WO2016153053A1 - 改変ポリメラーゼ - Google Patents

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WO2016153053A1
WO2016153053A1 PCT/JP2016/059727 JP2016059727W WO2016153053A1 WO 2016153053 A1 WO2016153053 A1 WO 2016153053A1 JP 2016059727 W JP2016059727 W JP 2016059727W WO 2016153053 A1 WO2016153053 A1 WO 2016153053A1
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lna
dna
polymerase
primer
amino acid
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PCT/JP2016/059727
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聡 小比賀
秀和 星野
邦彦 森廣
勇矢 笠原
正靖 ▲桑▼原
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国立大学法人大阪大学
国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所
国立大学法人群馬大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides

Definitions

  • the present invention relates to a modified polymerase.
  • Nucleic acid aptamers are selected from nucleic acid libraries containing various sequences by the Systematic® Evolution of Ligands® by Exponential enrichment (SELEX) method.
  • a nucleic acid aptamer refers to a nucleic acid molecule that can specifically bind to a target molecule by its three-dimensional structure.
  • Nucleic acid aptamers are expected as molecular target drugs because they bind specifically to target molecules and thus have few side effects; they can be chemically synthesized in large quantities;
  • Nucleic acid aptamers can be synthesized using natural nucleic acids such as DNA and RNA, but such natural nucleic acids can be easily degraded in vivo by nucleolytic enzymes. Therefore, it is necessary to protect these natural nucleic acids from degradation by replacing them with artificial nucleic acids with chemical modifications. However, when they are replaced with artificial nucleic acids, a decrease in activity due to aptamer structural changes frequently occurs. .
  • xenonucleic acid As an artificial nucleic acid that can be substituted for the above-mentioned natural nucleic acid, xenonucleic acid (XNA) is known. It is expected to obtain an aptamer having resistance to degrading enzymes by performing SELEX using a library containing artificial nucleic acid XNA in advance.
  • an XNA library is prepared through transcription from a DNA library to XNA (DNA ⁇ XNA), and then the sequence obtained by selection is reverse-transcribed (XNA ⁇ DNA) from the XNA in the sequence to DNA. Amplify.
  • transcription an XNA chain is synthesized using a DNA chain as a template, and in reverse transcription, a DNA chain is synthesized using an XNA chain as a template. These synthesis reactions are also called chain extension reactions, and are usually carried out using enzymes as catalysts.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a heat-resistant DNA-dependent DNA polymerase is used.
  • LNA degradation enzyme resistance
  • Non-Patent Document 1 discloses six types of XNA, namely 1,5-anhydrohexitol nucleic acid (HNA), cyclohexenyl nucleic acid (CeNA), 2′-O, 4′-C-methylene- ⁇ -D.
  • Ribonucleic acid also referred to as “2,4-BNA (bridged nucleic acid) / LNA (locked nucleic acid)
  • ANA arabino nucleic acid
  • FANA 2′-fluoro-arabino nucleic acid
  • ⁇ -L Studies on strand synthesis reactions using threofuranosyl nucleic acid (TNA) have been reported.
  • Non-Patent Document 1 an attempt was made to produce a modified polymerase based on a DNA polymerase mutant (TgoT) derived from Thermococcus gorgonarius, a hyperthermophilic archaeon.
  • TgoT DNA polymerase mutant
  • Pol6G12, PolC7 and PolD4K catalyze DNA ⁇ XNA
  • Pol6G12 is synthesized as HNA chain
  • PolC7 is synthesized as CeNA chain and LNA chain
  • PolD4K is synthesized as ANA chain and FANA chain. It was.
  • RT521 and RT521K were reported to catalyze XNA ⁇ DNA, RT521 was reverse transcribed into HNA, TNA, ANA and FANA chains, and RT521K was reverse transcribed into CeNA and LNA chains.
  • Non-Patent Document 2 reports the creation of a random library using LNA.
  • LNA-containing oligonucleotides are generated using LNA ATP or LNA TTP. That is, among A, C, G and T bases, only A or only T is LNA, and LNA-containing oligonucleotide synthesis is performed.
  • commercially available KOD XL polymerase Novagen is used.
  • An object of the present invention is to provide a modified polymerase capable of extending a chain containing an artificial nucleic acid. It is another object of the present invention to provide a modified polymerase capable of reverse transcription from a strand containing an artificial nucleic acid to DNA.
  • the present invention provides modified polymerases as described in (i) to (iii) below.
  • the modified polymerase (i) of the present invention comprises an amino acid sequence having the following mutation (1) or (2) in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing: (1) Asparagine at position 210 is aspartic acid, tyrosine at position 409 is valine, glycine, alanine, serine, threonine, leucine, phenylalanine, aspartic acid or glutamic acid, alanine at position 485 is a neutral amino acid, and position 664 Glutamic acid is substituted with lysine, glutamine or arginine respectively; or (2) asparagine at position 210 is aspartic acid and tyrosine at position 409 is valine, glycine, alanine, serine, threonine, leucine, phenylalanine, asparagine Acid or glutamic acid, alanine at position 485 is replaced with a neutral amino acid, aspartic acid at position 614 is replaced with asparagine
  • the further modified polymerase (ii) of the present invention comprises an amino acid sequence having the following mutation (1) or (2) in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing: (1) Asparagine at position 210 is substituted with aspartic acid, alanine at position 485 is replaced with a neutral amino acid, and glutamic acid at position 664 is replaced with lysine, glutamine, or arginine; or (2) asparagine at position 210 Is substituted with aspartic acid, alanine at position 485 is replaced with a neutral amino acid, aspartic acid at position 614 is replaced with asparagine, and glutamic acid at position 664 is replaced with lysine, glutamine, or arginine.
  • Still further modified polymerase (iii) of the present invention consists of an amino acid sequence having the following mutation in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing: Asparagine at position 210 is replaced with aspartic acid, and glutamic acid at position 664 is replaced with lysine, glutamine, or arginine.
  • the present invention also provides a method for synthesizing an LNA-containing oligonucleotide chain from a DNA-containing oligonucleotide.
  • This method includes a step of reacting a template comprising the DNA-containing oligonucleotide, a primer, LNA-NTP, and modified polymerase (i) or (ii).
  • the primer is an LNA-containing primer.
  • the template includes a random sequence.
  • the present invention further provides a method for synthesizing a DNA-containing oligonucleotide chain from an LNA-containing oligonucleotide.
  • This method includes a step of reacting a template, a primer, dNTP comprising the LNA-containing oligonucleotide and the modified polymerase (ii) or (iii) of the present invention.
  • the reacting step comprises 120 mM Tris- Performed in a buffer containing HCl (pH 7-9), 10 mM KCl, 6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , and 10 ⁇ g / mL bovine serum albumin (BSA).
  • the present invention also relates to a modified polymerase having LNA chain elongation activity, a mutation that attenuates exonuclease activity, a mutation that contributes to binding of triphosphates, and a mutation that enhances binding to DNA / LNA duplex
  • a modified polymerase is provided that is a polymerase modified to include
  • the modified polymerase further comprises a mutation that alleviates recognition of the sugar structure of the triphosphate.
  • the present invention also relates to a modified polymerase having reverse transcription activity, including a mutation that attenuates exonuclease activity and a mutation that enhances binding to DNA / LNA duplex, or a mutation that attenuates exonuclease activity And a mutation modified to include a mutation that enhances the binding to the DNA / LNA duplex and a mutation that contributes to the binding of the triphosphate.
  • a modified polymerase capable of extending a chain containing LNA that is an artificial nucleic acid is provided. Furthermore, according to the present invention, a modified polymerase capable of reverse transcription from a strand containing LNA to DNA is also provided. This allows for stable extension of the LNA chain from DNA. Also, reverse transcription reaction from LNA chain to DNA is possible.
  • Mutant 2 does not contain LNA-NTP (condition 1), lacks LNA-ATP, LNA-CTP, LNA-GTP and LNA-TTP (conditions 2-5), and lacks LNA-NTP. It is an electrophoresis photograph which shows the result of having performed LNA chain
  • FIG. 5 is an electrophoretogram showing the results of an LNA chain extension reaction under conditions 2-5) and conditions that do not lack LNA-NTP (condition 6).
  • FIG. 5 is an electrophoretogram showing the results of an LNA chain extension reaction under conditions 2-5) and conditions that do not lack LNA-NTP (condition 6).
  • amino acid substitutions are expressed as follows.
  • “E664K” represents a mutant in which glutamic acid at position 664 is replaced with lysine.
  • each replacement is shown by separating them with “/”.
  • “N210D / Y409V / A485L / D614N / E664K” describes asparagine at position 210 as aspartic acid, tyrosine at position 409 as valine, alanine at position 485 as leucine, aspartic acid at position 614 as asparagine, and A mutant in which glutamic acid at position 664 is replaced with lysine is shown.
  • the description “Y409” indicates that position 409 is tyrosine.
  • the modified polymerase (i) of the present invention comprises an amino acid sequence having the following mutation (1) or (2) in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing: (1) Asparagine at position 210 is aspartic acid, tyrosine at position 409 is valine, glycine, alanine, serine, threonine, leucine, phenylalanine, aspartic acid or glutamic acid, alanine at position 485 is a neutral amino acid, and position 664 Glutamic acid is substituted with lysine, glutamine or arginine respectively; or (2) asparagine at position 210 is aspartic acid and tyrosine at position 409 is valine, glycine, alanine, serine, threonine, leucine, phenylalanine, asparagine Acid or glutamic acid, alanine at position 485 is replaced with a neutral amino acid, aspartic acid at position 614 is replaced with asparagine
  • the further modified polymerase (ii) of the present invention comprises an amino acid sequence having the following mutation (1) or (2) in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing: (1) Asparagine at position 210 is substituted with aspartic acid, alanine at position 485 is replaced with a neutral amino acid, and glutamic acid at position 664 is replaced with lysine, glutamine, or arginine; or (2) asparagine at position 210 Is substituted with aspartic acid, alanine at position 485 is replaced with a neutral amino acid, aspartic acid at position 614 is replaced with asparagine, and glutamic acid at position 664 is replaced with lysine, glutamine, or arginine.
  • Still further modified polymerase (iii) of the present invention consists of an amino acid sequence having the following mutation in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing: Asparagine at position 210 is replaced with aspartic acid, and glutamic acid at position 664 is replaced with lysine, glutamine, or arginine.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing corresponds to the amino acid sequence of Thermococcus Kodakaraensis KOD1 DNA-dependent DNA polymerase (also referred to herein as “KOD polymerase”). Its origin does not matter.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids other than the predetermined substitution are deleted, substituted or added, Including those having polymerase activity.
  • one or several amino acids are deleted, substituted or added within a range in which the predetermined substitution is retained and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 has a sequence identity of 95% or more, and the predetermined polymerase activity
  • amino acid substitution in “one or several amino acids are deleted, substituted or added” herein may be any substitution as long as each function or effect is substantially maintained. For example, conservative substitution can be mentioned.
  • conservative substitution include substitution within the following groups (ie, between amino acids shown in parentheses): (glycine, alanine), (valine, isoleucine, leucine), (aspartic acid, glutamic acid) ), (Asparagine, glutamine), (serine, threonine), (lysine, arginine), (phenylalanine, tyrosine).
  • identity of a sequence is a relationship between two or more proteins or two or more polynucleotides determined by comparing the sequences, as is known in the art. Sequence “identity” means between protein or polynucleotide sequences, as determined by alignment between protein or polynucleotide sequences, or in some cases by alignment between a series of partial sequences. Means the degree of sequence invariance. Also, “similarity” refers to a protein or polynucleotide sequence as determined by alignment between protein or polynucleotide sequences, or in some cases by alignment between a series of partial sequences. It means the degree of correlation.
  • the method for determining identity and similarity is preferably a method designed to align the longest between the sequences to be compared. Methods for determining identity and similarity are provided as programs available to the public. For example, the BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) program by Altschul et al. (Eg Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215: 403-410; Altschyl et al, Nucleic Acids Res., 1997, 25: 3389-3402 ) Can be determined.
  • the conditions for using software such as BLAST are not particularly limited, but it is preferable to use default values.
  • the modified polymerase (i) has LNA chain elongation activity.
  • the modified polymerase (i) is preferably N210D / Y409V / A485L / E664K; or N210D / Y409V / A485L / D614N / E664K, N210D / Y409G / A485L / D614N / E664K, N210D / Y409A / A485L / D614, N210D / Y409S / A485L / D614N / E664K, N210D / Y409T / A485L / D614N / E664K, N210D / Y409L / A485L / D614N / E664K, N210D / Y409F / A485L / D614N / E664D / N614
  • the modified polymerase (ii) has LNA chain elongation activity.
  • the modified polymerase (ii) has reverse transcription activity from LNA to DNA.
  • the modified polymerase (ii) preferably has a mutation of N210D / A485L / E664K or N210D / A485L / D614N / E664K. N210D / A485L / E664Q is also preferred.
  • the modified polymerase (iii) has a reverse transcription activity from LNA to DNA (“reverse transcription activity”).
  • the modified polymerase (iii) preferably has a mutation of N210D / E664K or N210D / E664R.
  • LNA means 2′-O, 4′-C-methylene- ⁇ -D-ribonucleic acid (“2,4-BNA (bridged nucleic acid) / LNA (locked nucleic acid). ) ").
  • the “LNA chain” is an oligonucleotide containing LNA, for example, the following formula:
  • LNA chain elongation activity refers to the 3′-hydroxyl group of DNA annealed to template DNA or the oligonucleotide (eg, primer) of LNA and the 5′-triphosphate group of LNA. This refers to the activity of catalyzing the reaction that causes the template-dependent synthesis of LNA-containing oligonucleotides of DNA, that is, the elongation of LNA chains, by covalently binding ⁇ -phosphate.
  • the LNA chain extension activity can be determined by a method commonly used by those skilled in the art, for example, using the procedure described in Reference Example 3.
  • LNA is used as a substrate for LNA chain extension by the modified polymerase of the present invention.
  • methyl C-type LNA a methyl group is added to the 5-position carbon atom of the pyrimidine ring of cytosine of LNA.
  • reverse transcription activity from LNA to DNA refers to a template LNA-containing oligonucleotide or DNA oligonucleotide annealed to a polynucleotide (eg, primer ) Of 3) -hydroxyl group of LNA) is covalently bound to ⁇ -phosphate of 5′-triphosphate group of LNA, thereby catalyzing the reaction that causes synthesis of template-dependent DNA-containing oligonucleotide, that is, DNA strand elongation.
  • the reverse transcription activity can be determined by a method commonly used by those skilled in the art, for example, using the procedure described in Example 8.
  • the structural features of the modified polymerase having LNA chain extension activity include the following.
  • the three-dimensional structure of KOD polymerase is shown, for example, in Kai et al., J. Mol. Biol. 2001, 306, 469-477, and the functional site is largely an N-terminal region (“N-ter”: 1-130).
  • N-ter N-terminal region
  • Exo exonuclease region
  • Polymerase active region Palm region: 369-449 and 500-587, Fingers region: 450-499, and Thumb -1 and Thumb-2 regions (in the present specification, collectively referred to as "Thumb regions”): 588 to 774).
  • N210D substitution of asparagine at position 210 with aspartic acid
  • This N210D is commonly present in modified polymerases having LNA chain extension activity.
  • A485 (alanine at position 485) is located in the Fingers region and is thought to contribute to the binding of the triphosphate.
  • the alanine at position 485 can be replaced with a neutral amino acid (eg, leucine, isoleucine, phenylalanine, methionine).
  • a small bulk alanine can be replaced with a neutral amino acid (eg, leucine, isoleucine, phenylalanine, methionine) that can also be a bulky hydrophobic amino acid.
  • D614N substitution of aspartic acid at position 614 to asparagine
  • E664K substitution of glutamic acid at position 664 to lysine
  • D614N substitution of aspartic acid at position 614 to asparagine
  • E664K substitution of glutamic acid at position 664 to lysine
  • aspartic acid at position 614 can be replaced with asparagine
  • glutamic acid at position 664 can be replaced with lysine, glutamine, or arginine. It may be a substitution mutation only at position 664, or a substitution mutation at positions 614 and 664.
  • Y409 (tyrosine at position 409) can be further substituted.
  • Y409 is located in the Palm region and touches the sugar part of LNA-NTP.
  • Y409 can be substituted with valine, glycine, alanine, serine, threonine, leucine, phenylalanine, aspartic acid or glutamic acid.
  • Y409 substitution mutations can be made with the substitution mutations described above, ie, substitution mutations at positions 210, 485 and 664, or positions 210, 485, 614 and 664.
  • substitution of Y409 can be made with substitution of N210D, A485L, D614N and E664K.
  • Substitution of Y409 can alleviate the recognition of the sugar structure of the triphosphate and improve the uptake rate of LNA-NTP.
  • Y409 By replacing Y409 with an amino acid having a small size (bulk) group (for example, glycine, alanine or serine), higher LNA chain elongation activity can be obtained, and Y409 is valine (Y409V) or threonine.
  • Y409T By substituting (Y409T), LNA extension can be obtained with higher accuracy.
  • Modified polymerases with LNA chain extension activity have been modified to include mutations that attenuate exonuclease activity, mutations that contribute to triphosphate binding, and mutations that enhance binding to DNA / LNA duplexes It can be designed to be a polymerase.
  • the modified polymerase further comprises a mutation that alleviates recognition of the triphosphate sugar structure.
  • the structural characteristics of the modified polymerase having reverse transcription activity include the following. It is considered that the modified polymerase having activity has the following characteristics.
  • N210D substitution of asparagine at position 210 with aspartic acid attenuates exonuclease activity. This N210D is commonly present in modified polymerases having reverse transcription activity.
  • E614N is included together with E664K
  • reverse transcription activity is improved in combination with A485L.
  • the alanine at position 485 can be substituted with a neutral amino acid (eg, leucine, isoleucine, phenylalanine, methionine).
  • the glutamic acid at position 664 can be replaced with lysine, glutamine, or arginine.
  • the modified polymerase having reverse transcription activity includes a mutation that attenuates exonuclease activity and a mutation that enhances binding to DNA / LNA duplex, or a mutation that attenuates exonuclease activity and DNA / LNA duplex It can be designed to be a polymerase modified to include mutations that enhance binding to the strand and mutations that contribute to triphosphate binding.
  • a conventionally known method can be used as a method for producing the modified polymerase.
  • a method for producing a mutant (modified) DNA polymerase having a new function by introducing a mutation into a gene encoding a wild-type DNA polymerase by a protein engineering technique (J. Biol. Chem., 264 (11), 6447-6458 (1989)).
  • the gene encoding the DNA polymerase into which the mutation is introduced is not particularly limited as long as it is a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the gene may be a base sequence that can be obtained from a gene registration organization such as NCBI as a DNA-dependent DNA polymerase gene of Thermococcus kodakaraensis KOD1, or a base sequence that has been subjected to codon optimization (for example, in the sequence listing). Based on sequence information such as the base sequence of SEQ ID NO: 1, it can be obtained by methods commonly used by those skilled in the art.
  • Any known method may be used for introducing a mutation into a gene.
  • protein engineering techniques such as PCR and site-specific mutation can be used.
  • the gene of the modified polymerase is inserted into an expression vector as necessary, and transformed with the expression vector using, for example, E. coli as a host, and then applied to an agar medium containing a selective agent such as kanamycin to form colonies. After inoculating the colony in a nutrient medium such as LB medium and appropriately culturing (eg, growing at 37 ° C. and then culturing at 30 ° C. in the presence of an expression inducer such as IPTG), the cells are recovered and Crush and extract the crude enzyme solution.
  • the vector is preferably a pET vector, but is not limited thereto.
  • the culture medium composition, pH, temperature, cell density during culture, and culture time can be appropriately set.
  • Any known method may be used as a method for crushing bacterial cells.
  • ultrasonic treatment a physical crushing method such as French press or glass bead crushing, or a lytic enzyme such as lysozyme can be used.
  • the crude enzyme solution can be treated by heat treatment, for example, at 80 ° C. for 10 minutes, and then the crude purified enzyme can be obtained by centrifugation, membrane filtration or the like. After this operation, it can be separated and purified by heparin sepharose column chromatography. Furthermore, the process of refine
  • the modified polymerases (i) and (ii) are synthesized by a method for synthesizing an LNA-containing oligonucleotide chain from a DNA-containing oligonucleotide (also referred to as “LNA chain extension method” in this specification), and a modified polymerase ( ii) and (iii) can be used in a method for synthesizing a DNA-containing oligonucleotide chain from an LNA-containing oligonucleotide (also referred to as “reverse transcription method” in the present specification).
  • the LNA chain extension method of the present invention includes a step of reacting a template comprising a DNA-containing oligonucleotide, a primer, LNA-NTP and a modified polymerase (i) or (ii).
  • a DNA-containing oligonucleotide as a template and a primer, LNA-NTP (that is, four types of LNA-nucleoside triphosphates each having A, T, C and G as bases) LNA-ATP, LNA-TTP, LNA-CTP and LNA-GTP) reaction
  • the primer annealed to the template is extended while incorporating LNA
  • the LNA chain (LNA-containing oligonucleotide) is used as a primer extension product.
  • the LNA chain extension method of the present invention may further include an annealing step before the reaction step using a polymerase.
  • the primer and the complementary region on the template are hybridized, and in the subsequent extension step, the LNA strand complementary to the single-stranded DNA of the template is extended from the primer as a starting point by the action of the modified polymerase of the present invention.
  • DNA-LNA strands can be formed.
  • oligonucleotide may have any length suitable for the template, and examples thereof include those having a base number of, for example, 30 to 100, preferably 35 to 75.
  • the reaction temperature for the annealing and extension may be the same conditions as in normal PCR. For example, after annealing at 95 ° C. for 1 minute and then lowering to room temperature over 1 hour, the polymerase is used. Can be added and extended at 74 ° C. Examples of the composition of the reaction solution include those shown in Table 2 below, but are not limited thereto.
  • the concentration of the enzyme added may depend on the length of the extended chain, the reaction time, and the like, but is not limited to, for example, 20 ng / ⁇ L to 300 ng / ⁇ L, preferably 200 ng / ⁇ L to 300 ng / ⁇ L.
  • the reaction time may depend on the length of the extended chain, the concentration of enzyme added, etc., but may be 1.5 to 13.5 hours, but is not limited thereto.
  • the primer may be either a DNA primer (a primer composed of DNA) or an LNA primer (a primer composed of LNA).
  • the primer may contain both DNA and LNA. From the viewpoint of avoiding a rate-limiting step in the middle of the primer extension reaction, a primer containing LNA at least in part (preferably a primer that is all LNA) is preferred.
  • the length of the primer can be determined as appropriate, and examples thereof include those having a base number of, for example, 11 to 28, preferably 12 to 25. Primers can be appropriately designed and produced by those skilled in the art based on the sequence information of the template.
  • the template may be composed of a specific sequence or may include a random sequence.
  • the length of the random sequence is, for example, 10 to 50 bases.
  • the reverse transcription method of the present invention includes a step of reacting a template composed of an LNA-containing oligonucleotide, a primer, dNTP, and a modified polymerase (ii) or (iii).
  • a modified polymerase ii) or (iii).
  • an LNA-containing oligonucleotide is used as a template, and a primer, dNTP (that is, four types of deoxynucleoside triphosphates (dATP, dTTP) each having A, T, C, and G as bases.
  • the reverse transcription method of the present invention may further include an annealing step before the reaction step using a polymerase.
  • the primer and the complementary region on the template are hybridized, and in the subsequent extension step, a DNA strand complementary to the single-stranded LNA of the template is extended by the action of the modified polymerase of the present invention starting from the primer. And an LNA-DNA strand can be formed.
  • the primer for the reverse transcription method can be a DNA primer (a primer composed of DNA).
  • the length of the primer can be determined as appropriate, and examples thereof include those having a base number of, for example, 11 to 28, preferably 12 to 25. Primers can be appropriately designed and produced by those skilled in the art based on the sequence information of the template.
  • the template for the reverse transcription method may be composed of a specific sequence or may include a random sequence.
  • the length of the random sequence is, for example, 10 to 50 bases.
  • the template for the reverse transcription method may be an LNA chain transcribed based on a DNA template (for example, an LNA chain produced by the LNA chain extension method of the present invention).
  • the reaction temperature for annealing and extension can be the same as that for normal PCR. For example, after annealing at 95 ° C. for 1 minute, the temperature is lowered to room temperature over 1 hour for annealing. After performing, the polymerase can be added and extended at 74 ° C.
  • the composition of the reaction solution include those shown in Example 8, but are not limited thereto.
  • the concentration of the enzyme added may depend on the length of the extended chain, the reaction time, and the like, but is, for example, 10 ng / ⁇ L to 300 ng / ⁇ L, preferably 10 ng / ⁇ L to 100 ng / ⁇ L, but is not limited thereto.
  • the reaction time may depend on the length of the extended chain, the concentration of the enzyme added, etc., but may be 30 minutes to 3 hours, but is not limited thereto.
  • a divalent ion such as magnesium ion for example, as MgSO 4
  • a buffer solution for example, a commercially available PCR buffer solution (for example, KOD-Plus-Ver.2 Buffer (manufactured by Toyobo Co., Ltd.)) and any buffer prepared by those skilled in the art.
  • Solutions eg, buffers containing 120 mM Tris-HCl (pH 7-9), 10 mM KCl, 6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , and 10 ⁇ g / mL bovine serum albumin (BSA)
  • the pH of the buffer may vary depending on the buffer temperature and the extension reaction temperature.
  • the pH decreases by about 0.025, and the elongation reaction temperature can also affect the working pH.
  • the LNA chain extension reaction and reverse transcription method contains 120 mM Tris-HCl (pH 7-9), 10 mM KCl, 6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , and 10 ⁇ g / mL bovine serum albumin (BSA). In buffer. This buffer further contains 0.1% Triton® X-100.
  • the pH of the buffer is preferably pH 8-8. And pH 8.8 is more preferable than pH 8 in terms of the elongation efficiency of the LNA chain.
  • Example 1 Production of modified polymerase
  • (1-1: Construction of plasmid) The KOD polymerase gene was prepared by removing the intein sequence in advance by artificial gene synthesis and optimizing the codon (base sequence of SEQ ID NO: 1; the amino acid sequence encoded thereby is shown in SEQ ID NO: 2). Gene synthesis was commissioned to operon biotechnology.
  • the KOD polymerase gene was inserted between the NdeI site and SalI site of pET49 vector (Novagen), and an expression plasmid was constructed so that the KOD polymerase protein did not contain extra sequences such as tags.
  • the method of PrimeSTAR (registered trademark) Mutagenesis Basal Kit (TAKARA) was used for the point mutation introduction.
  • the nucleotide sequence of the KOD polymerase mutant gene was analyzed for the KOD polymerase mutant expression plasmid to confirm that the target sequence was correctly inserted. Table 1 lists the combinations of mutations introduced.
  • the KOD polymerase mutant expression plasmid was introduced into T7 Express Competent E. coli (High Efficiency) (NEB) by the heat shock method, spread on an LB / Km (50 ⁇ g / mL) plate, and allowed to stand at 37 ° C. The grown colonies were shaken at 37 ° C. on TB medium / 1% glucose / Km (50 ⁇ g / mL). When OD 600 reached 0.4 to 0.6, 1/1000 vol of 1M IPTG was added (final 1 mM), and the culture temperature was changed to 30 ° C. to induce expression. Six hours after adding IPTG, the culture was centrifuged to remove the supernatant, and E.
  • E. coli was recovered. E. coli was stored at ⁇ 80 ° C. and thawed during purification. The thawed E. coli was suspended in a buffer solution (10 mM sodium phosphate, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 10% glycerol), and the cells were disrupted by ultrasonic waves. After the E. coli disrupted solution was centrifuged (4 ° C., 8000 g, 5 minutes), the supernatant was recovered and heated in an 80 ° C. hot water bath for 10 minutes.
  • a buffer solution 10 mM sodium phosphate, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 10% glycerol
  • Contaminating proteins denatured by heating were removed by centrifugation (4 ° C., 8000 g, 5 minutes), and the supernatant was passed through a 0.45 ⁇ m PVDF membrane filter to completely remove fine particles.
  • the resulting crude purified solution was purified by AKTA pure (GE Healthcare) using HiTrap Heparin HP Columns (5 mL).
  • AKTA pure GE Healthcare
  • HiTrap Heparin HP Columns 5 mL.
  • For the KOD polymerase mutant adsorbed on the column gradually increase the NaCl concentration of the buffer solution (10 mM sodium phosphate, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 10% glycerol) from 100 mM to 2 M to the elution fraction. The peak was obtained.
  • the elution fraction was concentrated by ultrafiltration using Amicon Ultra 4 (30K) (Millipore), the buffer solution was replaced, and finally the storage buffer (Storage Buffer: 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)) 50 mM KCl, 50% glycerol, 0.1% Tween 20, 0.1% Nonidet P40) and stored at ⁇ 20 ° C.
  • Storage Buffer 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)
  • 50 mM KCl, 50% glycerol, 0.1% Tween 20, 0.1% Nonidet P40 50% glycerol, 0.1% Tween 20, 0.1% Nonidet P40
  • LNA-A (102 mg, 3.65 ⁇ 10 ⁇ 4 mol, 1.0 eq) and a stirring bar were placed in a 100 mL eggplant flask and dried overnight under reduced pressure, and azeotroped twice with dry-DMF (6 mL). It was then azeotroped 3 times with dry-MeCN (6 mL).
  • Proton sponge (117 mg, 5.46 ⁇ 10 ⁇ 4 mol, 1.46 eq) that had been dried under reduced pressure overnight was added, and further dried under reduced pressure overnight. The atmosphere was replaced with argon, a septum cap in the desiccator was attached, and an argon balloon was attached.
  • Trimethyl phosphate (1.3 mL, 1.29 ⁇ 10 ⁇ 2 mol, 36 eq) was added, suspended and allowed to stir in an ice bath for 30 minutes.
  • POCl 3 (55 ⁇ L, 5.90 ⁇ 10 ⁇ 4 mol, 1.5 eq) was added and stirred for 45 minutes in an ice bath.
  • dry-tributylamine 350 ⁇ L, 1.46 ⁇ 10 ⁇ 3 mol, 4.0 eq
  • 0.5 M DMF pyrophosphate (3.7 mL, 1.87 ⁇ 10 ⁇ 3 mol, 5.0 eq) were added. The mixture was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • LNA-T (103 mg, 3.81 ⁇ 10 ⁇ 4 mol, 1.0 eq) and a stirring bar were placed in a 100 mL eggplant flask, dried under reduced pressure overnight, and azeotroped twice with dry-DMF (6 mL). It was then azeotroped 3 times with dry-MeCN (6 mL).
  • Proton sponge (119 mg, 5.55 ⁇ 10 ⁇ 4 mol, 1.46 eq) that had been dried under reduced pressure overnight was added, and then further dried under reduced pressure overnight. The atmosphere was replaced with argon, a septum cap in the desiccator was attached, and an argon balloon was attached.
  • Trimethyl phosphate (1.4 mL, 1.39 ⁇ 10 ⁇ 2 mol, 36 eq) was added, completely dissolved, and stirred in an ice bath for 30 minutes.
  • POCl 3 (60 ⁇ L, 6.44 ⁇ 10 ⁇ 4 mol, 1.5 eq) was added, and the mixture was stirred for 45 minutes in an ice bath.
  • dry-tributylamine 400 ⁇ L, 1.67 ⁇ 10 ⁇ 3 mol, 4.0 eq
  • 0.5 M DMF pyrophosphate (4.0 mL, 2.02 ⁇ 10 ⁇ 3 mol, 5.0 eq) were added. The mixture was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • LNA-G (101 mg, 2.76 ⁇ 10 ⁇ 4 mol, 1.0 eq) and a stirring bar were placed in a 100 mL eggplant flask, dried under reduced pressure overnight, and azeotroped twice with dry-DMF (6 mL). It was then azeotroped 3 times with dry-MeCN (6 mL).
  • Proton sponge (118 mg, 5.51 ⁇ 10 ⁇ 4 mol, 1.5 eq) that had been dried under reduced pressure overnight was added, and further dried under reduced pressure overnight. The atmosphere was replaced with argon, a septum cap in the desiccator was attached, and an argon balloon was attached.
  • Trimethyl phosphate (1.0 mL, 9.94 ⁇ 10 ⁇ 3 mol, 36 eq) was added, suspended and allowed to stir in an ice bath for 30 minutes.
  • POCl 3 (40 ⁇ L, 4.29 ⁇ 10 ⁇ 4 mol, 1.5 eq) was added, and the mixture was stirred for 45 minutes in an ice bath.
  • dry-tributylamine (260 ⁇ L, 1.09 ⁇ 10 ⁇ 3 mol, 4.0 eq) and 0.5M DMF pyrophosphate (2.8 mL, 1.41 ⁇ 10 ⁇ 3 mol, 5.0 eq) were added. The mixture was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • Trimethyl phosphate (4.5 mL, 4.47 ⁇ 10 ⁇ 2 mol, 120 eq) was added, suspended and allowed to stir in an ice bath for 30 minutes.
  • POCl 3 60 ⁇ L, 6.44 ⁇ 10 ⁇ 4 mol, 1.5 eq was added, and the mixture was stirred for 45 minutes in an ice bath.
  • dry-tributylamine 400 ⁇ L, 1.67 ⁇ 10 ⁇ 3 mol, 4.0 eq
  • 0.5 M DMF pyrophosphate (3.8 mL, 1.92 ⁇ 10 ⁇ 3 mol, 5.0 eq) were added. The mixture was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • Reference Examples 1 to 3 show the techniques used for examining the activity of KOD polymerase mutants. In this example, the methods of Reference Examples 1 to 3 below were used unless otherwise specified.
  • the agarose used was for separation of low molecular weight nucleic acids (Agarose 21 (Nippon Gene)).
  • the composition of the gel, electrophoresis buffer, and loading dye are as follows. Gel: 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, 5% agarose, running buffer: 5 mM NaOH, 2 mM EDTA, 6 ⁇ loading dye: 300 mM NaOH, 12 mM EDTA, 30% glycerol, 0.1% bromophenol blue. Before running, the gel was equilibrated by soaking in running buffer for 1 hour. Electrophoresis was performed under conditions of room temperature and 3 V / cm constant voltage. For detection of single-stranded LNA, analysis was performed by PharosFX (manufactured by Bio-Rad) using a fluorescent dye labeled with a primer.
  • Example 3 Examination of LNA chain elongation activity of KOD polymerase mutant
  • strand extension activity was compared using primer strand: 5'_6-FAM_labeled primer P2 and template strand: Template DNA N10.
  • the reaction was allowed to proceed at 74 ° C. for 30 minutes.
  • Figure 1 shows the analysis results.
  • the result of selecting a representative example from FIG. 1 and analyzing by denaturing PAGE is shown in FIG.
  • the result of the unmodified wild type (“WT”) is shown as a control.
  • WT unmodified wild type
  • Primer primer
  • Primer + 10mer extension corresponding to the extension of the template
  • Mutation A485L common to mutants A2, A34, A13, A26, A48, and A53 is located in the Fingers region and is thought to contribute to the binding of triphosphates.
  • mutation Y409V common to A34 and A53 relaxes the recognition of the sugar structure of the triphosphate.
  • the inclusion of RNA in the DNA strand is inconvenient for survival, and thus is restricted by nucleotide sugar recognition so that NTP incorporation does not occur. However, this restriction causes a decrease in the uptake activity of LNA-NTP with a modified sugar moiety.
  • Mutation Y409V improves the uptake rate of LNA-NTP by relaxing sugar part recognition.
  • Example 4 Preparation of LNA library using KOD polymerase mutant
  • Table 4 The composition of the reaction solution used to create the LNA library is shown in Table 4 below. After heating the reaction solution to which KOD polymerase mutant has not been added at 95 ° C. for 1 minute and then lowering it to room temperature over 1 hour, KOD polymerase mutant 1 or 2 was added to perform the LNA chain extension reaction. Proceeded. As a control, a DNA library was prepared using the same amount of dATP, dCTP, dGTP and dTTP instead of LNA-ATP, LNA-CTP, LNA-GTP and LNA-TTP in Table 4.
  • Primer strand 5'_6-FAM_labeled primer P2
  • Template strand Template DNA N30 was used to create a 30mer LNA library.
  • the composition of the reaction solution is as shown in Table 4.
  • a DNA library was prepared using dATP, dCTP, dGTP and dTTP instead of LNA-ATP, LNA-CTP, LNA-GTP and LNA-TTP.
  • Comparison was performed using KOD polymerase mutant 2 under the conditions of reaction time: 1.5 hours, 3 hours, 6 hours, and 9 hours.
  • a 30-mer LNA extension reaction product began to be produced at an extension time of 1.5 hours, indicating that the reaction time for preparing an LNA library can be reduced from 9 hours (FIG. 4).
  • the primer was degraded by the weak exonuclease activity of the KOD polymerase mutant (FIG. 5, condition 1).
  • condition 6 the extension reaction is stopped halfway under the conditions that lack LNA-ATP, LNA-CTP, LNA-GTP, and LNA-TTP (conditions 2 to 5). Was shown to do. This has shown that incorporation of incorrect bases is limited to some extent and has a certain accuracy.
  • Example 7 LNA chain extension reaction using LNA primer by KOD polymerase mutant
  • Primer strand 5'_6-FAM_labeled primer P2 (DNA primer), 5'_6-FAM_labeled primer LP2 (LNA primer), template strand: Template DNA N30, polymerase: Mutant 2 and reaction time 1.5 hours, The reaction proceeded at 3 hours, 4.5 hours and 6 hours.
  • a DNA library using dNTP was prepared for DNA primers.
  • Each reaction solution is as shown in Table 4 except that the conditions in Table 6 below are followed.
  • dATP is used instead of LNA-ATP, LNA-CTP, LNA-GTP and LNA-TTP.
  • DCTP, dGTP and dTTP were used. The result is shown in FIG. Corresponding to FIG. 6, reaction conditions are shown in Table 6 below.
  • Example 8 Synthesis of DNA strand by reverse transcription from LNA oligonucleotide by various KOD polymerase mutants
  • Table 7 shows the template and primer sequences used in the reverse transcription reaction. After heating the reaction solution to which KOD polymerase mutant has not been added at 95 ° C. for 1 minute and then lowering to room temperature over 1 hour, KOD polymerase mutant is added and reverse transcription proceeds at 74 ° C. I let you.
  • the composition of the reaction solution was the same as that shown in Table 2 except that dATP, dCTP, dGTP and dTTP were used instead of LNA-ATP, LNA-CTP, LNA-GTP and LNA-TTP. Things were used.
  • the reverse transcription reaction was performed for 30 minutes. 1/6 vol of 6 ⁇ loading dye was added to the obtained reaction solution, and 1 pmol of primer chain was applied to an alkaline agarose gel for electrophoresis.
  • FIG. 7 (A) and (B) show the results of the examined KOD polymerase mutants, and FIG. 7 (c) shows those exhibiting characteristic activities.
  • mutants In all mutants, a mutation N210D that attenuates exonuclease activity has been introduced.
  • reverse transcription it is necessary that the polymerase binds to the DNA / LNA duplex and that the 3 'end of the primer strand is correctly positioned at the reaction site.
  • mutants A4 (E664K) and A43 (E664R) in which the negatively charged amino acid in the Thumb region is changed to a positive charge the reverse transcription activity is considered to be a result of improved DNA / LNA duplex binding ability. It is done.
  • A485L involved in binding to the triphosphate does not show reverse transcription activity (mutant A2).
  • Example 9 Examination of accuracy using KOD polymerase mutant for transcription (DNA ⁇ LNA) and reverse transcription (LNA ⁇ DNA) reactions
  • a reaction was performed using A48 (mutant 1) and A53 (mutant 2) for transcription (DNA ⁇ LNA) and A51 for reverse transcription (LNA ⁇ DNA).
  • the DNA strand was inserted into pT7Blue T-Vector (Takara Bio Inc.) by TA cloning, the base sequence was analyzed, and the accuracy of the polymerase was evaluated. Since errors can occur in steps other than transcription / reverse transcription, a control experiment was conducted in which the reactions of all steps were carried out with DNA, and the error rates of transcription and reverse transcription were corrected. The procedure is described below.
  • Reaction solution composition (total reaction solution 50 ⁇ L): 1x Buffer for KOD-Plus-Ver.2 1.5 mM MgSO 4 0.2 mM LNA-NTP (control: dNTP) 0.5 ⁇ M primer (Primer hmP3) 0.6 ⁇ M template (3'-B-Template_FA2-1A) 300 ng / ⁇ L KOD-A48 or A53 (control: 0.02 U / ⁇ L KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.)).
  • reaction solution liquid volume: 40 ⁇ L
  • polymerase slow cooling to 25 ° C. for 30 seconds at 94 ° C. for 1 hour
  • 10 ⁇ L of 1500 ng / ⁇ L of polymerase variant A48 or A53 was added to react.
  • Control The reaction solution was used for PCR as it was).
  • Reaction conditions 9 hours at 74 ° C. (control: step 1: 95 ° C. for 2 minutes ( ⁇ 1), step 2: 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 1 minute ( ⁇ 3) ).
  • Reverse transcription (LNA ⁇ DNA)> Reaction solution composition (reaction solution total 50 ⁇ L): Buffer solution for 1 ⁇ KOD-Plus-Ver.2 1.5 mM MgSO 4 0.2 mM dNTP 0.5 ⁇ M primer (5'-Primer hP5) LNA template solution 2.5 ⁇ L 2 ng / ⁇ L KOD_A51 (control: 0.02 U / ⁇ L KOD-Plus-).
  • Step 1 95 ° C. for 2 minutes ( ⁇ 1)
  • Step 2 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 74 ° C. (control: 68 ° C.) for 1 minute ( ⁇ 20).
  • PCR for TA cloning: 25 ⁇ L of reaction mixture. 1 ⁇ Taq reaction buffer, 1.5 mM MgSO 4 , 0.2 mM dNTP, 0.3 ⁇ M primer (Primer hP1, Primer hP5), 2.5 ⁇ L of bead suspension trapping reverse transcription strand, 0.1 U / ⁇ L rTaq Polymerase (Toyobo Co., Ltd.). Reaction conditions: Step 1: 94 ° C. for 2 minutes ( ⁇ 1), Step 2: 94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 1 minute ( ⁇ 20). It was purified using QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Inc.) and used for TA cloning.
  • TA cloning PCR product 1.5 ⁇ L, 2.5 ng / ⁇ L, pT7Blue® T-Vector 0.5 ⁇ L, Ligation® High® Ver.2 (Toyobo Co., Ltd.) 2 ⁇ L were mixed and reacted at 16 ° C. for 60 minutes, then E. coli It was introduced into DH5 ⁇ . Each plasmid was extracted from the obtained single colony and subjected to base sequence analysis.
  • Table 8 shows the primer and template sequences used for the accuracy evaluation of LNA transcription / reverse transcription.
  • Example 10 Production of modified polymerase (KOD polymerase mutant) and examination of LNA chain elongation activity)
  • Modified polymerases (KOD polymerase mutants) shown in Table 10 were prepared and evaluated for LNA chain elongation activity using a DNA chain as a template. These KOD polymerase mutants are obtained by substituting Y409 with the following amino acids, respectively.
  • the reaction solution to which the KOD polymerase mutant was not added was heated at 95 ° C. for 1 minute, and then annealed by lowering to 25 ° C. over 60 minutes. Then, the KOD polymerase mutant was added to extend the LNA chain at 74 ° C. The reaction was allowed to proceed. 1/6 volume of 6 ⁇ loading dye was added to the resulting reaction solution, and electrophoresis was performed on an alkaline agarose gel.
  • the various KOD polymerase mutants were subjected to LNA chain extension reaction in the following three reaction solution compositions.
  • Reaction solution composition 1 ⁇ KOD-Plus-Ver.2 buffer, KOD polymerase mutant: 300 ng / ⁇ L, 0.2 mM LNA-NTP, 1.5 mM MgSO 4 , primer: 0.5 ⁇ M 5′_6-FAM_labeled primer LP2, template: 0.6 ⁇ M Template DNA N50 Reaction temperature: 74 ° C., reaction time: 60 minutes Running conditions: 25 ° C., 35 V, 2 hours Gel: 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, 5% agar Running buffer: 50 mM NaOH, 2 mM EDTA Sample: 1.2 ⁇ L (0.5 pmol primer).
  • FIGS. 8, 9 and 10 The results of evaluations 1, 2 and 3 are shown in FIGS. 8, 9 and 10, respectively.
  • KOD polymerase mutants A62, A63 and A64 showed particularly high LNA chain elongation activity. These are mutants in which Y409 is replaced with low-volume amino acids (glycine, alanine and serine, respectively).
  • LNA chain elongation activity was also observed for A65 (threonine), A53 (valine) and A68 (aspartic acid), as well as A66 (leucine) and A67 (phenylalanine). It was found that changing the buffer composition of the reaction solution enables efficient LNA chain extension (FIGS. 8 to 10).
  • LNA chain elongation efficiency is higher under the conditions (Evaluation 2) using 1 ⁇ KOD DNA polymerase buffer 1 in FIG. 9 than under the conditions (Evaluation 1) using the buffer for 1 ⁇ KOD-Plus-Ver.2. Furthermore, under the conditions (Evaluation 3) using 1 ⁇ KOD DNA polymerase buffer 2 in FIG. 10, the LNA chain elongation efficiency was particularly high. According to FIGS. 8 to 10, gel movement of A69 (glutamic acid) was also observed, and it was evaluated that it had LNA chain elongation activity. When comparing the LNA chain elongation activity between A53 and A62 to A69, higher LNA chain elongation activity was observed when the size (bulk) of the amino acid group after substitution for Y409 was smaller.
  • Example 11 Examination of accuracy of LNA chain synthesis using KOD polymerase mutant
  • the produced modified polymerase was evaluated for the accuracy of LNA incorporation.
  • the type of modified polymerase was evaluated using A53 for two types of buffer solutions.
  • an extension reaction under the condition of lacking one of the four types of bases (Conditions 2 to 5 below: Condition 1 when no base is present and Condition 6 when four types of bases are aligned) I did.
  • the LNA chain elongation reaction was performed under the following reaction solution composition and conditions, and the LNA chain elongation activity was evaluated.
  • Reaction solution composition 1 ⁇ KOD DNA polymerase buffer 2 (120 mM Tris-HCl (pH 8.8) (25 ° C.), 10 mM KCl, 6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% Triton (registered trademark) X ⁇ 100, 10 ⁇ g / mL BSA), KOD polymerase variant A53: 300 ng / ⁇ L, 1.5 mM MgSO 4 , Condition 1: No LNA-NTP Condition 2: 0.2 mM LNA- (C, G, T) TP (ie lacking LNA-ATP), Condition 3: 0.2 mM LNA- (A, G, T) TP (ie lacking LNA-CTP), Condition 4: 0.2 mM LNA- (A, C, T) TP (ie lacking LNA-GTP), Condition 5: 0.2 mM LNA- (A, C, G) TP (ie lacking LNA-TTP), Condition 6: 0.2 mM LNA
  • the 1 ⁇ KOD DNA polymerase buffer 2 having the above reaction solution composition was replaced with 1 ⁇ KOD-Plus-Ver.2 buffer solution, the reaction time was 15 hours, and the sample amount was 1.5 ⁇ L (0.625 pmol).
  • an LNA chain extension reaction was performed, and the LNA chain extension activity was evaluated.
  • Example 12 Examination of accuracy of LNA chain synthesis using KOD polymerase mutant Except that the modified polymerase A53 of Example 11 was replaced with A65, the accuracy of LNA incorporation was evaluated in the same manner as in the case of using 1 ⁇ KOD DNA polymerase buffer 2. The result is shown in FIG.
  • a modified polymerase capable of extending a chain containing LNA that is an artificial nucleic acid is provided.
  • an LNA library can be created using a DNA strand consisting of a random sequence as a template.
  • an aptamer having resistance to degrading enzymes can be obtained in advance, and thus the time required for optimizing the aptamer can be shortened.
  • artificial nucleic acid libraries can increase the size of the library and broaden the scope of candidate aptamer screening. Creation of an artificial nucleic acid library is useful for screening sequences containing artificial nucleic acids that are candidates for drugs and the like and for efficient development of nucleic acid drugs containing artificial nucleic acids.

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Abstract

　配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、所定の変異を有するアミノ酸配列からなる、改変型ポリメラーゼが開示される。本発明によれば、ＬＮＡ鎖伸長活性を有するポリメラーゼ、および逆転写活性を有するポリメラーゼが提供される。

Description

改変ポリメラーゼ
　本発明は、改変ポリメラーゼに関する。
　核酸アプタマーは、Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment（ＳＥＬＥＸ）法によって、多様な配列を含む核酸ライブラリから選出される。核酸アプタマーとは、自身の立体構造によって標的分子に特異的に結合することのできる核酸分子をいう。核酸アプタマーは、特異的に標的分子と結合するため副作用が少ない；大量に化学合成することが可能である；などのため、分子標的薬として期待される。
　核酸アプタマーはＤＮＡおよびＲＮＡのような天然核酸を用いて合成され得るが、このような天然核酸は核酸分解酵素によって生体内で容易に分解され得る。よって、これらの天然核酸は、化学修飾を付した人工核酸に置き換えることによって分解から保護する必要があるが、人工核酸への置換の際に、アプタマーの構造変化による活性の低下が高頻度で起こる。
　上記天然核酸の代替となり得る人工核酸として、キセノ核酸（Xeno Nucleic Acid：ＸＮＡ）が知られている。あらかじめ人工核酸ＸＮＡを含むライブラリを用いてＳＥＬＥＸを行うことにより、分解酵素耐性を有するアプタマーを得ることが期待される。この場合、ＤＮＡライブラリからＤＮＡからのＸＮＡへの転写（ＤＮＡ→ＸＮＡ）を通じてＸＮＡライブラリを作成し、次いで選別により得られた配列を、配列中のＸＮＡをＤＮＡに逆転写（ＸＮＡ→ＤＮＡ）して増幅させる。転写では、ＤＮＡ鎖をテンプレートとしてＸＮＡ鎖が合成され、そして逆転写では、ＸＮＡ鎖をテンプレートとしてＤＮＡ鎖が合成される。これらの合成反応は鎖伸長反応とも呼ばれ、通常、酵素を触媒として行われる。
　ＤＮＡ鎖を増幅する（すなわち、ＤＮＡ鎖をテンプレートとしてＤＮＡ鎖を伸長する）ためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）では、熱耐性型のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが用いられる。しかし、野生型のＤＮＡポリメラーゼは、特にＬＮＡのような分解酵素耐性を有する人工核酸の鎖を伸長させることは困難である。
　非特許文献１には、６種のＸＮＡ、すなわち、１，５－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン－β－Ｄ－リボ核酸（ＬＮＡ：「２，４－ＢＮＡ（bridged nucleic acid）／ＬＮＡ（locked nucleic acid）」ともいう）、アラビノ核酸（ＡＮＡ）および２’－フルオロ－アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、α－Ｌ－スレオフラノシル核酸（ＴＮＡ）を用いた鎖合成反応の検討が報告されている。
　非特許文献１では、超好熱性古細菌であるサーモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）由来のＤＮＡポリメラーゼの変異体（ＴｇｏＴ）を基盤として改変ポリメラーゼの作出が試みられた。５つの改変ポリメラーゼのうち、Ｐｏｌ６Ｇ１２、ＰｏｌＣ７およびＰｏｌＤ４ＫはＤＮＡ→ＸＮＡを触媒し、Ｐｏｌ６Ｇ１２はＨＮＡ鎖を、ＰｏｌＣ７はＣｅＮＡ鎖およびＬＮＡ鎖を、ＰｏｌＤ４Ｋは、ＡＮＡ鎖およびＦＡＮＡ鎖を合成することが報告された。残りの２つであるＲＴ５２１およびＲＴ５２１Ｋは、ＸＮＡ→ＤＮＡを触媒し、ＲＴ５２１はＨＮＡ鎖、ＴＮＡ鎖、ＡＮＡ鎖およびＦＡＮＡ鎖を、ＲＴ５２１ＫはＣｅＮＡ鎖およびＬＮＡ鎖を逆転写することが報告された。
　非特許文献２には、ＬＮＡを用いたランダムライブラリーの作成が報告されている。ここでは、ＬＮＡ　ＡＴＰまたはＬＮＡ　ＴＴＰを用いてＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドを生成しており、すなわち、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴの塩基のうち、ＡのみまたはＴのみがＬＮＡであり、ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチド合成の際に、市販のＫＯＤ　ＸＬポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）が用いられている。
　しかし、ＳＥＬＥＸにおいて用いるためのＸＮＡライブラリを構成するＸＮＡ鎖について、テンプレートのＤＮＡからの安定した鎖の生成が求められる。よって、そのような安定的な鎖伸長を可能とするポリメラーゼの必要性が存在する。
Science 2012, 336, 341-344 Molecules 2012, 17, 13087-13097
　本発明は、人工核酸を含む鎖を伸長し得る改変ポリメラーゼを提供することを目的とする。本発明はまた、人工核酸を含む鎖からＤＮＡに逆転写し得る改変ポリメラーゼを提供することを目的とする。
　本発明は、以下（ｉ）～（iii）のような改変型ポリメラーゼを提供する。
　本発明の改変型ポリメラーゼ（ｉ）は、配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、以下の（１）あるいは（２）の変異を有するアミノ酸配列からなる：
（１）２１０位のアスパラギンがアスパラギン酸に、４０９位のチロシンがバリン、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸またはグルタミン酸に、４８５位のアラニンが中性アミノ酸に、ならびに６６４位のグルタミン酸がリジン、グルタミン、またはアルギニンに、それぞれ置換されている；あるいは
（２）２１０位のアスパラギンがアスパラギン酸に、４０９位のチロシンがバリン、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸またはグルタミン酸に、４８５位のアラニンが中性アミノ酸に、６１４位のアスパラギン酸がアスパラギンに、ならびに６６４位のグルタミン酸がリジン、グルタミン、またはアルギニンに、それぞれ置換されている。
　本発明のさらなる改変型ポリメラーゼ（ii）は、配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、以下の（１）あるいは（２）の変異を有するアミノ酸配列からなる：
（１）２１０位のアスパラギンがアスパラギン酸に、４８５位のアラニンが中性アミノ酸に、ならびに６６４位のグルタミン酸がリジン、グルタミン、またはアルギニンに、それぞれ置換されている；あるいは
（２）２１０位のアスパラギンがアスパラギン酸に、４８５位のアラニンが中性アミノ酸に、６１４位のアスパラギン酸がアスパラギンに、ならびに６６４位のグルタミン酸がリジン、グルタミン、またはアルギニンに、それぞれ置換されている。
　本発明のなおさらなる改変型ポリメラーゼ（iii）は、配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、以下の変異を有するアミノ酸配列からなる：
　２１０位のアスパラギンがアスパラギン酸に、ならびに６６４位のグルタミン酸がリジン、グルタミン、またはアルギニンに、それぞれ置換されている。
　本発明はまた、ＤＮＡ含有オリゴヌクレオチドからＬＮＡ含有オリゴヌクレオチド鎖を合成する方法を提供する。本方法は、当該ＤＮＡ含有オリゴヌクレオチドからなるテンプレート、プライマー、ＬＮＡ－ＮＴＰおよび改変型ポリメラーゼ（ｉ）または（ii）を反応させる工程を含む。
　１つの実施形態では、上記プライマーは、ＬＮＡ含有プライマーである。
　１つの実施形態では、上記テンプレートは、ランダム配列を含む。
　本発明はさらに、ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドからＤＮＡ含有オリゴヌクレオチド鎖を合成する方法を提供する。本方法は、当該ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドからなるテンプレート、プライマー、ｄＮＴＰおよび本発明の改変型ポリメラーゼ（ii）または（iii）を反応させる工程を含む。
　１つの実施形態では、上記のＤＮＡ含有オリゴヌクレオチドからＬＮＡ含有オリゴヌクレオチド鎖を合成する方法および上記のＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドからＤＮＡ含有オリゴヌクレオチド鎖を合成する方法において、上記反応させる工程は、１２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７～９）、１０ｍＭ　ＫＣｌ、６ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、および１０μｇ／ｍＬ　牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する緩衝液中で行われる。
　本発明はまた、ＬＮＡ鎖伸長活性を有する改変型ポリメラーゼであって、エキソヌクレアーゼ活性を減弱させる変異、三リン酸体の結合に寄与する変異、およびＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖との結合を強める変異を含むように改変されたポリメラーゼである、改変型ポリメラーゼを提供する。
　１つの実施形態では、上記改変型ポリメラーゼは、三リン酸体の糖構造の認識を緩和する変異をさらに含む。
　本発明はまた、逆転写活性を有する改変型ポリメラーゼであって、エキソヌクレアーゼ活性を減弱させる変異と、ＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖との結合を強める変異とを含む、あるいはエキソヌクレアーゼ活性を減弱させる変異と、ＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖との結合を強める変異と、三リン酸体の結合に寄与する変異とを含むように改変されたポリメラーゼを提供する。
　本発明によれば、人工核酸であるＬＮＡを含む鎖を伸長し得る改変ポリメラーゼが提供される。さらに、本発明によれば、ＬＮＡを含む鎖からＤＮＡに逆転写し得る改変ポリメラーゼも提供される。これにより、ＤＮＡからのＬＮＡ鎖の安定的な伸長が可能となる。また、ＬＮＡ鎖からのＤＮＡへの逆転写反応も可能となる。
各種ＫＯＤポリメラーゼ変異体について、Ｎ１０ランダム配列テンプレートによるＬＮＡ鎖伸長活性の結果を示す電気泳動写真である。 ＫＯＤポリメラーゼ変異体Ａ２、Ａ３４、Ａ４、Ａ１３、Ａ２６、Ａ４８、およびＡ５３について、Ｎ１０ランダム配列テンプレートによるＬＮＡ鎖伸長活性の結果を示す電気泳動写真である。 変異体１および変異体２について、３０ｍｅｒ（左側）および５０ｍｅｒ（右側）のＬＮＡライブラリの作成の結果を示す電気泳動写真である。 変異体２について、３０ｍｅｒのＬＮＡライブラリの作成に関して種々の反応時間にて検討した結果を示す電気泳動写真である。 変異体２について、ＬＮＡ－ＮＴＰを含まない条件（条件１）、ＬＮＡ－ＡＴＰ、ＬＮＡ－ＣＴＰ、ＬＮＡ－ＧＴＰおよびＬＮＡ－ＴＴＰをそれぞれ欠いた条件（条件２～５）、およびＬＮＡ－ＮＴＰを欠いていない条件（条件６）でＬＮＡ鎖伸長反応を行った結果を示す電気泳動写真である。 変異体２のＬＮＡ鎖伸長反応について、ＤＮＡプライマーおよびＬＮＡプライマーの比較結果を示す電気泳動写真である。 各種ＫＯＤポリメラーゼ変異体について、逆転写活性の結果を示す電気泳動写真である。 Ｙ４０９を種々に置換したＫＯＤポリメラーゼ変異体について、反応液にKOD-Plus-Ver.2用緩衝液を用いて行ったＮ１０ランダム配列テンプレートによるＬＮＡ鎖伸長活性の結果を示す電気泳動写真である。 Ｙ４０９を種々に置換したＫＯＤポリメラーゼ変異体について、反応液にＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液１を用いて行ったＮ１０ランダム配列テンプレートによるＬＮＡ鎖伸長活性の結果を示す電気泳動写真である。 Ｙ４０９を種々に置換したＫＯＤポリメラーゼ変異体について、反応液にＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液２を用いて行ったＮ１０ランダム配列テンプレートによるＬＮＡ鎖伸長活性の結果を示す電気泳動写真である。 Ａ５３について、反応液にＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液２を用いて、ＬＮＡ－ＮＴＰを含まない条件（条件１）、ＬＮＡ－ＡＴＰ、ＬＮＡ－ＣＴＰ、ＬＮＡ－ＧＴＰおよびＬＮＡ－ＴＴＰをそれぞれ欠いた条件（条件２～５）、およびＬＮＡ－ＮＴＰを欠いていない条件（条件６）でＬＮＡ鎖伸長反応を行った結果を示す電気泳動写真である。 Ａ５３について、反応液にKOD-Plus-Ver.2用緩衝液を用いて、ＬＮＡ－ＮＴＰを含まない条件（条件１）、ＬＮＡ－ＡＴＰ、ＬＮＡ－ＣＴＰ、ＬＮＡ－ＧＴＰおよびＬＮＡ－ＴＴＰをそれぞれ欠いた条件（条件２～５）、およびＬＮＡ－ＮＴＰを欠いていない条件（条件６）でＬＮＡ鎖伸長反応を行った結果を示す電気泳動写真である。 Ａ６５について、反応液にＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液２を用いて、ＬＮＡ－ＮＴＰを含まない条件（条件１）、ＬＮＡ－ＡＴＰ、ＬＮＡ－ＣＴＰ、ＬＮＡ－ＧＴＰおよびＬＮＡ－ＴＴＰをそれぞれ欠いた条件（条件２～５）、およびＬＮＡ－ＮＴＰを欠いていない条件（条件６）でＬＮＡ鎖伸長反応を行った結果を示す電気泳動写真である。
　本明細書においては、アミノ酸の置換を次のように表す。例えば、「Ｅ６６４Ｋ」は、６６４位のグルタミン酸をリジンに置換した変異体を表す。複数箇所を置換した場合は「／」で区切ってそれぞれの置換を併記して示す。例えば、「Ｎ２１０Ｄ／Ｙ４０９Ｖ／Ａ４８５Ｌ／Ｄ６１４Ｎ／Ｅ６６４Ｋ」は、２１０位のアスパラギンをアスパラギン酸に、４０９位のチロシンをバリンに、４８５位のアラニンをロイシンに、６１４位のアスパラギン酸をアスパラギンに、ならびに６６４位のグルタミン酸をリジンに置換した変異体を示す。なお、例えば「Ｙ４０９」との記載は、４０９位がチロシンであることを表す。
　本発明の改変型ポリメラーゼ（ｉ）は、配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、以下の（１）あるいは（２）の変異を有するアミノ酸配列からなる：
（１）２１０位のアスパラギンがアスパラギン酸に、４０９位のチロシンがバリン、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸またはグルタミン酸に、４８５位のアラニンが中性アミノ酸に、ならびに６６４位のグルタミン酸がリジン、グルタミン、またはアルギニンに、それぞれ置換されている；あるいは
（２）２１０位のアスパラギンがアスパラギン酸に、４０９位のチロシンがバリン、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸またはグルタミン酸に、４８５位のアラニンが中性アミノ酸に、６１４位のアスパラギン酸がアスパラギンに、ならびに６６４位のグルタミン酸がリジン、グルタミン、またはアルギニンに、それぞれ置換されている。
　本発明のさらなる改変型ポリメラーゼ（ii）は、配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、以下の（１）あるいは（２）の変異を有するアミノ酸配列からなる：
（１）２１０位のアスパラギンがアスパラギン酸に、４８５位のアラニンが中性アミノ酸に、ならびに６６４位のグルタミン酸がリジン、グルタミン、またはアルギニンに、それぞれ置換されている；あるいは
（２）２１０位のアスパラギンがアスパラギン酸に、４８５位のアラニンが中性アミノ酸に、６１４位のアスパラギン酸がアスパラギンに、ならびに６６４位のグルタミン酸がリジン、グルタミン、またはアルギニンに、それぞれ置換されている。
　本発明のなおさらなる改変型ポリメラーゼ（iii）は、配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、以下の変異を有するアミノ酸配列からなる：
　２１０位のアスパラギンがアスパラギン酸に、ならびに６６４位のグルタミン酸がリジン、グルタミン、またはアルギニンに、それぞれ置換されている。
　配列表の配列番号２のアミノ酸配列は、サーモコッカス・コダカラエンシス（Thermococcus Kodakaraensis）ＫＯＤ１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（本明細書においては、「ＫＯＤポリメラーゼ」ともいう）のアミノ酸配列に該当するが、その由来は問わない。
　ここで、本発明において、配列番号２に記載のアミノ酸配列とは、所定の置換以外のアミノ酸のうちの１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ所定のポリメラーゼ活性を有するものも含むものである。好ましくは、所定の置換を保持し、配列番号２のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有する範囲内で、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加され、かつ所定のポリメラーゼ活性を有するものも含むものが挙げられる。ここでの「１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加」におけるアミノ酸置換の例としては、各機能または効果を実質的に保持する限りにおいていずれの置換であってもよい。例えば、保存的置換が挙げられる。保存的置換としては、具体的には以下のグループ内（すなわち、括弧内に示すアミノ酸間）での置換が挙げられる：（グリシン、アラニン）、（バリン、イソロイシン、ロイシン）、（アスパラギン酸、グルタミン酸）、（アスパラギン、グルタミン）、（セリン、トレオニン）、（リジン、アルギニン）、（フェニルアラニン、チロシン）。
　本明細書において配列の「同一性」とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。配列の「同一性」とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、「類似性」とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸または配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarityとも称される。同一性および類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性および類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（例えば、Altschulら, J. Mol. Biol.，1990，215:403-410；Altschylら，Nucleic Acids Res., 1997，25:3389-3402）を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
　上記改変型ポリメラーゼ（ｉ）は、ＬＮＡ鎖伸長活性を有する。改変型ポリメラーゼ（ｉ）は、好ましくは、Ｎ２１０Ｄ／Ｙ４０９Ｖ／Ａ４８５Ｌ／Ｅ６６４Ｋ；またはＮ２１０Ｄ／Ｙ４０９Ｖ／Ａ４８５Ｌ／Ｄ６１４Ｎ／Ｅ６６４Ｋ、Ｎ２１０Ｄ／Ｙ４０９Ｇ／Ａ４８５Ｌ／Ｄ６１４Ｎ／Ｅ６６４Ｋ、Ｎ２１０Ｄ／Ｙ４０９Ａ／Ａ４８５Ｌ／Ｄ６１４Ｎ／Ｅ６６４Ｋ、Ｎ２１０Ｄ／Ｙ４０９Ｓ／Ａ４８５Ｌ／Ｄ６１４Ｎ／Ｅ６６４Ｋ、Ｎ２１０Ｄ／Ｙ４０９Ｔ／Ａ４８５Ｌ／Ｄ６１４Ｎ／Ｅ６６４Ｋ、Ｎ２１０Ｄ／Ｙ４０９Ｌ／Ａ４８５Ｌ／Ｄ６１４Ｎ／Ｅ６６４Ｋ、Ｎ２１０Ｄ／Ｙ４０９Ｆ／Ａ４８５Ｌ／Ｄ６１４Ｎ／Ｅ６６４Ｋ、Ｎ２１０Ｄ／Ｙ４０９Ｄ／Ａ４８５Ｌ／Ｄ６１４Ｎ／Ｅ６６４ＫもしくはＮ２１０Ｄ／Ｙ４０９Ｅ／Ａ４８５Ｌ／Ｄ６１４Ｎ／Ｅ６６４Ｋの変異を有する。
　上記改変型ポリメラーゼ（ii）は、ＬＮＡ鎖伸長活性を有する。改変型ポリメラーゼ（ii）は、ＬＮＡからのＤＮＡへの逆転写活性を有する。改変型ポリメラーゼ（ii）は、好ましくは、Ｎ２１０Ｄ／Ａ４８５Ｌ／Ｅ６６４Ｋ、またはＮ２１０Ｄ／Ａ４８５Ｌ／Ｄ６１４Ｎ／Ｅ６６４Ｋの変異を有する。Ｎ２１０Ｄ／Ａ４８５Ｌ／Ｅ６６４Ｑもまた好ましい。
　上記改変型ポリメラーゼ（iii）は、ＬＮＡからのＤＮＡへの逆転写活性（「逆転写活性」）を有する。改変型ポリメラーゼ（iii）は、好ましくは、Ｎ２１０Ｄ／Ｅ６６４ＫまたはＮ２１０Ｄ／Ｅ６６４Ｒの変異を有する。
　本明細書中において、「ＬＮＡ」とは、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン－β－Ｄ－リボ核酸をいう（「２，４－ＢＮＡ（bridged nucleic acid）／ＬＮＡ（locked nucleic acid）」ともいう）。「ＬＮＡ鎖」とは、ＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドであって、例えば以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
（ここで、「Ｂａｓｅ」は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）から選択される１つの塩基である）で表される所定の鎖長を有する核酸鎖である。さらに、本明細書中において「ＬＮＡ鎖伸長活性」とは、テンプレートＤＮＡにアニールされたＤＮＡまたはＬＮＡのオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）の３’－ヒドロキシル基に、ＬＮＡの５’－トリホスフェート基のα－ホスフェートを共有結合させることにより、ＤＮＡのテンプレート依存的なＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドの合成、すなわちＬＮＡ鎖の伸長を生じさせる反応を触媒する活性をいう。当該ＬＮＡ鎖伸長活性は、当業者が通常用いる方法にて、例えば、参考例３に記載の手順を用いて決定され得る。本発明の改変型ポリメラーゼによるＬＮＡ鎖伸長にはＬＮＡが基質として用いられるが、このような基質として、メチルＣ型ＬＮＡ（ＬＮＡのシトシンのピリミジン環の５位炭素原子にメチル基が付加されている）もまた用いられ得る。
　本明細書中において、ＬＮＡからのＤＮＡへの逆転写活性（単に「逆転写活性」ともいう）とは、テンプレートとなるＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドにアニールされたＤＮＡのオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）の３’－ヒドロキシル基に、ＬＮＡの５’－トリホスフェート基のα－ホスフェートを共有結合させることにより、テンプレート依存的なＤＮＡ含有オリゴヌクレオチドの合成、すなわちＤＮＡ鎖の伸長を生じさせる反応を触媒する活性をいう。当該逆転写活性は、当業者が通常用いる方法にて、例えば、実施例８に記載の手順を用いて決定され得る。
　ＬＮＡ鎖伸長活性を有する改変型ポリメラーゼの構造的特徴には、以下が挙げられる。ここで、ＫＯＤポリメラーゼの立体構造は、例えば、Kaiら J Mol Biol.２００１，３０６、４６９－４７７に示されており、機能部位は、大きくはＮ末端領域（「N-ter」：１～１３０位および３２７～３６８位）、エキソヌクレアーゼ領域（「Exo」：１３１～３２６位）、およびポリメラーゼ活性領域（Palm領域：３６９～４４９位および５００～５８７位、Fingers領域：４５０～４９９位、およびThumb-1、Thumb-2領域（本明細書中では、併せて「Thumb領域」という）：５８８～７７４位）に分けられる。
　Ｎ２１０Ｄ（２１０位のアスパラギンのアスパラギン酸への置換）は、エキソヌクレアーゼ領域に位置しており、エキソヌクレアーゼ活性を減弱させる。このＮ２１０Ｄは、ＬＮＡ鎖伸長活性を有する改変型ポリメラーゼに共通して存在する。
　Ａ４８５（４８５位のアラニン）は、Fingers領域に位置しており、三リン酸体の結合に寄与していると考えられる。４８５位のアラニンは、中性アミノ酸（例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン）に置換され得る。４８５位にて、嵩の小さなアラニンを、嵩高い疎水性アミノ酸でもあり得る中性アミノ酸（例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン）に置換し得る。
　Ｄ６１４Ｎ（６１４位のアスパラギン酸のアスパラギンへの置換）およびＥ６６４Ｋ（６６４位のグルタミン酸のリジンへの置換）は、ＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖との結合を強め得る。二重鎖と結合するThumb領域中に、負電荷をもつアミノ酸（Ｄ６１４：６１４位のアスパラギン酸、Ｅ６６４：６６４位のグルタミン酸）が存在するが、このアミノ酸を電荷なし（例えば、Ｄ６１４Ｎ）、あるいは正電荷（例えば、Ｅ６６４Ｋ）に変更することによって、ポリメラーゼとＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖との結合を強め、プライマー鎖の３’末端を反応部位に正しく位置させることができていると考えられる。ここで、６１４位のアスパラギン酸は、アスパラギンに置換され得、６６４位のグルタミン酸は、リジン、グルタミン、またはアルギニンに置換され得る。６６４位のみの置換変異、または６１４位および６６４位の置換変異でもよい。
　Ｙ４０９（４０９位のチロシン）がさらに置換され得る。Ｙ４０９は、Palm領域に位置しており、ＬＮＡ－ＮＴＰの糖部に接する。Ｙ４０９は、バリン、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸またはグルタミン酸に置換され得る。Ｙ４０９の置換変異は、上記の置換変異、すなわち、２１０位、４８５位および６６４位、あるいは２１０位、４８５位、６１４位および６６４位の置換変異と共になされ得る。１つの実施形態では、Ｙ４０９の置換は、Ｎ２１０Ｄ、Ａ４８５Ｌ、Ｄ６１４ＮおよびＥ６６４Ｋの置換と共になされ得る。Ｙ４０９の置換は、三リン酸体の糖構造の認識を緩和し、ＬＮＡ－ＮＴＰの取り込み速度を向上させ得る。Ｙ４０９がサイズ（嵩高さ）が小さい基を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニンまたはセリン）に置換されることにより、より高いＬＮＡ鎖伸長活性が得られ得、また、Ｙ４０９がバリン（Ｙ４０９Ｖ）またはトレオニン（Ｙ４０９Ｔ）に置換されることにより、より高い正確性にてＬＮＡ伸長が得られ得る。
　ＬＮＡ鎖伸長活性を有する改変型ポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を減弱させる変異、三リン酸体の結合に寄与する変異、およびＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖との結合を強める変異を含むように改変されたポリメラーゼとなるように設計され得る。好ましくは、当該改変ポリメラーゼは、三リン酸体の糖構造の認識を緩和する変異をさらに含む。
　逆転写活性を有する改変型ポリメラーゼの構造的特徴には、以下が挙げられる。活性を有する改変型ポリメラーゼには、以下の特徴があると考えられる。
　Ｎ２１０Ｄ（２１０位のアスパラギンのアスパラギン酸への置換）は、エキソヌクレアーゼ活性を減弱させる。このＮ２１０Ｄは、逆転写活性を有する改変型ポリメラーゼに共通して存在する。
　逆転写の際にはポリメラーゼがＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖と結合し、プライマー鎖の３’末端を反応部位に正しく位置させることが必要である。例えば、Thumb領域の負電荷アミノ酸が正電荷に変更された場合（例えば、Ｅ６６４ＫまたはＥ６６４Ｒ）に逆転写活性が見られ、これは、ポリメラーゼとＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖との結合が強められた結果であると考えられる。Thumb領域の負電荷アミノ酸が正電荷に中性に変更される変異（Ｅ６６４Ｑ）（これにより、ポリメラーゼのＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖結合能が微増され得る）と共に、三リン酸との結合に関与するＡ４８５Ｌを導入した場合も、逆転写活性が見られる。また、Ｅ６６４Ｋを有する変異体も、Ａ４８５Ｌとの組み合わせで逆転写活性が向上される。
　Ｅ６６４Ｋと共にＥ６１４Ｎを含む場合も、Ａ４８５Ｌとの組み合わせで逆転写活性が向上される。ここで、４８５位のアラニンは、中性アミノ酸（例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン）に置換され得る。６６４位のグルタミン酸は、リジン、グルタミン、またはアルギニンに置換され得る。
　逆転写活性を有する改変型ポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を減弱させる変異と、ＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖との結合を強める変異とを含む、あるいはエキソヌクレアーゼ活性を減弱させる変異と、ＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖との結合を強める変異と、三リン酸体の結合に寄与する変異とを含むように改変されたポリメラーゼとなるように設計され得る。
　改変型ポリメラーゼを製造する方法としては、従来の公知の方法が使用できる。例えば、野生型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、タンパク質工学的手法により新たな機能を有する変異型（改変型）ＤＮＡポリメラーゼを製造する方法がある（J. Biol. Chem., 264(11), 6447-6458(1989)）。変異を導入するＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子である限り、特に限定されない。例えば、遺伝子は、サーモコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子としてＮＣＢＩなどの遺伝子登録機関より入手可能な塩基配列、またはコドンの最適化を行った塩基配列（例えば、配列表の配列番号１の塩基配列）などの配列情報に基づいて、当業者が通常用いる方法により得ることができる。
　遺伝子に変異を導入する方法は既知のいかなる方法を用いてもよい。例えば、タンパク質工学的手法、例えばＰＣＲや部位特異的変異などの方法を用いることができる。
　改変型ポリメラーゼの遺伝子を必要に応じて発現ベクターに挿入し、例えば大腸菌を宿主として当該発現ベクターを用いて形質転換した後、カナマイシンなどの選択薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地に接種し、適宜培養（例えば、３７℃にて増殖させた後、ＩＰＴＧなどの発現誘導剤の存在下で３０℃にて培養）した後、菌体を回収および破砕し、粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、ｐＥＴベクターが好ましいが、これに限定されない。培地組成、ｐＨ、温度、培養の際の菌体密度および培養時間は、適宜設定し得る。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。粗酵素液を熱処理、例えば８０℃にて１０分間処理し、その後遠心、膜濾過などにより粗精製酵素を得ることができる。この操作の後、ヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し得る。さらにこれを精製または濃縮する工程を実施することもできる。これらの工程およびそれらに要する手段は、当業者によって適宜選択される。
　改変型ポリメラーゼ（ｉ）および（ii）は、ＤＮＡ含有オリゴヌクレオチドからＬＮＡ含有オリゴヌクレオチド鎖を合成する方法（本明細書中においては、「ＬＮＡ鎖伸長方法」ともいう）に、そして改変型ポリメラーゼ（ii）および（iii）は、ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドからＤＮＡ含有オリゴヌクレオチド鎖を合成する方法（本明細書中においては、「逆転写方法」ともいう）に用いることができる。
　本発明のＬＮＡ鎖伸長方法は、ＤＮＡ含有オリゴヌクレオチドからなるテンプレート、プライマー、ＬＮＡ－ＮＴＰおよび改変型ポリメラーゼ（ｉ）または（ii）を反応させる工程を含む。本発明の改変型ポリメラーゼを使用して、ＤＮＡ含有オリゴヌクレオチドをテンプレートとし、プライマー、ＬＮＡ－ＮＴＰ（すなわち、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧのそれぞれを塩基とする４種類のＬＮＡ－ヌクレオシド三リン酸（ＬＮＡ－ＡＴＰ、ＬＮＡ－ＴＴＰ、ＬＮＡ－ＣＴＰおよびＬＮＡ－ＧＴＰ）の混合物）を反応させることにより、テンプレートにアニールしたプライマーがＬＮＡを取り込みながら伸長し、プライマー伸長物としてＬＮＡ鎖（ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチド）が合成され得る。本発明のＬＮＡ鎖伸長方法は、ポリメラーゼを用いた反応工程の前に、アニーリング工程をさらに含み得る。アニーリング工程において、プライマーとテンプレート上の相補的領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、プライマーを起点として本発明の改変型ポリメラーゼの働きによりテンプレートの一本鎖ＤＮＡに相補的なＬＮＡ鎖を伸長させ、ＤＮＡ－ＬＮＡ鎖が形成され得る。
　ここで、「オリゴヌクレオチド」は、テンプレートに適した長さであればいずれでもよいが、例えば、その塩基数が、例えば、３０～１００、好ましくは、３５～７５であるものが挙げられる。
　上記アニーリングおよび伸長の反応温度は、通常のＰＣＲと同様の条件が用いられ得るが、例えば、９５℃にて１分間加熱後に１時間かけて室温まで温度を下げてアニーリングを行った後、ポリメラーゼを添加して７４℃にて伸長させ得る。反応液の組成は、以下の表２に示すものが例示として挙げられるが、これに限定されない。酵素の添加濃度は、伸長鎖の長さ、反応時間などに依存し得るが、例えば、２０ｎｇ／μＬ～３００ｎｇ／μＬ、好ましくは、２００ｎｇ／μＬ～３００ｎｇ／μＬであるが、これらに限定されない。反応時間は、伸長鎖の長さ、酵素の添加濃度などに依存し得るが、１．５時間～１３．５時間が採用され得るが、これらに限定されない。
　プライマーは、ＤＮＡプライマー（ＤＮＡで構成されるプライマー）およびＬＮＡプライマー（ＬＮＡで構成されるプライマー）のいずれでもよい。プライマーは、ＤＮＡとＬＮＡとの両方を含有するものであってもよい。プライマー伸長反応の途中での律速段階を回避する観点からは、ＬＮＡを少なくとも一部に含有するプライマー（好ましくは、全てがＬＮＡであるプライマー）が好ましい。プライマーの長さは適宜決定され得るが、その塩基数が、例えば、１１～２８、好ましくは、１２～２５であるものが挙げられる。プライマーは、テンプレートの配列情報に基づいて当業者により適宜設計され、作製され得る。
　テンプレートは、特定配列からなるものであってもよく、またはランダム配列を含むものであってもよい。ランダム配列の長さは、例えば、１０～５０塩基である。ランダム配列を含むテンプレートを用いることにより、ＬＮＡライブラリを作成することができる。
　本発明の逆転写方法は、ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドからなるテンプレート、プライマー、ｄＮＴＰおよび改変型ポリメラーゼ（ii）または（iii）を反応させる工程を含む。本発明の改変型ポリメラーゼを使用して、ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドをテンプレートとし、プライマー、ｄＮＴＰ（すなわち、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧのそれぞれを塩基とする４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）の混合物）を反応させることにより、テンプレートにアニールしたプライマーが、ＤＮＡを取り込みながら伸長し、プライマー伸長物としてＤＮＡ鎖（ＤＮＡ含有オリゴヌクレオチド）が合成され得る。本発明の逆転写方法は、ポリメラーゼを用いた反応工程の前に、アニーリング工程をさらに含み得る。アニーリング工程において、プライマーとテンプレート上の相補的領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、プライマーを起点として本発明の改変型ポリメラーゼの働きによりテンプレートの一本鎖ＬＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、ＬＮＡ－ＤＮＡ鎖が形成され得る。
　逆転写方法のためのプライマーは、ＤＮＡプライマー（ＤＮＡで構成されるプライマー）であり得る。プライマーの長さは適宜決定され得るが、その塩基数が、例えば、１１～２８、好ましくは、１２～２５であるものが挙げられる。プライマーは、テンプレートの配列情報に基づいて当業者により適宜設計され、作製され得る。
　逆転写方法のためのテンプレートは、特定配列からなるものであってもよく、またはランダム配列を含むものであってもよい。ランダム配列の長さは、例えば、１０～５０塩基である。逆転写方法のためのテンプレートは、ＤＮＡテンプレートをもとに転写したＬＮＡ鎖（例えば、本発明のＬＮＡ鎖伸長方法において作製したＬＮＡ鎖）であってもよい。
　逆転写方法の場合も同様に、アニーリングおよび伸長の反応温度は通常のＰＣＲと同様の条件が用いられ得るが、例えば、９５℃にて１分間加熱後に１時間かけて室温まで温度を下げてアニーリングを行った後、ポリメラーゼを添加して７４℃にて伸長させ得る。反応液の組成は、実施例８に示すものが例示として挙げられるが、これに限定されない。酵素の添加濃度は、伸長鎖の長さ、反応時間などに依存し得るが、例えば、１０ｎｇ／μＬ～３００ｎｇ／μＬ、好ましくは、１０ｎｇ／μＬ～１００ｎｇ／μＬであるが、これらに限定されない。反応時間は、伸長鎖の長さ、酵素の添加濃度などに依存し得るが、３０分～３時間が採用され得るが、これらに限定されない。
　ＬＮＡ鎖伸長方法および逆転写方法においては、本発明の改変型ポリメラーゼおよび上記核酸成分に加えて、例えば、マグネシウムイオンのような２価のイオン（例えば、ＭｇＳＯ４として）を共存させることが好ましい。また、改変型ポリメラーゼを用いる反応においては、緩衝液として、市販のＰＣＲ緩衝液（例えば、KOD-Plus-Ver.2用Buffer（東洋紡株式会社製））、および当業者によって調製される任意の緩衝液（例えば、１２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７～９）、１０ｍＭ　ＫＣｌ、６ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、および１０μｇ／ｍＬ　牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する緩衝液）が用いられ得る。ここで、緩衝液のｐＨは、緩衝液温度および伸長反応温度によって変動し得る。例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌでは緩衝液の温度が１℃上昇するとｐＨは０．０２５ほど低下し、伸長反応温度もまた作用ｐＨに影響し得る。
　１つの実施形態では、ＬＮＡ鎖伸長反応および逆転写方法は、１２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７～９）、１０ｍＭ　ＫＣｌ、６ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、および１０μｇ／ｍＬ　牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する緩衝液中で行われる。この緩衝液は、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００をさらに含有する。この実施形態において、例えば、緩衝液温度を２５℃として、通常のＰＣＲと同様の条件で反応を行うかまたは７４℃にて伸長反応を行う場合、この緩衝液のｐＨは、好ましくはｐＨ８～８．８であり、さらにはＬＮＡ鎖の伸長効率の面ではｐＨ８．８の方がｐＨ８よりも好ましい。
　以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　（実施例１：改変型ポリメラーゼの作出）
　（１－１：プラスミドの構築）
　ＫＯＤポリメラーゼ遺伝子は人工遺伝子合成によって、あらかじめインテイン配列を除去し、コドンの最適化を行った配列（配列番号１の塩基配列；それによりコードされたアミノ酸配列を配列番号２に示す）を作成した。遺伝子合成はオペロンバイオテクノロジーに依頼した。ＫＯＤポリメラーゼ遺伝子はpET49 vector （Novagen）のNdeIサイトとSalIサイトとの間に挿入し、ＫＯＤポリメラーゼタンパク質にタグなどの余分な配列が含まれないように発現プラスミドを構築した。点変異導入にはPrimeSTAR（登録商標）Mutagenesis Basal Kit（TAKARA）の手法を用いた。ＫＯＤポリメラーゼ変異体発現プラスミドについてＫＯＤポリメラーゼ変異体遺伝子の塩基配列解析を行うことで、目的の配列が正しく挿入されていることを確認した。表１に導入した変異の組み合わせを記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（１－２：ＫＯＤポリメラーゼ変異体の発現・精製）
　ＫＯＤポリメラーゼ変異体発現プラスミドをT7 Express Competent E.coli（High Efficiency）（ＮＥＢ）にヒートショック法によって導入し、LB/Km（５０μｇ／ｍＬ）プレートにまいて３７℃で静置した。生えてきたコロニーをＴＢ培地／１％グルコース／Ｋｍ（５０μｇ／ｍＬ）にうえて３７℃で振とうした。ＯＤ６００　０．４～０．６に到達した時点で１Ｍ　ＩＰＴＧを１／１０００ｖｏｌ添加（最終１ｍＭ）し、培養温度を３０℃に変更して発現誘導を行った。ＩＰＴＧを添加して６時間後に培養液を遠心して上清を除去し、大腸菌を回収した。大腸菌は－８０℃で保存して、精製の際に融解した。融解した大腸菌は緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＤＴＴ、１０％グリセロール）に懸濁し、超音波によって菌体を破砕した。大腸菌破砕溶液を遠心（４℃、８０００ｇ、５分）後、上清を回収して８０℃の湯浴で１０分加熱した。加熱によって変性した夾雑物タンパク質を遠心（４℃、８０００ｇ、５分）して除去し、上清を０．４５μｍ　ＰＶＤＦメンブレンフィルターに通すことで微粒子を完全に除去した。得られた粗精製溶液はHiTrap Heparin HP Columns（５ｍＬ）を用いてAKTA pure（GE Healthcare）で精製した。カラムに吸着させたＫＯＤポリメラーゼ変異体について、緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＤＴＴ、１０％グリセロール）のＮａＣｌ濃度を１００ｍＭ→２Ｍに徐々に上げることで溶出分画にＫＯＤポリメラーゼ変異体のピークを得た。溶出分画はAmicon Ultra 4（３０Ｋ）（Millipore）を用いた限外濾過によって濃縮後、緩衝液の置換を行い、最終的に保存緩衝液（Storage Buffer：５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　ＫＣｌ、５０％グリセロール、０．１％　Tween 20、０．１％ Nonidet P40）に溶解させて－２０℃で保存した。ＫＯＤポリメラーゼ変異体の濃度はブラッドフォード法によって決定し、Storage Bufferで目的の濃度に希釈して反応に用いた。
　（実施例２：糖修飾塩基の合成）
　（２－１：ＬＮＡ－ＡＴＰの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　ＬＮＡ－Ａ（１０２ｍｇ、３．６５×１０－４ｍｏｌ、１．０ｅｑ）と撹拌子を１００ｍＬナスフラスコに入れ一晩減圧乾燥させ、ｄｒｙ－ＤＭＦ（６ｍＬ）で２回共沸させた。次にｄｒｙ－ＭｅＣＮ（６ｍＬ）で３回共沸させた。一晩減圧乾燥させておいたプロトン・スポンジ（１１７ｍｇ、５．４６×１０－４ｍｏｌ、１．４６ｅｑ）を入れた後さらに一晩減圧乾燥させた。アルゴン置換し、デシケーター内のセプタムキャップを付けアルゴン風船を取り付けた。リン酸トリメチル（１．３ｍＬ、１．２９×１０－２ｍｏｌ、３６ｅｑ）を加え、懸濁させ氷浴中で３０分撹拌させた。ＰＯＣｌ３（５５μＬ、５．９０×１０－４ｍｏｌ、１．５ｅｑ）を加え氷浴下で４５分間撹拌した。氷浴下でｄｒｙ－トリブチルアミン（３５０μＬ、１．４６×１０－３ｍｏｌ、４．０ｅｑ）と０．５Ｍピロリン酸ＤＭＦ（３．７ｍＬ、１．８７×１０－３ｍｏｌ、５．０ｅｑ）を添加し室温で１時間反応させた。氷浴下で５分間撹拌し、ＴＥＡＢ緩衝液約６ｍＬ加え反応を止め、減圧留去した。少量の蒸留水を入れて溶かし、ジエチルエーテルで２回分液した。水相を減圧留去し、陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ－２５）で目的生成物である三リン酸を分取した。さらに、中圧カラム（Ｃ１８）で過剰のピロリン酸を除去し、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８）により精製、フラクションを減圧留去、凍結乾燥しＬＮＡ－ＡＴＰを得た。収量：６．１６μｍｏｌ。収率：１．６％。ＥＳＩ－ＭＳ（ネガティブイオンモード）ｍ／ｚ、実測値＝５１７．８、計算値（［（Ｍ－Ｈ）－］に対し）＝５１８．０。
　（２－２：ＬＮＡ－ＴＴＰの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　ＬＮＡ－Ｔ（１０３ｍｇ、３．８１×１０－４ｍｏｌ、１．０ｅｑ）と撹拌子を１００ｍＬナスフラスコに入れ一晩減圧乾燥させ、ｄｒｙ－ＤＭＦ（６ｍＬ）で２回共沸させた。次にｄｒｙ－ＭｅＣＮ（６ｍＬ）で３回共沸させた。一晩減圧乾燥させておいたプロトン・スポンジ（１１９ｍｇ、５．５５×１０－４ｍｏｌ、１．４６ｅｑ）を入れた後さらに一晩減圧乾燥させた。アルゴン置換し、デシケーター内のセプタムキャップを付けアルゴン風船を取り付けた。リン酸トリメチル（１．４ｍＬ、１．３９×１０－２ｍｏｌ、３６ｅｑ）を加え、完全に溶解させ氷浴中で３０分撹拌させた。ＰＯＣｌ３（６０μＬ、６．４４×１０－４ｍｏｌ、１．５ｅｑ）を加え氷浴下で４５分間撹拌した。氷浴下でｄｒｙ－トリブチルアミン（４００μＬ、１．６７×１０－３ｍｏｌ、４．０ｅｑ）と０．５Ｍピロリン酸ＤＭＦ（４．０ｍＬ、２．０２×１０－３ｍｏｌ、５．０ｅｑ）を添加し室温で１時間反応させた。氷浴下で５分間撹拌し重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）緩衝液約６ｍＬ加え反応を止め、減圧留去した。少量の蒸留水を入れて溶かし、ジエチルエーテルで２回分液した。水相を減圧留去し、陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ－２５）で目的生成物である三リン酸を分取した。さらに、中圧カラム（Ｃ１８）で過剰のピロリン酸を除去し、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８）により精製、フラクションを減圧留去、凍結乾燥しＬＮＡ－ＴＴＰを得た。収量：１１５μｍｏｌ。収率：３０．２％。ＥＳＩ－ＭＳ（ネガティブイオンモード）ｍ／ｚ、実測値＝５０８．９、計算値（［（Ｍ－Ｈ）－］に対し）＝５０９．１８。
　（２－３：ＬＮＡ－ＧｉＴＰの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　ＬＮＡ－Ｇ（１０１ｍｇ、２．７６×１０－４ｍｏｌ、１．０ｅｑ）と撹拌子を１００ｍＬナスフラスコに入れ一晩減圧乾燥させ、ｄｒｙ－ＤＭＦ（６ｍＬ）で２回共沸させた。次にｄｒｙ－ＭｅＣＮ（６ｍＬ）で３回共沸させた。一晩減圧乾燥させておいたプロトン・スポンジ（１１８ｍｇ、５．５１×１０－４ｍｏｌ、１．５ｅｑ）を入れた後さらに一晩減圧乾燥させた。アルゴン置換し、デシケーター内のセプタムキャップを付けアルゴン風船を取り付けた。リン酸トリメチル（１．０ｍＬ、９．９４×１０－３ｍｏｌ、３６ｅｑ）を加え、懸濁させ氷浴中で３０分撹拌させた。ＰＯＣｌ３（４０μＬ、４．２９×１０－４ｍｏｌ、１．５ｅｑ）を加え氷浴下で４５分間撹拌した。氷浴下でｄｒｙ－トリブチルアミン（２６０μＬ、１．０９×１０－３ｍｏｌ、４．０ｅｑ）と０．５Ｍピロリン酸ＤＭＦ（２．８ｍＬ、１．４１×１０－３ｍｏｌ、５．０ｅｑ）を添加し室温で１時間反応させた。氷浴下で５分間撹拌し、ＴＥＡＢ緩衝液約６ｍＬ加え反応を止め、減圧留去した。少量の蒸留水を入れて溶かし、ジエチルエーテルで２回分液した。水相を減圧留去し、陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ－２５）で目的生成物である三リン酸を分取した。さらに、中圧カラム（Ｃ１８）で過剰のピロリン酸を除去し、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８）により精製、フラクションを減圧留去、凍結乾燥しＬＮＡ－ＧｉＴＰを得た。収量：３２．３μｍｏｌ。収率：１１．７％。ＥＳＩ－ＭＳ（ネガティブイオンモード）ｍ／ｚ、実測値＝６０３．８、計算値（［（Ｍ－Ｈ）－］に対し）＝６０４．０３。
　（２－４：ＬＮＡ－ＧＴＰの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　１００ｍＬのナスフラスコに入ったＬＮＡ－ＧｉＴＰ（１．８６ｍｇ、２０．０３μｍｏｌ）を水１ｍＬで溶かし２８％濃アンモニア水（７．１ｍＬ）を加え撹拌した。４時間ごとにサンプリングしＨＰＬＣでピークを見た。反応液は濃縮した後、２８％濃アンモニア水（７．１ｍＬ）を加えさらに４時間撹拌した。ＨＰＬＣでＬＮＡ－ＧｉＴＰのピークが消失するまで、これを繰り返した。４８時間後、反応液を減圧留去し、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８）により精製、フラクションを減圧留去、凍結乾燥しＬＮＡ－ＧＴＰを得た。収量：１２．７４μｍｏｌ。収率：６３％。ＥＳＩ－ＭＳ（ネガティブイオンモード）ｍ／ｚ、実測値＝５３３．８、計算値（［（Ｍ－Ｈ）－］に対し）＝５３３．９９。
　（２－５：ＬＮＡ－ＣＴＰの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　ＬＮＡ－Ｃ（１０１ｍｇ、３．７２×１０－４ｍｏｌ、１．０ｅｑ）と撹拌子を１００ｍＬナスフラスコに入れ一晩減圧乾燥させ、ｄｒｙ－ＤＭＦ（６ｍＬ）で２回共沸させた。次にｄｒｙ－ＭｅＣＮ（６ｍＬ）で３回共沸させた。一晩減圧乾燥させておいたプロトン・スポンジ（１１３ｍｇ、５．２７×１０－４ｍｏｌ、１．４６ｅｑ）を入れた後さらに一晩減圧乾燥させた。アルゴン置換し、デシケーター内のセプタムキャップを付けアルゴン置換した。リン酸トリメチル（４．５ｍＬ、４．４７×１０－２ｍｏｌ、１２０ｅｑ）を加え、懸濁させ氷浴中で３０分撹拌させた。ＰＯＣｌ３（６０μＬ、６．４４×１０－４ｍｏｌ、１．５ｅｑ）を加え氷浴下で４５分間撹拌した。氷浴下でｄｒｙ－トリブチルアミン（４００μＬ、１．６７×１０－３ｍｏｌ、４．０ｅｑ）と０．５Ｍピロリン酸ＤＭＦ（３．８ｍＬ、１．９２×１０－３ｍｏｌ、５．０ｅｑ）を添加し室温で１時間反応させた。氷浴下で５分間撹拌し、ＴＥＡＢ緩衝液約６ｍＬ加え反応を止め、減圧留去した。少量の蒸留水を入れて溶かし、ジエチルエーテルで２回分液した。水相を減圧留去し、陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ－２５）で目的生成物である三リン酸を分取した。さらに、中圧カラム（Ｃ１８）で過剰のピロリン酸を除去し、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８）により精製、フラクションを減圧留去、凍結乾燥しＬＮＡ－ＣＴＰを得た。収量：１８．２８μｍｏｌ。収率：４．８９％。ＥＳＩ－ＭＳ（ネガティブイオンモード）ｍ／ｚ、実測値＝４９３．９、計算値（［（Ｍ－Ｈ）－］に対し）＝４９３．９８。
　（参考例：ＫＯＤポリメラーゼ変異体のＬＮＡ鎖伸長活性の試験法）
　ＫＯＤポリメラーゼ変異体について活性の検討に用いた手法を参考例１～３に示す。本実施例では、特に言及しない限り、下記参考例１～３の手法を用いた。
　（参考例１：変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ））
　泳動緩衝液：１×ＴＢＥ緩衝液、変性ポリアクリルアミドゲル：１×ＴＢＥ緩衝液、７Ｍ尿素、２０％ポリアクリルアミド。反応液１０μＬあたり、４０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％ブロモフェノールブルー：２μＬ、１０Ｍ尿素１２μＬを添加して泳動サンプルとした。５５℃、２００Ｖ定電圧で３０分予備泳動を行った後、サンプルをゲルにアプライして同条件で泳動した。
　（参考例２：アルカリアガロースゲル電気泳動）
　ＤＮＡ・ＲＮＡの一本鎖の解析には、二重鎖を解離させるために変性ＰＡＧＥが通常用いられる。しかしＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖のＴｍ値は非常に高くなっているため、変性ＰＡＧＥの条件では解離させることができず、ＬＮＡ一本鎖の解析には適さない。そこで、ＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖を完全に解離させて解析するためにアルカリアガロースゲル電気泳動法を用いた。ＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖であっても水酸化ナトリウム溶液中では解離するため、ＬＮＡを一本鎖の状態で解析することが可能である。
　アガロースは低分子量核酸分離用のもの（Agarose 21(株式会社ニッポン・ジーン)）を用いた。ゲルと泳動緩衝液、ローディングダイの組成は以下の通りである。ゲル：５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、５％アガロース、泳動緩衝液：５ｍＭ　ＮａＯＨ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、６×ローディングダイ：３００ｍＭ　ＮａＯＨ、１２ｍＭ　ＥＤＴＡ、３０％グリセロール、０．１％ブロモフェノールブルー。泳動前にゲルを泳動緩衝液に１時間浸して平衡化した。泳動は室温、３Ｖ／ｃｍ定電圧の条件で行った。一本鎖ＬＮＡの検出にはプライマーに標識した蛍光色素を用いて、PharosFX（Bio-Rad社製）によって解析を行った。
　（参考例３：ＫＯＤポリメラーゼ変異体のＬＮＡ鎖伸長活性反応）
　ＫＯＤポリメラーゼ変異体のＬＮＡ鎖伸長活性比較に用いた反応液の組成を、以下の表２に示す。ＫＯＤポリメラーゼ変異体を未添加の反応液を９５℃で１分加熱後、１時間かけて室温まで下げることでアニーリングを行った後、ＫＯＤポリメラーゼ変異体を添加して７４℃でＬＮＡ鎖伸長反応を進行させた。ＬＮＡ鎖伸長反応に用いたテンプレートとプライマーの配列を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　（実施例３：ＫＯＤポリメラーゼ変異体のＬＮＡ鎖伸長活性の検討）
　実施例１で作出したＫＯＤポリメラーゼ変異体について、プライマー鎖：5'_6-FAM_labeled primer P2、テンプレート鎖：Template DNA N10を用いて、ＬＮＡ鎖伸長活性を比較した。ＬＮＡ鎖伸長は７４℃で３０分の条件で反応を進行させた。得られた反応液に４０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％ブロモフェノールブルー：２μＬ、１０Ｍ尿素１２μＬを添加し、泳動サンプルとした。プライマー鎖０．６２５ｐｍｏｌを用いて、変性ＰＡＧＥによって解析を行った。ＬＮＡ鎖が短鎖であれば、変性ＰＡＧＥの条件でＤＮＡ／ＬＮＡ鎖を解離させることができるため、アルカリアガロースゲル電気泳動法を用いなかった。
　図１（図１－１，２，３，４）に解析結果を示す。図１の中から代表例を選んで変性ＰＡＧＥによって解析した結果を図２に示す。これらの図中、コントロールとして未改変の野生型（「ＷＴ」）の結果を示す。さらに、伸長の程度を明確化するためにプライマーのみ（「Ｐｒｉｍｅｒ」）およびテンプレートの伸長対応分（すなわち１０塩基分）伸長した場合（「Ｐｒｉｍｅｒ＋１０ｍｅｒ」）を併せて示す（以降の図においても同様である）。
　全ての変異体がエキソヌクレアーゼ活性を減弱させた変異Ｎ２１０Ｄを有している。変異体Ａ２、Ａ３４、Ａ１３、Ａ２６、Ａ４８、およびＡ５３に共通する変異Ａ４８５Ｌは、Fingers領域に位置しており、三リン酸体の結合に寄与していると考えられる。またＡ３４およびＡ５３に共通する変異Ｙ４０９Ｖは、三リン酸体の糖構造の認識を緩和していると考えられる。元来、野生型のポリメラーゼにおいてはＤＮＡ鎖中にＲＮＡが含まれることは生存において不都合であるため、ＮＴＰの取り込みが起こらないようにヌクレオチドの糖部認識によって制限されている。しかし、この制限は糖部に修飾を加えたＬＮＡ－ＮＴＰの取り込み活性を低下させる要因になる。変異Ｙ４０９Ｖは糖部認識を緩和することによってＬＮＡ－ＮＴＰの取り込み速度を向上させている。
　これらの三リン酸体に寄与する変異Ａ４８５Ｌ，Ｙ４０９ＶのみではＬＮＡ鎖の安定的な伸長には不十分である。ＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖の構造（Ａ型らせん）はＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の構造（Ｂ型らせん）と異なるため、通常のポリメラーゼはＤＮＡ／ＬＮＡ鎖と安定して結合することができないと考えられるためである。実際に、Ａ２、Ａ３４では、ＬＮＡ鎖の伸長が早い段階で停止している。そこで、ＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖との結合を強めるために、Ｄ６１４Ｎ（Ａ２６、Ａ５３）とＥ６６４Ｋ（Ａ４、Ａ１３、Ａ２６、Ａ４８、Ａ５３）を導入している。二重鎖と結合するThumb領域中には負電荷をもつアミノ酸（Ｄ６１４、Ｅ６６４）が存在するが、このアミノ酸を電荷なし（Ｄ６１４Ｎ）、あるいは正電荷（Ｅ６６４Ｋ）に変更することによって、ＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖との結合を強め、プライマー鎖の３’末端を反応部位に正しく位置させることができていると考えられる。変異体Ａ４のようにＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖との結合を強めただけではＬＮＡ伸長活性はそれほど高くないが、Ａ１３、Ａ２６、Ａ４８、Ａ５３のようにヌクレオチドモノマーとヌクレオチドポリマーそれぞれに寄与する変異を同時に導入することによって、ＬＮＡ鎖の安定的な伸長が可能になっている。これらの変異を包括的に有している変異体Ａ４８およびＡ５３が、特に高いＬＮＡ鎖伸長活性を示している。以下、Ａ４８を変異体１、Ａ５３を変異体２とも呼称する。
　（実施例４：ＫＯＤポリメラーゼ変異体を用いたＬＮＡライブラリの作成）
　ＬＮＡライブラリの作成に用いた反応液の組成を以下の表４に示す。ＫＯＤポリメラーゼ変異体を未添加の反応液を９５℃で１分加熱後、１時間かけて室温まで下げることでアニーリングを行った後、ＫＯＤポリメラーゼ変異体１または２を添加してＬＮＡ鎖伸長反応を進行させた。なお、コントロールとして、表４中のＬＮＡ－ＡＴＰ、ＬＮＡ－ＣＴＰ、ＬＮＡ－ＧＴＰおよびＬＮＡ－ＴＴＰの代わりに同量のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを用いて、ＤＮＡライブラリを作成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　プライマー鎖：5'_6-FAM_labeled primer P2、テンプレート鎖：Template DNA N30、Template DNA N50を用いて３０ｍｅｒおよび５０ｍｅｒのＬＮＡライブラリを作成した。ＬＮＡ鎖伸長は７４℃で９時間の条件で反応を進行させた。得られた反応液に６×ローディングダイを１／６容量添加し、プライマー鎖１ｐｍｏｌをアルカリアガロースゲルにアプライして電気泳動を行った。その結果、ｄＮＴＰを用いて作成したＤＮＡライブラリに匹敵するＬＮＡライブラリを作成することに成功した（図３）。
　（実施例５：ＫＯＤポリメラーゼ変異体を用いたＬＮＡ鎖伸長反応時間の検討）
　ＬＮＡ鎖伸長反応時間について検討を行った。
　プライマー鎖：5'_6-FAM_labeled primer P2, テンプレート鎖：Template DNA N30を用いて３０ｍｅｒのＬＮＡライブラリを作成した。反応液の組成は表４に示すとおりであり、コントロールとして、ＬＮＡ－ＡＴＰ、ＬＮＡ－ＣＴＰ、ＬＮＡ－ＧＴＰおよびＬＮＡ－ＴＴＰの代わりにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを用いて、ＤＮＡライブラリを作成した。ＫＯＤポリメラーゼ変異体２を用いて、反応時間：１．５時間、３時間、６時間、９時間の条件で比較した。伸長時間１．５時間で３０ｍｅｒのＬＮＡ伸長反応産物ができ始め、ＬＮＡライブラリを作成するための反応時間は９時間から短縮することが可能であることが示された（図４）。
　（実施例６：ＫＯＤポリメラーゼ変異体を用いたＬＮＡ鎖合成の正確性）
　ＬＮＡ－ＡＴＰ、ＬＮＡ－ＣＴＰ、ＬＮＡ－ＧＴＰおよびＬＮＡ－ＴＴＰのうちの一つを除いた反応条件において、単一配列のテンプレートを用いてＬＮＡ鎖伸長反応を行った場合、伸長反応が停止するか調べた。誤った塩基の取り込みが許容される場合、途中で伸長反応が停止することなく最後まで反応が進行してしまうことがわかった。
　プライマー鎖：5'_6-FAM_labeled primer P2、テンプレート鎖：Template DNA L3-1（表３）、ポリメラーゼ：変異体２を用いて、反応時間１３．５時間で反応を大過剰に進行させた。それぞれの反応液は、以下の表５の条件に従うこと以外は、表４に示すとおりとした。この結果を図５に示す。図５に対応して、反応条件を以下の表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　ＬＮＡ－ＮＴＰを含まない条件では、ＫＯＤポリメラーゼ変異体の微弱なエキソヌクレアーゼ活性によってプライマーが分解された（図５、条件１）。ＬＮＡ－ＮＴＰを欠いていない条件（条件６）と比べて、ＬＮＡ－ＡＴＰ、ＬＮＡ－ＣＴＰ、ＬＮＡ－ＧＴＰおよびＬＮＡ－ＴＴＰをそれぞれ欠いた条件（条件２～５）では、伸長反応が途中で停止することが示された。これによって、誤った塩基の取り込みがある程度制限されており、一定の正確性を有することが示された。
　（実施例７：ＫＯＤポリメラーゼ変異体によるＬＮＡプライマーを用いたＬＮＡ鎖伸長反応）
　ＤＮＡプライマーを用いてＬＮＡ鎖ライブラリを作成した場合、途中で伸長反応の進行が遅くなる律速段階のＬＮＡ鎖長が存在する。これは、プライマー鎖のＤＮＡ－ＬＮＡジャンクション領域を含む二重鎖の構造が不規則になっており、ポリメラーゼの結合が難しくなっているためだと考えられる。そこでＬＮＡプライマーを用いることによって、プライマー鎖のＤＮＡ－ＬＮＡジャンクション領域を削除した条件の反応を検討した。
　プライマー鎖：5'_6-FAM_labeled primer P2（ＤＮＡプライマー）、5'_6-FAM_labeled primer LP2（ＬＮＡプライマー）、テンプレート鎖：Template DNA N30、ポリメラーゼ：変異体２を用いて、反応時間１．５時間、３時間、４．５時間および６時間で反応を進めた。コントロールとして、ＤＮＡプライマーについて、ｄＮＴＰを用いたＤＮＡライブラリを作成した。それぞれの反応液は、以下の表６の条件に従うこと以外は、表４に示すとおりとし、ＤＮＡライブラリ作成の場合は、ＬＮＡ－ＡＴＰ、ＬＮＡ－ＣＴＰ、ＬＮＡ－ＧＴＰおよびＬＮＡ－ＴＴＰの代わりにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを用いた。この結果を図６に示す。図６に対応して、反応条件を以下の表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　その結果、ＬＮＡプライマーを用いた条件では、ＤＮＡプライマーを用いた条件のような伸長反応の途中段階での律速が生じなかった（図６）。伸長反応が全く進行していないプライマー鎖も存在するが、経時変化が観察されないため、ＬＮＡプライマーの合成の問題であると考えられる。
　（実施例８：各種ＫＯＤポリメラーゼ変異体によるＬＮＡオリゴヌクレオチドからの逆転写によるＤＮＡ鎖の合成）
　作製したＫＯＤポリメラーゼ変異体を用いて、ＬＮＡ鎖→ＤＮＡ鎖の逆転写活性を比較した。逆転写反応に用いたテンプレートとプライマーの配列を表７に示す。ＫＯＤポリメラーゼ変異体を未添加の反応液を９５℃で１分加熱後、１時間かけて室温まで下げることでアニーリングを行った後、ＫＯＤポリメラーゼ変異体を添加して７４℃で逆転写反応を進行させた。逆転写反応においては、反応液組成は、ＬＮＡ－ＡＴＰ、ＬＮＡ－ＣＴＰ、ＬＮＡ－ＧＴＰおよびＬＮＡ－ＴＴＰの代わりにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを用いたこと以外は、表２の組成と同様のものを用いた。逆転写反応は３０分間行った。得られた反応液に６×ローディングダイを１／６ｖｏｌ添加し、プライマー鎖１ｐｍｏｌをアルカリアガロースゲルにアプライして電気泳動を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　逆転写活性の比較を図７に示す。図７（Ａ）および（Ｂ）は、調べたＫＯＤポリメラーゼ変異体の結果を示し、図７（ｃ）は、その中から特徴的な活性を呈するものを示す。
　全ての変異体において、エキソヌクレアーゼ活性を減弱させる変異Ｎ２１０Ｄを導入している。逆転写の際にはポリメラーゼがＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖と結合し、プライマー鎖の３’末端を反応部位に正しく位置させることが必要である。Thumb領域の負電荷アミノ酸を正電荷に変更した変異体Ａ４（Ｅ６６４Ｋ）およびＡ４３（Ｅ６６４Ｒ）において、逆転写活性が見られるのはＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖結合能を向上させた結果であると考えられる。一方で、三リン酸体との結合に関与するＡ４８５Ｌのみでは、逆転写活性を示さない（変異体Ａ２）。しかし、ＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖結合能を微増させた変異（Ｅ６６４Ｑ：負電荷→中性）と共にＡ４８５Ｌを導入（変異体Ａ５１）すると、逆転写活性が観察される。これは、リン酸ジエステル結合形成反応の進行が早く進むならば、要求されるＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖結合能は低くて済むことを示していると考えられる。また、ＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖結合能を向上させたＥ６６４Ｋを有する変異体でも、Ａ４８５Ｌによって逆転写活性を向上し（変異体Ａ１３）、これらの変異に加えてＤ６１４Ｎをさらに有する変異体でも、逆転写活性がみられた（変異体Ａ２６）。
　（実施例９：転写（ＤＮＡ→ＬＮＡ）および逆転写（ＬＮＡ→ＤＮＡ）反応についてＫＯＤポリメラーゼ変異体を用いた正確性の検討）
　ＤＮＡテンプレートをもとに、転写（ＤＮＡ→ＬＮＡ）にＡ４８（変異体１）およびＡ５３（変異体２）を用い、そして逆転写（ＬＮＡ→ＤＮＡ）にＡ５１を用いて反応を行い、得られたＤＮＡ鎖をＴＡクローニングによってpT7Blue T-Vector（タカラバイオ株式会社製）に挿入し、塩基配列を解析し、ポリメラーゼの正確性を評価した。転写・逆転写以外のステップにおいてもエラーが生じ得るので、全てのステップの反応をＤＮＡで進めるコントロール実験を行い、転写および逆転写のエラー率に補正をかけた。以下に手順を記す。
＜転写（ＤＮＡ→ＬＮＡ）＞
反応液組成（反応液合計５０μＬ）：
　１×
KOD-Plus-Ver.2用緩衝液
　１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４
　０．２ｍＭ　ＬＮＡ－ＮＴＰ（コントロール：ｄＮＴＰ）
　０．５μＭ　プライマー（Primer hmP3）
　０．６μＭ　テンプレート（3'-B-Template_FA2-1A）
　３００ｎｇ／μＬ　ＫＯＤ－Ａ４８またはＡ５３（コントロール：０．０２Ｕ／μＬ　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡株式会社製））。
　ポリメラーゼ添加前の反応液（液量：４０μＬ）をアニーリング（９４℃にて３０秒、１時間かけて２５℃に徐冷）した後、１５００ｎｇ／μＬ　ポリメラーゼ変異体Ａ４８またはＡ５３を１０μＬ添加し、反応を進行させた（コントロール：反応液をそのままＰＣＲに用いた）。
反応条件：
　７４℃にて９時間
（コントロール：ステップ１：９５℃にて２分（×１）、ステップ２：９５℃にて３０秒、５５℃にて３０秒、６８℃にて１分（×３））。
　ＬＮＡ伸長サンプルに１００ｍＭ　ＮａＯＨを５０μＬ添加し、ポリメラーゼを変性させた。５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を２５０μＬ添加して中和した後、エタノール沈殿によって精製し、１×B/W Buffer（結合および洗浄緩衝液：５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１Ｍ　ＮａＣｌ、０．０５％　ｖ／ｖ　Ｔｗｅｅｎ２０）：１ｍＬに溶解させた（コントロール：反応後のサンプルに２×B/W Bufferを５０μＬ、１×B/W Bufferを９００μＬ添加した）。
　Dynabeads（登録商標）M-280 Streptavidin（Thermo Fisher Scientific, Inc.）５０μＬを１ｍＬの１×B/W Bufferによって３回洗浄した後、前述の反応後のサンプル１ｍＬを加え、６０分混和した。１ｍＬの１×B/W Bufferによって３回洗浄した後、１ｍＬの滅菌水で２回洗浄した。さらに１００ｍＭ　ＮａＯＨを５０μＬ加え、５分混和した後、上清を回収した。１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を１ｍＬ添加して中和した後、新しいDynabeads（登録商標）M-280 Streptavidin（洗浄済み）を５０μＬ添加して３０分混和することで、微量に含まれる可能性のあるテンプレート鎖をビーズ上にトラップして除去した。上清は回収して、Vivaspin 500（５，０００ＭＷＣＯ）（Sartorius AG）を用いて、滅菌水に置換・濃縮した。
＜逆転写（ＬＮＡ→ＤＮＡ）＞
反応液組成（反応液合計５０μＬ）:
　１× KOD-Plus-Ver.2用緩衝液
　１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４
　０．２ｍＭ　ｄＮＴＰ
　０．５μＭ　プライマー（5'-Primer hP5）
　ＬＮＡテンプレート溶液２．５μＬ
　２ｎｇ／μＬ　ＫＯＤ＿Ａ５１（コントロール：０．０２Ｕ／μＬ　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－）。
反応条件：
　ステップ１：９５℃にて２分（×１）、ステップ２：９５℃にて３０秒、５５℃にて３０秒、７４℃（コントロール：６８℃）にて１分（×２０）。
　反応後のサンプルに２×B/W Bufferを５０μＬ、１×B/W Bufferを９００μＬ添加した。
　Dynabeads（登録商標）M-280 Streptavidin ５０μＬを１ｍＬの１×B/W Bufferによって３回洗浄した後、前述の逆転写反応後のサンプル１ｍＬを加え、６０分混和した。１ｍＬの１×B/W Bufferによって３回、１ｍＬの１００ｍＭ　ＮａＯＨで４回、１ｍＬの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で１回、１ｍＬの滅菌水で２回洗浄した。洗浄操作によって、ＬＮＡ伸長鎖を可能な限り除去し、逆転写鎖をビーズにトラップした。ビーズを滅菌水５０μＬに懸濁させた。
　ＰＣＲ（ＴＡクローニング用）：反応液２５μＬ。１×Ｔａｑ反応緩衝液、１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰ、０．３μＭプライマー（Primer hP1，Primer hP5）、逆転写鎖をトラップしたビーズ懸濁液２．５μＬ、０．１Ｕ／μＬ　ｒＴａｑポリメラーゼ（東洋紡株式会社製）。反応条件：ステップ１：９４℃にて２分（×１）、ステップ２：９４℃にて３０秒、５０℃にて３０秒、７２℃にて１分（×２０）。QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN, Inc.）を用いて精製し、ＴＡクローニングに用いた。
　ＴＡクローニング：ＰＣＲ産物１．５μＬ、２．５ｎｇ／μＬ　pT7Blue T-Vector　０．５μＬ、Ligation High Ver.2（東洋紡株式会社製）２μＬを混合し、１６℃にて６０分反応させた後、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られたシングルコロニーから各々のプラスミドを抽出し、塩基配列解析を行った。
　表８は、ＬＮＡ転写・逆転写の正確性評価に用いたプライマーおよびテンプレートの配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　実験系の都合上、転写・逆転写以外に、クローニングの際にエラーが生じ得る。従って、バックグラウンドのエラー率を求めるためのコントロール実験として、全てのステップをＤＮＡで反応を進めてエラー率を調べた。表９は、ＬＮＡ転写・逆転写の正確性評価のための塩基配列解析結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　結果として、コントロール実験では、解析した１０２４塩基中に６個のエラーが含まれていた。よって実験系のエラー率は、エラー率＝６エラー／（３２サンプル×３２塩基）＝５．８×１０－３（１塩基あたり０．５８％のエラー）と求められた。対して、Ａ４８（転写）とＡ５１（逆転写）を用いた条件では、補正なしで生エラー率＝１７エラー／（３１サンプル×３２塩基）＝１７．１×１０－３、コントロールのエラー率を引いて補正すると、補正エラー率＝１７．１×１０－３－５．８×１０－３＝１１．３×１０－３（１塩基あたり１．１％のエラー）と求められた。また、Ａ５３（転写）とＡ５１（逆転写）を用いた条件では、補正なしで生エラー率＝９エラー／（２６サンプル×３２塩基）＝１０．８×１０－３、コントロールのエラー率を引いて補正すると補正エラー率＝１０．８×１０－３－５．８×１０－３＝５．０×１０－３（１塩基あたり０．５％のエラー）と求められた。よって、Ａ５３のＬＮＡ転写は、その後の逆転写反応で得られるＤＮＡ鎖の塩基配列解析からも正確性を維持したことが示された。また、ＳＥＬＥＸにおいては、Ａ５３（転写）とＡ５１（逆転写）とがより好適に用いられ得る。
　（実施例１０：改変型ポリメラーゼ（ＫＯＤポリメラーゼ変異体）の作出およびＬＮＡ鎖伸長活性の検討）
　表１０に示す改変型ポリメラーゼ（ＫＯＤポリメラーゼ変異体）を作製し、ＤＮＡ鎖を鋳型としたＬＮＡ鎖伸長活性を評価した。これらのＫＯＤポリメラーゼ変異体は、Ｙ４０９を下記のアミノ酸にそれぞれ置換したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　ＫＯＤポリメラーゼ変異体を未添加の反応液を９５℃にて１分加熱後、６０分かけて２５℃まで下げることでアニーリングを行い、次いでＫＯＤポリメラーゼ変異体を添加して７４℃でＬＮＡ鎖の伸長反応を進行させた。得られた反応液に６×ローディングダイを１／６容量添加し、アルカリアガロースゲルにて電気泳動を行った。
　各種ＫＯＤポリメラーゼ変異体について、以下の３通りの反応液組成にてＬＮＡ鎖の伸長反応を行った。
＜評価１＞
　反応液組成：１×KOD-Plus-Ver.2用緩衝液、ＫＯＤポリメラーゼ変異体：３００ｎｇ／μＬ、０．２ｍＭ　ＬＮＡ－ＮＴＰ、１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、プライマー：０．５μＭ　5'_6-FAM_labeled primer LP2、テンプレート：０．６μＭ　Template DNA N50
　反応温度：７４℃、反応時間：６０分
　泳動条件：２５℃、３５Ｖ、２時間
　ゲル：５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、５％寒天
　泳動緩衝液：５０ｍＭ　ＮａＯＨ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ
　サンプル：１．２μＬ（０．５ｐｍｏｌ　プライマー）。
＜評価２＞
　反応液組成：１×ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液１（１２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（２５℃）、１０ｍＭ　ＫＣｌ、６ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）　Ｘ－１００、１０μｇ／ｍＬ　ＢＳＡ）、ＫＯＤポリメラーゼ変異体：３００ｎｇ／μＬ、０．２ｍＭ　ＬＮＡ－ＮＴＰ、１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、プライマー：０．５μＭ　5'_6-FAM_labeled primer LP2、テンプレート：０．６μＭ　Template DNA N50
　反応温度：７４℃、反応時間：６０分
　泳動条件：２５℃、３５Ｖ、２時間
　ゲル：５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、５％寒天
　泳動緩衝液：５０ｍＭ　ＮａＯＨ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ
　サンプル：１．２μＬ（０．５ｐｍｏｌ　プライマー）。
＜評価３＞
　反応液組成：１×ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液２（１２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）（２５℃）、１０ｍＭ　ＫＣｌ、６ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）　Ｘ－１００、１０μｇ／ｍＬ　ＢＳＡ）、ＫＯＤポリメラーゼ変異体：３００ｎｇ／μＬ、０．２ｍＭ　ＬＮＡ－ＮＴＰ、１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、プライマー：０．５μＭ　5'_6-FAM_labeled primer LP2、テンプレート：０．６μＭ　Template DNA N50
　反応温度：７４℃、反応時間：６０分
　泳動条件：２５℃、３５Ｖ、２時間
　ゲル：５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、５％寒天
　泳動緩衝液：５０ｍＭ　ＮａＯＨ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ
　サンプル：１．２μＬ（０．５ｐｍｏｌ　プライマー）。
　評価１、２および３の結果をそれぞれ図８、９および１０に示す。図８に示す通り、ＫＯＤポリメラーゼ変異体Ａ６２、Ａ６３およびＡ６４が特に高いＬＮＡ鎖伸長活性を示した。これらは、Ｙ４０９を、嵩の低いアミノ酸（それぞれ、グリシン、アラニンおよびセリン）に置換された変異体である。図８においては、次いでＡ６５（トレオニン）、Ａ５３（バリン）およびＡ６８（アスパラギン酸）、さらにＡ６６（ロイシン）およびＡ６７（フェニルアラニン）についてもＬＮＡ鎖伸長活性が観察された。反応液の緩衝液の組成を変更することにより、効率的なＬＮＡ鎖伸長が可能になることが見出された（図８～１０）。１×KOD-Plus-Ver.2用緩衝液を用いた条件（評価１）よりも、図９の１×ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液１を用いた条件（評価２）でＬＮＡ鎖伸長効率が高くなり、さらに図１０の１×ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液２を用いた条件（評価３）において、ＬＮＡ鎖伸長効率が特に高かった。図８～１０によれば、Ａ６９（グルタミン酸）についてもゲルのバンドの移動がみられており、ＬＮＡ鎖伸長活性があると評価された。Ａ５３とＡ６２～Ａ６９とのＬＮＡ鎖伸長活性を比較すると、Ｙ４０９についての置換後のアミノ酸の基のサイズ（嵩高さ）が小さい方が、より高いＬＮＡ鎖伸長活性が観察された。
　（実施例１１：ＫＯＤポリメラーゼ変異体を用いたＬＮＡ鎖合成の正確性の検討）
　作製した改変ポリメラーゼについて、ＬＮＡ取り込みの正確性について評価した。改変ポリメラーゼの種類はＡ５３を用いて、二通りの緩衝液の場合について評価した。正確性評価の手法として、４種類の塩基のうち１種類欠いた条件（下記条件２～５：塩基なしの場合を条件１、４種類の塩基が揃った場合を条件６とする）で伸長反応をおこなった。
　下記の反応液組成および条件でＬＮＡ鎖伸長反応を行い、ＬＮＡ鎖伸長活性を評価した。
　反応液組成：１×ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液２（１２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）（２５℃）、１０ｍＭ　ＫＣｌ、６ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）　Ｘ－１００、１０μｇ／ｍＬ　ＢＳＡ）、ＫＯＤポリメラーゼ変異体Ａ５３：３００ｎｇ／μＬ、１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、
　条件１：ＬＮＡ－ＮＴＰなし，
　条件２：０．２ｍＭ　ＬＮＡ－（Ｃ，Ｇ，Ｔ）ＴＰ（すなわちＬＮＡ－ＡＴＰを欠く），
　条件３：０．２ｍＭ　ＬＮＡ－（Ａ，Ｇ，Ｔ）ＴＰ（すなわちＬＮＡ－ＣＴＰを欠く），
　条件４：０．２ｍＭ　ＬＮＡ－（Ａ，Ｃ，Ｔ）ＴＰ（すなわちＬＮＡ－ＧＴＰを欠く），
　条件５：０．２ｍＭ　ＬＮＡ－（Ａ，Ｃ，Ｇ）ＴＰ（すなわちＬＮＡ－ＴＴＰを欠く），
　条件６：０．２ｍＭ　ＬＮＡ－ＮＴＰ，
　プライマー：０．５μＭ　5'_6-FAM_labeled primer P2、
　テンプレート：０．６μＭ　Template DNA L3-2（配列番号１４）
　反応温度：７４℃、反応時間：１２０分
　泳動条件：２５℃、３５Ｖ、２時間
　ゲル：５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、５％寒天
　泳動緩衝液：５０ｍＭ　ＮａＯＨ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ
　サンプル：１．２μＬ（０．５ｐｍｏｌ　プライマー）。
　さらに、上記反応液組成の１×ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液２を１×KOD-Plus-Ver.2用緩衝液に代え、反応時間を１５時間とし、そしてサンプル量を１．５μＬ（０．６２５ｐｍｏｌ　プライマー）としてＬＮＡ鎖伸長反応を行い、ＬＮＡ鎖伸長活性を評価した。
　これらの結果を図１１および１２に示す。ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液２を用いた場合（図１１）も、KOD-Plus-Ver.2用緩衝液を用いた場合（図１２）とは伸長が同程度だった。反応緩衝液によって、伸長効率は大幅に向上するが、正確性については大きく変わらないことが示された。
　（実施例１２：ＫＯＤポリメラーゼ変異体を用いたＬＮＡ鎖合成の正確性の検討）
　実施例１１の改変ポリメラーゼＡ５３をＡ６５に代えたこと以外は、１×ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液２を用いた場合と同様にして、ＬＮＡ取り込みの正確性について評価した。この結果を図１３に示す。
　Ａ６５においても、Ａ５３と同様に、塩基の種類を１種類欠いた条件（条件２～５）において過剰な伸長反応は効率的に抑制された（図１３）。
　本発明によれば、人工核酸であるＬＮＡを含む鎖を伸長し得る改変ポリメラーゼが提供される。これにより、ＤＮＡ鎖からＬＮＡ鎖を安定的に伸長させることが可能となる。さらに、ランダム配列からなるＤＮＡ鎖をテンプレートに用いて、ＬＮＡライブラリを作成することもできる。人工核酸ライブラリからアプタマーを選出することにより、予め分解酵素耐性を有するアプタマーが取得でき、よって、アプタマーの最適化にかかる時間を短縮できる。さらに、人工核酸ライブラリによって、ライブラリのサイズを拡大でき、候補アプタマーのスクリーニングの範囲が広がる。人工核酸ライブラリの作成により、医薬品などの候補となる人工核酸を含む配列のスクリーニングおよび人工核酸を含む核酸医薬品の効率的な開発に有用となる。

Claims (11)

  1. 　配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、以下の（１）あるいは（２）の変異を有するアミノ酸配列からなる、改変型ポリメラーゼ：
    （１）２１０位のアスパラギンがアスパラギン酸に、４０９位のチロシンがバリン、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸またはグルタミン酸に、４８５位のアラニンが中性アミノ酸に、ならびに６６４位のグルタミン酸がリジン、グルタミン、またはアルギニンに、それぞれ置換されている；あるいは
    （２）２１０位のアスパラギンがアスパラギン酸に、４０９位のチロシンがバリン、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸またはグルタミン酸に、４８５位のアラニンが中性アミノ酸に、６１４位のアスパラギン酸がアスパラギンに、ならびに６６４位のグルタミン酸がリジン、グルタミン、またはアルギニンに、それぞれ置換されている。
  2. 　配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、以下の（１）あるいは（２）の変異を有するアミノ酸配列からなる、改変型ポリメラーゼ：
    （１）２１０位のアスパラギンがアスパラギン酸に、４８５位のアラニンが中性アミノ酸に、ならびに６６４位のグルタミン酸がリジン、グルタミン、またはアルギニンに、それぞれ置換されている；あるいは
    （２）２１０位のアスパラギンがアスパラギン酸に、４８５位のアラニンが中性アミノ酸に、６１４位のアスパラギン酸がアスパラギンに、ならびに６６４位のグルタミン酸がリジン、グルタミン、またはアルギニンに、それぞれ置換されている。
  3. 　配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、以下の変異を有するアミノ酸配列からなる、改変型ポリメラーゼ：
    　２１０位のアスパラギンがアスパラギン酸に、ならびに６６４位のグルタミン酸がリジン、グルタミン、またはアルギニンに、それぞれ置換されている。
  4. 　ＤＮＡ含有オリゴヌクレオチドからＬＮＡ含有オリゴヌクレオチド鎖を合成する方法であって、
    　該ＤＮＡ含有オリゴヌクレオチドからなるテンプレート、プライマー、ＬＮＡ－ＮＴＰおよび請求項１または２に記載の改変型ポリメラーゼを反応させる工程
    を含む、方法。
  5. 　前記プライマーが、ＬＮＡ含有プライマーである、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記ＤＮＡ含有オリゴヌクレオチドが、ランダム配列を含む、請求項４または５に記載の方法。
  7. 　ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドからＤＮＡ含有オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
    　該ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドからなるテンプレート、プライマー、ｄＮＴＰおよび請求項２または３に記載の改変型ポリメラーゼを反応させる工程
    を含む、方法。
  8. 　前記反応させる工程が、１２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７～９）、１０ｍＭ　ＫＣｌ、６ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、および１０μｇ／ｍＬ　牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する緩衝液中で行われる、請求項４から７のいずれかに記載の方法。
  9. 　ＬＮＡ鎖伸長活性を有する改変型ポリメラーゼであって、エキソヌクレアーゼ活性を減弱させる変異、三リン酸体の結合に寄与する変異、およびＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖との結合を強める変異を含むように改変されたポリメラーゼである、改変型ポリメラーゼ。
  10. 　前記改変型ポリメラーゼが、三リン酸体の糖構造の認識を緩和する変異をさらに含む、請求項９に記載の改変型ポリメラーゼ。
  11. 　逆転写活性を有する改変型ポリメラーゼであって、エキソヌクレアーゼ活性を減弱させる変異と、ＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖との結合を強める変異とを含む、あるいは、エキソヌクレアーゼ活性を減弱させる変異と、ＤＮＡ／ＬＮＡ二重鎖との結合を強める変異と、三リン酸体の結合に寄与する変異とを含むように改変されたポリメラーゼである、改変型ポリメラーゼ。
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