WO2003100058A2 - Verfahren zur erzeugung von polynukleotidmolekülen - Google Patents

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WO2003100058A2
WO2003100058A2 PCT/EP2003/005308 EP0305308W WO03100058A2 WO 2003100058 A2 WO2003100058 A2 WO 2003100058A2 EP 0305308 W EP0305308 W EP 0305308W WO 03100058 A2 WO03100058 A2 WO 03100058A2
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stranded polynucleotide
double
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strand breaks
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Markus Matuschek
Bernhard Hauer
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    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing polynucleotide molecules with modified properties.
  • Biomolecules - and especially biopolymers such as polynucleotides, polypeptides, polysaccharides etc. - are not only the basis of the biological life known to us, but are also increasingly being used in a wide variety of technical fields of application.
  • the search for new functional biomolecules, their isolation or production, as well as their technical application is the subject of modern biotechnology.
  • methods have been used for some time that follow the principles of natural evolution in the laboratory.
  • the recombination of sequence sections in nature represents a very successful strategy for the combination of punctual mutations, but also of domains within a polymer, of subunits of a heteromultimer, or of gene variants within a gene cluster or of genes within a genome.
  • homologous recombination ie The combination of corresponding sequence sections from different variants while maintaining orientation and reading frame is of great importance.
  • Recombination can be realized experimentally in different ways: on the one hand in vitro using individual enzyme functions or defined mixtures or sequences of enzymatic processing steps, on the other hand in vivo using cellular recombination and / or repair processes.
  • DNA shuffling also known as secual PCR
  • Any gene fragments that overlap in their sequence are generated and then reconstructed into products of the original length by PCR without addition of primer.
  • fragments of different origins can happen to be homologous to a product molecule in each PCR cycle get connected.
  • DNA shuffling basically allows you to limit the frequency of recombination events.
  • this method is experimentally complex, since the reaction conditions for generating the nucleic acid fragments must first be established.
  • a method which generates heteroduplexes from a population of polynucleotide sequences with mutations, which are then subjected to statistical repair in vivo by insertion into cells or in vitro by incubation with a cell extract, depending on the method relative frequency of the variants in the starting population to a certain extent recombined molecular variants arise (WO 99/29902).
  • This method is characterized by the use of cellular repair systems that specifically recognize unpaired bases and statistically repair one of the two strands in the double strand.
  • the limitation of this method lies on the one hand in the limited efficiency in introducing polynucleotides into cells and in the lack thereof
  • a further disadvantage is that only two starting molecules can be recombined with each other in one repair step.
  • the present invention is therefore based on the object of making available a method for producing polynucleotides with modified properties, which the above avoids the disadvantages of the known methods described and which allows an efficient recombination of genotypes of polynucleotide molecules and which thus leads to the generation of changed phenotypes.
  • the present invention thus relates to a method for producing polynucleotide molecules with modified properties, at least one cycle comprising the following steps:
  • steps (b) and (c) can be carried out sequentially or simultaneously.
  • the method according to the invention is thus characterized by a combination of advantages which cannot be achieved with any of the methods described so far.
  • the low experimental and time expenditure of the method and the possibility of automation are further advantages.
  • the method according to the invention is characterized in that by simultaneous nucleolytic degradation and nucleic acid synthesis; The so-called nick translation thus prevents both excessive fragmentation of the nucleic acids and the degradation of recombinant nucleic acids.
  • the total amount of DNA used is in principle available for the subsequent recombination of the nucleic acids in vitro.
  • the efficiency of the recombination can thus be increased in vitro compared to the methods for recombining nucleic acids described so far.
  • more than one cycle comprising steps (a) through (d) above, i.e. at least two, preferably at least 5, particularly preferably at least 10 and very particularly preferably at least 20.
  • polynucleotides with multiple newly combined sequence regions can be produced from an initial distribution of related polynucleotide sequences.
  • the cyclical application allows several different heterologous sequence sections to be combined with one another.
  • the number of cycles allows the frequency of recombination per strand of polynucleotide to be precisely controlled.
  • the average distance between recombination events from one cycle to the next can also be controlled.
  • a selection step is carried out after one, several or all cycles of the method according to the invention. This can refer to either the genotype or the phenotype or both the genotype and the phenotype of the polynucleotide.
  • the genotype of a polynucleotide is the sequential sequence of different monomers in the polynucleotide.
  • the phenotype is the sum of the functions and properties of a polynucleotide molecule and the transcription or translation products encoded by a polynucleotide.
  • the selection step can take place, for example, in the form of amplification-coupled (natural) selection, selection by physical separation or selection by screening (Koltermann and Kettling, Biophys. Chem. 66 (1999), 159; Kettling et al. Current Topics in Microbiol. and Immunol. 243 (1999), 173; Koltermann, Dissertation, TU Berlin (1998), Zhao et al. in Manual of Ind. Microbiol. and Biotechnol. Chapter 49, pp. 597604, ASM Press, Washington, DC, 1999; Reetz, Angew. Chem. 113 (2001) 113, 292-320.
  • step (a) of the method according to the invention a double-stranded polynucleotide molecule or a population of double-stranded polynucleotide molecules is provided.
  • the population of double-stranded polynucleotide molecules provided according to step (a) of the method according to the invention can be any population of double-stranded polynucleotide molecules which comprises at least two types of polynucleotide molecules, these comprising at least one homologous sequence section and at least one heterologous sequence section.
  • the term “population of single-stranded polynucleotide molecules” denotes a set of polynucleotide molecules, intermolecular interactions in the form of specific base pairings between the molecules being prevented or not existing.
  • polynucleotides includes both DNA and RNA, polynucleotides are linear, oriented (5 '- + 3' direction) heteropolymers, which can be single-stranded or double-stranded. In the double strand, two single strands are bound together by interactions in the form of specific base pairing.
  • the polynucleotides can also be DNA or RNA with modified monomers. In general, the method can also be applied to analogue, artificial polymers and to DNA-RNA hybrid double rods.
  • homologous sections refers to sections that are identical or complementary on two or more polynucleotide molecules, i.e. have the same information at the corresponding position.
  • heterologous sections refers to sections that are not identical or not complementary on two or more polynucleotide molecules, i.e. have different information at the corresponding position.
  • Information of a polynucleotide molecule denotes the sequential sequence of different monomers in a polynucleotide molecule.
  • a heterologous sequence region has a length of at least one nucleotide, but can also be considerably longer.
  • a heterologous sequence region can have a length of two nucleotides, or of three nucleotides, for example of codon, and preferably of more than 5 nucleotides, particularly preferably of more than 10 nucleotides. In principle, there is no limit to the length of a heterologous area. However, a heterologous region should preferably not be longer than 10,000 nucleotides, particularly preferably not longer than
  • Such longer sequence sections can be, for example, the hypervariable regions of a sequence coding for an antibody. Domains of a protein, genes in a gene cluster or regions of a genome.
  • the heterologous regions are preferably sequence regions in which the polynucleotide molecules differ from one another in individual bases. However, heterologous areas can also be based on the fact that deletion, duplication, insertion, inversion or addition is present or has occurred in a polynucleotide molecule.
  • the double-stranded polynucleotide molecules provided according to step (a) of the method according to the invention have at least one homologous and at least one heterologous sequence region according to the invention. However, they preferably have a large number of homologous and heterologous sections. In principle there is no upper limit to the number of homologous and heterologous sections.
  • the homologous sections have a length of preferably at least 5, preferably at least 10 and particularly preferably at least 20 nucleotides. Like the heterologous sections, the homologous sections can be much longer and there is in principle no upper limit for their length. They should preferably be no longer than 50,000 nucleotides, preferably no longer than 20,000 nucleotides, particularly preferably no longer than 10,000 nucleotides and very particularly preferably no longer than 1000 nucleotides.
  • Double-stranded polynucleotide molecules according to step (a) of the method according to the invention can be provided by methods known to the person skilled in the art. These include e.g. physical, chemical, biochemical and biological processes. These include both synthetic and preparative processes such as chemical synthesis of oligonucleotides, synthesis of nucleic acids by polymerase chain reaction (PCR), preparation of plasmids, cosmids, phages, BACs (bacterial artificial chromosomes), YACs (yeast artificial chromosomes) or chromosomal DNA.
  • PCR polymerase chain reaction
  • polynucleotide sequences from the mutant distribution of a quasi-species are used to provide a population of double-stranded polynucleotides with homologous and heterologous sections.
  • the term “related” relates to polynucleotides that are both homologous to one another as well as having heterologous sections.
  • a quasi-species is a dynamic population of mutually related molecular variants (mutants) resulting from faulty replication. It could be shown that according to the quasi-species principle, it is not the wild type (focus of the quasi-species), but the entire distribution that is the object of the selection.
  • the basis for the generation of a quasi-species is an incorrect replication of the molecular variants.
  • replication is preferably carried out with the aid of replication enzymes, i.e. Polymerases that enable the template-controlled synthesis of a polynucleotide molecule.
  • the introduction of errors, i.e. The variation of the molecular information can be caused by the inherently faulty copying process alone, but also by a targeted increase in the inaccuracy of the polymerase (e.g.
  • phenotype of a polynucleotide molecule denotes the sum of the functions and properties of a polynucleotide molecule and the transcription or translation products encoded by a polynucleotide.
  • sequences of different origins can be used, including polynucleotide sequences of a gene family from different species, polynucleotide sequences which are generated in vivo (eg by viruses, by mutator bacteria, by bacteria under UV radiation) or in vitro (eg by means of Q ⁇ -Replicase reaction, faulty PCR) were replicated with a particularly high error rate.
  • the polynucleotides used in the method according to the invention can be any polynucleotides, in particular DNA or RNA molecules.
  • all methods which lead to the cleavage of a phosphodiester bridge bond between 2 nucleotides in a polynucleotide strand of the double-stranded polynucleotide molecule are suitable for generating the single-strand breaks required in step (b) of the method according to the invention.
  • These can be physical or chemical processes (e.g. ultrasound treatment, partial ester hydrolysis).
  • Enzymatic methods are particularly suitable for step (b).
  • Nucleases for example, are suitable for this.
  • the single-strand breaks are introduced by sequence-specific nicking enzymes.
  • nicking enzymes V.Bchl from Bacillus chitinosporus, N.BstNBI from Bacillus stearother ophilus, N.BstSEI from Bacillus stearothermophilus, N.CviPII from Chlorella strain NC64A, N.CviQXI from Chlorella strain NC64A, V.EcoDem from E .coli, V.Hpall from Haemophilus parainfluenzae, V.Neal from Nocardia aero-colonigenes and V.Xorll from Xanthomonas oryzae.
  • the single-strand breaks can be inserted into the double-stranded polynucleotide molecules by means of sequence-unspecific nicking enzymes. It is possible, for example, to use DNase I from calf pancreas with Mg 2+ as a cofactor (Kunitz, J. Genetic Physiology 33 (1950), 349; Kunitz, J. Genetic Physiology 33 (1950), 363, and Melgac and Goldthwaite, J Biological Chem. 243 (1968), 4409).
  • reaction conditions in step (c) are selected depending on the enzymes used.
  • step (c) is carried out under conditions which lead to an increased error rate in the new synthesis.
  • the error rate of the new synthesis can be selected depending on the desired variants to be generated. Usual error rates are 0.1 x 10 ⁇ 3 to 10 x 10 " 3 , ie 0.01 to 1% error (exchange of 1 to 10 bases in a DNA section of 10,000 bases).
  • step (c) It is particularly suitable to carry out step (c) at an error rate of 1 ⁇ 10 -3 to 5 ⁇ 10 -3 , ie 0.1 to 0.5% error, ie there are 1 to 5 bases in a DNA section of 1000 bases exchanged.
  • the error rate of DNA polymerase I is 9 ⁇ 10 -5 (Kunkel et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 1539-1545.
  • the increase in the error rate when using DNA polymerase I consequently means an error rate greater than 9 x 10 ⁇ 6 .
  • the error rate of the new synthesis can in principle e.g. be increased by using mutated DNA polymerase or by choosing the appropriate reaction conditions in step (c).
  • the error rate of resynthesis is increased by polymerases with reduced or no proofreading activity.
  • the error rate of the new synthesis is increased by different nucleotide concentrations as starting materials.
  • concentration of one or more nucleotides can be varied in relation to the other nucleotides.
  • a deficit of a nucleotide, in particular of dATP, is preferred in comparison to the other nucleotides. Concentrations of, for example, 200 ⁇ M dGTP, dCTP and dTTP and of 20 to 50 ⁇ M ATP are suitable.
  • the error rate of the new synthesis is increased by the addition of nucleotide analogs.
  • Deoxyinosinosine triphosphate, 7-desazadesoxyguanosine triphosphate and deoxynucleoside- ⁇ -thio-triphosphate may be mentioned as nucleotide analogs.
  • the use of deoxyinosine triphosphate is particularly preferred.
  • the error rate of the new synthesis is increased by varying the salt concentration. Suitable for this is, for example, an increase in the Mg + ion concentration to concentrations above 1.5 mM.
  • the addition of Mn 2+ ions is also suitable, for example in a concentration range from 0.1 to 1 mM, in particular 0.2 to 0.5 mM.
  • the error rate of the new synthesis is determined by adding
  • Suitable additives are all substances that increase the error rate, examples include dimethyl sulfoxide, polyethylene glycol or glycerin.
  • the additives are particularly preferably added in the following concentrations: DMSO 2 to 10%, PEG 5 to 15%, glycerol> 0 to 30%, preferably 5 to 20%.
  • the error rate of the new synthesis is increased by changing the reaction temperature, in particular by increasing the temperature.
  • steps (b) and (c) are carried out simultaneously.
  • step (d) of the method according to the invention can be done by the production of single-stranded polynucleotide molecules according to step (d) of the method according to the invention.
  • Partially double-stranded polynucleotide molecules of the single-stranded polynucleotide molecules provided from step (d) according to step (e) of the method according to the invention can be produced by methods known to the person skilled in the art. It is preferably achieved by hybridizing the homologous sections of the complementary single-stranded polynucleotide molecules.
  • Hybridization to double-stranded polynucleotides takes place according to methods known to the person skilled in the art. In particular, it can e.g. can be achieved by combining the single strands and setting reaction conditions that promote the annealing of complementary polynucleotides, e.g. by lowering the temperature and / or lowering the salt concentration.
  • step (f) of the method according to the invention a template-directed nucleic acid synthesis is carried out on the basis of the partially double-stranded polynucleotide molecules produced in step (e).
  • template-directed nucleic acid synthesis designates the synthesis of a polynucleotide by extending an existing single strand on the basis of the information from a corresponding template strand.
  • Any enzyme with template-controlled polynucleotide polymerization activity which is capable of synthesizing polynucleotide strands can be used for the polymer reaction.
  • a large number of polymerases from various organisms and with different functions have already been developed. isolated and described.
  • temperature stability a distinction is made between thermostable (37 ° C) and thermostable polymerases (75 to 95 ° C).
  • polymerases differ with regard to the presence of 5 '-3' - and 3 '-5' exonucleolytic activity.
  • DNA-dependent DNA polymerases are the most important polymerases.
  • DNA polymerases with a temperature optimum at or around 37 ° C. can be used. These include, for example, the DNA polymerases I from E. coli, T7 DNA polymerase from bacteriophage T7 and the T4 DNA polymerase from bacteriophage T4, each of which is available from a large number of manufacturers, eg USB, Röche Molecular Biochemicals, Stratagene, NEB or Quantum Biotechnologies, are commercially available.
  • DNA polymerase I from E. coli holoenzyme
  • the enzyme is used for in vitro labeling of DNA using the nick translation method (Rigby et al. (J. Mol. Biol. 113 (1977)), 237-251)).
  • the Klenow fragment of DNA polymerase I from E. coli like the T7 DNA polymerase and the T4 DNA polymerase, has a 5 'exonuclease activity.
  • These enzymes are therefore used for so-called filling reactions or for the synthesis of long strands (Young et al. (Biochemistry 31 (1992), 8675-8690), Lehman (Methods Enzymol. 29 (1974), 46-53)).
  • the 3 '-5' exo (-) variant of the Klenow fragment of DNA polymerase I from E. coli also lacks the 3 'exonuclease activity.
  • This enzyme is often used for Sanger DNA sequencing (Sanger (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467)).
  • Sanger DNA sequencing Sanger (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467).
  • thermostable DNA polymerase with a temperature optimum at 75 ° C and sufficient stability at 95 ° C is the Taq DNA polymerase from Thermus aquaticus, which is commercially available.
  • the Taq DNA polymerase is a highly processive 5 '-3' DNA polymerase without 3 '-5' exonuclease activity. It is often used for standard PCRs, for sequencing reactions and for mutagenic PCRs (Cadwell and Joyce (PCR Methods Appl. 3 (1994), 136-140, Agrogoni and Kaminski (Methods Mol. Biol.
  • Tth DNA polymerase from Thermus thermophilus HB8 and the Tfl DNA polymerase from Thermus flavus have similar properties, but the Tth DNA polymerase additionally has an intrinsic reverse transcriptase (RT) Activity in the presence of manganese ions on (Cusi et al.
  • RT reverse transcriptase
  • thermostable DNA polymerases without 5'- but with 3'-exonuclease activity become commercial distributed: Pwo DNA polymerase from Pyrococcus woesei, Tli, Vent or DeepVent DNA polymerase from Thermococcus litoralix, Pfx or Pfu DNA polymerase from Pyrococcus furiosus, Tub DNA polymerase from Thermus ubiquitous, Tma - or UlTma DNA polymerase from Thermotoga maritima (Newton and Graham, in: PCR, spectrum Akad. Verlag Heidelberg (1994), 1)).
  • Polymerases without 3 'proofreading exonuclease activity are used to amplify PCR products as error-free as possible.
  • RNA-dependent DNA polymerases include the AMV reverse transcriptase from the Avian myeloblastosis virus, the M-MuLV reverse transcriptase from Moloney Murine leukemia virus, and the HUV reverse transcriptase from the human immunodeficiency virus the most common enzymes, which are also commercially available from various providers such as NEB, Life Technologies, Quantum Biotechnologies.
  • the AMV reverse transcriptase has an associated RNase-H activity. This is significantly reduced with the M-MuLV reverse transcriptase. Both M-MuLV and AMV reverse transcriptase lack 3 '-5' exonuclease activity.
  • DNA-dependent RNA polymerases include RNA polymerase from E. coli, SP6-RNA polymerase from Salmonella thyphimurium LT2 infected with bacteriophage SP6, T3-RNA polymerase from bacteriophage T3, and T7- RNA polymerase from bacteriophage T7 among the most common enzymes.
  • the template strands in step (f) of the method are DNA molecules, and a DNA-dependent DNA polymerase is used for the template-directed single-strand synthesis.
  • a non-thermostable DNA polymerase is used, particularly preferably one with 5'- and 3 '-exonucleolytic activity, e.g. Polymerase I from E. coli.
  • a non-thermostable DNA polymerase can be used which does not have 5'-1-3 '-exonucleolytic activity, but does have a 3' - + - 5 '-exonucleolytic activity, e.g. the Klenow fragment of DNA polymerase I from E. coli, the T7 DNA polymerase from bacteriophage T7 or the T4 DNA polymerase from bacteriophage T4.
  • a non-thermostable DNA polymerase can be used, which has neither 5'-3'- nor 3 '- + - 5' -exonucleolytic activity, such as the 3 '-5' -exo (-) variant of Klenow Fragment of DNA polymerase I from E. coli.
  • a thermostable polymerase eg Taq-Pol, Pwo-Pol is used.
  • This in turn can have 5 '- and 3' -exonucleolytic activity or 5 '-exonucleolytic activity, but no 3' -exonucleolytic activity such as the Taq-DNA polymerase from Thermus aquaticus, the Tth-DNA polymerase from Thermus thermo - philis HB8 or the Tfl-DNA polymerase from Thermus flavus.
  • thermostable DNA polymerase may not have 5 '- + 3' - but 3 '- + 5' exonucleolytic activity, e.g. the Pwo-DNA polymerase from Pyrococcus woesei, the VentR-DNA polymerase, the DeepVentR-DNA polymerase or the Tli-DNA polymerase from Thermococcus litoralis, the Pfu-DNA polymerase or the Pfx-DNA polymerase Pyrococcus furiosus or Tma DNA polymerase or Ulma DNA polymerase from Thermotoga maritima.
  • the Pwo-DNA polymerase from Pyrococcus woesei the VentR-DNA polymerase, the DeepVentR-DNA polymerase or the Tli-DNA polymerase from Thermococcus litoralis
  • the Pfu-DNA polymerase or the Pfx-DNA polymerase Pyrococcus furiosus or Tma DNA polymerase or Ulma
  • thermostable polymerase which has neither 3 '- + 5'- nor 5'-1-3' -exonuclelytic activity, e.g. the Stoffel fragment of the Taq DNA polymerase from Thermus aquaticus, the Tsp DNA polymerase or the exo (-) variant of the VentR-DNA polymerase or DeepVentR-DNA polymerase from Thermococcus litoralis.
  • thermostable polymerase the polymerase reaction preferably follows directly on to step (e) without intermediate purification or further sample treatment.
  • the matrix strands in step (f) of the method according to the invention on which the template-oriented. Single strand synthesis takes place, RNA molecules.
  • an RNA-dependent DNA polymerase is used for the template-directed single-strand synthesis, preferably AMV reverse transcriptase from the Avian myeloblastosis virus, HIV reverse transcriptase from the human immunodeficiency virus, or M-MuLV reverse transcriptase from the Moloney Murine Leukemia Virus.
  • a thermostable reverse transcriptase is preferably used, very particularly the Tth DNA polymerase from Thermus thermophilus with intrinsic reverse transcriptase activity. example 1
  • LipA H86W encoded by pBP2035 LipA S87T encoded by pBP2008
  • LipA F142W encoded by pBP2006 LipA L167A encoded by pBP2007.

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Erzeugung von Polynukleotidmolekülen mit veränderten Eigenschaften, wobei mindestens ein Zyklus umfassend die folgenden Schritte durchlaufen wird:(a) Bereitstellung eines doppelsträngigen Polynukleotidmoleküls oder einer Population doppelsträngiger Polynukleotidmoleküle, wobei die einzelnen Polynukleotide dieser Population mindestens einen homologen Sequenzabschnitt und mindestens einen heterologen Sequenzabschnitt besitzen,(b) Erzeugung von Einzelstrangbrüchen in den doppelsträngigen Polynukleotidmolekülen(c) nukleolytischer Abbau in 5'!3'Richtung ausgehend von den Einzelstrangbrüchen bei gleichzeitiger Neusynthese in 5'!3'Richtung unter Verschiebung der Einzelstrangbrüche in Richtung des 3'-Endes (d) Herstellung einzelsträngiger Polynukleotidmolekülen(e) Herstellung von partiell doppelsträngigen Polynukleotidmolekülen der aus Schritt (d) bereitgestellten einzelsträngigen Polynukleotidmolekülen(f) template-gerichtete Nukleinsäuresynthese ausgehend von den in Schritt (e) hergestellten partiell doppelsträngigen Polynukleotidmolekülenwobei die Schritte (b) und (c) nacheinander oder gleichzeitig ausgeführt werden können.

Description

Verfahren zur Erzeugung von Polynukleotidmolekulen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von Polynukleotidmolekulen mit veränderten Eigenschaften.
Biomoleküle - und insbesondere Biopolymere wie Polynukleotide, Polypeptide, Polysaccharide etc. - sind nicht nur Grundlage des uns bekannten biologischen Lebens, sondern finden zunehmend auch in den verschiedensten technischen Anwendungsfeidern Verwendung. Die Suche nach neuen funktionalen Biomolekülen, ihre Isolierung bzw. Herstellung, sowie ihre technische Anwendung ist Gegenstand der modernen Biotechnologie. Neben das zufällige Auffinden von bislang unbekannten Biomolekülen mit gewünschten Eigenschaften in der Natur (vgl. Naturstoff-Screening) treten seit einiger Zeit Verfahren, die die Prinzipien der natürlichen Evolution im Labor nachvo11ziehen.
Neben den Verfahren zum Erzeugen punktueller Mutationen (in Form von Basenaustausch, -deletion und -insertion) stellt die Rekombination von Sequenzabschnitten in der Natur eine sehr erfolgreiche Strategie zur Kombination von punktuellen Mutationen, aber auch von Domänen innerhalb eines Polymers, von Untereinheiten eines Heteromultimers, oder von Genvarianten innerhalb eines Genclusters oder von Genen innerhalb eines Genoms dar. Insbesondere der homologen Rekombination, d.h. der Kombination sich entsprechender Sequenzabschnitte aus verschiedenen Varianten unter Beibehaltung von Orientierung und Leseraster kommt eine große Bedeutung zu.
Experimentell lässt sich Rekombination unterschiedlich realisieren: Einerseits in-vitro unter Verwendung einzelner Enzym- funktionen oder definierter Mischungen bzw. Abfolgen enzyma- tischer Prozessierungsschritte, andererseits in-vivo unter Verwendung zellulärer Rekombinations- und/oder Reparaturprozesse.
Für in-vitro-Verfahren werden technisch bislang vorwiegend PCR-basierende Verfahren eingesetzt. Zunächst ist hier das DNA-Shuffling, auch als secual PCR bezeichnet, zu nennen (WO 95/22625; Stemmer, Nature 370 (1994), 389). Hierbei werden beliebige in ihrer Sequenz überlappende Genfragmente erzeugt und anschließend durch PCR ohne Primi r-Zugabe wieder zu Produkten der Originallänge aufgebaut. Durch gegenseitiges Primen der Fragmente könnnen so bei jedem PCR-Zyklus Fragmente unterschiedlichen Ursprungs zufällig zu einem Produktmolekül homolog verbunden werden. Durch Einstellen der Fragmentlänge ermöglicht das DNA-Shuffling prinzipiell ein Eingrenzen der Häufigkeit von Rekombinationsereignissen. Jedoch ist dieses Verfahren experimentell aufwendig, da zunächst die Reaktionsbedingungen zur Erzeugung der Nukleinsäurefragmente etabliert werden müssen. Ein anderes Verfahren zur Herstellung rekombinanter DNA in-vitro wurde von Shao et al., Nucl. Acids Res. 26 (1998), 681). In diesem Verfahren werden Primer mit randomisierten Sequenzen verwendet, die ein Starten der Polymerisation an zufälligen Stellen innerhalb eines Polynukleotids ermöglichen. So entstehen ähnlich dem DNA-Shuffling kurze Polynukleotid-Fragmente, die durch gegenseitiges Primen miteinander rekombinieren können. Ein Steuern der Rekombinationshäufigkeit ist mit dieser Methode kaum möglich. Außerdem führen die unspezifischen Primer zu einer vergleichsweise hohen inhärenten Fehlerrate, die bei sensiblen Sequenzabschnitten und/oder langen Genen problematisch werden kann. Alternativ zu diesen Methoden verwendet der staggered extension process (WO 98/42728; Zhao et al., Nat. Biotechnol.' 16 (1998), 258) ein modifiziertes PCR-Protokoll um einen Strang- austausch während der PCR-Amplifikation zu provozieren. Durch Verwendung sehr kurzer Phasen bei der Polymerisationstemperatur zwischen den Aufschmelz- und Annealingphasen können unvollständig gebildete Produkte mit neuen Matrizen hybridisieren und weiter verlängert werden. Das Einstellen der Rekombinationshäufigkeit kann durch Vorgabe der Polymerisationszeit und der Zyklusanzahl erfolgen. Technisch limitierend ist hier das exakte Einstellen sehr kurzer Phasen einer bestimmten Temperatur. Alternativ zu diesen PCR-basierenden Verfahren ist ein Verfahren beschrieben, das aus einer Population von Polynukleotidsequenzen mit Mutationen Heteroduplices erzeugt, welche dann in-vivo durch Einfügen in Zellen oder in-vitro durch Inkubation mit einem Zellextrakt einer statistischen Reparatur unterworfen werden, wodurch je nach relativer Häufigkeit der Varianten in der Ausgangspopulation zu einem gewissen Anteil rekombinierte Molekül- Varianten entstehen (WO 99/29902) . Charakteristisch für dieses Verfahren ist die Verwendung von zellulären Reparatursystemen, die spezifisch ungepaarte Basen erkennen und statistisch einen der beiden Stränge im Doppelstrang reparieren. Die Limitation dieses Verfahrens liegt einerseits in der begrenzten Effizienz, Polynukleotide in Zellen einzubringen und in der fehlenden
Kontrollierbarkeit der Reparaturprozesse. Weiterhin ist von entscheidendem Nachteil, dass in einem Reparaturschritt nur jeweils zwei Ausgangsmoleküle miteinander rekombiniert werden können.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Polynukleotiden mit veränderten Eigenschaften zur Verfügung zu stellen, das die oben beschriebenen Nachteile der bekannten Verfahren vermeidet und das eine effiziente Neukombination von Genotypen von Polynukleotid- Molekülen erlaubt und das so zur Erzeugung veränderter Phänotypen führt .
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen dargestellten Ausführungsformen gelöst.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung von Polynukleotidmolekulen mit veränderten Eigenschaften, wobei mindestens ein Zyklus umfassend die folgenden Schritte durchlaufen wird:
(a) Bereitstellung eines doppelstrangigen Polynukleotidmoleküls oder einer Population doppelsträngiger Polynukleotidmoleküle, wobei die einzelnen Polynukleotide dieser Population mindestens einen homologen Sequenzabschnitt und mindestens einen heterologen Sequenzabschnitt besitzen,
(b) Erzeugung von Einzelstrangbruchen in den doppelstrangigen Polynukleotidmolekulen
(c) nukleolytischer Abbau in 5 '—»-3 'Richtung ausgehend von den Einzelstrangbruchen bei gleichzeitiger Neusynthese in 5 '—»-3 'Richtung unter Verschiebung der EinzelStrangbrüche in Richtung des 3 ' -Endes
(d) Herstellung einzelsträngiger Polynukleotidmoleküle
(e) Herstellung von partiell doppelstrangigen Polynukleotidmolekulen der aus Schritt (d) bereitgestellten einzelstrangigen Polynukleotidmolekulen
(f) template-gerichtete Nukleinsäuresynthese ausgehend von den in Schritt (e) hergestellten partiell doppelstrangigen Polynukleotidmolekulen
wobei die Schritte (b) und (c) nacheinander oder gleichzeitig ausgeführt werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich somit durch eine Kombination von Vorteilen aus, die so mit keinem der bisher beschriebenen Verfahren erreichbar ist . Der geringe experimentelle und zeitliche Aufwand der Methode und die Möglichkeit der Auto- matisierung sind weitere Vorzüge. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass durch gleichzeitigen nukleolytischen Abbau und Nukleinsäure- synthese; also durch die sogenannte Nick-Translation sowohl eine übermäßige Fragmentierung der Nukleinsäuren als auch der Abbau rekombinantionsfähiger Nukleinsäuren vermieden wird. Für die anschließende Rekombination der Nukleinsäuren in-vitro steht prinzipiell die Gesamtmenge der eingesetzten DNA zur Verfügung.
Die Effizienz der Rekombination kann dadurch gegenüber den bis- her beschriebenen Methoden zur Rekombination von Nukleinsäuren in-vitro gesteigert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird mehr als ein Zyklus umfassend die obengenannten Schritte (a) bis (d) durchlaufen, d.h. mindestens zwei, vorzugsweise mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 10 und ganz besonders bevorzugt, mindestens 20.
Durch die zyklische Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich so aus einer Ausgangsverteilung verwandter Poly- nukleotidsequenzeri Polynukleotide mit mehrfach neu kombinierten Sequenzbereichen herstellen. Insbesondere erlaubt die zyklische Anwendung, mehrere verschiedene heterologe Sequenzabschnitte miteinander zu kombinieren. Weiterhin kann durch die Anzahl der Zyklen die Rekombinationshäufigkeit pro Polynukleotidstrang exakt gesteuert werden. Bei zyklischer Anwendung lässt sich so auch der mittlere Abstand zwischen Neukombinationsereignissen von einem zum nächsten Zyklus steuern.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird nach einem, mehreren oder allen Zyklen des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Selektionsschritt ausgeführt. Dieser kann sich entweder auf den Genotyp oder auf den Phänotyp oder sowohl auf den Genotyp als auch auf den Phänotyp des Polynukleotids beziehen.
Der Genotyp eines Polynukleotids ist dabei die sequentielle Abfolge von verschiedenen Monomeren in dem Polynukleotid. Der Phänotyp ist die Summe der Funktionen und Eigenschaften eines Polynukleotidmoleküls sowie der durch ein Polynukleotid codierten Transkriptions- oder Translationsprodukte.
Der Selektionsschritt kann dabei z.B. in Form von amplifikations- gekoppelter (natürlicher) Selektion, Selektion durch physikalische Separation oder Selektion durch Screening erfolgen (Koltermann und Kettling, Biophys. Chem. 66 (1999), 159; Kettling et al. Current Topics in Microbiol. and Immunol. 243 (1999), 173; Koltermann, Dissertation, TU Berlin (1998), Zhao et al. in Manual of Ind. Microbiol. and Biotechnol. Chapter 49, pp. 597604, ASM Press, Washington, DC, 1999; Reetz, Angew. Chem. 113 (2001) 113, 292-320. In Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein doppelsträngiges Polynukleotidmolekül oder eine Population doppelsträngiger Polynukleotidmoleküle bereitgestellt .
Bei der gemäß Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitgestellten Population aus doppelstrangigen Polynukleotidmolekulen kann es sich um jede beliebige Population doppelsträngiger Polynukleotidmoleküle handeln, die mindestens zwei Arten von Polynukleotidmolekulen umfasst, wobei diese mindestens einen homologen Sequenzabschnitt und mindestens einen heterologen Sequenzabschnitt umfassen. Der Begriff "Population einzel- strängiger Polynukleotidmoleküle" bezeichnet dabei eine Menge von Polynukleotidmolekulen, wobei intermolekularen Wechsel- Wirkungen in Form von spezifischen Basenpaarungen zwischen den Molekülen verhindert werden oder nicht bestehen. Der Begriff "Polynukleotide" (Nukleinsäuren, Oligonukleotide) umfasst dabei sowohl DNA als auch RNA, Polynukleotide sind lineare, orientierte (5 '-+3 'Richtung) Heteropolymere, die einzelsträngig oder doppel- strängig vorliegen können. Im Doppelstrang sind zwei Einzelstränge durch Wechselwirkungen in Form spezifischer Basenpaarung aneinander gebunden. Prinzipiell können die Polynukleotide auch DNA oder RNA mit modifizierten Monomeren sein. Generell lässt sich das Verfahren auch auf analog aufgebaute, artifizielle Polymere anwenden sowie auf DNA-RNA Hybrid Doppelstänge.
Der Begriff "Homologe Abschnitte" bezeichnet Abschnitte, die auf zwei oder mehr Polynukleotidmolekulen identisch oder komplementär sind, d.h. an der entsprechenden Position die gleiche Information aufweisen. Der Begriff "Heterologe Abschnitte" bezeichnet Abschnitte, die auf zwei oder mehr Polynukleotidmolekulen nicht identisch bzw. nicht komplementär sind, d.h. an der entsprechenden Position eine voneinander abweichende Information aufweisen. Information eines Polynukleotidmoleküls (Genotyp) bezeichnet dabei die sequentielle Abfolge von verschiedenen Monomeren in einem Polynukleotidmolekül. Ein heterologer Sequenz- bereich hat eine Länge von mindestens einem Nukleotid kann jedoch auch wesentlich länger sein. Insbesondere kann ein heterologer Sequenzbereich eine Länge von zwei Nukleotiden, oder von drei Nukleotiden, beispielsweise von Codon, sowie vorzugsweise von mehr als 5 Nukleotiden, besonders bevorzugt von mehr als 10 Nukleotiden aufweisen. Nach oben ist der Länge eines heterologen Bereichs im Prinzip keine Grenze gesetzt. Allerdings sollte ein heterologer Bereich vorzugsweise nicht länger als 10000 Nukleotide, besonders bevorzugt nicht länger als
5000 Nukleotide, insbesondere nicht länger als 2000 Nukleotide und ganz besonders bevorzugt nicht länger als 1000 Nukleotide sein. Derartige längere Sequenzabschnitte können beispielsweise die hypervariablen Bereiche einer einen Antikörper codierenden Sequenz sein. Domänen eines Proteins, Gene in einem Gencluster oder Bereiche eines Genoms . Vorzugsweise handelt es sich bei 5 den heterologen Bereichen um Sequenzbereiche in denen die Polynukleotidmoleküle in einzelnen Basen voneinander abweichen. Heterologe Bereiche können jedoch auch darauf beruhen, dass in einem Polynukleotidmolekül eine Deletion, Duplikation, Insertion, Inversion oder Addition vorliegt oder aufgetreten ist. 0
Die gemäß Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitgestellten doppelstrangigen Polynukleotidmoleküle weisen erfindungsgemäß mindestens einen homologen und mindestens einen heterologen Sequenzbereich auf. Vorzugsweise weisen sie jedoch eine Vielzahl homologer und heterologer Abschnitte. Der Anzahl der homologen- und heterologen Abschnitte ist nach oben prinzipiell keine Grenze gesetzt.
Die heterologen Abschnitte in den doppelstrangigen Polynukleotid- molekülen werden dabei jeweils von homologen Abschnitten unter- • brochen. Dabei haben die homologen Abschnitte eine Länge von vorzugsweise mindestens 5, bevorzugt von mindestens 10 und besonders bevorzugt von mindestens 20 Nukleotiden. Wie die heterologen Abschnitte können aber auch die homologen Abschnitte wesentlich länger sein und eine obere Grenze für ihre Länge gibt es im Prinzip nicht. Vorzugsweise sollten sie nicht länger als 50000 Nukleotide, bevorzugt nicht länger als 20000 Nukleotide, besonders bevorzugt nicht länger als 10000 Nukleotide und ganz besonders bevorzugt nicht länger als 1000 Nukleotide sein.
Das Bereitstellen doppelsträngiger Polynukleotidmoleküle gemäß Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren erfolgen. Hierzu zählen z.B. physikalische, chemische, biochemische und biologische Verfahren. Hierzu zählen sowohl synthetische als auch präparative Verfahren wie z.B. chemische Synthese von Oligonukleotiden, Synthese von Nukleinsäuren durch Polymerase-Kettreaktion (PCR) , Präparation von Plasmiden, Cosmiden, Phagen, BACs (bacterial artificial chromosome) , YACs (yeast artificial chromosome) oder chromo- somaler DNA.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden für das Bereitstellen einer Population doppelsträngiger Polynukleotide mit homologen und heterologen Abschnitten verwandte Polynukleotid-Sequenzen aus der Mutantenverteilung einer Quasi-Spezies verwendet. Der Begriff "verwandt" betrifft dabei Polynukleotide, die untereinander sowohl homologe als auch heterologe Abschnitte aufweisen. Als Quasi-Spezies wird dabei eine durch fehlerhafte Replikation entstehende, dynamische Population miteinander verwandter Molekülvarianten (Mutanten) bezeichnet. Es konnte gezeigt werden, dass entsprechend des Quasi-Spezies-Prinzips nicht der Wildtyp (Schwerpunkt der QuasiSpezies) , sondern die gesamte Verteilung Objekt der Selektion ist. Unter veränderten Selektionsbedingungen sind vorteilhafte Varianten in einer solchen Mutantenverteilung bereits entsprechend ihrem Fitnesswert enthalten und müssen nicht erst durch anschließende, zufällige Mutationen entstehen. Bei sukzessiver Verschiebung der Selektionsparameter gleicht die evolutive Generierung dann einer implizit gelenkten Drift der Quasi-Spezies entlang von Graten der Wertelandschaft. Die Herstellung von Quasi-Spezies und die Anwendung dieses Prinzips für die evolutive Biotechnologie ist beschrieben in WO 92/18645.
Grundlage für die Erzeugung einer Quasi-Spezies ist eine fehlerhafte Replikation der Molekülvarianten. Bei Verwendung von Poly- nukleotiden erfolgt die Replikation bevorzugt mit Hilfe von Replikationsenzymen, d.h. Polymerasen, die die matrizengesteuerte Synthese eines Polynukleotidmoleküls ermöglichen. Die Einführung von Fehlern, d.h. die Variation der Molekülinformation, kann durch den inhärent fehlerhaften Kopierprozess allein, aber auch durch eine gezielte Erhöhung der Ungenauigkeit der Polymerase (z.B. definiert ungleichgewichtige Zugabe der Monomere, Zugabe von Basenanaloga, fehlerhafte PCR, Polymerasen mit sehr hoher Fehlerrate) , durch chemische Modifikation von Polynukleotiden nach erfolgter Synthese, durch die komplette Synthese von Polynukleotiden unter zumindest teilweisem Einsatz von Monomer- gemischen und/oder von Nukleotidanaloga, sowie durch eine Kombination dieser Verfahren erreicht werden. Vorzugsweise werden Mutantenverteilungen einer Quasi-Spezies eingesetzt, wobei die einzelnen Mutanten der Quasi-Spezies in ihren phänotypischen Eigenschaften einer gewünschten molekularen Funktion gegenüber dem Wildtyp bereits verbessert sind. Der Begriff "Phänotyp eines Polynukleotidmoleküls" bezeichnet die Summe der Funktionen und Eigenschaften eines Polynukleotidmoleküls sowie der durch ein Polynukleotid codierten Transkriptions- oder Translationsprodukte .
Darüber hinaus können Sequenzen unterschiedlichen Ursprungs Verwendung finden, u.a. Polynukleotid-Sequenzen einer Genfamilie aus unterschiedlichen Spezies, Polynukleotid-Sequenzen, die in-vivo (z.B. durch Viren, durch Mutatorbakterien, durch Bakterien unter UV-Bestrahlung) oder in-vitro (z.B. mittels Qß-Replikase-Reaktion, fehlerhafter PCR) mit besonders hoher Fehlerrate repliziert wurden. Polynukleotid-Sequenzen, in die nach Synthese mittels chemischer Agenzien Mutationen eingeführt wurden oder die chemisch derart synthetisiert wurden, dass sie homologe und heterologe Abschnitte aufweisen, oder Polynukleotid-Sequenzen, die durch eine Kombination vorgenannter Verfahren erzeugt wurden. Prinzipiell, kann es sich bei den Poly- nukleotiden, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, um beliebige Polynukleotide handeln, insbesondere um DNA- oder RNA-Moleküle .
Zur Erzeugung der in Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlichen Einzelstrangbrüche eignen sich prinzipiell alle Methoden, die zur Spaltung einer Phosphodiesterbrücken- bindung zwischen 2 Nukleotiden in einem Polynukleotidstrang des doppelstrangigen Polynukleotidmoleküls führen. Dies können physikalische oder chemische Verfahren sein (z.B. Ultraschallbehandlung, partielle Esterhydrolyse) .
Besonders geeignet für Schritt (b) sind enzymatische Methoden.
Geeignet hierfür sind beispielsweise Nukleasen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren werden die Einzelstrangbrüche durch sequenzspezifische Nicking Enzyme eingeführt.
Beispiele hierfür sind die Nicking-Enzyme V.Bchl aus Bacillus chitinosporus , N.BstNBI aus Bacillus stearother ophilus, N.BstSEI aus Bacillus stearothermophilus, N.CviPII aus Chlorella strain NC64A, N.CviQXI aus Chlorella strain NC64A, V.EcoDem aus E.coli, V.Hpall aus Haemophilus parainfluenzae, V.Neal aus Nocardia aero- colonigenes und V.Xorll aus Xanthomonas oryzae.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die Einzelstrangbrüche in die doppelstrangigen Polynukleotidmoleküle durch sequenzunspezifische Nicking-Enzyme eingefügt werden. Möglich ist dabei z.B. die Verwendung von DNase I aus Kälberpankreas mit Mg2+ als Cofactor (Kunitz, J. Genetic Physiology 33 (1950), 349; Kunitz, J. Genetic Physiology 33 (1950), 363, und Melgac und Goldthwaite, J. Biolog. Chem. 243 (1968), 4409).
Die Reaktionsbedingungen in Schritt (c) werden in Abhängigkeit von den eingesetzten Enzymen gewählt .
In einer bevorzugten Ausführungsform wird Schritt (c) unter Bedingungen durchgeführt die zu einer erhöhten Fehlerrate der Neusynthese führen. Die Fehlerrate der Neusynthese kann dabei in Abhängigkeit der gewünschten zu erzeugenden Varianten gewählt werden. Übliche Fehlerraten sind 0,1 x 10~3 bis 10 x 10"3, d.h. 0,01 bis 1 % Fehler (Austausch von 1 bis 10 Basen in einem DNA-Abschnitt von 10000 Basen) .
Besonders geeignet ist die Durchführung von Schritt (c) bei einer Fehlerrate von 1 x 10~3 bis 5 x 10~3, d.h. 0,1 bis 0,5 % Fehler, d.h. es werden 1 bis 5 Basen in einem DNA-Abschnitt von 1000 Basen ausgetauscht.
Die Fehlerrate der DNA-Polymerase I beträgt 9 x 10~5 (Kunkel et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:1539-1545. Die Erhöhung der Fehlerrate bei Verwendung der DNA-Polymerase I bedeutet folglich eine Fehlerrate größer als 9 x 10~6.
Die Fehlerrate der Neusynthese kann prinzipiell z.B. durch Einsatz mutierter DNA-Polymerase erhöht werden oder durch Wahl der geeigneten Reaktionsbedingungen in Schritt (c) .
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Fehlerrate der Neusynthese erhöht durch Polymerasen mit verringerter oder ohne Korrekturleseaktivität .
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Fehlerrate der Neusynthese durch unterschiedliche Nukleotidkonzentrationen als Edukte erhöht. Dabei kann die Konzentration einzelner oder mehrerer Nukleotide im Verhältnis zu den übrigen Nukleotiden variiert werden. Bevorzugt ist ein Unterschuss eines Nukleotids, insbesondere von dATP im Vergleich zu den übrigen Nukleotiden. Geeignet sind Konzentrationen von beispielsweise je 200 μM dGTP, dCTP und dTTP und von 20 bis 50 μM ATP.
Bevorzugt ist ein Unterschuss zweier Nukleotide, insbesondere von dATP und dGTP in Vergleich zu den übrigen Nukleotiden. Geeignet sind Konzentrationen von beispielsweise je 200 μM dCTP und dTTP und je 40 μM dATP und dGTP.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Fehlerrate der Neusynthese durch den Zusatz von Nukleotidanaloga erhöht. Als Nukleotidanaloga seien genannt Desoxyinosinosintriphosphat, 7-Desazadesoxyguanosintriphosphat und Desoxynucleosid-α-thio-triphosphat. Besonders bevorzugt ist der Einsatz von Desoxyinosintriphosphat . In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Fehlerrate der Neusynthese durch Variation der Salzkonzentration erhöht. Geeignet hierfür ist beispielsweise eine Erhöhung der Mg+-lonen Konzentration auf Konzentrationen über 1,5 mM. Weiterhin geeignet ist die Zugabe von Mn2+-Ionen, beispielsweise in einem Konzentrationsbereich von 0,1 bis 1 mM, insbesondere 0,2 bis 0,5 mM.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver- fahrens wird die Fehlerrate der Neusynthese durch Zusatz von
Addition erhöht. Geeignete Additive sind alle Substanzen, welche die Fehlerrate erhöhen, exemplarisch seien genannt Dimethyl- sulfoxid, Polyethylenglykol oder Glycerin. Besonders bevorzugt werden die Additive in folgenden Konzentrationen zugegeben: DMSO 2 bis 10 %, PEG 5 bis 15 %, Glycerin > 0 bis 30 %, bevorzugt 5 bis 20 %.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Fehlerrate der Neusynthese durch eine Änderung der Reaktionstemperatur, insbesondere durch eine Temperaturerhöhung, erhöht.
Alle genannten Maßnahmen zur Erhöhung der Fehlerrate können auch in Kombination miteinander durchgeführt werden, z.B. Über- schuss eines Nukleotids bei erhöhter Mn2+ Ionen Konzentration.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Schritte (b) und (c) gleichzeitig durchgeführt.
Die Herstellung einzelstängiger Polynukleotidmoleküle gemäß Schritt (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durch dem
Fachmann bekannte Verfahren erfolgen. Hierzu zählen z.B. physiJ kaiische, chemische, biochemische und biologische Verfahren. Beispielhaft aufgezählt seien dabei das Aufschmelzen von Poly- nukleotid-Doppelsträngen mittels Erhitzen auf Temperaturen oberhalb der Annealingtemperatur (Newton, in: PCR, Spektrum Akademischer Verlag (1994) ; Lazurkin, Biopolymers 9 (1970) , 1253-1306) , die Denaturierung von Polynukleotid-Doppelsträngen mittels Zugabe von Denaturierungsreagenzien (z.B. Harnstoff oder Detergenzien) , die Zugabe von Enzymen, welche aus doppel- strängigen Polynukleotiden einzelsträngige Polynukleotide machen, z.B. durch exonukleolytischen Abbau von doppelsträngiger DNA zu einzelsträngiger DNA.
Die Herstellung von partiell doppelstrangigen Polynukleotid- molekülen der aus Schritt (d) bereitgestellten einzelstrangigen Polynukleotidmolekulen gemäß Schritt (e) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren erfolgen. Sie wird vorzugsweise durch Hybridisierung der homologen Abschnitte der komplementären einzelstrangigen Polynukleotidmoleküle erreicht.
Die Hybridisierung zu Doppelstrang-Polynukleotiden erfolgt nach dem Fachmann bekannten Methoden. Insbesondere kann sie z.B. erreicht werden durch Zusammengeben der Einzelstränge und Einstellung von Reaktionsbedingungen, die das Annealing komplementärer Polynukleotide fördern, wie z.B. durch Absenken der Temperatur und/oder Erniedrigung der Salzkonzentration.
In Schritt (f) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ausgehend von den in Schritt (e) hergestellten partiell doppelstrangigen Polynukleotidmolekulen eine template-gerichtete Nukleinsäure- synthese durchgeführt.
Der Begriff "template-gerichtete Nukleinsäuresynthese" bezeichnet dabei die Synthese eines Polynukleotids durch Verlängerung eines existierenden Einzelstrangs anhand der Information eines ent- sprechenden Matrizenstrangs.
Die Durchführung einer derartigen template-gerichteten Poly- merisierung ist dem Fachmann geläufig und ist z.B. beschrieben in Sambrook (Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory Press (1989) ) .
Für die Polymer sereaktion kann ein beliebiges Enzym mit matrizengesteuerter Polynukleotid-Polymerisations-Aktivität eingesetzt werden, das in der Lage ist Polynukleotidstränge zu synthetisieren. Eine Vielzahl an Polymerasen aus verschiedensten Organismen und mit unterschiedlichen Funktionen wurden bereits . isoliert und beschrieben. In Bezug auf die Art von Matrize und synthetisiertem Polynukleotid werden DNA-abhängige DNA-Polymerasen, RNA-abhängige DNA-Polymerasen (Reverse Transkriptasen) , DNA-abhängige RNA-Polymerasen und RNA-abhängige RNA-Polymerasen (Replikasen) unterschieden. In Bezug auf die Temperaturstabilität werden nicht thermostabile (37°C) und thermostabile Polymerasen (75 bis 95°C) unterschieden. Weiterhin unterscheiden sich Polymerasen in Bezug auf das Vorhandensein von 5 ' -3 ' - und 3 ' -5 ' -exo- nukleolytischer Aktivität. DNA-abhängige DNA-Polymerasen stellen die wichtigsten Polymerasen dar.
Verwendet werden können insbesondere DNA-Polymerasen mit einem Temper turoptimum bei oder um 37°C. Hierzu gehören beispiels- weise die DNA-Polymerasen I aus E. coli, T7-DNA-Polymerase des Bakteriophagen T7 und die T4-DNA-Polymerase des Bakterio- phagen T4, die jeweils von einer Vielzahl von Herstellern, z.B. USB, Röche Molecular Biochemicals , Stratagene, NEB oder Quantum Biotechnologies, kommerziell vertrieben werden. Die DNA-Polymerase I aus E. coli (Holoenzym) besitzt eine 5 ' -3 ' -Polymerase- Aktivität, eine 3 '-5'-Proofreading-Exonuclease-Aktivität und eine 5 ' -3 ' -Exonuclease-Aktivität. Das Enzym wird für in-vitro-Labeling von DNA mittels der Nick-Translation-Methode eingesetzt (Rigby et al. (J. Mol. Biol. 113 (1977)), 237-251)). Im Gegensatz zum Holoenzym besitzt das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aus E. coli wie die T7-DNA-Polymerase und die T4-DNA-Polymerase eine 5 ' -Exonuclease-Aktivität . Diese Enzyme werden daher für sogenannte Auffüllreaktionen oder für die Synthese langer Stränge eingesetzt (Young et al. (Biochemistry 31 (1992), 8675-8690), Lehman (Methods Enzymol. 29 (1974), 46-53)). Der 3 '-5'-exo (-) - Variante des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I aus E. coli fehlt schließlich auch die 3 ' -Exonuclease-Aktivität . Dieses Enzym wird of für die DNA-Sequenzierung nach Sanger eingesetzt (Sanger (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977), 5463-5467)). Neben diesen Enzymen existieren noch eine Vielzahl weiterer 37°C-DNA-Polymerasen mit unterschiedlichen Eigenschaften, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können.
Die am weitesten verbreitete, thermostabile DNA-Polymerase mit einem Temperaturoptimum bei 75°C und ausreichender Stabilität bei 95°C ist die Taq-DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus, die kommerziell erhältlich ist. Die Taq-DNA-Polymerase ist eine hoch-prozessive 5 ' -3 ' -DNA-Polymerase ohne 3 ' -5 ' -Exonuclease- Aktivität. Sie wird oft für Standard-PCRs , für Sequenzier- Reaktionen sowie für mutagene PCRs verwendet (Cadwell und Joyce (PCR Methods Appl. 3 (1994), 136-140, Agrogoni und Kaminski (Methods Mol. Biol. 23 (1993), 109-114)). Ähnliche Eigenschaften weisen die Tth-DNA-Polymerase aus Thermus thermophilus HB8 und die Tfl-DNA-Polymerase aus Thermus flavus auf. Die Tth- DNA-Polymerase weist jedoch zusätzlich noch eine intrinsische Reverse-Transkriptase- (RT) -Aktivität in Gegenwart von Mangan- Ionen auf (Cusi et al. (Biotechniques 17 (1994), 1034-1036)). Unter den thermostabilen DNA-Polymerasen ohne 5'- jedoch mit 3 ' -Exonuclease-Aktivität werden wiederum eine ganze Reihe kommerziell vertrieben: Pwo-DNA-Polymerase aus Pyrococcus woesei, Tli-, Vent- bzw. DeepVent-DNA-Polymerase aus Thermococcus litoralix, Pfx- bzw. Pfu-DNA-Polymerase aus Pyrococcus furiosus, Tub-DNA-Polymerase aus Thermus ubiquitous, Tma- bzw. UlTma-DNA- Polymerase aus Thermotoga maritima (Newton und Graham, in: PCR, -Spektrum Akad. Verlag Heidelberg (1994), 1)). Polymerasen ohne 3 ' -proofreading-Exonuclease-Aktivität werden eingesetzt, um möglichst fehlerfrei PCR-Produkte zu amplifizieren. Schließlich sind mit dem Stoffel-Fragment der Taq-DNA-Polymerase, mit der Vent- (exo-) -DNA-Polymerase, sowie der Tsp-DNA-Polymerase thermostabile DNA-Polymerasen ohne 5 '- und ohne 3 '-exo-nukleo- lytischer Aktivität verfügbar. Unter den RNA-abhängigen DNA- Polymerasen (Reverse Transkriptasen) gehören die AMV-Reverse- Transkriptase aus dem Avian Myeloblastosis Virus, die M-MuLV- Reverse Transkriptase aus Moloney Murine Leukemia Virus, und die HUV-Reverse Transkriptase aus dem Human Immunodeficiency Virus zu den gebräuchlichsten Enzymen, welche auch von diversen Anbietern wie z.B. NEB, Life Technologies, Quantum Biotechnologies kommerziell vertrieben werden. Die AMV-Reverse Transkriptase besitzt wie die HIV-Reverse Transkriptase eine assoziierte RNase-H-Aktivität. Diese ist bei der M-MuLV-Reverse Transkriptase deutlich reduziert. Sowohl der M-MuLV- als auch der AMV-Reversen Transkriptase fehlt eine 3 ' -5 ' -Exonuclease- Aktivität .
Unter den DNA-abhängigen RNA-Polymerasen gehören die RNA- Polymerase aus E. coli, die SP6-RNA-Polymerase aus Salmonella thyphimurium LT2, infiziert mit dem Bakteriophagen SP6, die T3-RNA-Polymerase aus dem Bakteriophage T3, und die T7-RNA-Poly- merase aus dem Bakteriophage T7 zu den gebräuchlichsten Enzymen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Matrizenstränge in Schritt (f) des Verfahrens DNA-Moleküle, und es wird für die template-gerichtete Einzel- Strangsynthese eine DNA-abhängige DNA-Polymerase verwendet.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird dabei eine nicht thermostabile DNA-Polymerase verwendet, besonders bevorzugt eine solche mit 5'- und 3 ' -exonukleolytischer Aktivität, wie z.B. Polymerase I aus E. coli.
Alternativ kann auch eine nicht thermostabile DNA-Polymerase verwendet werden, die keine 5'—1-3 ' -exonukleolytische Aktivität, aber eine 3 '—+-5 '-exonukleolytische Aktivität besitzt, wie z.B. das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aus E. coli, die T7-DNA-Polymerase aus dem Bakteriophagen T7 oder die T4-DNA- Polymerase aus dem Bakteriophagen T4.
Ferner kann auch eine nicht thermostabile DNA-Polymerase verwendet werden, die weder 5'—3'- noch 3 '-+-5 '-exonukleolytische Aktivität aufweist, wie z.B. die 3 '-5' -exo(-) -Variante des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase I aus E. coli. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine thermostabile Polymerase (z.B. Taq-Pol, Pwo-Pol) eingesetzt. Diese kann dabei wiederum 5 ' - und 3 ' -exonukleolytische Aktivität aufweisen oder aber 5 ' -exonukleolytische Aktivität, aber keine 3 ' -exonukleolytische Aktivität wie z.B. die Taq-DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus, die Tth-DNA-Polymerase aus Thermus thermo- philis HB8 oder die Tfl-DNA-Polymerase aus Thermus flavus.
Alternativ kann die thermostabile DNA-Polymerase keine 5 '-+3'- aber 3 '-+5 '-exonukleolytische Aktivität aufweisen, wie z.B. die Pwo-DNA-Polymerase aus Pyrococcus woesei, die VentR-DNA- Polymerase, die DeepVentR-DNA-Polymerase bzw. die Tli-DNA- Polymerase aus Thermococcus litoralis, die Pfu-DNA-Polymerase bzw. die Pfx-DNA-Polymerase aus Pyrococcus furiosus oder Tma-DNA- Polymerase bzw. Ul ma-DNA-Polymerase aus Thermotoga maritima.
Ferner kann eine thermostabile Polymerase verwendet werden, die weder 3 '-+5'- noch 5'—1-3 ' -exonuclelytische Aktivität aufweist, wie z.B. das Stoffel-Fragment der Taq-DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus, die Tsp-DNA-Polymerase oder die exo (-) -Variante der VentR-DNA-Polymerase bzw. DeepVentR-DNA-Polymerase aus Thermococcus litoralis.
Im Fall der Verwendung einer thermostabilen Polymerase schließt sich die Polymerasereaktion vorzugsweise direkt an den Schritt (e) an ohne zwischenzeitliche Aufreinigung oder weitere Probenbehandlung.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungs- gemäßen Verfahrens sind die Matrizenstränge in Schritt (f) des erfindungsgemäßen Verfahrens, an denen die template-gerichtete.' Einstrangsynthese erfolgt, RNA-Moleküle . In diesem Fall wird für die template-gerichtete Einzelstrangsynthese eine RNA-abhängige DNA-Polymerase verwendet, vorzugsweise AMV-Reverse Transkriptase aus dem Avian Myeloblastosis Virus, HIV-Reverse Transkriptase aus dem Human Immunodeficiency Virus, oder M-MuLV-Reverse Transkriptase aus dem Moloney Murine Leukemia Virus . Ferner wird bevorzugt eine thermostabile Reverse Transkriptase verwendet, ganz besonders die Tth-DNA-Polymerase aus Thermus thermophilus mit intrinsischer Reverse-Transkriptase-Aktivität . Beispiel 1
Sofern nicht anders angegeben, erfolgten die Versuche nach
Current Protocolls in Molecular Biology.
I . Bereitstellung des Ausgangsmaterials
Als Ausgangsmaterial wurden 4 Lipasevarianten eingesetzt: LipA H86W codiert durch pBP2035, LipA S87T codiert durch pBP2008, LipA F142W codiert durch pBP2006, LipA L167A codiert durch pBP2007.
Plasmidpräparation folgender Plasmide:
Figure imgf000016_0001
Spaltung der Plasmide mit den Restriktionsendonukleasen
HindiII und Sacl
Isolierung der Insertionen durch Gelextraktion mit dem
GFX-Kit (Fa. Pharmacia) 4. Resuspendierung der DNA-Fragmente in H20
5. Einstellung der DNA-Konzentrationen auf -250 ng/μl
II . Erzeugung von Einzelstrangbruchen und Neusynthese
1. 4 getrennte Reaktionsansätze für die Nick-Translation der Insertionen 56-20, 98-10, 124-9, 198-1-3 mit dem Nick-Translation-Kit (Fa. Röche, Kat. No. 976776)
Figure imgf000016_0002
Enzym Mix:
DNA-Polymerase I und DNAsel in 50 % Glycerin (v/v)
Inkubation der Ansätze bei 15°C, 90 min 3. Abstoppen der Reaktion durch Zugabe von 5 μl 0,5 M EDTA, pH 8,8
4. Fällen, Waschen, Trocknen und Resuspendieren der Ansätze in 20 μl H20
III. PCR ohne Primer
Reaktionsansatz für die PCR mit GC-Rich-PCR-System (Fa. Röche, Kat. No. 2140306)
Figure imgf000017_0001
thermostatische Tag DNA Polymerase und Tgo DNA Polymerase
PCR-Bedingungen:
Figure imgf000017_0002
IV. PCR mit Primern
Reaktionsansatz für die PCR mit GC-Rich-PCR-System (Fa. Röche, Kat. No. 2140306):
Figure imgf000017_0003
* Primer MAT16 = 5 v -GATCGACGTAAGCTTTAACGATGGAGAT-3
* Primer MAT19 = 5 λ-CATCGGGCGAGCTCCCAGCCCGCCGCG-3 ' PCR-Bedingungen:
Figure imgf000018_0001
V. Klonierung und Analyse der Fragmente
1. 20 μl der PCR-Produkte aus Schritt 4 werden mit HindiII und Sacl geschnitten 2. Fällen, Waschen, Trocknen und Resuspendieren des Ansatzes in 20 μl H20
3. Reinigung der geschnittenen Fragmente mit dem GFX-Kit (Fa. Pharmacia)
4. Ligation der geschnittenen Fragmente mit dem Vektor pBSIIKS (Fa. Stratagene) , der zuvor mit Hindlll und Sacl geschnitten wurde
5. Transformation der Ligationsansätze in Escherichia coli XLl-Blue
6. Sequenzanalyse von 29 Klonen mit Insertion

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Erzeugung von Polynukleotidmolekulen mit ver- änderten Eigenschaften, wobei mindestens ein Zyklus umfassend die folgenden Schritte durchlaufen wird:
(a) Bereitstellung eines doppelstrangigen Polynukleotidmoleküls oder einer Population doppelsträngiger Poly- nukleotidmoleküle, wobei die einzelnen Polynukleotide dieser Population mindestens einen homologen Sequenzabschnitt und mindestens einen heterologen Sequenzabschnitt besitzen,
(b) Erzeugung von Einzelstrangbruchen in den doppelstrangigen Polynukleotidmolekulen
(c) nukleolytischer Abbau in 5 '—1-3 'Richtung ausgehend von den Einzelstrangbruchen bei gleichzeitiger Neusynthese in 5 '—h3 'Richtung unter Verschiebung der Einzelstrangbrüche in Richtung des 3 ' -Endes
(d) Herstellung einzelsträngiger Polynukleotidmolekulen
(e) Herstellung von partiell doppelstrangigen Polynukleotidmolekulen der aus Schritt (d) bereitgestellten einzelstrangigen Polynukleotidmolekulen
(f) template-gerichtete Nukleinsäuresynthese ausgehend von den in Schritt (e) hergestellten partiell doppelstrangigen Polynukleotidmolekulen
wobei die Schritte (b) und (c) nacheinander oder gleichzeitig ausgeführt werden können.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei mehr als ein Zyklus umfassend die Schritte (a) bis (f) durchlaufen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei nach einem, mehreren oder allen Zyklen ein Selektionsschritt ausgeführt wird, und sich der Selektionsschritt entweder auf den Genotyp oder auf den Phänotyp oder sowohl auf den Genotyp als auch auf den Phänotyp des Polynukleotids bezieht.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , wobei in Schritt (b) die Einzelstrangbrüche durch sequenzspezifische Nicking- Enzyme eingefügt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , wobei in Schritt
(b) die Einzelstrangbrüche durch sequenzunspezifische Nicking-Enzyme eingefügt werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 , wobei in Schritt (c) DNA-Polymerase I verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 , wobei in Schritt
(c) durch Wahl geeigneter Reaktionsbedingungen die Fehlerrate der Neusynthese erhöht wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Fehlerrate der Neusynthese erhöht wird durch einen Überschuss eines oder mehrerer nukleotidtriphosphate .
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 , wobei die Fehlerrate der Neusynthese erhöht wird durch den Einsatz eines oder mehrerer nukleotidanaloga.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Fehler- rate der Neusynthese erhöht wird durch eine Variation der
Salz-Konzentration .
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Fehlerrate der Neusynthese erhöht wird durch Polymerasen mit ver- ringerter oder ohne Korrekturleseaktivität.
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