DE212015000061U1 - CRISPR-ermöglichtes Multiplex Genom Engineering - Google Patents

CRISPR-ermöglichtes Multiplex Genom Engineering Download PDF

Info

Publication number
DE212015000061U1
DE212015000061U1 DE212015000061.3U DE212015000061U DE212015000061U1 DE 212015000061 U1 DE212015000061 U1 DE 212015000061U1 DE 212015000061 U DE212015000061 U DE 212015000061U DE 212015000061 U1 DE212015000061 U1 DE 212015000061U1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
vector
cells
mutation
target region
population
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
DE212015000061.3U
Other languages
English (en)
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Colorado
Original Assignee
University of Colorado
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=53800598&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE212015000061(U1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by University of Colorado filed Critical University of Colorado
Publication of DE212015000061U1 publication Critical patent/DE212015000061U1/de
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1024—In vivo mutagenesis using high mutation rate "mutator" host strains by inserting genetic material, e.g. encoding an error prone polymerase, disrupting a gene for mismatch repair
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1082—Preparation or screening gene libraries by chromosomal integration of polynucleotide sequences, HR-, site-specific-recombination, transposons, viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/11—Applications; Uses in screening processes for the determination of target sites, i.e. of active nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/12—Applications; Uses in screening processes in functional genomics, i.e. for the determination of gene function
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised
    • C12N2330/31—Libraries, arrays

Abstract

Verwendung eines Vektors, umfassend: (i) mindestens eine Editier-Kassette, umfassend (a) eine Region, die homolog zu einer Target-Region einer Nukleinsäure in einer Zelle ist, (b) eine Mutation mindestens eines Nukleotids relativ zu der Target-Region, und (c) eine erste „Protospacer Adjacent Motif” (PAM) Mutation; (ii) einen Promotor; und (iii) eine Nukleinsäure, die für mindestens eine Guide-RNA (gRNA) codiert, umfassend (a) eine Region, die komplementär zu einem Teil der Target-Region ist; und (b) eine Region, die mit einer Cas9 Nuklease interagiert, zur Herstellung eines Medikaments zum Genom Engineering.

Description

  • VERWANDTE ANMELDUNG
  • Diese Anmeldung nimmt nach 35 U.S.C. §119 der Vereinigten Staaten die Priorität der vorläufigen Anmeldung 61/938,608 in Anspruch, die am 11. Februar 2014 eingereicht wurde und deren gesamte Lehre hierin durch Referenz aufgenommen ist.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die rationale Manipulation von großen DNA-Konstrukten ist eine zentrale Herausforderung für die aktuelle synthetische Biologie und Bemühungen des Genom Engineerings. In den letzten Jahren ist eine Vielzahl von Technologien entwickelt worden, um diese Herausforderung zu bewältigen und die Spezifität und Geschwindigkeit zu erhöhen, mit der Mutationen erzeugt werden können. Darüber hinaus sind adaptive Mutationen eine zentrale Triebkraft der Evolution, aber über ihre Häufigkeit und ihren relativen Beitrag zu zellulären Phänotypen ist selbst in den am besten untersuchten Organismen nur wenig bekannt. Dies ist zum Großteil auf die technischen Herausforderungen zurückzuführen, die mit der Beobachtung und Rekonstruktion dieser Genotypen und der Korrelation ihrer Anwesenheit mit dem Phänotyp von Interesse assoziiert sind. Beispielsweise führen Genom Editier-Verfahren, die auf zufällige Mutagenese angewiesen sind, zu komplexen Genotypen, die aus vielen Mutationen bestehen, deren relativer Beitrag schwer aufzuschlüsseln ist. Darüber hinaus ist es aufgrund des Fehlens von Informationen bezüglich der individuellen Mutationen schwierig, die epistatischen Interaktionen zwischen den Allelen zuzuordnen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • ”Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats” (CRISPR) kommen in vielen bakteriellen Genomen vor und man hat herausgefunden, dass sie eine wichtige Rolle in der adaptiven bakteriellen Immunität spielen. Transkription dieser Arrays führt zu CRISPR-RNAs, die für die Gen-Repression oder DNA-Spaltung die sequenz-spezifische Bindung der CRISPR/cas-Komplexe zu DNA-Targets in Zellen dirigieren. Die Spezifität dieser Komplexe ermöglicht neuartige in vivo Anwendungen für Stamm-Engineering.
  • Hierin werden Verfahren zur rationalen multiplex Manipulation von Chromosomen innerhalb der offenen Leserahmen (z. B. zur Erzeugung von Protein-Bibliotheken) oder innerhalb mehrerer Gene in einem beliebigen Segment eines Chromosoms beschrieben, in denen verschiedene CRISPR-Systeme verwendet werden. Diese Verfahren stellen ein effizienteres kombinatorisches Genom Engineering als die bisher beschriebenen zur Verfügung.
  • Die Erweiterung der Multiplexing-Fähigkeiten von CRISPR stellt eine aktuelle technologische Herausforderung dar und würde die Verwendung dieser Systeme zum Erzeugen rationaler Bibliotheken im Hochdurchsatzformat ermöglichen. Solche Fortschritte weisen weitreichende Auswirkungen auf die Felder des metabolischen und Protein-Engineerings auf, die die Überarbeitung komplexer genetischer Netzwerke für eine optimale Produktion anstreben.
  • Die Verfahren umfassen Einführen von Bestandteilen des CRISPR-Systems, umfassend die CRISPR-assoziierte Nuklease Cas9 und eine sequenz-spezifische Guide-RNA (gRNA), in Zellen, was zu sequenz-gerichteten Doppelstrangbrüchen unter Verwendung der Fähigkeit des CRISPR-Systems solche Brüche zu induzieren, führt. Die Bestandteile des CRISPR-Systems, umfassend die CRISPR-assoziierte Nuklease Cas9 und eine sequenz-spezifische Guide-RNA (gRNA), können codiert auf einem oder mehreren Vektoren, wie beispielsweise einem Plasmid, in die Zellen eingeführt werden. DNA-Rekombineering-Kassetten oder Editier-Oligonukleotide können rational entworfen werden, so dass sie eine gewünschte Mutation innerhalb des Target-Locus und eine Mutation an einem gemeinsamen Ort außerhalb des Target-Locus enthalten, die von dem CRISPR-System erkannt werden können. Die beschriebenen Verfahren können für viele Anwendungen verwendet werden, umfassend Ändern eines Wegs von Interesse.
  • In einer Ausführungsform ist das Verfahren ein Verfahren zum Genom Engineering, umfassend: (a) Einführen eines Vektors in Zellen, wobei der Vektor codiert: (i) eine Editier-Kassette, die eine Region beinhaltet, die homolog zu der Target-Region der Nukleinsäure in der Zelle ist und eine Mutation (bezeichnet als eine gewünschte Mutation) mindestens eines Nukleotids relativ zu der Target-Region, wie beispielsweise eine Mutation mindestens eines Nukleotids in mindestens einem Codon relativ zu der Target-Region, und eine „Protospacer Adjacent Motif” (PAM) Mutation beinhaltet; (ii) einen Promoter; und (iii) mindestens eine Guide-RNA (gRNA), wobei die gRNA umfasst: (a) eine Region (RNA), die komplementär zu einem Teil der Target-Region ist; und (b) eine Region (RNA), die eine Cas9 Nuklease rekrutiert, wodurch Zellen hergestellt werden, die den Vektor umfassen; (b) Aufrechterhalten der Zellen, die den Vektor umfassen, unter Bedingungen, unter denen Cas9 exprimiert wird, wobei die Cas9 Nuklease auf dem Vektor codiert wird, auf einem zweiten Vektor codiert wird oder in dem Genom der Zellen codiert wird, was zur Herstellung von Zellen führt, die den Vektor umfassen und die PAM-Mutation nicht umfassen und Zellen die den Vektor und die PAM-Mutation umfassen; (c) Kultivieren des Produkts von (b) unter Bedingungen, die für die Lebensfähigkeit der Zelle geeignet sind, wodurch lebensfähige Zellen hergestellt werden; (d) Erhalten von lebensfähigen Zellen, die in (c) hergestellt wurden; und (e) Sequenzieren des Editier-Oligonukleotids des Vektors von mindestens einer lebensfähigen Zelle, die in (d) erhalten wurde und Identifizieren der Mutation mindestens eines Codons.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Verfahren ein Verfahren zum Genom Engineering durch mit verfolgbarem CRISPR angereichertes Recombineering (engl. trackable CRISPR enriched recombineering), umfassend: (a) Einführen eines Vektors in eine erste Population von Zellen, wobei der Vektor codiert: (i) mindestens eine Editier-Kassette, die umfasst: (a) eine Region, die homolog zu einer Target-Region einer Nukleinsäure ist und eine Mutation mindestens eines Nukleotids relativ zu der Target-Region, wie beispielsweise eine Mutation mindestens eines Nukleotids in mindestens einem Codon relativ zu der Target-Region, und (b) eine „Protospacer Adjacent Motif” (PAM) Mutation umfasst; (ii) mindestens einen Promoter; und (iii) mindestens eine Guide-RNA (gRNA), umfassend: (a) eine Region (RNA), die komplementär zu einem Teil der Target-Region ist; und (b) eine Region (RNA), die eine Cas9 Nuklease rekrutiert, wodurch eine zweite Population von Zellen hergestellt wird, die den Vektor umfasst; (b) Aufrechterhalten der zweiten Population von Zellen unter Bedingungen, unter denen die Cas9 Nuklease exprimiert wird, wobei die Cas9 Nuklease auf dem Vektor codiert wird, auf einem zweiten Vektor oder in dem Genom der Zellen codiert wird, was zur DNA-Spaltung in den Zellen, die die PAM-Mutation nicht umfassen, und zum Tod solcher Zellen führt; (c) Erhalten von lebensfähigen Zellen, die in (b) hergestellt wurden; und (d) Identifizieren der Mutation mindestens eines Codons durch Sequenzieren des Editier-Oligonukleotids des Vektors von mindestens einer Zelle der zweiten Population von Zellen.
  • Jede der obigen Ausführungsformen kann weiter Synthetisieren und/oder Erhalten einer Population von Editier-Oligonukleotiden umfassen. Jede Ausführungsform kann weiter Amplifizieren der Population von Editier-Oligonukleotiden umfassen. In jeder der Ausführungsformen kann der Vektor weiter einen Spacer, mindestens zwei Priming-Stellen oder sowohl einen Spacer als auch mindestens zwei Priming-Stellen umfassen. In einigen Ausführungsformen umfasst die Editier-Kassette eine Target-Region, die eine Mutation mindestens eines Codons innerhalb von 100 Nukleotiden von der PAM-Mutation umfasst.
  • Ebenfalls beschrieben ist ein Vektor, umfassend:
    • (i) eine Editier-Kassette, die eine Region umfasst, die homolog zu einer Target-Region einer Nukleinsäure in einer Zelle ist und eine Mutation (bezeichnet als eine gewünschte Mutation) mindestens eines Nukleotids relativ zu der Target-Region, und eine „Protospacer Adjacent Motif” (PAM) Mutation beinhaltet;
    • (ii) einen Promoter; und
    • (iii) mindestens eine Guide-RNA (gRNA), umfassend: (a) eine Region (RNA), die komplementär zu einem Teil der Target-Region ist; und (b) eine Region (RNA), die eine Cas9 Nuklease rekrutiert.
  • Eine weitere Ausführungsform ist ein Vektor, umfassend:
    • (i) eine Editier-Kassette, die eine Region beinhaltet, die homolog zu einer Target-Region einer Nukleinsäure in einer Zelle ist und eine Mutation (bezeichnet als eine gewünschte Mutation) mindestens eines Nukleotids in mindestens einem Codon relativ zu der Target-Region und eine „Protospacer Adjacent Motif” (PAM) Mutation beinhaltet;
    • (ii) einen Promoter; und
    • (iii) mindestens eine Guide-RNA (gRNA), umfassend: (a) eine Region (RNA), die komplementär zu einem Teil der Target-Region ist; und (b) eine Region (RNA), die eine Cas9 Nuklease rekrutiert.
  • Eine weitere Ausführungsform ist ein Vektor, umfassend:
    • (i) mindestens eine Editier-Kassette umfassend: (a) eine Region, die homolog zu einer Target-Region einer Nukleinsäure ist und eine Mutation mindestens eines Nukleotids relativ zu der Target-Region und (b) eine „Protospacer Adjacent Motif” (PAM) Mutation umfasst;
    • (ii) mindestens einen Promoter; und
    • (iii) mindestens eine Guide-RNA (gRNA), umfassend: (a) eine Region (RNA), die komplementär zu einem Teil der Target-Region ist; und (b) eine Region (RNA), die eine Cas9 Nuklease rekrutiert.
  • Eine weitere Ausführungsform des Vektors ist ein Vektor, umfassend:
    • (i) eine Editier-Kassette, umfassend: (a) eine Region, die homolog zu einer Target-Region einer Nukleinsäure ist und eine Mutation mindestens eines Nukleotids in mindestens einem Codon relativ zu der Target-Region und (b) eine „Protospacer Adjacent Motif” (PAM) Mutation umfasst;
    • (ii) mindestens einen Promoter; und
    • (iii) mindestens eine Guide-RNA (gRNA), umfassend: (a) eine Region (RNA), die komplementär zu einem Teil der Target-Region ist; und (b) eine Region (RNA), die eine Cas9 Nuklease rekrutiert.
  • In jeder der Ausführungsformen kann der Vektor weiter einen Spacer; mindestens zwei Priming-Stellen; oder einen Spacer und mindestens zwei Priming-Stellen umfassen. In diesen Vektoren, in denen die Mutation mindestens eines Nukleotids in mindestens einem Codon ist, kann sich die Editier-Kassette beispielsweise innerhalb von 100 Nukleotiden von der PAM-Mutation befinden.
  • Ebenfalls beschrieben ist eine Bibliothek, umfassend eine Population von Zellen, die durch die hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Eine Bibliothek von einer Population von Zellen kann Zellen mit jedem der hierin beschriebenen Vektoren umfassen. Beispielsweise kann eine Population von Zellen einen Vektor umfassen, wobei der Vektor umfasst:
    • (i) eine Editier-Kassette, die eine Region beinhaltet, die homolog zu einer Target-Region einer Nukleinsäure in einer Zelle ist und eine Mutation (bezeichnet als eine gewünschte Mutation) mindestens eines Nukleotids relativ zu der Target-Region und eine „Protospacer Adjacent Motif” (PAM) Mutation beinhaltet;
    • (ii) einen Promoter; und
    • (iii) mindestens eine Guide-RNA (gRNA), umfassend: (a) eine Region (RNA), die komplementär zu einem Teil der Target-Region ist; und (b) eine Region (RNA), die eine Cas9 Nuklease rekrutiert.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann eine Population von Zellen einen Vektor umfassen, wobei der Vektor umfasst:
    • (i) eine Editier-Kassette, die eine Region beinhaltet, die homolog zu einer Target-Region einer Nukleinsäure in einer Zelle ist und eine Mutation (bezeichnet als eine gewünschte Mutation) mindestens eines Nukleotids in mindestens einem Codon relativ zu der Target-Region, und eine „Protospacer Adjacent Motif” (PAM) Mutation beinhaltet;
    • (ii) einen Promoter; und
    • (iii) mindestens eine Guide-RNA (gRNA), umfassend: (a) eine Region (RNA), die komplementär zu einem Teil der Target-Region ist; und (b) eine Region (RNA), die eine Cas9 Nuklease rekrutiert.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist das Verfahren ein Verfahren für CRISPR-unterstütztes rationales Protein-Engineering (kombinatorisches Genom Engineering), umfassend:
    • (a) Konstruieren einer Donor-Bibliothek, die rekombinante DNA umfasst, wie beispielsweise rekombinante Chromosomen oder rekombinante DNA in Plasmiden, durch Einführen beispielsweise durch Co-Transformation, in eine Population von ersten Zellen (i) eines oder mehrerer Editier-Oligonukleotide, wie beispielsweise rational entworfene Oligonukleotide, die die Deletion eines ersten einzelnen „Protospacer Adjacent Motif” Motivs (PAM) mit einer Mutation mindestens eines Codons in einem zu dem PAM benachbarten Gen (das benachbarte Gen) koppeln und (b) eine Guide-RNA (gRNA), die eine Nukleotid-Sequenz 5' von dem offenen Leserahmen eines Chromosoms anzielt, wodurch eine Donor-Bibliothek hergestellt wird, die eine Population von ersten Zellen umfasst, die rekombinante Chromosomen mit gezielten Codon Mutationen umfasst;
    • (b) Amplifizieren der in (a) konstruierten Donor-Bibliothek, beispielsweise durch PCR-Amplifikation rekombinanter Chromosome, die ein synthetisches Merkmal der Editier-Oligonukleotide verwenden und gleichzeitig eine zweite PAM-Deletion (Ziel-PAM-Deletion) an dem 3'-Terminus des Gens einbauen, wodurch die gezielten Codon-Mutationen direkt mit der Ziel-PAM-Deletion gekoppelt werden, beispielsweise durch kovalentes Koppeln, und wodurch eine wiedergewonnene Donor-Bibliothek hergestellt wird, die die Ziel-PAM-Deletion und die gezielten Codon-Mutationen trägt; und
    • (c) Einführen (z. B. Co-Transformieren) der Donor-Bibliothek, die die Ziel-PAM-Deletion und die gezielten Codon-Mutationen trägt und einem Ziel-gRNA-Plasmid in eine Population von zweiten Zellen, die typischerweise eine Population von naiven Zellen ist, wodurch eine Ziel-Bibliothek hergestellt wird, die die gezielten Codon-Mutationen umfasst.
  • Die Population der ersten Zellen und die Population der zweiten Zellen (z. B. Eine Population von naiven Zellen) sind typischerweise eine Population, in denen die Zellen alle von dem gleichen Typ sind und die prokaryotisch oder eukaryotisch sein können, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf Bakterien, Säugerzellen, Pflanzenzellen, Insektenzellen.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren weiter Aufrechterhalten der Ziel-Bibliothek unter Bedingungen, unter denen Protein hergestellt wird.
  • In einigen Ausführungsformen exprimiert die erste Zelle ein Polypeptid mit Cas9-Nukleaseaktivität. In einigen Ausführungsformen wird das Polypeptid mit Cas9-Nukleaseaktivität unter Kontrolle eines induzierbaren Promoters exprimiert.
  • In einigen Ausführungsformen sind die Editier-Oligonukleotide komplementär zu einer (einer, einer oder mehreren, mindestens einer) Target-Nukleinsäure, die in der ersten Zelle vorliegt. In einigen Ausführungsformen zielen die Editier-Oligonukleotide mehr als eine Target-Stelle oder -Locus in der ersten Zelle an. In einigen Ausführungsformen umfasst die Nukleinsäuresequenz der Editier-Oligonukleotide [gewünschtes Codon] eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder jegliche Kombinationen von Substitutionen, Deletionen und Insertionen relativ zu der Target-Nukleinsäure. In einigen Ausführungsformen werden die Editier-Oligonukleotide rational entworfen; in weiteren Ausführungsformen werden sie durch zufällige Mutagenese oder unter Verwendung degenerierter Primer-Oligonukleotide hergestellt. In einigen Ausführungsformen stammen die Editier-Oligonukleotide aus einer Sammlung von Nukleinsäuren (Bibliothek).
  • In einigen Ausführungsformen wird die gRNA auf einem Plasmid codiert. In einigen Ausführungsformen werden das Editier-Oligonukleotid und die gRNA durch Transformation in die erste Zelle eingeführt, beispielsweise durch Co-Transformation des Editier-Oligonukleotids und der Guide(g)-RNA. In einigen Ausführungsformen werden das Editier-Oligonukleotid und die gRNA sequenziell in die erste Zelle eingeführt. In anderen Ausführungsformen werden das Editier-Oligonukleotid und die gRNA gleichzeitig in die erste Zelle eingeführt.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst Wiedergewinnen der Donor-Bibliothek weiter (a) Screening der Zellen auf Einbau der Editier-Oligonukleotide und (b) Selektieren der Zellen, bei denen bestätigt wurde, dass sie das Editier-Oligonukleotid eingebaut haben. In einigen Ausführungsformen umfasst Wiedergewinnen der Donor-Bibliothek weiter Bearbeitung der wiedergewonnenen Donor-Bibliothek.
  • In einigen Ausführungsformen exprimiert die Zielzelle/naive Zelle ein Polypeptid mit Cas9-Nukleaseaktivität. In einigen Ausführungsformen wird das Polypeptid mit Cas9-Nukleaseaktivität unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors exprimiert.
  • Ebenfalls beschrieben ist ein Verfahren für CRISPR-unterstütztes rationales Protein-Engineering, umfassend:
    • (a) Einführen (z. B., Co-Transformieren) von (i) synthetischen dsDNA Editier-Kassetten, die Editier-Oligonukleotide umfassen und (ii) einem Vektor, der eine Guide-RNA (gRNA) exprimiert, die die genomische Sequenz direkt stromaufwärts von einem Gen von Interesse in einer Population von ersten Zellen anzielt, unter Bedingungen, unter denen Multiplex Recombineering und selektive Anreicherung der Editier-Oligonukleotide durch gRNA auftritt, wodurch eine Donor-Bibliothek hergestellt wird;
    • (b) Amplifizieren der Donor-Bibliothek mit einem Oligonukleotid, dass ein „Protospacer Adjacent Motif” (PAM) Motiv deletiert, das zu dem 3'-Ende des Gens von Interesse benachbart ist (Ziel-PAM), wodurch eine amplifizierte Donor-Bibliothek hergestellt wird, die dsDNA Editier-Kassetten, von denen aus die Ziel-PAM deletiert worden ist (mit einer 3' PAM-Deletion), rationale Codon-Mutationen, und eine P1-Stelle umfasst; und
    • (c) Bearbeiten der amplifizierten Donor-Bibliothek mit einem Enzym, wie beispielsweise einem Restriktionsenzym (z. B. BsaI), um die P1-Stelle zu entfernen; und
    • (d) Co-Transformieren einer Population von naiven Zellen mit der in (c) bearbeiteten amplifizierten Donor-Bibliothek und der Ziel-gRNA, wodurch eine Population von co-transformierten Zellen hergestellt wird, die dsDNA-Editier-Kassetten, von denen aus die Ziel-PAM deletiert worden ist (mit einer 3' PAM-Deletion), rationale Codon-Mutationen, und die Ziel-gRNA umfassen.
  • In allen beschriebenen Ausführungsformen kann eine Mutation von jedem gewünschten Typ sein, wie beispielsweise eine oder mehrere Insertionen, Deletionen, Substitutionen oder jegliche Kombinationen von zwei oder drei der zuvor genannten (z. B. Insertion und Deletion; Insertion und Substitution; Deletion und Substitution; Substitution und Insertion; Insertion, Deletion und Substitution). Insertionen, Deletionen und Substitutionen können eine beliebige Zahl von Nukleotiden betreffen. Sie können sich in Codons (codierenden Regionen) und/oder in nicht-codierenden Regionen befinden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1A und 1B geben einen Überblick über CRISPR-unterstütztes, rationales Protein-Engineering (engl. CRISPR assisted rational protein engineering, CARPE). 1A zeigt ein Schema zur Konstruktion einer Donor-Bibliothek. Synthetische dsDNA Editier-Kassetten werden mit einem Vektor co-transformiert, der eine Guide-RNA (gRNA) exprimiert, der die genomische Sequenz stromaufwärts des Gens von Interesse anzielt. Die Co-Transformation erzeugte über Multiplex Recombineering eine Donor-Bibliothek von den Editier-Oligonukleotiden, die selektiv durch die gRNA angereichert werden. Die Donor-Bibliothek wurde dann unter Verwendung eines Oligonukleotids amplifiziert, das ein PAM mutiert (deletiert), das zu dem 3'-Ende des Gens benachbart ist (Ziel-PAM). 1B zeigt ein Schema zur Konstruktion einer finalen Protein-Bibliothek. Die Donor-Bibliothek wurde mit BsaI bearbeitet, um die P1-Stelle zu entfernen, und die Bibliothek der dsDNA-Kassetten mit der 3'PAM-Deletion und den rationalen Codon-Mutationen wurde mit der Ziel-gRNA co-transformiert, um die finale Protein-Bibliothek zu erzeugen.
  • 2 zeigt die DNA-Sequenzen von Klonen aus der Konstruktion der galK Donor-Bibliothek, was den hocheffizienten Einbau des P1-Merkmals der Editier-Oligonukleotide (90% Mutationseffizienz), sowie die Mutation an der Target-Codon-Position (unterstrichen; 20% Mutationseffizienz) bestätigt. Die Sequenz von P1 wird in SEQ ID NO: 1 bereitgestellt.
  • 3A zeigt das Primer-Design. 3B zeigt die erwartete Dichte relativ zu der Zahl der Primer.
  • 4A stellt Linker- und Konstrukt-Ergebnisse dar. 4B zeigt 10 Änderungen in Bezug auf Emulsions-PCR-basiertes Tracking.
  • 5 ist ein Schema für rationales Protein-Editieren für metabolisches Engineering, wobei bei paralleler Synthese der Bibliothek 104–105 Merkmale pro Synthese gewonnen werden können.
  • 6 ist ein Schema zur Erzeugung von CRISPR-angereicherten, rationalen Protein-Bibliotheken, umfassend die Schritte 1) Multiplex-Rekombination, 2) Wiedergewinnung der Bibliothek und 3) Multiplex-Rekombination durch Koppeln von PAM mit der Bibliothek von Mutationen. CRISPR ermöglicht dabei eine schnelle Selektion rekombinanter Genotypen zum Anreichern der Protein-Bibliotheken von der Platte.
  • 7 ist ein Schema des Aufbaus und Demonstration von CARPE.
  • 8 zeigt Strategien zur iterativen CRISPR Co-Selektion.
  • 9 zeigt eine Strategie für Multiplex Protein-Engineering unter Verwendung von CARPE, umfassend die Schritte 1) Konstruktion der Donor-Bibliothek (Multiplex-Rekombination), 2) Wiedergewinnung der Donor-Bibliothek mittels PCR und 3) Konstruktion der Ziel-Bibliothek (Multiplex-Rekombination). Es liegen zwei PAM-Stellen für jede Gen-Bibliothek vor. Diese Strategie ermöglicht die rationale Konstruktion der Bibliothek für ORFs und ein schnelles Protein-Engineeringpotential.
  • 10 zeigt den Konzeptnachweis der Konstruktion einer galK Donor-Bibliothek unter Verwendung von CARPE, umfassend die Schritte 1) Konstruktion der Donor-Bibliothek (Multiplex-Rekombination) und 2) Wiedergewinnung der Donor-Bibliothek mittels PCR, welche aus Flüssigkulturen, 3 Stunden nach der Rekombination erfolgt.
  • 11A zeigt ein Schema für Multiplex CRISPR-basiertes Editieren unter Verwendung von CARPE. 11B zeigt ein Schema für Multiplex CRISPR-basiertes Editieren (Multiplex Amplifikation/Klonierung) unter Verwendung von Genom Engineering durch Recombineering, angereichert mit verfolgbarem CRISPR (engl. Genome Engineering by trackable CRISPR enriched recombineering, GEn-TraCER).
  • 12 zeigt einen repräsentativen GEn-TraCER Vektor (Konstrukt), der eine Editier-Kassette zum Editieren von Codon 24 von galK, einen Promotor, und einen Spacer beinhaltet.
  • 13 zeigt die Ergebnisse einer galK Editierung unter Verwendung von GEn-TraCER. Die oberen Abschnitte zeigen DNA-Sequenzierergebnisse des Chromosoms und des Vektors (Plasmids) der Zellen, die mit dem galK Codon 24 Editier-GEn-TraCER-Vektor transformiert worden sind, was darauf hindeutet, dass die Editier-Kassette (Oligonukleotid) auf dem Vektor als ein „trans-Barcode” sequenziert werden kann, was ein hocheffizientes Verfolgen der gewünschten Genomänderung (Mutation) ermöglicht. Der untere Teil zeigt DNA-Sequenzierchromatographen der Zellen, die den nicht-geänderten, Wildtyp-Phänotyp (rot) zeigen. Das Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Zellen mit multiplen Chromosomen, die sowohl das Wildtyp-, nicht-geänderte Allel als auch das geänderte/mutierte Allel tragen.
  • 14A–14C zeigen Schemata für GEn-TraCER. 14A zeigt einen Überblick über die Design-Bestandteile. Die GEn-TraCER Kassette enthält Guide-RNA (gRNA) Sequenz(en), um eine spezifische Stelle in dem Zellgenom anzuzielen und dsDNA-Spaltung zu bewirken. Eine homologe Region, die komplementär zur Target-Region ist, mutiert das PAM und andere naheliegende gewünschte Stellen. Die Zellen, die Rekombination durchlaufen, werden selektiv auf hohe Abundanz angereichert. Sequenzieren der GEn-TraCER Editier-Kassette in dem Vektor ermöglicht Verfolgen der genomischen Änderungen/Mutationen mit Genom-weitem Tracking mit kurzer Lesung. 14B zeigt eine beispielhafte Editier-Kassette für das E. coli galK Gen an Codon 145. Das PAM wird mit der am nächsten verfügbaren PAM-Mutation deletiert, die für eine synonyme Änderung an der am nächsten verfügbaren PAM-Position erstellt werden kann. Dies ermöglicht Mutagenese mit einer „stillen Narbe” von 1–2 Nukleotiden an der PAM-Deletionsstelle. 14C zeigt GEn-TraCER Kassetten die unter Verwendung von Array-basierten Syntheseverfahren synthetisiert werden können, wodurch parallele Synthese von mindestens 104–106 Kassetten für ein systematisches Targeting und gleichzeitige Auswertung der Fitness für tausende Mutationen auf einer genomweiten Skala ermöglicht wird.
  • 15A zeigt einen Überblick über GEn-TraCER Vektoren. 15B zeigt einen Teil eines repräsentativen GEn-TraCER zur Erzeugung einer Y145* Mutation in dem E. coli galK Gen, in dem die PAM-Mutation und das Codon, das mutiert wird, durch 17 Nukleotide getrennt sind. Die Nukleinsäuresequenz des Teils des repräsentativen GEn-TraCER wird in SEQ ID NO: 28 bereitgestellt und die reverse, komplementäre Sequenz wird durch SEQ ID NO: 33 bereitgestellt.
  • 16A–16C zeigen Kontrollen für das GEn-TraCER Design. 16A zeigt die Auswirkung der Größe der Editier-Kassette auf die Effizienz des Verfahrens. 16B zeigt die Auswirkung des Abstands zwischen der PAM-Mutation/Deletion und der gewünschten Mutation auf die Effizienz des Verfahrens. 16C zeigt die Auswirkung der Anwesenheit oder Abwesenheit des MutS-Systems auf die Effizienz des Verfahrens.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Bakterien und Archaea CRISPR-Systeme haben sich als leistungsfähige Werkzeuge für präzises Genom Editieren herausgestellt. Das Typ-II CRISPR-System von Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) ist in vitro besonders gut charakterisiert worden, und es sind einfache Design-Regeln zum Umprogrammieren von dessen doppelsträngiger DNA(dsDNA)-Bindungsaktivität aufgestellt worden (Jinek et al. Science (2012) 337 (6096): 816–821). Die Verwendung von CRISPR-vermittelten Genom Editier-Verfahren hat sich in der Literatur schnell für eine breite Vielzahl von Organismen angesammelt, umfassend Bakterien (Cong et al. Science (2013) 339 (6121): 819–823), Saccharomyces cerevisiae (DiCarlo et al. Nucleic Acids Res. (2013) 41: 4336–4343), Caenorhabditis elegans (Waaijers et al. Genetics (2013) 195: 1187–1191) und verschiedene Säugerzelllinien (Cong et al. Science (2013) 339 (6121): 819–823; Wang et al. Cell (2013) 153: 910–918). Wie bei anderen Endonuklease-basierten Genom Editier-Technologien, wie beispielsweise Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs), Homing Nukleasen und TALENEN, beruht die Fähigkeit der CRISPR-Systeme präzises Genom Editieren zu vermitteln, auf der hochspezifischen Natur der Target-Erkennung. Beispielsweise benötigt das Typ-I CRISPR-System von Escherichia coli und das S. pyogenes System eine perfekte Komplementarität zwischen der CRISPR RNA (crRNA) und einem 14–15 Basenpaar-langen Erkennungstarget, was darauf hindeutet, dass die Immunfunktionen der CRISPR-Systeme auf natürliche Weise eingesetzt werden (Jinek et al. Science (2012) 337 (6096): 816–821; Brouns et al. Science (2008) 321: 960–964; Semenova et al. PNAS (2011) 108: 10098–10103).
  • Hierin werden Verfahren zum Genom Editieren beschrieben, die eine Endonuklease einsetzen, wie beispielsweise die Cas9 Nuklease, die durch ein cas9 Gen codiert wird, um direkte Genom-Evolution durchzuführen/Änderungen (Deletionen, Substitutionen, Additionen) in der DNA, wie beispielsweise genomischer DNA zu erzeugen. Das cas9 Gen kann aus jeder beliebigen Quelle erhalten werden, wie beispielsweise aus einem Bakterium, wie beispielsweise dem Bakterium S. pyogenes. Die Nukleinsäuresequenz von cas9 und/oder Aminosäuresequenz von Cas9 kann relativ zu der Sequenz eines natürlich vorkommenden cas9 und/oder Cas9 mutiert sein; Mutationen können beispielsweise ein oder mehrere Insertionen, Deletionen, Substitutionen oder jegliche Kombinationen von zwei oder mehr der zuvor genannten sein. In solchen Ausführungsformen kann das resultierende mutierte Cas9 eine erhöhte oder verminderte Nukleaseaktivität relativ zu dem natürlich vorkommenden Cas9 aufweisen.
  • Die 1A, 1B, und 11A zeigen ein CRISPR-vermitteltes Genom Editier-Verfahren, das als CRISPR-unterstütztes rationales Protein-Engineering (engl. CRISPR assisted rational Protein engineering, CARPE) bezeichnet wird. CARPE ist ein zweistufiges Konstruktionsverfahren, das auf der Erzeugung der „Donor-” und „Ziel-”Bibliotheken beruht, die gerichteten Mutationen von Einzelstrang-DNA (ssDNA) oder Doppelstrang-DNA (dsDNA) Editier-Kassetten direkt in das Genom einbauen. In der ersten Stufe der Donor-Konstruktion (1A), werden rational gestaltete Editier-Oligos mit einer Guide-RNA (gRNA), die an eine Target-DNA-Sequenz, wie beispielsweise eine Sequenz 5' eines offenen Leserahmens oder einer anderen Sequenz von Interesse, hybridisiert oder diese anzielt, in Zellen co-transformiert. Eine Schlüsselinnovation von CARPE ist die Gestaltung von Editier-Oligonukleotiden, die die Deletion oder Mutation eines einzigen ”Protospacer Adjacent Motif” (PAM) Motivs mit der Mutation eines oder mehrerer gewünschter Codons in dem benachbarten Gen koppelt, wodurch die Erzeugung der gesamten Donor-Bibliothek in einer einzigen Transformation ermöglicht wird. Die Donor-Bibliothek wird dann durch Amplifikation der rekombinanten Chromosomen wiedergewonnen, z. B. durch eine PCR-Reaktion, unter Verwendung eines synthetischen Merkmals des Editier-Oligonukleotids; eine zweite PAM-Deletion oder Mutation wird gleichzeitig an dem 3'-Ende des Gens eingebaut. Dieser Ansatz koppelt daher die Codon-angezielten Mutationen direkt kovalent an eine PAM-Deletion. In einer zweiten Stufe von CARPE (1B) werden die PCR-amplifizierten Donor-Bibliotheken, die die Ziel-PAM-Deletion/Mutation und die gezielten Mutationen (gewünschte Mutation(en) eines oder mehrerer Nukleotide, wie beispielsweise einem oder mehreren Nukleotiden in einem oder mehreren Codons) tragen, mit einem Ziel-gRNA-Vektor in naive Zellen co-transformiert, um eine Population von Zellen zu erzeugen, die eine rational entworfene Protein-Bibliothek exprimiert.
  • In dem CRISPR-System lenken die CRISPR trans-aktivierende (tracrRNA) und die Spacer-RNA (crRNA) die Auswahl einer Target-Region. Wie hierin verwendet, bezieht sich eine Target-Region auf jeden Locus in der Nukleinsäure einer Zelle oder einer Population von Zellen, in denen mindestens eine Mutation mindestens eines Nukleotids, wie beispielsweise eine Mutation mindestens eines Nukleotids in mindestens einem Codon (einem oder mehreren Codons) gewünscht wird. Die Target-Region kann beispielsweise ein genomischer Locus (genomische Target-Sequenz) oder ein extra-chromosomaler Locus sein. Die tracrRNA und crRNA können als ein einzelnes, chimäres RNA-Molekül exprimiert werden, das als eine Einzel-Guide-RNA, Guide-RNA oder gRNA bezeichnet wird. Die Nukleinsäuresequenz der gRNA umfasst eine erste Nukleinsäuresequenz, die auch als eine erste Region bezeichnet wird, die komplementär zu einer Region der Target-Region ist und eine zweite Nukleinsäuresequenz, die auch als eine zweite Region bezeichnet wird, die eine Haarnadelstruktur (engl: stem loop structure) bildet und zur Rekrutierung von Cas9 zu der Target-Region dient. In einigen Ausführungsformen ist die erste Region der gRNA komplementär zu einer Region, die sich stromaufwärts der genomischen Target-Sequenz befindet. In einigen Ausführungsformen ist die erste Region der gRNA komplementär zu mindestens einem Teil der Target-Region. Die erste Region der gRNA kann vollständig komplementär (100% komplementär) zu der genomischen Target-Sequenz sein oder eine oder mehrere Fehlpaarungen beinhalten, vorausgesetzt, dass sie ausreichend komplementär zu der genomischen Target-Sequenz ist, um Cas9 spezifisch zu hybridisieren/zu lenken und zu rekrutieren. In einigen Ausführungsformen ist die erste Region der gRNA mindestens 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, oder mindestens 30 Nukleotide lang. In einigen Ausführungsformen ist die erste Region der gRNA mindestens 20 Nukleotide lang. In einigen Ausführungsformen ist die Haarnadelstruktur, die durch die zweite Nukleinsäuresequenz gebildet wird, mindestens 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, oder 100 Nukleotide lang. In spezifischen Ausführungsformen ist die Haarnadelstruktur zwischen 80 bis 90 oder 82 bis 85 Nukleotide lang, und in weiteren spezifischen Ausführungsformen ist die zweite Region der gRNA, die eine Haarnadelstruktur bildet, 83 Nukleotide lang.
  • In einigen Ausführungsformen ist die Sequenz der gRNA (von der Donor-Bibliothek), die unter Verwendung des CARPE-Verfahrens in die erste Zelle eingeführt wird, die gleiche, wie die Sequenz der gRNA (von der Ziel-Bibliothek), die in die zweite/naive Zelle eingeführt wird. In einigen Ausführungsformen wird mehr als eine gRNA in die Population der ersten Zellen und/oder der Population der zweiten Zellen eingeführt. In einigen Ausführungsformen umfasst das mehr als eine gRNA-Molekül eine erste Nukleinsäuresequenz, die komplementär zu mehr als einer Target-Region ist.
  • In dem CARPE Verfahren können Doppelstrang-DNA-Kassetten, die auch als Editier-Oligonukleotide bezeichnet werden, zur Verwendung in den beschriebenen Verfahren aus vielen Quellen erhalten werden oder daraus abstammen. Beispielsweise stammen die dsDNA-Kassetten in einigen Ausführungsformen von einer Nukleinsäure-Bibliothek, die durch nicht-homologe zufällige Rekombination (engl. non-homologous random recombination, NRR) diversifiziert wurde; solch eine Bibliothek wird als eine NRR-Bibliothek bezeichnet. In einigen Ausführungsformen werden die Editier-Oligonukleotide synthetisiert, beispielsweise durch Array-basierte Synthese. Die Länge der Editier-Oligonukleotide kann von dem Verfahren abhängen, das zur Gewinnung der Editier-Oligonukleotide verwendet wird. In einigen Ausführungsformen ist das Editier-Oligonukleotid ungefähr 500–200 Nukleotide, 75–150 Nukleotide, oder zwischen 80–120 Nukleotide lang.
  • Ein Editier-Oligonukleotid beinhaltet (a) eine Region, die homolog zu einer Target-Region der Nukleinsäure der Zelle ist und eine Mutation (bezeichnet als eine gewünschte Mutation) mindestens eines Codons relativ zu der Target-Region, und (b) eine ”Protospacer Adjacent Motif” (PAM) Mutation beinhaltet. Die PAM-Mutation kann jede Insertion, Deletion oder Substitution eines oder mehrerer Nukleotiden sein, die die Sequenz des PAM mutieren, so dass es nicht mehr von dem CRISPR-System erkannt wird. Eine Zelle, die eine PAM-Mutation umfasst kann als „immun” gegenüber CRISPR-vermittelter Tötung bezeichnet werden. Die gewünschte Mutation relativ zu der Sequenz der Target-Region kann eine Insertion, Deletion und/oder Substitution eines oder mehrerer Nukleotiden an mindestens einem Codon der Target-Region sein.
  • Das CARPE-Verfahren wird nachfolgend nur zum Zweck der Veranschaulichung in Bezug auf ein bakterielles Gen beschrieben. Diese Verfahren können auf jedes Gen(e) von Interesse angewendet werden, umfassend Gene von jedem Prokaryoten, umfassend Bakterien und Archaea, oder jedem Eukaryonten, umfassend Hefe und Säuger (umfassend humane) Gene. Das CARPE-Verfahren wurde auf dem galK Gen in dem E. coli Genom durchgeführt, teilweise aufgrund der Verfügbarkeit von Aktivitätstests für dieses Gen. Das Verfahren wurde unter Verwendung der BW23115 Elternstämme und des pSIM5-Vektors (Datta et al. Gene (2008) 379: 109–115) durchgeführt, um Recombineering zu vermitteln. Das cas9 Gen wurde unter Kontrolle eines pBAD-Promotors in ein pBTBX-2-Rückrat kloniert, um die Kontrolle der Spaltungsaktivität durch Zugabe von Arabinose zu ermöglichen. Die Beurteilung der Fähigkeit selektiv synthetische dsDNA-Kassetten (127 bp) einzubauen, wurde unter Verwendung von dsDNA-Kassetten aus den NNK-Bibliotheken durchgeführt, die aus degenerierten Primern und/oder aus rational entworfenen Oligonukleotiden (Oligos), konstruiert wurden, die als Teil einer Bibliothek mit 27.000 Mitgliedern mittels Microarray-Technologie synthetisiert wurden. In beiden Fällen wurden die Oligonukleotide so entworfen, dass sie die Reste des aktiven Zentrums des galK Genprodukts mutieren. Die hocheffiziente Rückgewinnung der Donorstamm-Bibliotheken wurde basierend auf den Änderungen der Amplicongrößen verifiziert, die mit Primern gegen den galK Locus erhalten wurden. Sequenzieren dieser Kolonie-PCR-Produkte aus den NRR-Bibliotheken wies darauf hin, dass die synthetische Priming-Stelle (P1) aus der dsDNA-Kassette mit einer Effizienz von ungefähr 90–100% eingebaut wurde. Dies deutet darauf hin, dass diese Bibliotheken mit hoher Effizienz erzeugt werden können ohne von den fehleranfälligen mutS Knockout-Stämmen abhängig zu sein, die typischerweise in anderen Recombineering-basierten Editieransätzen verwendet worden sind (Costantino et al. PNAS (2003) 100: 15748–15753; Wang et al. Nature (2009) 460: 894–898). Es trat ein Rückgang in der Effizienz der Codon-Mutationen auf (ungefähr 20%), der auf mutS-Korrekturen durch allelischen Austausch zurückzuführen sein kann. Eine vorläufige Beurteilung der Klone in den Ziel-Bibliotheken deutet darauf hin, dass die endgültige Codon-Editier-Effizienz ungefähr 10% betrug, wenn beide Phasen der Konstruktion in dem mutS+-Hintergrund durchgeführt wurden.
  • Es wurde ein Vergleich mit anderen kürzlich-veröffentlichten Protokollen für co-selektierbares Editieren durchgeführt, die alternative Protokolle verwenden, die die PAM- und Codon-Mutationen nicht-kovalent verknüpfen, sondern sich stattdessen auf deren Nähe zueinander während der Replikation verlassen (Wang et al. Nat. Methods (2012) 9: 591–593). In diesen nicht-kovalenten Experimenten wurden die gleichen Editier-Oligos wie oben verwendet und es wurden Anstrengungen unternommen, um deren Insertion unter Verwendung der ssDNA-Oligos zu co-selektieren, die die gleichen Donor-/Ziel-PAM-Stellen anzielen. Kolonie-Screening der resultierenden Mutanten zeigte eine hohe Effizienz in der Wiedergewinnung der PAM-Mutanten. Jedoch scheint es keine starke Co-Selektion für die Insertion von dsDNA-Editier-Kassetten zu geben. Dies kann auf die großen Unterschiede in den relativen Recombineering-Effizienzen der PAM-Ziel-Oligonukleotide und der Editier-Kassetten zurückzuführen sein, die beträchtliche chromosomale Deletionen erzeugen.
  • Die Fähigkeit, die endgültigen Editier-Effizienzen des CARPE-Verfahrens zu verbessern, können beispielsweise beurteilt werden durch Durchführen der Donor-Konstruktion in mutS-defizienten Stämmen, bevor sie in einen Wildtyp Donor-Stamm transferiert werden, in dem Bemühen den Verlust der Mutationen während der Donor-Konstruktionsphase zu verhindern. Zusätzlich kann die Allgemeingültigkeit des CARPE-Verfahrens beispielsweise durch Anwenden von CARPE auf eine Reihe von essenziellen Genen, umfassend dxs, metA, und folA, beurteilt werden. Essenzielle Gene sind unter Verwendung der beschriebenen gRNA-Designstrategien effektiv angezielt worden. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass trotz der Genzerstörung, die während der Erzeugung der Donor-Bibliothek auftritt, die Donor-Bibliotheken effektiv konstruiert werden können und innerhalb von 1–3 Stunden nach dem Recombineering wiedererlangt werden können.
  • Hierin werden auch Verfahren für verfolgbares, präzises Genom Editieren unter Verwendung eines CRISPR-vermittelten Systems bereitgestellt, bezeichnet als „Genome Engineering by Trackable CRISPR Enriched Recombineering” (GEn-TraCER). Die GEn-TraCER-Verfahren erzielen hocheffizientes Editieren/Mutieren unter Verwendung eines einzigen Vektors, der sowohl für die Editier-Kassette als auch für die gRNA codiert. GEN-TraCER stellt, wenn es zusammen mit paralleler DNA-Synthese, wie beispielsweise Array-basierter DNA-Synthese, verwendet wird, eine einstufige Erzeugung von tausenden präzisen Änderungen/Mutationen bereit und ermöglicht es, die Mutation durch Sequenzieren der Editier-Kassette auf dem Vektor, statt durch Sequenzieren des Genoms der Zelle (genomischer DNA), zuzuordnen. Diese Verfahren finden in Protein- und Genom Engineering-Anwendungen eine breite Verwendung, sowie zur Rekonstruktion von Mutationen, wie beispielsweise Mutationen, die in Labor-Evolutionsexperimenten identifiziert wurden.
  • Die Gen-TraCER-Verfahren und Vektoren kombinieren eine Editier-Kassette, die eine gewünschte Mutation und eine PAM-Mutation umfasst, mit einem Gen, das für eine gRNA codiert, auf einem einzigen Vektor, der die Erzeugung einer Bibliothek von Mutationen in einer einzigen Reaktion ermöglicht. Wie in 11B gezeigt ist, umfasst das Verfahren Einführen eines Vektors, der eine Editier-Kassette umfasst, die die gewünschte Mutation und die PAM-Mutation beinhaltet, in eine Zelle oder eine Population von Zellen. In einigen Ausführungsformen codieren die Zellen, in die der Vektor eingeführt wurde, auch für Cas9. In einigen Ausführungsformen wird ein für Cas9 codierende Gen anschließend in die Zelle oder die Population von Zellen eingeführt. Die Expression des CRISPR-Systems, das Cas9 und die gRNA beinhaltet, wird in der Zelle oder der Zellpopulation aktiviert; die gRNA rekrutiert Cas9 zu der Target-Region, wo dsDNA-Spaltung auftritt. Ohne an irgendeine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen, mutiert die homologe Region der Editier-Kassette, die komplementär zu der Target-Region ist, das PAM und das eine oder mehrere Codon der Target-Region. Zellen der Population von Zellen, die die PAM-Mutation nicht integriert haben, durchlaufen aufgrund der Cas9-vermittelten dsDNA-Spaltung nicht-editierten Zelltod. Zellen der Population von Zellen, die die PAM-Mutation integriert haben, durchlaufen keinen Zelltod; sie bleiben lebensfähig und werden selektiv auf hohe Abundanz angereichert. Es werden lebensfähige Zellen erhalten und eine Bibliothek von gezielten Mutationen bereitgestellt.
  • Das Verfahren des verfolgbaren Genom Editierens unter Verwendung von GEn-TraCER umfasst: (a) Einführen eines Vektors, der für mindestens eine Editier-Kassette, einen Promotor, und mindestens eine gRNA codiert, in eine Zelle oder in eine Population von Zellen, wodurch eine Zelle oder eine Population von Zellen hergestellt wird, die den Vektor umfasst (eine zweite Population von Zellen); (b) Aufrechterhalten der zweiten Population von Zellen unter Bedingungen, unter denen Cas9 exprimiert wird, wobei die Cas9 Nuklease auf dem Vektor, einem zweiten Vektor oder in dem Genom der Zellen der zweiten Population von Zellen codiert wird, was zur DNA-Spaltung und Tod von Zellen der zweiten Population von Zellen führt, die die PAM-Mutation nicht umfassen, wobei Zellen der zweiten Population von Zellen, die die PAM-Mutation umfassen, lebensfähig sind; (c) Erhalten lebensfähiger Zellen; und (d) Sequenzieren der Editier-Kassette des Vektors in mindestens einer Zelle der zweiten Population von Zellen, um die Mutation mindestens eines Codons zu identifizieren.
  • In einigen Ausführungsformen wird ein separater für cas9 codierender Vektor ebenfalls in die Zelle oder die Population von Zellen eingeführt. Einführen eines Vektors in eine Zelle oder eine Population von Zellen kann unter Verwendung jeglicher in der Technik bekannter Verfahren oder Techniken durchgeführt werden, beispielsweise können Vektoren durch Standardprotokolle eingeführt werden, wie beispielsweise Transformation, umfassend chemische Transformation und Elektroporation, Transduktion und Partikelbeschuss.
  • Eine Editier-Kassette umfasst (a) eine Region, die eine Target-Region einer Nukleinsäure in einer Zelle oder einer Population von Zellen erkennt (daran hybridisiert), die homolog zu der Target-Region der Nukleinsäure der Zelle ist und eine Mutation (bezeichnet als eine gewünschte Mutation) mindestens eines Nukleotids in mindestens einem Codon relativ zu der Target-Region, und (b) eine ”Protospacer Adjacent Motif” (PAM) Mutation beinhaltet. Die PAM-Mutation kann jede Insertion, Deletion oder Substitution eines oder mehrerer Nukleotide sein, die die Sequenz des PAM mutiert, so dass das mutierte PAM (PAM-Mutation) nicht durch das CRISPR-System erkannt wird. Eine Zelle, die eine solche PAM-Mutation umfasst, kann auch als „immun” gegenüber CRISPR-vermittelter Tötung bezeichnet werden. Die gewünschte Mutation, relativ zu der Sequenz der Target-Region kann eine Insertion, Deletion, und oder Substitution eines oder mehrerer Nukleotide in mindestens einem Codon der Target-Region sein. In einigen Ausführungsformen beträgt der Abstand zwischen der PAM-Mutation und der gewünschten Mutation auf der Editier-Kassette mindestens 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 Nukleotide auf der Editier-Kassette. In einigen Ausführungsformen befindet sich die PAM-Mutation mindestens 9 Nukleotide von dem Ende der Editier-Kassette. In einigen Ausführungsformen befindet sich die gewünschte Mutation mindestens 9 Nukleotide von dem Ende der Editier-Kassette.
  • In einigen Ausführungsformen ist die gewünschte Mutation, relativ zu der Sequenz der Target-Region, eine Insertion einer Nukleinsäuresequenz. Die in die Target-Region insertierte Nukleinsäuresequenz kann beliebig lang sein. In einigen Ausführungsformen ist die insertierte Nukleinsäuresequenz mindestens 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, oder mindestens 2000 Nukleotide lang. In Ausführungsformen, in denen eine Nukleinsäuresequenz in die Target-Region insertiert wird, umfasst die Editier-Kassette eine Region, die mindestens 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, oder mindestens 60 Nukleotide lang ist und homolog zu der Target-Region ist.
  • Der Ausdruck ”GEn-TraCER Kassette” kann verwendet werden, um sich auf eine Editier-Kassette, Promoter, Spacer-Sequenz und mindestens einen Teil eines für eine gRNA codierenden Gens zu beziehen. In einigen Ausführungsformen codiert ein Teil des für die gRNA codierenden Gens auf der GEn-TraCER Kassette den Teil der gRNA, der komplementär zu der Target-Region ist. In einigen Ausführungsformen ist der Teil der gRNA, der komplementär zu der Target-Region ist, mindestens 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, oder mindestens 30 Nukleotide lang. In einigen Ausführungsformen ist der Teil der gRNA, der komplementär zu der Target-Region ist, 24 Nukleotide lang. In einigen Ausführungsformen umfasst die GEn-TraCER Kassette weiter mindestens zwei Priming-Stellen. In einigen Ausführungsformen können die Priming-Stellen verwendet werden, um die GEn-TraCER Kassetten zu amplifizieren, beispielsweise durch PCR. In einigen Ausführungsformen wird der Teil der gRNA, der komplementär zu der Target-Region ist, als eine Priming-Stelle verwendet.
  • In dem GEn-TraCER-Verfahren können Editier-Kassetten und GEn-TraCER-Kassetten zur Verwendung in den beschriebenen Verfahren aus vielen Quellen erhalten werden, oder daraus stammen. Beispielsweise wird in einigen Ausführungsformen die Editier-Kassette synthetisiert, zum Beispiel durch Array-basierte Synthese. In einigen Ausführungsformen wird die GEn-TraCER-Kassette synthetisiert, zum Beispiel durch Array-basierte Synthese. Die Länge der Editier-Kassette und/oder GEn-TraCER-Kassette kann von den Verfahren abhängen, die zur Gewinnung der Editier-Kassette und/oder der GEn-TraCER-Kassette verwendet werden. In einigen Ausführungsformen ist die Editier-Kassette ungefähr 50–30 Nukleotide, 75–200 Nukleotide, oder zwischen 80–120 Nukleotide lang. In einigen Ausführungsformen ist die GEn-TraCER-Kassette ungefähr 50–300 Nukleotide, 75–200 Nukleotide, oder zwischen 80–120 Nukleotide lang.
  • In einigen Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren auch Erhalten der GEn-TraCER-Kassetten, zum Beispiel durch Array-basierte Synthese, und Konstruieren des Vektors. Verfahren zum Konstruieren eines Vektors werden dem Durchschnittsfachmann bekannt sein und können Ligieren der GEn-TraCER-Kassette in einen Vektor beinhalten. In einigen Ausführungsformen werden die GEn-TraCER-Kassetten oder eine Untergruppe (Pool) der GEn-TraCER-Kassetten vor der Konstruktion des Vektors amplifiziert, zum Beispiel durch PCR.
  • Die Zelle oder die Population von Zellen, die den Vektor umfasst, und auch für Cas9 codiert, wird unter Bedingungen Aufrechterhalten oder kultiviert, unter denen Cas9 exprimiert wird. Die Cas9-Expression kann kontrolliert werden. Die hierin beschriebenen Verfahren können aufrechterhalten der Zellen unter Bedingungen beinhalten, unter denen Cas9-Expression aktiviert wird, was zur Herstellung von Cas9 führt. Spezifische Bedingungen, unter denen Cas9 exprimiert wird, werden von Faktoren abhängen, wie beispielsweise der Natur des Promotors, der verwendet wird, um Expression Cas9 zu regulieren. In einigen Ausführungsformen wird die Cas9-Expression in der Anwesenheit eines Induktormoleküls, wie beispielsweise Arabinose, induziert. Cas9-Expression tritt auf, wenn die Zelle oder die Population von Zellen, die die für Cas9-codierende DNA umfasst, sich in der Anwesenheit des Induktormoleküls befinden. In einigen Ausführungsformen wird Cas9-Expression in der Gegenwart eines Repressormoleküls unterdrückt. Expression von Cas9 tritt auf, wenn die Zelle oder die Population von Zellen, die die für Cas9-codierende DNA umfasst, sich in der Abwesenheit eines Moleküls befindet, das die Expression von Cas9 unterdrückt.
  • Die Zellen der Population von Zellen, die lebensfähig bleiben, werden erhalten oder von den Zellen getrennt, die als eine Folge von Cas9-vermittelter Tötung nicht-editierten Zelltod durchlaufen; dies kann beispielsweise durchgeführt werden durch Ausbreiten der Population von Zellen auf einer Kulturoberfläche, Wachsen lassen der lebensfähigen Zellen, die dann zur Beurteilung zur Verfügung stehen.
  • Die gewünschte Mutation, die an die PAM-Mutation gekoppelt ist, ist verfolgbar unter Verwendung des GEn-TraCER-Verfahrens durch Sequenzieren der Editier-Kassette auf dem Vektor in lebensfähigen Zellen (Zellen, die die PAM-Mutation integrieren) von der Population. Dies ermöglicht eine einfache Identifizierung der Mutation, ohne dass das Genom der Zelle sequenziert werden muss. Die Verfahren beinhalten Sequenzieren der Editier-Kassette, um die Mutation eines oder mehrerer Codons zu identifizieren. Sequenzieren der Editier-Kassette kann als ein Bestandteil des Vektors erfolgen oder nach der Trennung des Vektors und gegebenenfalls Amplifikation, durchgeführt werden. Sequenzieren kann unter Verwendung jeglicher in der Technik bekannter Sequenzier-Verfahren durchgeführt werden, wie beispielsweise durch Sanger-Sequenzieren.
  • Die hierin beschriebenen Verfahren können in jedem Zelltyp durchgeführt werden, in dem das CRISPR-System funktionieren kann (z. B. DNA anzielen und schneiden), umfassend prokaryotische und eukaryotische Zellen. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle eine bakterielle Zelle, wie beispielsweise Escherichia spp. (z. B., E. coli). In anderen Ausführungsformen ist die Zelle eine Pilzzelle, wie beispielsweise eine Hefezelle, z. B. Saccharomyces spp. In anderen Ausführungsformen ist die Zelle eine Algenzelle, eine Pflanzenzelle, eine Insektenzelle, oder eine Säugerzelle, umfassend eine humane Zelle.
  • Ein „Vektor” ist jede Art von Nukleinsäure, die eine gewünschte Sequenz oder Sequenzen umfasst, die an eine Zelle geliefert oder darin exprimiert werden sollen. Die gewünschte Sequenz(en) kann in einen Vektor eingebaut werden, beispielsweise durch Restriktion und Ligation oder durch Rekombination. Die Vektoren sind üblicherweise aus DNA zusammengesetzt, obwohl RNA-Vektoren ebenfalls erhältlich sind. Vektoren umfassen, aber sind nicht beschränkt auf: Plasmide, Fosmide, Phagemide, Virus-Genome und künstliche Chromosomen.
  • Vektoren, die in dem GEN-TraCER-Verfahren nützlich sind, umfassen mindestens eine wie hierin beschriebene Editier-Kassette, einen Promotor, und mindestens ein für eine gRNA codierendes Gen. In einigen Ausführungsformen ist mehr als eine Editier-Kassette (beispielsweise 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Editier-Kassetten) auf einem Vektor enthalten. In einigen Ausführungsformen ist die mehr als eine Editier-Kassette homolog zu verschiedenen Target-Regionen (z. B. gibt es verschiedene Editier-Kassetten, von denen jede zu einer anderen Target-Region homolog ist). Alternativ oder zusätzlich kann der Vektor mehr als ein Gen enthalten, das für eine gRNA codiert (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr gRNAs). In einigen Ausführungsformen enthält die mehr als eine gRNA Regionen, die komplementär zu einem Teil von verschiedenen Target-Regionen sind (z. B. gibt es verschiedene gRNAs, von denen jede zu einer anderen Target-Region homolog ist).
  • In einigen Ausführungsformen wird eine eine GEn-TraCER-Kassette, die mindestens eine Editier-Kassette, einen Promoter und ein Gen umfasst, das für einen Teil einer gRNA codiert, in einen Vektor ligiert, der für einen anderen Teil einer gRNA codiert. Nach der Ligation ist der Teil der gRNA der GEn-TraCER-Kassette und der andere Teil der gRNA ligiert und bildet eine funktionelle gRNA.
  • Der Promotor und das für die gRNA codierende Gen sind operativ verknüpft. In einigen Ausführungsformen umfassen die Verfahren Einführen eines zweiten Vektors, der für Cas9 codiert. In solchen Ausführungsformen kann der Vektor weiter einen oder mehrere Promotoren umfassen, die operativ an ein Gen verknüpft sind, das für Cas9 codiert. Wie hierin verwendet, bedeutet „operativ” verknüpft, dass der Promotor die Transkription der DNA bewirkt oder reguliert, die für ein Gen codiert, wie beispielsweise das Gen, das für die gRNA codiert oder das Gen, das für Cas9 codiert. Der Promotor kann ein nativer Promotor sein (ein Promoter, der in der Zelle, in die der Vektor eingeführt wird, vorliegt). In einigen Ausführungsformen ist der Promotor ein induzierbarer oder reprimierbarer Promotor (der Promotor wird reguliert, um eine induzierbare oder reprimierbare Transkription eines Gens zu ermöglichen, wie beispielsweise des Gens, das für die gRNA codiert oder des Gens, das für Cas9 codiert), wie beispielsweise Promotoren, die durch die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Moleküls reguliert werden (z. B. ein Induktor oder ein Repressor). Die Art des Promotors, der für die Expression der gRNA benötigt wird, kann basierend auf den Spezien oder Zelltypen variieren und wird von einem Fachmann erkannt werden.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren Einführen eines separaten für Cas9 codierenden Vektors in die Zelle oder Population von Zellen vor oder gleichzeitig mit dem Einführen des Vektors, der mindestens eine wie hierin beschriebene Editier-Kassette, einen Promotor und mindestens eine gRNA umfasst. In einigen Ausführungsformen wird das für Cas9 codierende Gen in das Genom der Zelle oder Population von Zellen integriert. Die Cas9-codierende DNA kann vor dem Einführen des Vektors, der mindestens eine wie hierin beschriebene Editier-Kassette, einen Promotor, und mindestens eine gRNA umfasst, oder nach dem Einführen des Vektors, der mindestens eine wie hierin beschriebene Editier-Kassette, einen Promotor, und mindestens eine gRNA umfasst, in das zelluläre Genom integriert werden. Alternativ kann ein Nukleinsäuremolekül, wie beispielsweise eine für Cas9-codierende DNA, von der in das Genom integrierten DNA exprimiert werden. In einigen Ausführungsformen wird das für Cas9 codierende Gen in das Genom der Zelle integriert.
  • Vektoren, die für die hierin beschriebenen GEn-TraCER-Verfahren nützlich sind, können weiter eines Spacer-Sequenz, zwei oder mehr Priming-Stellen oder sowohl eine Spacer-Sequenz als auch zwei oder mehr Priming-Stellen umfassen. In einigen Ausführungsformen ermöglicht die Anwesenheit der Priming-Stellen, die die GEn-TraCER-Kassette flankieren, Amplifikation der Nukleinsäuresequenzen der Editier-Kassette, des Promotors und der gRNA.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Verwendung des CARPE-Verfahrens um galK zu editieren
  • Der CARPE-Ansatz wurde auf dem Galactokinase Gen, galK, in dem E. coli Genom durchgeführt; es gibt viele verfügbare Assays, um die Aktivität des Genprodukts zu untersuchen. Diese Experimente wurden unter Verwendung des E. coli BW23115 Elternstamms und dem pSIM5 Vektor (Datta et al. Gene (2008) 379: 109–115) durchgeführt, um Recombineering zu vermitteln. Das für Cas9-codierende Gen wurde unter Kontrolle eines pBAD-Promotors in das pBTBX-2-Rückgrat kloniert, um die Kontrolle der Cas9-Spaltungsaktivität durch Zugabe von Arabinose zu dem Kulturmedium zu ermöglichen.
  • Zunächst wurde die Fähigkeit getestet selektiv synthetische dsDNA-Kassetten (127 bp) einzubauen. Die synthetischen dsDNA-Kassetten stammen aus NNR-Bibliotheken, die aus degenerierten Primern oder aus rational entworfenen Oligos konstruiert wurden, die als Teil einer Bibliothek mit 27.000 Mitgliedern mittels Microarray-Technologie synthetisiert wurden. In beiden Fällen wurden die Oligonukleotide entworfen, um die Reste des aktiven Zentrums des galK Genprodukts zu mutieren, als auch die synthetische Priming-Stelle, P1 (SEQ ID NO: 1) zu enthalten. Die hocheffiziente Rückgewinnung der Donorstamm-Bibliotheken wurde basierend auf den Änderungen der Amplicongrößen verifiziert, die durch Kolonie-PCR mit Primern gegen den galK Locus erhalten wurden. Sequenzieren dieser Kolonie-PCR-Produkte aus den NNR-Bibliotheken wies darauf hin, dass die synthetische Priming-Stelle (P1) aus den dsDNA-Kassetten mit einer Effizienz von ungefähr 90–100% eingebaut wurde (2). Dieses überraschende und unerwartete Ergebnis deutet darauf hin, dass Bibliotheken mit hoher Effizienz erzeugt werden können, ohne auf die fehleranfälligen mutS Knockout-Stämme angewiesen zu sein, die typischerweise in anderen Recombineering-basierten Editier-Ansätzen verwendet worden sind (Costantino et al. PNAS (2003) 100: 15748–15753; Wang et al. Nature (2009) 460: 894–898). Jedoch gab es einen Rückgang in der Effizienz der Codon-Mutationen (ungefähr 20%), der auf eine Korrektur durch MutS während dem allelischen Austausch zurückzuführen sein kann. In dieser Arbeit betrug die endgültige Codon-Editier-Effizienz ungefähr 10% wenn beide Phasen der Konstruktion in dem mutS+-Hintergrund durchgeführt wurden.
  • Um die endgültigen Editier-Effizienzen und die Allgemeingültigkeit des CARPE-Verfahrens zu erhöhen, kann die Donor-Konstruktion in mutS-defizienten Stämmen vor dem Transferieren in einen mutS+-Donor Stamm durchgeführt werden, in der Bemühungen den Verlust von Mutationen während der Donor-Konstruktionsphase zu verhindern.
  • Beispiel 2: Verwendung des CARPE-Verfahren, um essenzielle Gene anzuzielen
  • Um die Allgemeingültigkeit des CARPE-Ansatzes zu testen, wurde das oben beschriebene Verfahren auf eine Reihe essenzieller Gene angewendet, umfassend dxs, metA, und folA. Essenzielle Gene können unter Verwendung der gRNA-Designstrategien angezielt werden (3).
  • Daten aus CARPE-Experimenten, die das dxs Gen anzielen, legen auch nahe, dass trotz der Genzerstörung, die während der Erzeugung der Donor-Bibliothek auftritt, es möglich ist, die Donor-Bibliotheken effektiv zu konstruieren und innerhalb von 1–3 Stunden nach dem Recombineering wiederzugewinnen.
  • Beispiel 3: Verwendung des CARPE-Verfahrens, um die Produktion von Isopentenol zu modulieren.
  • Die Jagd nach besseren Treibstoffen für die industrielle Fertigung mittels bakterieller Produktion erfordert die Fähigkeit State-of-the-Art Genom-Design, Engineering, und Screenen für das gewünschte Produkt durchführen zu können. Wir haben bereits die Fähigkeit nachgewiesen, die Expressionslevel jedes Gens in dem E. Coli Genom zu modifizieren (Warner et al. Nat. Biotechnol (2010) 28: 856–862). Dieses Verfahren, genannt verfolgbares Multiplex Recombineering (engl.: trackable multiplex recombineering, TRMR), erzeugt eine Bibliothek von ungefähr 8000 genomisch-modifizierten Zellen (~4000 überexprimierte Gene und ~4000 knock-down Gene). Diese Bibliothek wurde später unter verschiedenen Bedingungen gescreent, was ein tieferes Verständnis der Aktivitäten der Genprodukte ermöglichte und unter diesen Selektionen zu leistungsfähigeren Stämmen führte. TRMR ermöglicht die Modifikation der Proteinexpression auf zwei Ebenen (überexprimiert und knock-down), aber es ermöglichte nicht die Modifikation des offenen Leserahmens (engl. open reading frame; ORF). Hier wollen wir große Bibliotheken von ORF-Modifikationen erzeugen und ganze Stoffwechselwege für die optimale Produktion von Biokraftstoffen konstruieren.
  • Eine Hauptschwierigkeit bei der Produktion solcher Bibliotheken, die (im Gegensatz zu zufälliger Mutagenese) rational entworfen werden, ist die Insertionseffizienz der gewünschten Mutationen in die Target-Zellen. Beim Recombineering, dem kanonischen Verfahren für Genom-Modifikationen in E. coli, werden rekombinante Gene des Lambda Phagen verwendet, um die Insertion fremder DNA in das Wirtsgenom zu erleichtern. Jedoch leidet dieser Prozess an geringen Effizienzen und kann entweder durch Zugabe eines antibiotischen Resistenzgens, gefolgt von Selektion (wie in TRMR), oder durch rekursives Veranlassen von Rekombinationsereignissen überwunden werden (d. h. durch MAGE (Wang et al. Nature (2008) 460: 894–898). Das hierin beschriebene CARPE-Verfahren erhöht die Recombineeringseffizienz durch Einbeziehen der Verwendung des CRISPR-Systems, wodurch alle nicht-rekombinanten Zellen aus der Population entfernt werden. CRISPR ist ein kürzlich entdeckter RNA-basierter, adaptiver Abwehrmechanismus von Bakterien und Archaea gegen eindringende Phagen und Plasmide (Bhaya et al. Ann. Rev. of Genetics (2011) 45: 273–297). Dieses System durchlief massives Engineering, um sequenz-gerichtete Doppelstrangbrüche unter Verwendung von zwei Plasmiden zu ermöglichen; ein Plasmid codiert für die CRISPR-assoziierte Nuklease Cas9 und das zweite Plasmid codiert für die sequenz-spezifische Guide-RNA (gRNA), die Cas9 an seine einzigartige Lage führt (Qi et al. Cell (2013) 45: 273–297). Das CARPE-Verfahren nutzt die Fähigkeit des CRISPR Systems in einer Sequenz-abhängigen Art und Weise Doppelstrangbrüche, und infolgedessen den Zelltod zu induzieren. Wir produzieren DNA-Recombineering-Kassetten, die zusätzlich zu der gewünschten Mutation innerhalb des ORFs, eine Mutation an einem gemeinsamen Ort außerhalb des offenen Leserahmens des Gens beinhalten, der durch die CRISPR-Maschinerie angezielt wird. Dieser Ansatz der Verknüpfung/Kopplung der gewünschten Mutationen mit der Vermeidung von CRISPR-vermitteltem Tod, aufgrund der PAM Mutation/Deletion ermöglicht eine dramatische Anreicherung manipulierter Zellen innerhalb der gesamten Population von Zellen.
  • Das Verfahren wurde weiter unter Verwendung des DXS-Wegs demonstriert. Der DSX-Weg führt zu Produktion von Isopentenyl-Pyrophosphat (IPP), das zur Biosynthese von Terpenen und Terpenoiden führt. Interessanterweise kann IPP auch der Vorläufer von Lycopin und Isopentenol sein, die Zugabe der benötigten Gene vorausgesetzt. Während Lycopin die Bakterienkolonien rot färbt, und daher einfach screenbar ist, wird Isopentenol als ein Biokraftstoff der ,zweiten Generation' mit einer höheren Energiedichte und einer geringeren Wassermischbarkeit als Ethanol betrachtet. Es wurden drei Proteine zum Engineering ausgewählt: 1) DSX, das erste und das geschwindigkeitsbegrenzende der Enzym des Weges, 2) IspB, das den metabolischen Fluss aus dem DXS-Weg umleitet, und 3) NudF, für das gezeigt wurde, dass es IPP sowohl in E. coli als auch B. subtilis in Isopentenol umsetzt (Withers et al. App. Environ. Microbiol (2007) 73: 6277–6283; Zheng et al. Biotechnol. for biofuels (2013) 6: 57). Die Mutationen in den Genen, die für DXS und IspB codieren, werden mit einem neuen Bildanalysewerkzeug, das für die Quantifizierung der Koloniefarbe entwickelt wurde, auf erhöhte Lycpon Produktion gescreent. Die NudF-Aktivität wird direkt durch Messen der Isopentenol-Spiegel durch GC/MS und indirekt durch Isopentenol-auxotrophe Zellen gemessen, die als Biosensoren dienen werden. Dieses Verfahren bietet die Möglichkeit mit hoher Genauigkeit und Effizienz große Mutationsbibliotheken in dem E. coli-Genom und einem Stamm, der hohe Ausbeuten an Isopentenol erzeugt, rational zu konstruieren.
  • Beispiel 4: Verwendung des GEn-TraCER-Verfahrens, um galK zu ändern
  • Das GEn-TraCER-Verfahren wurde verwendet, um das galK-Gen zu editieren, welches als ein Modelsystem für Recombineering in E. coli gedient hat (Vu et al. 2000). Die ersten konstruierten GEn-TraCER-Kassetten wurden so entworfen, dass sie ein Stopp-Codon anstelle eines PAMs im Leseraster am Codon 24 des galK einführen, bezeichnet als galK_Q24 (12). Die Konstrukte und Vektoren wurden unter Verwendung eines benutzerdefinierten Python-Skripts zur Erzeugung der erforderlichen Mutationen in hohem Durchsatz entworfen.
  • Kontroll-Kassetten wurden unter Verwendung des zirkulären Polymerase-Klonier-Verfahrens (engl. Polymerase cloning, OPEC) in den durch Qi et al. Cell (2013) beschriebenen gRNA-Vektor kloniert. Das Rückgrat wurde mit den folgenden Primern linearisiert: CCAGAAATCATCCTTAGCGAAAGCTAAGGAT (SEQ ID NO: 29) und GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCT (SEQ ID NO: 30).
  • Die GenTRACER-Kassetten wurden als gBlocks bestellt und unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert: ATCACGAGGCAGAATTTCAGATAAAAAAAATCCTTAGCTTTCGCTAAGGATGATTTCTGG (SEQ ID NO: 31), ACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC (SEQ ID NO: 32).
  • Die Bestandteile wurden unter Verwendung von OPEC zusammengefügt und in E. coli transformiert, um die Vektoren zu erzeugen. Diese Prozedur ist in multiplex unter Verwendung der gepoolten Oligonukleotid-Bibliotheken mit Klonierungseffizienzen im Bereich von 104–105 CFU/μg durchzuführen.
  • E. coli MG1655 Zellen, die pSIM5 (Lambda-RED Plasmid) und das X2-cas9 Plasmid tragen, wurden bei 30°C in LB mit 50 μg/mL Kanamycin und 34 μg/mL Chloramphenicol bis zur mittleren log-Phase (0.4–0.7 OD) gezüchtet. Die Recombineering-Funktionen des pSIM5-Vektor wurden bei 42°C für 15 min induziert und anschließend für 10 min auf Eis gestellt. Die Zellen wurden dann durch Pelletieren und 2-maliges Waschen mit 10 mL gekühltem H2O elektrokompetent gemacht. Die Zellen wurden mit 100 ng eines GEn-TraCER Plasmids (das auch für eine Carbenicillin-Resistenz codiert) transformiert und erholten sich für 3 Stunden bei 37°. 50–100 μL der Zellen wurden auf das geeignete Medium ausplattiert, das 50 μg/mL Kanamycin und 100 μg/ml Carbenecillin enthält, um die CRISPR-editierten Stämme selektiv anzureichern. Editier-Effizienzen für das galK Gen wurden unter Verwendung eines rotweiß-Screenings auf mit Galaktose supplementiertem MacConkey Agar berechnet.
  • Basierend auf einem Screening auf MacConkey Agar wurden Editier-Effizienzen von ~100% mit dem galK_Q24* Design beobachtet. Interessanterweise gab es, im Gegensatz zu Oligo-vermittelten Recombineering-Verfahren, die Mismatch-Repair-Knockouts benötigen, um hohe Effizienzen zu erzielen (Li et al. 2003; Sawitzke et al. 2011; Wang et al. 2011), keinen Effekt in Stämmen mit oder ohne intakter Mismatch-Reparatur-Maschinerie.
  • Die Sequenzen der Chromosomen und Vektoren wurden anschließend durch Sanger-Sequenzieren verifiziert.
  • Wie erwartet, wurden die entworfenen Mutationen auf dem Chromosom (13) gespiegelt, was darauf hindeutet, dass die Mutation an beiden Orten vorhanden war und dass das Plasmid als transagierende Barcode (trans-Barcode) oder als Aufzeichnung der Genomänderung dient.
  • Das Design wurde für rationale Mutagenese von Protein-codierenden Rastern auf einer genomweiten Skala adaptiert, durch Erzeugen ”stiller, selektierbarer Narben”, die aus synonymen PAM-Mutationen (14B, ΔPAM) bestehen, um die Zellen gegen Cas9-vermittelte Spaltung zu „immunisieren”, aber das Translationsprodukt intakt lassen. Wir schlussfolgerten, dass die stillen Narben eine Co-Selektion auf nahegelegene Änderungen an einem Codon oder anderen Merkmalen von Interesse mit hoher Effizienz erlauben. Die Wirkungen der Armlänge der Homologie und des Abstands zwischen der PAM-Mutation/Deletion und der gewünschten Mutation in galK wurden untersucht und die Effizienzen verglichen (16B). Es wurde ein signifikanter Anstieg in der Mutationseffizienz an der galK Position 145 beobachtet, wenn die Armlänge der Homologie auf 80 bis 100 Nukleotide (~5% bzw. 45%) mit identischen PAM-Änderungen verlängert wurde.
  • Beispiel 5: Verwendung des GEn-TraCER-Verfahrens, um Mutationen zu rekonstruieren
  • Der GEn-TraCER-Ansatz wurde unter Verwendung einer benutzerdefinierten, automatisierten Design-Software auf einen genomischen Maßstab ausgeweitet, die an Targets der Stellen in dem Genom mit einer einfachen Benutzer-Eingabefunktion ermöglicht. Dieser Ansatz wurde durch Rekonstruieren aller nicht-synonymen Punktmutationen einer kürzlich veröffentlichten Studie über die thermale Adaption in E. coli (Tenaillon et al. 2012) getestet. Diese Studie charakterisierte den kompletten Satz von Mutationen, die in 115 Isolaten von unabhängig vermehrten Stämmen auftraten. Dieser Datensatz stellt eine vielfältige Quelle von Mutationen bereit, deren individuelle Fitness-Effekte weiter Licht auf die mechanistische Grundlagen dieses komplexen Phänotyps werfen. Jede dieser Mutationen wurde, sofern möglich, mit einer 2-fachen Redundanz in der Codon Verwendung und ΔPAM rekonstruiert, um eine statistische Korrektur sowohl für die PAM als auch die Codon Target-Mutationen in einer nachfolgenden Fitnessanalyse zu ermöglichen.
  • Beispiel 6: Verwendung des GEn-TraCER-Verfahrens, um genetische Interaktionen zu modulieren
  • Eine Promotor-Neuverkabelungs-Bibliothek wurde durch Integrieren eines Promotors erzeugt, der dynamisch durch ein Umgebungssignal (Sauerstoffspiegel, Kohlenstoffquelle, Stress) stromaufwärts von jedem Gen in dem E. coli Genom reguliert wird. Unter Verwendung des GEn-TraCER-Verfahrens wurden Stämme mit neu-verkabelten Genotypen erzeugt, die beispielsweise für die Toleranz gegenüber Chemikalien von Interesse für die Produktion vorteilhaft sein können.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • 35 U.S.C. §119 [0001]
    • Jinek et al. Science (2012) 337 (6096): 816–821 [0043]
    • Cong et al. Science (2013) 339 (6121): 819–823 [0043]
    • DiCarlo et al. Nucleic Acids Res. (2013) 41: 4336–4343 [0043]
    • Waaijers et al. Genetics (2013) 195: 1187–1191 [0043]
    • Cong et al. Science (2013) 339 (6121): 819–823 [0043]
    • Wang et al. Cell (2013) 153: 910–918 [0043]
    • Jinek et al. Science (2012) 337 (6096): 816–821 [0043]
    • Brouns et al. Science (2008) 321: 960–964 [0043]
    • Semenova et al. PNAS (2011) 108: 10098–10103 [0043]
    • Datta et al. Gene (2008) 379: 109–115 [0050]
    • Costantino et al. PNAS (2003) 100: 15748–15753 [0050]
    • Wang et al. Nature (2009) 460: 894–898 [0050]
    • Wang et al. Nat. Methods (2012) 9: 591–593 [0051]
    • Datta et al. Gene (2008) 379: 109–115 [0072]
    • Costantino et al. PNAS (2003) 100: 15748–15753 [0073]
    • Wang et al. Nature (2009) 460: 894–898 [0073]
    • Warner et al. Nat. Biotechnol (2010) 28: 856–862 [0077]
    • Wang et al. Nature (2008) 460: 894–898 [0078]
    • Bhaya et al. Ann. Rev. of Genetics (2011) 45: 273–297 [0078]
    • Qi et al. Cell (2013) 45: 273–297 [0078]
    • Withers et al. App. Environ. Microbiol (2007) 73: 6277–6283 [0079]
    • Zheng et al. Biotechnol. for biofuels (2013) 6: 57 [0079]
    • Vu et al. 2000 [0080]
    • Qi et al. Cell (2013) [0081]
    • Li et al. 2003 [0085]
    • Sawitzke et al. 2011 [0085]
    • Wang et al. 2011 [0085]
    • Tenaillon et al. 2012 [0089]

Claims (68)

  1. Verwendung eines Vektors, umfassend: (i) mindestens eine Editier-Kassette, umfassend (a) eine Region, die homolog zu einer Target-Region einer Nukleinsäure in einer Zelle ist, (b) eine Mutation mindestens eines Nukleotids relativ zu der Target-Region, und (c) eine erste „Protospacer Adjacent Motif” (PAM) Mutation; (ii) einen Promotor; und (iii) eine Nukleinsäure, die für mindestens eine Guide-RNA (gRNA) codiert, umfassend (a) eine Region, die komplementär zu einem Teil der Target-Region ist; und (b) eine Region, die mit einer Cas9 Nuklease interagiert, zur Herstellung eines Medikaments zum Genom Engineering.
  2. Verwendung eines Vektors, umfassend: (i) mindestens eine synthetisierte Editier-Kassette, umfassend (a) eine Region, die homolog zu einer Target-Region einer Nukleinsäure in einer Zelle ist, (b) eine Mutation mindestens eines Nukleotids relativ zu der Target-Region, und (c) eine erste „Protospacer Adjacent Motif” (PAM) Mutation; (ii) einen Promotor; und (iii) eine Nukleinsäure, die für mindestens eine Guide-RNA (gRNA) codiert, umfassend: (a) eine Region, die komplementär zu einem Teil der Target-Region ist; und (b) eine Region, die mit einer Cas9 Nuklease interagiert, zur Herstellung eines Medikaments zum Genom Engineering.
  3. Verwendung eines Vektors, umfassend: (i) mindestens eine Editier-Kassette, umfassend (a) eine Region, die homolog zu einer Target-Region einer Nukleinsäure in einer Zelle ist, (b) eine Mutation mindestens eines Nukleotids relativ zu der Target-Region, und (c) eine erste „Protospacer Adjacent Motif” (PAM) Mutation, wobei die Editier-Kassette als ein Trans-Barcode für nachfolgendes Sequenzieren dient; (ii) einen Promotor; und (iii) eine Nukleinsäure, die für mindestens eine Guide-RNA (gRNA) codiert, umfassend: (a) eine Region, die komplementär zu einem Teil der Target-Region ist; und (b) eine Region, die mit einer Cas9 Nuklease interagiert, zur Herstellung eines Medikaments zum Genom Engineering.
  4. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1–3, wobei die Target-Region sich innerhalb eines Gens von Interesse innerhalb der Zelle befindet.
  5. Verwendung eines Vektors nach Anspruch 4, wobei die Mutation mindestens eines Nukleotids sich innerhalb mindestens eines Codons des Gens von Interesse befindet.
  6. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 4–5, wobei die PAM Mutation sich außerhalb des Leserahmens des Gens von Interesse befindet.
  7. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 4–6, wobei das Gen von Interesse ein prokaryotisches Gen ist.
  8. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 4–6, wobei das Gen von Interesse ein eukaryotisches Gen ist.
  9. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1–8, wobei die Mutation mindestens eines Codons sich innerhalb von 100 Nukleotiden von der PAM-Mutation befindet.
  10. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1–9, wobei die Editier-Kassette chemisch synthetisiert wurde.
  11. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1–10, wobei die Editier-Kassette durch Array-basierte Synthese synthetisiert wurde.
  12. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1–11, wobei die gRNA eine einzelne chimäre gRNA umfasst.
  13. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1–11, wobei die gRNA eine crRNA und eine trRNA umfasst.
  14. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1–13, wobei der Vektor weiter mindestens zwei Priming-Stellen umfasst.
  15. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1–14, wobei der Vektor weiter einen selektierbaren Marker umfasst.
  16. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1–15, wobei der Vektor weiter eine Nukleinsäure umfasst, die für eine Cas9 Nuklease codiert.
  17. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1–16, wobei das Genom Engineering umfasst: (a) Einführen des Vektors in eine erste Population von Zellen, wodurch eine zweite Population von Zellen hergestellt wird, die den Vektor umfasst; (b) Aufrechterhalten der zweiten Population von Zellen unter Bedingungen, unter denen Cas9 Nuklease exprimiert wird, wobei die Cas9 Nuklease auf dem Vektor codiert wird, auf einem zweiten Vektor codiert wird oder auf genomischer DNA der zweiten Population von Zellen codiert wird, wodurch eine dritte Population von Zellen hergestellt wird, die den Vektor und die Target-Region umfasst, die die PAM-Mutation umfasst; (c) Kultivieren des Produkts von (b) unter Bedingungen, die für die Lebensfähigkeit der Zelle geeignet sind, wodurch lebensfähige Zellen hergestellt werden, die eine Zielbibliothek umfassen; (d) Erhalten von lebensfähigen Zellen, die in (c) hergestellt wurden; und (e) Identifizieren der Mutation mindestens eines Nukleotids durch Sequenzieren.
  18. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1–16, wobei das Genom Engineering umfasst: (a) Einführen des Vektors in eine erste Population von Zellen, wodurch eine zweite Population von Zellen hergestellt wird, die den Vektor umfasst; (b) Aufrechterhalten der zweiten Population von Zellen unter Bedingungen, unter denen Cas9 Nuklease exprimiert wird, wobei die Cas9 Nuklease auf dem Vektor codiert wird, auf einem zweiten Vektor codiert wird oder auf genomischer DNA der zweiten Population von Zellen codiert wird, wodurch eine dritte Population von Zellen hergestellt wird, die den Vektor und die Target-Region umfasst, die die PAM-Mutation umfasst; (c) Screenen oder Selektieren auf Zellen mit einem Phänotypen von Interesse; und (d) Identifizieren der Mutation mindestens eines Nukleotids durch Sequenzieren.
  19. Verwendung eines Vektors nach Anspruch 17 oder 18, wobei Sequenzieren Sequenzieren der Editier-Kassette des Vektors umfasst.
  20. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1–16, wobei das Genom Engineering umfasst: (a) Einführen des Vektors in eine erste Population von Zellen, wodurch eine zweite Population von Zellen hergestellt wird, die den Vektor umfasst; (b) Aufrechterhalten der zweiten Population von Zellen unter Bedingungen, unter denen Cas9 Nuklease exprimiert wird, wobei die Cas9 Nuklease auf dem Vektor codiert wird, auf einem zweiten Vektor codiert wird oder auf genomischer DNA der zweiten Population von Zellen codiert wird, wodurch eine dritte Population von Zellen hergestellt wird, die den Vektor und die Target-Region umfasst, die die PAM-Mutation umfasst; (c) Kultivieren des Produkts von (b) unter Bedingungen, die für die Lebensfähigkeit der Zelle geeignet sind, wodurch lebensfähige Zellen hergestellt werden, die eine Ziel-Bibliothek enthalten; (d) Erhalten von lebensfähigen Zellen, die in (c) hergestellt wurden; und (e) Identifizieren der Mutation mindestens eines Nukleotids durch Sequenzieren der Editier-Kassette des Vektors.
  21. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1–16, wobei das Genom Engineering umfasst: (a) Einführen des Vektors in eine erste Population von Zellen, wodurch eine zweite Population von Zellen hergestellt wird, die den Vektor umfasst; (b) Aufrechterhalten der zweiten Population von Zellen unter Bedingungen, unter denen Cas9 Nuklease exprimiert wird, wobei die Cas9 Nuklease auf dem Vektor codiert wird, auf einem zweiten Vektor codiert wird oder auf genomischer DNA der zweiten Population von Zellen codiert wird, wodurch eine dritte Population von Zellen hergestellt wird, die den Vektor und die Target-Region umfasst, die die PAM-Mutation umfasst; (c) Screenen oder Selektieren auf Zellen mit einem Phänotypen von Interesse; und (d) Identifizieren der Mutation mindestens eines Nukleotids durch Sequenzieren der Editier-Kassette des Vektors.
  22. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 17–21, wobei Genom Engineering weiter Cas-9 induzierten Zelltod von Zellen umfasst, die die PAM-Mutation nicht umfassen.
  23. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 17–22, wobei die Zellen prokaryotische Zellen sind.
  24. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 17–22, wobei die Zellen eukaryotische Zellen sind.
  25. Verwendung eines Vektors nach Anspruch 24, wobei die Zellen Hefe-, Algen-, Pflanzen- oder Säugerzellen sind.
  26. Verwendung einer Vektorbibliothek zur Herstellung eines Medikaments zum Genom Engineering, wobei die Vektorbibliothek mindestens zwei Vektoren wie in einem der Ansprüche 1–16 definiert, umfasst.
  27. Verwendung einer Vektorbibliothek nach Anspruch 26, wobei die Vektorbibliothek erzeugt ist durch ein Verfahren umfassend: Bereitstellen einer Vielzahl von synthetisierten Editier-Oligonukleotiden, von denen jedes jeweils (a) eine Region, die homolog zu einer Target-Region einer Nukleinsäure in einer Zelle ist, (b) eine Mutation mindestens eines Nukleotids relativ zu der Target-Region, und (c) eine temporäre „Protospacer Adjacent Motif” (PAM) Mutation umfasst, Transformieren der Vielzahl von synthetisierten Editier-Oligonukleotiden und einer ersten Guide-RNA in eine Population von Zellen, die die Target-Region umfasst, Aufrechterhalten der Zellen unter Bedingungen, unter denen Cas9 Nuklease exprimiert wird, wobei die Cas9 Nuklease auf genomischer DNA innerhalb der Zelle codiert wird oder auf einem Polynukleotid codiert wird, das in die Zellen transformiert wird, Anreichern der Zellen, die die temporäre PAM-Mutation umfassen, wodurch eine Donor-Bibliothek erzeugt wird, die Target-Regionen umfasst, die die Mutation in mindestens einem Nukleotid und die temporäre PAM-Mutation umfasst, Amplifizieren der Donor-Bibliothek, um eine erste PAM-Mutation einzubauen, wodurch eine amplifizierte Donor-Bibliothek erzeugt wird, die eine mutierte Target-Region und die erste PAM-Mutation umfasst, Einbauen einer Nukleinsäure, die für mindestens eine Guide-RNA und mindestens einen Promotor codiert, in die Polynukleotide der Donor-Bibliothek, wodurch die Vektor-Bibliothek erzeugt wird.
  28. Verwendung einer Vektorbibliothek nach Anspruch 27, wobei der Anreicherungsschritt Cas9-induzierten Zelltod von Zellen umfasst, die die temporäre PAM-Mutation nicht umfassen.
  29. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–28, wobei die Zellen prokaryotische Zellen sind.
  30. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–28, wobei die Zellen eukaryotisches Zellen sind.
  31. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–30, wobei die erste gRNA auf einem Plasmid codiert wird.
  32. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–31, wobei die synthetisierten Editier-Oligonukleotide und die gRNA sequentiell in die erste Zelle eingeführt werden.
  33. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–31, wobei die synthetisierten Editier-Oligonukleotide und die gRNA gleichzeitig in die erste Zelle eingeführt werden.
  34. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–33, wobei jede beliebige der gRNAs eine eine einzelne chimäre gRNA umfasst.
  35. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–33, wobei jede beliebige der gRNAs eine crRNA und eine trRNA umfasst.
  36. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–35, wobei die Cas9 Nuklease unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors exprimiert wird.
  37. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–36, wobei die erste PAM-Mutation stromabwärts von dem Gen von Interesse liegt.
  38. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–36, wobei die erste PAM-Mutation stromaufwärts von dem Gen von Interesse liegt.
  39. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–38, wobei die Mutation mindestens eines Nukleotids sich innerhalb von 100 Nukleotiden von der temporären PAM-Mutation befindet.
  40. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–39, wobei die Mutation mindestens eines Nukleotids sich innerhalb von 100 Nukleotiden von der ersten PAM-Mutation befindet.
  41. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–40, wobei die temporäre PAM-Mutation sich in der Nähe des 5'-Terminus der Editier-Oligonukleotide befindet.
  42. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–40, wobei die temporäre PAM-Mutation sich in der Nähe des 3'-Terminus der Editier-Oligonukleotide befindet.
  43. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–42, wobei die Target-Region sich in einem Gen von Interesse in der Zelle befindet.
  44. Verwendung einer Vektorbibliothek nach Anspruch 43, wobei die Mutation mindestens eines Nukleotids sich innerhalb mindestens eines Codons des Gens von Interesse befindet.
  45. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 43–44, wobei die temporäre PAM-Mutation sich außerhalb eines Leserahmens des Gens von Interesse befindet.
  46. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 43–45, wobei erste PAM-Mutation sich außerhalb eines Leserahmens des Gens von Interesse befindet.
  47. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–42, wobei die synthetisierten Editier-Oligonukleotide verschiedene Mutationen innerhalb der gleichen Target-Region umfassen.
  48. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–42, wobei die synthetisierten Editier-Oligonukleotide verschiedene Mutationen innerhalb verschiedener Target-Region umfassen.
  49. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–48, wobei die synthetisierten Editier-Oligonukleotide durch Array-basierte Synthese synthetisiert und gegebenenfalls amplifiziert werden.
  50. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–49, wobei die synthetisierten Editier-Oligonukleotide rational entworfen werden.
  51. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–50, wobei die Mutation mindestens eines Oligonukleotids eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen, oder Insertionen relativ zu der Target-Region umfasst.
  52. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–51, wobei die Nukleinsäure, die für mindestens eine Guide-RNA und einen Promotor codiert, durch Ligations-basiertes Klonieren in die Polynukleotide der Donor-Bibliothek eingebaut wird.
  53. Verwendung einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 27–51, wobei die Nukleinsäure, die für mindestens eine Guide-RNA und einen Promotor codiert, durch Ligations-freies Klonieren in die Polynukleotide der Donor-Bibliothek eingebaut wird.
  54. Verwendung einer Zelle zur Herstellung eines Medikaments zum Genom Engineering, wobei die Zelle einen Vektor wie in einem der Ansprüche 1–16 definiert umfasst.
  55. Verwendung einer Zellbibliothek zur Herstellung eines Medikaments zum Genom Engineering, wobei die Zellbibliothek eine Vektorbibliothek wie in einem der Ansprüche 26–53 definiert umfasst.
  56. Verwendung einer Zelle, umfassend (a) eine Nukleinsäure, die eine Target-Region umfasst, (b) einen Vektor, umfassend (i) mindestens eine Editier-Kassette, umfassend (a) eine Region, die homolog zu einer Target-Region einer Nukleinsäure in einer Zelle ist, (b) eine Mutation mindestens eines Nukleotids relativ zu der Target-Region, und (c) eine erste „Protospacer Adjacent Motif” (PAM) Mutation; (ii) einen Promotor; und (iii) eine Nukleinsäure, die für mindestens eine Guide-RNA (gRNA) codiert, umfassend (a) eine Region, die komplementär zu einem Teil der Target-Region ist; und (b) eine Region, die mit einer Cas9 Nuklease interagiert, und (c) eine Cas9 Nuklease zur Herstellung eines Medikaments zum Genom Engineering.
  57. Verwendung einer Zelle, umfassend (a) eine Nukleinsäure, die eine Target-Region umfasst, (b) einen Vektor, umfassend (i) mindestens eine synthetisierte Editier-Kassette, umfassend (a) eine Region, die homolog zu einer Target-Region einer Nukleinsäure in einer Zelle ist, (b) eine Mutation mindestens eines Nukleotids relativ zu der Target-Region, und (c) eine erste „Protospacer Adjacent Motif” (PAM) Mutation; (ii) einen Promotor; und (iii) eine Nukleinsäure, die für mindestens eine Guide-RNA (gRNA) codiert, umfassend (a) eine Region, die komplementär zu einem Teil der Target-Region ist; und (b) eine Region, die mit einer Cas9 Nuklease interagiert, und (c) eine Cas9 Nuklease zur Herstellung eines Medikaments zum Genom Engineering.
  58. Verwendung einer Zelle, umfassend (a) eine Nukleinsäure, die eine Target-Region umfasst, (b) einen Vektor, umfassend (i) mindestens eine Editier-Kassette, umfassend (a) eine Region, die homolog zu einer Target-Region einer Nukleinsäure in einer Zelle ist, (b) eine Mutation mindestens eines Nukleotids relativ zu der Target-Region, und (c) eine erste „Protospacer Adjacent Motif” (PAM) Mutation; wobei die Editier-Kassette als ein Trans-Barcode für nachfolgendes Sequenzieren dient; (ii) einen Promotor; und (iii) eine Nukleinsäure, die für mindestens eine Guide-RNA (gRNA) codiert, umfassend (a) eine Region, die komplementär zu einem Teil der Target-Region ist; und (b) eine Region, die mit einer Cas9 Nuklease interagiert, und (c) eine Cas9 Nuklease zur Herstellung eines Medikaments zum Genom Engineering.
  59. Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 56–58, wobei die Nukleinsäure weiter (a) die Mutation mindestens eines Nukleotids, und (b) eine erste „Protospacer Adjacent Motif” (PAM) Mutation umfasst.
  60. Verwendung einer Zelle nach Anspruch 59, wobei die Mutation mindestens eines Nukleotids durch Sequenzieren der Editier-Kassette des Vektors identifiziert wird.
  61. Verwendung einer Population von Zellen zur Herstellung eines Medikaments zum Genom Engineering, wobei die Population von Zellen eine Vielzahl von Zellen wie in einem der Ansprüche 56–60 definiert umfasst.
  62. Verwendung einer Population von Zellen nach Anspruch 61, umfassend eine Mutanten-Bibliothek, wobei jede Zelle der Mutanten-Bibliothek eine Nukleinsäure umfasst, die (a) eine Target-Region, (b) eine Mutation mindestens eines Nukleotids innerhalb der Target-Region relativ zu einer Wildtyp-Target-Region, wodurch eine Target-Region-Variante erzeugt wird, und (c) eine PAM-Mutation umfasst.
  63. Verwendung einer Population von Zellen nach Anspruch 62, wobei die Mutanten-Bibliothek rational entworfene Mutationen in mindestens einem Gen von Interesse umfasst.
  64. Verwendung einer Population von Zellen nach Anspruch 63, wobei das mindestens eine Gen von Interesse ein prokaryotisches Gen ist.
  65. Verwendung einer Population von Zellen nach Anspruch 63, wobei das mindestens eine Gen von Interesse ein eukaryotisches Gen ist.
  66. Verwendung einer Population von Zellen nach einem der Ansprüche 62–65, wobei die Mutanten-Bibliothek Target-Region-Varianten eines Gens von Interesse umfasst.
  67. Verwendung einer Population von Zellen nach einem der Ansprüche 62–65, wobei die Mutanten-Bibliothek Target-Region-Varianten mindestens eines Gens von Interesse umfasst.
  68. Verwendung einer Population von Zellen nach einem der Ansprüche 62–65, wobei die Mutanten-Bibliothek Target-Region-Varianten mindestens zweier Gene von Interesse umfasst.
DE212015000061.3U 2014-02-11 2015-02-11 CRISPR-ermöglichtes Multiplex Genom Engineering Active DE212015000061U1 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461938608P 2014-02-11 2014-02-11
US61/938,608 2014-02-11
PCT/US2015/015476 WO2015123339A1 (en) 2014-02-11 2015-02-11 Crispr enabled multiplexed genome engineering

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE212015000061U1 true DE212015000061U1 (de) 2017-09-03

Family

ID=53800598

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE212015000061.3U Active DE212015000061U1 (de) 2014-02-11 2015-02-11 CRISPR-ermöglichtes Multiplex Genom Engineering

Country Status (22)

Country Link
US (16) US10266849B2 (de)
EP (4) EP3985114A1 (de)
JP (3) JP2017505145A (de)
KR (3) KR102496984B1 (de)
CN (2) CN106164271B (de)
AU (2) AU2015217208B2 (de)
CA (3) CA3161903A1 (de)
CY (1) CY1123115T1 (de)
DE (1) DE212015000061U1 (de)
DK (1) DK3105328T3 (de)
ES (1) ES2802984T3 (de)
GB (1) GB2544382B (de)
HR (1) HRP20201040T1 (de)
HU (1) HUE049634T2 (de)
IL (2) IL246951B (de)
LT (1) LT3105328T (de)
MX (1) MX2016010285A (de)
PL (1) PL3105328T3 (de)
PT (1) PT3105328T (de)
RS (1) RS60492B1 (de)
SI (1) SI3105328T1 (de)
WO (1) WO2015123339A1 (de)

Families Citing this family (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013066438A2 (en) 2011-07-22 2013-05-10 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
BR112015026197B1 (pt) 2013-04-16 2022-12-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc Método para modificação marcada de um lócus genômico de interesse em uma célula de rato pluripotente
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
LT3066201T (lt) 2013-11-07 2018-08-10 Editas Medicine, Inc. Su crispr susiję būdai ir kompozicijos su valdančiomis grnr
RU2685914C1 (ru) 2013-12-11 2019-04-23 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы и композиции для направленной модификации генома
US20150165054A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting caspase-9 point mutations
CN106164271B (zh) 2014-02-11 2020-06-02 科罗拉多州立大学董事会（法人团体） Crispr支持的多路基因组工程化
GB201406968D0 (en) 2014-04-17 2014-06-04 Green Biologics Ltd Deletion mutants
GB201406970D0 (en) * 2014-04-17 2014-06-04 Green Biologics Ltd Targeted mutations
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
CA3168241A1 (en) * 2015-07-15 2017-01-19 Rutgers. The State University of New Jersey Nuclease-independent targeted gene editing platform and uses thereof
EP3365461B1 (de) * 2015-10-22 2020-10-14 Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) Endonuklease-barcoding
EP3365357B1 (de) 2015-10-23 2024-02-14 President and Fellows of Harvard College Entwickelte cas9-proteine für geneditierung
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
US11293029B2 (en) 2015-12-07 2022-04-05 Zymergen Inc. Promoters from Corynebacterium glutamicum
WO2017106251A1 (en) * 2015-12-14 2017-06-22 President And Fellows Of Harvard College Cas discrimination using tuned guide rna
CN108431226A (zh) * 2016-01-15 2018-08-21 阿斯利康(瑞典)有限公司 基因修饰测定
EP3219799A1 (de) 2016-03-17 2017-09-20 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Bedingte crispr-sgrna-expression
WO2017214615A1 (en) * 2016-06-10 2017-12-14 President And Fellows Of Harvard College Library-scale engineering of metabolic pathways
EP3473728B1 (de) * 2016-06-15 2021-10-20 Toolgen Incorporated Verfahren zum screening von gezielten genetischen scheren unter verwendung eines mehrfachzielsystems mit on-target- und off-target-aktivität und verwendung davon
US11293021B1 (en) 2016-06-23 2022-04-05 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
AU2017280353B2 (en) 2016-06-24 2021-11-11 Inscripta, Inc. Methods for generating barcoded combinatorial libraries
US10544390B2 (en) 2016-06-30 2020-01-28 Zymergen Inc. Methods for generating a bacterial hemoglobin library and uses thereof
US10544411B2 (en) 2016-06-30 2020-01-28 Zymergen Inc. Methods for generating a glucose permease library and uses thereof
AU2017306676B2 (en) 2016-08-03 2024-02-22 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
PT3496743T (pt) 2016-08-08 2022-03-30 Aerase Inc Composições e métodos para o tratamento do cancro com depleção de arginina e agentes imuno-oncológicos
AU2017308889B2 (en) 2016-08-09 2023-11-09 President And Fellows Of Harvard College Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
SG11201903089RA (en) 2016-10-14 2019-05-30 Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US20190359973A1 (en) * 2017-01-10 2019-11-28 Christiana Care Health Services, Inc. Methods for in vitro site-directed mutagenesis using gene editing technologies
WO2018165504A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
IL306092A (en) 2017-03-23 2023-11-01 Harvard College Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
EP3848459A1 (de) 2017-06-30 2021-07-14 Inscripta, Inc. Automatisierte zellverarbeitungsverfahren, module, instrumente und systeme
JP2020534795A (ja) 2017-07-28 2020-12-03 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ファージによって支援される連続的進化（ｐａｃｅ）を用いて塩基編集因子を進化させるための方法および組成物
US10738327B2 (en) 2017-08-28 2020-08-11 Inscripta, Inc. Electroporation cuvettes for automation
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
KR102510576B1 (ko) 2017-09-19 2023-03-14 트로픽 바이오사이언시즈 유케이 리미티드 유전자 발현을 침묵시키기 위한 식물의 비-암호화 rna 분자의 특이성 변형
CN111372650A (zh) 2017-09-30 2020-07-03 因思科瑞普特公司 流通式电穿孔仪器
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
WO2019113157A1 (en) 2017-12-05 2019-06-13 Aerase, Inc. Method and composition for treating arginase 1 deficiency
WO2019190874A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Inscripta, Inc. Automated control of cell growth rates for induction and transformation
WO2019200004A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 Inscripta, Inc. Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
US10501738B2 (en) 2018-04-24 2019-12-10 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of peptide libraries
US10526598B2 (en) 2018-04-24 2020-01-07 Inscripta, Inc. Methods for identifying T-cell receptor antigens
BR112020021660A2 (pt) 2018-04-27 2021-02-02 Iovance Biotherapeutics, Inc. métodos para expandir linfócitos infiltrantes de tumor e para tratar um indivíduo com câncer, população de linfócitos infiltrantes de tumor, e, composição de criopreservação
EP4252759A3 (de) 2018-05-11 2023-11-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Gegen pik3ca-mutationen gerichtete t-zell-rezeptoren und verwendungen davon
AU2019292919A1 (en) 2018-06-30 2021-03-11 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US10752874B2 (en) 2018-08-14 2020-08-25 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US11142740B2 (en) 2018-08-14 2021-10-12 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
US10532324B1 (en) 2018-08-14 2020-01-14 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US11965154B2 (en) 2018-08-30 2024-04-23 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
CA3115534A1 (en) 2018-10-22 2020-04-30 Inscripta, Inc. Engineered nucleic acid-guided nucleases
US11214781B2 (en) 2018-10-22 2022-01-04 Inscripta, Inc. Engineered enzyme
EP3874051A1 (de) * 2018-10-31 2021-09-08 Novozymes A/S Genombearbeitung durch geführte endonuklease und einzelsträngiges oligonukleotid
JP2022526908A (ja) 2019-03-19 2022-05-27 ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド 編集ヌクレオチド配列を編集するための方法および組成物
WO2020198174A1 (en) 2019-03-25 2020-10-01 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
US11001831B2 (en) 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
EP3953477A4 (de) 2019-06-06 2022-06-22 Inscripta, Inc. Härtung für rekursive nukleinsäuregesteuerte zelleditierung
JP7230197B2 (ja) * 2019-06-11 2023-02-28 富士フイルム株式会社 環状ペプチド、細胞足場材、細胞分離材、及び、培地
US10907125B2 (en) 2019-06-20 2021-02-02 Inscripta, Inc. Flow through electroporation modules and instrumentation
EP3986909A4 (de) 2019-06-21 2023-08-02 Inscripta, Inc. Genomweite rationell gestaltete mutationen, die zu einer erhöhten lysinproduktion in e. coli führen
US10927385B2 (en) 2019-06-25 2021-02-23 Inscripta, Inc. Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
AU2020310837A1 (en) * 2019-07-08 2022-02-24 Inscripta, Inc. Increased nucleic acid-guided cell editing via a LexA-Rad51 fusion protein
JP2022550599A (ja) 2019-10-03 2022-12-02 アーティサン ディベロップメント ラブズ インコーポレイテッド 操作されたデュアルガイド核酸を有するｃｒｉｓｐｒシステム
CA3155727A1 (en) 2019-10-25 2021-04-29 Cecile Chartier-Courtaud Gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
WO2021102059A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
KR20220110778A (ko) 2019-12-10 2022-08-09 인스크립타 인코포레이티드 신규 mad 뉴클레아제
US10704033B1 (en) 2019-12-13 2020-07-07 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US11008557B1 (en) 2019-12-18 2021-05-18 Inscripta, Inc. Cascade/dCas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells
US10689669B1 (en) 2020-01-11 2020-06-23 Inscripta, Inc. Automated multi-module cell processing methods, instruments, and systems
WO2021154706A1 (en) 2020-01-27 2021-08-05 Inscripta, Inc. Electroporation modules and instrumentation
CN115667491A (zh) 2020-03-10 2023-01-31 赛阿瑞斯公司 用于细胞处理的系统、装置及方法
WO2021201653A1 (ko) 2020-04-02 2021-10-07 중앙대학교 산학협력단 Crispr/cas9 시스템을 기반으로 한 유전체 편집 방법 및 이의 용도
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
AU2021267940A1 (en) 2020-05-08 2022-12-08 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
US11787841B2 (en) 2020-05-19 2023-10-17 Inscripta, Inc. Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli
KR20220006485A (ko) * 2020-07-08 2022-01-17 한국생명공학연구원 미세상동성 기반 말단 결합을 통한 유전자 교정에 이용되는 공여자 핵산 및 이의 용도
WO2022060749A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Inscripta, Inc. Crispr editing to embed nucleic acid landing pads into genomes of live cells
US11566241B2 (en) * 2020-10-02 2023-01-31 Inscripta, Inc. Methods and systems for modeling of design representation in a library of editing cassettes
US11512297B2 (en) 2020-11-09 2022-11-29 Inscripta, Inc. Affinity tag for recombination protein recruitment
US20220145276A1 (en) * 2020-11-10 2022-05-12 Inscripta, Inc. Transcriptional roadblocks for gene editing and methods of using the same
CA3204158A1 (en) 2021-01-04 2022-07-07 Juhan Kim Mad nucleases
US11332742B1 (en) 2021-01-07 2022-05-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
TW202241508A (zh) 2021-01-29 2022-11-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 細胞介素相關之腫瘤浸潤性淋巴球組合物及方法
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
CA3212439A1 (en) 2021-03-19 2022-09-22 Michelle SIMPSON-ABELSON Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd69 selection and gene knockout in tils
EP4330763A1 (de) 2021-04-29 2024-03-06 Alcon Inc. Farbige kosmetische photochrome kontaktlinsen
WO2022245754A1 (en) 2021-05-17 2022-11-24 Iovance Biotherapeutics, Inc. Pd-1 gene-edited tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
WO2022256448A2 (en) 2021-06-01 2022-12-08 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes
WO2022266538A2 (en) 2021-06-18 2022-12-22 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing or modifying human genes
WO2022267843A1 (en) * 2021-06-21 2022-12-29 Westlake University Library construction method based on long overhang sequence ligation
WO2023004074A2 (en) 2021-07-22 2023-01-26 Iovance Biotherapeutics, Inc. Method for cryopreservation of solid tumor fragments
WO2023028521A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Inscripta, Inc. Genome-wide rationally-designed mutations leading to enhanced cellobiohydrolase i production in s. cerevisiae
WO2023147488A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
WO2023167882A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Artisan Development Labs, Inc. Composition and methods for transgene insertion
WO2023196877A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2023200770A1 (en) 2022-04-12 2023-10-19 Inscripta, Inc. Curing for iterative nucleic acid-guided nuclease editing
WO2023201369A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment
WO2023220608A1 (en) 2022-05-10 2023-11-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with an il-15r agonist
WO2023225410A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Artisan Development Labs, Inc. Systems and methods for assessing risk of genome editing events
US20240052370A1 (en) 2022-07-27 2024-02-15 Inscripta, Inc. Modulating cellular repair mechanisms for genomic editing
WO2024062138A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Mnemo Therapeutics Immune cells comprising a modified suv39h1 gene

Family Cites Families (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1028757A (en) 1910-07-28 1912-06-04 Charles Margerison Combined curtain-pole and shade-support.
US1024016A (en) 1910-10-29 1912-04-23 Emma R Bowne Gas-burner.
US1001776A (en) 1911-01-12 1911-08-29 Augustin Scohy Railroad switch and frog.
US1001184A (en) 1911-04-20 1911-08-22 Charles M Coover Non-slipping device.
US1026684A (en) 1911-09-16 1912-05-21 Emil A Lauer Lamp.
US6562594B1 (en) 1999-09-29 2003-05-13 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
WO2001073000A2 (en) * 2000-03-24 2001-10-04 Maxygen, Inc. Methods for modulating cellular and organismal phenotypes
US20030044866A1 (en) 2001-08-15 2003-03-06 Charles Boone Yeast arrays, methods of making such arrays, and methods of analyzing such arrays
PT1453547T (pt) 2001-12-17 2016-12-28 Univ Pennsylvania Sequências do vírus adeno-associado (aav) do serotipo 8, vetores contendo as mesmas, e utilizações destas
EP2298904B1 (de) 2002-06-14 2017-05-24 BP Corporation North America Inc. Xylanasen, Nukleinsäuren, die diese codieren, und Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung
JP4447977B2 (ja) 2004-06-30 2010-04-07 富士通マイクロエレクトロニクス株式会社 セキュアプロセッサ、およびセキュアプロセッサ用プログラム。
DK2336362T3 (en) 2005-08-26 2019-01-21 Dupont Nutrition Biosci Aps USE OF CRISPR-ASSOCIATED GENES (CAS)
CN101583370A (zh) * 2005-09-27 2009-11-18 阿穆尼克斯公司 蛋白质药物及其用途
EP1981992A4 (de) * 2006-01-03 2010-01-06 Massachusetts Inst Technology Promotorkonstruktion und genetische kontrolle
PL2034848T3 (pl) 2006-06-16 2017-08-31 Dupont Nutrition Bioscences Aps Bakteria Streptococcus thermophilus
WO2008052101A2 (en) 2006-10-25 2008-05-02 President And Fellows Of Harvard College Multiplex automated genome engineering
US9309511B2 (en) 2007-08-28 2016-04-12 The Johns Hopkins University Functional assay for identification of loss-of-function mutations in genes
US20140121118A1 (en) 2010-11-23 2014-05-01 Opx Biotechnologies, Inc. Methods, systems and compositions regarding multiplex construction protein amino-acid substitutions and identification of sequence-activity relationships, to provide gene replacement such as with tagged mutant genes, such as via efficient homologous recombination
US20150368639A1 (en) 2011-04-14 2015-12-24 Ryan T. Gill Compositions, methods and uses for multiplex protein sequence activity relationship mapping
CA2834375C (en) * 2011-04-27 2020-07-14 Amyris, Inc. Methods for genomic modification
IN2014MN00974A (de) 2011-12-16 2015-04-24 Targetgene Biotechnologies Ltd
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
LT3401400T (lt) 2012-05-25 2019-06-10 The Regents Of The University Of California Būdai ir kompozicijos, skirtos rnr molekulės nukreipiamai tikslinės dnr modifikacijai ir rnr molekulės nukreipiamam transkripcijos moduliavimui
MA37681B2 (fr) 2012-05-25 2020-07-29 Cellectis Procédés pour modifier des lymphocytes t résistants allogéniques et immunosuppresseurs pour l'immunothérapie
EP2861737B1 (de) * 2012-06-19 2019-04-17 Regents Of The University Of Minnesota Gen-targeting in pflanzen durch dns-viren
WO2014022702A2 (en) 2012-08-03 2014-02-06 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing
DE202013012597U1 (de) 2012-10-23 2017-11-21 Toolgen, Inc. Zusammensetzung zum Spalten einer Ziel-DNA, umfassend eine für die Ziel-DNA spezifische guide-RNA und eine Cas-Protein-codierende Nukleinsäure oder ein Cas-Protein, sowie deren Verwendung
EP3138911B1 (de) 2012-12-06 2018-12-05 Sigma Aldrich Co. LLC Crispr-basierte genommodifizierung und -regulierung
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
PT2921557T (pt) 2012-12-12 2016-10-19 Massachusetts Inst Technology Engenharia de sistemas, métodos e composições guia otimizadas para a manipulação de sequências
ES2658401T3 (es) * 2012-12-12 2018-03-09 The Broad Institute, Inc. Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas
EP4234696A3 (de) 2012-12-12 2023-09-06 The Broad Institute Inc. Systeme, verfahren und zusammensetzungen mit crispr-cas-komponenten zur sequenzmanipulation
PL2784162T3 (pl) 2012-12-12 2016-01-29 Broad Inst Inc Opracowanie systemów, metod oraz zoptymalizowanych kompozycji przewodnikowych do manipulacji sekwencyjnej
DK2898075T3 (en) 2012-12-12 2016-06-27 Broad Inst Inc CONSTRUCTION AND OPTIMIZATION OF IMPROVED SYSTEMS, PROCEDURES AND ENZYME COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION
CA3081054A1 (en) 2012-12-17 2014-06-26 President And Fellows Of Harvard College Rna-guided human genome engineering
LT2943579T (lt) 2013-01-10 2018-11-12 Dharmacon, Inc. Molekulių bibliotekos ir molekulių generavimo būdai
AU2014207618A1 (en) 2013-01-16 2015-08-06 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
US10612043B2 (en) 2013-03-09 2020-04-07 Agilent Technologies, Inc. Methods of in vivo engineering of large sequences using multiple CRISPR/cas selections of recombineering events
KR101780885B1 (ko) 2013-03-14 2017-10-11 카리부 바이오사이언시스 인코포레이티드 핵산-표적화 핵산의 조성물 및 방법
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
CA2906553C (en) 2013-03-15 2022-08-02 The General Hospital Corporation Rna-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
EP4286517A3 (de) 2013-04-04 2024-03-13 President and Fellows of Harvard College Therapeutische verwendungen einer genomänderung mit crispr-/cas-systemen
US9890393B2 (en) 2013-05-29 2018-02-13 Cellectis Methods for engineering T cells for immunotherapy by using RNA-guided CAS nuclease system
IL243475B2 (en) 2013-07-09 2023-11-01 Harvard College Multiplex RNA-guided genome engineering
HRP20211563T1 (hr) 2013-07-11 2022-01-07 Modernatx, Inc. Pripravci koji sadrže sintetske polinukleotide koji kodiraju proteine srodne crispr-u i sintetske sgrna, te postupci njihove uporabe
US11306328B2 (en) 2013-07-26 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
CA2920253A1 (en) 2013-08-02 2015-02-05 Enevolv, Inc. Processes and host cells for genome, pathway, and biomolecular engineering
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
WO2015034872A2 (en) 2013-09-05 2015-03-12 Massachusetts Institute Of Technology Tuning microbial populations with programmable nucleases
ES2844174T3 (es) 2013-09-18 2021-07-21 Kymab Ltd Métodos, células y organismos
US20160237455A1 (en) 2013-09-27 2016-08-18 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions
US10822606B2 (en) 2013-09-27 2020-11-03 The Regents Of The University Of California Optimized small guide RNAs and methods of use
US20150098954A1 (en) 2013-10-08 2015-04-09 Elwha Llc Compositions and Methods Related to CRISPR Targeting
WO2015069682A2 (en) 2013-11-05 2015-05-14 President And Fellows Of Harvard College Precise microbiota engineering at the cellular level
JP5900942B2 (ja) 2013-11-06 2016-04-06 国立大学法人広島大学 核酸挿入用ベクター
US11326209B2 (en) 2013-11-07 2022-05-10 Massachusetts Institute Of Technology Cell-based genomic recorded accumulative memory
EP3071695A2 (de) 2013-11-18 2016-09-28 Crispr Therapeutics AG Crispr-cas-systemmaterialien und verfahren
US9074199B1 (en) 2013-11-19 2015-07-07 President And Fellows Of Harvard College Mutant Cas9 proteins
RU2685914C1 (ru) 2013-12-11 2019-04-23 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы и композиции для направленной модификации генома
WO2015089354A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Compositions and methods of use of crispr-cas systems in nucleotide repeat disorders
US10787654B2 (en) 2014-01-24 2020-09-29 North Carolina State University Methods and compositions for sequence guiding Cas9 targeting
CN106164271B (zh) 2014-02-11 2020-06-02 科罗拉多州立大学董事会（法人团体） Crispr支持的多路基因组工程化
CN106232814B (zh) 2014-02-13 2021-05-11 宝生物工程（美国)有限公司 从核酸的初始集合中耗尽靶分子的方法、以及用于实践其的组合物和试剂盒
WO2015153889A2 (en) 2014-04-02 2015-10-08 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Materials and methods for the treatment of latent viral infection
GB201406970D0 (en) 2014-04-17 2014-06-04 Green Biologics Ltd Targeted mutations
GB201406968D0 (en) 2014-04-17 2014-06-04 Green Biologics Ltd Deletion mutants
WO2015168600A2 (en) 2014-05-02 2015-11-05 Tufts University Methods and apparatus for transformation of naturally competent cells
JP2017517256A (ja) 2014-05-20 2017-06-29 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ 遺伝子配列を編集する方法
KR101886381B1 (ko) 2014-05-28 2018-08-10 기초과학연구원 불활성화된 표적 특이적 뉴클레아제를 이용한 표적 dna의 분리 방법
US9970001B2 (en) 2014-06-05 2018-05-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease design
CA2951707A1 (en) 2014-06-10 2015-12-17 Massachusetts Institute Of Technology Method for gene editing
JP2017518082A (ja) 2014-06-17 2017-07-06 ポセイダ セラピューティクス， インコーポレイテッド ゲノム中の特異的遺伝子座にタンパク質を指向させるための方法およびその使用
US20150376587A1 (en) 2014-06-25 2015-12-31 Caribou Biosciences, Inc. RNA Modification to Engineer Cas9 Activity
GB201411344D0 (en) 2014-06-26 2014-08-13 Univ Leicester Cloning
WO2016011080A2 (en) 2014-07-14 2016-01-21 The Regents Of The University Of California Crispr/cas transcriptional modulation
US20160053272A1 (en) 2014-07-18 2016-02-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods Of Modifying A Sequence Using CRISPR
US20160053304A1 (en) 2014-07-18 2016-02-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods Of Depleting Target Sequences Using CRISPR
US20160076093A1 (en) 2014-08-04 2016-03-17 University Of Washington Multiplex homology-directed repair
CN113789317B (zh) 2014-08-06 2024-02-23 基因工具股份有限公司 使用空肠弯曲杆菌crispr/cas系统衍生的rna引导的工程化核酸酶的基因编辑
US10513711B2 (en) 2014-08-13 2019-12-24 Dupont Us Holding, Llc Genetic targeting in non-conventional yeast using an RNA-guided endonuclease
WO2016040594A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 The Regents Of The University Of California Reconstruction of ancestral cells by enzymatic recording
EP3204513A2 (de) 2014-10-09 2017-08-16 Life Technologies Corporation Crispr-oligonukleotide und geneditierung
DK3212789T3 (da) 2014-10-31 2020-07-27 Massachusetts Inst Technology Massiv parallel kombinatorisk genetik til crispr
KR20240013283A (ko) 2014-12-03 2024-01-30 애질런트 테크놀로지스, 인크. 화학적 변형을 갖는 가이드 rna
CA2971391C (en) 2014-12-17 2023-05-09 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods for efficient gene editing in e. coli using guide rna/cas endonuclease systems in combination with circular polynucleotide modification templates.
CN114438169A (zh) 2014-12-20 2022-05-06 阿克生物公司 使用CRISPR/Cas系统蛋白靶向消减、富集、和分割核酸的组合物及方法
GB201506509D0 (en) 2015-04-16 2015-06-03 Univ Wageningen Nuclease-mediated genome editing
KR20180008572A (ko) 2015-05-15 2018-01-24 파이어니어 하이 부렛드 인터내쇼날 인코포레이팃드 Cas 엔도뉴클레아제 시스템, pam 서열 및 가이드 rna 요소의 신속한 특성화
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
AU2016280893B2 (en) 2015-06-18 2021-12-02 Massachusetts Institute Of Technology CRISPR enzyme mutations reducing off-target effects
EP3313989A4 (de) 2015-06-29 2018-12-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modifizierte crispr-rna und modifizierte single-crispr-rna und verwendungen davon
WO2017015015A1 (en) 2015-07-17 2017-01-26 Emory University Crispr-associated protein from francisella and uses related thereto
WO2017019867A1 (en) 2015-07-28 2017-02-02 Danisco Us Inc Genome editing systems and methods of use
WO2017031483A1 (en) 2015-08-20 2017-02-23 Applied Stemcell, Inc. Nuclease with enhanced efficiency of genome editing
JP6799058B2 (ja) 2015-09-21 2020-12-09 アークトゥラス・セラピューティクス・インコーポレイテッドＡｒｃｔｕｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． アレル選択的な遺伝子編集およびその使用
WO2017053713A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 Tarveda Therapeutics, Inc. Compositions and methods for genome editing
EP3365461B1 (de) 2015-10-22 2020-10-14 Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) Endonuklease-barcoding
ES2699848T3 (es) 2015-10-23 2019-02-13 Caribou Biosciences Inc Acido nucleico CRISPR clase 2 de tipo cruzado modificado que se dirige a ácidos nucleicos
CN106893739A (zh) 2015-11-17 2017-06-27 香港中文大学 用于靶向基因操作的新方法和系统
CN108699597A (zh) 2015-11-26 2018-10-23 DNAe集团控股有限公司 单分子对照
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
WO2017100343A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Arc Bio, Llc Methods and compositions for the making and using of guide nucleic acids
KR102006320B1 (ko) 2015-12-07 2019-08-02 지머젠 인코포레이티드 Htp 게놈 공학 플랫폼에 의한 미생물 균주 개량
JP2019500036A (ja) 2015-12-24 2019-01-10 ブレイン・バイオテクノロジー・リサーチ・アンド・インフォメーション・ネットワーク・アクチェンゲゼルシャフトＢＲＡＩＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 原核生物におけるｄｎａ末端修復経路の再構築
AU2017280353B2 (en) 2016-06-24 2021-11-11 Inscripta, Inc. Methods for generating barcoded combinatorial libraries
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases

Non-Patent Citations (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
35 U.S.C. §119
Bhaya et al. Ann. Rev. of Genetics (2011) 45: 273–297
Brouns et al. Science (2008) 321: 960–964
Cong et al. Science (2013) 339 (6121): 819–823
Costantino et al. PNAS (2003) 100: 15748–15753
Datta et al. Gene (2008) 379: 109–115
DiCarlo et al. Nucleic Acids Res. (2013) 41: 4336–4343
Jinek et al. Science (2012) 337 (6096): 816–821
Li et al. 2003
Qi et al. Cell (2013)
Qi et al. Cell (2013) 45: 273–297
Sawitzke et al. 2011
Semenova et al. PNAS (2011) 108: 10098–10103
Tenaillon et al. 2012
Vu et al. 2000
Waaijers et al. Genetics (2013) 195: 1187–1191
Wang et al. 2011
Wang et al. Cell (2013) 153: 910–918
Wang et al. Nat. Methods (2012) 9: 591–593
Wang et al. Nature (2008) 460: 894–898
Wang et al. Nature (2009) 460: 894–898
Warner et al. Nat. Biotechnol (2010) 28: 856–862
Withers et al. App. Environ. Microbiol (2007) 73: 6277–6283
Zheng et al. Biotechnol. for biofuels (2013) 6: 57

Also Published As

Publication number Publication date
AU2018271257B2 (en) 2020-08-13
US10240167B2 (en) 2019-03-26
US10731180B2 (en) 2020-08-04
KR102209636B1 (ko) 2021-01-29
LT3105328T (lt) 2020-07-10
US20220364121A1 (en) 2022-11-17
US20170240922A1 (en) 2017-08-24
WO2015123339A1 (en) 2015-08-20
KR102496984B1 (ko) 2023-02-06
US20180371499A1 (en) 2018-12-27
US10266849B2 (en) 2019-04-23
MX2016010285A (es) 2017-01-11
US20210254104A1 (en) 2021-08-19
US11639511B2 (en) 2023-05-02
EP3105328A1 (de) 2016-12-21
RS60492B1 (sr) 2020-08-31
SI3105328T1 (sl) 2020-09-30
US20220119844A1 (en) 2022-04-21
DK3105328T3 (da) 2020-07-13
JP2019205478A (ja) 2019-12-05
EP3690044A1 (de) 2020-08-05
CY1123115T1 (el) 2021-10-29
US20200157575A1 (en) 2020-05-21
HUE049634T2 (hu) 2020-09-28
US10465207B2 (en) 2019-11-05
US20190376087A1 (en) 2019-12-12
US11078498B2 (en) 2021-08-03
IL246951B (en) 2019-03-31
KR20160122197A (ko) 2016-10-21
CN106164271B (zh) 2020-06-02
AU2015217208B2 (en) 2018-08-30
US10435715B2 (en) 2019-10-08
CA3075047C (en) 2022-02-01
US20190264231A1 (en) 2019-08-29
JP2021087454A (ja) 2021-06-10
EP3985114A1 (de) 2022-04-20
JP7232540B2 (ja) 2023-03-03
ES2802984T3 (es) 2021-01-22
US10711284B2 (en) 2020-07-14
AU2018271257A1 (en) 2018-12-13
US11345933B2 (en) 2022-05-31
HRP20201040T1 (hr) 2021-01-08
US10351877B2 (en) 2019-07-16
US20200157574A1 (en) 2020-05-21
US10364442B2 (en) 2019-07-30
CN111705365A (zh) 2020-09-25
EP4063503A1 (de) 2022-09-28
CA2938456A1 (en) 2015-08-20
US9982278B2 (en) 2018-05-29
IL261664A (en) 2018-10-31
CA3075047A1 (en) 2015-08-20
US20190194693A1 (en) 2019-06-27
US20240093241A1 (en) 2024-03-21
GB2544382B (en) 2018-05-30
US11702677B2 (en) 2023-07-18
US20200392539A1 (en) 2020-12-17
CA2938456C (en) 2022-06-21
US20170321226A1 (en) 2017-11-09
JP6863620B2 (ja) 2021-04-21
GB2544382A (en) 2017-05-17
US10669559B2 (en) 2020-06-02
EP3690044B1 (de) 2024-01-10
US20180230493A1 (en) 2018-08-16
GB201615434D0 (en) 2016-10-26
US20190390227A1 (en) 2019-12-26
EP3105328B1 (de) 2020-04-08
US11795479B2 (en) 2023-10-24
PT3105328T (pt) 2020-07-06
CA3161903A1 (en) 2015-08-20
JP2017505145A (ja) 2017-02-16
US20180230492A1 (en) 2018-08-16
CN106164271A (zh) 2016-11-23
AU2015217208A1 (en) 2016-09-08
IL261664B (en) 2020-11-30
PL3105328T3 (pl) 2020-10-19
NZ723531A (en) 2022-03-25
KR20220142547A (ko) 2022-10-21
KR20210002759A (ko) 2021-01-08
EP3105328A4 (de) 2017-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE212015000061U1 (de) CRISPR-ermöglichtes Multiplex Genom Engineering

Legal Events

Date Code Title Description
R207 Utility model specification
R150 Utility model maintained after payment of first maintenance fee after three years
R151 Utility model maintained after payment of second maintenance fee after six years
R152 Utility model maintained after payment of third maintenance fee after eight years