DE10234577A1

DE10234577A1 - Einheitliche Strategie zur Generierung und vielfältigen Rekombination von diversifizierten Oligonukleotiden und DNS - Molekülen zur Funktionsgestaltung von funktionstragenden DNS - Molekülen und ihren Produkten

Info

Publication number: DE10234577A1
Application number: DE2002134577
Authority: DE
Inventors: Hubert S. Dr. Bernauer; Kristian Dr. Müller
Original assignee: ATG BIOSYNTHETICS GmbH
Current assignee: ATG BIOSYNTHETICS GmbH
Priority date: 2002-07-30
Filing date: 2002-07-30
Publication date: 2004-06-17

Abstract

Die meisten der heutzutage angewandten DNS-Diversifizierungsverfahren benutzen zum einen abbauende Verfahren Endonukleasen zur Fragmentierung von DNS, die spezifisch (Restriktionsenzyme) oder unspezifisch (z. B. DNasel) wirken, bzw. Exonukleasen, die terminale nukleolytische Aktivitäten aufweisen. DOLLAR A Zum anderen werden bei aufbauenden Verfahren verschiedene PCR-Strategien eingesetzt, um das oben genannte Ziel zu erreichen. DOLLAR A Das hier beschriebene Verfahren zeigt eine neue vorteilhafte Methode zur Subfragmentierung von DNS-Molekülen mit höherer Reproduzierbarkeit als vergleichbare herkömmliche Verfahren. DOLLAR A Ein einheitlicher molekularer Mechanismus zur Rekombination verschiedener DNS-Moleküle mit chimären, diversifizierten Molekülsubsequenzen ist mit diesem Verfahren kompatibel, um die chimären DNS-Moleküle aus diesem und aus anderen verschiedenen Diversifizierungsstrategien nach demselben Grundprinzip miteinander zu verbinden. DOLLAR A Das beschriebene, erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet, komplementäre, homologe und einzelsträngige Enden an DNS-Fragemen und deren Subfragmenten zu erzeugen. Ziel ist es auch, unterschiedliche, intrinsisch nicht homologe DNS-Fragmente und/oder solche mit Homologie zueinander aus verschiedenen Quellen miteinander unter Sequenzdiversifizierung kombinieren zu können. DOLLAR A Es erlaubt die Einstellung verschiedenerr Kombinationswahrscheinlichkeiten zwischen verschiedenen DNS-Fragmenten an vorbestimmter Stelle, bis hin zur Erzeugung vollständig ...

Description

Für die Funktionsdiversifizierung in der Molekularbiologie ist es notwendig und sinnvoll, beliebige DNS-Moleküle verschiedener Grösse miteinander zu verbinden. Klassische Verfahren verwenden DNS-Moleküle, die mit Restriktionsenzymen zu kompatiblen Enden zurechtgeschnitten werden. Die endständigen Sequenzen weisen komplementäre Sequenzhomologie über wenige Basenpaare, i.d.R. 1–4, Bp auf, die dann entweder polar gerichtet oder in ihrer Orientierung frei miteinander mittels Ligation, bei grösseren Überlappungen ab ca. 10 Bp auch ohne Ligation unter Erzeugung rekombinanter DNS-Moleküle verbunden werden können (Aslanidis C., de Jong P.J., Schmitz G. (1994) PCR Methods Appl 4(3):172–7). Auch glattendige DNS-Moleküle (PCR-Produkte, Restriktionsfragmente) können mittels Ligasen, wenn auch sehr ineffizient, verbunden und rekombiniert werden.
Andere Verfahren verwenden unspezifische Endo- und Exonukleasen, um DNS-Moleküle zu fragmentieren und aus diesen chimäre, sequenzdiversifizierte Moleküle herzustellen. Mittels Polymerasen können kompatible, heterogene DNS-Fragmente, Subfragmente aus diesen und Oligonukleotiden iterativ mittels PCR reassembliert werden.
Die Verwendung von unspezifischen Nukleasen zur Fragmentierung von DNS-Molekülen ist mit der Problematik behaftet, dass die Reaktionsbedingungen für die enzymatischen Reaktionen nicht leicht einstellbar sind, da deren Reproduzierbarkeit eine hohe Variabilität aufweist. Die erfindungsgemässe DNS-Diversifizierungsstrategie für die Subfragmentierung von DNS-Molekülen beruht auf dem sehr reproduzierbaren Einbauverhältnis von desoxyNukleotidtriphosphaten verschiedener Konzentrationen während einer Polymerisationsreaktion in die DNS.
Das Ziel dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Rekombination von Nukleinsäuremolekülen, insbesondere DNS, welches ermöglicht, die genannten Nachteile zu vermeiden. Darüber hinaus sollte das Verfahren weitere Vorteile aufweisen, wie beispielsweise eine methodische Einheitlichkeit chimäre DNS- Moleküle aus verschiedenen DNS-Diversifizierungsstrategien (Rekombinationsstrategien) stammend auf der Fragmentebene miteinander zu rekombinieren. Dies ist von grossem Vorteil, da unterschiedliche Diversifizierungsstrategien unterschiedliche Ergebnisse liefern und in ihrer Auflösung (Länge der Fragmente, Rekombinationsfrequenz) unterschiedlich sind.
Durch Einbau geeigneter Nukleotide, wie beispielsweise desoxyUracil (dU) in die DNS ist es möglich die Spaltung des Phosphodiester-Rückgrats an einer bis mehreren vorbestimmten Positionen zu initiieren. Eine vorbestimmte Spaltposition kann beispielsweise mittels des gezielten Einbaus von desoxyUracilamiditen bei der Synthese von Oligonukleotidprimern definiert werden. Insbesondere aber ist es möglich durch Einstellen eines Konzentrationsverhältnisses von dU/ dT eine statistische Positionsbestimmung der Spaltstelle in den DNS-Molekülen zu erreichen, indem dU beispielsweise bei einer PCR-Reaktion gegenüber eines komplementären Adenosinnukleotids als Triphosphat durch eine Polymerase eingebaut wird.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden in den Ansprüchen wiedergegeben, die hier durch Bezugnahme inkorporiert werden.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Illustration der Erfindung, ohne sie einzuschränken.
zu Tabelle 1:
Tabelle 1 zeigt ein Schema bei zur Planung verschiedener Sequenzdiversifizierungsstrategien 1-q (s. auch Abb. 1 bis 6).
Die Kombination aus der Verwendung von Nukleotidanaloga (z.B. desoxyUracil) enthaltenden, verschiedensten Oligonukleotidprimertypen (zu Unterscheiden nach Anzahl, Lage, Randomisierungsgrad, Ankerprimer (j/n) etc.) und der Verwendung von templategängigen Uracilanalogontriphosphaten (z.B. desoxyUraciltriphosphat) zum Einbau in die DNS-Kette bei der Synthese von Ausgangsamplifikationsprodukten (1..m) und deren beliebige Kombinierbarkeit ist das Ziel dieses Verfahrens.
Aus der Vermischung der Sequenzen von Ausgangsamplifikationsprodukten (1..m) verschiedener gleicher oder verschiedener kompatibler Diversifizierungsstrategien entstehen chimäre Diversifizierungsprodukte (1..n) aus den Ausgangsamplifikationsprodukten (1..m) zu n(1..m). Die sequentielle Kombination der Diversifizierungsprodukte aus verschiedenen Diversifizierungsstrategien (0-q) (n = 1) + (n = 2).. + (n = n) führt zu grössernen Molekülen deren Diversifizierungsgrad entlang der Sequenz man steuern kann.
Beispiel 1.
Mit der Einstellung von Nukleotiden in verschiedenen Verhältnissen in einem aufbauenden Verfahren (z.B. PCR) lassen sich reproduzierbarere Ergebnisse bei der DNS-Fragmentierung erzielen.
Der i.d.R. polymerasevermittelte Einbau von desoxyUraciltriphosphat und Thymindintriphosphat in einem sequenzspezifisch zu optimierenden Verhältnis (dU/dT) kann zur weiteren Fragmentierung von DNA-Fragmenten unter Erzeugung komplementärer Enden verwendet werden (s.1).
Die Reassemblierung des DNA-Fragmentgemisches kann mittels der Extensionsmethode erfolgen. Das DNA-Fragmentgemisch besteht aus verschiedenen, an sich sequenzhomologen, aber leicht divergierenden Sequenzen. Die Reassemblierung erzeugt multiple, chimäre Moleküle aus dem statistischen sequentiellen Zusammenfügen der Molekülfragmente des DNA-Fragmentgemisches. Die Länge der Subfragmente und deren Verteilung sind hierbei durch die Variation der Konzentrationsverhältnisse dU/dT aber auch durch die Anpassung der DNS-Sequenz bezüglich der Frequenz der Thyminpositionen unter Verwendung synonymer Codonen beim Sequenzdesign bei Verwendung von Synthetischen Genen möglich.
Zur Amplifikation von DNS-Fragmenten verwendet man ein dNTP-Gemisch, das Desoxyuracil- (dUTP) und Desoxythymidin-triphosphat (dTTP) in einem bestimmten, vorteilhaften Verhältnis enthält. Je nach den Konzentrationsverhältnissen von dUTP/ dTTP kann man aufgrund des statistischen Einbaus von dUTP eine Vielzahl von geeigneten komplementären Enden erzeugen.
Von dem dUTP/ dTTP – Verhältnis wird in Abhängigkeit vom GC-Gehalt der Gesamtsequenz auch die Länge der generierten überlappenden Fragmente bestimmt.
Das optimale Verhältnis von dUTP zu dTTP muss deshalb zunächst experimentell eingestellt werden. Die Einstellung des dUTP/ dTTP – Verhältnisses ist deshalb ein ganz besonders kritischer Parameter. Es ist i.d.R. so zu wählen, dass im Schnitt für jedes zehnte bis fünfzigste, beispielsweise jedes zwanzigste, dTTP ein dUTP eingebaut wird.
z.B : Nukleotidgemisch bestehend aus

dATP : 0,2 mM

dGTP : 0,2 mM

dCTP : 0,2 mM

dTTP : 0,2 mM

dUTP : 0,01 mM
Überlappende Einzelstränge erhält man dann in einem zweiten Schritt, indem man mittels Enzymen oder/ und chemisch spaltet (z.B. erst Behandlung mit Desoxyuracilglycosidase und danach Spaltung nach Maxam-Gilbert (1 M Piperidin in H₂O bei 90° C) oder T4-Exonuklease V, Watson D.E., Bennett G.N. (1997) Biotechniques 23(5):858–62, 864).
Verschiedene zu rekombinierende DNS-Fragmente werden in Abhängigkeit vom Thymidingehalt der Sequenz, soweit bekannt, in einem Ansatz gemischt und in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise denaturiert und unter Diversifizierung reassembliert. Die Subfragmente können in einer PCR-Reaktion iterativ durch wiederholte Denaturierungs-, Reannealing- und Auffüllreaktionen mittels einer thermostabilen Polymerase reassembliert werden.
Beispiel 2.
Erzeugung von geeigneten Kombinationstellen zum Verbinden von verschiedenen Ausgangsamplifikationsprodukten (z.B. PCR-Fragmente) mit terminaler Homologie, die mit desoxyUracil-haltigen Oligonukleotidprimern generiert werden s. 2a, 2b und Abb. 6.
Verwendet man in den PCR-Amplifikationsreaktionen zweier verschiedener PCR-Fragmente solche U-haltige Oligonukleotidprimer, die untereinander wenigstens teilweise komplementär sind, so lassen sich zwischen zwei verschiedenen DNS-Fragmenten überlappende, komplementäre Einzelstrang-DNS-Stränge erzeugen, die miteinander verbunden werden können.
Solche PCR-Fragmente können aus verschiedenen DNS-Diversifizierungsstrategien stammen und können auf einer höheren, der Fragmentebene, nochmals miteinander rekombiniert und diversifiziert werden.
Die Erzeugung von einzelsträngigen, überlappenden Enden ist möglich, in dem man jeweils desoxyuracilhaltige Primer verwendet und an der desoxyuracilhaltigen Position spaltet.
Einbau von Desoxyuracil am 3'-Primerende in das DNS-Molekül 1
Einbau von Desoxyuracil am 3'-Primerende in das DNS-Molekül 2
Behandlung der Doppelstränge aus Beispiel 1+2 mit Uraci-DNS-Glycosylase EC.3.2.2.3 und T4 Endonuklease V (E.C.3.1.25.1), OH^–, bzw. Piperidin.
Inkubation von 500ng PCR-Produkt bei 37°C in 20mM Tris-HCl ph8.0, 1mM EDTA 1mM DTT für eine Stunde mit 2U Uracil-DNS-Glycosylase und 5U T4 Endonuklease V
2a Erzeugen kompatibler Enden von DNA-Amplifikationsprodukten mittels dem gezielten Einbau von desoxyUracil in den bei der Amplifikation zur Verwendung kommenden Oligonukleotidprimern. (p)X _ Zuckerrest nach Uracildesoxyglycolylasebehandlung und Spaltung und gegebenenfalls ein Rest R.
Eine Abtrennung des 5'-endständigen Spaltproduktes mittels Streptavidin-Affinitätschromatographie ist möglich, wenn die Primer z.B. 5'-terminal oder intern biotinyliert sind, beispielsweise mit streptavidinvermantelten Kavitäten von Reagenzgefäßen (z.B. im 96-Bohrloch-Format) oder Streptavidinsäulchen ist es möglich, -D-biotin verbundenen Einzelstränge zurückzuhalten und partial bis vollständig einzelsträngige DNS zu erzeugen, die im Überstand bleibt bzw. im Durchlauf.
zu 2b. Die Kombination von terminal kompatiblen, doppelsträngigen DNA-Fragmentenden kann mittels komplementärer, desoxyuracilhaltiger Primer ermöglicht werden, indem längere, kompatible, komplementäre, überlappende Enden erzeugt werden. Primersequenzen mit durchgezogenen Linien gezeichnet sind 5'- terminal und komplementär zum Gegenstrang, Primersequenzen mit unterbrochener Linie dargestellt sind 3'- terminal am DNA-Fragment angeordnet. Jeweils eine durchgezogene und unterbrochene Primersequenz an unterschiedlichen Fragmenten dargestellt sind komplementär und schaffen Kompatibilität, um die Fragmente miteinander zu verbinden.
Die Verwendung von U-haltigen, terminalen Primern kann die Kombinationsfähigkeit der diversifizierten Amplifikationsprodukte mit weiteren Amplifikationsprodukten, die nach dem gleichen oder einem anderen Diversifikationsverfahren hergestellt wurden herstellen.
2c. Fragmente a, b, c, d; DNS-Diversifikationsverfahren 1, 2 ...q. Aus verschiedenen DNS-Diversifikationsverfahren chimäre stammende DNA-Moleküle können zu verschiedenen Kombinationen sequentiell assembliert werden (s. auch 6.).
Der so gewonnene Rekombinationsmix bzw. die Assemblierungsprodukte werden in einen Vektor kloniert und anschließend in geeignete Wirtssysteme transformiert.
Beispiel 3.
zu 3 : Die Kombination nicht kompatibler, nicht homologer dsDNA-Enden kann mittels Einführung komplementärer, desoxyuracilhaltiger Sequenzen durch Anker-PCR ermöglicht werden. Primersequenzen mit durchgezogenen Linien dargestellt sind 5'- terminal, Primersequenzen mit unterbrochenen Linien dargestellt sind 3'-terminal am DNA-Fragment angeordnet. Jeweils eine durchgezogene und eine unterbrochene Linie unterschiedlicher Fragmente sind komplementär gemacht und kompatibel um die Fragmente miteinander zu verbinden. Anker – PCR – Primersequenzen können so gestaltet werden, dass ein Baukastensystem mit kompatiblen Sequenzmodulen aus sonst nicht homologen, teilkomplementären DNA-Molekülen möglich wird.

a. Mindestens zwei DNS-Moleküle verschiedenen Ursprungs, mit den Ausprägungen q(1..m) auch chimäre Moleküle, die zuvor einer bis mehreren Rekombinationsstrategien unterworfen wurden, können mit einer vereinheitlichten Kombinationsstrategie unter Verwendung von homologen, komplementären, U-haltigen Primern miteinander verknüpft werden.
b. Die Kombinatorik kann auch zur Erzeugung von zirkulären Molekülen, wie der Herstellung und von Plasmiden verwendet werden (s. auch 6.).

Beispiel 5
zu 5 Mit je einem terminalen, feststehenden Primer (optional mit U) und mindestens einem komplementär gestalteten U-haltigen-Primer, der aus mindestens zwei verschiedenen divergierenden DNA-bzw. Gensequenzen abgeleitet sind, kann man terminal kompatible, zur vollständigen Sequenz ergänzende DNA-Subfragmente aus verschiedenen divergierenden Sequenzen erzeugen. DesoxyUracil muss nicht terminalständig sein, sondern kann auch primerintern sein.
Bei der Sequenzergänzung können zwei Varianten unterschieden werden (a) mit vollständiger Denaturierung der Teilfragmente und Ergänzung der Einzelstränge zum Doppelstrang durch eine Polymerasereaktion beim Reassembly (b) ohne Denaturierung und Polymerasereaktion findet eine einfache sequenzergänzende Kombination nur im Bereich der überlappenden Primer statt.
Chimäre Ankerprimer kann man so gestalten, dass sie aus Primern die definiert aus verschiedenen Gen – bzw. Fragmentregionen abgeleitet sind mit demselben Verfahren auch Deletionen in die zu rekombinierenden Zielsequenzen einführen kann, was zu einer Fragment-Deletions-Kombinationsstrategie führt.
Beispiel 6
zu 6 : Mit je einem oder zwei definierten, feststehenden terminalen U-Primer und vollständig statistischen (zufällige) desoxyUracil-haltigen Primern kann man terminal kompatible, sequenzergänzende DNS-Subfragmente aus verschiedenen homologen aber sequenzdivergierenden DNS-Molekülen erzeugen.
Unter Verwendung von chimären Ankerprimern mit zufälligen und definierten Sequenzen kann man mit demselben Verfahren auch Deletionen in die zu rekombinierenden Zielsequenzen einführen.
Schliesslich kann man auch die Verfahren 4 und 5 miteinander kombinieren.
Beispiel 7
zu Tabelle 2: Exemplarisch wurde dem zu diversifizierenden Ausgangsamplifikationsprodukt m = 1 des Diversifizierungsprodukts n = 1 bei der Polymerisationsreaktion dU/dT (1 : 20) eingestellt. Bei m = 2 wurde dieselbe Diversifizierungsstrategie verwendet. Die beiden wurden zur Kombination mit n = 2 mit denselben terminalen je ein dU enthaltenden Primerpaaren amplifiziert, gespalten, gemischt und reassembliert. Mit n = 2 wurde genauso verfahren. Bei n = 1,2 wurden die terminalen Amplifikationsprimer so gewählt, dass für die Kombination der Diversifikationsprodukte n1 + n2 überlappende Enden generiert werden können.
Anwendungsbeispiele für (Re-)Diversifizierungsstrategien:

1. Anwendungsbeispiele, in denen DNS-Fragmente miteinander verbunden werden, die überlappende endständige Homologien besitzen
a. Zusammenbau der Teil-DNS-Fragmente synthetischer Gene
b. in vitro DNS-Splicing zur Herstellung von Gensequenzen aus Exonsequenzen.
c. Rekombination von verschiedenen teilweise sequenzhomologen DNS-Molekülen zur Variation und Optimierung von Funktionsmerkmalen und physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften
2. Wenn Moleküle miteinander verbunden werden sollen, die keine Homologie in den endständigen Sequenzen besitzen, dann müssen endständige, komplementäre, homologe Sequenzen eingeführt werden, z.B. durch Anker-PCR.
3. Herstellung chimärer Genome, Chromosomen, Vektoren etc. Der Einbau von desoxyUracil in vivo nach der Kunkel-Methode (Kunkel, T.A. et. al.(1981), Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 78, 6734–6738., Kunkel T.A. (1985) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82:488–492) oder analoger Verfahren lässt die Spaltung von grösseren DNA-Molekülen und auch die Kombination mit PCR-vermittelten Einbau von u-haltigen Oligonukleotidprimern unter Verwendung verschiedener Diversifizierungsstrategien zu.
Anwendungsbeispiele, wo DNS-Moleküle ohne intrinsische Homologien verbunden werden:
a. bei der Konstruktion von Vektoren aus beliebigen Funktionselementen, z.B. Vectortoolbox mit verschiedenen Selektionsmarkern, ORIs, Affinitätsmarkierungen, Reportergenen, Multiplen Klonierungsstellen (Cloning Sites), Regulatorboxen etc. zur freien Kombinierbarkeit der Elemente.
b. bei der Konstruktion von chimären Fusionsgenen zur Bereitstellung bzw. Kombination neuer Genfunktionen, Gendomänen, Funktionsdomänen.

Vor der Transformation von Bakterien mit chimären, sequenzdiversifizierten DNS-Molekülen können effizienzsteigernde Maßnahmen den Transformationserfolg verbessern, wie z.B. die affinitätschromatographische Aufreinigung der Fragmente zur Abtrennung der zu den Überlappungen komplementären Einzelstrang DNS-Moleküle oder deren Titration mit komplementären Oligonukleotiden. Weitere dem Fachmann bekannte molekularbiologische Maßnahmen, sowie die Transformierbarkeit des Wirts mit den rekombinanten Fragmenten, die Ligierbarkeit der Fragmente etc. können angewendet werden.
Ausplattierung der Transformanden entsprechend der Einzelwurftechnik und die Prüfung einzelner Klone in einem geeigneten Test (Bioassay), der in vivo bzw. in vitro erfolgen kann, auf die gewünschten Eigenschaften sind nachfolgende Schritte in diesem Verfahren, die einer individuellen Ausarbeitung durch den Fachmann bedürfen und hier nicht dargestellt werden.
Prinzipiell aber sind Bioassays notwendig, die erlauben aus der grossen Vielzahl der Varianten rekombinanter diversifizierter Syntheseprodukte (Cis-Elemente, Gene, Plasmide (Vektoren), Chromosomen (artifizielle), Genome etc. und deren Folgeprodukte (variante Proteine, RIVA-Moleküle) solche mit gewünschten Eigenschaften wie Bindungsaffinität, Substratspezifität, Selektivität, Aktivität, Stabilität, Produkte etc. zu selektieren.
Zur weiteren Forcierung der Rekombination von Kandidatengenen, um geeignete Kandidaten mit gewünschten Eigenschaften noch zu verbessern, ist die iterative Wiederholung des Verfahrens unter beispielsweise der Rekombination der Gensequenzen der besten Kandidaten der n-1-Runde eine weitere Möglichkeit, das Ziel zu erreichen, gewünschte molekulare Eigenschaften zu erzeugen.
Aufgrund der grossen Anzahl von Möglichkeiten zur Diversifizierung von DNS-Molekülen ist eine computerunterstützte, experimentelle Planung mit Hilfe eines eigens auf die beschriebene Methode angepassten Computerprogramms sinnvoll.
Die Basis für ein solches Computerprogram ist das Wissen um die zu diversifizierenden Sequenzen und die Kombinatoik anzuwendender Diversifizierungsstrategien aus Tabelle 1 die kein Anspruch auf Vollständigkeit hat und hinter der viele verschiedene Algorithmen zur Optimierung stehen.
Entsprechend der experimentellen Anforderungen kann anhand der zu diversifizierenden Sequenzen die Lage, die geeignete Hybridisierungstemperatur (T_m) geeigneter Oligonukleotidprimer, sowie die Einbaupositionen von Uracil und dUTP/ dTTP – Konzentrationsverhältnisse errechnet werden.
Weiterhin sollte es in der Lage sein alle Parameter für die Kombination verschiedener Diversifizierungsstrategien aus verschiedenen, hier beschriebenen Teilstrategien zu erfassen, zu strukturieren und Vorschläge für die Planung von Experimenten zu machen, sowie die Ergebnisse simulieren und den Diversifikationsgrad zu errechnen und zu steuern. Insbesondere kann der Diversifikationsgrad durch die Auswahl und Kombination unterschiedlicher Diversifikationsstrategien für verschiedene Teilsequenzen unterschiedlich gestaltet werden und zusätzliche Diversifikation durch Mutationsstrategien (z.B. „error prone" PCR) eingerechnet werden. Rashtchian A., Buchman G.W., Schuster D.M., Berninger M.S. (1992) Anal Biochem ;206(1):91–7., Watson D.E., Bennett G.N. (1997) Biotechniques 23(5):858–62, 864

Claims

Verfahren zur Erzielung der freien Kombinierbarkeit verschiedener doppelsträngiger DNS – Moleküle aus verschiedenen Diversifizierungsstrategien nach einem einheitlichen Verfahren, das prinzipiell der Prozedur folgt A.) Bereitstellung mindestens zwei verschiedener DNS-Moleküle B.) Vermehrung der Ausgangs-DNS-Moleküle mittels geeigneter molekularbiologischer Verfahren unter Verwendung von Oligonukleotidprimer mit deren Hilfe die Spaltung eines DNS Stranges erreicht werden kann C.) gegebenenfalls Fragmentierung der DNS-Ausgangsamplifikationsprodukte in Subfragmente D.) Erzeugung von kompatiblen, komplementären Enden, die eine kombinatorische Vermischung der Sequenzen erlauben E.) Sequenzentsprechende Kombination mindestens terminal homologer DNS-Fragmente aus verschiedenen DNS-Diversifizierungsstrategien.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Erzielen der Kombinierbarkeit von mindestens zwei terminal mindestens teilweise homologen Enden doppelsträngiger DNS-Moleküle i.d.R. unterschiedlicher Sequenz.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das auf den Einbau von Nukleotidanaloga während einer Polymerisationsreaktion (a) auf dem gezielten oder positionsgerichteten Einbau eines bis mehrerer Nukleotidanaloga in die zu kombinierende doppelsträngige Nukleinsäure mittels nukleotidanalogahaltigen Oligonukleotidprimern (b) auf dem statistischen Einbau von Nukleotidanalogatriphosphaten beruht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das auf dem Einbau von Desoxyuracil in die zu kombinierenden doppelsträngigen Desoxynukleinsäuren beruht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 – 4. das auf dem gezielten Einbau mindestens eines Desoxyuracilrests in mindestens einem zur Amplifikation eines Templates vorgesehenen uracilhaltigen Oligonukleotidprimern eines beliebigen Amplifikationsverfahrens (z.B. in vivo; in vitro, PCR, LCR, strand displacement amplification, TempliPhi (Amersham) und/ oder mittels der Beimischung von dUTP in einem Reaktionsmix bei der Polymerisation beruht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem mindestens ein Teil des Nukleotidanalogon gezielt physikalisch, chemisch oder enzymatisch entfernt wird, umfassend einen Schritt, bei dem folgend die Phosphodiesterbrücke an mindestens einem Nukleotidanalogon gezielt gespalten werden kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem durch das mindestens eine, in die DNS-Sequenz eingebaute Nukleotidanalogon eine Spaltreaktion der DNS initiiert werden kann; beispielsweise an einer Desoxyuracilbase mittels einer desoxyUracilglycosylase, die dieses aus dem Pentosephosphatrückgrat entfernt und nachfolgende spaltende Reaktionen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem terminal oder an einer funktionalen Gruppe mindestens an einer der Spaltstellen vor oder nach der Spaltung gezielt eine Affinitätsmarkierung eingeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8., bei dem die Affinitätsmarkierung mittels eines aktiven Biotinderivates, z.B. N'-Aminooxymethylcarbonylhydrazino-D-biotin, oder dergleichen erfolgt oder mittels anderer geeigneter chemischer Verbindungen oder Biomoleküle mit chemischer Reaktivität zur modifizierten Stelle mit weiteren spezifischen Affinitäten erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem mindestens ein Teil des einen der beiden Einzelstränge an einer oder beiden Seiten des Doppelstrangmoleküls unter Ausnutzung der Affinitätsmarkierungen abgetrennt wird oder die abgespaltenen DNS-Fragment mittels überschüssiger Moleküle mit komplementären Sequenzen austitriert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem aus einem Gemisch von mindestens zwei DNS-Fragmenten solche mit überlappenden einzelsträngigen Enden erzeugt werden, welche miteinander unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen in allen möglichen Kombinationen spezifisch angelagert werden können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem eine) bis viele (Scharen) verschiedener Amplifikationsprimer und -paare verwendet werden, die a. mindestens ein Nukleotidanalogon z.B. dUracil enthalten b. Ankerprimer zur Erzeugung von Homologien oder zur Erzeugung von Deletionen sein können, c. komplementäre, terminale Sequenzen unterschiedlicher Amplifikationsprodukte umfassen, d. aus einer gegebenen Sequenz intern sequenzidentisch abgeleitet sind e. aus einer gegebenen Sequenz abgeleitet aber partialrandomisiert sind, f. vollständig zufällige Sequenzen sind g. sequenzüberlappend oder -nichtüberlappend sein können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem die Positionen der zu erreichenden Sollbruchstellen und Rekombinationsfrequenzen an den Einzelsträngen (a) statistisch eingestellt werden, bzw. die Häufigkeit Nukleotidanalogen wie die von Desoxyuracilpositionen relativ zu den Thymdinpositionen in den Oligonukleotidprimersequenzen. Durch die Verwendung verschiedener Konzentrationen zur Einstellung von Uracil- und Thymidinamiditverhältnissen bei der Oligonukleotidsynthese kann eine statistisch optimale Verteilung von UTP zu TTP zur Einstellung optimaler Fragmentgrössen bei der Fragmentierung erreicht werden. (b) durch die Nutzung geeigneter Algorithmen für die Berechnung der zur Verwendung kommenden Oligonukleotidprimer(scharen) anhand der Sequenzen der Ausgangsamplifikationsprodukte errechnet werden, um gezielt die idealen Bruchstellen in den DNS-Zielsequenzen per in silico Verfahren einzustellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1. bis 13., bei dem freie Rekombinierbarkeit der mindestens teilweise doppelsträngigen DNS-Moleküle mit mindestens teilweise komplementären terminalen Sequenzen mittels der Kombination unterschiedlicher Diversifikationsstrategien zur Generierung von Sequenzdiversität in Diversifizierungsprodukten erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 1.–14., bei dem natürliche und artifizielle, synthetische Genfragmente, Gene, Plasmide, Vektoren, Chromosomen, Genome mit natürlichen, modifizierten und/oder artifiziellen Sequenzen Verwendung zur Sequenzkombination finden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, bei dem in den verwendeten DNS-Molekülen bei schwierigen Sequenzeigenschaften wie Homopolymerstretches, repetitive Sequenzen, extremen G/C-Gehalten durch die Verwendung synthetischer DNS-Moleküle mittels dem Einbau synonymer Codonen geeignete Sequenzeigenschaften erzeugt werden können, wird z.B. eingestellen eines mittlerer G/C-Gehaltes
Verfahren nach einem der Ansprüche 1. bis 16., bei dem Heterodupex-DNS-Moleküle aus den verschiedenen Sequenzen hergestellt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1. bis 17., bei dem Heteroduplex-DNS-Moleküle aus den verschiedenen Sequenzen dem mismatch repair von pro- und eukaryotischen Zellen ausgesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1. bis 18., bei dem zur Kombination von Diversifizierungsprodukte ein System von geeigneten Kombinationssequenzelementen mittels beispielsweise Anker-PCR eingeführt wird, um mittels des Verfahrens beliebige unterschiedliche terminal sonst nicht homologe Amplifikationsprodukte miteinander kombinieren zu können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1. bis 19., bei dem die Diversifizierungsprodukte zur Bildung chimärer Sequenzen (z.B. codierende) aus nicht chimären und/ oder chimären Ausgangsamplifikationsprodukten genetischen Funktionselementen entsprechen, wie z.B. Proteindomänen oder Exonen zur Bildung chimärer, codierender Sequenzen innerhalb der Sequenzen und der Kombination von nicht chimären und/ oder chimären Amplifikationsfragmenten untereinander.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1. bis 20, das vollautomatisch nach üblichen Standardverfahren (z. B.: auf geeigneten Robotersystemen) ablaufen kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1. bis 21., das miniaturisiert in mikrofluidischen Systemen abläuft.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1. bis 22, das Automatisierung und Miniaturisierung vereinigt
Verfahren nach einem der Ansprüche 1. bis 23., bei dem in einem weiteren Schritt die auf verschiedene Art und Weise präparierten zu Diversifizierungsprodukte gemischt und rekombiniert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1. bis 24., bei dem entstehende Sequenzlücken und Nicks in vitro vor der Ligation und dem Einbringen in geeignete Zellsysteme mit geeigneten Enzymen gegebenenfalls repariert und/oder ligiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1. bis 25., bei dem entstehende Sequenzlücken und Nicks in vivo mit den in geeigneten Zellsystemen befindlichen Reparatursystemen repariert und/ oder ligiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1. bis 26., bei dem eine hybridisierte Menge geeigneter Diversifizierungsprodukte mit komplementären Überlappungen in geeigneten Zellsystemen auch ohne Ligation zur Replikation gebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1. bis 27., bei dem die (re-)kombinierten, Diversifizierungsprodukte (Genfragmente, Gendomänen, ganze Gene, Genbatterien, Plasmide, artifizielle Chromosomen, Teilgenome, Genome) in Zellen zur Replikation eingebracht und exprimiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1. bis 28, bei dem die Zellen mit (re-) kombinierten DNS-Molekülen vereinzelt werden.
Verfahren nach Anspruch 1. bis 29., nachdem die Einzelzellen mit rekombinanten DNS-Molekülklonen vermehrt werden und zur Messung und Selektion gewünschter Eigenschaften der sequenzdiversifizierten Moleküle selbst oder ihrer Transkriptions- und Translationsprodukte in einem Bioassay eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1. bis 30., bei dem die Bioassays im Hochdurchsatzverfahren automatisiert und gegebenenfalls miniaturisiert abgearbeitet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1. bis 31., bei dem einzelne oder mehrere der Schritte im Sinne der evolutiven oder selektiven Verbesserung von Eigenschaften der sequenzdiversifizierten Moleküle selbst oder ihrer Produkte, wie RNAs oder Proteine rekursiv angewendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 32., das nach Testung von Funktionsparametern der Diversifizierungsprodukte oder deren Produkte nach Transkription oder Translation (Genprodukte) zur deren weiterer Veränderung (Optimierung) nach rationalen Gesichtspunkten iterativ durchgeführt wird.
Verfahren nach 1. bis 33., bei dem alle essentiellen Reagentien für eine bestimmte (Re-)Diversifizierungsstrategie in einem geeigneten Kit bereitgestellt werden.
Kit, umfassend die Komponenten für die Durchführung von Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1. bis 34. sowie eine entsprechende Arbeitsanleitung.
Computerprogramm, das geeignet ist, alle Parameter für eine Diversifizierungsstrategie aus verschiedenen hier beschriebenen Teilstrategien zu erfassen, zu berechnen und Vorschläge für die Planung und Durchführung von Experimenten zu machen.