GENERACIÓN DE MOLÉCULAS DE POLINUCLEÓ IDO La presente invención se relaciona con un método para generar moléculas de poiinucleótido con propiedades alteradas. "Las biomoléculas, y en particular biopolimeros tales como polinucleótidos, polipéptidos, polisacáridos, etc., no solamente forman la base de la vida biológica como la conocemos, sino que también se usan incrementantemente en una variedad completa de aplicaciones industriales. La búsqueda de nuevas biomoléculas funcionales, su aislamiento y preparación y su aplicación industrial son el asunto materia de la biotecnología moderna. Además de encontrar por casualidad biomoléculas previamente desconocidas con propiedades deseadas en la naturaleza (v.gr., tamizado para substancias naturales), han aparecido recientemente métodos que copian en un laboratorio los principios de evolución natural . Además de los métodos para generar mutaciones de punto (en la forma de intercambio, omisión e inserción de bases) , la recombi ación de secciones de secuencia es una estrategia muy exitosa en naturaleza para la combinación de mutaciones de punto, pero también de dominios dentro de un polímero, de subunidades de un heteromultímero, o de variantes de gene dentro de un grupo de genes o de genes dentro de un genoma . La recombinación homologa, es decir, la combinación de las secciones de secuencia correspondientes de diferentes variantes mientras que retienen la orientación y cuadro de lectura, es particularmente importante. Experimentalmente, la recombinación se puede realizar de diferentes maneras: en primer lugar, in vitro utilizando funciones de enzima individuales o mezclas definidas o secuencias de pasos de procesamiento enzimático, en segundo lugar, en vivo utilizando procesos de recombinación celular y/o reparación. Previamente, principalmente los métodos basados e PCR se han usado en métodos in vitro industriales. El primero a mencionar aquí es evasión de ADN, también mencionado como PCR secual (&? 95/22625; Stemmer, Mature 370 (1994), 389). En este caso, los fragmentos de gene al azar cuyas secuencias se traslapan se generan y subsecuentemente se reconstruyen mediante PCR sin adición de imprimadores para proporcionar productos de la longitud original. De esta manera, en cada ciclo de PCR es posible que fragmentos de diferentes orígenes, imprimándose entre sí, se combinen al azar y homogéneamente a una molécula de producto. La evasión de ADN hace posible en principio limitar la frecuencia de eventos de recombinación ajusfando la longitud de fragmento. Sin embargo, este método es experimentalmente complicado, puesto que primero las condiciones de reacción para generar los fragmentos de ácido nucleico se tienen que establecer.
Otro método para preparar ADN recombinante in vitro se ha reportado por Zhao y col., Nucí. Acids Res. 26 81998), 681). Este método usó imprimadores con secuencias al azar, que permiten que la polimerización inicie en sitios aleatorios dentro de un polinucleótido. De esta manera, similar a la evasión de ADN, fragmentos de polinucleótido cortos se producen que se pueden recombinar entre si mediante imprimación entre si. Controlando la frecuencia de recombinación es difícilmente posible utilizando este método. Además, los imprimadores no específicos ocasionan un régimen de error inherente comparativamente elevado que se puede convertir en un problema para secciones de secuencia sensibles y/o genes largos. Como una alternativa a estos métodos, el proceso de extensión escalonada (WO 98/42728; Zhao y col., What. Biotechnol. " (1998), 258 (utiliza un protocolo de PCR modificado a fin de provocar intercambio de hebra durante amplificación de PCR. Utilizando fases muy cortas a la temperatura de polimerización entre las fases de fusión y recocido, los productos incompletos se pueden hibridizar con plantillas nuevas y extenderse adicionalmente . La frecuencia de recombinación se puede ajustar ajusfando previamente el tiempo de polimerización y el número de ciclos. Una limitación técnica aquí es el ajuste preciso de fases muy cortas a una temperatura particular. Como una alternativa a estos métodos basados en PCR, se ha descrito un método que se genera de una población de secuencias de polinucleótido con mutaciones heterodobles que luego se someten a reparación aleatoria en vivo introduciéndolos en células o in vitro incubándolas con un extracto de célula, resultando en una cierta proporción de variantes de molécula recombinante, dependiendo de la frecuencia relativa de las variantes en la población de partida (WO 99/29902) . Este método se caracteriza por el uso de sistemas de reparación celula que reconocen- específicamente las bases no emparejadas y reparan al azar ya sea las dos hebras en una hebra doble. Este método, si se limita por una parte por la eficiencia limitada al introducir polinucleótidos en células y por la capacidad de control faltante de los procesos de reparación. Una desventaja decisiva es además el hecho de que en cada paso de reparación solamente dos moléculas de partícula se pueden recombinar entre sí. Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para preparar polinucleótidos con propiedades alteradas, que evita las desventajas arriba descritas de los métodos conocidos y que permite recombinación eficiente de genotipos de moléculas de polinucleótido, generando de esta manera fenotipos alterados. Se ha encontrado que este objeto se logra proporcionando las modalidades descritas en las De esta manera, la presente invención se relaciona con un método para generar moléculas de polinucleótido con propiedades alteradas, que comprende ir a través de cuando menos un ciclo que comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una molécula de polinucleótido de doble hebra o una población de moléculas de polinucleótido de doble hebra, con los polinucleótidos individuales de la población teniendo cuando menos una sección de secuencia homologa y cuando menos una sección secuencia heteróloga, (b) generar roturas de una sola hebra en las moléculas de polinucleótido de doble hebra (c) iniciar la degradación nuclelitica 5' ->3' de las roturas de una sola hebra, con síntesis 5r->3' de-novo simultáneas y desplazar las roturas de una sola hebra en la dirección del extremo 3' , (d) preparar las moléculas de polinucleótido de una sola hebra (e) preparar moléculas de polinucleótido parcialmente de doble hebra de las moléculas de polinucleótido de una sola hebra provistas por el paso (d) , (f) iniciar síntesis de ácido nucleico dirigido por plantilla de las moléculas de polinucleótido parcialmente de doble hebra preparadas en el paso (e) , siendo posible llevar a cabo los pasos (b) y (c) sucesiva o
simultáneamente . El método de la invención, por lo tanto se distingue por una combinación de ventajas, que no se pueden lograr con cualquier de los métodos previamente descritos. Beneficios adicionales del método son su baja complejidad experimental y la pequeña cantidad de tiempo necesaria y también la posibilidad de automatización. El método de la invención se distingue por el hecho de que: la degradación nucleolítica simultánea y síntesis de ácido nucleico, es decir traslación de corte", evita tanto fragmentación de ácido nucleico excesivo como degradación de ácidos nucleicos recombinantes . En principio, la cantidad completa de ADN usada está disponible para recombinación subsecuente de los ácidos nucleicos in vitro. Esto hace posible aumentar la eficiencia de recombinación comparada con los métodos anteriormente descritos para recombinar ácidos nucleicos in vitro. Una modalidad preferida comprende ir a través de más de un ciclo que comprende los pasos (a) a (d) arriba mencionados, es decir, cuando menos dos, de preferencia Cuando menos 5, particularmente de preferencia por lo menos 10, y muy particularmente preferible por lo menos 20 ciclos. La aplicación cíclica del método de la .invención de esta manera hace posible preparar a partir de una distribución de partida de secuencias de polinucleótido
relacionadas, polinucleótidos con regiones de secuencia que se han combinado recientemente varias veces. Dicha aplicación cíclica en particular permite que una pluralidad de diferentes secciones de secuencia heterologa diferentes se puedan combinar entre sí. Además, es posible controlar de manera precisa la frecuencia de recombinación por hebra de polinucleótido a través del número de ciclos, La aplicación cíclica también hace posible controlar de esta manera el intervalo promedio entre eventos de recombinación de un ciclo al siguiente , En una modalidad preferida adicional, se lleva a cabo un paso de selección después de uno, varios o todos los ciclos del método de la invención. Dicho paso de selección se puede relacionar ya sea con el genotipo o el fenotipo o con ambos el genotipo y el fenotipo del polinucleótido. A este respecto, el genotipo de un polinucleótido es la secuencia de diferentes monómeros en el polinucleótido. El fenotipo es la suma de las funciones y propiedades de una molécula de polinucleótido y los productos de transcripción y traslación codificados por un polinucleotido. El paso de selección se puede llevar a cabo, por ejemplo, como selección acoplada con amplificación (natural), selección por separación física o selección por tamizado
(Koltermann. y ettling, Biophys . Chem. 66 (1999), 159; Ketting y col., Current Topics in Microbiol. And Immunol. 243
(1999), 173; Koletermann, Dissertation, TU Berlín (1998); Zhao y col., en Manual of Ind. Microbiol and Biotechnol., Capítulo 49, pág. 597604, ASM Press, Washington, DC 1999; Reetz, Angew. Chem. 113 (2001) 133, 292-320. El paso (a) del método de la invención proporciona una molécula de polinucleótido de doble hebra o una población de polinucleótidos de doble hebra. La población de moléculas de polinucleótido de doble hebra que se proporciona de conformidad con el paso (a) del método de la invención puede ser cualquier población de las moléculas de polinucleótido de doble hebra que comprende cuando menos dos tipos de moléculas de polinucleótido, que comprenden por lo menos una sección de secuencia homologa y por lo menos una sección de secuencia heteróloga. A este respecto, el término "población de moléculas de polinucleótido de una sola hebra" se refiere a una cantidad de moléculas de polinucleótido, con interacciones intermoleculares en la forma de parejas de base específicas entre las moléculas que se impide o que son no existentes.
El término "polinucleótidos" (ácidos nucleicos, oligonucleótidos) aquí comprende tanto ADN como RNA, polinucleótidos son heteropolímercs lineales, orientados (5' ->3r ) que pueden estar en forma de una sola hebra o doble hebra. En una hebra doble, dos hebras solas se ligan entre si a través de interacciones en la forma de emparejamiento de base especifico. En principio, los polinucleótidos también pueden ser ADN o RNA con monómeros modificados. En general, el mé odo también se puede aplicar a polímeros artificiales construidos de manera similar y también a hebras dobles híbridas de ADN-RNA. El término "secciones homólogas" se refiere a secciones que son idénticas o complementarias en dos o más moléculas de polinucleótido, es decir, que contienen la misma información en posiciones correspondientes. El término "secciones heterólogas" se refiere a secciones que no son idénticas y no complementarias en dos o más moléculas de polinucleótido, es decir, que contienen información diferente en las posiciones correspondientes. La información de una molécula de polinucleótido (genotipo) aquí se refiere a la secuencia de monómeros diferentes en una molécula de polinucleótido. Una región de secuencia heterologo es cuando menos un nucleótido de longitud, pero también puede ser substancialmente más larga. Una región de secuencia heteróloga en particular, puede ser dos nucleótidos, o tres nucléotidos, por ejemplo de un codón, y de preferencia más de 5 nucleótidos, particularmente de preferencia más de 10 nucleótidos, de longitud. En principio, la longitud de una región heteróloga no debe ser más larga de 10,000 nucleótidos, particularmente de preferencia no más larga de 5,000 nucleótidos, en particular no más larga de 2,000 nucleótidos, y muy particularmente de preferencia no más larga de 1,000 nucleótidos. Las secciones de secuencia relativamente lar-gas de esta clase pueden ser, por ejemplo, las secciones hipervariables de una secuencia que codifica un anticuerpo, dominios de una proteína, genes en un grupo de genes s reglones de un genoma. Las regiones heterólogas de preferencia son regiones de secuencia en las que las moléculas de polínucleótido difieren una de la otra en bases individuales. Sin embargo, las regiones heterólogas también se pueden basar en una omisión, duplicación, inserción, inversión o adición estando presente o habiendo ocurrido en una molécula de polínucleótido. Las moléculas de polínucleótido de doble hebra provistas de conformidad con el paso (a) del método de la invención tienen, de conformidad con la invención, cuando menos un homólogo y por lo menos una región de secuencia heteróloga. De preferencia, sin embargo, tienen una multiplicidad de secciones homologas y heterólogas. En principio, no hay límite superior para el número de secciones homologas y heterologas. Las secciones heterologas en las moléculas de polinucléótido dé doble hebra en cada caso se interrumpen por secciones homologas, A este respecto, las secciones homologas son de preferencia cuando menos 5, de preferencia por lo menos 10, y par icularmente de preferencia al menos 20, nucleótidos de longitud» Sin embargo, como las secciones heterologas, las secciones homologas pueden ser substáncialment más largas y, en principio no hay limite superior de su longitud. Preferencialmente, no deben ser más largas de 50,000 nucleótidos, de preferencia no más larga de 20,000 nucleótidos, particularmente de preferencia no más larga de 10,000 nucleótidos, y muy particularmente de preferencia no más larga de 1,000 nucleótidos. Las moléculas de polinucléótido de doble hebra se pueden proporcionar de conformidad con el paso (a) del método de la invención mediante métodos conocidos por el trabajador experto. Estos incluyen, por ejemplo, métodos físico, químico, bioquímico y biológicos. Estos incluyen métodos tanto sintéticos como de preparación, tales como, por ejemplo, síntesis química de oligonucleótidos, síntesis de ácidos nucleicos mediante reacción de cadena de polimerasa (PCR), preparación de plásmidos, cósmidos, fagos, BACs (cromosomas artificiales bacterianos), YACs (cromosomas artificiales de levadura) o ADM cromosomal.
En una modalidad particularmente preferida del método de la invención, una población de polinucleótidos de dobla hebra con secciones omólogas y heterólogas se proporciona usando secuencias de polinucleótido relacionadas de la distribución de imitantes de una casi especie. El término ^relacionado" aquí se relaciona con polinucleótidos, entre los que se encuentra ambas secciones homólogas y heterólogas. Casi especie se refiere a una población dinámica de variantes dé molécula (mutantes) relacionados entre si, que se produce mediante réplica propensa a error. Fue posible mostrar que, de conformidad con el principio de casi especie, el sujeto de selección no es el tipo silvestre (centro de masa de la casi especie) sino la distribución completa. Con condiciones de selección alteradas, esta distribución de mutantes ya contiene variantes ventajosas de conformidad con su valor de ajuste, que por lo tanto no necesita producirse primero mediante mutaciones aleatorias, subsecuentes. En el caso de desplazamiento sucesivo de los parámetros de selección generación evolutiva entonces se parece a un desplazamiento implícitamente dirigido de la casi especia a lo largo de bordes del panorama de valor. wo 92/18645 describe la preparación de casi especie y la aplicación de este principio para biotecnología evolutiva. La generación de una casi especie si está basada en réplica propensa a error de las variantes moleculares.
Cuando se utilizan polinucleótidos, la réplica se lleva a cabo de preferencia con ayuda de enzimas de réplica, es decir, polimerasas, que permiten síntesis controlada por plantilla de una molécula de polinucleotido. La introducción de errores, es decir, variación en información molecular se puede logra mediante el proceso de copiado propenso a error inherentemente solo o bien aumentando específicamente la imprecisión de polimerasa (v.gr., adición específicamente no equilibrada de monómeros, adición de análogos de base, PCR propenso a error, polimerasas con regímenes de error muy elevados), mediante modificación química después de síntesis de polinucleótidos, mediante síntesis completa de polinucleótidos con cuando menos uso parcial de mezclas de monómero y/o análogos de nucleótido, y mediante una combinación de los métodos. Se da preferencia a utilizar distribuciones de mutantes de una casi especie, las propiedades fenotípicas de una función molecular deseada de los mutantes individuales de las casi especies que ya se ha mejorado en comparación con el tipo silvestre. El término "fenotipo de una molécula de polinucleotido" se refiere a la suma de funciones y propiedades de una molécula de polinucleotido y del producto de transcripción o traslación codificado por un polinucleotido. Además, es posible utilizar secuencias dé origen diferente, entre otras secuencias de polinucleotido de una familia de genes de diferentes especies, las secuencias de polinucleotido que se han replicado a un régimen de error particularmente elevado en vivo ( v . cr. , por viruses, por bacterias de mutante, por bacterias bajo irradiación de UV) o in vit.ro. (v„gr.f por medio de reacción d.e ?ß-replicasa, PCR propenso a error, secuencias de polinucleotido hacia las que después de síntesis, mutaciones se han introducido por medio de. agentes químicos o que. se han sintetizado químicamente, de tal manera que tienen secciones homologas y heterólogas, o secuencias de polinucleótido que se han generado mediante una combinación de. métodos arriba mencionados. En principio,, los polinucleótidos usados en el método de la invención pueden ser cualesquiera polinucleótidos, en particular moléculas de ADN o RNA- La rotura de- hebra única- requerida- en el paso (b) del método de la invención, en principio, se puede generar mediante cualquier método que conduzca a disociación de un enlace de fosfodiéster entre 2 nucleótidos en una hebra de polinucleotido de la molécula de polinucleótido de doble hebra. Dichos métodos pueden ser métodos físicos o químicos (v.gr., tratamiento con ultrasonido, hidrólisis de éster parcial) . Los métodos enzimáticos- son particularmente apropiados para el paso (b) . Ejemplos de enzimas apropiadas para esto son nueleasas . En una modalidad preferida del método de la invención, roturas de hebra única se introducen mediante enzimas de corte especificas en secuencia. Los ejemplos de las enzimas de corte son V.'BchT de
Bacillus chitinosporus, N.BstNBI de Bacillus stearot ermop ilus, N.BstSEI de Bacillus stearothermophilus, N.CviPII de cepa Clorella NC64A, N.CviQXI de cepa Clorella NC64A, V.EcoDem de E. coii, V.H alT de Haemophilus parainfluenzae, V.Meal de Mocardia aerocolonigenes y V.XorlI de Xanthomonas oryzae. En una modalidad preferida adicional, es posible introducir roturas de hebra única hacia las moléculas de polinucleótido de doble hebra mediante enzimas de corte especificas de no secuencia. A este respecto, es posible usar, por ejemplo, Dnase I de páncreas de becerro con Mg2+ como cofactor (Kunitz, J. Genetic Physiology 33 (1950) , 349; Kunitz, J. Genetic Physiology 33 (1950), 363, y Melgac y Goldthwaite, J. Biolog. Chen 243 (1968), 4409) . Las condiciones de reacción en el paso (c) se seleccionan dependiendo de las enzimas usadas. En una modalidad preferida, el paso (c) se lleva a cabo bajo condiciones que ocasionan un régimen de error aumentado de síntesis de-novo. Dicho régimen de error de síntesis de-novo se puede seleccionar dependiendo de las variantes deseadas que se van a generar. Los regímenes de error típicos son de 0.1 x 10~3 a 10 x 10~3, es decir, 0.01 a 1% de error (intercambio de 1 a 10 bases en una sección de ADN de 10,000 bases). Es particularmente útil llevar a cabo el paso (c) con un régimen de error de 1 x 10~3 a 5" x 10~3, es decir, 0.1 a 0.5% de error, es decir, 1 a 5 bases se intercambian en una sección de ADN de 1,000 bases. El régimen de error de polímerasa G de KDhT es 9 x 10"s (Kunkel y col. 81984) J. Biol. Chem. 259:1539-1545). Consecuentemente, cuando se utiliza polimerasa I de ADN, un aumento en el régimen de error significa un régimen de error más de 9 x 10-6. En principio, el régimen de error de la síntesis de-novo se puede aumentar, por ejemplo, usando polimerasa de ADN mutada o seleccionando las condiciones de reacción apropiadas en el paso (c). En una modalidad preferida, el régimen de error de síntesis de-novo se aumenta utilizando polimerasas con actividad reducida o no a prueba de lectura. En una modalidad preferida del método de la invención, el régimen de error de síntesis de-novo se aumenta por concentraciones de nucleótido diferentes como material de partida. A est respecto, la concentración de nucleótidos individuales o varios se pueden variar relativamente a los otros nucleótidos. Se da preferencia a una cantidad subestequiométrica de un nucleótido, en particular de dATP, comparado con los otros nucleótidos. Los ejemplos de concentraciones apropiadas son 200 uM cada una de dGTP, dCTP y d T y de 20 a 50 uM ATP. Se da preferencia a cantidades subes tequiométricas de dos nucleótidos, en particular de dATP y dGTP, comparados con los otros nucleótidos. Los ejemplos de concentraciones apropiadas son 2?0 uM cada una de dCTP y dTTP y 40 uM cada uno de dATP y dGTP. En una modalidad adicional del método de la invención, el régimen de erro de síntesis de-novo se aumenta mediante la adición de análogos de nucleótido. Los análogos de nucleótido que se pueden mencionar son trifosfato de deoxinosina, trifosfato de 7-deazadeoxiguanosina y alf -tiotrifosfato de deoxinucleosida . Se da preferencia particular a utilizar trifosfato de deoxinosina. En una modalidad adicional del método de la invención, el régimen de error de síntesis de-novo se aumenta variando la concentración de sal. Un ejemplo apropiado para esto es un aumento en la concentración de iones de Mg2+ a concentraciones superiores a. 1.5 mM. También es apropiada la adición de iones de Mn2+, por ejemplo en una escala de concentración de 0.1 a 1 M, en particular 0.2 a 0.5 mM. En una modalidad adicional del método de la invención, el régimen de error de síntesis de-novo se aumenta agregando aditivos . Un aditivo apropiado es cualquier substancia que aumenta el régimen de error; los ejemplos que se pueden mencionar son sulfóxido de dimetilo, polietilenglicol, y glicerol. Se da preferencia particular añadiendo los aditivos a las siguientes concentraciones: DMSO a de 2 a 10%, PEG a de 5 <a 15%, glicerol a de > 0 a 30%, de preferencia 5 a 20%. En una modalidad adicional, el régimen de error de la síntesis de-novo se aumenta cambiando la temperatura de reacción, en particular mediante un aumento en temperatura. Todas las medidas mencionadas para aumentar el régimen de error también se pueden llevar a cabo en combinación entre sí, por ejemplo, exceso de un nucleótido a concentración de ión de Mn2* aumentada. En una modalidad preferida, los pasos (b) y (c) se llevan a cabo simultáneamente. La preparación de las moléculas de polinucleótido de una sola hebra, de conformidad con el paso (d) del método de la invención, se puede llevar a cabo utilizando métodos conocidos por el trabajador experto. Estos incluyen, por ejemplo, métodos físicos, químicos, bioquímicos y biológicos. Los ejemplos que se pueden enumerar aquí son fusión de hebras dobles de polinucleótido por medio de calentamiento a temperaturas superiores a la temperatura de recocido (Newton en: PCR, Spektrum Akademischer Verlag (1994); Lazurkin Biopolymers 9 (1970), 1253-1306), desnaturalizar hebras dobles de polinucleótido por medio de adición de reactivos de desnaturalización (v.gr», urea o detergentes), adición de enzimas que convierten polinucleótidos de doble hebra a polinucleótidos de una sola hebra, por ejemplo, mediante degradación exonucleolitica de ADN de doble hebra a un ADN de una sola hebra. La preparación de moléculas de polinucleótido parcialmente de hebra doble de las moléculas de polinucleótido de una sola hebra proporcionadas por el paso (d)' , de conformidad con el paso (e) del método de la invención, se pueden llevar a cabo utilizando métodos conocidos por el trabajador experto y se logra de preferencia hibridizando las secciones homólogas de las moléculas de polinucleótido de una sola hebra complementarias. La hibridización para proporcionar polinucleótidos de doble hebra se lleva a cabo usando métodos conocidos por el trabajador experto y, en particular, se puede lograr por ejemplo, combinando las hebras únicas y ajusfando las condiciones de reacción, que promueven el recocido de polinucleótidos complementarios, tales como por ejemplo, reduciendo la temperatura y/o reduciendo la concentración de sal . Empezando de las moléculas de polinucleótido parcialmente de doble hebra preparadas en el paso (e) , una síntesis de ácido nucleico dirigida por plantilla se lleva a cabo -en el paso (f) del método de la invención. El término "síntesis de ácido nucleico dirigida por plantilla" aquí se refiere a la síntesis de un polinucleótido extendido una sola hebra existente sobre la base de la información de una hebra de plantilla correspondiente. El trabajador experto está familiarizado con llevar a cabo una polimerización dirigida por plantilla de. esta clase, que se describe, por ejemplo, en Sambrook (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Cualquier enzima que tiene actividad de polimerización de polinucleótido controlada por plantilla y que es capaz de sintetizar hebras de polinucleótido se pueden usar para la r-eacción de pólimerasa. Una multiplicidad de polimerasas de una gran variedad de organismos y con diferentes funciones ya se han aislado y descrito. Existe una distinción con respecto al tipo de plantilla y de polinucleótido sintetizado entre polimerasas dependientes de ADN o de AON, polimerasas de ADN dependientes de RNA (transcriptasas invertidas), polimerasas de. RNA dependientes de ADN y polimerasas de RNA dependientes de RNA (réplicas) . Con respecto a estabilidad de temperatura, existe una distinción entre polimerasas no termoestablés (37°C) y termoestables (75 a 95!C). Además, las polimerasas difieren con respecto a la presencia de actividad 5' -3' y 3' -5' -exonucleolitica. Las polimerasas más importantes son polimerasas de ADN dependientes de ADN". En particular, es posible usar polimerasas de ADN que tienen una temperatura óptima de alrededor de 37 °C.
Estas incluyen, por ejemplo, la polímerasa G de AD de E.coli, pol merasa de ADN T7 de bacteriófago T7 y polimerasa de ADN T4 de, bacteriófago T4, cada una de las cuales se vende comercialmente por una multiplicidad de fabricantes, por ejemplo, USB, Roche Molecular Biochemicals , Stratagene, MEB o
Quantum Biotechnologies . La polimerasa í de ADN de E.coli (holoenzima) tiene una actividad de polimerasa 5' -3'-, una actividad de exonucleasa a prueba de lectura de 3' -5'- y actividad de exonucleasa de 5' -3' . La enzima se utiliza para etiquetado de AD in vitro por medio del método de traslación de corte. (Rigby y col. (J. Mol. Biol. 113 (1977)), 237-251) . En contraste con la holoenzima, el fragmento Klenow de polimerasa G de ADN" de E.coli como polimerasa de ADN G7 y polimerasa de ADN T4, no tiene actividad de exonucleasa 5'. Por lo tanto, estas enzimas se utilizan para ""reacciones de llenado'''' o para la síntesis de hebras largas (Y'oung y col. (Biochemistry 31 (1992), 8675-8690), Lehman (Methods Enzymol. 29 81974), 46-53)). Finalmente, la variante 3'-5'-exo{-} del fragmento Klenow de polimerasa G de ADN de E. coli también carece de actividad de exonucleasa 3' . Esta enzima se usa frecuentemente para secuencia de ADN' de conformidad con Sanger (Sanger (Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 74 (1977), 5463-5467) ) . Además de estas enzimas, existe una multiplicidad de pclimerasas de ADN de 37 °C adicionales con diferentes propiedades, que se pueden utilizar en el método de la invención. La polimerasá de ADN termoestable más común, que tiene una temperatura óptima de 75°C y es suficientemente estable a 95 °C es polimerasá dé ADN Taq de Thermos aquaticus, que está comercialmente disponible. La polimerasá de ADN Taq es una polimerasá de ADN 5' -3' altamente procesiva que no tiene- actividad de exonucleasa 3' -5'. Frecuentemente se usa para PCRs convencionales para reacciones de secuencia y para PCRs mutagénicos (Cadwell y Joyce ( PCR Methods Appl. 3 (1994), 136-140, Agrogoni y Makinski (Methods Mol. Biol. W23 (1993), 109-114)). La polimerasá de ADN Tth de Thermus thermop ilus HB8 ? polimerasá de ADN Tfl de Thermus flavus tienen propiedades similares. La polimerasá de Adn Tth, sin embargo, tiene adicionalmente una actividad de transcriptasa reversa (RT) intrínseca en presencia de iones de manganeso (c Cusi y col. (Biotechriiques 17 (1994), 1034-2036)). Nuevamente, un buen número de las polimerasas de AJDN termoestables con actividad de exonucleasa 3' pero sin 5' se venden comercialmente: polimerasá de ADN Pwo de Pyrococcus woesei, polimerasas de ADN Tli, Vent y DeepVent de Thermocoeeus litoralix, polimerasas de ADN Pfx y Pfu ñde Pyurococcus furiosus, polimerasa de ADN Tub de thermus ubiquitous, polimerasa de ADN' Tma y UlTma de Termotoga marítima (Newton y Graham, en: PCR, Specktrum Akad, Verlag Heidelberg (1994), 1)). Las polimerasas que carecen de actividad de exonucleasa a prueba de lectura 3r se utilizan a fin de amplificar productos de PCR como con tan pocos errores como sea posible. Finalmente, las polimerasas de ADN que carecen de ambas actividades 5r y 30'" exonucleolí ticas están disponibles en la forma del fragmento Stoffel de polimerasa de ADN Taq, la polimerasa de ADN Vent-(exo-) y polimerasa de ADN Tsp. Las enzimas más comunes entre las polimerasas de ADN dependientes de RNA ( transciptasas de reversa) incluyen transcriptasa de reversa de AMV de avian myeloblastosis virus, transcriptasa de reversa M-MüLT de virus de leucemi Moloney murine y transcriptasa de reversa de HIV de virus de inmunodeficiencia humana, que también se venden por varios proveedores tales como, por ejemplo, NEB, Life Technologies, Quantum Biotechnologies . Como transcriptasa de reversa HIV, t anscriptasa de reversa AMV tiene una actividad de Rnase H asociada que se reduce marcadamente en transcriptasa de reversa M-MuLV. Tambas transcriptasa de reversa M-MuLV y AMV carecen de actividad de exonucleasa 3' -5'. Las enzimas más comunes entre las polimerasas de RNA dependientes de ADN incluyen polimerasa de RNA de E.coli polimerasa de SP6 RNA de Salmonella t ohimurium LT2 infectada con bacteriofase SP6, polimerasa de RNA T3 de bacteriófago T3 y polimerasa de RNA T7 de bacteriófago %7. En una modalidad preferida del método de la invención, las hebras de plantilla en el paso (f) del método son moléculas de ADN y polimerasa de ADN dependiente de ADN se usa para síntesis de una sola hebra dirigida por plantilla. En una modalidad particularmente preferida, una polimerasa de ADN no termoestable, particularmente de preferencia una con actividad 5' y 3' exonucleolítica, tal como por ejemplo polimerasa I de E.coli se utiliza aquí. Como una alternativa, también es posible usar una polimeríza de ADN no termoestable qué tiene una actividad exonucleolítica 3r->5',: pero no actividad exonucleolítica 5'- 3', tal como por ejemplo, el fragmento Klenow de polimerasa I de ADN de C.coli, polimerasa de ADN T7 de bacteriófago T7 o polimerasa de ADN' T~4 de bacterioffato T4. Además también es posible usar una polimerasa de ADN no termoestable que no tiene actividad exonucleolítica 5r->3' ni 3'->5' , tal como por ejemplo, la variante 3'-5'-ixo(-) del fragmento Klenow de polimerasa I de ADN de E.coli. Otra modalidad particularmente preferida utiliza una polimerasa termoestable (v.gr., polimerasa Taq, polimerasa Pwo) que nuevamente pueden tener actividades exonucleolíticas 5' y 3' o bien actividad exonucleolítica 5' pero no actividad exonucleolítica 3r, tal como por ejemplo, polimerasa de ADN Taq de Thermus aquaticus, polimerasa de ADN Tth de Thermus thermophilis HB3 o polimerasa de ADN Tfl de thermus 1avus . Alternativamente, la polimerasa de ADN termoestable puede tener actividad exonucleolítica 3'-Z5' pero no 5'->3', tal como por ejemplo, la polimerasa de ADN Pwo, de Pyrococcus woesei, la polimerasa de ADN VentR, la polimerasa de ADN de DeepVentR o la polimerasa de AND Tli de thermococcus litoralis, la polimerasa de ADN Pfu o la polimerasa de ADN Pfx de Pyrococcus furiosus o polimerasa de ADN Tma o polimerasa de ADN UITma de Thermotoga marítima. Además es posible usar una polimerasa termoestable que no tiene actividad exonucleolítica 3' -5' ni 5'-3', tal como por ejemplo, el fragmento Stoffel de polimerasa de ADN Taq de thermus acuatieus, la polimerasa de ADN Tsp o la variante exo(-) de polimerasa de ADN VentR o polimerasa de ADN DeepVentR de Thermococcus litoralis. Si una polimerasa termoestable se usa, la reacción de polimerasa de preferencia sigue inmediatamente el paso le) , sin purificación intermedia o tratamiento de muestra adicional . En otra modalidad preferida del método de la invención, las hebras de plantilla en la que se lleva a cabo la síntesis de una sola hebra dirigida por plantilla en el paso (f) del método de la invección son moléculas de R A. En este caso, la síntesis de hebra única dirigida por plantilla utiliza una polimerasa de ADN dependiente de RNA, de preferencia transcriptasa de reversa de HIV de virus de inraunodeficiencia humana, o transcriptasa de reversa M-MuLV de virus de leucemia murina Moloney. Se da preferencia adicional a utilizar una transcriptasa de reversa termoestable, uy particularmente polimerasa de ADN Tth de Thermus thermophilus, que tiene actividad de transcriptasa de reversa intrínseca. Ejemplo 1 A menos que se manifieste de otra manera, los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con los Protocolos Actuales en Biología Molecular. Y. Proporcionar el material de partida 4 variantes de lipasa se usaron como material de partida: LipA H86W codificada por pBP2035, LipA S87T codificada por pBP2008, LipA F1452W codificada por pBP2006, LipA L167A codificada por pBP20C7. 1. Preparación de plásmido de los siguientes plásmidos. Plásmido Vector Tamaño Inserción Tamaño de Variante de de Vector Vector Enzima
PBP2006 pBSIIKS 2961 bp 56-20 1142 bp F142W PBP2007 pBSIIKS 2961 bp 98-10 1142 bp L167A pBP'2008 pBSIIKS 2961 bp 124-9 1142 bp S87T pBP2035 pBSTTKS 2961 b 198-1-3 1142 b R$6W 2. Disociar los plásmidos con endonucleasas de restricción HindiII y SacI 3. Aislar las inserción mediante extracción de gel usando el Equipo GFX (Pharmacia) 4. Resuspender los fragmentos de ADISI en H20 5. Ajustar las concentraciones de ADN" a -250 ng/ul II. Generación de roturas de una sola hebra y síntesis de-novo 1. 4 mezclas de reacción separadas para traslación de corte de inserciones 56-20, 98-10, 124-9, 198-1-3, usando el equipo de traslación de corte (Roche, Cat . No. 976776) Componente Volumen
Solución de ADN con inserción -250 ng/ul 16 ul dATP 0.4 mM 2.5 ul dCTP 0.4 WM 2.5 ul dGTP 0.4 mM 2.5 ul dTTP 0.4 mM 2.5 ul
x tarnpón 5 ul
H20 14 ul
Mezcla de enzima1' 5 ul
Total 50 ul Mezcla de enzima:
Polimerasa I de ADN y ADNsel en 50% de glicerol (v/v)
2. Incubar las mezclas a 15 °C, 90 min. 3. Detener la reacción añadiendo 5 ul de 0.5 M de EDTA, pH 8.8 4. Precipitar, lavar, secar y resuspender las mezclas de 20 ul de III. PC sin imprimadores La mezcla de reacción para PCR usando el sistema de PCR rico en GC (Roche, Cat. No. 2140306) Componente Volumen
Mezcla de 6 ul de cada mezcla de 2.4 24 ul dNTP 10 mM 1 ul
Solución de resolución 5M rica en GC 10 ul
Tampón de reacción rico en GC 10 ul H20 grado PCR 4 ul
Mezcla de enzima rica en GC 21 1 ul
Total 50 ul
21 Polimerasa de ADN Taq termostática y polimerasa de ADN
Condiciones de PCR: Temperatura Tiempo Ciclos 95°C 5 min 55°C 60 s 72°C 60 s 95°C 30 s 72°C 10 rain 4 C x min IV. PCR con imprimadores La mezcla de reacción para PCR usando el sistema de PCR rico en GC (Roche, Cat. No. 2140306): Componente Volumen
Producto de PCR del paso 3 5 ul sNTP 10 mM I ul Imprimador MAT16* 6.25 uM 2 ul Imprimador MAT1 * 6.25 uH" 2 ul Solución de resolución rica en GC 5M 10 ul Tampón de reacción rico en GC 10 ul H20 grado. PCR 19 ul Mezcla de enzima rica en GC 1 ul Total 50 ul * Imprimador ????6 = S^GATCGACGTA GCTTTAACGATGGAGAT-S'" * Imprimador MAT19 = 5' -CATCGGGCGAGCTCCCAGCCCGCCGCG-3' Condiciones de PCR: Temp ratura Tiempo Ciclos 95 °C 5 min 52°C 30 s 25 72°C 60 s 95°C 30 s 72°C 10 min 4°C x min V. Clonación y análisis de los fragmentos 1 , 20 ul del producto de PCR del paso 4 se cortan con HindIII y SacI 2. Precipitar, lavar, secar y resuspender la mezcla en 20 ul de H20 3. Purificar los fragmentos cortados usando el equipo GFX
( Pharmacia) 4. Ligar los fragmentos cortados con vector pBSIIKS (Stratagene), que se ha cortado con anticipación con HindIII y SacI 5. Transformar las mezclas de ligado en Escherichia coli
XLl-Azul 6. Análisis de secuencia de 29 clones con inserciones.
LISTADO DE SECUENCIAS 110> BASF AG 120> Método para generar moléculas de polinucleótidos 130> PF53571/MSt 140> PCT/EP03/05308 141> 2003-05-21 160> 4 170> Patentln versión 3.1 210> 1 211> 1142 212> ADN 213> pBluescriptIIKS+ <220> <221> rtiisc_feature <223> Lipasas en pBluescriptIIKS+ <400> 1 aagctttaac gatggagata aacatggtca gattgatgcg ttccagggtg gcggcgaggg 60 cggtggcatg ggcgttggcg gtgatgccgc tggccggcgc ggccgggttg acgatggccg 120 cgtcgcccgc ggccgtcgcg gcggacacct acgcggcgac gcgctatccg gtgatcctcg 180 tccacggcct cgcgggcacc gacaagttcg cgaacgtggt ggactattgg tacggaatcc 240 agagcgatct gcaatcgcat ggcgcgaagg tgtacgtcgc gaatctctcg ggattecaga 300 gcgacgacgg gccgaacggc cgcggcgagc agctgctcgc ctacgtgaag caggtgctcg 360 cggccaccgg cgcgaccaag gtgaacctga tcggctggag ccagggcggc ctgacctcgc 420 gctacgtcgc ggccgtcgcg ccgcaactgg tggcctcggt gaegaegate ggcacgccgc 480 atcgcggctc cgagttcgcc gacttcgtgc aggacgtgct gaagaccgat ccgaccgggc 540 tctcgtcgac ggtgatcgcc gccttcgtca acgtgttcgg cacgctcgtc agcagctcgc 600 acaacaccga ccaggacgcg ctcgcggcgc tgcgcacgct caccaccgcg cagaccgcca 660 cctacaaccg gaacttcccg agcgcgggcc tgggcgcgcc cggttcgtgc cagacgggcg 720 ccgcgaccga aaccgtcggc ggcagccagc acctgctcta ttcgtggggc ggcaccgcga 780 tccagcccac ctccaccgtg ctcggcgtga ccggcgcgac cgacaccagc accggcacgc 840 tcgacgtcgc gaacgtgacc gacccgtcca cgctcgcgct gctcgccacc ggcgcggtga 900 tgatcaatcg cgcctcgggg cagaacgacg ggctcgtctc gcgctgcagc tcgctgttcg 960 ggcaggtgat cagcaccagc taccactgga accatctcga cgagatcaac cagctgctcg 1020 gcgtgcgcgg cgccaacgcg gaagatccgg tcgcggtgat ccgcacgcac gtgaaccggc 1080 tcaagctgca gggcgtgtga tggcgcaggc cgatcgtccg gcgcgcggcg ggctgggagc 1140 te 1142
<210> 2 <211> 1142 <212> ADN <213> pBluescriptKSII+ <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (1142) <223> <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (1142) <223> <400> 2·' aagctttaac gatggagata aacatggtca gattgatgcg ttccagggtg gcggcgaggg 60 cggtggcatg ggcgttggcg gtgatgccgc tggccggcgc ggccgggttg acgatggccg 120 cgtcgcccgc ggccgtcgcg gcggacacct acgcggcgac gcgctatccg gtgatcctcg 180 tccacggcct cgcgggcacc gacaagttcg cgaacgtggt ggactattgg .tacggaatcc 240 agagcgatct gcaatcgcat ggcgcgaa¾g tgtacgtcgc gaatctctcg ggattccaga 300 gcgacgacgg gccgaacggc cgcggcgagc agctgctcgc ctacgtgaag caggtgctcg 360 cggccaccgg cgcgaccaag gtgaacctga tcggccacac ccagggcggc ctgacctcgc 420 gctacgtcgc ggccgtcgcg ccgcaactgg tggcctcggt gacgacgatc ggcacgccgc 480 atcgcggctc cgagttcgcc gacttcgtgc aggacgtgct gaagaccgat ccgaccgggc 540 tctcgtcgac ggtgatcgcc gccttcgtca acgtgttcgg cacgctcgtc agcagctcgc 600 acaacaccga ccaggacgcg ctcgcggcgc tgcgcacgct caccaccgcg cagaccgcca 660 cctacaaccg gaacttcccg agcgcgggcc tgggcgcgcc cggttcgtgc cagacgggcg 720 ccgcgaccga aaccgtcggc ggcagccagc acctgctcta ttcgtggggc ggcaccgcga 780 tccagcccac ctccaccgtg ctcggcgtga ccggcgcgac cgacaccagc accggcacgc 840 tcgacgtcgc gaacgtgacc gacccgtcca cgctcgcgct gctcgccacc ggcgcggtga 900 tgatcaatcg cgcctcgggg cagaacgacg ggctcgtctc gcgctgcagc tcgctgttcg 960 ggcaggtgat cagcaccagc taccactgga accatctcga cgagatcaac cagctgctcg 1020 gcgtgcgcgg cgccaacgcg gaagatccgg tcgcggtgat ccgcacgcac gtgaaccggc 1080 tcaagctgca gggcgtgtga tggcgcaggc cgatcgtccg gcgcgcggcg ggctgggagc 1140 te 1142
<210> 3 <211> 1142 <212> ADN <213> pBluescriptKSII+ <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (1142) <223> <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (1142) <223> <220> <221 misc_feature <222> (1) .. (1142) <223> 220> 221> misc_feature 222> (1) .. (1142) 223> <400> 3 aagctttaac gatggagata aacatggtca gattgatgcg ttccagggtg gcggcgaggg 60 cggtggcatg ggcgttggcg gtgatgccgc tggccggcgc ggccgggttg acgatggccg 120 cgtcgcccgc ggccgtcgcg gcggacacct acgcggcgac gcgctatccg gtgatcctcg 180 tccacggcct cgcgggcacc gacaagttcg cgaacgtggt ggactattgg tacggaatcc 240 agagcgatct gcaatcgcat ggcgcgaagg tgtacgtcgc gaatctctcg ggattccaga 300 gcgacgacgg gccgaacggc cgcggcgagc agctgctcgc ctacgtgaag caggtgctcg 360 cggccaccgg cgcgaccaag gtgaacctga tcggccacag ccagggcggc ctgacctcgc 420 gctacgtcgc ggccgtcgcg ccgcaactgg tggcctcggt gacgacgatc ggcacgccgc 480 atcgcggctc cgagttcgcc gacttcgtgc aggacgtgct gaagaccgat ccgaccgggc 540 tctcgtcgac ggtgatcgcc gccttcgtca acgtgttcgg cacgctcgtc agcagctcgc 600 acaacaccga ccaggacgcg ctcgcggcgc tgcgcacggc caccaccgcg cagaccgcca 660 cctacaaccg gaacttcccg agcgcgggcc tgggcgcgcc cggttcgtgc cagacgggcg 720 ccgcgaccga aaccgtcggc ggcagccagc acctgctcta ttcgtggggc ggcaccgcga 780 tccagcccac ctccaccgtg ctcggcgtga ccggcgcgac cgacaccagc accggcacgc 840 tcgacgtcgc gaacgtgacc gacccgtcca cgctcgcgct gctcgccacc ggcgcggtga 900 tgatcaatcg cgcctcgggg cagaacgacg ggctcgtctc gcgctgcagc tcgctgttcg 960 ggcaggtgat cagcaccagc taccactgga accatctcga cgagatcaac cagctgctcg 1020 gcgtgcgcgg cgccaacgcg gaagatccgg tcgcggtgat ccgcacgcac gtgaaccggc 1080 tcaagctgca gggcgtgtga tggcgcaggc cgatcgtccg gcgcgcggcg ggctgggagc 1140 te 1142
<210> 4 <211> 1142 <212> ADN <213> pBluescriptKSII+ 220> 221> misc_featuré 222> (1) .. (1142) 223> <400> 4 aagctttaac gatggagata aacatggtca gattgatgcg ttccagggtg gcggcgaggg 60 cggtggcatg ggcgttggcg gtgatgccgc tggccggcgc ggccgggttg acgatggccg 120 cgtcgcccgc ggccgtcgcg gcggacacct acgcggcgac gcgctatccg gtgatcctcg 180 tccacggcct cgcgggcacc gacaagttcg cgaacgtggt ggactattgg tacggaatcc 240 agagcgatct gcaatcgcat ggcgcgáagg tgtacgtcgc gaatctctcg ggattccaga 300 gcgacgacgg gccgaacggc cgcggcgagc agctgctcgc ctacgtgaag caggtgctcg 360 cggccaccgg cgcgaccaag gtgaacctga tcggccacag ccagggcggc ctgacctcgc 420 gctacgtcgc ggccgtcgcg ccgcaactgg tggcctcggt gacgacgatc ggcacgccgc 480 atcgcggctc cgagttcgcc gacttcgtgc aggacgtgct gaagaccgat ccgaccgggc 540 tctcgtcgac ggtgatcgcc gcctgggtca acgtgttcgg cacgctcgtc agcagctcgc 600 acaacaccga ccaggacgcg ctcgcggcgc tgcgcacgct caccaccgcg cagaccgcca 660 cctacaaccg gaacttcccg agcgcgggcc tgggcgcgcc cggttcgtgc cagacgggcg 720 ccgcgaccga aaccgtcggc ggcagccagc acctgctcta ttcgtggggc ggcaccgcga 780 tccagcccac ctccaccgtg ctcggcgtga ccggcgcgac cgacaccagc accggcacgc 840 tcgacgtcgc gaacgtgacc gacccgtcca cgctcgcgct gctcgccacc ggcgcggtga 900 tgatcaatcg cgcctcgggg cagaacgacg ggctcgtctc gcgctgcagc tcgctgttcg 960 ggcaggtgat cagcaccagc taccactgga accatctcga cgagatcaac cagctgctcg 1020 gcgtgcgcgg cgccaacgcg gaagatccgg tcgcggtgat ccgcacgcac gtgaaccggc 1080 tcaagctgca gggcgtgtga tggcgcaggc cgatcgtccg gcgcgcggcg ggctgggagc 1140 te 1142