DE60124272T2

DE60124272T2 - Methode zur zielgerichteten evolution

Info

Publication number: DE60124272T2
Application number: DE60124272T
Authority: DE
Inventors: Philipp Holliger; Farid Department of Oncology Ghadessy; Jennifer Lee Ong
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 2000-09-13
Filing date: 2001-09-13
Publication date: 2007-05-03
Anticipated expiration: 2021-09-14
Also published as: US7514210B2; US20080166772A1; EP1964932A2; ES2274901T3; ES2304580T3; ATE396259T1; CA2585083A1; EP1806406A2; EP1505151B1; WO2002022869A3; US20040005594A1; EP1505151A2; ATE344320T1; WO2002022869A2; EP1505151A3; CA2421963C; US20090246853A1; DE60124272D1; JP2007190027A; EP1317539B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Verwendung bei der in vitro-Evolution molekularer Bibliotheken. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Selektieren von Nukleinsäuren, die für Genprodukte codieren, bei denen die Nukleinsäure und die Aktivität des codierten Genprodukts durch Kompartimentierung miteinander in Verbindung gebracht werden.
Hintergrund der Erfindung
Evolution erfordert die Erzeugung genetischer Diversität (Diversität der Nukleinsäure), gefolgt von der Selektion solcher Nukleinsäuren, die nützliche Merkmale codieren. Da die Aktivität von Nukleinsäuren und ihr codiertes Genprodukt in biologischen Organismen physikalisch miteinander verbunden sind (die Nukleinsäuren codieren den molekularen Bauplan der Zellen, auf die sie beschränkt sind), erzeugen Veränderungen des Genotyps, die in einer adaptiven Veränderung bzw. adaptiven Veränderungen des Phänotyps resultieren, Vorteile für den Organismus, die zu gesteigertem Überleben und gesteigerter Nachkommenschaft führen. Multiple Runden der Mutation und Selektion können somit in einer progressiven Anreicherung von Organismen (und dem codierenden Genotyp) mit einer gesteigerten Anpassung an eine gegebene Selektionsbedingung resultieren. Systeme für die schnelle Evolution von Nukleinsäuren oder Proteinen in vitro müssen diesen Prozess auf der molekularen Ebene derart nachahmen, dass die Nukleinsäure und die Aktivität des codierten Genprodukts verbunden werden müssen und die Aktivität des Genprodukts selektierbar sein muss.
In vitro-Selektionstechniken sind ein rasch expandierendes Gebiet und erweisen sich oft als wirkungsvoller als ein rationales Design, um Biopolymere mit erwünschten Eigenschaften zu erhalten. Bei Selektionsversuchen des letzten Jahrzehnts wurden unter Verwendung z.B. von Phage Display oder SELEX-Techniken viele neue Polynukleotid- und Polypeptidliganden gewonnen. Die Selektion im Hinblick auf Katalyse hat sich als schwerer erwiesen. Die Strategien haben die Bindung an Übergangszustands-Analoga, die kovalente Bindung an Suizid-Inhibitoren, die Annäherungs-Kopplung und kovalente Produktbindung beinhaltet. Obwohl diese Ansätze sich nur auf einen bestimmten Teil des enzymatischen Zyklus fokussieren, gab es einige Erfolge. Schlussendlich wäre es jedoch erstrebenswert, direkt auf den katalytischen Umsatz hin zu selektieren. Tatsächlich waren einfache Durchmusterungen auf den katalytischen Umsatz eher kleiner Mutanten-Bibliotheken relativ erfolgreicher als die verschiedenen Selektionsansätze und haben einige Katalysatoren mit stark erhöhten katalytischen Raten erbracht.
Obwohl Polymerasen eine Vorbedingung für Technologien darstellen, die molekularbiologisch definiert sind, d.h. positionsspezifische Mutagenese, cDNA-Klonierung und insbesondere Sanger-Sequenzierung und PCR, leiden sie oft an ernsten Beeinträchtigungen aufgrund der Tatsache, dass sie zur Durchführung von Aufgaben hergestellt werden, für die die Natur sie nicht optimiert hat. Es scheint so, dass nur wenige Versuche unternommen wurden, um die Eigenschaften von aus der Natur erhältlichen Polymerasen zu verbessern und sie durch Protein-Engineering für ihre spezifischen Anwendungen maßzuschneidern. Die technischen Fortschritte waren größtenteils peripher und beinhalten die Verwendung von Polymerasen aus einem breiteren Spektrum von Organismen, die Verwendung von Puffern und Additiv-Systemen ebenso wie von Enzymgemischen.
Bestrebungen zur Verbesserung der Eigenschaften von Polymerasen haben sich traditionell auf Protein-Engineering gestützt. Beispielsweise sind Varianten von Taq-Polymerase (z.B. Stoffel-Fragment und Klentaq) durch vollständige oder partielle Deletion von dessen 5'-3'-Exonuklease-Domäne erzeugt worden und zeigen eine verbesserte Thermostabilität und Widergabetreue, jedoch auf Kosten eines verringerten Voranschreitens (Prozessivität) (Barnes 1992, Gene 112, 29–35, Lawyer et al., 1993, PCR Methods and Applications 2, 275). Zusätzlich hat die Verfügbarkeit hochauflösender Strukturen von Proteinen das rationale Design von Mutanten mit verbesserten Eigenschaften erlaubt (beispielsweise Taq-Mutanten mit verbesserten Eigenschaften des Didesoxynukleotid-Einbaus für die zyklische Sequenzierung, Li et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci USA 96, 9491). Es sind außerdem genetische in vivo-Ansätze für das Protein-Design verwendet worden, z.B. durch die Komplementation eines polA^–-Stammes zur Selektion aktiver Polymerasen aus Repertoires mutanter Polymerasen (Suzuki et al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sci USA 93, 9670). Jedoch ist der Ansatz der genetischen Komplementation hinsichtlich der Eigenschaften, auf die selektiert werden kann, begrenzt.
Jüngste Fortschritte der Molekularbiologie haben es erlaubt, dass einige Moleküle gemäß ihren Eigenschaften in vitro zusammen mit den sie codierenden Nukleinsäuren co-selektiert werden. Die selektierten Nukleinsäuren können nachfolgend für die weitere Analyse oder Verwendung kloniert oder zusätzlichen Runden der Mutation und Selektion unterworfen werden. Diesen Verfahren gemeinsam ist die Etablierung großer Bibliotheken von Nukleinsäuren. Moleküle mit den gewünschten Eigenschaften (Aktivität) können durch Selektionsschemata isoliert werden, die auf die gewünschte Aktivität des codierten Genprodukts hin selektieren, wie etwa eine gewünschte biochemische oder biologische Aktivität, z.B. Bindungsaktivität.
Die WO 99/02671 und Tawfik D. & Griffiths A. D. (1998) Nature Biotech. 16, 652, beschreiben ein Verfahren zum Isolieren eines oder mehrerer genetischer Elemente, die für ein Genprodukt codieren, das eine gewünschte Aktivität besitzt. Genetische Elemente werden zunächst einer Kompartimentierung in Mikrokapseln unterzogen und dann transkribiert und/oder translatiert, um ihre entsprechenden Genprodukte (RNA oder Protein) in den Mikrokapseln zu erzeugen. Alternativ sind die genetischen Elemente in einer Wirtszelle enthalten, in der die Transkription und/oder Translation (Expression) des Genprodukts stattfindet, und die Wirtszellen werden zunächst in Mikrokapseln kompartimentiert. Genetische Elemente, die Genprodukte mit der gewünschten Aktivität erzeugen, werden nachfolgend sortiert. Das in der WO 99/02671 beschriebene Verfahren stützt sich auf das Genprodukt, das die Mikrokapsel oder das genetische Element (oder beide) katalytisch modifiziert, sodass die Anreicherung der modifizierten Einheit oder der modifizierten Einheiten eine Selektion der gewünschten Aktivität ermöglicht.
Suzuki et al. (1996) PNAS 93: 9670–9675, die WO 98/23733 und die WO 94/26766 beschreiben die Zufallsmutagenese von DNA-Polymerasen, die zu einer verbesserten Thermostabilität führt, und DNA-Polymerasen mit verbesserter Thermostabilität.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung stellen wir ein Verfahren zum Selektieren eines Enzyms bereit, welches in der Lage ist, Nukleinsäure ausgehend von einer Matrize zu vervielfältigen, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: (a) Bereitstellen eines Pools von Nukleinsäuren, der Mitglieder umfasst, die ein Enzym, welches in der Lage ist, Nukleinsäure von einer Matrize aus zu vervielfältigen, oder eine Variante des Enzyms codieren; (b) Unterteilen des Pools von Nukleinsäuren in Mikrokapseln, sodass jede Mikrokapsel ein Nukleinsäuremitglied des Pools zusammen mit dem Nukleinsäurereplikase-Enzym oder der Variante, das bzw. die durch das Nukleinsäuremitglied codiert wird, umfasst; (c) Zulassen, dass die Nukleinsäurereplikation stattfindet; und (d) Detektieren der Replikation des Nukleinsäuremitglieds durch das Enzym.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Selektieren eines Polypeptids bereitgestellt, das in der Lage ist, die Aktivität einer Enzymreaktion zu modifizieren, die befähigt ist, Nukleinsäure von einer Matrize aus zu amplifizieren, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: (a) Bereitstellen eines Enzyms, das in der Lage ist, Nukleinsäure von einer Matrize aus zu amplifizieren; (b) Bereitstellen eines Pools von Nukleinsäuren, der Mitglieder umfasst, die ein oder mehrere Kandidatenpolypeptide codieren; (c) Unterteilen des Pools von Nukleinsäuren in Mikrokapseln, so dass jede Mikrokapsel ein Nukleinsäuremitglied des Pools, das von dem Nukleinsäuremitglied codierte Polypeptid und das Enzym umfasst; und (d) Detektieren der Replikation des Nukleinsäuremitglieds durch das Enzym.
Bevorzugt ist das Polypeptid ein Promotor der Enzymaktivität. Das Polypeptid kann ein Enzym sein, bevorzugt eine Kinase oder eine Phosphorylase, die befähigt ist, auf das Enzym einzuwirken, um dessen Aktivität zu modifizieren. Das Polypeptid kann ein Chaperon sein, das an der Faltung oder am Zusammenbau des Enzyms beteiligt ist, oder das für die Aufrechterhaltung der Replikase-Funktion benötigt wird (z.B. Telomerase, HSP 90). Alternativ kann das Polypeptid an einem Stoff wechselweg beteiligt sein, wobei der Stoffwechselweg als ein Endprodukt ein Substrat besitzt, das an einer Replikationsreaktion beteiligt ist. Das Polypeptid kann darüber hinaus ein beliebiges Enzym sein, das befähigt ist, eine Reaktion zu katalysieren, die einen Inhibitor (natürlich oder nicht natürlich) des Enzyms in einer solchen Weise modifiziert, dass es dessen inhibierende Aktivität reduziert oder aufhebt. Schließlich kann das Polypeptid die NAP-Aktivität auf nicht-katalytische Weise unterstützen, z.B. durch Assoziation mit dem Enzym oder dessen Substrat etc. (z.B. Prozessivitätsfaktoren im Fall von DNA-Polymerasen, z.B. T7-DNA-Polymerase & Thioredoxin).
Enzyme, die befähigt sind, Nukleinsäuren von einer Matrize aus zu amplifizieren, können z.B. Polypeptid- oder Ribonukleinsäure-Enzymmoleküle sein. Bei einer hochgradig bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym gemäß der Erfindung ein Replikase-Enzym, d.h. ein Enzym, das befähigt ist, Nukleinsäure von einer Matrize aus zu amplifizieren, wie z.B. ein Polymerase-Enzym (oder eine Ligase). Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung resultiert die Amplifikation der Nukleinsäure aus mehr als einer Runde der Nukleinsäure-Replikation. Bevorzugt ist die Amplifikation der Nukleinsäure eine exponentielle Amplifikation.
Die Amplifikationsreaktion wird bevorzugt aus den folgenden ausgewählt: einer Polymerasekettenreaktion (PCR), einer reversen Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), einer nested PCR, einer Ligase-Kettenreaktion (LCR), einem Transkriptions-basierten Amplifikationssystem (TAS), einer selbsttragenden Sequenzreplikation (3SR), NASBA, einer Transkriptions-vermittelten Amplifikationsreaktion (TMA) und einer Strangverdrängungsamplifikation (SDA).
Bei einer hochgradig bevorzugten Ausführungsform ist die nach der Amplifikation vorliegende Kopienzahl des Nukleinsäuremitglieds weitgehend proportional zur Aktivität der Replikase, der Aktivität eines erforderlichen Polypeptids oder der Bindungsaffinität des ersten und zweiten Polypeptids.
Die Nukleinsäurereplikation kann durch die Bestimmung der Kopienzahl des Nukleinsäuremitglieds detektiert werden. Alternativ oder zusätzlich kann die Nukleinsäurereplikation durch die Bestimmung der Aktivität eines Polypeptids, das durch das Nukleinsäuremitglied codiert wird, detektiert werden.
Bei einer hochgradig bevorzugten Ausführungsform werden die Bedingungen in der Mikrokapsel eingestellt, um auf eine Replikase oder ein Polypeptid hin zu selektieren, die/das unter solchen Bedingungen aktiv ist, oder im Hinblick auf ein Paar von Polypeptiden, das zur stabilen Interaktion unter solchen Bedingungen befähigt ist.
Die Replikase besitzt bevorzugt Polymerase-, reverse Transkriptase- oder Ligase-Aktivität.
Das Polypeptid kann von der Nukleinsäure durch in vitro-Transkription und -Translation bereitgestellt werden. Alternativ kann das Polypeptid von der Nukleinsäure in vivo in einem Expressionswirt bereitgestellt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform bestehen die Mikrokapseln der eingekapselten wässrigen Komponente aus einer Wasser-in-Öl-Emulsion. Die Herstellung der Wasser-in-Öl-Emulsion erfolgt bevorzugt durch Emulgieren einer wässrigen Phase mit einer Ölphase in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels, umfassend 4,5% v/v Span 80, 0,4% v/v Tween 80 und 0,1% v/v Triton X100, oder eines oberflächenaktiven Mittels, umfassend Span 80, Tween 80 und Triton X100 in weitgehend den gleichen Anteilen. Bevorzugt beträgt das Verhältnis von Wasser:Ölphase 1:2, was zu einer adäquaten Tröpfchengröße führt. Solche Emulsionen besitzen eine höhere Thermostabilität als ölreichere Emulsionen.
Bevorzugt kann das Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, um Replikaseenzyme zu selektieren, die eine größere Thermostabilität besitzen als ein entsprechendes nicht-selektiertes Enzym. Bevorzugter ist das Replikaseenzym eine Taq-Polymerase mit einer mehr als 10-fach gesteigerten Halbwertszeit bei 97,5°C im Vergleich zu wildtypischer Taq-Polymerase.
Das Replikaseenzym kann eine größere Toleranz gegenüber Heparin besitzen als ein entsprechendes nicht-selektiertes Enzym. Bevorzugt ist das Replikaseenzym eine Taq-Polymerase, die bei einer Konzentration von 0,083 Unit/μl oder mehr an Heparin aktiv ist.
Das Replikaseenzym kann befähigt sein, einen Primer mit einer 3'-Fehlpaarung zu verlängern. Bevorzugt ist die 3'-Fehlpaarung eine 3'-Purin-Purin-Fehlpaarung oder eine 3'-Pyrimidin-Pyrimidin-Fehlpaarung. Bevorzugter ist die 3'-Fehlpaarung eine A-G-Fehlpaarung, oder die 3'-Fehlpaarung ist eine C-C-Fehlpaarung.
Beispielsweise kann das Verfahren der Erfindung verwendet werden, um eine Taq-Polymerasemutante zu selektieren, die die folgenden Mutationen (Aminosäuresubstitutionen) umfasst: F73S, R205K, K219E, M236T, E434D und A608V.
Beispielsweise kann das Verfahren der Erfindung verwendet werden, um eine Taq-Polymerasemutante zu selektieren, die die folgenden Mutationen (Aminosäuresubstitutionen) umfasst: K225E, E388V, K540R, D578G, N583S und M747R.
Beispielsweise kann das Verfahren der Erfindung verwendet werden, um eine Taq-Polymerasemutante zu selektieren, die die folgenden Mutationen (Aminosäuresubstitutionen) umfasst: G84A, D144G, K314R, E520G, A608V, E742G.
Beispielsweise kann das Verfahren der Erfindung verwendet werden, um eine Taq-Polymerasemutante zu selektieren, die die folgenden Mutationen (Aminosäuresubstitutionen) umfasst: D58G, R74P, A109T, L245R, R343G, G370D, E520G, N583S, E694K, A743P.
Die Erfindung verwendet bevorzugt eine Wasser-in-Öl-Emulsion, die erhalten werden kann durch Emulgieren einer wässrigen Phase mit einer Ölphase in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels, umfassend 4,5% v/v Span 80, 0,4% v/v Tween 80 und 0,1% v/v Triton X100, oder eines oberflächenaktiven Mittels, umfassend Span 80, Tween 80 und Triton X100 in weitgehend den gleichen Anteilen. Bevorzugt ist das Verhältnis von Wasserphase:Ölphase 1:2. Dieses Verhältnis scheint eine Diffusion der dNTPs (und vermutlich anderer kleiner Moleküle) zwischen Mikrokapseln bei höheren Temperaturen zu erlauben, was für einige Anwendungen nützlich ist, für andere jedoch nicht. Die Diffusion kann kontrolliert werden, indem man das Verhältnis von Wasserphase:Ölphase auf 1:4 erhöht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A ist ein Diagramm, das eine Ausführungsform eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, wie angewendet auf eine Auswahl einer sich selbst erzeugenden Polymerase, bei der die Anzahl der Genkopien mit dem enzymatischen Umsatz verbunden ist.
1B ist ein Diagramm, das ein allgemeines Schema einer kompartimentierten Selbstreplikation (CSR) zeigt: 1) Ein Repertoire diversifizierter Polymerasegene wird kloniert und in E. coli exprimiert. Die Kugeln stellen aktive Polymerasemoleküle dar. 2) Bakterienzellen, die die Polymerase und das codierende Gen enthalten werden in Reaktionspuffer suspendiert, der flankierende Primer und Nukleotidtriphosphate (dNTPs) enthält, und in wässrige Kompartimente aufgeteilt. 3) Das Polymeraseenzym und das codierende Gen werden aus der Zelle freigesetzt und erlauben, dass die Selbstreplikation voranschreitet. Polymerasen geringer Aktivität (weißes Hexagon) versagen bei der Replikation des sie codierenden Gens. 4) Die „Nachkommen"-Polymerasegene werden freigesetzt, erneut diversifiziert und für einen weiteren Zyklus der CSR erneut kloniert.
2 ist ein Diagramm, das wässrige Kompartimente der hitzestabilen Emulsion zeigt, die E. coli-Zellen enthält, die grünes Fluoreszenzprotein (GFP) exprimieren, und zwar vor (A, B) und nach (C) dem Thermocycling, wie durch Lichtmikroskopie abgebildet. (A, B) stellen das gleiche Bildfenster dar. (A) wurde für GFP-Fluoreszenz bei 535 nm aufgenommen und (B) in sichtbarem Licht zur Sichtbarmachung von Bakterienzellen in den Kompartimenten. Das „Verschmieren" der fluoreszenten Bakterien in (A) basiert auf der Brown'schen Bewegung während der Exposition. Die durchschnittlichen Dimensionen des Kompartiments, wie durch Laserdiffraktion bestimmt, sind unten angegeben.
3A ist ein Diagramm, das die Kreuzreaktion zwischen Emulsionskompartimenten zeigt. Zwei Standard-PCR-Reaktionen, die sich in ihrer Matrizengröße (PCR1 (0,9 kb), PCR2 (0,3 kb)) und hinsichtlich der Anwesenheit von Taq (PCR 1: + Taq, PCR 2: kein Enzym) unterscheiden, werden einzeln oder in Kombination amplifiziert. Wenn sie in der Lösung kombiniert werden, werden beide Matrizen amplifiziert. Wenn sie vor dem Mischen separat emulgiert werden, wird nur PCR 1 amplifiziert. M: ϕX174 HaeIII-Marker.
3B ist ein Diagramm, das die Kreuzreaktion zwischen Emulsionskompartimenten zeigt. Bakterielle Zellen, die wildtypische Taq-Polymerase (2,7 kb) oder das Taq-Polymerase Stoffel-Fragment (unter den Pufferbedingungen nur geringfügig aktiv) (1,8 kb) exprimieren, werden vor dem Emulgieren 1:1 gemischt. In Lösung wird das kürzere Stoffel-Fragment bevorzugt amplifiziert. In der Emulsion gibt es eine vorherrschende Amplifikation des Wt-Taq-Gens und nur eine schwache Amplifikation des Stoffel-Fragments (Pfeil). M: λHindIII-Marker.
4 ist ein Diagramm, das die Details einer Ausführungsform eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, wie es auf eine Auswahl einer sich selbst erzeugenden Polymerase angewendet wird.
5 ist ein Diagramm, das die Details einer Ausführungsform eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, um auf den Einbau neuer oder ungewöhnlicher Substrate hin zu selektieren.
6 ist ein Diagramm, das die Selektion von RNA mit (intermolekularer) katalytischer Aktivität unter Verwendung der Verfahren unserer Erfindung zeigt.
7 ist ein Diagramm, das ein Modell eines Taq-DNA-Komplexes zeigt.
8A: Allgemeines Schema einer kooperativen CSR-Reaktion.
Nukleosid-Diphosphat-Kinase (ndk) wird ausgehend von einem Plasmid exprimiert und setzt Desoxynukleosiddiphosphate, die keine Substrate für Taq-Polymerase sind, in Desoxynukleosidtriphosphate um, die Substrate sind. Sobald ndk hinreichende Mengen an Substrat erzeugt hat, kann Taq das ndk-Gen replizieren.
B: Bakterienzellen, die die wildtypische ndk (0,8 kb) oder ein inaktives trunkiertes Fragment (0,5 kb) exprimieren, werden vor dem Emulgieren 1:1 gemischt. In der Lösung wird das kürzere trunkierte Fragment bevorzugt amplifiziert. In der Emulsion gibt es eine vorherrschende Amplifikation des wildtypischen ndk-Gens und nur eine schwache Amplifikation des trunkierten Fragments (Pfeil), was anzeigt, dass in der Emulsion nur aktive ndk-Gene, die Substrat erzeugen, amplifiziert werden. M: HaeIII ϕX174-Marker.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Praxis der vorliegenden Erfindung wird, solange nicht anders angegeben, konventionelle Techniken der Chemie, der Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA und Immunologie verwenden, die innerhalb der Fähigkeiten des Durchschnittsfachmanns liegen. Solche Techniken sind in der Literatur erklärt. Siehe hierzu z.B. J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Bücher 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; B. Roe, J. Crabtree und A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak und James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Herausgeber), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; und D. M. J. Lilley und J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Methods in Enzymology, Academic Press.
Kompartimentierte Selbst-Replikation
Unsere Erfindung beschreibt eine neue Selektionstechnologie, die wir als CSR (kompartimentierte Selbstreplikation) bezeichnen. Sie besitzt das Potential, zu einem genetischen Selektionssystem für Katalyse ebenso wie für makromolekulare Interaktionen erweitert zu werden.
In ihrer einfachsten Form beinhaltet die CSR die Segregation von Genen, die für DNA-Polymerasen codieren und deren Produktion in getrennten, räumlich abgegrenzten, wässrigen Kompartimenten aus einer neuen hitzestabilen Wasser-in-Öl-Emulsion steuern. Ausgestattet mit Nukleotidtriphosphaten und passenden flankierenden Primern, replizieren Polymerasen nur ihre eigenen Gene. Entsprechend werden nur Gene repliziert, die aktive Polymerasen codieren, während inaktive Varianten, die ihre Gene nicht kopieren können, aus dem Genpool verschwinden. In Analogie zu biologischen Systemen produziert die Aktivste („Fitteste") unter den unterschiedlich angepassten Varianten die meisten „Nachkommen" und stellt damit eine direkte Korrelation zwischen der nach der Selektion vorliegenden Kopienzahl und dem enzymatischen Umsatz her.
Die CSR ist nicht auf Polymerasen beschränkt, sondern kann bei einer breiten Vielzahl enzymatischer Transformationen Anwendung finden, die um die „Replikase-Maschinerie" angeordnet werden. Beispielsweise kann auf ein Enzym selektiert werden, das eine Polymerase „füttert", die wiederum ihr Gen repliziert. Es können kompliziertere gekoppelte kooperative Reaktionsschemata ins Auge gefasst werden, bei denen mehrere Enzyme entweder Replikasesubstrate produzieren oder Replikase-Inhibitoren verbrauchen.
Polymerasen nehmen eine zentrale Stellung bei der Aufrechterhaltung des Genoms, bei der Übertragung und Expression genetscher Information ein. Polymerasen befinden sich außerdem im Zentrum der modernen Biologie und erlauben Kerntechnologien, wie etwa Mutagenese, cDNA-Bibliotheken, Sequenzierung und die Polymerasekettenreaktion (PCR). Jedoch leiden die gebräuchlich verwendeten Polymerasen häufig unter ernsthaften Mängeln, da sie zur Durchführung von Aufgaben verwendet werden, für die die Natur sie nicht optimiert hat. Tatsächlich sind die meisten Fortschritte peripher gewesen, einschließlich der Verwendung von Polymerasen aus verschiedenen Organismen, verbesserten Puffer- und Additivsystemen, ebenso wie von Enzymgemischen. Die CSR ist ein neues Selektionssystem, das ideal für die Isolierung von „Designer"-Polymerasen für spezifische Anwendungen geeignet ist. Viele Merkmale der Polymerasefunktion stehen einer „Verbesserung" offen (z.B. Prozessivität, Substratauswahl, etc.). Weiterhin ist die CSR ein Werkzeug, um die Polymerasefunktion zu untersuchen, z.B. zur Untersuchung nicht-mutierbarer Regionen, zur Untersuchung von Komponenten des Replisoms, etc. Weiterhin kann die CSR für die „per Schusstechnik" erfolgende funktionelle Klonierung von Polymerasen, direkt ausgehend von diversen, nicht-kultivierten mikrobiellen Populationen, verwendet werden.
Die CSR repräsentiert ein neues Prinzip der Repertoire-Selektion von Polypeptiden. Vorherige Ansätze waren durch verschiedene „Display"-Verfahren gekennzeichnet, bei denen Phänotyp und Genotyp (Polypeptid und codierendes Gen) als Teil eines „genetischen Pakets" verbunden waren, die das codierende Gen enthalten und das Polypeptid auf der „Außenseite" präsentieren. Die Selektion erfolgt hier über einen Schritt der Affinitätsreinigung, nach dem übrig gebliebene Klone für weitere Selektionsrunden in Zellen herangezogen (amplifiziert) werden (mit den resultierenden Voreingenommenheiten im Hinblick auf wachstumsstörende Selektionen). Weitere Störungen resultieren aus Unterschieden der Präsentationseffizienzen zwischen verschiedenen Polypeptiden.
Bei einem anderen Set von Verfahren werden sowohl das Polypeptid als auch das/die codierende(n) Gen(e) in einer Zelle „verpackt". Die Selektion erfolgt in vivo über das Polypeptid, das die Zelle in einer solchen Weise modifiziert, dass sie einen neuen Phänotyp annimmt, z.B. Wachstum in Gegenwart eines Antibiotikums. Da der Selektionsdruck auf ganze Zellen angewendet wird, neigen solche Ansätze dazu, für die Erzeugung falsch positiver Treffer empfindlich zu sein. Weiterhin sind Strategien der in vivo-Komplementation in der Weise begrenzt, als Selektionsbedingungen und somit selektierbare Phänotypen nicht frei ausgewählt werden können und durch Begrenzungen der Lebensfähigkeit des Wirts weiter eingeschränkt werden.
Bei der CSR gibt es keine direkte physikalische Verbindung (kovalent oder nicht-kovalent) zwischen Polypeptid und codierendem Gen. Mehrere Kopien erfolgreicher Gene werden direkt und in vitro als Teil des Selektionsprozesses „gezüchtet".
Die CSR ist auf ein breites Spektrum von DNA- und RNA-Polymerasen anwendbar, tatsächlich sogar auf alle Polypeptide (oder Polynukleotide), die an der Replikation oder Genexpression beteiligt sind. Die CSR kann auch auf DNA- und RNA-Ligasen angewendet werden, die ihre Gene aus Oligonukleotid-Fragmenten zusammenbauen.
Die CSR ist das einzige Selektionssystem, bei dem die Umsatzrate des Enzyms direkt mit der nach der Selektion vorliegenden Kopienzahl des zugehörigen codierenden Gens in Verbindung steht.
Es gibt großes Interesse an Polynukleotidpolymeren mit veränderten Basen, veränderten Zuckern oder sogar veränderten Rückgratchemien. Jedoch kann die Festphasensynthese für gewöhnlich nur relativ kurze Polymere bereitstellen, und natürlich vorkommende Polymerasen bauen – nicht-überraschender Weise – die meisten Analoga nur schwach ein. CSR ist ideal geeignet für die Selektion von Polymerasen, die für nicht-natürliche Substrate toleranter sind, um Polynukleotidpolymere mit neuen Eigenschaften für die Chemie, Biologie und Nanotechnologie (z.B. DNA-Kabel) herzustellen.
Schließlich besitzt die hitzestabile Emulsion, die für die CSR entwickelt wurde, eigene Anwendungen. Mit > 10⁹ Mikrokompartimenten/ml bietet die Emulsions-PCR (ePCR) die Möglichkeit eines parallelen PCR-„Multiplexing" in einem noch nie da gewesenen Größenmaßstab mit potentiellen Anwendungen von der Genverknüpfungsanalyse bis zur Konstruktion genomischer Repertoires direkt aus Einzelzellen. Sie kann auch Anwendungsmöglichkeiten für im großen Maßstab durchgeführte diagnostische PCR-Anwendungen, wie etwa „Digitale PCR" (Vogelstein & Kinzler (1999), PNAS, 96, 9236–9241) besitzen. Die Kompartimentierung individueller Reaktionen kann außerdem die Konkurrenz zwischen verschiedenen Gensegmenten ausschließen, die entweder bei Multiplex-PCR oder Zufallsprimer-PCR amplifiziert werden, und zu einer weniger voreingenommenen Verteilung der Amplifikationsprodukte führen. ePCR kann somit eine Alternative zu gesamtgenomischer DOP-PCR (und verwandten Methodiken) bereitstellen oder tatsächlich verwendet werden, um DOP-PCR (und verwandte Methodiken) effektiver zu machen.
Das Selektionssystem gemäß unserer Erfindung basiert auf der Selbstreplikation in einem kompartimentierten System. Unsere Erfindung stützt sich auf die Tatsache, dass aktive Replikasen befähigt sind, Nukleinsäuren (insbesondere ihre codierenden Sequenzen) zu replizieren, während inaktive Replikasen dies nicht können. Somit können wir bei den Verfahren unserer Erfindung ein kompartimentiertes System bereitstellen, bei dem eine Replikase in einem Kompartiment weitgehend unfähig ist, auf irgendwelche anderen Matrizen einzuwirken als auf die Matrizen innerhalb dieses Kompartiments; insbesondere kann sie nicht so wirken, dass sie eine Matrize in irgendeinem anderen Kompartiment repliziert. Bei hochgradig bevorzugten Ausführungsformen codiert die Matrizennukleinsäure in dem Kompartiment die Replikase. Somit kann die Replikase nichts anderes als ihre codierende Sequenz replizieren; die Replikase ist somit an ihre codierende Sequenz „gebunden". Als Ergebnis, bei hochgradig bevorzugten Ausführungsformen unserer Erfindung, ist die Endkonzentration der codierenden Sequenz (d.h. die Kopienzahl) abhängig von der Aktivität des von ihr codierten Enzyms.
Unser Selektionssystem, wie angewendet auf die Selektion von Replikasen, hat den Vorteil, dass es den katalytischen Umsatz (k_cat/K_m) mit der nach der Selektion vorliegenden Kopienzahl des Gens, das den Katalysator codiert, verbindet. Somit bietet die Kompartimentierung die Möglichkeit zur Verbindung von Genotyp und Phänotyp eines Replikaseenzyms, wie unten in weiterem Detail beschrieben, durch eine gekoppelte enzymatische Reaktion, die die Replikation des Gens oder der Gene des Enzyms bzw. der Enzyme als einen ihrer Schritte beinhaltet.
Die Verfahren unserer Erfindung machen bevorzugt Gebrauch von Nukleinsäurebibliotheken, deren Natur und Konstruktion unten in größerem Detail beschrieben wird. Die Nukleinsäurebibliothek umfasst einen Pool verschiedener Nukleinsäuren, deren Mitglieder Varianten einer bestimmten Einheit (der zu selektierenden Einheit) codieren. Somit, wie z.B. zur Selektion von Replikasen verwendet, benutzen die Verfahren unserer Erfindung eine Nukleinsäurebibliothek oder einen Pool mit Mitgliedern, die die Replikase bzw. die Varianten der Replikase codieren. Jede der von den verschiedenen Bibliotheksmitgliedern codierten Einheiten wird verschiedene Eigenschaften besitzen, z.B. variierende Toleranz gegenüber Hitze oder der Gegenwart kleiner inhibitorischer Moleküle, oder Toleranz gegenüber Basenpaar-Fehlpaarungen (wie unten in größerem Detail beschrieben). Die Population der Nukleinsäurevarianten liefert daher ein Ausgangsmaterial für die Selektion und ist in vielerlei Hinsicht analog zur Variation einer natürlichen Population von Organismen, wie sie durch Mutation hervorgerufen wird.
Gemäß unserer Erfindung werden die verschiedenen Mitglieder der Nukleinsäurebibliothek oder des Nukleinsäurepools in viele Kompartimente oder Mikrokapseln sortiert oder kompartimentiert. Bei bevorzugten Ausführungsformen enthält jedes Kompartiment im wesentlichen ein Nukleinsäuremitglied des Pools (in einer oder mehreren Kopien). Zusätzlich umfasst das Kompartiment auch das Polypeptid oder Polynukleotid (in einer oder bevorzugt mehreren Kopien), das von diesem Nukleinsäuremitglied codiert wird (unabhängig davon, ob es eine Replikase, ein Polypeptid etc. ist, wie unten diskutiert). Die Natur dieser Kompartimente ist so, dass minimaler oder weitgehend kein Austausch von Makromolekülen (wie etwa Nukleinsäuren und Polypeptiden) zwischen verschiedenen Kompartimenten erfolgt. Wie unten in weiterem Detail erklärt, nutzen hochgradig bevorzugte Ausführungsformen unserer Erfindung wässrige Kompartimente in Wasser-in-Öl-Emulsionen. Wie oben erklärt, kann jedwede Replikaseaktivität, die in dem Kompartiment vorhanden ist (egal, ob nun von der Replikase gezeigt, durch ein Polypeptid modifiziert oder gezeigt von einem Polypeptid, das in Verbindung mit einem anderen Polypeptid wirkt) nur auf die Matrize in diesem Kompartiment einwirken.
Die Bedingungen in dem Kompartiment können variiert werden, um auf Polypeptide zu selektieren, die unter diesen Bedingungen aktiv sind. Wenn beispielsweise Replikasen selektiert werden, können die Kompartimente eine erhöhte Temperatur besitzen, um auf Replikasen mit höherer thermischer Stabilität hin zu selektieren. Weiterhin wird die Verwendung der hier beschriebenen Selektionsverfahren für Fusionsproteine, die thermostabile Replikase und ein Protein von Interesse umfassen, die Selektion thermisch stabiler Proteine erlauben.
Ein Verfahren für den Einbau thermischer Stabilität in ansonsten labile Proteine von kommerzieller Wichtigkeit ist im Hinblick auf deren Produktion im Großmaßstab und deren Vertrieb wünschenswert. Es ist ein Reportersystem beschrieben worden, um die Proteinfaltung zu verbessern, indem man Proteine als Fusionen mit grünem Fluoreszenzprotein (GFP) exprimiert (Waldo et al. (1999), Nat. Biotechnol. 17: 691–695). Die Funktion des Letztgenannten steht in Beziehung zu der produktiven Faltung des fusionierten Proteins unter Beeinflussung der Faltung und/oder Funktionalität des GFP, was die gesteuerte Entwicklung von Varianten mit verbesserter Faltung und Expression erlaubt. Gemäß diesem Aspekt unserer Erfindung werden Proteine an eine thermostabile Replikase fusioniert (oder an ein Polypeptid, das Replikaseaktivität unterstützt) und auf aktive Fusionen in Emulsion selektiert, dieses als ein Verfahren zur Entwicklung von Proteinen mit gesteigerter Thermostabilität und/oder Löslichkeit. Von instabilen Varianten des Fusionspartners wird erwartet, dass sie vor oder während der Thermocyclerbehandlung aggregieren und präzipitieren und somit die Replikaseaktivität in den entsprechenden Kompartimenten kompromittieren. Lebensfähige Fusionen werden eine Selbstreplikation in der Emulsion erlauben, wobei die Umsatzrate mit der Stabilität des Fusionspartners verbunden ist.
In einem verwandten Ansatz kann neue oder gesteigerte Chaperoninaktivität durch die Coexpression einer Bibliothek von Chaperonen zusammen mit einem Polymerase-Polypeptid-Fusionsprotein entwickelt werden, wobei sich die Proteingruppierung (unter den Selektionsbedingungen) fehlerhaft faltet. Die Replikation des/der Gen(e), die das Chaperonin codieren, kann nur fortschreiten, nachdem die Chaperonin-Aktivität die Polymeraseaktivität in dem Polymerase-Polypeptid-Fusionsprotein gerettet hat.
Die Thermostabilität eines Enzyms kann durch konventionelle Mittel, wie sie in der Technik bekannt sind, gemessen werden. Beispielsweise kann die katalytische Aktivität des nativen Enzyms bei einer bestimmten Temperatur als Referenzwert gemessen werden. Enzymassays sind in der Technik wohlbekannt, und es sind über die Jahre Standard-Assays etabliert worden. Beispielsweise wird der Einbau von Nukleotiden durch eine Polymerase gemessen, z.B. unter Verwendung radioaktiv markierter dNTPs, wie etwa dATP, und von Filterbindungstests, wie sie in der Technik bekannt sind. Das Enzym, dessen Thermostabilität zu messen ist, wird bei einer erhöhten Temperatur präinkubiert, und es wird dann seine verbleibende Aktivität (z.B. Polymeraseaktivität im Fall von Polymer asen) bei einer niedrigeren, optimalen Temperatur gemessen und mit dem Bezugswert verglichen. Im Fall von Taq-Polymerase beträgt die erhöhte Temperatur 97,5°C, die optimale Temperatur 72°C. Die Thermostabilität kann in Form der Halbwertszeit bei der erhöhten Temperatur ausgedrückt werden (d.h. der Inkubationszeit bei höherer Temperatur, über die die Polymerase 50% ihrer Aktivität verliert). Beispielsweise können die thermostabilen Replikasen, Fusionsproteine oder Polypeptide, die über unsere Erfindung selektiert werden, eine Halbwertszeit besitzen, die 2×, 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10× oder mehr als die des nativen Enzyms beträgt. Am bevorzugtesten besitzen die thermostabilen Replikasen etc. eine Halbwertszeit, die das 11-fache oder mehr beträgt, wenn man auf diese Weise vergleicht. Bevorzugt werden die selektierten Polymerasen bei 95°C oder mehr, 97,5°C oder mehr, 100°C oder mehr, 105°C oder mehr, oder 110°C oder mehr präinkubiert. Somit stellen wir bei einer hochgradig bevorzugten Ausführungsform unserer Erfindung Polymerasen mit erhöhter Thermostabilität bereit, die bei 97,5°C eine Halbwertszeit zeigen, die dem 11-fachen oder mehr derjenigen des entsprechenden wildtypischen (nativen) Enzyms entspricht.
Die Resistenz gegenüber einem Inhibitor, wie etwa Heparin im Fall der Polymerasen, kann ebenfalls wie oben getestet und gemessen werden. Die Resistenz gegenüber Inhibition kann in Begriffen der Konzentration des inhibitorischen Faktors ausgedrückt werden. Beispielsweise können wir bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung Heparin-resistente Polymerasen bereitstellen, die in Heparinkonzentrationen bis zu bzw. zwischen 0,083 Unit/μl und 0,33 Unit/μl aktiv sind. Zum Vergleich zeigen unsere Assays an, dass die Konzentration von Heparin, die die native (wildtypische) Taq-Polymerase inhibiert, im Bereich von zwischen 0,0005 bis zu 0,0026 Unit/μl liegt.
Resistenz wird praktischer Weise in Begriffen derjenigen Inhibitor-Konzentration ausgedrückt, von der herausgefunden wird, dass sie die Aktivität der selektierten Replikase, des selektierten Fusionsproteins oder Polypeptids inhibiert, und zwar im Vergleich zu der Konzentration, für die ermittelt wird, dass sie das native Enzym inhibiert. Somit können die resistenten Replikasen, Fusionsproteine oder Polypeptide, die durch unsere Erfindung selektiert werden, 10×, 20×, 30×, 40×, 50×, 60×, 70×, 80×, 90×, 100×, 110×, 120×, 130×, 140×, 150×, 160×, 170×, 180×, 190×, 200× oder mehr an Resistenz im Vergleich zu dem nativen Enzym besitzen. Am bevorzugtesten besitzen die resistenten Replikasen etc. eine 130× oder mehr gesteigerte Resistenz, wenn man sie auf diese Weise vergleicht. Die selektierten Replikasen etc. besitzen bevorzugt 50% oder mehr, 60% oder mehr, 70% oder mehr, 80% oder mehr, 90% oder mehr oder sogar 100% der Aktivität bei der Konzentration des inhibitorischen Faktors. Weiterhin können die Kompartimente Mengen eines inhibitorischen Mittels, wie etwa Heparin, enthalten, um auf Replikasen zu selektieren, die unter solchen Bedingungen Aktivität besitzen.
Wie unten erklärt, können die Verfahren unserer Erfindung verwendet werden, um ein Paar interagierender Polypeptide zu selektieren, und die Bedingungen in den Kompartimenten können verändert werden, um Polypeptide auszuwählen, die befähigt sind, unter diesen Bedingungen zu wirken (beispielsweise hohe Salzkonzentration oder erhöhte Temperatur, etc.). Die Verfahren unserer Er findung können außerdem verwendet werden, um auf Faltung, Stabilität und/oder Löslichkeit eines fusionierten Polypeptids, das unter solchen Bedingungen (z.B. hohe Salzkonzentration, erhöhte Temperatur oder chaotrope Mittel, etc.) wirksam ist, zu selektieren.
Das Selektionsverfahren unserer vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um auf verschiedene Replikationsaktivitäten hin zu selektieren, z.B. auf Polymeraseaktivität. Hier ist die Replikase eine Polymerase, und die katalytische Reaktion ist die Replikation ihres eigenen Gens durch die Polymerase. Somit sind defekte Polymerasen oder Polymerasen, die inaktiv unter den Bedingungen sind, unter denen die Reaktion durchgeführt wird (die Selektionsbedingungen), unfähig, ihre eigenen Gene zu amplifizieren. Entsprechend werden Polymerasen, die weniger aktiv sind, ihre codierenden Sequenzen in ihren Kompartimenten langsamer replizieren. Dementsprechend werden diese Gene unterrepräsentiert sein oder sogar aus dem Genpool verschwinden.
Aktive Polymerasen sind auf der anderen Seite befähigt, ihre eigenen Gene zu replizieren, und die resultierende Kopienzahl dieser Gene wird gesteigert werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Kopienzahl eines Gens unter den Bedingungen, unter denen die Reaktion durchgeführt wird, in dem Pool eine direkte Beziehung zu der Aktivität des codierten Polypeptids aufweisen. Bei dieser bevorzugten Ausführungsform wird die aktivste Polymerase in dem endgültigen Pool am stärksten repräsentiert sein (d.h. ihre Kopienzahl in dem Pool wird am höchsten sein). Wie erkennbar sein wird, ermöglicht dies eine leichte Klonierung der aktiven Polymerasen gegenüber inaktiven. Das Verfahren unserer Erfindung ist daher in der Lage, eine direkte Verbindung der Umsatzrate des Enzyms mit der resultierenden Kopienzahl des Gens, welches das Enzym codiert, herzustellen.
Beispielsweise kann das Verfahren auf die Isolierung aktiver Polymerasen (DNA-, RNA-Polymerasen und reverse Transkriptasen) aus thermophilen Organismen angewandt werden. Kurz dargestellt, wird eine thermostabile Polymerase intrazellulär in Bakterienzellen exprimiert, und diese werden (z.B. in einer Wasser-Öl-Emulsion) in geeignetem Puffer kompartimentiert, dies zusammen mit geeigneten Mengen der vier dNTPs und Oligonukleotiden, die eine Primerfunktion an beiden Enden des Polymerasegens oder an Plasmidsequenzen, die das Polymerase-Gen flankieren, ausüben. Die Polymerase und ihr Gen werden durch einen Temperaturschritt aus den Zellen entlassen, der die Zellen lysiert und Enzymaktivitäten, die mit den Wirtszellen assoziiert sind, zerstört. Polymerasen aus mesophilen Organismen (oder weniger thermostabile Polymerasen) können in einer analogen Weise exprimiert werden, mit dem Unterschied, dass die Zelllyse entweder bei Umgebungstemperatur ablaufen sollte (z.B. durch die Expression eines lytischen Proteins (z.B. abgeleitet aus lytischen Bakteriophagen), durch Detergens-vermittelte Lyse (z.B. Bugbuster^TM, kommerziell erhältlich), oder die Lyse kann bei erhöhter Temperatur in Gegenwart eines die Polymerase stabilisierenden Mittels stattfinden (z.B. hohe Konzentrationen an Prolin (siehe Beispiel 27) im Falle von Klenow oder Trehalose im Falle von RT). In solchen Fällen kann die Hintergrundpolymeraseaktivität des Wirtsstamms in die Selektionen eingreifen, und es kann bevorzugt sein, Gebrauch von mutanten Stämmen zu machen (z.B. polA^–).
Alternativ können Polymerasegene (entweder als Plasmide oder als lineare Fragmente) wie oben kompartimentiert werden, und die Polymerase kann in situ in den Kompartimenten exprimiert werden, indem man eine in vitro Transkription/Tfranslation (ivt) anwendet, gefolgt von einem Temperaturschritt zur Zerstörung enzymatischer Aktivitäten, die mit dem in vitro-Translationsextrakt assoziiert sind. Polymerasen aus mesophilen Organismen (oder weniger thermostabile Polymerasen) können in situ in einer analogen Weise exprimiert werden, mit dem Unterschied, dass es zur Vermeidung der mit dem in vitro-Translationsextrakt assoziierten enzymatischen Aktivitäten bevorzugt sein kann, einen Translationsextrakt zu verwenden, der aus definierten, gereinigten Komponenten zusammengesetzt ist, wie etwa das PURE-System (Shimazu et al. (2001) Nat. Biotech., 19: 751).
PCR-Thermocycling führt dann zur Amplifikation der Polymerasegene durch die von ihnen codierten Polypeptide, d.h. es werden nur diejenigen Gene amplifiziert werden, die aktive Polymerasen codieren, bzw. Polymerasen, die unter den gewählten Bedingungen aktiv sind. Weiterhin wird die Kopienzahl eines Polymerasegens X nach der Selbstamplifikation direkt proportional zu der katalytischen Aktivität der von ihm codierten Polymerase X sein (siehe 1A und 1B).
Durch Variieren der Selektionsbedingungen in dem Kompartiment können Polymerasen oder andere Replikasen mit gewünschten Eigenschaften unter Verwendung der Verfahren unserer Erfindung selektiert werden. Somit, indem man Repertoires von Polymerasegenen (diversifiziert durch gezielte oder zufällige Mutation) der Selbstamplifikation aussetzt, sowie durch Veränderung der Bedingungen, unter denen Selbstamplifikation stattfinden kann, kann das System für die Isolierung und Herstellung von Polymerasen mit veränderten, verstärkten oder neuen Eigenschaften verwendet werden. Solche verstärkten Eigenschaften können eine erhöhte Thermostabilität, erhöhte Prozessivität, erhöhte Genauigkeit (besseres Korrekturlesen), einen verstärkten Einbau nicht bevorzugt angenommener Substrate (z.B. von Ribonukleotiden, Farbstoff-modifizierten Nukleotiden, von allgemeinen Basen, wie etwa 5-Nitroindol, oder von anderen ungewöhnlichen Substraten, wie etwa Pyren-Nukleotiden (Matray & Kool (1999), Nature 399, 704–708) (3) oder Resistenz gegenüber Inhibitoren (z.B. Heparin in klinischen Proben) beinhalten. Neue Eigenschaften können bestehen im Einbau nicht-natürlicher Substrate (z.B. von Ribonukleotiden), der Umgehung des Ablesens bzw. Korrekturlesens geschädigter Stellen (z.B. von nicht-basischen Stellen (Paz-Elizur T. et al. (1997) Biochemistry 36, 1766), Thymidin-Dimeren (Wood R. D. (1999) Nature 399,639), Hydantoin-Basen (Duarte V et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27,496)) und möglicherweise sogar in neuen Chemien (z.B. neue Rückgrate, wie etwa PNA (Nielsen PE. Curr. Opin Biotechnol. 1999; 10 (1): 71–5) oder Sulfon (Benner SA et al. Pure Appl. Chem. 1998 Feb; 70 (2): 263–6) oder in veränderten Zuckerchemien (A. Eschenmoser, Science 284, 2118–24 (1999)). Die Technik kann auch verwendet werden, um Faktoren zu isolieren oder zu entwickeln, die die Polymerasefunktion verstärken oder modi fizieren, wie etwa Prozessivitätsfaktoren (wie Thioredoxin im Fall von T7-DNA-Polymerase (Doublie S. et al (1998) Nature 391, 251)).
Jedoch können andere Enzyme neben Replikasen, wie etwa Telomerasen, Helikasen etc. ebenfalls gemäß unserer Erfindung selektiert werden. Somit wird Telomerase in situ exprimiert (in Kompartimenten), z.B. durch in vitro-Translation zusammen mit Telomerase-RNA (entweder hinzugegeben oder auch in situ transkribiert; z.B. Bachand et al., (2000) RNA 6: 778–784).
Die Kompartimente enthalten außerdem Taq Pol und dNTPs, sowie Telomer-spezifische Primer. Bei niedriger Temperatur ist Taq inaktiv, jedoch wird eine aktive Telomerase Telomere an ihr eigenes, sie codierendes Gen (ein lineares DNA-Fragment mit passenden Enden) anhängen. Nach der Telomerase-Reaktion amplifiziert das Thermocycling nur für aktive Telomerase codierende Gene. Es kann Diversität in das Telomerasegen oder die RNA (oder beide) eingeführt werden, und zwar gezielt oder zufällig. Wie auf die Selektion von Helikasen angewendet, ist das Selektionsverfahren im wesentlichen das gleiche, wie es für Telomerasen beschrieben wurde, jedoch wird die Helikase eher dafür verwendet, um Stränge auf zu winden als für die Hitzedenaturierung.
Die Verfahren unserer Erfindung können außerdem verwendet werden, um auf DNA-Reparaturenzyme oder Transläsions-Polymerasen, wie etwa E. coli Pol IV und Pol V, hin zu selektieren. Hier wird ein Schaden in die Primer eingeführt (gezielte Chemie) oder eine zufällig wirkende Mutagenbehandlung durchgeführt (z.B. UV, mutagene Chemikalien, etc.). Dies erlaubt die Selektion von Enzymen, die befähigt sind, Primer zu reparieren, die für die Replikation oder die eigene Gensequenz erforderlich sind (Informationswiederherstellung) oder den Weg zu verbesserten „Reparasen" für die Gentherapie, etc.
Die Verfahren unserer Erfindung können außerdem in ihren verschiedenen Ausführungsformen verwendet werden, um auf Polypeptide zu selektieren, die befähigt sind, die Replikase-Aktivität direkt oder indirekt zu modulieren. Zusätzlich kann die Erfindung dafür verwendet werden, um ein Paar von Polypeptiden zu selektieren, das befähigt ist, zu interagieren, oder für die Selektion katalytischer Nukleinsäuren, wie etwa katalytischer RNA (Ribozyme). Diese und andere Ausführungsformen werden unten in weiterem Detail beschrieben.
Nukleinsäure prozessierende Enzyme
Wie hier verwendet, ist ein Nukleinsäure prozessierendes Enzym ein beliebiges Enzym, das ein Proteinenzym oder ein Nukleinsäureenzym sein kann, das befähigt ist, zum Modifizieren, Verlängern (wie etwa um wenigstens ein Nukleotid), zum Amplifizieren oder anderweitigen Beeinflussen von Nukleinsäuren, wie etwa, um die Nukleinsäure durch Amplifikation in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung selektierbar zu machen. Solche Enzyme besitzen daher eine Aktivität, die z.B. in der Amplifikation, Stabilisierung, Destabilisierung, Hybridisierung oder Denaturierung, der Replikation, dem Schutz oder der Entschützung von Nukleinsäuren resultiert, oder irgendeine andere Aktivität, auf deren Basis eine Nukleinsäure durch Amplifikation selektiert werden kann. Beispiele beinhalten Helikasen, Telomerasen, Ligasen, Rekombinasen, Integrasen und Replikasen. Replikasen sind bevorzugt.
Replikase/Replikation
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Replikation" auf das Matrizen-abhängige Kopieren einer Nukleinsäuresequenz. Nukleinsäuren werden unten diskutiert und beispielhaft dargestellt. Allgemein ist das Produkt der Replikation eine andere Nukleinsäure, ob nun von derselben Art oder von einer anderen Art. Einbezogen sind somit die Replikation von DNA zur Herstellung von DNA, die Replikation von DNA zur Herstellung von RNA, die Replikation von RNA zur Herstellung von DNA und die Replikation von RNA zur Herstellung von RNA. „Replikation" soll daher Prozesse umfassen, wie etwa die DNA-Replikation, Polymerisation, Ligation von Oligonukleotiden oder Polynukleotiden (z.B. Trinukleotid (Triplett) 5'-Triphosphaten) zur Ausbildung längerer Sequenzen, Transkription, reverse Transkription, etc.
Der Begriff „Replikase" soll ein Enzym mit katalytischer Aktivität bezeichnen, das befähigt ist, Nukleotide und Aufbaublöcke zu verbinden, um Nukleinsäuresequenzen auszubilden. Solche Nukleotidbildungsblöcke beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Nukleoside, Nukleosidtriphosphate, Desoxynukleoside, Desoxynukleosidtriphosphate, Nukleotide (umfassend eine Stickstoffenthaltende Base, wie etwa ein Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin, etc., einen 5-Kohlenstoffzucker und eine oder mehrere Phosphatgruppen), Nukleotidtriphosphate, Desoxynukleotide, wie etwa Desoxyadenosin, Desoxythymidin, Desoxycytidin, Desoxyuridin, Desoxyguanidin, Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) und synthetische oder künstliche Analoga von diesen. Aufbaublöcke beinhalten außerdem Oligomere oder Polymere von beliebigen von diesen, z.B. Trinukleotide (Tripletts), Oligonukleotide und Polynukleotide.
Somit kann eine Replikase eine zuvor bestehende Nukleinsäuresequenz (Primer) verlängern, indem sie Nukleotide oder Desoxynukleotide einbaut. Eine solche Aktivität ist in der Technik als „Polymerisation" bekannt, und die Enzyme, die diese ausführen, sind als „Polymerasen" bekannt. Ein Beispiel für eine solche Polymerase-Replikase ist DNA-Polymerase, die befähigt ist, DNA zu replizieren. Die Primer können gegenüber der verlängerten Sequenz chemisch von der gleichen oder von unterschiedlicher Form sein (z.B. ist Säuger-DNA-Polymerase dafür bekannt, dass sie eine DNA-Sequenz ausgehend von einem RNA-Primer verlängert). Der Begriff Replikase beinhaltet auch solche Enzyme, die Nukleinsäuresequenzen zusammenfügen, egal, ob nun Polymere oder Oligomere, um längere Nukleinsäuresequenzen auszubilden. Eine solche Aktivität wird von den Ligasen gezeigt, die Stücke von DNA oder RNA ligieren.
Die Replikase kann vollständig aus Replikasesequenz bestehen, oder sie kann eine Replikasesequenz umfassen, die mit einem heterologen Polypeptid oder einem anderen Molekül, wie etwa einem Polypeptid, durch chemische Mittel verbunden ist, oder in Form eines Fusionsproteins vorliegen oder aus zwei oder mehr aufbauenden Teilen zusammengesetzt sein.
Bevorzugt ist die Replikase gemäß der Erfindung eine DNA-Polymerase, RNA-Polymerase, reverse Transkriptase, DNA-Ligase oder RNA-Ligase.
Bevorzugt ist die Replikase eine thermostabile Replikase. Eine „thermostabile" Replikase, wie sie hier verwendet wird, ist eine Replikase, die signifikante Resistenz gegenüber thermischer Denaturierung bei erhöhten Temperaturen zeigt, typischer Weise oberhalb der Körpertemperatur (37°C). Bevorzugt liegt eine solche Temperatur im Bereich von 42°C bis 160°C, bevorzugter zwischen 60 bis 100°C, am bevorzugtesten über 90°C. Im Vergleich zu einer nicht-thermostabilen Replikase zeigt die thermostabile Replikase eine signifikant gesteigerte Halbwertszeit (Inkubationszeit bei erhöhter Temperatur, die in 50% Aktivitätsverlust resultiert). Bevorzugt behält die thermostabile Replikase 30% oder mehr ihrer Aktivität nach der Inkubation bei erhöhter Temperatur, bevorzugter 40%, 50%, 60%, 70% oder 80% oder mehr ihrer Aktivität. Noch bevorzugter behält die Replikase 80% an Aktivität. Am bevorzugtesten beträgt die beibehaltene Aktivität 90%, 95% oder mehr, sogar 100%. Nicht-thermostabile Replikasen würden wenig oder keinen Erhalt an Aktivität nach ähnlichen Inkubationen bei der erhöhten Temperatur zeigen.
Polymerase
Ein Beispiel für eine Replikase ist DNA-Polymerase. DNA-Polymerase-Enzyme sind natürlich vorkommende intrazelluläre Enzyme und werden von einer Zelle verwendet, um einen Nukleinsäurestrang unter Verwendung eines Matrizenmoleküls zu replizieren, um einen komplementären Nukleinsäurestrang herzustellen. Enzyme mit DNA-Polymerase-Aktivität katalysieren die Ausbildung einer Bindung zwischen der 3'-Hydroxylgruppe an dem wachsenden Ende eines Nukleinsäure-Primers und der 5'-Phosphatgruppe eines Nukleotidtriphosphats. Diese Nukleotidtriphosphate werden für gewöhnlich aus Desoxyadenosin-Triphosphat (A), Desoxythymidin-Triphosphat (T), Desoxycytidin-Triphosphat (C) und Desoxyguanosin-Triphosphat (G) ausgewählt. Jedoch können DNA-Polymerasen modifizierte oder veränderte Versionen dieser Nukleotide einbauen. Die Reihenfolge, in der die Nukleotide angefügt werden, wird durch die Basenpaarung an einen DNA-Matrizenstrang diktiert; eine solche Basenpaarung erfolgt durch „kanonische" Wasserstoffbindung (Wasserstoffbindung zwischen A- und T-Nukleotiden und G und C-Nukleotiden gegenüberliegender DNA-Stränge), obwohl eine nicht-kanonische Basenpaarung, wie etwa eine G:U-Basenpaarung, in der Technik bekannt ist. Siehe z.B. Adams et al., The Biochemistry of the Nucleic Acids 14–32 (11. Auflage 1992). Die in vitro-Verwendung von Enzymen mit DNA-Polymeraseaktivität ist in den letzten Jahren bei einer Vielzahl biochemischer Anwendungen gebräuchlicher geworden, einschließlich cDNA-Synthese und DNA-Sequenzierungsreaktionen (siehe Sambrook et al., (2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)) und der Amplifikation von Nukleinsäuren durch Verfahren, wie etwa der Polymerasekettenreaktion (PCR) (Mullis et al., US-Patente Nr. 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159) und bei Verfahren der durch RNA-Transkription vermittelten Amplifikation (z.B. Kacian et al., PCT Veröffentlichung Nr. WO 91/01384).
Verfahren, wie etwa PCR, machen Gebrauch von Zyklen der Primer-Verlängerung durch die Verwendung einer DNA-Polymerase-Aktivität, gefolgt von thermischer Denaturierung der resultierenden doppelsträngigen Nukleinsäure, um eine neue Matrize für eine weitere Runde der Primer-Anhybridisierung und -Verlängerung bereitzustellen. Da die hohen Temperaturen, die für die Strang-Denaturierung notwendig sind, in einer irreversiblen Inaktivierung vieler DNA-Polymerasen resultieren, liefert die Entdeckung und Verwendung von DNA-Polymerasen, die befähigt sind, bei Temperaturen oberhalb von etwa 37°C bis 42°C aktiv zu bleiben (thermostabile DNA-Polymeraseenzme) einen Vorteil an Kosten- und Arbeitseffizienz. Thermostabile DNA-Polymerasen sind in einer Anzahl thermophiler Organismen entdeckt worden, einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus und Spezies der Gattungen Bacillus, Thermococcus, Sulfolobus und Pyrococcus. DNA-Polymerasen können direkt aus diesen thermophilen Organismen gereinigt werden. Jedoch können wesentliche Steigerungen der Ausbeute von DNA-Polymerase erhalten werden, indem man zunächst das Gen, das für das Enzym codiert, durch Verfahren der rekombinanten DNA-Technik in einem Multikopien-Expressionsvektor kloniert, den Vektor in einen Wirtszellstamm inseriert, der befähigt ist, das Enzym zu exprimieren, die Vektor-enthaltenden Wirtszellen kultiviert und die DNA-Polymerase dann aus einem Wirtszellstamm, der das Enzym exprimiert hat, extrahiert.
Die bislang charakterisierten bakteriellen DNA-Polymerasen besitzen bestimmte Muster von Ähnlichkeiten und Unterschieden, was einige dazu veranlasst hat, diese Enzyme in zwei Gruppen aufzuteilen: diejenigen, deren Gene Introns/Inteine enthalten (Klasse B DNA-Polymerasen) und diejenigen, deren DNA-Polymerasegene im Wesentlichen ähnlich zu dem von E. coli DNA-Polymerase I sind und die keine Introns enthalten (Klasse A DNA-Polymerasen).
Es sind mehrere thermostabile DNA-Polymerasen der Klassen A und B, die aus thermophilen Organismen stammen, kloniert und exprimiert worden. Unter den Klasse A-Enzymen: Lawyer et al. J. Biol. Chem. 264: 6427–6437 (1989) und Gelfund et al., US-Patent Nr. 5,079,352 beschreiben die Klonierung und Expression einer thermostabilen DNA-Polymerase voller Länge aus Thermus aquaticus (Taq). Lawyer et al., in PCR Methods and Applications, 2: 275–287 (1993) und Barnes, PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/06188 (1992) offenbaren die Klonierung und Expression trunkierter Versionen der gleichen DNA-Polymerase, während Sullivan, EPO-Veröffentlichung Nr. 0482714A1 (1992), die Klonierung einer mutierten Version der Taq-DNA-Polymerase beschreibt. Asakura et al., J. Ferment. Bioeng. (Japan), 74: 265–269 (1993) haben, wie bereichtet, eine DNA-Polymerase aus Thermus thermophilus kloniert und exprimiert. Gelfund et al., PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/06202 (1992) haben eine gereinigte thermostabile DNA-Polymerase aus Thermosipho africanus offenbart. Eine thermostabile DNA-Polymerase aus Thermus flavus wird von Akhmetzjanov und Vakhitov, Nucleic Acids Res., 20: 5839 (1992), beschrieben. Uemori et al., J. Biochem. 113: 401–410 (1993) und EPO-Veröffentlichung Nr. 0517418A2 (1992) haben die Klonierung und Expression einer DNA-Polymerase aus dem thermophilen Bakterium Bacillus caldotenax beschrieben. Ishino et al., japanische Patentanmeldung Nr. HEI 4[1992]-131400 (Veröffentlichungsdatum Nov. 19, 1993) beschreiben die Klonierung einer DNA-Polymerase aus Bacillus stearothermophilus. Unter den Klasse B-Enzymen: Eine rekombinante thermostabile DNA-Polymerase aus Thermococcus litoralis ist beschrieben worden von Comb et al., EPO-Veröffentlichung Nr. 0 455 430 A3 (1991), Comb et al., EPO-Veröffentlichung Nr. 0547920A2 (1993) und Perler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 89: 5577–5581 (1992). Eine klonierte thermostabile DNA-Polymerase aus Sulfolobus solofatarius wird in Pisani et al., Nucleic Acids Res. 20: 2711–2716 (1992) und in der PCT-Veröffentlichung WO 93/25691 (1993) offenbart. Das thermostabile Enzym aus Pyrococcus furiosus wird offenbart in Uemori et al., Nucleic Acids Res., 21: 259–265 (1993), während eine rekombinante DNA-Polymerase aus Pyrococcus sp. gewonnen wird, wie dies in Comb et al., EPO-Veröffentlichung Nr. 0547359A1 (1993), offenbart ist.
Viele thermostabile DNA-Polymerasen besitzen zusätzlich zu einer DNA-Polymeraseaktivität weitere Aktivitäten; diese können eine 5'-3'-Exonukleaseaktivität und/oder eine 3'-5'-Exonukleaseaktivität beinhalten. Die Aktivitäten von 5'-3'- und 3'-5'-Exonukleasen sind Durchschnittsfachleuten wohlbekannt. Die 3'-5'-Exonuklease-Aktivität verbessert die Genauigkeit des neu synthetisierten Strangs durch Entfernen unkorrekter Basen, die eingebaut worden sein können; DNA-Polymerasen, bei denen eine solche Aktivität niedrig ist oder fehlt, wie beschrieben unter Einbeziehung von Taq-DNA-Polymerase (siehe Lawyer et al., J. Biol. Chem. 264: 6427–6437), besitzen erhöhte Fehlerraten beim Einbau von Nukleotidresten in den Primer-Verlängerungsstrang. Bei Anwendungen, wie etwa Nukleinsäureamplifikationsprozeduren, bei denen die Replikation von DNA oft geometrisch im Bezug auf die Anzahl der Primer-Verlängerungszyklen ist, können solche Fehler zu ernsthaften, Artefakt-bildenden Problemen, wie etwa einer Sequenzheterogenität des Nukleinsäure-Amplifikationsprodukts (Amplikon), führen. Somit ist eine 3'-5'-Exonukleaseaktivität ein erwünschtes Merkmal einer thermostabilen DNA-Polymerase, die für solche Zwecke verwendet wird.
Im Gegensatz dazu ist die oft bei DNA-Polymeraseenzymen vorhandene 5'-3'-Exonukleaseaktivität häufig bei speziellen Anwendungen unerwünscht, da diese Nukleinsäuren verdauen kann, einschließlich Primern, die ein ungeschütztes 5'-Ende besitzen. Somit ist eine thermostabile DNA-Polymerase mit einer abgeschwächten oder fehlenden 5'-3'-Exonukleaseaktivität ebenso ein erwünschtes Merkmal eines Enzyms für biochemische Anwendungen. Es sind verschiedene DNA-Polymeraseenzyme beschrieben worden, bei denen eine Modifikation in eine DNA-Polymerase eingeführt wurde, die diese Aufgabe erfüllt. Beispielsweise kann das Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase I als ein proteolytisches Fragment des Holoenzyms erzeugt werden, bei dem die Domäne des Proteins, die die 5'-3'-Exonukleaseaktivität kontrolliert, entfernt wurde. Das Klenow-Fragment behält dabei die Polymeraseaktivität und die 3'-5'-Exonukleaseaktivität nach wie vor bei. Barnes, supra, und Gelfund et al., US-Patent Nr. 5,079,352, haben 5'-3'-Exonuklease-defiziente rekombinante Taq-DNA-Polymerasen hergestellt. Ishino et al., EPO-Veröffentlichung Nr. 0517418A2, haben eine 5'-3'-Exonuklease-defiziente DNA-Polymerase hergestellt, die aus Bacillus caldotenax abgeleitet wurde. Auf der anderen Seite besitzen Polymerasen, denen die 5'-3'-Exonuklease-Domäne fehlt, oft eine reduzierte Prozessivität.
Ligase
DNA-Strangbrüche und -Lücken werden vorübergehend während der Replikation, der Reparatur und Rekombination erzeugt. Bei Säugerzellkernen hängt die erneute Verbindung solcher Strangbrüche von verschiedenen, unterschiedlichen DNA-Polymerasen und DNA-Ligaseenzymen ab. Der Mechanismus zur Verbindung von DNA-Strangunterbrechungen durch DNA-Ligaseenzyme ist in breitem Umfang beschrieben worden. Die Reaktion wird initiiert durch die Ausbildung eines kovalenten Enzym-Adenylat-Komplexes. DNA-Ligaseenzyme von Säugern und Viren verwenden ATP als Cofaktor, während bakterielle DNA-Ligaseenzyme NAD verwenden, um die Adenylylgruppe zu erzeugen. Im Fall der ATP-verwendenden Ligasen wird das ATP in AMP und Pyrophosphat gespalten, wobei der Adenylylrest über eine Phosphoramidatbindung an die ε-Aminogruppe eines spezifischen Lysinrestes an der aktiven Stelle des Proteins gebunden wird (Gumport, R. I. et al., PNAS, 68: 2559–63 (1971)). Der reaktivierte AMP-Rest des DNA-Ligase-Adenylat-Intermediats wird auf den 5'-Phosphatterminus eines Einzelstrangbruchs in doppelsträngiger DNA übertragen, um einen kovalenten DNA-AMP-Komplex mit einer 5'-5'-Phosphoanhydrid-Bindung zu erzeugen. Dieses Reaktionszwischenprodukt ist auch für mikrobielle und aus Säugern stammende DNA-Ligaseenzyme isoliert worden, ist jedoch von kürzerer Lebensdauer als das mit Adenylyl versehene Enzym. Beim letzten Schritt der DNA-Ligation katalysieren von Adenylyl freie DNA-Ligaseenzyme, die für die Erzeugung einer Phosphodiester-Bindung benötigt werden, die Verdrängung des AMP-Restes durch den Angriff der angrenzenden 3'-Hydroxylgruppe an der mit Adenylyl versehenen Stelle.
Das Vorkommen von drei verschiedenen DNA-Ligaseenzymen, DNA-Ligase I, II und III, ist zuvor durch eine biochemische und immunologische Charakterisierung gereinigter Enzyme etabliert worden (Tomkinson, A. E. et al., J. Biol. Chem., 266: 21728–21735 (1991) und Roberts, E. et al., J. Biol. Chem., 269: 3789–3792 (1994)).
Amplifikation
Die Verfahren unserer Erfindung beinhalten die Matrizen-basierte Amplifikation gewünschter Nukleinsäuren. „Amplifikation" bezieht sich auf die Steigerung der Kopienzahl eines bestimmten Nukleinsäurefragments (oder eines Teils von diesem), entweder resultierend aus einer enzymatischen Kettenreaktion (wie etwa einer Polymerasekettenreaktion, einer Ligase-Kettenreaktion oder einer selbsttragenden Sequenzreplikation) oder aus der Replikation des gesamten oder eines Teils des Vektors, in das dieses kloniert wurde. Vorzugsweise ist die Amplifikation gemäß unserer Erfindung eine exponentielle Amplifikation, wie sie z.B. von einer Polymerasekettenreaktion gezeigt wird.
Es sind viele Verfahren der Ziel- und Signal-Amplifikation in der Literatur beschrieben worden, z.B. siehe allgemeine Übersichtsartikel über diese Verfahren in Landegren, U. et al., Science 242: 229–237 (1988) und Lewis, R., Genetic Engineering News 10: 1, 54–55 (1990). Diese Amplifikationsverfahren können bei den Verfahren unserer Erfindung benutzt werden und beinhalten Polymerasekettenreaktion (PCR), PCR in situ, Ligase-Amplifikationsreaktion (LAR), Ligase-Hybridisierung, Qβ-Bakteriophagen-Replikase, Transkriptions-basiertes Amplifikationssystem (TAS), genomische Amplifikation mit Transkript-Sequenzierung (GAWTS), Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NAS-BA) und in situ-Hybridisierung.
Polymerasekettenreaktion (PCR)
PCR ist ein Verfahren der Nukleinsäure-Amplifikation, das unter anderem in den US-Patenten Nr. 4,683,195 und 4,683,202 beschrieben ist. PCR besteht aus wiederholten Zyklen von mittels DNA-Polymerase erzeugten Primer-Verlängerungsreaktionen. Die Ziel-DNA wird hitzedenaturiert, und zwei Oligonukleotide, die die Zielsequenz an gegenüberliegenden Strängen der zu amplifizierenden DNA „umklammern", werden anhybridisiert. Diese Oligonukleotide werden Primer zur Verwendung mit DNA-Polymerase. Die DNA wird durch Primer-Verlängerung kopiert, um eine zweite Kopie beider Stränge herzustellen. Durch Wiederholen des Zyklus der Hitzedenaturierung, Primer-Hybridisierung und -Verlängerung, kann die Ziel-DNA in etwa zwei bis vier Stunden eine Million Mal oder mehr amplifiziert werden. Die PCR ist ein Werkzeug der Molekularbiologie, das in Verbindung mit einer Detektionstechnik verwendet werden muss, um die Ergebnisse der Amplifikation zu bestimmen. Ein Vorteil der PCR besteht darin, dass sie die Empfindlichkeit durch Amplifizieren der Menge an Ziel-DNA in etwa 4 Stunden um das 1 Million- bis 1 Milliarden-fache erhöht.
Die Polymerasekettenreaktion kann wie folgt bei den Selektionsverfahren unserer Erfindung verwendet werden. Beispielsweise kann die PCR verwendet werden, um auf Varianten von Taq-Polymerase mit Polymeraseaktivität hin zu selektieren. Wie oben in weiterem Detail beschrieben, wird eine Bibliothek von Nukleinsäuren, die jeweils eine Replikase oder eine Variante der Replikase, z.B. Taq-Polymerase, codieren, erzeugt und in Kompartimente aufgeteilt. Jedes Kompartiment umfasst im Wesentlichen ein Mitglied der Bibliothek zusammen mit der Replikase oder der Variante, die von diesem Mitglied codiert wird.
Die Polymerase oder Variante kann in vivo in einem transformierten Bakterium oder einem anderen geeigneten Expressionswirt, z.B. Hefe oder Insekten- oder Säugerzellen, exprimiert werden und der Expressionswirt in einem Kompartiment eingekapselt werden. Hitze oder andere geeignete Mittel werden appliziert, um den Wirt aufzubrechen und die Polymerasevariante und ihre codierende Nukleinsäure in dem Kompartiment freizusetzen. Im Falle eines bakteriellen Wirts kann eine zeitlich kontrollierte Expression eines lytischen Proteins, z.B. von Protein E aus ΦX174 oder der Einsatz eines induzierbaren λ-Lysogens, verwendet werden, um das Bakterium aufzubrechen.
Es wird klar sein, dass die Polymerase oder ein anderes Enzym kein heterologes Protein sein muss, das in dem Wirt exprimiert wird (z.B. als ein Plasmid), sondern von einem Gen exprimiert werden kann, das einen Teil des Wirtsgenoms ausmacht. Somit kann die Polymerase z.B. eine endogene oder native bakterielle Polymerase sein. Wir haben gezeigt, dass im Fall von Nukleotiddiphosphatkinase (ndk), eine endogene (nicht induzierte) Expression von ndk hinreichend ist, um dNTPs für die eigene Replikation zu erzeugen. Somit können die Selektionsverfahren gemäß unserer Erfindung für die direkte funktionelle Klonierung von Polymerasen und anderen Enzymen aus diversen (und nicht kultivierten) mikrobiellen Populationen verwendet werden.
Alternativ kann die Nukleinsäurebibliothek zusammen mit Komponenten eines in vitro-Transkriptions/Translationssystems (wie in diesem Dokument in weiterem Detail beschrieben) kompartimentiert werden und die Polymerasevariante in vitro in dem Kompartiment exprimiert werden.
Jedes Kompartiment umfasst außerdem Komponenten für eine PCR-Reaktion, z.B. Nukleotidtriphosphate (dNTPs), Puffer, Magnesium und Oligonukleotid-Primer. Die Oligonukleotid-Primer können Sequenzen haben, die Sequenzen entsprechen, die das Polymerasegen flankieren (d.h. in der genomischen oder Vektor-DNA) oder die Sequenzen in dem Polymerasegen entsprechen. Das PCR-Thermocycling wird dann gestartet, um es jeder Polymerasevariante mit Polymeraseaktivität zu erlauben, die Nukleinsäuresequenz zu amplifizieren.
Aktive Polymerasen werden ihre zugehörigen Nukleinsäuresequenzen amplifizieren, während Nukleinsäuresequenzen, die schwach aktive oder inaktive Polymerasen codieren, schwach oder gar nicht repliziert werden. Im allgemeinen wird erwartet werden, dass die endgültige Kopienzahl jedes Mitglieds der Nukleinsäurebibliothek proportional zum Ausmaß der Aktivität der von diesem codierten Polymerasevariante ist. Nukleinsäuren, die aktive Polymerasen codieren, werden überrepräsentiert sein, und Nukleinsäuren, die inaktive oder schwach aktive Polymerasen codieren, werden unterrepräsentiert sein. Die resultierenden amplifizierten Sequenzen können dann kloniert und sequenziert werden etc., und die Replikationsfähigkeit jedes Mitglieds kann eingeschätzt werden.
Wie an anderer Stelle in größerem Detail beschrieben, können die Bedingungen in jedem Kompartiment verändert werden, um auf Polymerasen zu selektieren, die unter diesen Bedingungen aktiv sind. Beispielsweise kann Heparin zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben werden, um Polymerasen auszuwählen, die resistent gegenüber Heparin sind. Die Temperatur, bei der die PCR stattfindet, kann erhöht werden, um auf hitzeresistente Varianten der Polymerase hin zu selektieren. Weiterhin können Polymerasen selektiert werden, die befähigt sind, DNA-Sequenzen, wie etwa Primer mit veränderten 3'-Enden oder veränderten Teilen der Primer-Sequenz, zu verlängern. Die veränderten 3'-Enden oder andere Veränderungen können nicht-natürliche Basen (veränderte Zucker- oder Basengruppierungen), modifizierte Basen (z.B. blockierte 3'-Enden) und sogar Primer mit veränderten Rückgratchemien (z.B. PNA-Primer) beinhalten.
Reverse Transkriptase-PCR
RT-PCR wird verwendet, um RNA-Ziele zu amplifizieren. Bei diesem Prozess wird das reverse Transkriptase-Enzym verwendet, um RNA in komplementäre DNA (cDNA) zu überführen, die dann unter Verwendung von PCR amplifiziert werden kann. Dieses Verfahren hat sich als nützlich für die Detektion von RNA-Viren erwiesen.
Die Verfahren unserer Erfindung können RT-PCR verwenden. Somit kann der Pool an Nukleinsäuren, der die Replikase oder deren Varianten codiert, in Form einer RNA-Bibliothek bereitgestellt werden. Diese Bibliothek kann in vivo in Bakterien, Säugerzellen, Hefe, etc. erzeugt werden, die kompartimentiert werden, oder durch in vitro-Transkription kompartimentierter DNA. Die RNA kann eine co-kompartimentierte Replikase (z.B. reverse Transkriptase oder Polymerase) codieren, die in vivo exprimiert wurde (und durch unten offenbarte Mittel zusammen mit der RNA in die Emulsion freigesetzt wurde) oder die in vitro exprimiert wurde. Andere Komponenten, die für die Amplifikation notwendig sind (Polymerase und/oder reverse Transkriptase, dNTPs, Primer) werden ebenfalls kompartimentiert. Unter dem/den gegebenen Selektionsdruck/Selektionsdrücken dient das cDNA-Produkt der reversen Transkriptionsreaktion als Matrize für die PCR-Amplifikation. Ebenso wie bei anderen Replikationsreaktionen (insbesondere ndk in den Beispielen) kann die RNA eine Reihe von Enzymen codieren, die die Reaktion füttern.
Selbsttragende Sequenzreplikation (3SR)
Die selbsttragende Sequenzreplikation (3SR) ist eine Variation der TAS, die die isotherme Amplifikation einer Nukleinsäurematrize über sequenzielle Runden von reverser Transkriptase (RT), Polymerase und von Nukleaseaktivitäten, die über einen Enzym-Cocktail vermittelt werden, sowie geeignete Oligonukleotid-Primer beinhaltet (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874). Der enzymatische Abbau der RNA der RNA/DNA-Heteroduplex wird anstelle einer Hitzedenaturierung verwendet. RNase H und alle anderen Enzyme werden zu der Reaktion hinzugegeben, und alle Schritte erfolgen bei der gleichen Temperatur und ohne weitere Zugaben von Reagenzien. Nach diesem Prozess sind in einer Stunde bei 42°C Amplifikationen von 10⁶ bis 10⁹ erreicht worden.
Die Verfahren unserer Erfindung können daher ausgeweitet werden, um Polymerasen oder Replikasen aus mesophilen Organismen unter Verwendung von isothermer 3SR-Amplifikation anstelle von PCR-Thermocycling zu selektieren (Guatelli et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7797; Compton (1991) Nature 7; 350: 91–92). Wie oben beschrieben, beinhaltet 3SR die konzertierte Aktion von zwei Enzymen: einer RNA-Polymerase sowie einer reversen Transkriptase, die bei einer gekoppelten Reaktion der Transkription und reversen Transkription kooperieren, was zu einer simultanen Amplifikation sowohl von RNA als auch von DNA führt. Klarer Weise kann dieses System der Selbst-Amplifikation auf jedes einzelne der beiden beteiligten Enzyme oder auf beide gleichzeitig angewendet werden. Es kann außerdem die Entwicklung der RNAse H-Aktivität entweder als Teil des reversen Transkriptaseenzyms (z.B. von HIV-1-RT) oder für sich selbst beinhalten.
Die verschiedenen enzymatischen Aktivitäten, die 3SR und verwandte Verfahren definieren, sind alle Ziele für die Selektion unter Verwendung der Verfahren unserer Erfindung. Varianten entweder von T7-RNA-Polymerase, reverser Transkriptase (RT) oder RNase H können in den wässrigen Kompartimenten der Emulsionen bereitgestellt werden und auf Bedingungen selektiert werden, die ansonsten limitierend sind. Diese Varianten können über E. coli „Genpellets" (d.h. Bakterien, die das Polypeptid exprimieren) oder andere Mittel, wie sie an anderer Stelle in diesem Dokument beschrieben sind, eingeführt werden. Die initiale Freisetzung in der Emulsion kann vermittelt werden durch enzymatische (z.B. Lambda-Lysogen) oder thermische Lyse oder andere Verfahren, wie sie hier offenbart sind. Die letztgenannten können die Verwendung von Agenzien nötig machen, die die enzymatische Aktivität bei vorübergehend erhöhten Temperaturen stabilisieren. Es kann beispielsweise notwendig sein, Mengen an Prolin, Glycerol, Trehalose oder anderen stabilisierenden Mitteln, wie sie in der Technik bekannt sind, einzubeziehen, um eine Stabilisierung hitzeempfindlicher Enzyme, wie etwa reverser Transkriptase, zu bewirken. Weiterhin kann eine schrittweise Entfernung des Mittels unternommen werden, um auf eine erhöhte Stabilität des hitzeempfindlichen Enzyms hin zu selektieren.
Alternativ, und wie hier an anderer Stelle offenbart, können Varianten über gekoppelte Transkription/Translation erzeugt werden, wobei die exprimierten Produkte in den 3SR-Zyklus eingespeist werden.
Es wird außerdem erkennbar sein, dass es möglich ist, reverse Transkriptase durch die thermostabile Tth-DNA-Polymerase zu ersetzen. Tth-DNA-Polymerase ist dafür bekannt, dass sie reverse Transkriptase Aktivität besitzt, und die RNA-Matrize wird unter Verwendung dieses Enzyms effektiv in Matrizen-DNA revers transkribiert. Es ist daher möglich, auf nützliche Varianten dieses Enzyms hin zu selektieren, z.B. durch Einführen bakteriell exprimierter T7-RNA-Polymerasevarianten in die Emulsion und Präinkubieren bei einer ansonsten nicht permissiven Temperatur.
Das Beispiel 18 unten ist ein Beispiel, das einen Weg zeigt, bei dem die Verfahren unserer Erfindung unter Verwendung selbsttragender Sequenzreplikation (3SR) auf die Selektion von Replikasen angewendet werden können.
Ligationsamplifikation (LAR/LAS)
Die Ligationsamplifikationsreaktion oder das Ligationsamplifikationssystem verwendet DNA-Ligase und vier Oligonukleotide, zwei pro Zielstrang. Diese Technik wird beschrieben von Wu, D. Y. und Wallace, R. B. (1989) Genomics 4: 560. Die Oligonukleotide hybridisieren an benachbarten Sequenzen auf der Ziel-DNA und werden durch Ligase verbunden. Die Reaktion wird hitzedenaturiert, und der Zyklus wird wiederholt.
In Analogie auf die Anwendung gegenüber Polymerasen kann unser Verfahren auf Ligasen, insbesondere solchen aus thermophilen Organismen, angewendet werden. Oligonukleotide, die komplementär zu einem Strang der Ligasegensequenz sind, werden synthetisiert (entweder als perfekter Treffer oder gezielte oder zufällige Diversität umfassend). Die zwei End-Oligos überlappen in den Vektor oder die untranslatierten Regionen des Ligasegens. Das Ligasegen wird entweder für die Expression in einem geeigneten Wirt kloniert und zusammen mit den Oligonukleotiden und einer geeigneten Energiequelle (für gewöhnlich ATP (oder NADPH)) kompartimentiert. Wenn nötig, wird die Ligase, die wie oben in Bakterien exprimiert wird, durch thermische Lyse aus den Zellen freigesetzt. Die Kompartimente enthalten geeigneten Puffer zusammen mit geeigneten Mengen einer geeigneten Energiequelle (ATP oder NADH) und Oligonukleotiden, die die Gesamtheit des Ligasegens codieren, sowie ebenso flankieren Sequenzen, die für die Klonierung erforderlich sind. Die Ligation der Oligonukleotide führt zum Zusammenbau eines Ligasegens voller Länge durch eine aktive Ligase (wobei das Ligasegen auf dem Expressionsplasmid als Matrize dient). In Kompartimenten, die eine inaktive Ligase enthalten, wird kein Zusammenbau stattfinden. Ebenso wie mit Polymerasen wird die Kopienzahl eines Ligasegens X nach der Selbstligation bevorzugt proportional zu der katalytischen Aktivität unter den Selektionsbedingungen der hiervon codierten Ligase X sein.
Nach der Lyse der Zellen führt das Thermocycling zum Anhybridisieren der Oligonukleotide an das Ligasegen. Jedoch hängt die Ligation der Oligos und somit der Zusammenbau des Ligasegens voller Länge von der Anwesenheit einer aktiven Ligase im selben Kompartiment ab. Somit werden nur Gene, die aktive Ligasen codieren, ihre eigenen codierenden Gene aus den vorliegenden Oligonukleotiden zusammenbauen. Zusammengebaute Gene können dann amplifiziert, diversifiziert und für eine weitere Runde der Selektion erneut kloniert werden, wenn nötig. Die Verfahren unserer Er findung sind daher geeignet für die Selektion von Ligasen, die bei der Ligation schneller oder effizienter sind.
Wie an anderer Stelle vermerkt, kann die Ligase entweder in situ durch Expression über einen geeigneten bakteriellen oder andersartigen Wirt oder durch in vitro-Translation produziert werden. Die Ligase kann eine Oligonukleotid (z.B. Ribo- oder Desoxyribozym)-Ligase sein, die ihre eigene Sequenz aus den verfügbaren Fragmenten zusammenbaut, oder die Ligase kann eine konventionelle (Polypeptid-)Ligase sein. Die Länge der Oligonukleotide wird von der spezifischen Reaktion abhängen, jedoch wenn nötig, können diese sehr kurz sein (z.B. Tripletts). Wie an anderer Stelle vermerkt, kann das Verfahren unserer Erfindung verwendet werden, um auf ein Polypeptid hin zu selektieren, das befähigt ist, Ligaseaktivität entweder direkt oder indirekt zu modulieren. Beispielsweise kann das zu entwickelnde Gen ein anderes Enzym oder Enzyme darstellen, die ein Substrat für die Ligase erzeugen (z.B. NADH) oder einen Inhibitor verbrauchen. In diesem Fall codieren die Oligonukleotide Teile des anderen Enzyms oder der anderen Enzyme etc.
Die Ligationsreaktion zwischen Oligonukleotiden kann alternative Chemien, z.B. Amidbindungen, einbauen. Solange die chemischen Bindungen nicht in das Matrizen-basierte Kopieren des gegenüberliegenden Stranges durch eine beliebige Replikase (z.B. reverse Transkriptase) eingreifen, kann eine breite Anzahl von Verknüpfungschemien und Ligasen, die diese katalysieren, entwikkelt werden.
Qβ-Replikase
Bei dieser Technik wird RNA-Replikase des Bakteriophagen Qβ, die einzelsträngige RNA repliziert, verwendet, um Ziel-DNA zu amplifizieren, wie von Lizardi et al. (1988) Bio. Technology 6: 1197 beschrieben. Zuerst wird die Ziel-DNA an einen Primer hybridisiert, der einen T7-Promotor und eine Qβ-5'-Sequenzregion beinhaltet. Unter Verwendung dieses Primers erzeugt die reverse Transkriptase eine cDNA, die den Primer bei dem Prozess mit deren 5'-Ende verbindet. Diese zwei Schritte sind ähnlich zu dem TAS-Protokoll. Die resultierende Heteroduplex wird hitzedenaturiert. Danach wird ein zweiter Primer, der eine Qβ-3'-Sequenzregion enthält, verwendet, um eine zweite Runde der cDNA-Synthese zu starten. Diese resultiert in einer doppelsträngigen DNA, die sowohl die 5'- als auch die 3'-Enden des Qβ-Bakteriophagen enthält, sowie ebenso eine aktive T7-RNA-Polymerase-Bindungsstelle. T7-RNA-Polymerase transkribiert dann die doppelsträngige DNA in neue RNA, die Qβ nachahmt. Nach ausgedehntem Waschen zur Entfernung jedweder unhybridisierten Sonde, wird die neue RNA von ihrem Ziel eluiert und durch Qβ-Replikase repliziert. Die letztgenannte Reaktion erzeugt eine 10⁷-fache Amplifikation in etwa 20 Minuten. Ein signifikanter Hintergrund kann aufgrund winziger Mengen an Sonden-RNA, die in unspezifischer Weise bei der Reaktion zurückbleibt, erzeugt werden.
Eine Reaktion, die Qβ-Replikase, wie oben beschrieben, verwendet, kann benutzt werden, um eine kontinuierliche Selektionsreaktion bei einer alternativen Ausführungsform gemäß unserer Erfindung durchzuführen.
Beispielsweise wird das Gen für Qβ-Replikase (mit passenden 5'- und 3'-Regionen) zu einer in vitro-Translationsreaktion hinzugegeben und kompartimentiert. In den Kompartimenten wird die Replikase exprimiert und beginnt unmittelbar damit, ihr eigenes Gen zu replizieren. Nur Gene, die für eine aktive Replikase codieren, replizieren sich selbst. Die Replikation schreitet fort, bis die NTPs erschöpft sind. Da die NTPs jedoch dazu veranlasst werden können, durch die Emulsion zu diffundieren (siehe die Beschreibung von ndk in den Beispielen) kann die Replikationsreaktion von außen „gefüttert" werden und viel länger voranschreiten, im wesentlichen solange, bis in den Kompartimenten kein Raum für weitere Replikation übrig ist. Es ist möglich, die Reaktion weiter fortzuführen, indem man Serienverdünnungen des Emulsionsgemischs in einer frischen Ölphase vornimmt und nach der Zugabe einer frischen Wasserphase, die NTPs enthält, erneut emulgiert. Qβ-Replikase ist dafür bekannt, dass sie sehr fehleranfällig ist, und so wird alleine die Replikation eine Menge an zufälliger Diversität einführen (was erstrebenswert sein kann). Die hier beschriebenen Verfahren erlauben die Entwicklung spezifischerer (z.B. Primer-abhängiger) Formen der Qβ-Replikase. Ebenso wie bei anderen Replikationsreaktionen (insbesondere ndk in den Beispielen) kann eine Reihe von Enzymen, die die Reaktion füttern, entwickelt werden.
Andere Amplifikationstechniken:
Eine alternative Amplifikationstechnik kann bei der vorliegenden Erfindung genutzt werden. Beispielsweise ist die „Rolling Circle-Amplifikation" (Lizardi et al., (1998) Nat Genet 19: 225) eine Amplifikationstechnologie, die kommerziell erhältlich ist (RCAT^TM), die durch DNA-Polymerase angetrieben wird und zirkuläre Oligonukleotid-Sonden unter isothermen Bedingungen mit entweder linearer oder geometrischer Kinetik replizieren kann.
In Gegenwart zweier geeignet gestalteter Primer erfolgt eine geometrische Amplifikation über DNA-Strang-Verdrängung und Hyperverzweigung, um 10¹² oder mehr Kopien jedes zirkulären Moleküls in 1 Stunde zu erzeugen.
Wenn ein einzelner Primer verwendet wird, erzeugt die RCAT in wenigen Minuten eine lineare Kette tausender tandemartig verbundener DNA-Kopien eines Ziels, die kovalent mit diesem Ziel verbunden sind.
Eine weitere Technik, die Strang-Verdrängungs-Amplifikation (SDA; Walker et al., (1992) PNAS (USA) 80: 392) beginnt mit einer spezifisch definierten Sequenz, die für ein spezifisches Ziel singulär ist. Anders jedoch als andere Techniken, die auf Thermocycling basieren, ist die SDA ein isothermer Prozess, der eine Reihe von Primern, DNA-Polymerase und ein Restriktionsenzym verwendet, um die singuläre Nukleinsäuresequenz exponentiell zu amplifizieren.
Die SDA umfasst sowohl eine Zielerzeugungsphase als auch eine exponentielle Amplifikationsphase.
Bei der Zielerzeugung wird doppelsträngige DNA hitzedenaturiert, wodurch zwei Einzelstrang-Kopien erzeugt werden. Eine Reihe spezifisch hergestellter Primer verbinden sich mit DNA-Polymerase (Amplifikations-Primer zum Kopieren der Basensequenz und „Puffer-Primer" zum Verdrängen der neu erzeugten Stränge), um veränderte Ziele auszubilden, die zur exponentiellen Amplifikation befähigt sind.
Der Prozess der exponentiellen Amplifikation beginnt mit veränderten Zielen (einzelsträngige partielle DNA-Stränge mit restriktionsverdauten Enzymerkennungsstellen) aus der Zielerzeugungsphase.
Ein Amplifikations-Primer wird an jedem Strang an seine komplementäre DNA-Sequenz gebunden. DNA-Polymerase verwendet dann den Primer zur Identifizierung einer Position, um den Primer ausgehend von seinem 3'-Ende zu verlängern, wobei das veränderte Ziel als Matrize für die Anfügung einzelner Nukleotide benutzt wird. Die verlängerten Primer bilden somit ein doppelsträngiges DNA-Segment, das eine vollständige Restriktionsenzymerkennungsstelle an jedem Ende enthält.
Ein Restriktionsenzym wird dann an das doppelsträngige DNA-Segment an seiner Erkennungsstelle gebunden. Das Restriktionsenzym dissoziiert von der Erkennungsstelle ab, nachdem es nur einen Strang des doppelseitigen Segments geschnitten hat, wobei ein Einschnitt erzeugt wird. DNA-Polymerase erkennt den Einschnitt und verlängert den Strang von dieser Stelle aus, wobei der zuvor erzeugte Strang verdrängt wird. Die Erkennungsstelle wird somit wiederholt durch das Restriktionsenzym und die DNA-Polymerase eingeschnitten und wiederhergestellt, wobei die das Zielsegment enthaltenden DNA-Stränge kontinuierlich verdrängt werden.
Jeder verdrängte Strang ist dann verfügbar, um wie oben mit Amplifikations-Primern zu hybridisieren. Der Prozess geht weiter mit wiederholtem Einschneiden, Verlängerung und Verdrängung neuer DNA-Stränge, was in einer exponentiellen Amplifikation des ursprünglichen DNA-Ziels resultiert.
Selektion katalytischer RNA
Bekannte Verfahren der in vitro-Evolution sind verwendet worden, um katalytisch aktive RNA-Moleküle (Ribozyme) mit einem vielgestaltigen Spektrum von Aktivitäten zu erzeugen. Diese jedoch haben die Selektion durch Selbstmodifikation beinhaltet, die in inhärenter Weise Varianten isoliert, die sich auf „Nachbarschaftskatalyse" stützen und die in trans reduzierte Aktivitäten besitzen.
Die Kompartimentierung liefert ein Mittel zur Selektion tatsächlich in trans wirkender Ribozyme, die zu mehrfachem Umsatz befähigt sind, ohne die Notwendigkeit, Substrat durch kovalente Verbindung oder Interaktionen mittels Wasserstoffbindung (d.h. Basenpaarung) an das Ribozym anzuheften.
Im simpelsten Fall kann ein Gen, das ein Ribozym codiert, in die Emulsion eingeführt und leicht transkribiert werden, wie folgt gezeigt durch die Transkription und die 3SR-Amplifikation der für Taq-Polymerase codierenden RNA in situ: Das Taq-Polymerasegen wird zunächst in der Emulsion transkribiert. 100 μl eines Reaktionsgemischs, umfassend 80 mM HEPES-KOH (pH 7,5), 24 mM MgCl₂, 2 mM Spermidin, 40 mM DTT, rNTPs (30 mM) und 50 ng T7-Taq-Matrize (siehe Beispiel 18: Selektion unter Verwendung selbsttragender Sequenzreplikation (3SR)), 60 Unit T7-RNA-Polymerase (USB) und 40 Unit RNAsin (Promega) werden unter Verwendung des Standardprotokolls emulgiert. Die Emulsionen werden bei 37°C für bis zu 6 Stunden inkubiert, und die Analyse der Reaktionsprodukte durch Gelelektrophorese zeigt Niveaus der RNA-Produktion, vergleichbar denen der nicht-emulgierten Kontrolle.
Durch Erzeugen eines 5'-Überhangs (z.B. durch Anligieren entweder von DNA- oder RNA-Adaptern) in dem emulgierten Gen werden RNA-Varianten mit der Fähigkeit zur Durchführung der Matrizen-gesteuerten Anfügung sukzessiver dNTPs in trans (d.h. Polymeraseaktivität, siehe 6) selektiert. Gene, die „aufgefüllt" wurden, können durch PCR gerettet werden, indem man Primer verwendet, die zu der einzelsträngigen Region des Gens komplementär sind (d.h. der Region, die vor dem Auffüllen mit dem Ribozym einzelsträngig ist) oder durch das Einfangen von durch Biotin (oder anderweitig) modifizierten Nukleotiden, die eingebaut wurden, gefolgt von PCR. In Kompartimenten ohne katalytische RNA-Aktivität bleibt diese Region einzelsträngig, und der PCR wird es nicht gelingen, die Matrize zu amplifizieren (alternativ werden keine Nukleotide eingebaut, und die Matrize wird nicht gebunden, sondern weggewaschen).
Ein Kopplungsansatz kann außerdem verwendet werden, um die Bandbreite der enzymatischen Aktivitäten, auf die selektiert werden kann, weiter auszudehnen. Beispielsweise kann die Co-Emulgierung einer DNA-Polymerase mit dem oben beschriebenen Gen (5'-Überhang) verwendet werden, um auf Ribozyme zu selektieren, die ein ansonsten ungeeignetes NTP-Substrat in ein Substrat umsetzen, das von der Polymerase verwendet werden kann. Wie zuvor kann das „aufgefüllte" Gen dann durch PCR gerettet werden. Der obige Ansatz kann auch dazu verwendet werden, um auf Protein-Polymeraseenzyme hin zu selektieren, die in situ ausgehend von einer ähnlichen Matrize (d.h. mit 3'-Überhang) produziert wurden. Ein Diagramm, das die Selektion von RNA mit katalytischer Aktivität zeigt, ist in 6 dargestellt.
Selektion von Polypeptiden, die zur Modifikation der Replikaseaktivität befähigt sind
Bei einer anderen Ausführungsform wird unsere Erfindung verwendet, um auf ein Polypeptid hin zu selektieren, das befähigt ist, die Aktivität einer Replikase zu modifizieren. Bei dieser Ausführungsform wird ein Pool von Nukleinsäuren erzeugt, umfassend Mitglieder, die ein oder mehrere Kandidaten-Polypeptide codieren. Mitglieder der Nukleinsäurebibliothek werden zusammen mit einer Replikase kompartimentiert (welche, wie oben erklärt, nur in der Lage ist, auf diejenige Nukleinsäure einzuwirken, die für das Polypeptid codiert).
Die Kandidatenpolypeptide können funktionell oder chemisch voneinander verschieden sein, oder sie können Varianten eines Polypeptids sein, von dem bekannt ist oder vermutet wird, dass es befähigt ist, Replikaseaktivität zu modulieren. Mitglieder des Pools werden dann zusammen mit den von ihnen codierten Polypeptiden oder Polynukleotiden in Kompartimente segregiert, sodass bevorzugt jedes Kompartiment ein einzelnes Mitglied des Pools zusammen mit seinem zugehörigen codierten Polypeptid umfasst. Jedes Kompartiment umfasst außerdem ein oder mehrere Moleküle der Replikase. Somit ist das codierte Polypeptid in der Lage, die Aktivität der Replikase zu modulieren, bzw. die Replikation der im Kompartiment eingeschlossenen Nukleinsäure (d.h. der Nukleinsäure, die das Polypeptid codiert) zu verhindern oder zu verstärken. Auf diese Weise ist das Polypeptid befähigt, über die Replikase zu wirken, um die Anzahl von Molekülen der es codierenden Nukleinsäure zu steigern oder zu verringern. Bei einer hochgradig bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Polypeptid befähigt, die Replikaseaktivität zu steigern, um eine Detektion oder Selektion des Polypeptids durch Detektieren der codierenden Nukleinsäure zu ermöglichen.
Das modulierende Polypeptid kann direkt oder indirekt auf die Replikase einwirken. Beispielsweise kann das modulierende Polypeptid ein Enzym sein, das eine Aktivität umfasst, die auf das Replikasemolekül einwirkt, z.B. durch eine posttranslationale Modifikation der Replikase, um die Replikase zu aktivieren oder zu inaktivieren. Das Polypeptid kann wirken, indem es einen Liganden an dem Replikasemolekül anbringt oder ihn von diesem entfernt. Es ist bekannt, dass viele Replikasen, wie etwa Polymerasen und Ligasen, durch Phosphorylierung reguliert werden, sodass bei bevorzugten Ausführungsformen das Polypeptid gemäß der Erfindung eine Kinase oder eine Phosphorylase ist. Das modulierende Polypeptid kann auch direkt mit der Replikase interagieren, und deren Eigenschaften modifizieren (z.B. Thioredoxin & T7-DNA-Polymerase, Mitglieder des Replisoms, z.B. clamp, Helikase, etc. mit DNA-Polymerase III).
Alternativ kann das modulierende Polypeptid seine Wirkungen auf die Replikase in einer indirekten Weise ausüben. Beispielsweise kann die Modulation der Replikaseaktivität über einen dritten Körper erfolgen, wobei dieser dritte Körper durch das modulierende Polypeptid modifiziert wird, z.B. wie oben beschrieben.
Weiterhin kann das modulierende Polypeptid ein Enzym sein, das einen Bestandteil eines Pathways ausbildet, der als ein Endprodukt ein Substrat für die Replikase produziert. Bei dieser Ausführungsform ist das modulierende Polypeptid an der Synthese eines Zwischenprodukts (oder des Endprodukts) des Stoffwechselweges beteiligt. Dementsprechend ist die Replikationsrate (und somit die Menge der Nukleinsäure, die das Polypeptid codiert) abhängig von der Aktivität des modulierenden Polypeptids.
Beispielsweise kann das modulierende Polypeptid eine Kinase sein, die beteiligt ist an der Biosynthese von Basen, Desoxyribonukleosiden, Desoxyribonukleotiden, wie etwa dAMP, dCMP, dGMP und dTMP, Desoxyribonukleosiddiphosphaten (wie etwa dADP, dCDP, dGDP und dTDP), Desoxyribonukleosidtriphosphaten, wie etwa dATP, dCTP, dGTP oder dTTP, oder Nukleosiden, Nukleotiden, wie etwa AMP, CMP, GMP und UMP, Nukleosiddiphosphaten (wie etwa ADP, CDP, GDP und UDP) oder Nukleosidtriphosphaten, wie etwa ATP, CTP, GTP oder UTP, etc. Das modulierende Polypeptid kann beteiligt sein an der Synthese anderer Zwischenprodukte bei der Biosynthese von Nukleotiden (wie beschrieben und wohlbekannt aus biochemischen Textbüchern, wie etwa Stryer oder Lehninger), wie etwa IMP, 5-Phospho-α-D-Ribose-1-pyrophosphorsäure, 5-Phospho-β-D-ribosylamin, 5-Phosphoribosyl-glycinamid, 5-Phosphoribosyl-N-formylglycinamid, etc. Somit kann das Polypeptid ein Enzym umfassen, wie etwa Ribosephosphat-Pyrophosphokinase, Phosphoribosylglycinamidsynthetase, etc. Andere Beispiele solcher Polypeptide werden Fachleuten bekannt sein. Die Verfahren unserer Erfindung erlauben die Selektion solcher Polypeptide mit verbesserter katalytischer Aktivität.
Bei wiederum einer anderen Ausführungsform hat der Modulator die Funktion, einen Bestandteil des Replikationscocktails (Primer, dNTP, Replikase, etc.) zu „entblockieren". Ein Beispiel für einen blockierten Bestandteil wäre ein Primer oder dNTP mit einer angehefteten chemischen Gruppierung, die die im CSR-Zyklus verwendete Replikase inhibiert. Alternativ könnte das verwendete Paar von Primern kovalent über ein Verknüpfungsmittel verbunden werden, mit einer Spaltung des Mittels durch einen Modulator, die es den beiden Primern erlaubt, ihr Gen in Gegenwart supplementierter Replikase zu amplifizieren. Ein Beispiel für ein Verknüpfungsmittel wäre eine Peptid-Nukleinsäure (PNA). Zusätzlich, durch Erstellen eines großen Oligonukleotids, das für ein Paar von Primer-Sequenzen codiert, die mit der Ziel-Nukleotidsequenz durchsetzt sind, könnten neue, positionsspezifische Restriktionsenzyme entwickelt werden. Wie zuvor ist die Rate der Replikation (und damit die Menge an Nukleinsäure, die das Polypeptid codiert) abhängig von der Aktivität des modulierenden Polypeptids. Alternativ kann der Modulator das 5'-Ende eines Primers modifizieren, sodass die Amplifikationsprodukte, die den Primer einbauen, durch ein geeignetes Mittel (z.B. einen Antikörper) eingefangen und somit angereichert und erneut amplifiziert werden können.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann das Spektrum der CSR weiter verbreitert werden, um auf Polypeptide zu selektieren, die nicht notwendigerweise thermostabil sind. Auslieferungsvehikel (z.B. E. coli), die Expressionskonstrukte enthalten, die für eine sekretierbare Form eines Modulators/einer Replikase von Interesse codieren, werden kompartimentiert. Die Einbeziehung eines induzierenden Mittels in die wässrige Phase und die Inkubation bei einer permissiven Temperatur (z.B. 37°C) erlauben die Expression und Sekretion des Modulators/der Replikase in das Kompartiment. Man lässt dem Modulator dann hinreichend Zeit, um in irgendeiner der zuvor genannten Weisen zu wirken, um die nachfolgende Amplifikation des zugehörigen codierenden Gens zu erleichtern (z.B. durch Verbrauch eines Inhibitors der Replikation). Die sich ergebende Temperaturveränderung während des Amplifikationsprozesses dient dazu, das Kompartiment von enzymatischen Aktivitäten der Wirtszelle zu befreien (die sich bis zu diesem Punkt von der wässrigen Phase getrennt wurden) und das codierende Gen für die Amplifikation freizusetzen.
Somit, gemäß einer Ausführungsform der Erfindung, stellen wir ein Verfahren zur Selektion eines Polypeptids bereit, das an einem Stoffwechselweg beteiligt ist, der als Endprodukt ein Substrat besitzt, das an einer Replikationsreaktion beteiligt ist (ein „Pathway-Polypeptid"), wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer Replikase; (b) Bereitstellen eines Pools von Nukleinsäuren, umfassend Mitglieder, die jeweils ein Pathway-Polypeptid oder eine Variante des Pathway-Polypeptids codieren; (c) Unterteilen des Pools von Nukleinsäuren in Kompartimente, sodass jedes Kompartiment ein Nukleinsäuremitglied des Pools, das Pathway-Polypeptid oder die von dem Nukleinsäuremitglied codierte Variante, die Replikase oder andere Komponenten des Pathways umfasst; und (d) Detektieren der Amplifikation des Nukleinsäuremitglieds durch die Replikase.
Die Beispiele (insbesondere Beispiel 19 und die folgenden Beispiele) zeigen die Verwendung unserer Erfindung bei der Selektion von Nukleosiddiphosphatkinase (NDP-Kinase), die die Übertragung einer Phosphatgruppe von ATP auf ein Desoxynukleosiddiphosphat zur Erzeugung eines Desoxynukleosidtriphosphats katalysiert.
Bei wiederum einer anderen Ausführungsform ist das modulierende Polypeptid so geartet, dass es einen Inhibitor der Replikaseaktivität verbraucht. Beispielsweise ist bekannt, dass Heparin ein Inhibitor der Replikase (Polymerase)-Aktivität ist. Unser Verfahren erlaubt die Selektion einer Heparinase mit gesteigerter Aktivität durch Kompartimentieren einer Bibliothek von Nukleinsäuren, die für Heparinase oder Varianten dieses Enzyms codieren, in Gegenwart von Heparin und Polymerase. Heparinasevarianten mit gesteigerter Aktivität sind befähigt, Heparin in einem größeren Ausmaß oder schneller zu zerlegen, wodurch sie somit die Inhibition der Replikaseaktivität in dem Kompartiment beseitigen und die Replikation der Nukleinsäure (d.h. der Nukleinsäure, die die Heparinasevariante codiert) in dem Kompartiment erlauben.
Selektion interagierender Polypeptide
Die wichtigsten Systeme für die Selektion von Protein-Protein-Interaktionen sind in vivo-Verfahren, wobei das wichtigste und am besten entwickelte das Hefe-zwei-Hybrid-System (Fields & Song, Nature (1989) 340, 245–246) ist. Bei diesem System und verwandten Ansätzen werden zwei Hybridproteine erzeugt: ein Köder-Hybrid, umfassend Protein X in Fusion mit einer DNA-Bindungsdomäne und ein Beute-Hybrid, umfassend Protein Y in Fusion mit einer Transkriptionsaktivierungsdomäne, wobei die auf Zugehörigkeit basierende Interaktion von X und Y den Transkriptionsaktivator wiederherstellt. Es sind zwei weitere in vivo-Systeme präsentiert worden, bei denen die Polypeptidkette eines Enzyms in zwei Teilen exprimiert wird, die an die zwei Proteine X und Y fusioniert sind, und bei denen die verwandtschaftliche Interaktion von X-Y die Funktion des Enzyms wiederherstellt (Karimova (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 5752–6; Pelletier (1999) Nat Biotechnol, 17, 683–690), was der Zelle einen selektierbaren Phänotyp verleiht.
Es ist jüngst gezeigt worden, dass Taq-Polymerase in einer ähnlichen Weise gespalten werden kann (Vainshtein et al. (1996) Protein Science 5, 1785). Gemäß unserer Erfindung stellen wir daher ein Verfahren bereit, um ein Paar von Polypeptiden zu selektieren, die zur stabilen Interaktion befähigt sind, indem man Taq-Polymerase oder irgendein anderes Enzym oder einen Faktor, der bei der Polymerasereaktion als Hilfsfaktor wirkt, spaltet.
Das Verfahren umfasst mehrere Schritte. Der erste Schritt besteht in der Bereitstellung einer ersten Nukleinsäure und einer zweiten Nukleinsäure. Die erste Nukleinsäure codiert für ein erstes Fusionsprotein, umfassend eine erste Subdomäne einer Replikase (oder eines anderen, siehe oben) Enzyms, das mit einem ersten Polypeptid fusioniert wird, während die zweite Nukleinsäure ein zweites Fusionsprotein codiert, das eine zweite Subdomäne einer Replikase (oder eines anderen, siehe oben) Enzyms umfasst, das mit einem zweiten Polypeptid fusioniert ist. Die zwei Fusionsproteine sind so, dass die stabile Interaktion der ersten und zweiten Subdomäne der Replikase (oder anderer, siehe oben) Replikaseaktivität erzeugt (entweder direkt oder indirekt). Wenigstens eine der ersten und zweiten Nukleinsäuren (bevorzugt beide) wird in Form eines Pools von Nukleinsäuren bereitgestellt, die für Varianten des/der jeweiligen ersten und/oder zweiten Polypeptids/Polypeptide codieren.
Der Pool oder die Pools von Nukleinsäuren werden dann in Kompartimente unterteilt, sodass jedes Kompartiment eine erste Nukleinsäure und eine zweite Nukleinsäure zusammen mit den entsprechenden Fusionsproteinen umfasst, die von der ersten und zweiten Nukleinsäure codiert werden. Man lässt das erste Polypeptid dann an das zweite Polypeptid binden, sodass die Bindung des ersten und zweiten Polypeptids zu einer stabilen Interaktion der Replikasesubdomänen führt, um Replikaseaktivität zu erzeugen. Schließlich wird die Amplifikation wenigstens einer der ersten und zweiten Nukleinsäuren durch die Replikase detektiert.
Unsere Erfindung umfasst damit ein in vitro-Selektionssystem, bei dem die Wiederherstellung der Replikasefunktion durch die enge Assoziation von zwei Polypeptidliganden die Amplifikation und Verbindung der Gene der beiden Liganden antreibt. Ein solches in vitro Zwei-Hybrid-System ist besonders geeignet für die Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen bei hohen Temperaturen, z.B. für die Untersuchung der Proteome thermophiler Organismen oder für die Erzeugung hochgradig stabiler Interaktionen.
Das System kann auch auf die Durchmusterung und Isolierung molekularer Verbindungen angewandt werden, die eine auf Zugehörigkeit basierende Interaktion unterstützen. Beispielsweise können Verbindungen chemisch mit beiden Primern oder mit dNTPs verknüpft werden und würden somit nur in Amplikons eingebaut werden, wenn sie die Assoziation unterstützen. Um Kreuzreaktionen zu vermeiden, wären solche Verbindungen erst dann freizusetzen, nachdem eine Kompartimentierung stattgefunden hat, z.B. durch Kopplung an Mikrobeads oder durch Einschluss in lösliche Mikrokugeln.
Einzelschritt- und Mehrfachschritt-Selektionen
Die Selektion geeigneter Einkapselungsbedingungen ist erstrebenswert. In Abhängigkeit von der Komplexität und Größe der zu durchmusternden Bibliothek kann es nutzbringend sein, die Einkapselungsprozedur so anzusetzen, dass 1 oder weniger als 1 Nukleinsäure pro Mikrokapsel oder Kompartiment eingekapselt wird. Dies wird die größte Auflösungsstärke bereitstellen. Dort, wo die Bibliothek größer und/oder komplexer ist kann dies jedoch unpraktikabel sein; es kann bevorzugt sein, mehrere Nukleinsäuren zusammen einzukapseln und zu kompartimentieren und sich auf die wiederholte Anwendung des Verfahrens der Erfindung zu stützen, um eine Sortierung der gewünschten Aktivität zu erreichen. Es kann eine Kombination von Einkapselungs-Prozeduren verwendet werden, um die gewünschte Anreicherung zu erhalten.
Theoretische Studien zeigen an, dass es, je größer die Anzahl der erzeugten Nukleinsäurevarianten ist, umso wahrscheinlich ist, dass ein Molekül mit den gewünschten Eigenschaften erzeugt werden wird (siehe Perelson und Oster, 1979, J Theor Biol, 81, 64570, für eine Beschreibung, wie dies auf Repertoires von Antikörpern anzuwenden ist). Jüngst ist auch praktisch bestätigt worden, dass größere Phagen-Antikörper-Repertoires tatsächlich zur Bildung von mehr Antikörpern mit besseren Bindungsaffinitäten führen als kleinere Repertoires (Griffiths et al., (1994) EMBO J., 13, 3245–60). Um sicherzustellen, dass seltene Varianten erzeugt werden, und somit befähigt sind, selektiert zu werden, ist eine große Bibliotheksgröße erstrebenswert. Somit ist die Verwendung optimal kleiner Mikrokapseln günstig.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Nukleinsäuren, können die Mikrokapseln oder Kompartimente gemäß der Erfindung weitere Komponenten umfassen, die dafür erforderlich sind, dass die Replikationsreaktion stattfinden kann. Andere Komponenten des Systems können z.B. solche umfassen, die für die Transkription und/oder Translation der Nukleinsäure notwendig sind. Diese werden für die Erfordernisse eines spezifischen Systems aus den folgenden ausgewählt: einem geeigneten Puffer, einem in vitro-Transkriptions/Replikationssystem und/oder einem in vitro-Translationssystem, das alle notwendigen Bestandteile, Enzyme und Cofaktoren, RNA-Polymerase, Nukleotide, Nukleinsäuren (natürlich oder synthetisch), Transfer-RNAs, Ribosomen und Aminosäuren und die Substrate der interessierenden Reaktion enthält, um die Selektion des modifizierten Genprodukts zu erlauben.
Puffer
Ein geeigneter Puffer wird ein solcher sein, in dem alle gewünschten Komponenten des biologischen Systems aktiv sind und wird daher von den Erfordernissen jedes spezifischen Reaktionssystems abhängen. Puffer, die für biologische und/oder chemische Reaktionen geeignet sind, sind in der Technik bekannt, und Rezepte werden in verschiedenen Labortexten bereitgestellt (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
In vitro-Translation
Die Replikase kann bereitgestellt werden durch Expression von einem geeigneten Wirt, wie an anderer Stelle beschrieben, oder sie kann durch in vitro-Transkription/Translation in einem geeigneten System, wie in der Technik bekannt, produziert werden.
Das in vitro-Translationssystem wird für gewöhnlich einen Zellextrakt umfassen, typischerweise aus Bakterien (Zubay, 1973, Annu Rev Genet, 7, 267–87; Zubay, 1980, Methods Enzymol, 65, 856–77; Lesley et al., 1991, J Biol Chem 266 (4), 2632–8; Lesley, 1995, Methods Mol Biol, 37, 265–78), Kaninchen-Retikulozyten (Pelham und Jackson, 1976, Eur J Biochem, 67, 247–56) oder Weizenkeim (Anderson et al., 1983, Methods Enzymol, 101, 635–44). Viele geeignete Systeme sind kommerziell erhältlich (z.B. von Promega), einschließlich einiger, die eine gekoppelte Transkription/Translation erlauben (alle Bakteriensysteme und die Retikulozyten- und Weizenkeim-TNT^TM Extraktsysteme von Promega). Das verwendete Gemisch von Aminosäuren kann synthetische Aminosäuren beinhalten, wenn gewünscht, um die mögliche Anzahl oder Varietät von Proteinen, die in der Bibliothek erzeugt werden, zu erhöhen. Dies kann durchgeführt werden, indem man tRNAs mit künstlichen Aminosäuren belädt und diese tRNAs für die in vitro-Translation der zu selektierenden Proteine verwendet (Ellman et al., 1991, Methods Enzymol, 202, 301–36; Benner, 1994, Trends Bio technol, 12, 158–63; Mendel et al., 1995, Annu Rev Biophys Biomol Struct, 24, 435–62). Besonders erstrebenswert sein kann die Verwendung eines in vitro-Translationssystems, das aus gereinigten Komponenten, wie etwa dem PURE-System (Shimizu et al., (2001) Nat. Biotech., 19, 751) aufgebaut ist.
Nach jeder Runde der Selektion kann die Anreicherung des Pools von Nukleinsäuren im Hinblick auf solche, die Moleküle von Interesse codieren, durch nicht-kompartimentierte in vitro-Transkription/Replikation oder gekoppelte Transkriptions-Translations-Reaktionen untersucht werden. Der selektierte Pool wird in einen geeigneten Plasmidvektor kloniert, und RNA oder rekombinantes Protein wird für eine weitere Reinigung und Untersuchung von den einzelnen Klonen produziert.
Die Erfindung bezieht sich darüber hinaus auf ein Verfahren zur Herstellung eines Genprodukts, sobald eine Nukleinsäure, die für das Genprodukt codiert, durch das Verfahren der Erfindung selektiert wurde. Natürlich kann die Nukleinsäure selbst direkt durch konventionelle Mittel exprimiert werden, um das Genprodukt zu erzeugen. Jedoch können alternative Techniken verwendet werden, wie Fachleuten ersichtlich sein wird. Beispielsweise kann die in dem Genprodukt enthaltene genetische Information in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut werden und ausgehend hiervon exprimiert werden.
Kompartimente
Wie hier verwendet, ist der Begriff „Kompartiment" synonym mit „Mikrokapsel", und die Begriffe werden in austauschbarer Weise verwendet. Die Funktion des Kompartiments besteht darin, eine Co-Lokalisation der Nukleinsäure und des entsprechenden, von der Nukleinsäure codierten Polypeptids zu ermöglichen. Dies wird bevorzugt erreicht durch die Fähigkeit des Kompartiments, eine Diffusion von Matrizen- und Produkt-Strängen zu anderen Kompartimenten im wesentlichen einzuschränken. Jedwede Replikaseaktivität des Polypeptids wird daher beschränkt, um auf eine Nukleinsäure ausgeübt zu werden, die sich in den Grenzen eines Kompartiments befindet, und nicht auf andere Nukleinsäuren in anderen Kompartimenten. Eine andere Funktion der Kompartimente besteht aus der Restriktion der Diffusion von Molekülen, die bei einer chemischen oder enzymatischen Reaktion erzeugt werden, und die eine Replikationsreaktion füttern oder entblockieren.
Die Kompartimente der vorliegenden Erfindung benötigen daher angemessene physikalische Eigenschaften, um das Funktionieren der Erfindung zu erlauben.
Zunächst, um sicherzustellen, dass die Nukleinsäuren und die Polypeptide nicht zwischen den Kompartimenten diffundieren, muss der Inhalt jedes Kompartiments vom Inhalt der umgebenden Kompartimente isoliert werden, sodass kein oder wenig Austausch der Nukleinsäuren und der Polypeptide zwischen den Kompartimenten über eine signifikante Zeitspanne stattfindet.
Zweitens erfordert das Verfahren der vorliegenden Erfindung, dass es nur eine begrenzte Anzahl von Nukleinsäuren pro Kompartiment gibt, oder dass alle Mitglieder in einem einzelnen Kompartiment klonal (d.h. identisch) sind. Dies stellt sicher, dass das Polypeptid, das von einer einzelnen Nukleinsäure codiert wird und dieser entspricht, von anderen, unterschiedlichen Nukleinsäuren isoliert werden wird. Somit wird die Kopplung zwischen einer Nukleinsäure und ihrem zugehörigen Polypeptid hochspezifisch sein. Der Anreicherungsfaktor ist am größten mit durchschnittlich einer oder wenigen Nukleinsäureklon-Spezies pro Kompartiment, wobei die Verbindung zwischen Nukleinsäure und der Aktivität des codierten Polypeptids so fest wie möglich ist, da das von einer individuellen Nukleinsäure codierte Polypeptid von den Produkten aller anderen Nukleinsäuren isoliert werden wird. Jedoch, selbst wenn die theoretisch optimale Situation von durchschnittlich einer Nukleinsäure oder weniger pro Kompartiment nicht verwendet wird, kann ein Verhältnis von 5, 10, 50, 100 oder 1000 oder mehr Nukleinsäuren pro Kompartiment nützlich beim Selektieren aus einer großen Bibliothek sein. Nachfolgende Runden der Selektion, einschließlich einer erneuten Kompartimentierung mit abweichender Nukleinsäureverteilung, werden eine stringentere Selektion der Nukleinsäuren erlauben. Bevorzugt gibt es im Durchschnitt eine einzige klonale Nukleinsäurespezies oder weniger pro Kompartiment.
Weiterhin enthält jedes Kompartiment eine Nukleinsäure; dies bedeutet, dass während einige Kompartimente leer bleiben können, die Bedingungen so eingestellt werden, dass statistisch jedes Kompartiment wenigstens eine und bevorzugt nur eine Nukleinsäure enthalten wird.
Drittens darf die Ausbildung und Zusammensetzung der Kompartimente die Funktion der Maschinerie für die Expression der Nukleinsäure und die Aktivität der Polypeptide nicht aufheben.
Folglich muss jedes verwendete Kompartimentierungssystem diese drei Erfordernisse erfüllen. Das/die geeigneten System(e) können in Abhängigkeit von der genauen Natur der Erfordernisse bei jeder Anwendung der Erfindung variieren, wie dem Fachmann ersichtlich sein wird.
Es sind verschiedene Techniken für die Kompartimentierung verfügbar, z.B. Gas-Aphrons (Juaregi und Varley, 1998, Biotechnol. Bioeng. 59, 471) und vorgefertigte Nanowells (Huang und Schreiber, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 94, 25). Für verschiedene Anwendungen können verschiedene Kompartimentgrößen und Oberflächenchemien, wie unten in größerem Detail diskutiert, erstrebenswert sein. Beispielsweise kann es hinreichend sein, die Diffusion begrenzende poröse Materialien, wie etwa Gele oder Alginat (Draget et al., 1997, Int J Macromol 21, 47), oder Materialien des Zeolith-Typs zu verwenden. Weiterhin, wenn die in situ PCR oder innerzelluläre PCR ausgeführt wird, können die Zellen mit einem vernetzenden Fixiermittel behandelt werden, um poröse Kompartimente auszubilden, die eine Diffusion von dNTPs, Enzymen und Primern erlauben.
Es ist eine breite Vielfalt von Kompartimentierungs- oder Mikroverkapselungsprozeduren verfügbar (Benita, S. Herausgeber (1996). Microencapsulation: Methods and industrial Applications. Drugs and pharmaceutical sciences. Herausgegeben von Swarbrick, J. New York: Marcel Dekker), und diese können verwendet werden, um die Kompartimente zu erzeugen, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Tatsächlich sind in der Literatur mehr als 200 Verfahren der Mikroeinkapselung und Kompartimentierung identifiziert worden (Finch, C. A. (1993) Encapsulation and controlled release. Spec. Publ.-R. Soc. Chem. 138, 35).
Diese beinhalten membranumhüllte wässrige Vesikel, wie etwa Lipidvesikel (Liposomen) (New, R. R. C., Herausgeber (1990). Liposomes: a practical approach. The practical approach series. Herausgegeben von Rickwood, D. & Hames, B. D. Oxford: Oxford University Press) und nichtionische Tensidvesikel (van Hal, D. A., Bouwstra, J. A. & Junginger, H. E. (1996). Nonionic surfactant vesicles containing estradiol for topical application. In Microencapsulation: Methods and industrial applications (Benita, S., Herausgeber), S. 329–347. Marcel Dekker, New York). Dies sind mit geschlossenen Membranen versehene Kapseln aus einzelnen oder mehrfachen Doppelschichten, bestehend aus nicht-kovalent zusammengefügten Molekülen, wobei jede Doppelschicht von ihrem Nachbarn durch ein wässriges Kompartiment getrennt ist. Im Fall von Liposomen ist die Membran aus Lipidmolekülen zusammengesetzt; dies sind für gewöhnlich Phospholipide, jedoch können Sterole, wie etwa Cholesterol, ebenfalls in die Membranen eingebaut werden (New, R. R. C., Herausgeber (1990). Liposomes: a practical approach. The practical approach series. Herausgegeben von Rickwood, D. & Hames, B. D. Oxford: Oxford University Press). Eine Vielzahl von Enzymkatalysierten biochemischen Reaktionen, einschließlich der RNA- und DNA-Polymerisation, kann in Liposomen durchgeführt werden (Chakrabarti J Mol Evol. (1994), 39, 555–9; Oberholzer Biochem Biophys Res Commun. (1995), 207, 250–7; Oberholzer Chem Biol. (1995) 2, 677–82; Walde, Biotechnol Bioeng (1998), 57, 216–219; Wick & Luisi, Chem Biol. (1996), 3, 277–85).
Bei einem Membran-umhüllten Vesikelsystem ist viel von der wässrigen Phase außerhalb des Vesikels und daher nicht kompartimentiert. Diese zusammenhängende wässrige Phase sollte entfernt werden oder die biologischen Systeme in ihr inhibiert oder zerstört werden (z.B. durch Verdau der Nukleinsäuren mit DNase oder RNase), damit die Reaktionen auf die kompartimentierten Mikrokapseln beschränkt werden (Luisi et al., Methods Enzymol. 1987, 136, 188–216).
Enzym-katalysierte biochemische Reaktionen sind auch in Mikrokapsel-Kompartimenten, die durch eine Vielzahl anderer Verfahren erzeugt werden, gezeigt worden. Viele Enzyme sind in reversen micellären Lösungen aktiv (Bru & Walde, Eur J Biochem. 1991,199, 95–103; Bru & Walde, Biochem Mol Biol Int. 1993, 31, 685–92; Creagh et al., Enzyme Microb Technol. 1993, 15, 383–92; Haber et al., 1993, NICHT AUFFINDBAR; Kumar et al., Biophys J 1989, 55, 789–792; Luisi, P. L. & B., S.-H. (1987), (Activity and conformation of enzymes in reverse micellar solutions. Methods Enzymol 136 (188), 188–216; Mao & Walde, Biochem Biophys Res Commun 1991, 178, 1105–1112; Mao, Q. & Walde, P. (1991). Substrate effects on the enzymatic activity of alpha-chymotrypsin in reverse micelles. Biochem Biophys Res Commun 178 (3), 1105–12; Mao Eur J Biochem. 1992, 208, 165–70; Perez, G. M., Sanchez, F. A. & Garcia, C. F. (1992). Application of active-phase plot to the kinetic analysis of lipoxygenase in reverse micelles. Biochem J.; Walde, P., Goto, A., Monnard, P.-A., Wessicken, M. & Luisi, P. L. (1994), Oparin's reactions revisited: enzymatic synthesis of poly(adenylic acid) in micelles and self-reproducing vesicles. J. Am. Chem. Soc. 116, 7541–7547; Walde, P., Han, D. & Luisi, P. L. (1993). Spectroscopic and kinetic studies of lipases solubilized in reverse micelles. Biochemistry 32, 4029–34; Walde Eur J Biochem. 1988 173, 401–9)), wie etwa das AOT-Isooctan-Wasser-System (Menger, F. M. & Yamada, K. (1979). J Am. Chem. Soc. 101, 6731–6734).
Kompartimente können außerdem erzeugt werden durch interfaciale Polymerisation und interfaciales Komplexieren (Whateley, T. L. (1996) Microcapsules: preparation by interfacial polymerisation and interfacial complexation and their applications. In Microencapsulation: Methods and industrial applications (Benita, S., Herausgeber), S. 349–375. Marcel Dekker, New York). Mikrokapselkompartimente dieser Sorte können starre, nicht-permeable Membranen oder semipermeable Membranen aufweisen. Semipermeable Mikrokapseln, begrenzt durch Zellulosenitratmembranen, Polyamidmembranen und Lipid-Polyamidmembranen, können sämtlich biochemische Reaktionen unterstützen, einschließlich Multienzymsystemen (Chang, Methods Enzymol. 1987, 136, 67–82; Chang, Artif Organs, 1992, 16, 71–4; Lim Appl Biochem Biotechnol. 1984, 10: 81–5). Alginat/Polylysin-Kompartimente (Lim & Sun, Science (1980) 210, 908–10), die unter sehr milden Bedingungen gebildet werden können, haben ebenfalls gezeigt, dass sie sehr biokompatibel sind, wobei sie z.B. ein wirksames Verfahren darstellen, um lebende Zellen und Gewebe einzukapseln (Chang, Artif Organs. (1992) 16, 71–4; Sun ASAIO J. (1992), 38, 125–7).
Nicht-membranöse Kompartimentierungssysteme auf Basis einer Phasenverteilung einer wässrigen Umgebung in einem kolloidalen System, wie etwa eine Emulsion, können ebenfalls verwendet werden.
Vorzugsweise werden die Kompartimente der vorliegenden Erfindung aus Emulsionen gebildet; heterogene Systeme aus zwei unmischbaren flüssigen Phasen, wobei eine der Phasen in Form von Tröpfchen mikroskopischer oder kolloidaler Größe in der anderen Phase dispergiert ist (Becher, P. (1957) Emulsions: theory and practice. Reinhold, New York; Sherman, P. (1968) Emulsion science. Academic Press, London; Lissant, K. J., Herausgeber, Emulsions and emulsion technology. Surfactant Science New York: Marcel Dekker, 1974; Lissant; K. J., Herausgeber, Emulsions and emulsion technology. Surfactant Science New York: Marcel Dekker, 1984).
Emulsionen können aus jeder geeigneten Kombination unmischbarer Flüssigkeiten erzeugt werden. Bevorzugt besitzt die Emulsion der vorliegenden Erfindung Wasser (enthaltend die biochemischen Komponenten) als Phase, die in Form fein verteilter Tröpfchen vorliegt (der dispersen, inneren oder diskontinuierlichen Phase) und eine hydrophobe, damit unmischbare Flüssigkeit (ein „Öl") als Matrix, in der diese Tröpfchen suspendiert sind (die nicht-disperse, kontinuierliche oder äußere Phase). Solche Emulsionen werden als „Wasser-in-Öl" (W/O) bezeichnet. Dies hat den Vorteil, dass die gesamte wässrige Phase, die die biochemischen Komponenten enthält, in abgegrenzte Tröpfchen (die innere Phase) kompartimentiert wird. Die äußere Phase, die ein hydrophobes Öl ist, enthält allgemein keine der biochemischen Komponenten und ist somit inert.
Die Emulsion kann durch Zugabe von einem oder mehreren oberflächenaktiven Mitteln (Tensiden) stabilisiert werden. Diese oberflächenaktiven Mittel werden als Emulgatoren bezeichnet und wirken an der Wasser/Öl-Grenzfläche, um eine Trennung der Phasen zu verhindern (oder wenigstens zu verzögern). Viele Öle und viele Emulgatoren können für die Erzeugung von Wasser-in-Öl-Emulsionen verwendet werden; eine kürzlich erstellte Datensammlung listete über 16.000 oberflächenaktive Mittel auf, von denen viele als Emulgatoren verwendet werden (Ash, M. und Ash, I. (1993) Handbook of industrial surfactants. Gower, Aldershot). Geeignete Öle beinhalten leichtes weißes Mineralöl und nicht-ionische oberflächenaktive Mittel (Schick, 1966, nicht aufgefunden), wie etwa Sorbitanmonooleat (Span^TM 80; ICI) und Polyoxyethylensorbitanmonooleat (Tween^TM 80; ICI) oder t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100).
Die Verwendung anionischer oberflächenaktiver Mittel kann ebenfalls nutzbringend sein. Geeignete oberflächenaktive Mittel beinhalten Natriumcholat und Natriumtaurocholat. Besonders bevorzugt ist Natriumdesoxycholat, bevorzugt bei einer Konzentration von 0,5% w/v oder weniger. Die Einbeziehung solcher oberflächenaktiver Mittel kann in einigen Fällen die Expression der Nukleinsäuren und/oder die Aktivität der Polypeptide steigern. Die Zugabe einiger anionischer oberflächenaktiver Mittel zu einem nicht-emulgierten Reaktionsgemisch hebt die Translation vollständig auf. Während der Emulgierung jedoch wird das oberflächenaktive Mittel von der wässrigen Phase in die Grenzschicht verschoben, und die Aktivität wird wieder hergestellt. Die Zugabe eines anionischen oberflächenaktiven Mittels zu den zu emulgierenden Gemischen stellt sicher, dass die Reaktionen nur nach der Kompartimentierung voranschreiten.
Die Erzeugung einer Emulsion erfordert allgemein die Anwendung mechanischer Energie, um die Phasen zusammen zu bringen. Es gibt eine Vielzahl von Wegen, dies zu tun, die eine Vielzahl mechanischer Vorrichtungen verwenden, einschließlich Rührern (wie etwa magnetischen Rührstäbchen, Propeller- oder Turbinenrührern, Vorrichtungen mit Rührarmen und Rührbesen), Homogenisatoren (einschließlich Rotor-Stator-Homogenisatoren, Hochdruckventil-Homogenisatoren und Düsenhomogenisatoren), Kolloidmühlen, Ultraschall- und „Membranemulgier"-Vorrichtungen (Becher, P. (1957) Emulsions: theory and practice. Reinhold, New York; Dickinson, E. (1994) in Wedlock, D. J. (Herausgeber), Emulsions and droplet size control. Butterworth-Heinemann, Oxford, Band S. 191–257).
Wässrige Kompartimente, die in Wasser-in-Öl-Emulsionen ausgebildet werden, sind im allgemeinen stabil, mit wenig oder keinem Austausch von Polypeptiden oder Nukleinsäuren zwischen den Kompartimenten. Zusätzlich ist es bekannt, dass mehrere biochemische Reaktionen in Emulsionskompartimenten ablaufen. Weiterhin sind komplizierte biochemische Prozesse, herausragender Weise Gentranskription und Translation, in Emulsionsmikrokapseln ebenfalls aktiv. Die Technik existiert, um Emulsionen mit Volumina in der gesamten Bandbreite bis hin zu industriellen Größenordnungen von tausenden von Litern zu erzeugen (Becher, P. (1957) Emulsions: theory and practice. Reinhold, New York; Sherman, P. (1968) Emulsion science. Academic Press, London; Lissant, K. J., Herausgeber, Emulsions and emulsion technology. Surfactant Science New York: Marcel Dekker, 1974; Lissant, K. J., Herausgeber, Emulsions and emulsion technology. Surfactant Science New York: Marcel Dekker, 1984).
Die bevorzugte Kompartimentgröße wird mit den genauen Erfordernissen jedes einzelnen Selektionsprozesses variieren, der gemäß der vorliegenden Erfindung durchzuführen ist. In allen Fällen wird es ein optimales Gleichgewicht zwischen der Größe der Genbibliothek, der erforderlichen Anreicherung und der erforderlichen Konzentration von Komponenten in den einzelnen Kompartimenten geben, um eine effiziente Expression und Reaktivität der Polypeptide zu erreichen.
Die Prozesse der Expression können entweder in situ in jeder einzelnen Mikrokapsel oder exogen in Zellen (z.B. Bakterien) oder anderen geeigneten Formen der Subkompartimentierung erfolgen. Sowohl die in vitro-Transkription als auch die gekoppelte Transkription/Translation werden bei sub-nanomolaren DNA-Konzentrationen weniger effizient. Aufgrund der Erfordernis für nur eine begrenzte Anzahl an DNA-Molekülen, die in jedem Kompartiment vorhanden sein sollen, setzt dies daher eine praktische Obergrenze für die mögliche Kompartimentgröße, wenn die in vitro-Transkription verwendet wird. Bevorzugt, für die Expression in situ unter Verwendung der in vitro-Transkription und/oder Translation beträgt das mittlere Volumen der Kompartimente weniger als 5,2 × 10^–16 m³ (entsprechend einem kugeligen Kompartiment mit einem Durchmesser von weniger als 1 μm).
Eine Alternative ist die Trennung von Expression und Kompartimentierung, z.B. unter Verwendung eines zellulären Wirts. Für die Einbeziehung von Zellen (insbesondere eukaryotischer Zellen) können mittlere Kompartimentdurchmesser von mehr als 10 μm bevorzugt sein.
Wie in den Beispielen gezeigt, haben wir zur Co-Lokalisation des Polymerasegens und des codierten Proteins im gleichen Emulsionskompartiment Bakterien (E. coli) verwendet, die als „Auslie ferungsvehikel" Taq-Polymerase überexprimieren. E. coli-Zellen (Durchmesser 1–5 μm) passen problemlos in unsere Emulsionskompartimente, wobei sie Platz für hinreichende Mengen an PCR-Reagenzien, wie etwa Nukleotidtriphosphate und Primer, belassen (wie gezeigt in 2). Der Denaturierungsschritt des ersten PCR-Zyklus bricht die Bakterienzelle auf und entlässt die exprimierte Polymerase und ihr codierendes Gen in das Kompartiment, was es der Selbstreplikation erlaubt, voranzuschreiten, während gleichzeitig bakterielle enzymatische Hintergrundaktivitäten zerstört werden. Weiterhin, in Analogie mit Heißstart-Strategien, verhindert diese zelluläre „Subkompartimentierung" die Freisetzung von Polymeraseaktivität bei Umgebungstemperaturen und die resultierenden unspezifischen Amplifikationsprodukte.
Die tatsächliche DNA- oder RNA-Konzentration in den Kompartimenten kann durch verschiedene Verfahren, die Fachleuten wohlbekannt sind, künstlich erhöht werden. Diese beinhalten z.B. die Zugabe volumenausschließender Chemikalien, wie etwa von Polyethylenglykolen (PEG) und eine Vielzahl von Genamplifikationstechniken, einschließlich der Transkription unter Verwendung von RNA-Polymerasen, einschließlich solchen aus Bakterien, wie etwa E. coli (Roberts, 1969 Nature 224, 1168–74; Blattner and Dahlberg, 1972 Nat New Biol. 237, 227–32; Roberts et al., 1975 J Biol Chem. 250, 5530–41; Rosenberg et al., 1975 J Biol Chem 250, 4755–4764), Eukaryoten, z.B. siehe (Weil et al., 1979 J Biol Chem. 254, 6163–6173; Manley et al., 1983 Methods Enzymol. 101, 568–82) und Bakteriophagen, wie etwa T7, T3 und SP6 (Melton et al., 1984 Nucleic Acids Res. 12, 7035–56); der Polymerasekettenreaktion (PCR) (Saiki et al., 1988 Science 239, 487–91); der Qβ-Replikase-Amplifikation (Miete et al., 1983 J Mol Biol. 171, 281–95; Cahill et al., 1991 Clin Chem. 37, 1482–5; Chetverin und Spirin, 1995 Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 51, 225–70; Katanaev et al., 1995 FEBS Lett., 359, 89–92); der Ligase-Kettenreaktion (LCR) (Landegren et al., 1988 Science, 241; 1077–80; Barany, 1991 PCR Methods Appl., 1, 5–16); selbsttragendem Sequenzreplikationssystem (Fahy et al., 1991 PCR Methods Appl. 1, 25–33) und Strang-Verdrängungs-Amplifikation (Walker et al., 1992 Nucleic Acids Res. 20, 1691–6). Gen-Amplifikationstechniken, die Thermocycling benötigen, wie etwa PCR und LCR, können ebenfalls verwendet werden, wenn die Emulsionen und die in vitro-Transkription oder die gekoppelten Transkriptions-Translationssysteme hitzestabil sind (beispielsweise können die gekoppelten Transkriptions-Translationssysteme aus einem thermostabilen Organismus, wie etwa Thermus aquaticus, hergestellt werden).
Eine Steigerung der tatsächlichen lokalen Nukleinsäurekonzentration erlaubt eine wirkungsvolle Nutzung größerer Kompartimente.
Die Kompartimentgröße muss hinreichend groß sein, um all die erforderlichen Komponenten der biochemischen Reaktionen aufzunehmen, die nötiger Weise in diesem Kompartiment stattfinden müssen. Beispielsweise erfordern in vitro sowohl Transkriptionsreaktionen als auch gekoppelte Transkriptions-Translations-Reaktionen eine Gesamtkonzentration an Nukleosidtriphosphat von etwa 2 mM.
Beispielsweise ist, um ein Gen zu einem einzigen kurzen RNA-Molekül von 500 Basen Länge zu transkribieren, ein Minimum von 500 Molekülen an Nukleosidtriphosphat pro Kompartiment (8,33 × 10^–22 Mol) erforderlich. Um eine 2 mM Lösung herzustellen, muss diese Anzahl von Molekülen in einem Kompartiment mit einem Volumen von 4,17 × 10^–19 Litern (4,17 × 10^–22 m³) enthalten sein, welches bei Kugelförmigkeit einen Durchmesser von 93 nm hätte. Somit ist die bevorzugte Untergrenze für Mikrokapseln ein Durchmesser von etwa 0,1 μm (100 nm).
Wenn Expressionswirte als Auslieferungsvehikel verwendet werden, gibt es viel weniger strenge Erfordernisse hinsichtlich der Kompartimentgröße. Grundlegender Weise hat das Kompartiment von hinreichender Größe zu sein, um den Expressionswirt ebenso wie hinreichende Mengen an Reagenzien zu enthalten, um die erforderlichen Reaktionen durchzuführen. Somit sind in solchen Fällen größere Kompartimentgrößen > 10 μM bevorzugt. Durch eine geeignete Auswahl des Vektors, der für die Expression in dem Wirt verwendet wird, kann die Matrizenkonzentration in den Kompartimenten über den Replikationsursprung des Vektors und die resultierende Kopienzahl kontrolliert werden (z.B. E. coli: colE (pUC) > 100, p15: 30–50, pSC101: 1–4). Entsprechend kann die Konzentration des Genprodukts mengenmäßig kontrolliert werden durch die Auswahl des Expressionspromotors und des Expressionsprotokolls (z.B. vollständige Induktion der Expression gegenüber einer Durchlässigkeit des Promotors). Bevorzugt ist die Konzentration des Genprodukts so hoch wie möglich.
Weiterhin erlaubt die Verwendung von „Fütter-Kompartimenten" eine Zufuhr der Substrate von außerhalb (siehe Ghadessy et al., (2001), PNAS, 98, 4552; 01). Fütter-Emulsions-Reaktionen von außerhalb können Kompartimentgrößen von < 0,1 μm für Ribozymselektionen erlauben, da die Reagenzien nicht in ihrer Gesamtheit in dem Kompartiment enthalten sein müssen.
Die Größe von Emulsions-Mikrokapseln oder Kompartimenten kann einfach dadurch variiert werden, indem man die verwendeten Emulsionsbedingungen zur Ausbildung der Emulsion gemäß den Erfordernissen des Selektionssystems maßschneidert. Je größer die Kompartimentgröße, umso größer ist das Volumen, das benötigt werden wird, um eine gegebene Nukleinsäurebibliothek einzukapseln, da der letztlich begrenzende Faktor die Größe des Kompartiments und somit die Anzahl an Mikrokapsel-Kompartimenten, die pro Volumeneinheit möglich ist, sein wird.
Die Größe der Kompartimente wird nicht nur im Hinblick auf die Erfordernisse des Replikationssystems ausgewählt, sondern auch bezogen auf die Erfordernisse des für die Nukleinsäure verwendeten Selektionssystems. Somit können die Komponenten des Selektionssystems, wie etwa eines chemischen Modifikationssystems, Reaktionsvolumina und/oder Reagenzkonzentrationen erfordern, die für die Replikation nicht optimal sind. Wie hier dargestellt, können solche Erfordernisse durch einen zweiten, erneuten Einkapselungsschritt erfüllt werden; darüber hinaus können sie erfüllt werden durch Auswählen der Kompartimentgröße, um die Replikation und Selektion als Ganzes zu maximieren. Die empirische Bestimmung eines optimalen Kompartimentvolumens und einer optimalen Reagenzkonzentration, z.B. wie hier dargestellt, ist bevorzugt.
Bei einer hochgradig bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Emulsion eine Wasser-in-Öl-Emulsion. Die Wasser-in-Öl-Emulsion wird hergestellt durch tropfenweises Zugeben einer wässrigen Phase zu einer Ölphase in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels, umfassend 4,5% (v/v) Span 80, etwa 0,4% (v/v) Tween 80 und etwa 0,05–0,1% (v/v) Triton X100, in Mineralöl, bevorzugt mit einem Verhältnis der Ölphase:Wasserphase von 2:1 oder 3:1. Es zeigt sich, dass das Verhältnis der drei oberflächenaktiven Mittel wichtig für die vorteilhaften Eigenschaften der Emulsion ist, und entsprechend umfasst unsere Erfindung auch eine Wasser-in-Öl-Emulsion mit gesteigerten Mengen an oberflächenaktivem Mittel, jedoch mit im Wesentlichen dem gleichen Verhältnis von Span 80, Tween 80 und Triton X100. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das oberflächenaktive Mittel 4,5% (v/v) Span 80, 0,4% (v/v) Tween 80 und 0,05% (v/v) Triton X100.
Die Wasser-in-Öl-Emulsion bildet sich bevorzugt unter konstantem Rühren in 2 ml Rundboden-Biofreeze-Gefäßen bei kontinuierlichem Rühren bei 1000 rpm für weitere 4 oder 5 Minuten nach der vollständigen Zugabe der wässrigen Phase. Die Zugaberate kann bis zu 12 Tropfen/min (jeweils ca. 10 μl) betragen. Die wässrige Phase kann nur Wasser beinhalten, oder sie kann eine gepufferte Lösung mit zusätzlichen Komponenten, wie etwa Nukleinsäuren, Nukleotidtriphosphaten, etc. umfassen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die wässrige Phase ein PCR-Reaktionsgemisch, wie an anderer Stelle in diesem Dokument offenbart, sowie Nukleinsäure und Polymerase. Die Wasser-in-Öl-Emulsion kann aus 200 μl der wässrigen Phase (z.B. dem PCR-Reaktionsgemisch) und 400 μl der Ölphase, wie oben beschrieben, gebildet werden.
Die Wasser-in-Öl-Emulsion gemäß der Erfindung hat vorteilhafte Eigenschaften einer erhöhten Hitzestabilität. Somit werden keine Veränderungen der Kompartimentgröße oder Anzeichen von Verschmelzung nach 20 Zyklen der PCR beobachtet, wie beurteilt durch Laserdiffraktion und Lichtmikroskopie. Dies ist in 2 gezeigt. Zusätzlich schreitet die Polymerasekettenreaktion effizient in den Kompartimenten dieser Wasser-in-Öl-Zusammensetzung voran, um sich Raten anzunähern, die bei Lösungs-PCR beobachtet werden. Die durchschnittlichen Größen des wässrigen Kompartiments in der Wasser-in-Öl-Emulsion gemäß unserer Erfindung betragen im Durchschnitt 15 μm in der Größe. Sobald sie gebildet wurden, erlauben die Kompartimente der Emulsion gemäß unserer Erfindung keinen in signifikantem Maße stattfindenden Austausch von Makromolekülen, wie etwa von DNA und Proteinen (wie in 3A gezeigt). Dies liegt vermutlich daran, dass das große Molekulargewicht und die geladene Natur der Makromoleküle eine Diffusion über die hydrophobe Schale des oberflächenaktiven Mittels ausschließt, selbst bei erhöhten Temperaturen.
Nukleinsäuren
Eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung ist so, wie oben beschrieben. Bevorzugt ist die Nukleinsäure ein Molekül oder Konstrukt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem DNA-Molekül, einem RNA-Molekül, einem partiell oder vollständig künstlichen Nukleinsäuremolekül, das ausschließlich aus synthetischen Basen oder einem Gemisch natürlich vorkommender und synthetischer Basen besteht, wobei ein jedes der vorstehend genannten mit einem Polypeptid verbunden sein kann, und wobei ein jedes der vorstehend genannten mit irgendeiner anderen molekularen Gruppe oder einem anderen molekularen Konstrukt verbunden sein kann. Vorzugsweise kann die andere molekulare Gruppe oder das Konstrukt ausgewählt sein aus der Gruppe, bestehend aus Nukleinsäuren, polymeren Substanzen, insbesondere Beads, z.B. Polystyrol-Beads, magnetischen Substanzen, wie etwa magnetischen Beads, Markierungen, wie etwa Fluorophoren oder Isotopen-Markierungen, chemischen Reagenzien, Bindungsmitteln, wie etwa Makrozyklen, und dergleichen.
Die Nukleinsäure kann geeignete regulatorische Sequenzen umfassen, wie etwa solche, die für eine effiziente Expression des Genprodukts erforderlich sind, z.B. Promotoren, Enhancer, Translationsstartsequenzen, Polyadenylierungssequenzen, Spleißstellen und dergleichen.
Die Begriffe „Isolieren", „Sortieren" und „Selektieren", sowie Varianten hiervon, werden hier verwendet. Die Isolation gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf das Verfahren der Abtrennung einer Einheit von einer heterogenen Population, z.B. einem Gemisch, sodass die Einheit frei von wenigstens einer Substanz ist, mit der sie vor dem Isolationsprozess assoziiert ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform bezieht sich „Isolierung" auf Reinigung einer Einheit im Wesentlichen bis zur Homogenität. Das „Sortieren" einer Einheit bezieht sich auf den Prozess des bevorzugten Isolierens gewünschter Einheiten gegenüber nicht erwünschten Einheiten. Insoweit, als sich dies auf die Isolierung der gewünschten Einheiten bezieht, sind die Begriffe „Isolieren" und „Sortieren" gleichwertig. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erlaubt das Sortieren gewünschter Nukleinsäuren aus Pools (Bibliotheken oder Repertoires) von Nukleinsäuren, die die gewünschte Nukleinsäure enthalten. „Selektieren" wird verwendet, um sich auf den Prozess (einschließlich des Sortierungsprozesses) zu beziehen, bei dem eine Einheit gemäß einer bestimmten Eigenschaft hiervon isoliert wird.
„Oligonukleotid" bezieht sich auf ein Molekül, das aus zwei oder mehr Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden zusammengesetzt ist, bevorzugt aus mehr als drei. Die exakte Größe des Oligonukleotids wird von der schlussendlichen Funktion oder Verwendung des Oligonukleotids abhängen. Das Oligonukleotid kann synthetisch oder durch Klonieren erhalten werden.
Die gemäß unserer Erfindung selektierten Nukleinsäuren können weiter manipuliert werden. Beispielsweise werden Nukleinsäuren, die selektierte Replikase oder interagierende Polypeptide codieren, in einen Vektor eingebaut und in geeignete Wirtszellen eingeführt, um transformierte Zelllinien zu erzeugen, die das Genprodukt exprimieren. Die resultierenden Zelllinien können dann für eine reproduzierbare qualitative und/oder quantitative Analyse der Wirkung(en) potentieller Arzneimittel, die die Funktion des Genprodukts beeinflussen, vervielfältigt werden. Somit können Genprodukt-exprimierende Zellen für die Identifizierung von Verbindungen verwendet werden, insbesondere von Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, die die Funktion des Genprodukts modulieren. Somit sind Wirtszellen, die das Genprodukt exprimieren, nützlich für Arzneimittel-Screens, und es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, um Verbindungen zu identifizieren, die die Aktivität des Genprodukts modulieren, wobei diese Verfahren das Exponieren von Zellen, die heterologe DNA enthalten, die für das Genprodukt codiert, (wobei diese Zellen funktionelles Genprodukt produzieren) gegenüber wenigstens einer Verbindung oder einem Gemisch von Verbindungen oder einem Signal umfassen, dessen Fähigkeit zur Modulation der Aktivität dieses Genprodukt bestimmt werden soll, gefolgt vom Überwachen dieser Zellen auf Veränderungen, die durch diese Modulation verursacht werden. Ein solcher Assay erlaubt die Identifizierung von Modulatoren, wie etwa Agonisten, Antagonisten und allosterischen Modulatoren des Genprodukts. Wie hier verwendet, bezieht sich eine Verbindung oder ein Signal, die/das die Aktivität eines Genprodukts moduliert, auf eine Verbindung, die die Aktivität des Genprodukts in einer solchen Weise verändert, dass die Aktivität des Genprodukts in Gegenwart der Verbindung oder des Signals (im Vergleich zur Abwesenheit dieser Verbindung oder dieses Signals) anders ist.
Zell-basierte Screening-Assays können erstellt werden durch Konstruieren von Zelllinien, bei denen die Expression eines Reporterproteins, d.h. eines leicht zu testenden Proteins, wie etwa R-Galaktosidase, Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) oder Luciferase, von dem Genprodukt abhängig ist. Ein solcher Test ermöglicht die Detektion von Verbindungen, die die Genproduktfunktion direkt modulieren, wie etwa von Verbindungen, die das Genprodukt antagonisieren, oder von Verbindungen, die andere zelluläre Funktionen inhibieren oder potenzieren, die für die Aktivität des Genprodukts benötigt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit, um auf exogene Weise Genprodukt-abhängige Prozesse, die in der Zelle stattfinden, zu beeinflussen. Rekombinantes Genprodukt produzierende Wirtszellen, z.B. Säugerzellen, können mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht werden, und der/die modulierenden Effekt(e) hiervon können dann bewertet werden durch Vergleichen der Genprodukt-vermittelten Antwort in Anwesenheit und Abwesenheit der Testverbindung, oder durch In-Bezug-Setzen der Genprodukt-vermittelten Antwort von Testzellen oder Kontrollzellen (d.h. Zellen, die das Genprodukt nicht exprimieren) mit der Gegenwart der Verbindung.
Nukleinsäurebibliotheken
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist nützlich zum Sortieren von Bibliotheken von Nukleinsäuren. Hier werden die Begriffe „Bibliothek", „Repertoire" und „Pool" gemäß ihrer gebräuchlichen Sinnhaftigkeit in der Technik verwendet, sodass eine Bibliothek von Nukleinsäuren ein Repertoire von Genprodukten codiert. Im allgemeinen werden Bibliotheken aus Pools von Nukleinsäuren konstruiert und besitzen Eigenschaften, die das Sortieren erleichtern. Eine anfängliche Selektion einer Nukleinsäure aus einer Bibliothek von Nukleinsäuren unter Verwendung der vorliegenden Erfindung wird in den meisten Fällen das Durchmustern einer großen Anzahl von Nukleinsäurevarianten erfordern. Bibliotheken von Nukleinsäuren können in einer Vielzahl verschiedener Weisen erzeugt werden, einschließlich der folgenden.
Pools natürlich vorkommender Nukleinsäuren können aus genomischer DNA oder cDNA kloniert werden (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York); beispielsweise haben sich Phagen-Antikörperbibliotheken, hergestellt durch die PCR-Amplifikation von Repertoires von Antikörpergenen aus immunisierten oder nicht-immunisierten Donoren, als sehr wirkungsvolle Quelle funktioneller Antikörperfragmente gezeigt (Winter et al., 1994 Annu Rev Immunol, 12, 433–55; Hoogenboom, H. R. (1997) Trends Biotechnol., 15, 62–70, Designing and optimizing library selection strategies for generating high-affinity antibodies. Trends Biotechnol. 15, 62–70; Hoogenboom, H. R. (1997) Trends Biotechnol., 15, 62–70). Es können außerdem Bibliotheken von Genen hergestellt werden, codierend für die Gesamtheit (siehe z.B. Smith, G. P. (1985) Science, 228, 1315–7; Parmley, S. F. und Smith, G. P. (1988) Gene, 73, 305–18) oder Teile von Genen (siehe z.B. Lowman et al., (1991) Biochemistry, 30, 10832–8) oder für Pools von Genen (siehe z.B. Nissim, A., Hoogenboom et al., (1994) EMBO J, 13, 692–8), und zwar mittels zufälliger oder „gedopter" synthetischer Oligonukleotide. Die Bibliotheken können außerdem hergestellt werden durch Einführen von Mutationen in eine Nukleinsäure oder Pools von Nukleinsäuren, und zwar „nach dem Zufallsprinzip" durch eine Vielzahl von Techniken in vivo, einschließlich der Verwendung von „Mutatorstämmen" von Bakterien, wie etwa E. coli mutD5 (Liao et al., (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83, 576–80; Yamagishi et al., (1990) Protein Eng, 3, 713–9; Low et al., (1996), J Mol Biol, 260, 359–68); der Verwendung des Antikörper-Hypermutationssystems der B-Lymphocyten (Yelamos et al., (1995), Nature, 376, 225–9). Zufällige Mutationen können außerdem – sowohl in vivo als auch in vitro – durch chemische Mutagene, Ionisierung oder UV-Bestrahlung (siehe Friedberg et al. 1995, DNA repair and mutagenesis. ASM Press, Washington D. C.) oder durch den Einbau mutagener Basenanaloga (Freese, 1959, J Mol. Biol., 1,87; Zaccolo et al., (1996), J Mol Biol, 255, 589–603) eingeführt werden. "Zufällige" Mutationen können außerdem in vitro während der Polymerisation in Gene eingeführt werden, z.B. unter Verwendung fehleranfälliger Polymerasen (Leung et al., (1989), Technique, 1, 11–15).
Eine weitere Diversifizierung kann eingeführt werden durch die Verwendung homologer Rekombination entweder in vivo (Kowalczykowski et al., (1994) Microbiol Rev, 58, 401–65) oder in vitro (Stemmer, (1994), Nature, 370, 389–9.; Stemmer, (1994) Proc Natl Acad Sci USA, 91, 10747–51).
Agens
Wie hier verwendet, beinhaltet der Begriff „Agens" (bzw. „Mittel"), ohne hierauf beschränkt zu sein, ein Atom oder Molekül, wobei das Molekül anorganisch oder organisch sein kann, ein biologisches Effektormolekül und/oder eine Nukleinsäure, die für ein Mittel codiert, wie etwa ein biologisches Effektormolekül, ein Protein, ein Polypeptid, ein Peptid, eine Nukleinsäure, eine Peptid-Nukleinsäure (PNA), ein Virus, ein Virus-artikes Partikel, ein Nukleotid, ein Ribonukleotid, ein synthetisches Analogon eines Nukleotids, ein synthetisches Analogon eines Ribonukleotids, ein modifiziertes Nukleotid, ein modifiziertes Ribonukleotid, eine Aminosäure, ein Aminosäureanalogon, eine modifizierte Aminosäure, ein modifiziertes Aminosäure-Analogon, ein Steroid, ein Proteoglykan, ein Lipid, eine Fettsäure und ein Kohlenhydrat. Ein Mittel kann in Lösung oder in Suspension vorliegen (z.B. in kristalliner, kolloidaler oder anderer teilchenförmiger Form). Das Mittel kann in Form eines Monomers, Dimers, Oligomers, etc., oder anderweitig in einem Komplex vorliegen.
Polypeptid
Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „Peptid", „Polypeptid" und „Protein" auf ein Polymer, bei dem die Monomere Aminosäuren sind und über Peptid- oder Disulfidbindungen miteinander verbunden sind. „Polypeptid" bezieht sich entweder auf eine natürlich vorkommende Aminosäurekette voller Länge oder ein „Fragment hiervon" oder ein „Peptid", wie etwa eine ausgewählte Region des Polypeptids, die an ein anderes Protein, Peptid oder Polypeptid in einer Weise bindet, die durch einen Liganden moduliert werden kann, oder auf ein Aminosäurepolymer oder ein Fragment oder Peptid hiervon, das teilweise oder vollständig nicht-natürlich ist. „Fragment hiervon" bezieht sich somit auf eine Aminosäuresequenz, die Bestandteil eines Polypeptids voller Länge ist, mit zwischen etwa 8 und etwa 500 Aminosäuren Länge, bevorzugt mit etwa 8 bis etwa 300, bevorzugter mit etwa 8 bis etwa 200 Aminosäuren, und noch bevorzugter mit etwa 10 bis etwa 50 oder 100 Aminosäuren Länge. „Peptid" bezieht sich auf eine kurze Aminosäuresequenz, die 10–40 Aminosäuren lang ist, bevorzugt 10–35 Aminosäuren. Zusätzlich können nicht-natürliche Aminosäuren, z.B. β-Alanin, Phenylglycin und Homoarginin, einbezogen sein. Gewöhnlich anzutreffende Aminosäuren, die nicht Gen-codiert sind, können ebenfalls bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Alle Aminosäuren, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können entweder das optische D- oder L-Isomer darstellen. Die L-Isomere sind bevorzugt. Zusätzlich sind andere Peptidomimetika ebenfalls nützlich, z.B. in Linkersequenzen von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung (siehe Spatola, (1983), in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Weinstein, Herausgeber Marcel Dekker, New York, S. 267). Ein „Polypeptid-bindendes Molekül" ist ein Molekül, bevorzugt ein Polypeptid, Protein oder Peptid, das die Fähigkeit besitzt, an ein anderes Polypeptid, Protein oder Peptid zu binden. Bevorzugt ist diese Bindungsbefähigung durch einen Liganden modulierbar.
Der Begriff „synthetisch", wie er hier verwendet wird, bedeutet, dass der beschriebene Prozess oder die beschriebene Substanz nicht gewöhnlich in der Natur vorkommen. Bevorzugt wird eine synthetische Substanz als Substanz definiert, die durch in vitro-Synthese oder Manipulation erzeugt wird.
Der Begriff „Molekül" wird hier verwendet, um sich auf irgendein Atom, Ion, Molekül, Makromolekül (z.B. ein Polypeptid) oder eine Kombination solcher Einheiten zu beziehen. Der Begriff „Ligand" kann austauschbar mit dem Begriff „Molekül" verwendet werden. Moleküle gemäß der Erfindung können frei in Lösung vorliegen, oder sie können teilweise oder vollständig immobilisiert sein. Sie können als diskrete Einheiten vorliegen oder mit anderen Molekülen komplexiert sein. Bevorzugt beinhalten Moleküle gemäß der Erfindung Polypeptide, die auf der Oberfläche von Bakteriophagenpartikeln präsentiert werden. Bevorzugter beinhalten Moleküle gemäß der Erfindung Bibliotheken von Polypeptiden, die als integrale Bestandteile der Hüllproteine auf der äußeren Oberfläche von Bakteriophagenpartikeln präsentiert werden. Verfahren für die Herstellung von Bibliotheken, die nach dem Zufallsprinzip erstellte Polypeptide codieren, sind in der Technik bekannt und können bei der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Die Erzeugung nach dem Zufallsprinzip („Randomisierung") kann vollständig oder partiell sein; im Falle einer partiellen Randomisierung codieren die ausgewählten Codons bevorzugt Optionen für Aminosäuren und nicht für Stopcodons.
BEISPIELE
Beispiel 1. Konstruktion von Taq-Polymerase-Expressionsplasmiden
Das offene Leseraster der Taq-Polymerase wird mittels PCR aus genomischer DNA von Thermus aquaticus unter Verwendung der Primer 1 & 2 amplifiziert, mit XbaI und SalI geschnitten und in pASK75 (Skerra A. 1994, Gene 151, 131), das mit XbaI und SalI geschnitten worden war, ligiert. pASK75 ist ein Expressionsvektor, der die Synthese von Fremdproteinen in E. coli unter der Transkriptionskontrolle des tetA-Promotors/Operators steuert.
Die Klone werden unter Verwendung der Primer 3, 4 auf Inserts durchgemustert und auf die Expression aktiver Taq-Polymerase (Taq Pol) (siehe unten) hin getestet. Die inaktive Taq-Pol-Mutante D785H/E786V wird unter Verwendung von Quickchange-Mutagenese (Stratagene) konstruiert. Die mutierten Reste sind entscheidend wichtig für die Aktivität (Doublie S. et al, 1998, Nature 391, 251; Kiefer J. R. et al., 1998, Nature 391; 304). Die resultierenden Klone werden unter Verwendung von PCR-Screening mit den Primern 3, 5 und durch diagnostischen Verdau der Produkte mit PmlI auf Mutationen hin durchgemustert. Die mutanten Klone werden auf die Expression aktiver Taq-Polymerase (siehe unten) hin getestet.
Beispiel 2. Proteinexpression und Aktivitätsassay
Transformierte TG1-Zellen werden in 2 × TY 0,1 mg/ml Ampicillin herangezogen. Für die Expression werden Übernacht-Kulturen 1/100 in frischem 2 × TY-Medium verdünnt und bei 37°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0,5 herangezogen. Die Proteinexpression wird induziert durch die Zugabe von Anhydro-Tetracyclin bis zu einer Endkonzentration von 0,2 μg/ml. Nach 4 Stunden weiterer Inkubation bei 37°C werden die Zellen abzentrifugiert, einmal gewaschen und in einem gleich großen Volumen an 1 × SuperTaq-Polymerasepuffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 0,1% Triton X-100, 1,5 mM MgCl₂) (HT Biotechnology Ltd, Cambridge UK) resuspendiert.
Die gewaschenen Zellen werden direkt zu einem PCR-Reaktionsgemisch hinzugegeben (2 μl pro 30 μl Reaktionsvolumen), dieses umfassend Matrizen-Plasmid (20 ng), die Primer 4 und 5 (je 1 μM), dNTPs (0,25 mM), 1 × SuperTaq-Polymerasepuffer, und mit Mineralöl überschichtet. Die Reaktionsansätze werden für 10 min bei 94°C inkubiert, um Taq-Pol aus den Zellen freizusetzen, und dann einer Thermocycler-Behandlung mit 30 Zyklen des Profils 94°C (1 min), 55°C (1 min), 72°C (2 min) unterzogen.
Beispiel 3. Emulgieren der Amplifikationsreaktionen
Die Emulgierung der Reaktionsansätze wird wie folgt durchgeführt. 200 μl an PCR-Reaktionsgemisch (Taq-Expressionsplasmid (200 ng), Primer 3 und 4 (je 1 μM), dNTPs (0,25 mM), Taq-Polymerase (10 Unit)) werden tropfenweise (12 Tropfen/min) zu der Ölphase (Mineralöl (Sigma)) in Gegenwart von 4,5% (v/v) Span 80 (Fluka), 0,4% (v/v) Tween 80 (Sigma) und 0,05% (v/v) Triton X100 (Sigma) unter konstantem Rühren (1000 rpm) in 2 ml Rundboden-Biofreeze-Gefäßen (Costar, Cambridge, MA) hinzugegeben. Nach vollständiger Zugabe der wässrigen Phase wird das Rühren für weitere 4 Minuten fortgesetzt. Die emulgierten Gemische werden dann auf 0,5 ml Dünnwand-PCR-Röhrchen (100 μl/Röhrchen) überführt, und die PCR wird durchgeführt unter Verwendung von 25 Zyklen des Profils 94°C (1 min), 60°C (1 min), 72°C (3 min), nach einer anfänglichen Inkubation bei 94°C für 5 min. Die Reaktionsgemische werden durch die Zugabe eines doppelten Volumens an Ether, Vortexen und Zentrifugieren für 2 Minuten vor dem Entfernen der Etherphase zurückgewonnen. Das amplifizierte Produkt wird durch Gelelektrophorese auf Agarosegelen unter Verwendung von Standardmethoden (siehe z.B. J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Bücher 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory Press) sichtbar gemacht.
Für das Emulgieren ganzer Zellen, die Taq-Polymerase exprimieren, wird das Protokoll auf folgende Weise modifiziert: Das Taq-Expressionsplasmid und die Taq-Polymerase in dem Reaktionscocktail werden weggelassen, und stattdessen werden 5 × 10⁸ induzierte E. coli TG1-Zellen (die die exprimierte Taq-Polymerase ebenso beherbergen wie das Expressionsplasmid) zusammen mit dem Zusatzstoff Tetramethylammoniumchlorid (50 μM) und RNase (0,05% w/v, Roche, UK) hinzugegeben. Die Anzahl der PCR-Zyklen wird außerdem auf 20 reduziert.
Beispiel 4. Selbstreplikation des wildtypischen Taq-Gens voller Länge
Um die Verbindung von Genotyp und Phänotyp während der Selbstreplikation zu testen, mischten wir Zellen, die entweder wildtypische Taq-Polymerase (wt Taq) oder das (unter den Pufferbedingungen) schwach aktive Stoffel-Fragment (sf Taq) (F. C. Lawyer et al., PCR Methods Appl 2, 275–87 (1993)) exprimieren, bei einem Verhältnis von 1:1 und unterwarfen diese der CSR entweder in Lösung oder in Emulsion. In Lösung wird das kleinere sf Taq bevorzugt amplifiziert. In der Emulsion jedoch gibt es eine nahezu ausschließliche Selbstreplikation des wt Taq-Gens voller Länge (3B). Die Anzahl an Bakterienzellen wird eingestellt, sodass die Mehrzahl der Emulsionskompartimente nur eine einzige Zelle enthält. Da die Zellen jedoch zufällig unter den Kompartimenten verteilt sind, ist es unvermeidbar, dass ein geringer Anteil zwei oder mehr Zellen enthalten wird. Da die Kompartimente keine Matrizen-DNA auszutauschen scheinen (3A), ist es wahrscheinlich, dass die geringe Menge an sf Taq-Amplifikation in der Emulsion aus diesen Kompartimenten resultiert. Es ist jedoch klar, dass ihre Häufigkeit niedrig ist, und, als solche die Selektionen wahrscheinlich nicht beeinflusst. Tatsächlich ist bei einer Testselektion eine einzige Runde der CSR hinreichend, um wildtypische Taq-Klone aus einem 10⁶-fachen Überschuss an inaktiven Taq-Mutanten zu isolieren.
Unter Verwendung fehleranfälliger PCR (error-prone PCR) haben wir zwei Repertoires an zufällig erzeugten Taq-Mutanten hergestellt (L1 (J. P. Vartanian, M. Henry, S. Wain-Hobson, Nucleic Acid Res. 24, 2627–2631 (1996)) und L2 (M. Zaccolo, E. Gherardi, J Mol Biol 285, 775–83 (1999)). Nur 1–5% der L1- oder L2-Klone sind aktiv, wie gemäß PCR eingeschätzt, jedoch steigerte eine einzige Runde der CSR-Selektion für die Polymeraseaktivität unter Standard-PCR-Bedingungen den Anteil aktiver Klone auf 81% (L1*) und 77% (L2*).
Beispiel 5. Mutagenisierende PCR
Taq-Polymerasegen-Varianten werden unter Verwendung von zwei verschiedenen Verfahren der fehleranfälligen PCR konstruiert.
Das erste verwendet die Nukleosid-Analoga dPTP und dLTP (Zaccolo et al., (1996) J Mol Biol. 255, 589–603). Kurz dargestellt, wird eine 3 Zyklen umfassende PCR-Reaktion durchgeführt, wobei der Reaktionsansatz 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 0,1% Triton X100, 2 mM MgCl₂, dNTPs (500 μM), dPTP (500 μM), dLTP (500 μM), 1 pM Matrizen-DNA, die Primer 8 und 9 (jeweils 1 μM) und Taq-Polymerase (2,5 Unit) in einem Gesamtvolumen von 50 μl umfasst und das thermische Profil 94°C (1 min), 55°C (1 min), 72°C (5 min) ist. Ein 2 μl-Aliquot wird dann auf eine 100 μl Stan dard-PCR-Reaktion übertragen, die 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 0,1% Triton X-100, 1,5 mM MgCl₂, dNTPs (250 μM), die Primer 6 und 7 (je 1 μM) und Taq-Polymerase (2,5 Unit) umfasst. Diese Reaktion wird 30 Zyklen mit dem Profil 94°C (30 Sekunden), 55°C (30 Sekunden), 72°C (4 Minuten) unterworfen. Das Amplifikationsprodukt wird gelgereinigt und wie oben in pASK75 kloniert, um die Bibliothek L2 zu erzeugen.
Das zweite Verfahren verwendet eine Kombination von „voreingenommenen" dNTPs und MnCl₂, um Fehler bei der PCR einzuführen. Das Reaktionsgemisch umfasst 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 0,1% Triton X-100, 2,5 mM MgCl₂, 0,3 mM MnCl₂, 1 pM Matrizen-DNA, dTTP, dCTP, dGTP (alle 1 mM), dATP (100 μM), Primer 8 und 9 (jeweils 1 μM) und Taq-Polymerse (2,5 Unit). Dieser Reaktionsansatz wird 30 Zyklen mit dem Profil 94°C (30 Sekunden), 55°C (30 Sekunden), 72°C (4 Minuten) unterworfen, und die amplifizierten Produkte werden wie oben kloniert, um die Bibliothek L1 zu erzeugen.
Beispiel 6. Selektionsprotokoll
Für die Selektion aktiver Polymerasen werden PCR-Reaktionen in Emulsionen durchgeführt, wie oben beschrieben, jedoch unter Verwendung der Primer 8 und 9. Für die Selektion von Varianten mit gesteigerter Thermostabilität werden die Emulsionen bei 99°C für bis zu 7 Minuten präinkubiert, bevor die Zyklusbehandlung wie oben durchgeführt wird. Für die Selektion von Varianten mit gesteigerter Aktivität in Gegenwart des Inhibitors Heparin, wird letztgenannter bis auf Konzentrationen von 0,08 und 0,16 Unit/μl hinzugegeben und die Zyklusbehandlung wird wie oben durchgeführt. Detaillierte Protokolle sind in den weiteren, unten stehenden Beispielen angegeben.
Die Amplifikationsprodukte, die aus den Kompartimenten resultieren, die eine aktive Polymerase enthalten, werden mit Ether aus der Emulsion extrahiert wie zuvor, und dann mittels Standard-Phenol-Chloroform-Extraktion gereinigt. 0,5 Volumina an PEG/MgCl₂-Lösung (30% v/v PEG 800, 30 mM MgCl₂) werden dann hinzugegeben, und nach dem Mischen wird die Zentrifugation für 10 Minuten bei Raumtemperatur bei 13.000 rpm durchgeführt. Der Überstand (enthaltend nicht-eingebaute Primer und dNTPs) wird verworfen, und das Pellet wird in TE resuspendiert. Die amplifizierten Produkte werden dann auf Zentrifugenröhrchen (Qiagen) weiter gereinigt, um eine vollständige Entfernung der Primer sicherzustellen. Diese Produkte werden dann unter Verwendung der Primer 6, 7 (die externe nested Primer gegenüber den Primern 8 und 9 darstellen) in einer Standard-PCR-Reaktion erneut amplifiziert, mit dem Unterschied, dass nur 20 Zyklen verwendet werden. Die erneut amplifizierten Produkte werden gelgereinigt und erneut, wie oben, in pASK75 kloniert. Es werden Transformanten ausplattiert, und die Kolonien werden wie unten durchgemustert. Die Restlichen werden in 2 × TY/0,1 mg/ml Ampicillin abgekratzt, bis auf eine OD₆₀₀ = 0,1 herunter verdünnt und herangezogen und induziert wie oben, um das Selektionsprotokoll zu wiederholen.
Beispiel 7. Protokoll zur Kolonie-Durchmusterung
Kolonien werden in eine 96-Well-Kulturschale (Costar) gepickt, herangezüchtet und wie oben für die Expression induziert. Für die Durchmusterung werden 2 μl an Zellen in einer 30 μl-PCR-Reaktion verwendet, um wie oben auf Aktivität hin zu testen, wobei dies in einer 96-Well-PCR-Platte (Costar) unter Verwendung der Primer 4 und 5 erfolgt. Es wird ein Temperaturgradienten-Block verwendet, um auf „Selektanten" mit erhöhter Thermostabilität hin durchzumustern. Die Reaktionen werden für 5 Minuten bei Temperaturen präinkubiert, die von 94,5 bis 99°C reichen, bevor eine Standard-Zyklusbehandlung wie oben mit den Primern 4 und 5 oder 3 und 4 erfolgt. Für das Durchmustern auf Heparin-kompatible Polymerasen, wird Heparin zu 0,1 Unit/30 μl bei dem 96-Well-Format-Kolonie-PCR-Screen hinzugegeben.
Aktive Polymerasen werden dann in einem Spektrum von Heparinkonzentrationen, reichend von 0,007 bis 3,75 Unit/30 μl, getestet und mit dem Wildtyp verglichen.
Beispiel 8. Assay auf katalytische Aktivität der Polymerasen
K_cat und K_m (dTTP) werden unter Verwendung eines homopolymeren Substrats bestimmt (Polesky et al., (1990) J. Biol. Chem. 265: 14579–91). Das endgültige Reaktionsgemisch (25 μl) umfasst 1 × SuperTaq-Puffer (HT Biotech), poly(dA)oligo(dT) (500 nM, Pharmacia) und variable Konzentrationen an [α-3²P]dTTP (etwa 0,01 Ci/mmol). Die Reaktion wird gestartet durch die Zugabe von 5 μl Enzym in 1 × SuperTaq-Puffer, um endgültige Enzymkonzentrationen zwischen 1–5 nM zu ergeben. Die Reaktionen werden für 4 Minuten bei 72°C inkubiert, mit EDTA gequencht, wie in Beispiel 14 und auf 24 mm DE-81-Filter appliziert. Die Filter werden dann gewaschen, und die Aktivität wird wie in Beispiel 14 gemessen. Die kinetischen Parameter werden unter Verwendung der Standard-Lineweaver-Burke-Auftragung bestimmt. Versuche unter Verwendung von 50% reduziertem Homopolymer-Substrat zeigten keine große Differenz beim Einbau von dTTP durch die Polymerase, was anzeigt, dass es in hinreichendem Überschuss vorliegt, um das verwendete Protokoll der kinetischen Analyse zu validieren.
Beispiel 9. Standard-PCR in wässrigen Kompartimenten in einer Emulsion
Um festzustellen, ob die Bedingungen in den wässrigen Kompartimenten, die in einer Emulsion vorliegen, permissiv für die Katalyse sind, wird ein Standard-Reaktionsgemisch emulgiert und eine PCR durchgeführt. Dies führt zur Amplifikation des Taq-Polymerasegens korrekter Größe, das in der Plasmidmatrize vorliegt, wobei die Ausbeuten hinreichende Ausbeuten sind, um eine Sichtbarmachung unter Verwendung von Standard-Agarosegel-Elektrophorese zu erlauben.
Beispiel 10. Emulgieren von E. coli, das Taq-Polymerase exprimiert, und nachfolgende PCR zur Amplifikation des Polymerasegens
E. coli-Zellen, die Taq-Polymerase exprimieren, werden emulgiert, und die PCR wird unter Verwendung von Primern durchgeführt, die die Polymerasekassette in dem Expressionsvektor flankieren. Emulgierungen von bis zu 5 × 10⁸ Zellen (pro 600 μl Gesamtvolumen) führen zu erkennbarer Produktbildung, wie beurteilt mittels Agarosegelelektrophorese. Die Zellen segregieren daher in die wässrigen Kompartimente, wo die Bedingungen für die Selbstamplifikation des Polymerasegens durch die exprimierte Taq-Polymerase geeignet sind. Für ähnliche Emulsionen wurde bestimmt, dass sie etwa 1 × 10¹⁰ Kompartimente pro ml enthalten (Tawfik D. & Griffiths A. D. (1998) Nature Biotech. 16, 652). Die große Anzahl an Zellen, die emulgiert werden können, erlaubt die Selektion aus vielgestaltigen Repertoires von randomisiertem Protein.
Beispiel 11. Aufrechterhaltung der Genotyp-Phänotyp-Verbindung in der Emulsion
Um für ein Selektionsverfahren brauchbar zu sein, sollte die Mehrzahl der wässrigen Kompartimente in der Emulsion eine einzige Zelle beinhalten, und die Unbeschadetheit der Kompartimente sollte während des Thermocycling aufrecht erhalten werden. Dies wird getestet, indem man in die Emulsion Zellen einbezieht, die eine Konkurrenz-Matrize beinhalten, die durch ihre kleinere Größe unterscheidbar ist.
E. coli, das Taq-Polymerase exprimiert, wird mit E. coli, das das Stoffel-Fragment exprimiert, in einem Verhältnis von eins zu eins co-emulgiert. Das Stoffel-Fragment ist unter den in der Emulsion verwendeten Bedingungen wenig aktiv, und somit ist die Amplifikation seiner Expressionskassette durch das gleiche Primerpaar, das für die Taq-Selbstamplifikation verwendet wird, das Ergebnis einer Co-Kompartimentierung mit einer Zelle, die aktive Taq-Polymerase exprimiert, oder einer Durchlässigkeit von Taq-Polymerase zwischen den Kompartimenten. Nach der PCR wird für die große Mehrheit der Produkte gefunden, dass diese dem aktiven Taq-Polymerasegen entspricht, was somit die Prämisse von einer Zelle pro dauerhaftem Kompartiment validiert (siehe 2, Ghadessy et al (2001), PNAS, 98, 4552).
Beispiel 12. Test-Selektion von aktiver gegenüber inaktiver Taq-Polymerase
Um zu zeigen, dass das Verfahren auf potentiell seltene Varianten hin selektieren kann, wurde ein 10⁶-facher Überschuss an Zellen, die inaktive Polymerase exprimieren, gegenüber solchen, die die aktive Form exprimieren, co-emulgiert. Nach der PCR und dem Klonieren des amplifizierten Produkts zeigte ein einzelner Expressions-Screen unter Verwendung eines 96-Well-Formats eine 10⁴-fache Anreicherung für die aktive Polymerase an.
Beispiel 13. Gesteuerte Evolution der Taq-Polymerase-Varianten mit gesteigerter Hitzestabilität
Polymerasen mit einer gesteigerten Hitzestabilität sind von potentieller praktischer Wichtigkeit, da sie den Aktivitätsverlust während des Thermocycling reduzieren und höhere Denaturierungstemperaturen für die Amplifikation von GC-reichen Matrizen erlauben. Somit haben wir, ausgehend von vorselektierten Bibliotheken (L1*, L2*), das Selektionsverfahren unserer Erfindung zunächst für die gesteuerte Evolution von Taq-Varianten mit erhöhter Hitzestabilität verwendet und progressiv die Temperatur und Dauer der anfänglichen Hitzedenaturierung gesteigert. Nach 3 Runden der Selektion isolierten wir T8 (Tabelle 1), einen Taq-Klon mit einer 11-fach längeren Halbwertszeit bei 97,5°C als das bereits thermostabile wildtypische Taq-Enzym (Tabelle 2), was T8 zum hitzestabilsten Mitglied der beschriebenen Pol I-Familie macht (Die Klone wurden mittels eines PCR-Assays durchgemustert und markiert. Kurz dargestellt, wurden 2 μl an induzierten Zellen zu 30 μl PCR-Mix hinzugegeben, und die Amplifikation eines 0,4 kb-Fragments wurde unter Selektionsbedingungen (z.B. einer Steigerung der Mengen von Heparin) gemessen). Die Hitzestabilität und Heparinresistenz von gereinigten, mit His-Tag versehenen Wildtyp-Klonen und mutanten Taq-Klonen wird bestimmt wie in Lawyer R. T. et al., PCR Methods Appl. 2, 275–287 (1993); Lawer et al., J. Biol. Chem 264, 6427–37 (1989) beschrieben, unter Verwendung aktivierter Lachssperma-DNA und normalisierter Enzymkonzentrationen. Die Mutationen, die T8 (und der Mehrzahl weniger thermostabiler Mutanten) Hitzestabilität verleihen, konzentrieren sich in der 5'-3'-Exonuklease-Domäne (Tabelle 1). Tatsächlich zeigen Trunkierungsvarianten der Taq-Polymerase (F. C. Lawyer et al., (1993) PCR Methods Appl 2, 275–87; W. M. Barnes, (1992) Gene 112, 29–35), denen diese Exonuklease-Domäne fehlt, eine verbesserte Thermostabilität, was nahelegt, dass diese weniger hitzestabil als die Hauptpolymerasedomäne sein könnte. Die niedrigere Hitzestabilität der Exonukleasedomäne kann funktionelle Signifikanz besitzen (z.B. eine Notwendigkeit einer größeren Flexibilität widerspiegeln), da die stabilisierenden Mutationen in T8 die Exonukleaseaktivität zu reduzieren scheinen (etwa 5-fach) (5'-3'-Exonuklease-Aktivität wird im wesentlichen bestimmt wie in Y. Xu, et al., J Mol Biol 268, 284–302 (1997), jedoch in 1 × Taq-Puffer mit 0,25 mM dNTPs und dem 22-Mer-Oligonukleotid von Y. Xu, et al., J Mol Biol 268, 284–302 (1997), bei 5'-Markierung mit Cy5 (Amersham). Die Stationärzustands-Kinetik wird gemessen wie in A. H. Polesky, T. A. Steitz, N. D. Grindley, C. M. Joyce, J Biol Chem 265, 14579–91 (1990), unter Verwendung des homopolymeren Substrats poly(dA)₂₀₀ (Pharmacia) und von oligo(dT)₄₀-Primer bei 50°C (zumindest bei niedriger Temperatur).
Tabelle 1: Eigenschaften selektierter Klone. Fettgedruckte Klone stehen durch die unterstrichenen Mutationen in Beziehung zu einander. Die Reihenfolge der Klone ist im Bezug auf wt Taq festgelegt worden.

* wie bestimmt durch PCR (relativ gegenüber Taq_wt), bei 97,5°C
** wie beurteilt durch PCR (relativ gegenüber Taq_wt)

Zwei Bibliotheken von Taq-Polymerase-Varianten, die unter Verwendung fehleranfälliger PCR erzeugt wurden, werden in E. coli exprimiert (Bibliothek L1, 8 × 10⁷ Klone, Bibliothek L2 2 × 10⁷ Klone; siehe Beispiel 5) und emulgiert wie zuvor. Die erste Runde der PCR wird ausgeführt, um aktive Varianten unter Verwendung des Standard-Taq-Polymerase-Thermocycling-Profils, das oben dargestellt ist, anzureichern. Angereicherte Amplifikationsprodukte werden gereinigt und erneut kloniert, um Bibliotheken zu erzeugen, die aktive Varianten umfassen (L1*, L2*, ca. 10⁶ Klone für jede Bibliothek). Eine Durchmusterung der L1*- bzw. L2*-Bibliothek zeigte, dass 81% bzw. 77% der zufällig gepickten Klone aktiv waren.
Es wird Selektionsdruck auf die Bibliotheken L1* und L2* während der nächsten Runde der PCR angewendet, indem man die Emulsionen bei 99°C für 6 oder 7 Minuten vor dem normalen PCR-Zyklus präinkubiert. Unter diesen Bedingungen verliert die wildtypische Taq-Polymerase ihre gesamte Aktivität. Amplifizierte Produkte werden angereichert und kloniert wie oben, und ein 96-Well-Expressions-Screen wird verwendet, um unter normalen PCR-Bedingungen auf aktive Varianten zu selektieren. Dies erbrachte 7 Klone aus der L2*-Bibliothek und 10 Klone aus der L1*-Bibliothek. Diese werden dann unter Verwendung eines Temperaturgradienten-PCR-Blocks auf er höhte Thermostabilität hin durchgemustert, mit einer 5-minütigen Präinkubation bei Temperaturen von 94,5 bis 99°C vor der Standard-Zyklusbehandlung. Wie durch Gelelektrophorese eingeschätzt, sind 5 Klone von jeder Bibliothek mit einer gesteigerten Thermostabilität im Vergleich zum Wildtyp vorhanden. Diese Mutanten sind in der Lage, das 320 bp große Ziel nach der Präinkubation bei 99°C für 5 Minuten effizient zu amplifizieren. Das wildtypische Enzym besitzt keine erkennbare Aktivität nach der Präinkubation bei Temperaturen oberhalb von 97°C für 5 Minuten oder mehr.
Beispiel 14. Assay auf Thermostabilität der Polymerase
Assays der Hitzeinaktivierung von WT und gereinigten, mit His-Tag versehenen Polymerasen werden in einem Standard-PCR-Gemisch von 50 μl, umfassend 1 × SuperTaq-Puffer (HT-Biotech), 0,5 ng Plasmid-DNA-Matrize, 200 μM jeweils von dATP, dTTP und dGTP, den Primern 3 und 4 (10 μM) und Polymerase (etwa 5 nM), durchgeführt. Die Reaktionsgemische werden mit Öl überschichtet und bei 97,5°C inkubiert, wobei nach definierten Intervallen 5 μl-Aliquots entnommen und auf Eis gelagert werden. Diese Aliquots werden in einem 50 μl-Aktivitäts-Reaktionspuffer, enthaltend 25 mM N-tris[Hydroxymethyl-3-amino-propansulfonsäure (TAPS) (pH 9,5), 1 mM β-Mercaptoethanol, 2 mM MgCl₂, jeweils 200 μM von dATP, dTTP und dGTP, 100 μM [α-³²P]dCTP (0,05 Ci/mmol) und 250 μg/ml aktivierter Lachssperma-DNA-Matrize, getestet. Die Reaktionen werden für 10 Minuten bei 72°C inkubiert und durch die Zugabe von EDTA (25 mM Endkonzentration) abgestoppt. Die Reaktionsvolumina werden mit Lösung S (2 mM EDTA, 50 μg/ml an gescherter Lachssperma-DNA) bis auf 500 μl aufgefüllt, und es werden 500 μl 20% TCA (v/v)/2% Natriumpyrophosphat (v/v) hinzugegeben. Nach 20 Minuten Inkubation auf Eis werden die Reaktionsansätze auf 24 mm GF/C-Filter (Whatman) appliziert. Nicht eingebaute Nukleotide werden durch 3 Waschschritte mit 5% TCA (v/v), 2% Natriumpyrophosphat (v/v), gefolgt von zwei Waschschritten mit 96% Ethanol (v/v), entfernt. Die getrockneten Filter werden in Szintillationsgefäßen, enthaltend Ecoscint A (National Diagnostics) ausgezählt. Der Assay wird unter Verwendung einer bekannten Menge der markierten dCTP-Lösung (Auslassen der Waschschritte) kalibriert.
Beispiel 15. Gesteuerte Evolution von Taq-Polymerase-Varianten mit gesteigerter Aktivität in Gegenwart des Inhibitors Heparin
Wie oben angezeigt, können die Verfahren unserer Erfindung auch dafür verwendet werden, um Resistenz gegenüber einem Inhibitor der Enzymaktivität zu entwickeln. Heparin ist ein in breitem Maße vernvendetes Antikoagulans, jedoch außerdem ein potenter Inhibitor der Polymeraseaktivität, was Schwierigkeiten bei der PCR-Amplifikation aus klinischen Blutproben verursacht (J. Satsangi, D. P. Jewell, K. Welsh, M. Bunce, J. I. Bell, Lancet 343, 1509–10 (1994)). Obwohl Heparin durch verschiedene Prozeduren aus den Blutproben entfernt werden kann, kann dies sowohl kosten- als auch zeitaufwändig sein. Die Verfügbarkeit einer Heparin-kompatiblen Polymerase würde daher die Cha rakterisierung therapeutisch wichtiger Amplikons erheblich verbessern und die Notwendigkeit einer möglicherweise kostenmäßig nicht vertretbaren Heparinase-Behandlung der Proben (Taylor A. C. (1997) Mol. Ecol 6, 383) aufheben.
Die L1*- und L2*-Bibliotheken werden kombiniert und in Emulsion auf Polymerasen selektiert, die in bis zu 0,16 Unit Heparin pro μl aktiv sind. Nach einer einzigen Runde wurden 5 aktive Klone in dem 96-Well-PCR-Screen unter Einbeziehung einer Reaktion von 0,1 Unit/30 μl isoliert, bei der der Wildtyp keine Aktivität zeigt. Die Titration zeigt, dass 4 dieser Klone in der bis zu 4-fachen Menge an Heparin, die den Wildtyp inhibiert, aktiv sind (0,06 Unit/30 μl gegenüber 0,015 Unit/30 μl). Der andere Klon ist aktiv in der bis zu 8-fachen Menge an Heparin, die den Wildtyp inhibiert (0,12 Unit/30 μl gegenüber 0,015 Unit/30 μl).
Unter Verwendung einer Selektion in Gegenwart steigender Mengen an Heparin isolierten wir H15, eine Taq-Variante, die in der PCR bei dem bis zu 130-fachen der inhibitorischen Konzentration von Heparin (Tabelle 2) funktionell ist. Interessanter Weise sind die Heparin-Resistenz verleihenden Mutationen ebenfalls im Cluster angehäuft, in diesem Fall in der Base der „Finger- und Daumen"-Polymerase-Subdomänen, Regionen, die an der Bindung von Duplex-DNA beteiligt sind. Tatsächlich, urteilend von einer kürzlich erstellten hochauflösenden Struktur eines Taq-DNA-Komplexes (Y. Li, S. Korolev, G. Waksman, EMBO J 17, 7514–25 (1998)) bilden vier der sechs Reste, die in H15 mutiert sind (K540, D578, N583, M747) einen direkten Kontakt entweder mit dem Matrizen- oder dem Produktstrang aus (wie in 7 gezeigt). H15-Mutationen scheinen neutral zu sein (oder sich gegenseitig zu kompensieren), soweit es die Affinität für die Duplex-DNA betrifft (während sie vermutlich die Affinität für Heparin reduzieren) (Tabelle 2). Die K_D für DNA wird unter Verwendung von BIAcore bestimmt. Kurz gesagt, wird das 68-mer, das in M. Astake, N. D. Grindley, C. M. Joyce, J Biol Chem 270, 1945–54 (1995) verwendet wurde, am 5'-Ende biotinyliert und an einen SA-Sensorchip gebunden, und die Bindung von Polymerase wird in 1 × Taq-Puffer (siehe oben) bei 20°C gemessen. Die relativen K_D-Werte werden durch einen PCR-Einstufungstest unter Verwendung abnehmender Mengen an Matrize eingeschätzt. Die genaue molekulare Basis der Heparin-Inhibition ist nicht bekannt, jedoch sprechen unsere Ergebnisse stark für überlappende (und vermutlich sich gegenseitig ausschließende) Bindungsstellen für DNA und Heparin in der aktiven Stelle der Polymerase nahe, was die Idee unterstützt, dass Heparin seinen inhibitorischen Effekt ausübt, indem es Duplex-DNA imitiert und mit dieser um die Bindung an der aktiven Stelle konkurriert. Es ist unsere Beobachtung, dass die Heparin-Inhibition unter Bedingungen von im Überschuss vorliegender Matrizen-DNA merklich reduziert wird (siehe hierzu: Durchmusterung und Einstufung der Klone durch einen PCR-Assay). Kurz dargestellt, werden 2 μl an induzierten Zellen zu 30 μl PCR-Gemisch hinzu gegeben, und die Amplifikation eines 0,4 kb-Fragments wird unter Selektionsbedingungen (z.B. steigende Mengen an Heparin) getestet. Die Thermostabilität und Heparin-Resistenz der gereinigten, mit His-Tag versehenen wildtypischen und mutanten Taq-Klone wird bestimmt wie beschrieben in F. C. Lawyer et al., PCR Methods Appl 2, 275–87 (1993); F. C. Lawyer et al., J Biol Chem 264, 6427– 37 (1989), unter Verwendung aktivierter Lachssperma-DNA und normalisierter Enzymkonzentrationen (Tabelle 2), was mit dieser Hypothese konsistent zu sein scheint. Tabelle 2: Eigenschaften selektierter Taq-Klone

* kommerzielle Taq-Präparation (HT Biotechnology), ** mit N-terminalem His₆-Tag, gemessen mittels CTP³²-Einbau in Lachssperma-DNA, *** kein Tag, gemessen durch PCR-Assay, ^✝ Taq, veröffentlichter Wert: 1 nM^–1 (1), Klenow (Cambio), 4 nM^–1, ^‡ E. coli DNA Pol I, veröffentlichter Wert: 3,8 s^–1 (A. H. Polesky, T. A. Steitz, N. D. Grindley, C. M. Joyce, J Biol Chem 265, 14579–91 (1990)), ^§ bezogen auf Taq_wt, gemessen durch mutS ELISA (Genecheck) (P. Debbie, et al., Nucleic Acids Res 25, 4825–4829 (1997). Pfu (Stratagene): 0,2.

Beispiel 16. Matrizen-Evolution bei Emulsionsselektion
Ein klassisches Ergebnis bei in vitro-Replikationsversuchen ist eine Anpassung der Matrizensequenz an eine schnellere Replikation (S. Spiegelman, Q. Rev. Biophys. 4, 213–253 (1971)). Tatsächlich beobachten wir auch Matrizenevolution durch stille Mutationen. Anders als die codierenden Mutationen (AT zu GC vs. GC zu AT/29 vs. 16) zeigen nicht codierende Mutationen eine erstaunliche Neigung (AT zu GC vs. GC zu AT/0 vs. 42) in Richtung eines verringerten GC-Gehalts, wie allgemeinen angenommen zur Förderung einer effizienteren Replikation durch Erleichterung der Strangauftrennung und der Destabilisierung von Sekundärstrukturen. Jenseits der Selektion auf Anpassung kann unser Verfahren auch auf Anpassungsfähigkeit hin selektieren; d.h. die Polymerasen können sich in Richtung einer optimalen, wahrscheinlich höheren Rate der Selbstmutation entwickeln (M. Eigen, Naturwissenschaften 58, 465–523 (1971)). Tatsächlich können unter adaptivem Stress Mutationen spontan in asexuellen Bakterienpopulationen entstehen (F. Taddei, et al., Nature 387, 700–2 (1997); P. D. Sniegowski, P. J. Gerrish, R. E. Lenski, Nature 387, 703–5 (1997)). In Analogie könnte argumentiert werden, dass unser Verfahren Polymerasevarianten favorisieren könnte, die fehleranfälliger sind und somit zu einer schnelleren adaptiven Evolution befähigt sind. Jedoch zeigte keine der selektierten Polymerasen gesteigerte Fehlerraten (Tabelle 2). Das Eliminie ren von Rekombination und die Verringerung der Mutationslast während unseres Verfahrenszyklus können den Selektionsdruck in Richtung fehleranfälligerer Enzyme verstärken.
Beispiel 17. Assay für Heparintoleranz von Polymerasen
Die Heparintoleranz von Polymerasen wird unter Verwendung eines ähnlichen Tests wie dem auf thermische Stabilität hin getestet. Heparin wird seriell in dem Aktivitätspuffer verdünnt (0 bis 320 Unit/45 μl), und 5 μl an Enzym in dem Standard-PCR-Gemisch oben werden hinzugegeben. Die Reaktionen werden inkubiert und der Einbau wird wie oben getestet.
Beispiel 18. Selektion von Taq-Varianten mit gesteigerter Fähigkeit zur Verlängerung ausgehend von einer 3'-fehlgepaarten Base
Die verwendeten Primer sind Primer 9 (LMB388ba5WA) und Primer 10 (8fo2WC). Diese Primerkombination präsentiert den Polymerasevarianten eine 3'-Purin-Purin-Fehlpaarung (A-G) und eine 3'-Pyrimidin-Pyrimidin-Fehlpaarung (C-C). Dies sind die Fehlpaarungen, die von Taq-Polymerase am wenigsten toleriert werden (Huang et al., 1992, Nucleic Acids Res 20 (17): 4567–73), und die nur schwach verlängert werden.
Das Selektionsprotokoll ist im Wesentlichen dasselbe wie zuvor, mit der Ausnahme, dass diese beiden Primer in der Emulsion verwendet werden. Die Verlängerungszeit wird außerdem auf 8 Minuten erhöht. Nach zwei Runden der Selektion werden 7 Klone isoliert, die eine bis zu 16-fache Zunahme bei der Verlängerung der Fehlpaarung zeigen, wie beurteilt durch einen PCR-Einstufungstest (siehe Beispiel 2: Verwendung der Primer 5 und 11), mit Standardisierung der Aktivität unter Verwendung des normalen Primerpaars. Diese Klone werden nachfolgend wieder in die ursprünglichen L1*- und L2*-Bibliotheken gemischt, dies zusammen mit wildtypischer Taq, und der Selektionsprozess wird wiederholt, jedoch mit einer geringeren Anzahl von Zyklen (10) bei der CSR-Reaktion. Diese Selektionsrunde erbrachte zahlreiche Klone, von denen die besten eine bis zu 32-fache Steigerung der Fehlpaarungs-Verlängerung zeigten, wie durch PCR (siehe Beispiel 2) unter Verwendung der Primer 5 und 11 beurteilt.
Der Einbau eines nicht korrekten Basenpaars durch Taq-Polymerase kann den Polymerisationsprozess zum Stillstand bringen, da bestimmte Fehlpaarungen (siehe oben) von Taq nur schwach verlängert werden. Als solche kann Taq-Polymerase alleine nicht bei der Amplifikation großer (> 6 kb) Matrizen verwendet werden (Barnes). Dieses Problem kann überwunden werden, indem man Taq mit einer Polymerase supplementiert, die eine 3'-5'-Exonuklease-Aktivität besitzt (z.B. Pfu-Polymerase), die nicht korrekt eingebaute Basen entfernt und eine Wiederaufnahme der Polymerisation durch Taq erlaubt. Die obigen Klone werden daher auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die Amplifikation großer DNA-Fragmente („long-distance PCR") aus einer Lambda-DNA-Matrize durchzufüh ren, da hier für den Einbau einer unkorrekten Base nicht erwartet wird, dass er die Polymerisation anhält. Unter Verwendung der Primer 12 (LBA23) und 13 (LFO46) (je 1 μM) in einer 50 μl-PCR-Reaktion, enthaltend 3 ng an Lambda-DNA (New England Biolabs), dNTPs (0,2 mM), 1 × PCR-Puffer (HT Biotech), ist der Klon M1 befähigt, ein 23 kb-Fragment zu amplifizieren, wobei er 20 Wiederholungen eines 2-stufigen Amplifikationszyklus (94°C, 15 Sekunden; 68°C, 25 Minuten) verwendet. Die wildtypische Polymerase ist bei Verwendung des gleichen Reaktionspuffers nicht befähigt, Produkte oberhalb von 13 kb zu verlängern. Kommerzielle Taq (Perkin Elmer) kann unter Verwendung des vom Hersteller gelieferten Puffers nicht über 6 kb hinaus verlängern.
Beispiel 19. Selektion unter Verwendung selbsttragender Sequenzreplikation (3SR)
Um die Machbarkeit von 3SR in einer Emulsion zu demonstrieren, wird das Taq-Polymerasegen zunächst ausgehend von einem Elternplasmid (siehe Beispiel 1) PCR-amplifiziert, wobei ein Vorwärts-Primer verwendet wird, der so gestaltet ist, dass er einen T7-RNA-Polymerase-Promotor in das PCR-Produkt einbaut. Ein 250 μl 3SR-Reaktionsgemisch, umfassend das modifizierte Taq-Gen (50 ng), 180 Unit T7-RNA-Polymerase (USB, 63 Unit reverse Transkriptase (HT-Biotech), rNTPs (12,5 mM), dNTPs (1 mM), MgCl₂ (10 mM), Primer Taqba2T7 (Primer 12; 125 pmol), Primer 88fo2 (Primer 4; 125 pmol), 25 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl und 2,0 mM DTT, wird hergestellt. 200 μl hiervon werden unter Verwendung des Standardprotokolls emulgiert. Nach verlängerter Inkubation bei Raumtemperatur wird beobachtet, dass die Amplifikation des Taq-Gens (das eine Modellgengröße darstellt) in der Emulsion stattfindet, wie durch Standard-Gelelektrophorese beurteilt.
Um die Bandbreite des Verfahrens weiter auszudehnen, wird die 3SR-Reaktion in einem in vitro-Transkriptions/Translations-Extrakt (EcoPro, Novagen) durchgeführt. Das inaktive Taq-Gen (siehe Beispiel 1) wird unter Verwendung der Primer 2 (TaqfoSal) und 12 (Taqba2T7) aus dem Elternplasmid amplifiziert. Es werden 100 ng (etwa 1 × 10¹⁰ Kopien) hinzugegeben, um 100 μl der wässrigen Phase auszubilden, die EcoPro-Extrakt (70 μl), Methionin (4 μl), reverse Transkriptase (84 Unit, HT-Biotech), Primer 12 (Taqba2T7, 2 μM), Primer 13 (TaqfoLMB2, 2 μM) und dNTPs (250 μM) enthält. Die wässrige Phase wird unter Verwendung des Standard-Protokolls in eine 400 μl Ölphase emulgiert. Nach der Inkubation bei 37°C über Nacht, wird die Emulsion unter Verwendung des Standard-Protokolls extrahiert, und die wässrige Phase wird unter Verwendung einer PCR-Reinigungssäule (Qiagen) weiter gereinigt. Die vollständige Entfernung der Primer wird sichergestellt durch die Behandlung von 5 μl des Säuleneluats mit 2 μl ExoZap-Reagenz (Stratagene). DNA, die in der Emulsion durch 3SR erzeugt wurde, wird unter Verwendung von 2 μl behandeltem Säuleneluat in einer ansonsten nach Standard ablaufenden 50 μl-PCR-Reaktion unter Verwendung von 20 Zyklen der Amplifikation mit den Primern 6 (LMB, ref 2) und 12 (Taqba2T7) gerettet. Verglichen mit dem Hintergrund (der Kontrollreaktion, bei der die reverse Transkriptase bei der 3SR-Reaktion in der Emulsion weggelassen wird), war eine intensivere Bande korrekter Größe zu sehen, wenn die Produkte unter Verwendung von Agarosegelelektrophorese sichtbar gemacht wurden. Die 3SR-Reaktion kann daher in den Transkriptions-/Translationsextrakten ablaufen, was die gesteuerte Evolution von Mitteln erlaubt, die in den wässrigen Kompartimenten exprimiert werden.
Wildtypische Taq-Polymerase besitzt begrenzte reverse Transkriptase-Aktivität (Perler et al., (1996) Adv Protein Chem., 48, 377–435). Es ist auch bekannt, dass reverse Transkriptasen (z.B. HIV reverse Transkriptase, die sowohl Aktivitäten der reversen Transkriptase als auch der Polymerase besitzt) erheblich fehleranfälliger sind als andere Polymerasen. Dies wirft die Möglichkeit auf, dass eine fehleranfälligeere Polymerase (bei der eine erhöhte Toleranz für ein nicht zugehöriges Substrat erkennbar ist) eine verstärkte reverse Transkriptase-Aktivität besitzen könnte. Die Gene für die Taq-Varianten M1, M4, ebenso wie die inaktive Mutante, werden aus den Elternplasmiden amplifiziert, wobei die Primer 12 (Taqba2T7) und 2 (TaqfoSal verwendet werden und die 3SR-Reaktion wie oben in dem Transkriptions-/Translations-Extrakt (Novagen) ausgeführt wird, mit dem Unterschied, dass reverse Transkriptase nicht exogen hinzugegeben wird. Bei den Kontrollreaktionen wird Methionin aus dem Reaktionsgemisch weggelassen. Nach 3 Stunden Inkubation bei 37°C, wird die Reaktion wie oben behandelt, und die PCR wird unter Verwendung der Primer 6 und 12 durchgeführt, um die Produkte zu retten, die bei der 3SR-Reaktion synthetisiert wurden. Einer der getesteten Klone, Klon M4, ergab im Vergleich zu der Kontrollreaktion eine intensivere Bande korrekter Größe, wenn die Produkte unter Verwendung von Agarosegelelektrophorese sichtbar gemacht wurden. Es scheint daher so zu sein, dass Klon M4 ein gewisses Maß an reverser Transkriptase-Aktivität besitzt. Dieses Ergebnis zeigt, dass es möglich ist, funktionell aktive Replikasen in vitro zu exprimieren. In Verbindung mit der Selektion durch Kompartimentierung können neuartige Replikasen entwickelt werden.
Selektion von Mitteln, die die Replikaseaktivität modifizieren
Beispiel 19 und die folgenden Beispiele beschreiben, wie die Verfahren unserer Erfindung verwendet werden können, um ein Enzym zu selektieren, das an einem Stoffwechselweg beteiligt ist, dessen Endprodukt ein Substrat für die Replikase ist. Diese Beispiele zeigen ein Verfahren für die Selektion von Nukleosiddiphosphatkinase (NDP-Kinase), die die Übertragung einer Phosphatgruppe von ATP auf ein Desoxynukleosiddiphosphat katalysiert, um ein Desoxynukleosidtriphosphat (dNTP) zu erzeugen. Hier liefert das selektierbare Enzym (NDK) Substrate für die Taq-Polymerase, um das Gen, das für das Enzym codiert, zu amplifizieren. Dieses Selektionsverfahren unterscheidet sich von der kompartimentierten Selbstreplikation einer Replikase (CSR, Ghadessy und Holliger) dadurch, dass die Replikation ein gekoppelter Prozess ist, der die Selektion von Enzymen (Nukleinsäuren und Protein) erlaubt, die selber keine Replikasen sind. Bakterien, die NDK exprimieren (und deren Gen auf einem Expressionsvektor enthalten) werden mit deren Substrat (in diesem Fall dNDPs und ATP) und zusammen mit den anderen Reagenzien, die benötigt werden, um deren Am plifikation zu unterstützen (Taq-Polymerase, Primer, die für das ndk-Gen spezifisch sind und Puffer) co-emulgiert. Die Kompartimentierung in einer Wasser-in-Öl-Emulsion stellt die Segregation der einzelnen Bibliotheksvarianten sicher. Aktive Klone liefern die dNTPs, die für die Taq-Polymerase nötig sind, um das ndk-Gen zu amplifizieren. Varianten mit gesteigerter Aktivität liefern mehr Substrat für ihre eigene Amplifikation und somit korreliert die nach der Selektion vorliegende Kopienzahl mit der enzymatischen Aktivität in den Begrenzungen der Polymeraseaktivität. Zusätzlicher Selektionsdruck entsteht aus der minimalen Menge an dNTPs, die für die Polymeraseaktivität benötigt werden, somit werden Klone mit gesteigert katalytischer Aktivität auf Kosten der schwach aktiven Varianten bevorzugt amplifiziert (Selektion für k_cat ebenso wie für K_m).
Durch Aufzeigen, dass wir ein Enzym entwickeln können, dessen Produkt in die Polymerasereaktion eingespeist wird, hoffen wir, schließlich multiple Enzyme zusammen zu entwickeln, die durch einen Stoffwechselweg verbunden sind, bei dem das Produkt eines Enzyms das Substrat für das nächste ist. Diversität könnte in zwei oder mehr Gene eingeführt werden, und beide Gene können auf Plasmiden oder Phagen in denselben Expressionswirt co-transformiert werden. Wir hoffen darauf, kooperative Enzymsysteme zu entwickeln, die die Selektion auf die Synthese nicht-natürlicher Substrate und deren nachfolgenden Einbau in DNA ermöglichen.
Beispiel 20. Induzierte Expression von NDP-Kinase in Bakterienzellen
Ein pUC19-Expressionsplasmid, welches das EcoRI/HindIII-Restriktionsfragment mit dem offenen Leseraster der Nukleosiddiphosphatkinase aus Myxococcus xanthus enthält, wird kloniert. Das Plasmid wird aus einer Übernacht-Kultur präpariert und in den ndk-, pykA-, pykF-Stamm von E. coli QL1387 transformiert. Eine Übernachtkultur von OL1387/pUC19ndk wird in Gegenwart von Chloramphenicol (10 μg/ml Endkonzentration), Ampicillin (100 μg/ml Endkonzentration) und Glukose (2%) für 14–18 Stunden herangezogen. Die Übernachtkultur wird 1:100 in 2 × TY verdünnt, 10 μg/ml Chloramphenicol, 100 μg/ml Ampicillin und 0,1% Glukose. Die Zellen werden bis zu einer OD_600nm von 0,4 herangezogen und mit IPTG (1 mM Endkonzentration) für 4 Stunden bei 37°C induziert. Nach der Proteininduktion werden die Zellen einmal in SuperTaq-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 9, 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 1,5 mM MgCl₂, HT Biotechnology) gewaschen und in 1/10 Volumen des gleichen Puffers resuspendiert. Die Anzahl der Zellen wird durch spektrophotometrische Analyse mit der Nährung OD₆₀₀ 0,1 = 1 × 10⁸ Zellen/ml quantifiziert.
Beispiel 21. Phosphoryltransfer-Reaktion in wässrigen Kompartimenten in einer Emulsion
Um festzustellen, ob Desoxynukleosiddiphosphate durch NDP-Kinase in Taq-Puffer phosphoryliert werden können, wird eine Standard-PCR-Reaktion durchgeführt, bei der dNTPs durch dNDPs und ATP, ein Phosphat-Donormolekül, ersetzt werden. Nukleosiddiphosphatkinase wird von E. coli QL1387 (einen für ndk und Pyruvat-Kinase defizienten Stamm von E. coli), wie im vorherigen Beispiel beschrieben, exprimiert. Die Zellen werden mit dem PCR-Reaktionsgemisch gemischt.
Die gewaschenen Zellen werden zu einem PCR-Reaktionsgemisch (etwa 8e5 Zellen/μl Endkonzentration) mit SuperTaq-Puffer, 0,5 μM Primern, 100 μM von jedem dNDP, 400 μM ATP, SuperTaq-Polymerase (0,1 Unit/μl Endkonzentration, HT Biotechnology) hinzugeben.
Nach dem Aufbrechen der Zellen bei 65°C für 10 min, dem Inkubieren des Reaktionsgemischs für 10 Minuten bei 37°C und Thermocycling (15 Zyklen mit 94°C 15 sec, 55°C 30 sec, 72°C 1 min 30 sec) wurden die amplifizierten Produkte auf einem Standard 1,5%-Agarose/TBE-Gel, das mit Ethidiumbromid (Sambrook) gefärbt wurde, sichtbar gemacht. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass die exprimierte NDP-Kinase dNDPs phosphorylieren kann, um Taq-Polymerase mit Substraten für die PCR-Amplifikation des ndk-Gens zu versorgen.
Das Experiment wird wiederholt, und zwar mit dem zusätzlichen Schritt, dass das Reaktionsgemisch mit Mineralöl und Detergens gemäß obiger Beschreibung emulgiert wird. Es wird herausgefunden, dass NDP-Kinase in den wässrigen Kompartimenten einer Emulsion aktiv ist.
Beispiel 22. Kompartimentierung von NDK-Varianten durch Emulgierung
Das ursprüngliche Emulsionsgemisch erlaubte während des Thermocyclings die Diffusion kleiner Moleküle zwischen den Kompartimenten. Jedoch, durch Anpassen des Wasser-zu-Öl-Verhältnisses und durch Minimieren des Thermocycling-Profils, wird der Austausch von Produkt und Substrat zwischen den Kompartimenten minimiert, was in einer festeren Verbindung von Genotyp zu Phänotyp resultiert. Wenn es gegeben ist, dass die Diffusionsraten durch Modifizieren des Emulsionsgemisches kontrolliert werden können, kann es möglich sein, die Pufferbedingungen nach der Emulgierung anzupassen, was möglicherweise eine größere Kontrolle der Selektionsbedingungen erlaubt (d.h. Einstellen des pH durch die Zugabe von Säure oder Base oder Start/Stop-Reaktionen durch die Zugabe von Substraten oder Inhibitoren).
150 μl an PCR-Reaktionsgemisch (SuperTaq-Puffer, 0,5 μM von jedem Primer, 100 μM von jedem dNDP, 400 μM ATP, 0,1 Unit/μl Taq-Polymerase, 8 × 10⁵ Zellen/μl von QL1387/ndk) werden in Gegenwart von 4,5% v/v Span 80, 0,4% v/v Tween 80 und 0,05% v/v Triton X-100 tropfenweise (1 Tropfen/5 sec) unter konstantem Rühren in einem 2 ml-Rundboden-Biofreeze-Gefäß (Corning) zu 450 μl Ölphase (Mineralöl) hinzugeben. Nach Zugabe der wässrigen Phase wird das Rühren für weitere 5 Minuten fortgesetzt. Die Emulsionsreaktionen werden in dünnwandigen PCR-Röhrchen aliquotiert (100 μl) und wie oben angezeigt einer Thermocycling-Behandlung unterzogen.
Die Wiedergewinnung der amplifizierten Produkte nach der Emulgierung wird wie folgt durchgeführt. Nach dem Thermocycling werden die Produkte durch eine Extraktion mit 2 Volumina Diethylether wiedergewonnen, gevortext und für 10 Minuten in einer Tisch-Mikrozentrifuge zentrifugiert. Die Amplifikationsprodukte werden analysiert wie zuvor.
Beispiel 23. Minimieren von Hintergrund-Kinase-Aktivität
Die Niveaus an Hintergrund-Kinase-Aktivität werden bestimmt durch Emulgieren von E. coli TG1-Zellen in Taq-Puffer, mit Substraten wie oben beschrieben. Es wird herausgefunden, dass native Nukleosiddiphosphatkinase aus E. coli nach der initialen Denaturierung genug Aktivität beibehält, um in unserem Test eine signifikante Kinaseaktivität bereitzustellen. Das pUC19-Expressionsplasmid, das das ndk-Gen enthält, wird in einen ndk-defizienten Stamm von E. coli (QL1387) transformiert. Im Vergleich zu einer katalytischen Knockout-Mutante von mx ndk (H117A) wird die Hintergrund-Kinase-Aktivität in unserem Assay als vernachlässigbar bestimmt (die amplifizierten Produkte konnten durch Agarosegelelektrophorese nicht sichtbar gemacht werden), wenn ndk von dem Knockoutstamm exprimiert wurde.
Beispiel 24. Aufrechterhaltung der Genotyp-Phänotyp-Verknüpfung in der Emulsion
Eine katalytische Knock out-Mutation (NDK H117A) von NDP-Kinase wird mit wildtypischer NDP-Kinase in gleichen Mengen co-emulgiert. Die inaktive Mutante von ndk wird über ein kleineres Amplifikationsprodukt unterschieden, da die 5'- und 3'-Regionen, die das offene Leseraster stromabwärts von den Stellen der Primerreaktion flankieren, bei der Konstruktion der Knockout-Mutante entfernt werden. Unsere Emulgierungsprozedur ergibt eine vollständige Ausrichtung in Richtung der Amplifikation der aktiven Kinase, wie bestimmt durch Agarosegelelektrophorese.
Beispiel 25. Verfahren zur parallelen Genotypisierung heterogener Zellpopulationen
Der Ansatz beinhaltet eine Kompartimentierung der fraglichen Zellen in der Emulsion (siehe WO 93/03151) zusammen mit PCR-Reagenzien etc. und Polymerase. Anstatt nun Gene, die von einer Zelle stammen, durch PCR-Zusammenbau zu verbinden, werden ein (oder mehrere) biotinylierte Primer sowie mit Streptavidin (oder irgendeinem anderen geeigneten Mittel, um Primer an Beads zu binden) beschichtete Polystyrol-Beads verwendet. Somit werden die PCR-Fragmente aus einer einzigen Zelle auf ein einziges Bead übertragen. Die Beads werden vereint, unter Verwendung fluoreszent markierter Sonden (wie beschrieben für die „digitale PCR") auf Anwesenheit einer bestimmten Mutation oder eines Allels hin überprüft und durch FACS ausgezählt. Multiplex-PCR erlaubt die simultane Überprüfung von 10 oder eventuell mehr Markern. Einzelne Beads können ebenfalls für die Sequenzierung sortiert werden.
Die Anwendungen beinhalten z.B. die Diagnose symptomfreier Tumore, die von der Detektion einer sehr kleinen Anzahl mutanter Zellen in einem großen Überschuss normaler Zellen abhängen. Der Vorteil dieses Verfahrens gegenüber der Zellfärbung ist der Durchsatz. Es können potentiell 10⁸–10⁹ Zellen gleichzeitig geprüft werden.
Beispiel 25. Short-patch-CSR
Das vorliegende Beispiel bezieht sich auf die Selektion von Polymerasen mit niedriger katalytischer Aktivität oder Prozessivität. Die kompartimentierte Selbstreplikation (CSR), wie beschrieben, ist ein Verfahren zum Selektieren von Polymerasevarianten mit gesteigerter Adaption an bestimmte Selektionsbedingungen. Mutanten mit gesteigerter katalytischer Aktivität besitzen einen Selektionsvorteil gegenüber solchen, die unter den Selektionsbedingungen weniger aktiv sind. Jedoch ist es für viele Zielsetzungen der Selektion (z.B. veränderte Substratspezifität) wahrscheinlich, dass die Zwischenprodukte entlang des evolutionären Wegs zu einem neuen Phänotyp eine verringerte katalytische Aktivität besitzen. Beispielsweise ist es bei kinetischen Studien von E. coli DNA-Polymerase I so, dass Mutationen, wie etwa E710A, die Affinität und den Einbau von Ribonukleotiden auf Kosten niedrigerer katalytischer Raten und einer geringeren Affinität für wildtypische Substrate (Desoxyribonukleotide) steigerten (F. B. Perler, S. Kumar, H. Kong, Adv. in Prot. Chem. 48, 377–430 (1996)). Die korrespondierende Mutante von Taq-DNA-Polymerase I, E615A, kann Ribonukleotide effektiver in PCR-Produkte einbauen als wildtypische Polymerase. Jedoch ist sie bei Verwendung wildtypischer Substrate nur befähigt, kurze Fragmente und nicht das Taq-Gen voller Länge zu synthetisieren, wie über Agarosegelelektrophorese analysiert. Daher ist es schwierig, mittels CSR auf diese Mutation hin zu selektieren. Bei einem anderen Selektionsversuch, bei dem β-Glucuronidase zu einer β-Galactosidase hin entwickelt wird, wird der gewünschte Phänotyp nach mehreren Selektionsrunden erhalten, jedoch auf Kosten der katalytischen Aktivität. Es wird außerdem herausgefunden, dass selektierte Varianten in den anfänglichen Selektionsrunden befähigt sind, die Umsetzung mehrerer verschiedener Substrate, die von keinem der Elternenzyme angenommen werden, zu katalysieren, jedoch bei viel niedrigeren katalytischen Raten (T. A. Steitz, J Biol Chem 274, 17395–8 (1999)).
Um das Problem anzugehen, befähigt zu sein, auf Polymerasevarianten mit niedriger katalytischer Aktivität oder Prozessivität, wie sie entlang eines evolutiven Weges hin zu einem gewünschten Phänotyp vorkommen können, zu selektieren, wird eine Variante der CSR verwendet, bei der nur eine kleine Region (ein „Flicken" bzw. „patch") des untersuchten Gens einer Zufallsveränderung unterzogen und repliziert wird. Diese Technik wird als „Short-patch-CSR (spCSR)" bezeichnet. spCSR erlaubt es auch weniger aktiven oder prozessiven Polymerasen bei einer Selektionsrunde nach wie vor angereichert zu werden, indem sie den Selektionsvorteil, der der hochaktiven und prozessiven Mutanten gegeben wird, mindert. Dieses Verfahren erstreckt sich auch auf das zuvor beschriebene Verfahren der kompartimentierten Selbstreplikation, jedoch, da nicht das gesamte Gen repliziert wird, ist das „Short-patch-Verfahren" z.B. auch dafür nützlich, spezifische Domänen unabhängig vom Rest des Proteins zu untersuchen.
Es gibt viele Wege, um eine lokalisierte Diversität in ein Gen einzuführen; hierunter sind fehleranfällige PCR (unter Verwendung von Mangan oder synthetischen Basen, wie oben für die Taq-Polymerase-Bibliothek beschrieben), DNA-Shuffling (C. A. Brautigam, T. A. Steitz, Curr Opin Struct Biol 8, 54–63 (1998); Y. Li, S. Korolev, G. Waksman, EMBO J 17, 7514–25 (1998), Kassettenmutagenese (E. Bedford, S. Tabor, C. C. Richardson, Proc Natl Acad Sci USA 94, 479–84 (1997)), über degenerierte Oligonukleotide gesteuerte Mutagenese (Y. Li, V. Mitaxov, G. Waksman, Proc Natl Acad Sci USA 96, 9491–6 (1999); M. Suzuki, D. Baskin, L. Hood, L. A. Loeb, Proc Natl Acad Sci USA 93, 9670–5 (1996)) und dessen Varianten, z.B. „Sticky Feet-Mutagenese" (J. L. Jestin, P. Kristensen, G. Winter, Angew. Chem. Int. Ed. 38, 1124–1127 (1999)), und Zufallsmutagenese durch Amplifikation von ganzem Plasmid (T. Oberholzer, M. Albrizio, P. L. Luisi, Chem Biol. 2, 677–82 (1995)). Kombinatorisches Alanin-Scannning (A. T. Haase, E. F. Retzel, K. A. Staskus, Proc Natl Acad Sci USA 87, 4971–5 (1990)) kann verwendet werden, um Bibliotheksvarianten zu erzeugen, um zu bestimmen, welche Aminosäurereste funktionell wichtig sind.
Strukturdaten (M. J. Embleton, G. Gorochov, P. T. Jones, G. Winter, Nucleic Acids Res 20, 3831–7 (1992)), Sequenz-Alignment-Daten (D. S. Tawfik, A. D. Griffiths, Nat. Biotechnol. 16, 652–656 (1998)) und biochemische Daten aus Studien der DNA-Polymerase I offenbaren Regionen des Gens, die an der Nukleotidbindung und Katalyse beteiligt sind. Mehrere mögliche Regionen, auf die abgezielt werden kann, beinhalten die Regionen 1–6, wie diskutiert in D. S. Tawfik, A. D. Griffith, Nat. Biotechnol. 16, 652–656 (1998)) (Die Regionen 3, 4 und 5 werden bei Taq-DNA-Polymerase I auch als Motiv A, B bzw. C bezeichnet). Andere mögliche Regionen, auf die man abzielen kann, wären diejenigen Regionen, die zwischen verschiedenen Spezies konserviert sind, diejenigen, bei denen die Strukturdaten implizieren, dass sie mit dem Nukleotidsubstrat in Kontakt treten oder dass sie an der Katalyse beteiligt sind, oder sich in der Nähe der aktiven Stelle oder einer anderen Region befinden, die für die Polymerasefunktion oder Substratbindung wichtig ist.
Während einer Selektionsrunde ist es für jede Bibliotheksvariante erforderlich, dass sie nur die Region der Diversität repliziert. Dies kann leicht erreicht werden, indem man bei einer PCR-Reaktion Primer bereitstellt, die die diversifizierte Region flankieren. Die CSR-Selektionen werden im wesentlichen durchgeführt, wie beschrieben. Nach der CSR-Selektion wird die kurze Region, die diversifiziert und repliziert worden ist, nun erneut in das Ausgangsgen (oder ein anderes genetisches Gerüst, z.B. eine Bibliothek von Mutanten des Elterngens, ein verwandtes Gen etc.) eingeführt, entweder unter Verwendung geeignet positionierter Restriktionsstellen oder von PCR-Rekombinationsverfahren, wie etwa PCR-Shuffling oder Quickchange-Mutagenese etc. Der spCSR-Zyklus kann viele Male wiederholt werden, und es können mehrere Regionen gleichzeitig oder itera tiv mit flankierenden Primern angesteuert werden, um einzelne Regionen entweder getrennt oder in einschließender Weise zu amplifizieren.
Um die Stringenz der Selektionen auf einer späteren Stufe zu erhöhen, lässt sich die spCSR einfach dadurch verstärken, dass man die Länge der replizierten Sequenz erhöht, wie definiert durch die flankierenden Primer, bis hin zur CSR voller Länge. Tatsächlich kann es bei einer Selektion auf Prozessivität z.B. nützlich sein, das replizierte Segment über das codierende Gen hinaus bis hin zum ganzen Vektor zu verlängern, indem man Strategien analog der iPCR (inverted PCR) verwendet.
Die spCSR kann Vorteile gegenüber der CSR voller Länge haben, nicht nur bei Betrachtung von Polymerasevarianten mit niedrigen Aktivitäten oder Prozessivitäten, sondern auch, wenn man abgegrenzte Regionen eines Proteins auf Mutierbarkeit hin untersucht, z.B. in Verbindung mit kombinatorischem Alanin-Scanning (A. T. Haase, E. F. Retzel, K. A. Staskus, Proc Natl Acad Sci USA 87, 4971–5 (1990)), um zu bestimmen, welche Aminosäurereste funktionell wichtig sind. Solche Informationen können für ein späteres Stadium nützlich sein, um semi-rationale Ansätze zu leiten, d.h. um Diversität gezielt in Reste und Regionen zu bringen, die nicht an der Kernaktivität der Polymerase beteiligt sind. Weiterhin kann die scCSR verwendet werden, um Polypeptidsegmente zwischen Polymerasen zu transplantieren (so wie bei Immunglobulin-CDR-Transplantierung). Ein einfacher Tausch von Segmenten kann aufgrund sterischer Kollisionen zunächst zu geringfügig aktiven Polymerasen führen und ein „Neuformen" erfordern, um die Segmente funktionell zu integrieren. Ein Neuformen kann erfolgen entweder unter Verwendung von CSR voller Länge (z.B. aus bestehenden Bibliotheken von Zufallsmutanten) oder mittels einer spCSR, die auf sekundäre Regionen abzielt (siehe „Vernier-Zone" in Antikörpern).
Die kurzen Stücke können außerdem sowohl am N- als auch am C-Terminus als Erweiterungen existierender Polymerasegensequenzen oder als interne Insertionen befindlich sein. Präzedenzfälle für solche den Phänotyp modifizierenden Erweiterungen und Insertionen kommen in der Natur vor. Beispielsweise sind sowohl eine C-terminale Erweiterung von T5 DNA-Pol als auch die Thioredoxin-Bindungsinsertion bei T7 DNA-Pol von entscheidender Bedeutung für die Prozessivität dieser Enzyme und erlauben es diesen, das große (> 30 kb) Genom des T-Phagen effizient zu replizieren. Für N- oder C-terminale Erweiterungen ist außerdem gezeigt worden, dass sie die Aktivität bei anderen Enzymen steigern.
Beispiel 26. CSR bei niedriger Temperatur unter Verwendung des Klenow-Fragments
Das Klenow-Fragment wurde aus genomischer DNA von E. coli in den Expressionsvektor pASK75 (ebenso wie bei Taq) kloniert und exprimiert im E. coli-Stamm DH5αZ1 (Lutz R. & Bujard H. (1997), Nucleic Acids Res 25, 1203). Die Zellen wurden gewaschen und in 10 mM Tris pH 7,5 re suspendiert. 2 × 10⁸ resuspendierte Zellen (20 μl) wurden zu 200 μl Niedrigtemperatur-PCR-Puffer (LTP) (Iakobashvili, R. & Lapidot, A. (1999), Nucleic Acids Res., 27, 1566) hinzugegeben und emulgiert wie beschrieben (Ghadessy et al. (2001), PNAS, 98, 4552). LTP bestand aus 10 mM Tris (pH 7,5), 5,5 M L-Prolin, 15% w/v Glycerol, 15 mM MgCl₂ + geeigneten Primern (da Prolin die Schmelztemperatur herabsetzt, müssen die Primer 40-mere oder länger sein) und dNTPs und wurde, wie beschrieben emulgiert. Die Zyklusbedingungen der niedrig temperierten PCR waren 70°C 10 min, 50× (70°C 30 sec, 37°C 12 min). Die wässrige Phase wurde wie beschrieben extrahiert, und die gereinigten Selektionsprodukte wurden erneut amplifiziert wie beschrieben (Ghadessy et al., (2001) PNAS, 98, 4552).
Zahlreiche Modifikationen und Variationen der beschriebenen Verfahren und des Systems der Erfindung werden Fachleuten ersichtlich sein, ohne dabei vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen. Obwohl die Erfindung im Zusammenhang mit spezifischen bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, sollte es sich verstehen, dass die Erfindung, wie sie beansprucht ist, nicht unangemessen auf solche spezifischen Ausführungsformen beschränkt werden soll. Tatsächlich sollen verschiedene Modifikationen der gewünschten Weisen zur Durchführung der Erfindung, die Fachleuten in der Molekularbiologie oder auf verwandten Gebieten ersichtlich sind, in den Schutzumfang der folgenden Ansprüche einbezogen sein.
Tabelle 3: In den Beispielen verwendete Primer-Sequenzen
SEQUENZEN Thermostabiler Klon T7-88: Nukleotidsequenz
Thermostabiler Klon T7-88: Aminosäuresequenz
Thermostabiler Klon T9: Nukieinsäuresequenz
Thermostabiler Klon T9: Aminosäuresequenz
Thermostabiler Klon T13: Aminosäuresequenz
Thermostabiler Klon 8 (T8): Nukleinsäuresequenz
Thermostabiler Klon 8 (T8): Aminosäuresequenz
Anmerkung: Die ersten beiden Aminosäuren am N-Terminus sind nicht sequenziert.
Heparin-resistenter Klon 94: Nukleinsäuresequenz
Heparin-resistenter Klon H94: Aminosäuresequenz
Anmerkung: N-terminale 5 Aminosäuren nicht bestimmt.
Heparin-resistenter Klon 15: Nukleinsäuresequenz
Heparin-resistenter Klon 15: Aminosäuresequenz
Anmerkung: Die N-terminalen 5-Aminosäuren sind nicht bestimmt.
Fehlpaarungs-Verlängerungs-Klon M1: Nukleinsäuresequenz
Fehlpaarungs-Verlängerungs-Klon M1: Aminosäuresequenz
Anmerkung: Die N-terminalen 2 Aminosäuren sind nicht bestimmt.
Fehlpaarungs-Verlängerungs-Klon M4: Nukleinsäuresequenz
Fehlpaarungs-Verlängerungs-Klon M4: Aminosäuresequenz
Anmerkung: N-terminale 6 Aminosäuren sind nicht bestimmt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Selektieren eines Enzyms, welches in der Lage ist, Nukleinsäure von einer Matrize zu vervielfältigen, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt: (a) Bereitstellen eines Pools von Nukleinsäuren, der Mitglieder umfasst, die ein Enzym, welches in der Lage ist, Nukleinsäure von einer Matrize zu vervielfältigen, oder eine Variante des Enzyms codieren, (b) Unterteilen des Pools von Nukleinsäuren in Mikrokapseln, so daß jede Mikrokapsel ein Nukleinsäuremitglied des Pools zusammen mit dem Enzym oder der Variante, das bzw. die durch das Nukleinsäuremitglied codiert wird, umfaßt, (c) Zulassen, daß die Nukleinsäurereplikation stattfindet, und (d) Detektieren der Replikation des Nukleinsäuremitglieds durch das Enzym.
Verfahren zum Selektieren eines Mittels, welches in der Lage ist, die Aktivität eines Enzyms, das in der Lage ist, Nukleinsäure von einer Matrize zu vervielfältigen, zu modifizieren, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt: (a) Bereitstellen eines Enzyms, welches in der Lage ist, Nukleinsäure von einer Matrize zu vervielfältigen, (b) Bereitstellen eines Pools von Nukleinsäuren, der Mitglieder umfasst, die ein oder mehrere Kandidatenmittel codieren, (c) Unterteilen des Pools von Nukleinsäuren in Mikrokapseln, so daß jede Mikrokapsel ein Nukleinsäuremitglied des Pools, das durch das Nukleinsäuremitglied codierte Mittel und das Enzym umfaßt, und (d) Detektieren der Replikation des Nukleinsäuremitglieds durch das Enzym.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Mittel ein Promotor für Enzymaktivität ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Mittel ein Enzym, vorzugsweise eine Kinase oder eine Phosphorylase, ist, welche(s) in der Lage ist, so auf das Enzym zu wirken, daß dessen Aktivität modifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Mittel ein Polypeptid ist, welches an einem Stoffwechselweg beteiligt ist, wobei der Weg als Endprodukt ein Substrat hat, das an einer Nukleinsäure-Replikationsreaktion beteiligt ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Mittel ein Polypeptid ist, welches in der Lage ist, bei einer Nukleinsäure-Replikationsreaktion ein Substrat zu erzeugen oder einen Inhibitor zu verbrauchen.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Mittel ein Polypeptid ist, welches in der Lage ist, einen Nukleotidprimer oder ein Nukleosidtriphosphatsubstrat, der bzw. das bei einer Nukleinsäure-Replikationsreaktion verwendet wird, so zu modifizieren, daß a) sein 3'-Ende verlängerbar wird, b) ein an den Nukleotidprimer oder das Nukleosidtriphosphat angehängter Substratteil so modifiziert wird, daß die Detektion oder das Einfangen des Produktanhangs des aufgenommenen Nukleotidprimers oder des Nukleosidtriphosphats erlaubt wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Verarbeitung des Nukleinsäuremitglieds die Replikation des gesamten oder eines Abschnitts (von Abschnitten) des Mitglieds darstellt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Verarbeitung des Nukleinsäuremitglieds entweder eine Auffüllreaktion eines an das Mitglied angehängten 5'-Überhangs oder eine Verlängerung eines 3'-Endes des Mitglieds umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Vervielfältigung der Nukleinsäure aus mehr als einer Runde der Nukleinsäurereplikation resultiert.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Replikation der Nukleinsäure eine exponentielle Vervielfältigung ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Replikationsreaktion eine Polymerasekettenreaktion (PCR), eine reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), eine verschachtelte PCR, eine Ligasekettenreaktion (LCR), ein Vervielfältigungssystem auf Basis von Transkription (TAS), eine autarke Sequenzreplikation (3SR), NASBA, eine durch Transkription vermittelte Vervielfältigungsreaktion (TMA) oder eine Strangverdrängungs-Vervielfältigung (SDA) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Anzahl an Kopien des Nukleinsäuremitglieds nach der Vervielfältigung im wesentlichen proportional zur Aktivität des Enzyms ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Anzahl an Kopien des Nukleinsäuremitglieds nach der Vervielfältigung im wesentlichen proportional zur Aktivität des Mittels ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die Anzahl an Kopien des Nukleinsäuremitglieds nach der Vervielfältigung im wesentlichen proportional zur Bindungsaffinität und/oder der Kinetik des ersten und des zweiten Polypeptids ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Nukleinsäurereplikation durch Untersuchen der Anzahl an Kopien des Nukleinsäuremitglieds detektiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Nukleinsäurereplikation durch Untersuchen der Anzahl an Kopien von Abschnitten des Nukleinsäuremitglieds detektiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Nukleinsäurereplikation durch Untersuchen des Vorliegens von Markierungen an dem Nukleinsäuremitglied detektiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Nukleinsäurereplikation durch Bestimmen der Aktivität eines durch das Nukleinsäuremitglied codierten Polypeptids detektiert wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Bedingungen in der Mikrokapsel so eingestellt werden, daß ein Enzym oder ein Mittel, das unter solchen Bedingungen aktiv ist, ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Polypeptid aus der Nukleinsäure durch in vitro-Transkription und -Translation bereitgestellt wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Nukleinsäuremitglied in einen Vektor aufgenommen und in eine Wirtszelle eingebracht wird, um das Polypeptid zu exprimieren.
Verfahren nach Anspruch 22, welches das Exprimieren des Polypeptids von dem Vektor umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Mikrokapseln wäßrige Mikrokapseln einer Wasser-in-Öl-Emulsion umfassen.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Wasser-in-Öl-Emulsion hergestellt wird durch Emulgieren einer wäßrigen Phase mit einer Ölphase und einem oberflächenaktiven Mittel, welches 4,5% v/v Span80, 0,4% v/v Tween80 und 0,1% v/v Triton X100 umfaßt, oder einem oberflächenaktiven Mittel, welches Span80, Tween80 und Triton X100 in im wesentlichen den gleichen Anteilen umfaßt.