DE60202196T2

DE60202196T2 - Orientationsgerichtete konstruktion von plasmiden

Info

Publication number: DE60202196T2
Application number: DE60202196T
Authority: DE
Inventors: Yitzhak Ben-Asouli; Farhat Osman
Original assignee: Gene Bio Application Ltd
Current assignee: Gene Bio Application Ltd
Priority date: 2001-02-12
Filing date: 2002-02-11
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2022-02-12
Also published as: ES2235013T3; EP1362101A2; WO2002064774A3; IL141392A0; EP1362101B1; US7279278B2; US20040209272A1; WO2002064774A2; DE60202196D1; ATE284441T1

Description

Umfeld der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur orientierungsgerichteten Konstruktion eines Konstruktes, umfassend mindestens zwei Nucleinsäuresegmente von Interesse. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung in schnelles und vielseitiges Verfahren zur effizienten Klonierung von Konstrukten durch PCR-Anreicherung der erwünschten Orientierung.
Hintergrund der Erfindung
Genetische Vektoren sind eines der wichtigsten grundlegenden Werkzeuge für die Forschung überall auf der Welt in den Umfeldern der Medizin, Biologie und Biotechnologie. Nahezu alle Studien in diesen Umfeldern benötigen die Verwendung von genetischen Vektoren. Solche genetischen Vektoren werden nicht nur in der Forschung benötigt, zum Beispiel in der Medizin; genetische Vektoren sind auch ein Mittel, um Gentherapie von Erkrankungen mit einem genetischen Hintergrund durchzuführen. Dieses vielversprechende Umfeld liegt an der vordersten Front der letzten medizinischen Entwicklungen, wenn die Sequenzen des menschlichen Genoms schließlich bestimmt wurden, die jedem Forscher in der Welt eine fantastische Menge an Information über neue Gene, die für genetische Reparatur verwendbar sind, eröffnen. Zusätzlich verwenden Biotechnologen genetische Vektoren für die Einführung von Genen in verschiedene Organismen, um große Mengen des Proteins, das durch diese Gene exprimiert wird, herzustellen. Die Landwirtschaft nutzt ebenfalls genetische Vektoren, hauptsächlich in der Herstellung von transgenen Pflanzen mit verbessertem Ertrag oder verbesserter Resistenz gegenüber sowohl Schädlingen als auch Pestiziden und für die Verlängerung der Lagerungszeit der landwirtschaftlichen Produkte.
Genetische Vektoren sind Shuttle mit einer DNA-Sequenz, die genetische Information codiert, die in-vivo in Organismen, wie Bakterien, Hefe, Zellaggregaten und transgenen Tieren oder in in-vitro Systemen exprimiert werden. Genetische Vektoren sind in den meisten Fällen zirkuläre DNA- Segmente, die als Plasmide bekannt sind, die genetische Information enthalten, aber es gibt auch andere genetische Vektoren, wie Viren und Transposons, die für den Zweck maßgeschneidert sind. Die Information, die von den Vektoren getragen wird, ist auf ihr biologisches Ziel und auf die biologische Umgebung, in die der Vektor eingeführt wird, maßgeschneidert. Ein genetischer Vektor kann genetische Segmente aus verschiedenen Quellen enthalten. Zum Beispiel kann eine Sequenz eines Gens, die ein Säugetierprotein codiert, in bakterielle Sequenzen eingebaut werden, um einen genetischen Vektor zu bilden, der das menschliche Protein in Bakterien exprimiert, so dass man durch Kultivierung der Bakterien große Mengen dieses menschlichen Proteins erhalten würde.
Der Stand der Technik
Die Vektorkonstruktion umfasst eine Vielzahl von rekombinanten DNA-Technologieverfahren, die auf Spalten und Religieren von DNA-Fragmenten beruhen. Die Insertion von neuen Genen in Ziel-DNA-Fragmente ist eine der am besten bekannten Verwendungen für rekombinante DNA-Technologie. Dieses Verfahren schließt die Spaltung des Zielfragments (das die Vektorsequenz umfasst) mit einem Restriktionsenzym ein. Genauso wird die einzuführende DNA, die das Gen von Interesse trägt, mit dem gleichen Enzym oder mit einem geeigneten Enzym, das die gleichen 3' oder 5' Überhänge zurücklässt, gespalten. In einer Art der Restriktionsenzymspaltung lässt die Spaltung von sowohl der Ziel-DNA als auch der einzuführenden DNA überlappende 3' oder 5' Nucleotidfragmente an jedem Ende zurück. Diese überlappenden Fragmente oder "mit überstehender Spaltstelle" sind gut bekannte Eigenschaften von einigen Restriktionsenzymen.
Weitere Verfahren zum direkten Klonieren von DNA-Fragmenten in Ziel-DNA-Sequenzen stehen zur Verfügung, wie das Verfahren, das durch Mead et al. [Bio//Technology 9: 657 (1991)] beschrieben ist. Dieses Verfahren basiert auf der Fähigkeit von Taq-Polymerase inhärent Desoxyadenosin (dATP) an das 3' Ende von einigen neu synthetisierten Duplexmolekülen anzufügen, beschrieben durch Clark, J. M. [Nucleic Acids Research 20: 9677 (1988)]. Diese einzelnen Adenosinüberhänge basenpaaren mit 3' Thymidin (dTTP) Überhängen an der Insertionsstelle eines spezifisch gestalteten Vektors. Es wurde gefunden, dass sogar einzelne Basenpaare ausreichend sind, um zwei Nucleotidsequenzen über Wasserstoffbindung zu verbinden.
In noch einem anderen Verfahren zum Einführen eines Nucleotidfragments in eine Ziel-DNA, das als glattendige Ligation bekannt ist, werden die zu ligierenden Fragmente unter Verwendung von Restriktionsenzymen gespalten, die keine 3' oder 5' überhängenden Nucleotide an der Enzymspaltstelle zurücklassen. Diese Enzyme sind aufgrund dieses Merkmals ihrer enzymatischen Aktivität als "glattendige" Enzyme bekannt. Nach der Spaltung behalten glattendige Restriktionsenzyme einzelne 5' "terminale" Phosphate an beiden Seiten der Restriktionsstelle. Diese terminalen 5' Phosphate werden von der DNA-Ligase für die anschließende Religation der gespaltenen DNA-Sequenz benötigt.
Keines der zuvor genannten Verfahren erlaubt es einem Forscher, eine spezifische Orientierung für das Segment von Interesse auszuwählen und zu verstärken. Dies stellt einen entscheidenden Nachteil dar, weil die einzuführende DNA sich selbst an jede der zwei 5' oder 3' Orientierungen bezüglich der Ziel-Nucleotidsequenz positionieren kann.
In den meisten Verfahren ist die Insertorientierung kritisch, zum Beispiel benötigt die Ligation einer Promotorsequenz an ein heterologes Gen um anschließend Genexpression zu erhalten oder um chimäre Gene oder Proteine herzustellen, die Ligation in der korrekten Orientierung.
Darüber hinaus werden die meisten Vektoren selbst, ohne das Insert, ligieren, falls keine Richtung für das Insert bereitgestellt wird. Darüber hinaus werden bis zu 50% der Gene im Durchschnitt, wenn sie in verschiedene Vektoren eingeführt werden, in der falschen Orientierung ligieren. Dies reduziert dramatisch die gesamt experimentelle Effizienz. Deshalb wurden viele Verfahren zur präferenziellen Klonierung von Insert-DNA-Fragmenten in Zielsequenzen in einer bevorzugten Orientierung erfunden. Diese Verfahren sind allgemein als gerichtete Klonierungstechniken bekannt.
Gerichtete Klonierung wird für gewöhnlich durchgeführt durch anfängliches Spalten der Ziel-Nucleotidsequenzen mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen, was zu Molekülen mit unterschiedlichen DNA-Enden an der Ziel-Insertionsstelle führt. Die einzuführende DNA wird auch unter Verwendung der gleichen zwei Restriktionsenzyme gespalten, wodurch zwei verschiedene DNA-Enden hergestellt werden, die einer spezifischen Orientierung in der Ziel-Insertionsstelle entsprechen.
Obwohl dieses Verfahren häufig im Stand der Technik verwendet wird, besitzt es Nachteile. Zum Beispiel ist das Spalten von sowohl der Ziel-DNA als auch der einzuführenden DNA mit multiplen Restriktionsenzymen sehr zeitaufwändig. Zusätzlich erhöhen multiple Enzymspaltungen das Risiko, dass entweder die Ziel- oder einzuführende DNA-Sequenz an einer inneren Restriktionsstelle in einer spezifischen Weise, oder unspezifisch (Staraktivität) oder alternativ überhaupt nicht gespalten wird. Die Probleme, die mit dem Spalten der Enden von DNA-Strängen assoziiert sind, kennzeichnen auch spaltungsbasierte Verfahren, wie das benötigte Spalten der Insertsequenz. Darüber hinaus benötigt die Spaltung mit zwei verschiedenen Restriktionsendonucleasen das Wechseln der Puffer zwischen jeder Reaktion und erniedrigt die Wahrscheinlichkeit der richtigen Spaltung der DNA-Sequenz. Darüber hinaus ist die Verwendung von Restriktionsenzymen im Vektordesign ein limitierender Faktor beim Einführen von Sequenzen, der die Flexibilität des gewünschten Konstruktes beeinflussen kann.
Viele Forscher haben versucht, die Verfahren, die gerichtetes Klonieren von DNA-Fragmenten betreffen, zu verbessern, wie oben ausgeführt ist. Eines der am meisten verwendeten Verfahren, das gerichtete Ligation einschließt, betrifft die Subklonierung von DNA-Fragmenten, die durch eine Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) amplifiziert wurden.
Das häufigste Verfahren zum Klonieren von PCR-Produkten schließt den Einbau von flankierenden Restriktionsstellen in die Enden der Primermoleküle ein. Der PCR-Zyklus wird durchgeführt, und die amplifizierte DNA wird anschließend gereinigt, mit (einer) geeigneten Endonuklease(n) gespalten und mit einer geeigneten Vektorpräparation ligiert. So benötigen typische PCR-Klonierungsverfahren die Herstellung von PCR-Primermolekülen, die an "angefügte" Basensequenzen mit einer bevorzugten Restriktionserkennungssequenz angeheftet sind. Auch diese Verfahren können zu einer unbeabsichtigten inneren Spaltung von uncharakterisierten oder polymorphen Sequenzen führen. Solche Beschränkungen von früheren Verfahren erhöhen die Kosten und Komplexität der routinemäßigen Klonierung von PCR-Produkten.
Darüber hinaus weist dieses Protokoll die gleichen Nachteile wie das zuvor genannte Doppelspaltungsverfahren auf. Darüber hinaus weisen die PCR-Primer mehr Basen auf, um die Restriktionsstelle zu beherbergen, was zu zusätzlichen Ausgaben für PCR-Primer führt. Zusätzlich wird dieses Verfahren durch die häufig ineffiziente Spaltung von Restriktionsendonuclease Spaltungsstellen in der Nähe eines Endes einer doppelsträngigen Nucleinsäure beschränkt.
Ein anderes Verfahren zur gerichteten Klonierung eines Inserts in eine Zielsequenz verwendet Exonuclease III [Kaluz, et al., Nucleic Acid Research, 20 (16): 4369–4370 (1992)], um die "überstehenden Enden" zu bilden. In dem Verfahren, das durch Kaluz et al., beschrieben ist, wurden die einzuführenden DNA-Fragmente mit Exonuclease III gespalten. Die Zahl der Nucleotide, welche die Exonuclease III von dem 3' Ende von DNA pro Minute spaltet, ist gut bekannt. Nach einer zeitkontrollierten Spaltung verblieben die Insertfragmente mit 5' überlappenden Nucleotidschwänzen. Diese Schwänze wurden bearbeitet, so dass die 5' Enden nur noch in einer Orientierung nach Basenpaarung mit dem Zielplasmid-DNA-Molekül hybridisieren würde.
Dennoch ist das Exonuclease III-Verfahren besonders zeitabhängig, und das Enzym spaltet fortgesetzt DNA solange die Reaktion inkubiert wird. Aus diesem Grund könnte die Exonuclease III potenziell durch die Endnucleotide hindurch und in die codierende Region der einzuführenden DNA-Sequenz spalten, was ein ungewünschtes experimentelles Ergebnis hervorruft.
In noch einem anderen Verfahren wird die Herstellung von überstehenden Enden unter Verwendung der 3' Exonuclease Aktivität von T4 DNA-Polymerase durchgeführt [Kuijper, J. L. et al., Gene 112: 147–155 (1992)], ein weiteres Verfahren zur gerichteten Klonierung von PCR-gebildeten Fragmenten in eine Ziel-DNA-Sequenz beruht auf dem Einbau von Uracil in die PCR-Primer, gefolgt durch Behandlung mit Uracil-N-Glycosylase [Nisson, P. C., et al., PCR Methods and Applications 1: 120–123 (1991)].
Ein anderes Beispiel ist in dem US Patent Nr. 5,523,221 offenbart, das auf ein Verfahren zum gerichteten Klonieren einer einzuführenden DNA-Sequenz in eine Ziel-DNA-Sequenz gerichtet ist. Dieses Verfahren schließt die Bildung einer monophosphorilierten Ziel-DNA-Sequenz und einer monophosphorilierten einzuführenden DNA-Sequenz, gefolgt durch Kombinieren der einzuführenden DNA-Sequenz, vorzugsweise mit DNA-Ligase, mit der Zielsequenz, ein. So kann die Insertsequenz nur in einer Richtung bezüglich der Zielsequenz ligieren. Vorzugsweise ist die Ziel-DNA-Sequenz ein Plasmid. Dieses Verfahren verwendet die kalbsintestinale alkalische Phosphatase (CIAP), um eine Monophosphat Ziel-DNA herzustellen. Das Verfahren besitzt einige Nachteile, die Verwendung von monophosphorilierter Ziel-DNA und einzuführender DNA reduziert signifikant die Ligationseffizienz und benötigt multiple Restriktionsenzymspaltungen.
Alle der obigen gerichteten Klonierungsverfahren benötigen multiple Restriktionsenzymspaltungen, das Hinzufügen von extra Nucleotiden zu dem Insert, oder sie sind teuer und zeitaufwändig. Aus diesen Gründen besteht ein Bedarf für ein einfaches, effizientes, schnelles und billiges Verfahren zur gerichteten Klonierung eines DNA-Fragments in seine Zielsequenz.
Um die oben genannte Komplexität von verwendeten Endonucleasen zu lösen, wurde PCR-Technologie verwendet, um hybride (chimäre) Gene zu bearbeiten, ohne die Notwendigkeit, Restriktionsenzyme zum Teilen des Gens vor der Hybridbildung zu verwenden. In diesem Ansatz werden Fragmente der verschiedenen Gene, von denen beabsichtigt ist, dass sie das Hybrid bilden, in getrennten Polymerase-Ketten-Reaktionen gebildet. Die in diesen getrennten Reaktionen verwendeten Primer sind so gestaltet, dass die Enden der verschiedenen Produkte der getrennten Reaktionen komplementäre Sequenzen enthalten. Wenn diese getrennt hergestellten PCR-Produkte gemischt, denaturiert und wieder zusammengelagert werden, haben die Stränge passende Sequenzen an ihren 3' Endüberlappungen und wirken füreinander als Primer. Eine Verlängerung dieser Überlappung durch DNA-Polymerase bildet ein Molekül, in dem die Originalsequenzen zusammengespleißt sind, um das Hybridgen zu bilden. So benötigt dieses Verfahren jedes Mal spezifische Primer wenn man wünscht, ein chimäres Molekül zu konstruieren, das die gleichen Fragmente an einem anderen Ort oder Orientierung enthält. Darüber hinaus erlaubt es nicht ein geradliniges Mittel, um invertierte oder direkt wiederholte DNA-Sequenzen zu bilden [Horton, et al., Gene 77: 61–68 (1989)].
Insgesamt schließen die gegenwärtigen Verfahren, die für die Herstellung von genetischen Vektoren verwendet werden, vielschrittige Verfahren ein, die sehr zeitaufwändig sind. Im Durchschnitt beträgt die benötigte Zeit, um ein genetisches Insert in ein existierendes Plasmid einzubauen, mehr als drei Tage. Wenn ein genetischer Vektor aus vielen verschiedenen genetischen Segmenten zusammengebaut werden muss, kann seine Konstruktion einige Wochen und mehr benötigen. Wenn darüber hinaus ein genetisches Segment in eine Sequenz in einer definierten Orientierung eingebaut werden muss, wird die Verfahrenskomplexität erhöht, und die Produkte benötigen eine längere Überprüfungszeit.
Die ligasefreie Subklonierung wurde als ein schnelles Subklonierungsverfahren beschrieben [Shuldiner A., et al., Nucleic Acid Research, 18: 1920 (1990) und Analytical Biochemistry 194: 9–15 (1991)]. Dieses Verfahren wird durchgeführt durch Einbauen von Sequenzen in die PCR-Primer an den 5' Enden, was zu einem PCR-Produkt führt, dessen 3' Enden komplementär sind zu den 3' Enden des linearisierten Empfängerplasmids. Das PCR-Produkt und das Plasmid werden in einer zweiten PCR-Reaktion zusammengespleißt, in der die Taq-Polymerase die komplementären überlappenden 3' Enden verlängert. Jedoch besitzt auch dieses Verfahren einigen Nachteil im Vergleich zum erfindungsgemäßen Verfahren. Die Primer, die für das ligasefreie Verfahren gestaltet wurden, sollten komplementäre Sequenzen gegenüber beiden Segmenten von Interesse aufweisen, und deshalb sind diese Primer ziemlich lang (ungefähr 50 Nucleotide), teuer und weisen ein gesteigertes Potenzial eines nicht-spezifischen Zusammenlagerns an die Matrize auf, wohingegen die Primer, die für das vorliegende Verfahren gestaltet wurden, die minimale Länge aufweisen, was spezifisches Zusammenlagern an die Matrize erlaubt. Darüber hinaus können die Segmente ebenso wie die Primer, die für die vorliegende Erfindung hergestellt wurden, für die Konstruktion von verschiedenen Konstrukten verwendet werden. Zum Beispiel können ein Segment, das einen Replikationsursprung und einen selektierbaren Marker aufweist, oder sogar ein bestimmtes Reportergen, mit verschiedenen Segmenten von Interesse in verschiedenen Konstrukten ligiert werden. Diese kombinierten Produkte können hinsichtlich der erwünschten Orientierung unter Verwendung der gleichen Primer angereichert werden, wohingegen das ligasefreie Verfahren von Shuldiner et al. auf die spezifische Richtung und Kombination von Segmenten beschränkt ist. So wird jedes unterschiedliche Konstrukt die Herstellung von verschiedenen Produkten und die Synthese von verschiedenen Primern benötigen, wohingegen die vorliegende Erfindung sehr viel vielfältiger und ökonomischer ist. Andere Nachteile des Shuldiner et al., ligasefreien Verfahrens sind die Notwendigkeit der extensiven Optimierung der Anzahl von PCR-Zyklen der PCR der zweiten Stufe, der Temperatur, an der heterologes erneutes Zusammenlagern und Zyklisierung auftritt, sowie der Konzentration von NaCl. Am wichtigsten beträgt die berichtete Effizienz des Shuldiner et al., Verfahren ca. 50% der Gesamtzahl der Kolonien, wohingegen die Wirksamkeit des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ca. 95% beträgt. Darüber hinaus wurde eine erfolgreiche Subklonierung mit dem Shuldiner et al., Verfahren für PCR-Produkte bis zu einer Größe von 1,7 kb erreicht. Und schließlich sind zwei Primer, die in dem Verfahren von Shuldiner et al. verwendet werden, an ihrem 3' Ende komplementär zu der Zielsequenz und an ihrem 5' Ende zu dem Plasmid. So werden, um das gleiche Fragment in zwei verschiedene Plasmide einzuführen, etwa acht Primer benötigt, wohingegen nur sechs Primer für das erfindungsgemäße OER-Verfahren benötigt werden.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entwicklung eines schnellen Verfahrens, das ausgerichtet ist, um den Vorgang der Konstruktion von genetischen Vektoren zu verkürzen und zu vereinfachen, und um diesen Vorgang einfacher zu gestalten, indem genetische Vektoren bereitgestellt werden, die mit ihren Sequenzen in der geeigneten Orientierung angeordnet sind, ohne die Notwendigkeit für übermäßiges Überprüfen. Der zentrale Vorgang, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt wird, wird als Orientierungsanreicherungsreaktion (engl.: Orientation Enrichment Reaction (OER)) bezeichnet. In diesem Vorgang gibt es in jedem Zyklus eine Anreicherung, die hinsichtlich jener Vektoren anreichert, die genetische Segmente enthalten, die in der passenden Richtung angeordnet sind, so dass am Ende des Vorgangs ein genetischer Vektor erhalten wird, in dem alle Segmente passend ausgerichtet sind. Jeder Zyklus wird gebildet aus einer Phase von Polymerase-Ketten-Reaktion, gefolgt durch Produktreinigung und einer anschließenden Stufe der Segmentligation. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine unbegrenzte Anzahl von DNA-Segmenten aneinander ligiert werden, wobei die Größe des erhaltenen Endsegments die einzige Beschränkung ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren verkürzt signifikant die Zeit, die benötigt wird, um einen genetischen Vektor zu konstruieren, was die Konstruktion des Vektors sehr einfach und vielseitiger macht. Im Durchschnitt können acht genetische Segmente miteinander über Nacht ligiert werden. Wenn die Richtung der genetischen Vektoren untersucht wird, stellt sich hieraus, dass ca. 95% davon die benötigte Sequenz in der richtigen Orientierung enthält.
Zusammenfassung der Erfindung
Als einen ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur orientierungsgerichteten Konstruktion eines Konstruktes, umfassend mindestens zwei Nucleinsäuresegmente von Interesse, umfassend die Schritte:

a. Bereitstellen von Produkten mit phosphorilierten glatten Enden, diese Produkte sind aus den Nucleinsäuresegmenten von Interesse, die in dem Konstrukt kombiniert werden sollen, abgeleitet;
b. Durchführen von separaten Ligationsreaktionen, wobei in jeder Reaktion die phosphorilierten glattendigen Produkte von zwei verschiedenen Segmenten, die in Schritt (a) erhalten wurden, ligiert werden, diese Ligation führt zu einer kombinierten Sequenz, umfassend zwei Segmente von Interesse, die aneinander angeheftet sind;
c. Durchführen einer PCR-Amplifikationsreaktion unter Verwendung der kombinierten ligierten Sequenz, die in Schritt (b) erhalten wurde, als Matrize und spezifischer Anreicherungsprimer, die die PCR-Amplifikation in Richtung der erwünschten Orientierung führen, jede kombinierte ligierte Sequenz wird in einer separaten Reaktion PCR-amplifiziert, um ein kombiniertes Produkt mit phosphorilierten glatten Enden zu erzeugen;
d. Isolieren und Reinigen des kombinierten Produktes, das in Schritt (c) erhalten wurde, dieses kombinierte Produkt weist die angereicherte erwünschte Orientierung auf;
e. fakultativ zyklische Wiederholung der Schritte (b) bis (d) für eine erwünschte Anzahl von Wiederholungen, um alle Segmente von Interesse zu kombinieren, eine solche zyklische Wiederholung der Ligation von Produkten wird gefolgt von Orientierungsanreicherungs-PCR, und erlaubt die Kombination aller Segmente von Interesse, um das endisolierte kombinierte Produkt mit allen Segmenten, angeordnet in der gewünschten Orientierung, zu erzeugen; und
f. Durchführen einer Selbstligation des endisolierten gereinigten kombinierten Produktes, das in Schritt (d) oder (e) erhalten wurde, Erzeugen eines zirkulären doppelsträngigen DNA-Konstruktes, das alle die erwünschten Segmente passend angeordnet und operabel miteinander verbunden enthält.

In einer spezifischen Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren für die orientierungsgerichtete Konstruktion eines Konstruktes, umfassend mindestens zwei Nucleinsäuresegmente, gedacht. Eine der Segmente von Interesse umfasst ein replizierbares Segment, und in einigen Ausführungsformen kann dieses Segment auch Sequenzen aufweisen, die für einen selektierbaren Marker codieren.
Das replizierbare Segment, das in einem der Segmente von Interesse enthalten ist, umfasst eine Replikationsursprungs(ori)Sequenz.
Gemäß einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das replizierbare Segment aus einem replizierbaren Vektor abgeleitet sein, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus retroviralen Vektoren, Phagenvektoren, Plasmidvektoren, Expressionsvektoren, selbstreplizierenden Vektoren, Transpositionselementen, Phagemidvektoren und YAC-Vektoren besteht.
Gemäß einer spezifisch bevorzugten Ausführungsform können die phosphorilierten glattendigen Produkte aus Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden durch verschiedene Verfahren, zum Beispiel:

(i) Durchführen eines ersten Satzes an PCR-Amplifikation unter Verwendung der Segmente als Matrize, um Produkte zu erzeugen, die phosphorilierte glatte Enden aufweisen, jedes Segment wird in einer separaten Reaktion amplifiziert, unter Verwendung spezifischer Primer; oder
(ii) Erzeugen von glattendigen Produkten durch Spaltung der Nucleinsäuresegmente von Interesse unter Verwendung einer Endonuclease mit glatter Spaltstelle; oder
(iii) Erzeugen von kohäsiven Endprodukten durch Spaltung der Nucleinsäuresegmente unter Einsatz einer Endonuclease mit überstehender Spaltstelle, gefolgt von einer Auffüllreaktion; oder
(iv) Erzeugen von kohäsiven Endprodukten durch Spaltung der Nucleinsäuresegmente unter Einsatz einer Endonuclease mit überstehender Spaltstelle, gefolgt von Einzelstrang-DNA-Endonucleasereaktion, die einzelsträngige Uberhänge von den DNA-Enden abbaut.

Falls die glattendigen Produkte durch PCR-Reaktion erhalten werden, sollte eine Phosphorilierungsreaktion durchgeführt werden. Eine Phosphorilierungsreaktion unter Einsatz von T4 Polynucleotidkinase kann an den glattendigen PCR-Produkten, oder vorzugsweise an den Primern, die für die PCR-Reaktion verwendet werden, durchgeführt werden.
In noch einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur orientierungsgerichteten Konstruktion eines Konstruktes, umfassend mehr als zwei Nucleinsäuresegmente. Ähnlich zu den Schritten, die in der Kombination von zwei Segmenten auftreten, schließt die Kombination von mehr als zwei Segmenten zyklische Wiederholung der Schritte (a) bis (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens ein, um isolierte kombinierte Produkte mit der erwünschten Orientierung zu erzeugen. Diese kombinierten Produkte werden anschließend ligiert, um eine kombinierte ligierte Sequenz zu erzeugen. In jeder Ligationsreaktion werden nur zwei der kombinierten Produkte, die in der zyklischen Wiederholung der Schritte des Verfahrens erhalten werden, ligiert. Der nächste Schritt schließt eine PCR-Reaktion unter Verwendung der ligierten Sequenz als eine Matrize und spezifische Anreicherungsprimer, die diese PCR-Amplifikation in Richtung der erwünschten Orientierung führen, ein. Die erhaltenen kombinierten Produkte mit der erwünschten Orientierung werden anschließend isoliert und gereinigt.
Die oben genannten Schritte können zyklisch für eine erwünschte Zahl von Wiederholungen wiederholt werden, um ein kombiniertes Produkt mit all den Segmenten von Interesse zu erzeugen, die in der gewünschten Orientierung angeordnet sind, um ein endkombiniertes Produkt zu erzeugen. Der letzte Schritt ist die Selbstligation des isolierten endkombinierten Produktes zur Erzeugung eines zirkulären doppelsträngigen DNA-Konstruktes, das alle die erwünschten Segmente passend angeordnet und operabel miteinander verbunden enthält.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform setzt das erfindungsgemäße Verfahren als spezifische Primer für den ersten Satz von PCR-Amplifikationsreaktionen einen 5' Primer, umfassend eine Sequenz, die von dem 5' Ende eines Segmentes von Interesse abgeleitet ist (Sense Primer) und einen 3' Primer, der komplementär ist zu der Sequenz des 3' Endes des zu amplifizierenden spezifischen Segmentes (Antisense Primer), ein.
Darüber hinaus können die spezifischen Anreicherungsprimer, die in der Amplifikation der kombinierten ligierten Sequenzen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, sein: ein 5' Primer, umfassend eine Sequenz, abgeleitet von dem 5' Ende des ersten Segmentes, die stromaufwärts des zweiten ligierten Segmentes in dem kombinierten ligierten Produkt liegt (Sense Primer) und ein 3' Primer, der komplementär ist zu der 3' Endsequenz des zweiten ligierten Segmentes (Antisense Primer), der kombinierten ligierten Sequenz.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform betrifft die Primer, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Jeder der Primer kann von etwa 4 bis etwa 200 Nucleotide in Bezug auf die Länge umfassen. Weiter bevorzugt umfasst jeder der Primer von 5 bis etwa 50, und am meisten bevorzugt umfassen die Primer von etwa 8 bis etwa 30 Nucleotide in Bezug auf die Länge.
Spezifisch bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen die Enzyme, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Zum Beispiel kann die Ligationsreaktion durchgeführt werden durch den Einsatz von DNA-Ligase, und die PCR-Amplifikation kann durchgeführt werden durch den Einsatz einer High Fidelity DNA Polymerase.
Gemäß einer spezifischen Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Konstruktion eines Konstruktes vorgesehen, umfassend mindestens zwei Segmente von Interesse. Solche Segmente können die Folgenden sein: eines der Segmente von Interesse, die eine Replikationsursprungs(ori)Sequenz und fakultativ eine Sequenz umfassen, die für einen selektierbaren Marker codiert; mindestens ein zusätzliches Segment, umfassend eine heterologe oder homologe codierende Nucleinsäuresequenz von Interesse, oder Mutationen, Fragmente oder Derivate davon und fakultativ mindestens einen selektierbaren Marker; und fakultativ mindestens ein zusätzliches Segment, umfassend Nucleinsäuresequenzen, die für Expressions-, Kontroll-, Promotions- und/oder regulatorische Elemente codieren.
Die heterologe oder homologe codierende Sequenz von Interesse kann ein Protein codieren, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Reporterproteinen, Enzymen, Hormonen, Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Strukturproteinen und industriell einsetzbaren Proteinen besteht, oder selbst ein therapeutisches Produkt sein. Gemäß einer anderen spezifischen Ausführungsform kann die heterologe codierende Sequenz ein Reporterprotein codieren, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem grünen fluoreszenten Protein (GFP), Luciferase, sekretierter alkalischer Phosphatase (SEAP) und ⎕-Galactosidase (⎕-gal) besteht.
Konstrukte umfassend eine heterologe oder homologe codierende Sequenz können gemäß einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung Expressionsvehikel sein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren manuell durchgeführt werden.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren automatisch durchgeführt werden.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 Schematische Darstellung des OER-Verfahrens
Die Ligation von zwei PCR-Produkten (Fragmente I und II), durchgeführt unter Verwendung einer Ligase, bildete vier verschiedene mögliche Orientierungen (A, B, C, D). Die Anreicherung hinsichtlich der erwünschten Orientierung wurde durch PCR-Reaktion unter Verwendung spezifischer Primer durchgeführt. Der 5' Primer ist ein Sense Primer, der von dem 5' Ende des stromaufwärts gelegenen Segments abgeleitet ist, und der 3' Primer ist ein Antisense Primer, der von dem 3' Ende des stromabwärts gelegenen Segments abgeleitet ist. Abkürzungen: OER (Orientierungsanreicherungsreaktion), Frag. (Fragment), Lig. (Ligation).
2A–2C Konstruktion eines Konstruktes mit den vier möglichen Orientierungen und Verwendung des OER-Verfahrens
2A PCR von zwei DNA-Segmenten, 1: PCR des ersten Segments unter Verwendung der Primer 335 und 336 (jeweils SEQ ID NOs: 7 und 8), um ein DNA-Segment von 630 Nucleotiden Länge zu bilden; 2: PCR des zweiten Segments unter Verwendung der Primer 826 und 827 (jeweils SEQ ID NOs: 9 und 10), um ein Segment von 500 Nucleotiden Länge zu bilden; M: DNA-Marker ⎕/BstE II.
2B PCR für die Ligationsprodukte von zwei DNA-Segmenten, die einer PCR unter A unterzogen wurden, 1–4: PCR für die Spleißprodukte der zwei Segmente mit vier möglichen Orientierungen (jeweils 335-826, 335-827, 336-826, 336-827); ein Segment mit einer Länge von 1130 wird durch Verknüpfung der zwei vorherigen Segmente erhalten; M: DNA-Marker ⎕/BstE II.
2C Analyse der Orientierung der eingeführten Segmente unter Verwendung von Restriktionsenzymen. Spaltung von PCR-Produkten unter Verwendung des Restriktionsenzyms PvuII; die Figur zeigt, dass ein unterschiedliches Spaltungsmuster für die vier verschiedenen Orientierungen erhalten wird; M: DNA-Marker.
3A–3C Konstruktion des pcDNAPKRwt Konstruktes unter Verwendung des OER-Verfahrens
3A Oben: schematische Darstellung, welche die Herstellung des ersten Segments unter Verwendung der Primer 2037 und 2038 (jeweils SEQ ID NO: 1 und 2) und die Herstellung des zweiten Segments unter Verwendung der Primer 546 und 547 (jeweils SEQ ID NO: 3 und 4) zeigt. Unten: Agarosegel, das die PCR-Produkte der ersten Amplifikationsreaktion, die das erste und zweite Segment erzeugt (jeweils 2746 bp und 1657 bp), zeigt.
3B Oben: schematische Darstellung, welche die Erzeugung des dritten Segments durch Ligieren der Segmente 1 und 2 und Anreicherung hinsichtlich der erwünschten Orientierung durch Durchführen von PCR unter Verwendung der 2037 und 547 Primer (jeweils SEQ ID NO: 1 und 4) zeigt. Unten: Agarosegel, welches das PCR-Produkt des dritten Segments (4403 bp) zeigt, welches das kombinierte Produkt des ersten und des zweiten Produkts ist.
3C Oben: PKR wt Minipräparationsanalyse der Kolonien. Unten: Darstellung, die eine schematische Karte des resultierenden Endplasmids zeigt. Abkürzungen: Phos. (phosphoriliert), Hum. (human), c. (Zelle), lib. (Bibliothek), Prim. (Primer), Amp (Ampicillin), ori (Replikationsursprung), S-lig. (Selbstligation), Dig. (Spaltung).
4A–4B Konstruktion der pcDNA-PKR⎕ 6 Konstruktes unter Verwendung der OER-Verfahrens
4A Oben: schematische Darstellung, welche die Erzeugung eines Segments zeigt, das eine Deletionsmutation aufweist. Das Segment wurde hergestellt durch Durchführen einer PCR unter Verwendung der Primer 548 und 549 (jeweils SEQ ID NOs: 5 und 6) und des Plasmids pcDNAPKRwt (das oben erzeugt wurde) als eine Matrize. Das Produkt von PKR⎕ 6 ist gezeigt. Unten: Agarosegel, welches das PCR-Produkt des Endsegments (4385 bp) zeigt, das eine Deletion von 18 Nucleotiden aufweist.
4B Agarosegel, das die Verdauungsprodukte des PKR⎕ 6 Plasmids zeigt, die nach Minipräparation erhalten wurden. Unten: Darstellung, die eine schematische Karte des resultierenden Endplasmids zeigt. Abkürzungen: Phos. (phosphoriliert), Prim. (Primer), Amp (Ampicillin), ori (Replikationsursprung), S-lig. (Selbstligation), Dig. (Spaltung), Del. (Deletion), bp (Basenpaare).
5A–5E Schematische Darstellung unter Verwendung des OER-Verfahrens in der Konstruktion von Zwei verschiedenen Konstrukten für die gleiche Matrize
5A Die PGFP-LacP-LacZ und die pLacZ-LacP-GFP Plasmide, die beide den IPTG induzierbaren Promotor (LacP) tragen, wurden unter Verwendung einer einzelnen Matrize in zwei verschiedenen Orientierungen durch das erfindungsgemäße OER-Verfahren konstruiert.
5B Die Insertion des LacP Promotors und die Anreicherung der Orientierung I führt zu LacZ Expression.
5C Die Insertion des LacP Promotors und die Anreicherung der Orientierung II führt zu GFP Expression.
5D Etwa 95% der Bakterien, die mit dem pGFP-LacP-LacZ Konstrukt transformiert wurden, die durch Anreicherung der Orientierung I hergestellt wurden, führten zu Kolonien, die eine blaue Farbe zeigen.
5E Etwa 95% der Bakterien, die mit dem pLacZ-LacP-GFP Konstrukt transformiert wurden, die durch Anreicherung der Orientierung II hergestellt wurden, führten zu Kolonien, die ein grün fluoreszierendes Signal unter UV Licht zeigen.
Abkürzungen: Orien. (Orientierung), LacP (IPTG induzierter Promotor), GFP (grün fluoreszierendes Protein), LacZ (⎕-Galactosidasegen), Amp (Ampicillin), Ori (Replikationsursprung), bl. (blau), gr. (grün).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die meisten der Klonierungstechniken von Nukleinsäuresequenzen schließen die Verwendung von PCR ein. Diese Verfahren erlauben die einfache Klonierung von irgendeiner Nucleinsäuresequenz, die von bekannten Sequenzen flankiert ist, durch das Gestalten von Primern, die Restriktionsendonuclease Spaltungssequenzen aufweisen. Nach der Amplifikation kann das doppelsträngige PCR-Produkt mit der korrespondierenden Endonuclease gespalten werden, um kleine 5' oder 3' Überhangsequenzen zu erhalten, die für die Endonucleasen charakteristisch sind. Die PCR-Produkte sind für die Klonierung in einen Vektor, der mit der gleichen Endonuclease gespalten wurde, bereit. Jedoch sind diese Verfahren durch die häufig ineffiziente Spaltung der Restriktionsendonuclease Spaltungsstellen nahe einem Ende einer doppelsträngigen Nucleinsäure begrenzt. Darüber hinaus ist dem Fachmann gut bekannt, dass rekombinante Klone mit Linker-DNA (die eine Vielzahl von Restriktionsstellen enthält) reduzierte E. coli Transfektionseffizienzen aufweisen. Das Klonierungsverfahren der vorliegenden Erfindung ist vorteilhaft, weil es nicht die Verwendung von Restriktionsenzymen einschließt und deshalb keine Insertion von DNA Linkern benötigt. Aus diesem Grund sind die Transfektionseffizienzen von Klonen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wurden, größer als jene, die durch Techniken hergestellt werden, welche die Verwendung von DNA-Linkern benötigen.
So betrifft die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur orientierungsgerichteten Konstruktion eines Konstruktes, das mindestens zwei Nucleinsäuresegmente von Interesse umfasst. In einem ersten Schritt werden Produkte mit phosphorilierten glatten Enden bereitgestellt. Diese Produkte sind von den Nucleinsäuresegmenten von Interesse, die in dem Endkonstrukt kombiniert werden sollen, abgeleitet. Phosphorilierte glattendige Segmente können unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren erhalten werden, die hier im Folgenden beschrieben werden. In einem nächsten Schritt werden separate Ligationsreaktionen durchgeführt, um zwei Segmente von Interesse zu kombinieren. In jeder Reaktion werden die phosphorilierten glattendigen Produkte von zwei verschiedenen Segmenten, die in dem ersten Schritt erhalten wurden, ligiert. Diese Ligation erzeugt eine kombinierte ligierte Sequenz, die zwei Segmente von Interesse aufweist, die aneinander angeheftet sind. Wie in dem dargestellten Beispiel in 1 und in dem Experiment, das in 2 (siehe Beispiel 1) angegeben wird, gezeigt ist, kann die Ligation von zwei doppelsträngigen Segmenten zu Produkten mit vier verschiedenen Orientierungen führen. Der nächste Schritt wäre deshalb die Anreicherung hinsichtlich der erwünschten Orientierung in der resultierenden Produktpopulation, die erreicht werden kann durch Durchführen einer PCR-Reaktion unter Verwendung der ligierten Sequenz, die in dem zweiten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wurde, indem eine Matrize und spezifische Anreicherungsprimer die PCR-Amplifikation in Richtung der erwünschten Orientierung führen. Jede kombinierte ligierte Sequenz wird in einer separaten Reaktion PCR amplifiziert, um das kombinierte Produkt mit der gewünschten Orientierung ebenso wie phosphorilierten glatten Enden zu erzeugen. In einem vierten Schritt wird das kombinierte Produkt, das in dem dritten Schritt erhalten wurde, isoliert und gereinigt. Dieses kombinierte Produkt weist die angereicherte erwünschte Orientierung auf. Falls das gewünschte Produkt aus mehr als zwei Segmenten zusammengesetzt ist, können die zweiten bis vierten Schritte zyklisch für irgendeine Anzahl von Wiederholungen wiederholt werden, um all die Segmente von Interesse zu kombinieren. Die Zahl der Wiederholungen dieser Schritte hängt von der Zahl der zu ligierenden Segmente ab. Die zyklische Wiederholung der Ligation von Produkten gefolgt durch Orientierungsanreicherungs PCR wird das Kombinieren von allen Segmenten von Interesse ermöglichen, um das endisolierte kombinierte Produkt mit allen Segmenten, die in der erwünschten Orientierung angeordnet sind, zu erzeugen. Der letzte Schritt ist Durchführen der Selbstligation des linearen endisolierten gereinigten kombinierten Produkts, das in dem vorhergehenden Schritt erhalten wurde, was ein zirkuläres doppelsträngiges DNA-Konstrukt mit all den erwünschten Segmenten passend angeordnet und operabel miteinander verknüpft erzeugt. Es wird verstanden, dass in dem Fall, in dem ein lineares Produkt erwünscht ist, keine Notwendigkeit für den Selbstligationsschritt besteht.
So wie er hier verwendet wird, bedeutet der Begriff "Nucleinsäure" Polynucleotide, wie Desoxyribonucleinsäure (DNA) und, wo geeignet, Ribonucleinsäure (RNA). Die Begriffe sollen verstanden werden, dass sie, als Äquivalente, Analoga von entweder RNA oder DNA einschließen, die von Nucleotidanaloga hergestellt wurden, und wie auf die beschriebene Ausführungsform anwendbar, einzelsträngige (wie Sense oder Antisense) und doppelsträngige Polynucleotide. Der Begriff DNA, so wie er hier verwendet wird, schließt auch cDNA, d.h. komplementäre oder Copy DNA ein, die von einer RNA-Matrize durch die Wirkung von reverser Transkriptase (RNA abhängige DNA Polymerase) hergestellt wird.
Der Begriff "operabel verknüpft" wird hier verwendet, um anzugeben, dass eine erste Nucleinsäuresequenz mit einer zweiten Nucleinsäuresequenz operabel verknüpft ist, wenn die erste Nucleinsäuresequenz in einer funktionellen Nachbarschaft mit der zweiten Nucleinsäuresequenz angeordnet wird. Zum Beispiel ist ein Promotor operativ mit einer codierenden Sequenz verknüpft, wenn der Promotor die Transkription oder Expression der codierenden Sequenz bewirkt. Im Allgemeinen sind operativ verknüpfte DNA-Sequenzen kontinuierlich und, wenn es notwendig ist um zwei Protein codierende Regionen zu verbinden, in demselben Leserahmen.
So wie hier verwendet, betrifft "PCR" (Polymerase-Ketten-Reaktion) ein Verfahren zum Amplifizieren einer oder mehrerer spezifischer Nucleinsäuresequenzen durch wiederholte Synthese- und Denaturierungsrunden unter geeigneten "Amplifikationsbedingungen".
Die PCR benötigt zwei Primer, die in der Lage sind mit einem Einzelstrang einer doppelsträngigen Ziel-Nucleinsäuresequenz zu hybridisieren, die unter geeigneten "Hybridisierungsbedingungen" amplifiziert werden soll. In der PCR ist diese doppelsträngige Zielsequenz denaturiert, und ein Primer ist an jeden Einzelstrang des denaturierten Ziels angelagert. Die Primer lagern sich an die Ziel-Nucleinsäure an entfernten Stellen (stromabwärts und stromaufwärts) voneinander und in Orientierungen an, so dass das Extensionsprodukt eines Primers, wenn es von seinem Komplement getrennt wird, mit dem Extensionsprodukt, das von dem anderen Primer und dem Zielstrang gebildet wird, hybridisiert. Sobald ein gegebener Primer an die Zielsequenz hybridisiert, wird der Primer durch die Wirkung einer DNA-Polymerase verlängert. Im Allgemeinen wird eine hitzestabile DNA-Polymerase verwendet, so dass keine neue Polymerase nach jedem Denaturierungsschritt hinzugefügt werden muss. Eine solche thermostabile DNA-Polymerase ist dem Fachmann bekannt, zum Beispiel kann es die Taq-Polymerase sein. Das Extensionsprodukt wird anschließend von der Zielsequenz denaturiert, und das Verfahren wird wiederholt. Ein besonderes Verfahren zum Minimieren der Wirkungen von Kreuzkontamination von Nucleinsäureamplifikation ist in US Patent Nr. 5,035,996, das hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist, beschrieben. Das US Pat. Nr. 5,494,810 an Barany et al. mit dem Titel "Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)", das hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist, betrifft ein patentiertes Verfahren (beschrieben in den US Pat. Nrs. 4,683,202 und 4,683,195) für die exponenzielle Amplifikation eines spezifischen DNA-Fragments durch Verwenden von zwei Oligonucleotidprimern, die an gegenüberliegende Stränge hybridisieren und die Region von Interesse in einer Ziel-DNA flankieren. Das US Pat. Nr. 4,459,359, das ebenfalls durch Bezugnahme eingeschlossen ist, beschreibt PCR Assays.
So wie hier verwendet, sind "Amplifikationsbedingungen" jene Bedingungen, unter denen ein Nucleinsäuremolekül mit zwei Oligonucleotidprimern hybridisieren kann, die einige Homologie zu dem Nucleinsäuremolekül aufweisen, und durch Primerextension das Nucleinsäuremolekül replizieren, was ein einzelsträngiges Nucleinsäuremolekül in ein doppelsträngiges Nucleinsäuremolekül über Primerextension überführt. Dies ist die Elongation. Die beiden Stränge werden anschließend durch Erhöhen der Temperatur voneinander geschmolzen, und die einzelnen Stränge stehen wieder für Hybridisierung mit einem homologen einzelsträngigen Oligonucleotidprimer zur Verfügung. Solche Bedingungen sind dem Fachmann gut bekannt und sind im Folgenden detaillierter für einige spezifische Nucleinsäuremoleküle beschrieben.
So wie hier verwendet, schließen "Hybridisierungsbedingungen" Temperaturen, Salzkonzentrationen, Primersequenzen, Nucleinsäuresequenzen, Lösungsmittelkonzentrationen ein, die es erlauben, dass zwei einzelsträngige Nucleinsäuremoleküle über Wasserstoffbrücken, wie von Watson und Crick beschrieben, basenpaaren. Diese Bedingungen sind spezifisch für jeden Satz aus Nucleinsäuren und Primern. Jedoch sind dem Fachmann allgemeine Bedingungen bekannt, und sie sind unten detaillierter und unter Bezugnahme beschrieben.
Die PCR-Mischung kann die Ziel-DNA, das DNA Primerpaar, vier Desoxyribonucleosidtriphosphate (A, T, C, G), MgCl₂, DNA-Polymerase (thermostabil) und herkömmliche Puffer enthalten. Die DNA kann für eine Anzahl von Zyklen (für gewöhnlich 20–40 Zyklen) amplifiziert werden. Es ist im Allgemeinen möglich, die Sensitivität des Nachweises durch Verwendung einer Vielzahl von Zyklen zu steigern, wobei jeder Zyklus aus einem kurzen Denaturierungszeitraum der Ziel-DNA bei einer erhöhten Temperatur, dem Abkühlen der Reaktionsmischung und der Polymerisation mit der DNA-Polymerase besteht. Die Auswahl der PCR-Primersequenzen, die Herstellung von PCR-Reagenzien und Reaktionsmischungen und die Gestaltung und Durchführung von PCR sind im PCR Stand der Technik gut bekannt.
Kurz gesagt werden Enzym, Primer, Ziel-Nucleinsäure, dNTPs, MgCl₂ und Puffer in einer Reaktionsmischung gemischt. Das Gefäß wird in ein PCR-Gerät gesetzt, von dem viele Versionen kommerziell von Lieferanten wie Perkin Elmer Cetus Instruments, erhältlich sind und auf eine Temperatur zwischen etwa 50°C und ungefähr 80°C, vorzugsweise zwischen 70°C und 80°C erhitzt.
So wie hier verwendet ist die "Amplifikation" ein Spezialfall der Nucleinsäurereplikation, der Matrizenspezifität einschließt. Matrizenspezifität wird hier von Replikationsfidelität (d.h. Synthese der passenden Polynucleotidsequenz) und Nucleotid (Ribo- oder Desoxyribo-)spezifität unterschieden.
Der Nachweis des amplifizierten Nucleinsäureprodukts kann durch irgendeine einer Vielzahl von bekannten Techniken erreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform, die in Schritt (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben ist, wird das amplifizierte Produkt auf der Basis des Molekulargewichts durch Gelelektrophorese getrennt, und die getrennten Produkte weiden anschließend durch die Verwendung von Nucleinsäure spezifischen Färbungen sichtbar gemacht, was es einem erlaubt, die einzelnen Spezies des aufgelösten amplifizierten Produkts, das in dem Gel vorliegt, zu beobachten. Obwohl eine Vielzahl von Nucleinsäure spezifischen Färbungen existiert und geeignet wäre, um die elektrophoretisch getrennten Nucleinsäuren sichtbar zu machen, ist Ethidiumbromid bevorzugt.
In einer spezifischen Ausführungsform zielt das erfindungsgemäße Verfahren auf die orientierungsgerichtete Konstruktion eines Konstruktes, umfassend mindestens zwei Segmente. Eines der Segmente von Interesse umfasst ein replizierbares Segment, und in einigen Ausführungsformen kann dieses Fragment auch Sequenzen enthalten, die einen selektierbaren Marker codieren. Alternativ dazu kann irgendein anderes Segment von Interesse die Sequenzen umfassen, die für einen selektierbaren Marker codieren. Das replizierbare Segment, das in einem der Segmente von Interesse enthalten ist, umfasst eine Replikationsursprungs(ori)Sequenz.
So wie hier verwendet, bedeutet replizierbares Segment oder prokaryotisches Replikon eine DNA-Sequenz mit der Fähigkeit, die autonome Replikation auf die extrachromosomale Aufrechterhaltung des rekombinanten DNA-Moleküls in einer prokaryoten Wirtszelle, wie einer bakteriellen Zelle, die damit transformiert wurde, zu führen. Solche Replikons sind im Stand der Technik gut bekannt. Gemäß einer spezifischen Ausfükrungsform der vorliegenden Erfindung kann das replizierbare Segment von einem replizierbaren Vektor abgeleitet sein, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus retroviralen Vektoren, Phagenvektoren, Plasmidvektoren, Expressionsvektoren, selbstreplizierenden Vektoren, Transpositionselementen, Phagemidvektor und YAC-Vektoren.
Zusätzlich können jene Ausführungsformen, die ein prokaryotes Replikon einschließen, auch einen selektierbaren Marker einschließen, der zum Beispiel ein Gen ist, dessen Expression Arzneimittelresistenz an einen bakteriellen Wirt, der damit transformiert wurde, verleiht. Typische bakterielle Arzneimittelresistenzgene sind jene, welche Resistenz gegenüber Ampicillin, Tetracyclin oder Kanamycin verleihen.
Eine Vielzahl von selektierbaren Markern kann in irgendein Konstrukt eingebaut werden. Zum Beispiel kann ein selektierbarer Marker verwendet werden, der einen selektierbaren Phänotyp, wie Arzneimittelresistenz, Nährstoffauxotrophie, Resistenz gegenüber einem cytotoxischen Mittel oder Expression eines Oberflächenproteins verleiht. Selektierbare Markergene, die verwendet werden können, schließen neo, gpt, dhfr, ada, pac, hyg CAD und hisD ein. Der übertragene selektierbare Phänotyp macht es möglich, die Empfängerzellen zu identifizieren und zu isolieren. Amplifizierbare Gene, die selektierbare Marker codieren (z.B. ada, dhfr und das multifunktionelle CAD Gen, das Carbamylphosphatsynthase, Aspartattranscarbamylase und Dihydroorotase codiert) weisen die zusätzliche Eigenschaft auf, dass sie die Selektion von Zellen erlauben, die amplifizierte Kopien des selektierbaren Markers, eingebaut in das Genom, enthalten. Dieses Merkmal stellt einen Mechanismus zur signifikanten Steigerung der Kopienzahl eines benachbarten oder verknüpften Gens, dessen Amplifikation erwünscht ist, bereit.
Selektierbare Marker können in zwei Kategorien eingeteilt werden: positiv selektierbare und negative selektierbare (in anderen Worten, Marker mit entweder positiver Selektion oder negativer Selektion). In der positiven Selektion sind Zellen, welche den positiv selektierbaren Marker exprimieren, in der Lage die Behandlung mit einem Selektionsmittel zu überleben (wie neo, gpt, dhfr, ada, pac, hyg mdrl und hisD). In der negativen Selektion werden die Zellen, die den negativ selektierbaren Marker exprimieren, in der Gegenwart des Selektionsmittels zerstört (z.B. tk, gpt).
Es wird verstanden, dass das erfindungsgemäße Verfahren für die Erzeugung eines Fragments verwendet werden kann, das verschiedene Anzahlen von Segmenten von Interesse umfasst, die passend in einer erwünschten Orientierung angeordnet sind. Dieses Fragment kann anschließend in einen existierenden linearisierten Vektor eingebaut werden, um das Konstrukt von Interesse unter Verwendung herkömmlicher Klonierungstechniken zu erzeugen.
Beispiele für herkömmliche Klonierungstechniken schließen die Verwendung von Restriktionsendonucleasen, gefolgt durch Ligation, wie beschrieben in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, hier durch Bezugnahme eingeschlossen, ein.
Gemäß einer spezifisch bevorzugten Ausführungsform können die glattendigen Produkte des ersten Schritts des erfindungsgemäßen Verfahrens durch verschiedene Verfahren erhalten werden, zum Beispiel:

(i) Durchführen eines ersten Satzes an PCR-Amplifikation unter Verwendung der Segmente als Matrize, um Produkte zu erzeugen, die phosphorilierte glatte Enden aufweisen, jedes Segment wird in einer separaten Reaktion amplifiziert, unter Verwendung spezifischer Primer; oder
(ii) Erzeugen von glattendigen Produkten durch Spaltung der Nucleinsäuresegmente von Interesse durch eine glattendige Endonuclease, wie SrfI (GCCC/GGGC), SmaI (CCC/GGG) oder EcoRV (GAT/ATC); oder
(iii) Erzeugen von kohäsiven Endprodukten durch Spaltung der Nucleinsäuresegmente unter Einsatz einer Endonuclease mit überstehender Spaltstelle, gefolgt von einer Auffüllreaktion; oder
(iv) Erzeugen von kohäsiven Endprodukten durch Spaltung der Nucleinsäuresegmente unter Einsatz einer Endonuclease mit überstehender Spaltstelle, gefolgt von Einzelstrang-DNA-Endonucleasereaktion, Abbau von einzelsträngigen Überhängen von den DNA-Enden.

Nach der Spaltung können glattendige Restriktionsenzyme einzelne 5' "terminale" Phosphate an beiden Seiten der Restriktionsstelle beibehalten.
Falls die glattendigen Produkte durch PCR-Reaktion erhalten werden, sollte eine Phosphorilierungsreaktion durchgeführt werden. Es wird außerdem verstanden, dass es viele alternative Verfahren zur Herstellung eines phosporilierten DNA-Segments gibt. Zum Beispiel wird das Enzym Polynucleotidkinase vom Fachmann verwendet, um Phosphatgruppen an das 5' Ende von DNA-Molekülen hinzuzufügen. Eine Phosphorilisierungsreaktion unter Einsatz T4 Kinase kann an dem glatten Ende von PCR-Produkten oder vorzugsweise an den Primern, die für die PCR-Reaktion verwendet werden, durchgeführt werden.
In noch einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur orientierungsgerichteten Konstruktion eines Konstruktes, das mehr als zwei Nucleinsäuresegmente umfasst. Genauso wie in den Schritten, welche die Kombination von zwei Segmenten einschließen, schließt die Kombination von mehr als zwei Segmenten zyklische Wiederholung der Schritte (b) bis (d) gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ein, um isolierte kombinierte Produkte mit der gewünschten Orientierung zu erzeugen. Diese kombinierten Produkte werden anschließend ligiert, um eine kombinierte ligierte Sequenz zu erzeugen. In jeder Ligationsreaktion werden nur zwei der kombinierten Produkte, die in der zyklischen Wiederholung erhalten wurden, ligiert. Der nächste Schritt schließt eine PCR-Reaktion unter Verwendung der ligierten Sequenz als einer Matrize ein, und spezifische Anreicherungsprimer führen diese PCR-Amplifikation in Richtung der erwünschten Orientierung. Die kombinierten erhaltenen Produkte, welche die erwünschte Orientierung aufweisen, werden anschließend isoliert und gereinigt.
Die Schritte können zyklisch für eine erwünschte Anzahl von Wiederholungen wiederholt werden, um ein endkombiniertes Produkt mit all den Segmenten von Interesse in der gewünschten Orientierung zu erhalten. Der letzte Schritt ist die Selbstligation des isolierten endkombinierten Produkts zur Erzeugung eines zirkulären doppelsträngigen DNA-Konstruktes, das die erwünschten Segmente passend angeordnet und operabel verbunden enthält.
Das erfindungsgemäße Verfahren setzt vorzugsweise als spezifische Primer für den ersten Satz an Amplifikationsreaktionen einen 5' Primer ein, der eine Sequenz umfasst, die von dem 5' Ende des Segments von Interesse (Sense Primer) abgeleitet ist, und einen 3' Primer, der komplementär ist zu der Sequenz des 3' Endes des spezifisch zu amplifizierenden Segments (Antisense Primer).
Weiterhin können die spezifischen Anreicherungsprimer, die in der Amplifikation der kombinierten ligierten Sequenzen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, sein: ein 5' Primer, der eine Sequenz aufweist, die von dem 5' Ende des ersten Segments abgeleitet ist, das stromaufwärts von dem zweiten ligierten Segment in dem kombinierten ligierten Produkt (Sense Primer) liegt und ein 3' Primer, der komplementär zu der 3' Endsequenz des zweiten ligierten Segments (Antisense Primer) der kombinierten ligierten Sequenz ist.
Der Begriff komplementäre Nucleinsäuresequenz, so wie er hier verwendet wird, betrifft eine Sequenz von Nucleotiden in einem einzelsträngigen Molekül von DNA oder RNA, das ausreichend komplementär ist zu einem anderen Einzelstrang, um spezifisch (nicht zufällig) mit ihm mit anschließender Wasserstoffbindung zu hybridisieren.
Unter Hybridisierung wird die Paarung von komplementären Nucleotidsequenzen (Strängen von Nucleinsäure) verstanden, um einen Duplex, Heteroduplex oder Komplex mit mehr als zwei einzelsträngigen Nucleinsäuren durch Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basenpaaren zu bilden. Die Hybridisierung ist eine spezifische, d.h. nicht zufällige Interaktion zwischen/unter komplementären Polynucleotiden, die kompetitiv inhibiert werden kann.
Es sollte angemerkt werden, dass die gleichen Primer für die erste PCR-Reaktion, die das glattendige Segment von Interesse erzeugt, und die Orientationsanreicherungs-PCR-Reaktion, wie beispielhaft in 1 und in den Beispielen 1 und 2 dargestellt, verwendet werden kann.
Der Begriff Primer, so wie er hier verwendet wird, ist: ein Polynucleotid, ob aus einer Nucleinsäurerestriktionsspaltung oder synthetisch hergestellt, das in der Lage ist, als ein Initiationspunkt für die Synthese zu wirken, wenn er unter Bedingungen gesetzt wird, welche die Synthese eines Primerextensionsprodukts induzieren, das komplementär ist zu einem Matrizennucleinsäurenstrang, d.h. in der Gegenwart von Nucleotiden und einem Mittel für die Polymerisation, wie DNA-Polymerase, reverse Transkriptase oder ähnlichem, unter einer geeigneten Temperatur und pH Reaktionsbedingungen.
Oligonucleotide oder Polynucleotide für die Verwendung als PCR-Primer können chemisch synthetisiert werden nach dem Festphasenphosphoramidittriester Verfahren, das zum ersten Mal von Beaucage und Carruthers [Tetrahedron Lett. 22: 1859–1862 (1981)] beschrieben wurde, unter Verwendung eines automatischen Sequenziergerätes, wie beschrieben in Needham-VanDevanter [Needham-VanDevanter, D. R., et al., Nucleic Acids Res. 12: 6159–6168 (1984)]. Die Reinigung von Oligonucleotiden geschieht entweder durch native Acrylamid Gelelektrophorese oder durch Anionenaustausch HPLC. Die Sequenz der synthetischen Oligonucleotide kann unter Verwendung des chemischen Degradationsverfahrens von Maxam und Gilbert [Maxam, A. M. und Gilbert, W. Methods in Enzymology Grossman, L. und Moldave, D., Hrsg., Academic Press, New York, 65: 499–560 (1980)], verändert werden.
Die Wahl der Nucleotidsequenz eines Primers hängt von Faktoren ab, wie der Entfernung auf der Nucleinsäure von der Region, die für die erwünschte spezifische Nucleinsäuresequenz codiert, die in einer Nucleinsäure von Interesse anwesend ist und ihrer Hybridisierungsstelle auf der Nucleinsäure relativ zu einem zweiten Primer, der verwendet werden soll. Der Primer wird vorzugsweise in einzelsträngiger Form für die maximale Effizienz bereitgestellt, aber er kann alternativ doppelsträngig sein. Wenn er doppelsträngig ist, wird der Primer zuerst behandelt, um seine Stränge zu trennen, bevor ex verwendet wird, um die Extensionsprodukte herzustellen. Vorzugsweise ist der Primer ein Polydesoxyribonucleotid.
Polynucleotid, so wie hier verwendet, ist ein Polymer von einzel- oder doppelsträngigen Nucleotiden. So wie hier verwendet, schließt "Polynucleotid" und seine grammatikalischen Äquivalente den vollständigen Bereich von Nucleinsäuren ein. Ein Polynucleotid betrifft typischerweise ein Nucleinsäuremolekül, das als ein linearer Strang von zwei oder mehr Desoxyribonucleotiden und/oder Ribonucleotiden umfasst ist. Die exakte Größe hängt von vielen Faktoren ab, die wiederum von den letztendlich verwendeten Bedingungen abhängen, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung schließt Primer, RNA/DNA-Segmente, Oligonucleotide (relativ kurze Polynucleotide), Gene, Vektoren, Plasmide und ähnliches ein.
Die Polynucleotide können durch eine Vielzahl von Verfahren hergestellt werden, einschließlich de novo chemischer Synthese und Ableitung von Nucleinsäurefragmenten von nativen Nucleinsäuresequenzen, die als Gene oder Teile von Genen in einem Genom, Plasmid oder anderem Vektor existieren, wie durch Restriktionsendonucleasespaltung von größeren doppelsträngigen Nucleinsäuren und Strangtrennung oder durch enzymatische Synthese unter Verwendung einer Nucleinsäurematrize.
Die de novo chemische Synthese eines Polynucleotids kann unter Verwendung irgendeines geeigneten Verfahrens durchgeführt werden, wie zum Beispiel den Phosphotriester oder Phosphodiesterverfahren. Siehe Narang et al. [Meth. Enzymol. (1979) 68: 90; US Pat Nr. 4,356,270; Itakura et al., (1989) Ann. Rev. Biochem. 53: 323–56; und Brown et al., (1979) Meth. Enzymol. 68: 109].
Vorzugsweise umfasst jeder der Primer, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden von etwa 4 bis etwa 200 Nucleotide in Bezug auf die Länge. Weiter bevorzugt umfasst jeder der Primer von etwa 5 bis etwa 50 Nucleotide in Bezug auf die Länge. Am meisten bevorzugt umfasst jeder der Primer von etwa 8 bis etwa 30 Nucleotide.
Die Enzyme, die in dem eefindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, können zum Beispiel DNA-Ligase, für die Ligationsreaktion vorzugsweise T4 Ligase sein. Während der Ligation verknüpft die DNA-Ligase kovalent Wasserstoff gebundene doppelsträngige DNA-Moleküle. Dieses Enzym benötigt ein 5' terminales Phosphat, um als ein Elektronenakzeptor wirken zu können.
Für die PCR-Amplifikationsreaktion sind hitzestabile (thermophile) DNA-Polymerasen insbesondere bevorzugt, weil sie in einer am meisten bevorzugten Ausführungsform stabil sind, in der die PCR in einer einzelnen Lösung durchgeführt wird, in der die Temperatur zyklisch variiert. Repräsentative hitzestabile Polymerasen sind die DNA-Polymerasen, die isoliert wurden aus Bacillus stearothermophilus (Bio-Rad, Richmond, Calif.), Thermus thermophilus (FINZYME, ATCC #27634), Thermus Spezies (ATCC #31674), Thermus aquaticus Stamm TV 1151B (ATCC #25105), Sulfolobus acidocaldarius, beschrieben von Bukhrashuili et al. [Biochem. Biophys. Acta, 1008: 102–7 (1989)] und von Elie et al. [Biochem. Biophys. Acta, 951: 261–7 (1988)], Thermus filiformis (ATCC #43280), die Polymerase, die isoliert ist aus Thermus flavus (Molecular Biology Resources; Milwaukee, Wis.) und "Vent"-Polymerasen (New England Biolabs, Beverly, Me.). Die Taq-DNA-Polymerase ist von einer Vielzahl von Quellen erhältlich, einschließlich Perkin Elmer Cetus (Norwalk, Conn.), Promega (Madison, Wis.) und Stratagene (La Jolla, Calif.), und die AmpliTaq^TM DNA-Polymerase ist eine rekombinante Taq-DNA-Polymerase, die von Perkin-Elmer Cetus zur Verfügung gestellt wird.
Insbesondere bevorzugt ist eine High Fidelity DNA-Polymerase mit Korrekturlesefähigkeit, die in der Lage ist, Fragmente von etwa 40 kd mit einer minimalen Anzahl von Mutationen zu polymerisieren. Solche Polymerasen sind kommerziell erhältlich und schließen zum Beispiel PFU (von Promega) und TaKaRa Ex Taq (TaKaRa) ein. Es kann bevorzugt sein, für die PCR-Reaktion eine Polymerase zu verwenden, die glattendige Produkte erzeugt. Polymerasen, die 3' Überhangprodukte zurücklassen, können auch in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, jedoch wird die Verwendung einer solchen T4 DNA-Polymerase das Exonucleaseverfahten benötigen, um den 3' Überhang zu entfernen und ein glattendiges Produkt zu erzeugen.
Gemäß einer spezifischen Ausführungsform zielt das erfindungsgemäße Verfahren auf die Konstruktion eines Konstruktes, das mindestens zwei Segmente von Interesse umfasst. Solche Segmente können zum Beispiel ein Segment von Interesse, umfassend eine Replikationsursprungs(ori)Sequenz und fakultativ eine Sequenz codierend für einen selektierbaren Marker, ein Segment umfassend eine Sequenz von Interesse und fakultativ einen selektierbaren Marker; mindestens ein zusätzliches Segment umfassend eine Nucleinsäure mit heterologer oder homologer codierender Sequenz oder Mutationen, Fragmenten oder Derivaten davon; und fakultativ mindestens ein zusätzliches Segment, umfassend Nucleinsäuresequenzen, die für Expressions-, Kontroll-, Promotions- und/oder regulatorische Elemente codieren, sein.
So kann gemäß der Erfindung ein DNA-Konstrukt einen bakteriellen Replikationsursprung und bakterielle Antibiotikaresistenzmarker einschließen, welche die Plasmidherstellung in Bakterien im großen Maßstab erlauben. Ein DNA-Konstrukt, das DNA, die für einen selektierbaren Marker codiert, zusammen mit zusätzlichen Kontrollsequenzen, wie einem Promotor, Polyadenylierungsstelle und Spleißübergänge einschließt, kann verwendet werden, um einen selektierbaren Phänotyp zu verleihen.
Demzufolge schließen der Begriff Kontroll- und regulatorische Elemente Promotoren, Terminatoren und andere Expressionskontrollelemente ein. Solche regulatorischen Elemente sind beschrieben in Goeddel; [Goeddel et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]. Zum Beispiel kann irgendeine einer Vielzahl von Expressionskontrollsequenzen, welche die Expression einer DNA-Sequenz kontrollieren, wenn sie operativ mit ihr verknüpft sind, in diesen Vektoren verwendet weiden, um DNA-Sequenzen, die irgendein gewünschtes Protein unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens codieren, zu exprimieren.
Solche regulatorischen Sequenzen können Promotoren, Enhancer, Gerüst-Anheftungsregionen, negativ regulatorische Elemente, transkriptionelle Initiationsstellen, regulatorische Proteinbindungsstellen oder Kombinationen von den Sequenzen umfassen. Darüber hinaus können Sequenzen hinzugefügt werden, welche die Strukturstabilität der RNA oder des hergestellten Proteins beeinflussen. Diese Sequenzen schließen Polyadenylierungssignale, mRNA Stabilitätselemente, Spleißstellen, Leadersequenzen zur Verstärkung oder Modifikation der Transport- oder Sektetionseigenschaften des Proteins oder andere Sequenzen, welche die Funktion oder Stabilität von Protein- oder RNA-Molekülen verändern oder verbessern, ein.
So wie er hier verwendet wird, betrifft der Begriff "homologe oder heterologe codierende Sequenz" oder "Gen" eine Nucleinsäure, umfassend einen offenen Leserahmen, der für irgendein erwünschtes Gen codiert, das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wird, einschließlich sowohl Exon und (fakultativ) Intronsequenzen. Der Begriff "Intron" betrifft eine DNA-Sequenz, die in einem bestimmten Gen anwesend ist, die nicht in Protein übersetzt wird und für gewöhnlich zwischen Exons gefunden wird.
Die heterologe oder homologe codierende Sequenz von Interesse gemäß der Erfindung kann ein Protein codieren, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Reporterproteinen, Enzymen, Hormonen, Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Strukturproteinen und industriell einsetzbaren Proteinen, oder sie kann selbst ein therapeutisches Produkt sein.
Darüber hinaus können heterologe oder homologe codierende Sequenzen, die in ein Konstrukt durch die vorliegende Erfindung eingebaut sind, DNA sein, die ein Translations- oder Transkriptionsprodukt codiert, dessen Expression in Zellen erwünscht ist, oder einen Teil eines Translations- oder Transkriptionsprodukts, wie einem Proteinprodukt oder RNA-Produkt, das nützlich ist in der Behandlung eines bestehenden Zustandes oder das verhindert, dass er auftritt (z.B., hGH oder EPO); oder DNA, die kein Genprodukt codiert, aber selbst nützlich ist als eine transkriptionelle regulatorische Sequenz oder eine DNA, die nützlich ist, um einen bestehenden Zustand zu behandeln oder zu verhindern, dass er auftritt.
Die DNA-Sequenzen, die in ein Konstrukt gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eingeführt werden, können ein gesamtes gewünschtes Produkt codieren, oder sie können, zum Beispiel (einen) aktive(n) oder funktionelle(n) Abschnitte) des Produkts codieren. Das Produkt kann zum Beispiel ein Hormon, ein Cytokin, ein Antigen, ein Antikörper, ein Enzym, ein Gerinnungsfaktor, ein Transportprotein, ein Rezeptor, ein regulatorisches Protein, ein Strukturprotein, ein Transkriptionsfaktor, eine Antisense RNA oder ein Ribozym sein. Zusätzlich kann das Produkt ein Protein oder eine Nucleinsäure sein, das/die nicht in der Natur vorkommt (d.h. ein neues Protein oder eine neue Nucleinsäure). Die DNA kann aus einer Quelle erhalten werden, in der sie in der Natur vorkommt; oder sie kann durch genetische Engineeringtechniken gemäß der Erfindung hergestellt werden. Die DNA kann eines oder mehrere therapeutische Produkte codieren.
Gemäß einer anderen spezifischen Ausführungsform kann die heterologe codierende Sequenz ein Reporterprotein codieren, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem grünen fluoreszenten Protein (GFP), Luciferase, sekretierter alkalischer Phosphatase (SEAP) und ⎕-Galactosidase (⎕-gal).
Es wird verstanden, dass das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kann, um Segmente zu konstruieren, die heterologe oder homologe codierende Sequenzen, Mutationsderivate oder Fragmente davon codieren. Deshalb kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, um Konstrukte mit spezifischen Mutationen, wie im Folgenden beschrieben, zu konstruieren.
Unter "Derivaten" werden die "Fragmente", "Varianten", "Analoga" oder "Derivate" einer codierenden und/oder nicht codierenden Region der Nucleinsäuresequenz verstanden. Ein "Fragment" eines Moleküls, so wie irgendeine der DNA oder cDNA-Sequenzen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, soll irgendeinen Nucleotiduntersatz des Moleküls betreffen. Eine "Variante" eines solchen Moleküls soll ein natürlich auftretendes Molekül betreffen, das im Wesentlichen gleich ist zu entweder dem Gesamtmolekül oder einem Fragment davon. Ein "Analog" eines Moleküls kann ein homologes Molekül aus derselben Spezies oder aus verschiedenen Spezies sein. Die Aminosäuresequenz eines Analogs oder eines Derivats kann von der Originalsequenz verschieden sein, wenn mindestens ein Rest deletiert, eingeführt oder substituiert ist. Insbesondere kann ein Analog oder Derivat der Nucleinsäuresequenz, die durch das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kann, mindestens eine Mutation, Punktmutation, Nonsensmutation, Missensmutation, Deletion, Insertion oder Rearrangement enthalten. Die codierende Region kann auch dadurch verändert werden, indem die Degeneriertheit des genetischen Codes verwendet wird, um die codierende Sequenz zu verändern, so dass, während die Nucleotidsequenz substanziell verändert wird, sie trotzdem ein Protein mit einer Aminosäuresequenz codiert, die im Wesentlichen gleich ist zu den offenbarten Fusionssequenzen.
Es wird verstanden, dass die Gesamtlänge des DNA-Konstruktes gemäß einer Anzahl von Bestandteilen (exogene DNA, Zielsequenzen, selektierbares Markergen) und der jeweiligen Länge variieren wird. Die Gesamtkonstruktlänge wird im Allgemeinen mindestens 20 Nucleotide betragen.
Das hier beschriebene Konstrukt, das eine heterologe oder homologe codierende Sequenz enthält, kann gemäß einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung ein Expxessionsvehikel sein.
"Expressionsvehikel", so wie hier verwendet, schließen Vektoren, wie Plasmide, Viren, einen Bakteriophagen, integrierte DNA-Fragmente und andere Vehikel ein, welche die Integration von DNA-Fragmenten in das Genom des Wirtes ermöglichen. Expressionsvektoren sind typischerweise selbstreplizierende DNA oder RNA-Konstrukte, die das erwünschte Gen oder seine Fragmente und operabel verknüpfte genetische Kontrollelemente enthalten, die in einer geeigneten Wirtszelle erkannt weiden und die Expression der erwünschten Gene bewirken. Diese Kontrollelemente sind in der Lage, die Expression in einem geeigneten Wirt zu bewirken. Im Allgemeinen können genetische Kontrollelemente ein prokaryotes Promotorsystem oder ein eukaryotes Promoterexpressionskontrollsystem einschließen. Wie oben offenbart, schließt ein solches System typischerweise einen transkriptionellen Promotor, einen fakultativen Operator, um den Start der Transkription zu kontrollieren, Transkriptionsenhancer, um die Menge der RNA-Expression zu erhöhen, eine Sequenz, die eine geeignete Ribosomenbindestelle codiert, RNA-Spleißübergänge, Sequenzen, welche die Transkription und Translation terminimieren, und so weiter, ein. Die Expressionsvektoren enthalten für gewöhnlich einen Replikationsursprung, der es dem Vektor erlaubt, unabhängig von der Wirtszelle zu replizieren.
Plasmide sind die am häufigsten verwendete Form von Vektoren, aber andere Formen von Vektoren, die einer äquivalenten Funktion dienen und die im Stand der Technik bekannt sind oder es werden, sind für die Verwendung hier geeignet. Siehe, z.B. Pouwels et al., Cloning Vectors: a Laboratory Manual (1985 und Ergänzungen), Elsevier, N. Y.; und Rodriquez, et al. (Hrsg.) Vectors: a Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses, Buttersworth, Boston, Mass (1988), die hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Im Allgemeinen enthalten solche Vektoren zusätzlich spezifische Gene, die in der Lage sind eine phänotypische Selektion in transformierten Wirtszellen bereitzustellen. Die Verwendung von parkaryoten und eurkaryoten viralen Expressionsvektoren ist ebenfalls vorgesehen.
Der Vektor wird in eine Wirtszelle durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, eingeführt. Die Einführung des Vektors in die Wirtszelle kann durch irgendein Verfahren erreicht werden, welches das Konstrukt in die Zelle einführt, einschließlich zum Beispiel Calciumphosphatpräzipitation, Mikroinjektion, Elektroporation oder Transformation. Siehe z.B. Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., Hrsg. John Wiley & Sons, N. Y. (1989).
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin für die orientierungsgerichtete Konstruktion eines mutierten DNA-Konstruktes mit mindestens einer spezifischen Mutation verwendet weiden. Die spezifische Mutation kann in das Konstrukt während einer der PCR-Amplifikationsreaktionen, welche die anfänglichen glattendigen Segmente von Interesse erzeugen, eingeführt werden. Für Punktmutationen kann die gewünschte Mutation durch die Primer, die für die PCR-Reaktion verwendet weiden, um das Segment von Interesse zu erzeugen, eingeführt werden. Die Erzeugung einer Deletionsmutation kann erreicht werden unter Verwendung von Primern, die von Regionen abgeleitet sind, die nicht die Region einschließen, die deletiert werden soll.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren manuell durchgeführt werden.
In einer spezifisch bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren automatisch durchgeführt werden.
Eine Vielzahl von Verfahren im Stand der Technik der Molekularbiologie sind hier nicht detailliert beschrieben, weil sie dem Fachmann gut bekannt sind. Solche Verfahren schließen ortsgerichtete Mutagenese, Expression von cDNAs, Analyse von rekombinanten Proteinen und Peptiden, Transformation von bakteriellen Zellen, Transfektion von Säugetierzellen und ähnliches ein. Lehrbücher, die solche Verfahren beschreiben, sind z.B., Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; ISBN: 0879693096, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, von F. M. Ausubel, ISBN: 047150338X, John Wiley & Sons, Inc. 1988 und Short Protocols in Molecular Biology, von F. M. Ausubel et al. (Hrsg.) 3. Aufl. John Wiley & Sons; ISBN: 0471137812, 1995. Diese Publikationen sind hier in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen. Darüber hinaus sind eine Anzahl von immunologischen Techniken nicht in jedem Fall hier im Detail beschrieben, weil sie dem Fachmann gut bekannt sind. Siehe z.B., Current Protocols in Immunology, Coligan et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons. Inc., New York, NY.
Offenbart und beschrieben, wird verstanden, dass diese Erfindung nicht auf die besonderen Beispiele, Verfahrensschritte und hier offenbarten Materialien beschränkt ist, so dass Verfahrensschritte und Materialien geringfügig variieren können. Es wird ebenfalls verstanden, dass die hier verwendete Terminologie nur zum Zweck der Beschreibung von besonderen Ausführungsformen verwendet wird und keine Beschränkung beabsichtigt, weil der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung nur durch die angehängten Patentansprüche und Äquivalente davon begrenzt wird.
In dieser Beschreibung und den folgenden Ansprüchen, außer der Zusammenhang benötigt es anders, werden das Wort "umfassen" und Variationen wie "umfasst" und "umfassend" derart verstanden, dass sie den Einschluss einer angegebenen ganzen Zahl oder Schritt oder Gruppe von ganzen Zahlen oder Schritten, aber nicht den Ausschluss von irgendeiner ganzen Zahl oder Schritt oder Gruppe von ganzen Zahlen oder Schritten implizieren.
Es muss angemerkt werden, dass die Einzahlformen, so wie sie in dieser Beschreibung und den angehängten Ansprüchen verwendet werden, "ein", "eine/r/s" und "der/die/das" Pluralformen einschließen, außer der Zusammenhang gibt es klar anders vor.
Die folgenden Beispiele sind repräsentativ für Techniken, die durch die Erfinder beim Durchführen von Aspekten der vorliegenden Erfindung eingesetzt wurden. Es soll verstanden werden, dass während diese Techniken exemplarisch oder bevorzugte Ausführungsformen für die Durchführung der Erfindung sind, der Fachmann im Licht der vorliegenden Offenbarung erkennen wird, dass zahlreiche Modifikationen gemacht werden können, ohne den Geist und beabsichtigten Umfang der Erfindung zu verlassen.
Beispiele
Experimentelle Verfahren
Medien
Luria-Bertani (LB) Medium enthielt Trypton, Hefeextrakt und NaCl zu jeweils 10 g, 5 g und 10 g pro Liter. Die LB Platten waren mit 20 mg pro Liter Ampicillin für ⎕-Lactamase Resistenz ergänzt.
Bakterielle Stämme
E. coli Stamm JM109 (Promega)
Enzyme
T4 DNA-Ligase (TaKaRa), T4 Polynucleotid Kinase (TaKaRa), Pfu DNA-Polymerase (Promega), Restriktionsenzyme – PvuII und EcoRI (BioLab).
Primer
Herstellung von phosphorilierten Primern
20 μg Primer wurden mit 50 Einheiten T4 Polynukleotid Kinase in Gegenwart von 1 mM ATP für 30 Minuten bei 37°C phosphoriliert. Die Phosphorilierungsreaktion wurde durch Inaktivierung der Kinase durch Inkubation der Reaktion für 20 Minuten bei 65°C gestoppt. Die Primer wurden mit Tris gepuffertem Phänol extrahiert und mit 0,1 Volumen 3 M KAc (pH 5,4) und 2,5 Volumen eiskaltem Ethanol präzipitiert. Die phosphorilierten Primer wurden zu 0,2 ng/μl in TE (10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA) resuspendiert.
PCR-Reaktion
Die PCR-Reaktion wurde durchgeführt unter Verwendung 1 μM jedes Primers pro 20 μl, 200 μM dNTP, 10 ng Matrizen DNA und 1,5 Einheiten Pfu DNA-Polymerase in 1 × Pfu Polymerasepuffer. Die PCR-Zyklusbedingungen waren 30 Sekunden bei 92°C 1 Minute bei 50°C, 3,5 Minuten bei 72°C für 25 Zyklen, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C.
Isolierung des PCR-Produkts – Elektroelution
Nach der PCR-Amplifikation wurden die PCR-Produkte in Agarosegel getrennt, und das spezifische Segment von Interesse wurde unter Verwendung von Standardelektroelutionsverfahren extrahiert.
Ligation
Die Ligationsreaktion wurde durchgeführt in 20 μl 1 × T4 DNA-Ligasepuffer, enthaltend 10 ng jedes PCR-Produkts, 500 nM ATP und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase. Die Reaktion wurde für 30 Minuten bei 22°C inkubiert, gefolgt von Erhitzen für 10 Minuten bei 65°C.
Transformation und Plasmidminipräparation
E. coli Stamm JM109 (100 μl) (Promega) wurde mit 10 μl der Selbstligationsreaktion transformiert und auf LB + Amp ausplattiert. Die Platten wurden bei 37°C über Nacht inkubiert. Ampicillin resistente Kolonien wurden in 5 ml LB + Ampicillin überführt und über Nacht inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Plasmide durch Standardminipräparationsprotokolle isoliert. Nach der Plasmidminipräparation wurde die DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym analysiert. Nach den Analysen wurde das Plasmid durch Standard Plasmid DNA Protokolle im großen Maßstab gereinigt.
Die Plasmid DNA, die im großen Maßstab plasmidgereinigt wurde und Minipräp Plasmid DNA wurden durch das Verfahren der alkalischen Lyse gereinigt [Birnboim, H. C., et al., Nucleic Acids Research, 7: 1512–1522 (1979), Birnboim, H. C., Methods Enzymol. 100: 243–255 (1983)].
Beispiel 1
Erzeugung von Konstrukten mit vier verschiedenen möglichen Orientierungen unter Verwendung des OER-Verfahrens
Um das erste Segment zu erzeugen wurde eine PCR-Reaktion unter Verwendung einer humanen T-Zell cDNA Bibliothek als eine Matrize, phosphorilierten Primern 335 (SEQ ID NO: 7) und 336 (SEQ ID NO: 8) und der High Fidelity thermisch stabilen Polymerase Pfu DNA-Polymerase durchgeführt, die ein glattendiges Produkt erzeugte. Beide Primer wurden wie in den Verfahren oben beschrieben phosphoriliert.
Das zweite Segment wurde erzeugt durch Durchführen einer PCR-Reaktion unter Verwendung einer humanen T-Zell cDNA Bibliothek als eine Matrize, phosphorilierten Primern 826 (SEQ ID NO: 9) und 827 (SEQ ID NO: 10). Nach den PCR-Amplifikationen von beiden Segmenten wurden die PCR-Produkte in einem 1,5% Agarosegel getrennt, und die erwünschten Produkte (PCR-Produkt 1 der ersten PCR-Reaktion, PCR-Produkt 2 der zweiten PCR-Reaktion) wurden unter Verwendung von Standardelektroelutionsverfahren (2A) extrahiert.
Es wurde ein kombiniertes Produkt, das beide Segmente umfasste, durch Durchführen einer Ligationsreaktion mit den isolierten PCR-Produkten, wie oben beschrieben, erzeugt. Das Ligationsreaktionsprodukt wurde getrennt durch vier PCR-Reaktionen unter Verwendung der phosphorilierten flankierenden Primer 335 und 826 (jeweils SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 9), den Primern 335 und 827 (jeweils SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 10), den Primern 336 und 826 (jeweils SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9) und den Primern 336 und 827 (jeweils SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 10), um ein drittes DNA-Fragment (2B) zu erzeugen, amplifiziert. Nach der PCR-Amplifikation wurden die PCR-Produkte in einem Agarosegel getrennt, und das spezifische Segment wurde durch Elektroelution extrahiert. Das kombinierte Produkt mit der gewünschten Orientierung wurde als nächstes unter Verwendung von PvuII Restriktionsenzym analysiert. Wie in 2C gezeigt ist, wiesen die resultierenden Produkte alle vier möglichen Orientierungen auf.
Beispiel 2
Verwendung des OER-Verfahrens in der Herstellung der Plasmide pcDNAPKRwt und des mutierten Plasmids pcDNAPKR 6
Als ein Beispiel zur Erzeugung von Konstrukten unter Verwendung des erfindungsgemäßen OER-Verfahrens wurden das pcDNAPKRwt als auch sein korrespondierendes mutiertes Konstrukt konstruiert.
Um das erste Segment zu erzeugen wurde eine PCR-Reaktion unter Verwendung von Plasmid pBlueScript (pBS) (Stratagene) als einer Matrize, phosphorilierten Primern 2037 (SEQ ID NO: 1) und 2038 (SEQ ID NO: 2) und der High Fidelity thermisch stabilen Polymerase Pfu DNA-Polymerase durchgeführt, die ein glattendiges Produkt erzeugte. Beide Primer waren phosphoriliert, wie in den Verfahren oben beschrieben. Diese erste DNA-Produkt umfasst das ⎕-Lactamase Resistenzgenz (Amp^r) und der Replikationsursprung(ori) aus Plasmid pBS wurde durch PCR amplifiziert.
Das zweite Segment wurde durch Anlagern einer humanen T-Zell cDNA Bibliothek mit phosphorilierten Primern 546 (SEQ ID NO: 3) und 547 (SEQ ID NO: 4) in einer cDNA Konzentration von 100 ng/μl und Durchführung einer PCR-Reaktion erzeugt.
Nach den PCR-Amplifikationen der beiden Segmente wurden die PCR-Produkte in einem 1% Agarosegel aufgetrennt, und die erwünschten Produkte (PCR-Produkt 1 (Amp-Ori) aus der ersten PCR-Reaktion, das PCR-Produkt 2 (PKRwt) aus der zweiten PCR-Reaktion) wurden unter Verwendung von Standardelektroelutionsverfahren (3A) extrahiert.
Ein kombiniertes Produkt, das beide Segmente umfasste, wurde erzeugt durch Durchführen einer Ligationsreaktion mit den isolierten PCR-Produkten, wie oben beschrieben. Das Ligationsreaktionsprodukt wurde durch PCR unter Verwendung der phosphorilierten flankierenden Primer 2037 und 547 (jeweils SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 4) amplifiziert, was ein drittes DNA-Segment (3B) erzeugte. Nach der PCR-Amplifikation wurden die PCR- Produkte in einem Agarosegel aufgetrennt, und das spezifische Segment (PCR-Produkt: Amp-Ori-PKRwt) wurde durch Elektroelution extrahiert. Das kombinierte Produkt mit der erwünschten Orientierung wurde als nächstes selbst ligiert, um ein doppelsträngiges DNA-Konstrukt zu erzeugen. Die Transformation in einen E. coli Stamm (Promega) wurde unter Verwendung des resultierenden Plasmids durchgeführt, gefolgt von Minipräparation der DNA. Positive Klone wurden gepickt und weiter unter Verwendung des EcoRI Restriktionsenzyms analysiert. Wie in 3C gezeigt ist, enthielten die meisten Kolonien das Plasmid pcDNAPKRwt mit der erwünschten Orientierung.
Herstellung eines Plasmids mit mutierter cDNA von PKR (PKR⎕ 6):
Als ein Beispiel für Insertion von Mutation und Erzeugung eines mutierten Konstruktes unter Verwendung des erfindungsgemäßen OER-Verfahrens wurde als nächstes das PKR⎕ 6 Plasmid konstruiert.
Das DNA-Plasmid pcDNAPKRwt (das oben beschrieben wurde) wurde als eine Matrize für die PCR-Amplifikation verwendet. Ein glattendiges Produkt mit der erwünschten Mutation (Deletionsmutation in diesem Fall) wurde unter Verwendung der phosphorilierten flankierenden Oligonucleotidprimer 548 und 549 (jeweils als SEQ ID NO: 5 und 6 bezeichnet) erzeugt. Nach der PCR-Amplifikation wurden die PCR-Produkte in einem Agarosegel aufgetrennt, und das spezifische Segment (PKR-Amp-Ori-PKR) wurde unter Verwendung von Standardelektroelutionsverfahren (4A) extrahiert.
Das kombinierte Produkt mit der erwünschten Orientierung wurde als nächstes selbst ligiert, um ein doppelsträngiges DNA-Konstrukt zu erzeugen. Eine Transformation in einen E. coli Stamm (Promega) wurde unter Verwendung des resultierenden Plasmids durchgeführt, gefolgt von Minipräparation der DNA. Positive Klone wurden gepickt und weiter unter Verwendung des EcoRI Restriktionsenzyms analysiert. Wie in 4B gezeigt ist, enthielten die meisten der Kolonien das Plasmid pcDNAPKR⎕ 6 mit der erwünschten Orientierung.
Beispiel 3
Verwendung von zwei verschiedenen Sätzen von Primern, um die erwünschte Orientierung von zwei verschiedenen Konstrukten von dergleichen Matrize durch das OER-Verfahren zu führen
Um die leistungsfähige Verwendung des OER-Verfahrens in der Konstruktion von zwei verschiedenen Plasmiden mit erwünschter Orientierung aus der gleichen Matrize exemplarisch darzustellen, wurden beide Plasmide pGFP-LacP-LacZ und pLacZ-LacP-GFP konstruiert, die das ⎕-Galactosidase Gen (LacZ), den IPTG induzierbaren Promotor (LacP) und das grün fluoreszente Protein (GFP) enthielten.
Die Insertion des LacP Promotors unter Verwendung der Orientierung 1 (5A) führt zu der Expression des ⎕-Galactosidase Gens (LacZ), was zu blauer Farbe der transformierten Kolonien (5D) führt. Die Insertion des LacP Promotors unter Verwendung der Orientierung II (5A) führt zu GFP (grün fluoreszenztes Protein) Genexpression, die zu transformierten Kolonien führt, die ein grün fluoreszierendes Signal unter UV Licht zeigen.
Das LacP (IPTG induzierter Promotor) Segment wurde erzeugt durch Durchführen einer PCR-Reaktion unter Verwendung des Plasmids pBlueScript (pBS) (Stratagene) als eine Matrize, phosphorilierten Primern 110 (SEQ ID NO: 12) und 732 (SEQ ID NO: 11) ebenso wie der High Fidelity thermisch stabilen Polymerase Pfu DNA-Polymerase, die ein glattendiges Produkt bildet. Beide Primer sind phosphoriliert, wie in den Verfahren oben beschrieben.
Das zweite Segment wurde erzeugt durch eine zweite PCR-Reaktion unter Verwendung von Plasmid pLacZ-GFP (pLG) (Gene Bio-Application) als eine Matrize, phosphorilierten Primern 622 (SEQ ID NO: 14) und 592 (SEQ ID NO: 13) und der High Fidelity thermisch stabilen Polymerase Pfu DNA-Polymerase. Dieses DNA-Fragment umfasst das LacZ, das ⎕-Lactamase Resistenzgen (Amp^r) den Replikationsursprung(ori) und GFPuv Gene (5A).
Nach den PCR-Amplifikationen der beiden Segmente wurden die PCR-Produkte in 1% Agarosegel aufgetrennt, und die erwünschten Produkte (PCR-Produkt 1 (LacP) aus der ersten PCR-Reaktion und das PCR-Produkt 2 (LacZ-Amp^r-Ori-GFP) aus der zweiten PCR-Reaktion wurden unter Verwendung von Standardelektroelutionsverfahren extrahiert.
Ein kombiniertes Produkt, das beide Segmente umfasst, wurde erzeugt durch Durchführen einer Ligationsreaktion mit den isolierten PCR-Produkten, wie oben beschrieben. Das Ligationsreaktionsprodukt wurde amplifiziert durch zwei separate PCR-Reaktionen unter Verwendung der phosphorilierten flankierenden Primer 592 und 110 (jeweils SEQ ID NO: 13 und SEQ ID NO: 12), was ein drittes DNA-Segment (LacP bis LacZ) bildete, wie in 5B gezeigt, oder 592 und 732 (jeweils SEQ ID NO: 13 und SEQ ID NO: 11), was ein drittes DNA-Segment (LacP bis GFPuv) bildete, wie in 5C gezeigt. Nach der PCR-Amplifikation wurden die PCR-Produkte in einem Agarosegel aufgetrennt, und die spezifischen Segmente (PCR Produkt 1: GFP-Amp-Ori-LacP-LacZ, PCR-Produkt 2: LacZ-Amp-Ori-LacP-GFP) wurden durch Elektroelution extrahiert. Die kombinierten Produkte mit der erwünschten Orientierung wurden als nächstes selbst ligiert, um ein doppelsträngiges DNA-Konstrukt zu erzeugen. Eine Transformation eines E. coli Stamms (Promega) mit den zwei verschiedenen Konstrukten wurde als nächstes durchgeführt. Wie in 5D gezeigt, zeigten die meisten der mit pGFP-LacP-LacZ Plasmid transformierten Kolonien eine blaue Farbe, und die meisten der mit pLacZ-LacP-GFP Plasmid transformierten Kolonien zeigten eine grüne Farbe unter UV Licht. So zeigte das erfindungsgemäße OER-Verfahren eine Vielseitigkeit und hohe Effizienz in der Erzeugung von Konstrukten mit einer erwünschten Orientierung aus identischer Matrize.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur orientierungsgerichteten Konstruktion eines Konstruktes, umfassend mindestens zwei Nucleinsäuresegmente von Interesse, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a. Bereitstellen von Produkten mit phosphorilierten glatten Enden, abgeleitet aus den Nucleinsäuresegmenten von Interesse; b. Durchführen von separaten Ligationsreaktionen, wobei in jeder Reaktion die phosphorilierten glattendigen Produkte von zwei verschiedenen Segmenten, die in Schritt (a) erhalten wurden, ligiert werden, um eine kombinierte ligierte Sequenz zu erzeugen; c. Durchführen einer PCR-Amplifikationsreaktion unter Verwendung der kombinierten ligierten Sequenz, die in Schritt (b) erhalten wurde, als Matrize und spezifischer Anreicherungsprimer, die die PCR-Amplifikation in Richtung der erwünschten Orientierung führen, wobei jede kombinierte ligierte Sequenz in einer separaten Reaktion amplifiziert wird, wodurch ein kombiniertes Produkt mit phosphorilierten glatten Enden erzeugt wird; d. Isolieren und Reinigen des kombinierten Produktes mit angereicherter erwünschter Orientierung, das in Schritt (c) erhalten wurde; e. fakultativ zyklische Wiederholung der Schritte (b) bis (d) für eine erwünschte Anzahl von Wiederholungen, um die isolierten kombinierten Produkte mit erwünschter Orientierung zu erzeugen; und f. Durchführen einer Selbstligation des isolierten gereinigten kombinierten Produkts, das in Schritt (e) erhalten wurde, Erzeugen eines zirkulären doppelsträngigen DNA-Konstruktes, das die erwünschten Segmente passend angeordnet und operabel verbunden enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei ein erstes Segment von Interesse ein replizierbares Segment umfasst und das erste Segment von Interesse und/oder ein beliebiges anderes Segment von Interesse eine Sequenz umfasst, die für einen selektierbaren Marker codiert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die phosphorilierten glattendigen Produkte aus Schritt (a) erhalten werden durch ein Beliebiges aus Folgendem: (i) Durchführung eines ersten Satzes an PCR-Amplifikation unter Verwendung der Segmente als Matrize, um Produkte zu erzeugen, die phosphorilierte glatte Enden aufweisen, wobei jedes Segment in einer separaten Reaktion amplifiziert wird, unter Verwendung spezifischer Primer; (ii) Erzeugen von glattendigen Produkten durch Spaltung der Nucleinsäuresegmente uter Verwendung einer Endonuclease mit glatter Spaltstelle; (iii) Erzeugen von kohäsiven Endprodukten durch Spaltung der Nucleinsäuresegmente unter Einsatz einer Endonuclease mit überstehender Spaltstelle, gefolgt von einer Auffüllreaktion; und (iv) Erzeugen von kohäsiven Endprodukten durch Spaltung der Nucleinsäuresegmente unter Einsatz einer Endonuclease mit überstehender Spaltstelle, gefolgt von Einzelstrang-DNA-Endonucleasereaktion und Abbau von einzelsträngigen Überhängen von den DNA-Enden.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die phosphorilierten glattendigen Produkte durch Phosphorilierung eines beliebigen der glattendigen PCR-Produkte in (i) oder der PCR-Primer unter Einsatz von T4 Kinase erhalten werden.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Konstrukt mehr als zwei Nucleinsäuresegmente umfasst, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) cyclische Wiederholung der Schritte (a) bis (d) wie in Anspruch 1 definiert, um die isolierten kombinierten Produkte mit der erwünschten Orientierung zu erzeugen; (b) Durchführungen separater Ligationsreaktionen, wobei in jeder Ligationsreaktion die PCR-Produkte von zwei kombinierten Produkten, die in Schritt (a) erhalten wurden, ligiert werden, um eine kombinierte ligierte Sequenz zu erzeugen; (c) Durchführung einer PCR-Reaktion unter Verwendung der kombinierten ligierten Sequenz, die in Schritt (b) erhalten wurde, als Matrize und spezifischer Anreicherungsprimer, die die PCR-Amplifizierung zu der erwünschten Orientierung führen, wobei jede kombinierte ligierte Sequenz in einer separaten Reaktion amplifiziert wird, unter Erzeugung eines kombinierten Produktes; (d) Isolieren und Reinigen der kombinierten Produkte mit der erwünschten Orientierung, die in Schritt (c) erhalten wurden; (e) cyclische Wiederholung der Schritte (b) bis (d) für eine erwünschte Anzahl von Wiederholungen, um ein kombiniertes Produkt zu erzeugen, das alle Nucleinsäuresegmente in der erwünschten Orientierung angeordnet enthält, um ein endgültiges kombiniertes Produkt zu erhalten; und (f) Durchführen einer Selbstligation der isolierten endgültigen kombinierten Produkte, die in Schritt (e) erhalten wurden, Erzeugen eines zirkulären doppelsträngigen DNA-Konstruktes, das die erwünschten Sequenzen passend angeordnet und operabel verbunden enthält.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei das replizierbare Segment eine Replikationsursprungs (ori) Sequenz umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das replizierbare Segment aus einem replizierbaren Vektor abgeleitet ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus retroviralen Vektoren, Phagenvektoren, Plasmidvektoren, Expressionsvektoren, selbstreplizierenden Vektoren, Phagemidvektoren und YAC-Vektoren besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die spezifischen Primer, die in dem ersten Satz von PCR-Amplifikationsreaktion (Schritte (a) bis (d)) eingesetzt werden, sind: ein 5' Primer, umfassend eine Sequenz, die von dem 5' Ende eines interessierenden Segmentes abgeleitet ist (Sense Primer) und ein 3' Primer, der komplementär ist zu der Sequenz des 3' Endes des zu amplifizierenden spezifischen Segmentes (Antisense Primer).
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die spezifischen Anreicherungsprimer, die in der Amplifikation der kombinierten ligierten Sequenzen eingesetzt werden, sind: (i) ein 5' Primer, umfassend eine Sequenz, abgeleitet von dem 5' Ende des ersten Segments, die stromaufwärts des zweiten ligierten Segments in dem kombinierten ligierten Produkt liegt (Sense Primer); und (ii) ein 3' Primer, der komplementär ist zu der 3' End-Sequenz des zweiten ligierten Segmentes (Antisense Primer), der kombinierten ligierten Sequenz.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 8 und 9, wobei jeder der Primer etwa 4 bis etwa 200 Nucleotide in Bezug auf die Länge umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei jeder der Primer etwa 8 bis etwa 30 Nucleotide in Bezug auf die Länge umfasst.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Ligationsreaktion unter Einsatz von DNA-Ligase durchgeführt wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die PCR-Amplifikation unter Einsatz einer High Fidelity DNA Polymerase durchgeführt wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Konstrukt umfasst: a. eines der interessierenden Segmente, die eine Replikationsursprungs(ori)Sequenz und eine Sequenz umfassen, die für einen selektierbaren Marker codiert; b. mindestens ein zusätzliches Segment, umfassend eine heterologe oder homologe codierende Nucleinsäuresequenz von Interesse, oder Mutationen, Fragmente und Derivate davon; und c. fakultativ mindestens ein zusätzliches Segment, umfassend Nucleinsäuresequenzen, die für Expressions-, Kontroll-, Promotions- und/oder regulatorische Elemente codieren.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die heterologe oder homologe codierende Sequenz von Interesse ein Protein codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Reporterproteinen, Enzymen, Hormonen, Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Strukturproteinen und industriell einsetzbaren Proteinen besteht, oder selbst ein therapeutisches Produkt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die heterologe codierende Sequenz ein Reporterprotein codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem grünen fluoreszenten Protein (GFP), Luciferase, sekretierter alkalischer Phosphatase (SEAP) und β-Galactosidase (β-gal) besteht.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei das Konstrukt ein Expressionsvehikel ist.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das Verfahren manuell durchgeführt wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Methode automatisch durchgeführt wird.