧＫは、したがって、第１の熱安定性プライマー依存性の進化性ＲＮＡポリメラーゼである。ＲＮＡ合成が、細胞性のｍＲＮＡから「Ｃａｐスナッチング」によって誘導される短いＲＮＡプライマーから開始される（例えばウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Plotch, S.J., et al., A unique cap(m7GpppXm)-dependent influenza virion endonuclease cleaves capped RNAs to generate the primers that initiate viral RNA transcription. Cell, 1981. 23(3): p. 847-58、Mir, M.A., et al., Storage of cellular 5' mRNA caps in P bodies for viral cap-snatching. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(49): p. 19294-9））例があるが、ＤＮＡ鋳型由来のプライマー依存性のＲＮＡ合成は、自然界において一般に観察されない表現型であり、ＲＮＡ合成は、特異的プロモーター配列（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Steitz, T.A., The structural basis of the transition from initiation to elongation phases of transcription, as well as translocation and strand separation, by T7 RNA polymerase. Curr Opin Struct Biol, 2004. 14(1): p. 4-9））又はタンパク質転写因子複合体から典型的に新たに開始される。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、プライマー依存性のＲＮＡ合成が可能であるが（Rusakova, E.E., et al., Mutant T7 RNA polymerase is capable of catalyzing DNA primer extension reaction. FEBS Lett, 1998. 423(2): p. 189-92、Ivanov, S.A., et al., RNA synthesis by T7 RNA polymerase supported primer extension. Mol Biol (Mosk), 2004. 38(5): p. 798-803）、推定上、あらかじめアニールされたＤＮＡプライマーへの結合がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの進化性の形態への立体構造変化を引き起こさないので、それは、弱く、非進化性である（Yin, Y.W. and T.A. Steitz, Structural basis for the transition from initiation to elongation transcription in T7 RNA polymerase. Science, 2002. 298(5597): p. 1387-95）。
それがＲＮＡ ５’末端又はＲＮＡ ５’ＵＴＲの化学的性質の自由選択を可能にするので、プライマー依存性のＲＮＡ合成は多くの適用にとって可能性として有用である。ＴＧＫは、ビオチン、Ｃｙ３、又はＦＩＴＣなどのような５’基を有するもの並びに内部アルファＳ、２’ＯＭｅ、又はＬＮＡ修飾を含むＤＮＡ及びＲＮＡプライマーオリゴヌクレオチドの両方を含む種々様々のプライマーを伸長することができる。実際、発明者らは、ＴＧＫによる伸長を著しい程度まで低下させるプライマー修飾をまだ同定していない。さらに、ＴＧＫは、Ｇとの転写を初期化するためのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの必要性から、酵素ＲＮＡ合成を自由にする。
ＴＧＫはまた、修飾ＮＴＰの組み込みに関して、拡張した基質スペクトルを示す。例えば、ＴＧＫは、５−メチル−Ｃ及びプソイドウリジン（Ψ）と完全に置換された１．７ｋｂルシフェラーゼｍＲＮＡの合成を可能にし、最近、示されているように、遺伝子療法及び幹細胞再プログラムにおける適用の可能性を有する（Warren, L., et al., Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell, 2010、Kormann, M.S., et al., Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nat Biotechnol, 2011. 29(2): p. 154-7）。さらに、ＴＧＫは、完全に２’−アジド（２’−Ｎ３）又は２’−フルオロ（２’−Ｆ）によって置換されたＤＮＡを効率的に合成し、拡張した化学的性質を有するヌクレアーゼ抵抗性（Watts, J.K., et al., Studies on the hydrolytic stability of 2'-fluoroarabinonucleic acid (2'F-ANA). Org Biomol Chem, 2009. 7(9): p. 1904-10、Ono, T., M. Scalf, and L.M. Smith, 2'-fluoro modified nucleic acids: polymerase-directed synthesis, properties and stability to analysis by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Nucleic Acids Research, 1997. 25(22): p. 4581-4588）アプタマーの進化における適用を有する。２’Ｆ−ＲＮＡの一晩での合成が、先に記載されているが（Ono, T., M. Scalf, and L.M. Smith, 2'-fluoro modified nucleic acids: polymerase-directed synthesis, properties and stability to analysis by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Nucleic Acids Research, 1997. 25(22): p. 4581-4588）、ＴＧＫは、数分で完全に置換された２’Ｆ−ＲＮＡの合成が可能である。
結論として、発明者らの結果は、ＤＮＡポリメラーゼからＲＮＡポリメラーゼへの適応性のある経路が驚くほど短いことを示唆する。発明者らの「野生型」ポリメラーゼＴｇｏＴは、エキソヌクレアーゼ（Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ）及びウラシル停止（Ｖ９３Ｑ）機能の不能並びに基質混在を増加させるためのTherminator変異（Ａ４８５Ｌ）の、４つの変異を含有したが、これらは、ベースライン以上のＲＮＡポリメラーゼ活性を与えなかった。したがって、ＲＮＡポリメラーゼ活性への「進化論的なジャンプ」は、たった２つの残基の変異を含んだ：ともに進化性のＲＮＡポリメラーゼ活性だけでなく、高度に修飾されたＲＮＡポリマーのＴＬＳ及び合成をも可能にした活性部位における古典的な立体的ゲート（Ｙ４０９）及びｔｈｕｍｂドメインにおける新しく記載された「第２のゲート」（Ｅ６６４）。ポリメラーゼｔｈｕｍｂサブドメインにおける「第２のゲート」の同定は、ポリメラーゼ基質特異性の重要な決定因子が活性部位の外側に位置し、最初の組み込み及び伸長ステップの後にその影響を及ぼすことを示す。
実施例２５についての図面の説明
図４３．ｔｈｕｍｂドメイン変異によるＲＮＡポリメラーゼ活性の増強。ａ）相同な大腸菌ＤＮＡ ｐｏｌ II（ＰＤＢ：３ＭＡＱ（Ono, T., M. Scalf, and L.M. Smith, 2'-fluoro modified nucleic acids: polymerase-directed synthesis, properties and stability to analysis by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Nucleic Acids Research, 1997. 25(22): p. 4581-4588））上にマッピングしたＤ４Ｎの構造。Ｄ４における９つの変異は青色で示し、立体的ゲート変異（Ｄ４ Ｙ４０９Ｎを作製するために追加）は、赤色で示し、ＴｇｏＴにおける既存の変異は、黄色で示す（Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ａ４８５Ｌ）。ｂ）Ｂ−ＤＮＡ、Ａ−ＲＮＡ、及びＨＮＡ−ＲＮＡヘテロ二本鎖のらせんパラメーター（Swan, M.K., et al., Structural basis of high-fidelity DNA synthesis by yeast DNA polymerase delta. Nat Struct Mol Biol, 2009. 16(9): p. 979-86）。ｃ）ＤＮＡからのＲＮＡ伸長、並びにｄ）Ｄ４Ｎ及びその親ポリメラーゼによるＲＮＡプライマー。
図４４．ＲＮＡポリメラーゼ活性に対するｔｈｕｍｂドメインに対する変異の効果。ａ）Ｄ４におけるｔｈｕｍｂ変異の復帰分析。変異はそれぞれ、個々に野生型に復帰させ、ｄＮＴＰ活性に従って標準化した溶解物を用いてアッセイした進化性のＲＮＡポリメラーゼ活性に対する効果。ｂ）ＲＮＡプライマーからの、精製ポリメラーゼＤ４Ｎ、ＴＮＱ、及びＴＧＫによる大腸菌ｔＲＮＡＴｙｒ合成の時間的経過。
図４５．ＴＧＫによるｍＲＮＡ合成。ａ）標識ＲＮＡプライマーからＴＧＫによって合成したＣｙ５標識ＧＦＰ ＲＮＡの変性アガロース電気泳動。ｂ）ａ）において示すＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲ。ｃ）ＴＧＫによって合成したＧＦＰのインビトロ翻訳。ＧＦＰは、ゲルを染色せずに、ＧＦＰの中に組み込まれた蛍光リシンの励起によって視覚化した。ｄ）ＴＧＫによって合成されたルシフェラーゼの天然アガロース電気泳動。ＲＮＡは、Ｃｙ５によって直接視覚化する；ラダーはＳＹＢＲ Ｇｏｌｄを用いて染色した。ｅ）ｄ）において示されるＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲ。
図４６．修飾核酸の合成。ａ）完全長のＧＦＰ（ａ）を示す２’ＯＨプリン、５−メチルＣＴＰ、及び偽ＵＴＰ（Ψ）を使用する、修飾ＲＮＡの変性アガロース電気泳動及びｂ）ルシフェラーゼｃ）完全置換２’フルオロ−ＮＴＰ、２’アジド−ＮＴＰ、並びに２’フルオロ−ＡＴＰ、２’アジド−ＧＴＰ、ＣＴＰ、及びｄＴＴＰの混合物を用いるＲＮＡプライマーの伸長。ｄ）ＴＧＫによる修飾プライマーからのＲＮＡ合成。プライマーＦＩＴＣ ５’Ａ、ＦＩＴＣ ５’Ｃ、ＦＩＴＣ ５’Ｇ、及びＦＩＴＣ ５’Ｕは、示されるように修飾された５’塩基と共に配列5’-CCCCTTATTAGCGTTTGCC-3’を有するＲＮＡプライマーである。プライマー４チオは、同じＲＮＡ配列であるが、塩基４及び５の間にホスホロチオエート結合を有する。プライマー２’Ｏ−メチルは、同じＲＮＡ配列であるが、２’Ｏ−メチル塩基と交換された塩基４及び５を有する。プライマーＬＮＡ２、ＬＮＡ３、及びＬＮＡ５は、ＬＮＡ（ＬＮＡ２）と交換された塩基１９及び２０（２つの３’塩基）、ＬＮＡ（ＬＮＡ３）と交換された塩基１７及び１９、又はＬＮＡ（ＬＮＡ５）と交換された塩基１７、１８、及び１９を有するＤＮＡプライマーである。ｅ）２’アジド、２’フルオロ（ｆ）、プソイドウリジン（ｇ）、及び５−メチルデオキシシチジン（ｈ）の構造。
図４７．第２のゲート機能の機構的な態様。ａ）６６４変異の重要性を示すＮＴＰを用いるプライマー伸長。プライマーＤはすべて、ＤＮＡであり、プライマー＋１は、同一のＤＮＡプライマー＋１ＮＭＰであり、プライマー＋６は、同じＤＮＡストレッチ＋６ＮＭＰであり、プライマーＲは、プライマーＤの等価物であるが、ＲＮＡとしての等価物である。赤色のボックスは、プライマーの３’を強調表示する。本明細書で、ＴｇｏＴ及びＴＹＫは、ＮＴＰを不十分に組み込み、ＴＧＥは、６ＮＴＰを効率的に組み込むが、次いで失速し、ＴＧＫはプライマーを完全に伸長することができる。ｂ）ＴｇｏＴの処理能力。ＮＴＰを用いる、ＴＧＥ（ＴｇｏＴ Ｙ４０９Ｇ）、ＴＹＫ（ＴｇｏＴ Ｅ６６４Ｋ）、及びＴＧＫ（ＴｇｏＴ Ｙ４０９Ｇ Ｅ６６４Ｋ）は、ＤＮＡプライマーからシングルヒット条件下でアッセイした。ｃ）ＲＮＡプライマー以外は（ｂ）と同様。ＴＧＫのみが、ＮＴＰを用いてプライマーを伸長することができる。ｄ）ｄＮＴＰと共に示されるように脱塩基部位を有するＤＮＡプライマー以外は（ｂ）と同様。この場合、ＴＹＫ及びＴＧＫの両方（Ｅ６６４Ｋ変異を有するポリメラーゼの両方）は、プライマー伸長が可能であるが、ＴｇｏＴ及びＴＧＥは可能でない。ｅ）障害がシクロピリミジン二量体（ＣＰＤ）である以外は（ｅ）と同様。なおまた、ＴＹＫ及びＴＧＫのみが障害バイパスが可能である。
図４８．遺伝子操作された進化性のＲＮＡポリメラーゼの構造モデル ａ）相同な大腸菌ＤＮＡ ｐｏｌ II（３ＭＡＱ；（Ono, T., M. Scalf, and L.M. Smith, 2'-fluoro modified nucleic acids: polymerase-directed synthesis, properties and stability to analysis by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Nucleic Acids Research, 1997. 25(22): p. 4581-4588））上にマッピングしたＴＧＫの構造。２ステップの適応性のある経路を形成する重要な変異は、赤色で示す。野生型からの他の変異（Ｖ９３Ｑ、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ａ４８５Ｌ）は、黄色で示す。鋳型鎖は、紫色の図として示し、プライマー鎖は、オレンジの図として示す。入って来るｄＧＴＰは緑色で示す。ｂ）Ａ型及びＢ型の間の核酸中間体がＤＮＡポリメラーゼによって合成される場合に生成される衝突を示す、Ｐｆｕの三元複合体にモデル化されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド二重鎖（１ＥＦＳ；（Wang, M., et al., Insights into Base Selectivity from the 1.8 A Resolution Structure of an RB69 DNA Polymerase Ternary Complex. Biochemistry, 2011. 50(4): p. 581-90））（S. Wynne and A. Leslie、非公開の構造）。ｃ）引き起こされる電荷反転を示すＥ６６４Ｋ変異以外は（ｂ）と同様。
図４９．ＲＮＡポリメラーゼ最適化 ａ）６６４位のスクリーニング。ＴｇｏＴ Ｙ４０９Ｎ 位Ｅ６６４は、ｉＰＣＲ（ＮＮＫコドンを使用して）によって多様化し、１９０のコロニーはＰＡＡによってスクリーニングした。活性変異体は、配列決定し、ｄＮＴＰ活性によって標準化した５×溶解物は、ＮＴＰ活性についてスクリーニングした。ｂ）立体的ゲートスクリーニング。ＴｇｏＴ Ｅ６６４Ｋ（Ｙ４０９）の立体的ゲートを多様化し、Ｅ６６４位に関してスクリーニングした。
図５０．ＴＧＫ ＲＮＡポリメラーゼ及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのエラースペクトル ａ）ＴＧＫ ｂ）Ｔ７
図５１．終了可能性 それぞれのＮＴＰ組み込みステップの終了の可能性の分析は、Ｅ６６４Ｋ変異の効果を明らかに実証する：ＴＧＥ（ＴｇｏＴ Ｙ４０９Ｇ）は６つのＮＴＰを組み込むことができるが、プライマー鎖の１００％が、＋６で終了する。対照的に、ＴＹＫ（ＴｇｏＴ Ｅ６６４Ｋ）及びＴＧＫ（ＴｇｏＴ Ｙ４０９Ｇ／Ｅ６６４Ｋ）は、＋６以上にＮＴＰを組み込むことができ、終了可能性における明らかな変化をほとんど有していない。
実施例２５に対する参考文献
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上記の本明細書において言及される刊行物はすべて、参照によって本明細書において組み込まれる。本発明の記載される態様及び実施形態の様々な修飾及び変形は、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者らに明らかになるであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載したが、主張される本発明がそのような特定の実施形態に不当に限定されないことが理解されたい。実際、当業者らに明らかな、本発明を実行するための記載されるモードの様々な修飾は、以下の請求項の範囲内にあるように意図される。

Claims (16)

  1. ＤＮＡヌクレオチドポリマー鋳型から非ＤＮＡヌクレオチドポリマーを産生することができる核酸ポリメラーゼであって、
    以下のいずれかのアミノ酸配列からなる前記核酸ポリメラーゼ。
    （ｉ）配列番号１のアミノ酸配列において、Ｖ９３Ｑ、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ａ４８５Ｌ、Ｖ５８９Ａ、Ｅ６０９Ｋ、Ｉ６１０Ｍ、Ｋ６５９Ｑ、Ｅ６６４Ｑ、Ｑ６６５Ｐ、Ｒ６６８Ｋ、Ｄ６６９Ｑ、Ｋ６７１Ｈ、Ｋ６７４Ｒ、Ｔ６７６Ｒ、Ａ６８１Ｓ、Ｌ７０４Ｐ、及びＥ７３０Ｇの置換変異を有するアミノ酸配列：
    （ii）配列番号１のアミノ酸配列において、Ｖ９３Ｑ、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ａ４８５Ｌ、Ｅ６５４Ｑ、Ｅ６５８Ｑ、Ｋ６５９Ｑ、Ｖ６６１Ａ、Ｅ６６４Ｑ、Ｑ６６５Ｐ、Ｄ６６９Ａ、Ｋ６７１Ｑ、Ｔ６７６Ｋ、及びＲ７０９Ｋの置換変異を有するアミノ酸配列：
    （iii）配列番号１のアミノ酸配列において、Ｖ９３Ｑ、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｙ４０９Ｎ、Ａ４８５Ｌ、及びＥ６６４Ｑ置換変異を有するアミノ酸配列：
    （iv）配列番号１のアミノ酸配列において、Ｖ９３Ｑ、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ａ４８５Ｌ、及びＥ６６４Ｋの置換変異を有するアミノ酸配列：
    （ｖ）配列番号１のアミノ酸配列において、Ｖ９３Ｑ、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｙ４０９Ｇ、Ａ４８５Ｌ、及びＥ６６４Ｋの置換変異を有するアミノ酸配列：
    （vi）配列番号１のアミノ酸配列において、Ｖ９３Ｑ、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｙ４０９Ｎ、Ａ４８５Ｌ、及びＥ６６４Ｑの置換変異を有するアミノ酸配列：
  2. 非ＤＮＡヌクレオチドポリマーが、ＲＮＡポリマーである、請求項１に記載の核酸ポリメラーゼ。
  3. ＲＮＡヌクレオチドポリマーを作製するための方法であって、請求項２に記載の核酸ポリメラーゼとＤＮＡ鋳型とを接触させるステップ及びポリメリゼーションさせるためにインキュベートするステップを含む方法。
  4. ＤＮＡヌクレオチドポリマー鋳型からＨＮＡヌクレオチドポリマーを産生することができる、請求項１に記載の核酸ポリメラーゼ。
  5. ＤＮＡヌクレオチドポリマー鋳型からＨＮＡヌクレオチドポリマーを産生することができ、以下のアミノ酸配列からなる、請求項４に記載の核酸ポリメラーゼ。
    （ｉ）配列番号１のアミノ酸配列において、Ｖ９３Ｑ、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ａ４８５Ｌ、Ｖ５８９Ａ、Ｅ６０９Ｋ、Ｉ６１０Ｍ、Ｋ６５９Ｑ、Ｅ６６４Ｑ、Ｑ６６５Ｐ、Ｒ６６８Ｋ、Ｄ６６９Ｑ、Ｋ６７１Ｈ、Ｋ６７４Ｒ、Ｔ６７６Ｒ、Ａ６８１Ｓ、Ｌ７０４Ｐ、及びＥ７３０Ｇの置換変異を有するアミノ酸配列：
  6. ＨＮＡヌクレオチドポリマーを作製するための方法であって、請求項４又は５に記載の核酸ポリメラーゼとＤＮＡ鋳型とを接触させるステップ及びポリメリゼーションさせるためにインキュベートするステップを含む方法。
  7. ＨＮＡヌクレオチドポリマーをＤＮＡヌクレオチドポリマーに逆転写することができる核酸ポリメラーゼであって、
    配列番号１のアミノ酸配列において、Ｉ５２１Ｌ、Ｉ５２１Ｐ、及びＩ５２１Ｈからなる群から選択される置換変異を有するアミノ酸配列からなる前記核酸ポリメラーゼ。
  8. 置換変異Ｉ５２１Ｌを含む、請求項７に記載の核酸ポリメラーゼ。
  9. 置換変異Ａ４８５Ｌをさらに含む、請求項７又は８に記載の核酸ポリメラーゼ。
  10. 置換変異Ｖ９３Ｑをさらに含む、請求項７〜９のいずれかに記載の核酸ポリメラーゼ。
  11. 置換変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａをさらに含む、請求項７〜１０のいずれかに記載の核酸ポリメラーゼ。
  12. ポリメラーゼが、置換変異Ｉ５２１Ｌを含み、前記ポリメラーゼが、置換変異Ａ４８５Ｌをさらに含み、前記ポリメラーゼが、置換変異Ｖ９３Ｑをさらに含み、前記ポリメラーゼが、置換変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａをさらに含む、請求項７〜１１のいずれかに記載の核酸ポリメラーゼ。
  13. ＤＮＡヌクレオチドポリマーを作製するための方法であって、請求項７〜１２のいずれかに記載の核酸ポリメラーゼとＨＮＡ鋳型とを接触させるステップ及びポリメリゼーションさせるためにインキュベートするステップを含む方法。
  14. 請求項１、２、４、５及び７〜１２のいずれかに記載のポリメラーゼをコードする核酸。
  15. 請求項１４に記載の核酸を含む宿主細胞。
  16. （ｉ）ＨＮＡヌクレオチドポリマーをＤＮＡヌクレオチドポリマー鋳型から産生することができる、請求項４又は５に記載の核酸ポリメラーゼ及び
    （ii）ＨＮＡヌクレオチドポリマーをＤＮＡヌクレオチドポリマーに逆転写することができる、請求項７〜１２のいずれかに記載の核酸ポリメラーゼ
    を含む系。
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