JP2017505145A - Ｃｒｉｓｐｒにより可能にされる多重ゲノムエンジニアリング - Google Patents

Ｃｒｉｓｐｒにより可能にされる多重ゲノムエンジニアリング Download PDF

Info

Publication number
JP2017505145A
JP2017505145A JP2016568490A JP2016568490A JP2017505145A JP 2017505145 A JP2017505145 A JP 2017505145A JP 2016568490 A JP2016568490 A JP 2016568490A JP 2016568490 A JP2016568490 A JP 2016568490A JP 2017505145 A JP2017505145 A JP 2017505145A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
mutation
cell
cells
editing
region
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2016568490A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2017505145A5 (ja
Inventor
ライアン ティー． ギル，
ライアン ティー． ギル，
アンドリュー ガルスト，
アンドリュー ガルスト，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Colorado
Original Assignee
University of Colorado
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=53800598&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2017505145(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by University of Colorado filed Critical University of Colorado
Publication of JP2017505145A publication Critical patent/JP2017505145A/ja
Publication of JP2017505145A5 publication Critical patent/JP2017505145A5/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1024—In vivo mutagenesis using high mutation rate "mutator" host strains by inserting genetic material, e.g. encoding an error prone polymerase, disrupting a gene for mismatch repair
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1082—Preparation or screening gene libraries by chromosomal integration of polynucleotide sequences, HR-, site-specific-recombination, transposons, viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/11—Applications; Uses in screening processes for the determination of target sites, i.e. of active nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/12—Applications; Uses in screening processes in functional genomics, i.e. for the determination of gene function
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised
    • C12N2330/31—Libraries, arrays

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

種々のＣＲＩＳＰＲシステムが使用される、（例えば、タンパク質ライブラリーにおける）オープンリーディングフレームまたは細胞もしくは細胞の集団における染色体の任意のセグメント内の染色体の合理的な多重操作のための方法およびベクターが本明細書において記載される。方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼＣａｓ９および配列特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素を細胞に導入し、配列指向性２本鎖切断を導入するＣＲＩＳＰＲシステムの能力を使用してかかる切断をもたらすステップを含む。

Description

関連出願
本出願は、米国特許法§１１９の下、２０１４年２月１１日に出願された米国仮出願第６１／９３８，６０８号の利益を請求し、その全体の教示は、参照によって本明細書中に組み込まれる。
巨大なＤＮＡ構築物の合理的な操作は、現在の合成生物学にとっての中心的な課題およびゲノムエンジニアリングの取り組みである。近年、様々なテクノロジーが、この課題に取り組むために開発され、変異が生み出され得る特異性およびスピードを増大させる。加えて、適応変異は、進化の中心的な駆動するものであるが、それらの存在量、および細胞の表現型への関連のある寄与は、最も十分に研究された生物においてでさえあまり理解されていない。これは、これらの遺伝子型、および目的の表現型と相関するそれらの存在を観察し、再構築することに関連する技術的課題に大部分起因し得る。例えば、ランダム変異誘発に頼ったゲノム編集の方法は、多くの変異からなる複雑な遺伝子型をもたらし、そのそれぞれの関連のある寄与は、絡まりを解くのが難しい。さらに、対立遺伝子間のエピスタシス相互作用は、個々の変異に関する情報の欠如に起因し、割り当てることが難しい。
クラスター化規則的間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）は、多くの細菌のゲノムに存在し、適応細菌免疫において重要な役割を果たすことが見出された。これらのアレイの転写は、遺伝子抑制またはＤＮＡ切断のため、細胞においてＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ複合体のＤＮＡ標的への配列特異的結合を指向する、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡを生じさせる。これらの複合体の特異性は、菌株エンジニアリングの新規ｉｎ ｖｉｖｏ適用を可能にする。
種々のＣＲＩＳＰＲシステムが使用される、オープンリーディングフレーム内（例えば、タンパク質ライブラリーを作製するために）または染色体の任意のセグメントにおける複数の遺伝子内の染色体の合理的な多重操作の方法が、本明細書において記載される。これらの方法は、従前の利用可能なものより効率的なコンビナトリアルゲノムエンジニアリングを提供する。
ＣＲＩＳＰＲの多重化能力を拡大することは、現在の技術的課題を提示し、高処理形式で合理的なライブラリーを作製するためのこれらのシステムの使用を可能にするであろう。かかる進歩は、最適な生成のための複雑な遺伝子ネットワークをリファクタリングしようとする、代謝エンジニアリングおよびタンパク質エンジニアリングの分野に対する広範な意味を有する。
方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼＣａｓ９および配列特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素を細胞に導入し、配列指向性２本鎖切断を導入するＣＲＩＳＰＲシステムの能力を使用してかかる切断をもたらすステップを含む。ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼＣａｓ９および配列特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素は、プラスミドなどの１つまたは複数のベクター上にコードされる細胞に導入され得る。ＤＮＡリコンビニアリングカセットまたは編集オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子座内の所望の変異、およびＣＲＩＳＰＲシステムにより認識され得る標的遺伝子座の外側の共通の位置の変異を含むよう合理的に設計され得る。記載される方法は、目的の経路を変えることを含む多くの適用のために使用され得る。
一実施形態において、方法は、（ａ）（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異などの、標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む編集カセット、（ｉｉ）プロモーター、ならびに（ｉｉｉ）（ａ）標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）、を含む、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするベクターを細胞に導入して、これにより、ベクターを含む細胞を生成するステップ、（ｂ）Ｃａｓ９が発現される条件下でベクターを含む細胞を維持するステップであって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、ベクター上にコードされるか、第２のベクター上にコードされるか、または細胞のゲノム上にコードされ、ベクターを含みＰＡＭ変異を含まない細胞ならびにベクターおよびＰＡＭ変異を含む細胞の生成をもたらす、ステップ、（ｃ）（ｂ）の生成物を細胞生存に適した条件下で培養し、これにより、生細胞を生成するステップ、（ｄ）（ｃ）において生成された生細胞を得るステップ、ならびに（ｅ）（ｄ）において得られた少なくとも１つの生細胞のベクターの編集オリゴヌクレオチドを配列決定し、少なくとも１つのコドンの変異を同定するステップを含む、ゲノムエンジニアリングの方法である。
別の実施形態において、方法は、（ａ）（ｉ）（ａ）核酸の標的領域に相同であり、標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異などの、標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異を含む領域、および（ｂ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む少なくとも１つの編集カセット、（ｉｉ）少なくとも１つのプロモーター、ならびに（ｉｉｉ）（ａ）標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、をコードするベクターを細胞の第１の集団に導入して、これにより、ベクターを含む細胞の第２の集団を生成するステップ、（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼが発現される条件下で細胞の第２の集団を維持するステップであって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、ベクター、第２のベクター、または細胞の第２の集団の細胞のゲノム上にコードされ、ＰＡＭ変異を含まない細胞におけるＤＮＡ切断およびかかる細胞の死をもたらす、ステップ、
（ｃ）（ｂ）において生成された生細胞を得るステップ、ならびに（ｄ）細胞の第２の集団の少なくとも１つの細胞のベクターの編集オリゴヌクレオチドを配列決定することにより、少なくとも１つのコドンの変異を同定するステップを含む、追跡可能なＣＲＩＳＰＲ濃縮リコンビニアリングによるゲノムエンジニアリングの方法である。
上記実施形態のいずれかは、編集オリゴヌクレオチドの集団を合成するおよび／または得るステップをさらに含み得る。いずれかの実施形態は、編集オリゴヌクレオチドの集団を増幅するステップをさらに含み得る。実施形態のいずれかにおいて、ベクターは、スペーサー、少なくとも２つのプライミング部位、またはスペーサーおよび少なくとも２つのプライミング部位両方をさらに含み得る。一部の実施形態において、編集カセットは、ＰＡＭ変異の１００ヌクレオチド以内の少なくとも１つのコドンの変異を含む標的領域を含む。
（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む編集カセット、
（ｉｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含むベクターも記載される。
さらなる実施形態は、
（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む、編集カセット、
（ｉｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含むベクターである。
さらなる実施形態は、
（ｉ）（ａ）核酸の標的領域に相同であり、標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異を含む領域、および（ｂ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む少なくとも１つの編集カセット、
（ｉｉ）少なくとも１つのプロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含むベクターである。
ベクターの別の実施形態は、
（ｉ）（ａ）核酸の標的領域に相同であり、標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異を含む領域、および（ｂ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む少なくとも１つの編集カセット、
（ｉｉ）少なくとも１つのプロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含むベクターである。
任意の実施形態において、ベクターは、スペーサー、少なくとも２つのプライミング部位、またはスペーサーおよび少なくとも２つのプライミング部位をさらに含み得る。変異が、少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドのものであるベクターにおいて、編集カセット変異は、例えば、ＰＡＭ変異の１００ヌクレオチド以内にあり得る。
本明細書において記載される方法により生成される細胞の集団を含むライブラリーも記載される。細胞の集団のライブラリーは、本明細書において記載されるベクターのいずれかを有する細胞を含み得る。例えば、細胞の集団は、
（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む編集カセット、
（ｉｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含むベクターを含み得る。
さらなる実施形態において、細胞の集団は、
（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む編集カセット、
（ｉｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含むベクターを含み得る。
さらなる実施形態において、方法は、
（ａ）（ｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する遺伝子（隣接遺伝子）における少なくとも１つのコドンの変異を有する第１の単一のＰＡＭの欠失と結合する、合理的に設計されたオリゴヌクレオチドなどの、１つまたは複数の編集オリゴヌクレオチド、および（ｂ）染色体のオープンリーディングフレームの５’にあるヌクレオチド配列を標的にするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、第１の細胞の集団に導入することにより（例えば、共形質転換により）、プラスミド中に組換え染色体または組換えＤＮＡなどの、組換えＤＮＡを含む、ドナーライブラリーを構築し、これにより、標的コドン変異を有する組換え染色体を含む第１の細胞の集団を含むドナーライブラリーを生成するステップ、
（ｂ）編集オリゴヌクレオチド由来の合成特性を使用し、遺伝子の３’末端の第２のＰＡＭ欠失（最終ＰＡＭ欠失）を同時に取り込む、組換え染色体の、例えば、ＰＣＲ増幅により、（ａ）において構築されたドナーライブラリーを増幅し、これにより、標的コドン変異を最終ＰＡＭ欠失に直接結合、例えば、共有結合させ、最終ＰＡＭ欠失および標的コドン変異を有する回収されたドナーライブラリーを生成するステップ、ならびに
（ｃ）最終ＰＡＭ欠失および標的コドン変異を有するドナーライブラリー、ならびに最終ｇＲＮＡプラスミドを、典型的には、ナイーブ細胞の集団である、第２の細胞の集団に導入し（例えば、共形質転換し）、これにより、標的コドン変異を含む最終ライブラリーを生成するステップ
を含む、ＣＲＩＳＰＲに支援される合理的なタンパク質エンジニアリング（コンビナトリアルゲノムエンジニアリング）の方法である。
第１の細胞の集団、および第２の細胞の集団（例えば、ナイーブ細胞の集団）は、典型的には、細胞が、全て同一タイプであり、これらに限定されないが、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などの、原核生物または真核生物であり得る集団である。
一部の実施形態において、方法は、タンパク質が生成される条件下で最終ライブラリーを維持するステップをさらに含む。
一部の実施形態において、第１の細胞は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを発現する。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、誘導可能なプロモーターの制御下で発現される。
一部の実施形態において、編集オリゴヌクレオチドは、第１の細胞に存在する（１つ、１つまたは複数、少なくとも１つの）標的核酸に相補的である。一部の実施形態において、編集オリゴヌクレオチドは、第１の細胞における１つより多くの標的部位または遺伝子座を標的にする。一部の実施形態において、編集オリゴヌクレオチド［所望のコドン］の核酸配列は、１つまたは複数の置換、欠失、挿入、または標的核酸に対する置換、欠失、および挿入の任意の組合せを含む。一部の実施形態において、編集オリゴヌクレオチドは、合理的に設計され、さらなる実施形態において、それらは、ランダム変異誘発または縮重プライマーオリゴヌクレオチドを使用することにより生成される。一部の実施形態において、編集オリゴヌクレオチドは、核酸の収集物（ライブラリー）に由来する。
一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、プラスミド上にコードされる。一部の実施形態において、編集オリゴヌクレオチドおよびｇＲＮＡは、形質転換、例えば、編集オリゴヌクレオチドおよびガイド（ｇ）ＲＮＡの共形質転換により、第１の細胞に導入される。一部の実施形態において、編集オリゴヌクレオチドおよびｇＲＮＡは、第１の細胞に順次導入される。他の実施形態において、編集オリゴヌクレオチドおよびｇＲＮＡは、第１の細胞に同時に導入される。
一部の実施形態において、ドナーライブラリーを回収するステップは、（ａ）編集オリゴヌクレオチドの取り込みについて細胞をスクリーニングするステップ、および（ｂ）編集オリゴヌクレオチドを取り込んだことが確認された細胞を選択するステップをさらに含む。一部の実施形態において、ドナーライブラリーを回収するステップは、回収されたドナーライブラリーを処理するステップをさらに含む。
一部の実施形態において、最終細胞／ナイーブ細胞は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを発現する。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、誘導可能なプロモーターの制御下で発現される。
（ａ）（ｉ）編集オリゴヌクレオチドを含む合成ｄｓＤＮＡ編集カセット、および（ｉｉ）目的の遺伝子のすぐ上流のゲノム配列を標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現するベクターを、第１の細胞の集団に、編集オリゴヌクレオチドのｇＲＮＡによる多重リコンビニアリングおよび選択的濃縮が生じる条件下で導入し（例えば、共形質転換し）、これにより、ドナーライブラリーを生成するステップ、
（ｂ）目的の遺伝子の３’末端に隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（最終ＰＡＭ）を欠失する、オリゴヌクレオチドを有するドナーライブラリーを増幅し、これにより、最終ＰＡＭが欠失された（３’ＰＡＭ欠失を有する）ｄｓＤＮＡ編集カセット、合理的なコドン変異、およびＰ１部位を含む増幅されたドナーライブラリーを生成するステップ、
（ｃ）増幅されたドナーライブラリーを、制限酵素（例えば、ＢｓａＩ）などの酵素で処理して、Ｐ１部位を取り除くステップ、ならびに
（ｄ）（ｃ）において処理された増幅されたドナーライブラリーおよび最終ｇＲＮＡで、ナイーブ細胞の集団を共形質転換し、これにより、最終ＰＡＭが欠失された（３’ＰＡＭ欠失を有する）ｄｓＤＮＡ編集カセット、合理的なコドン変異、および最終ｇＲＮＡを含む、共形質転換された細胞の集団を生成するステップ
を含む、ＣＲＩＳＰＲに支援される合理的なタンパク質エンジニアリングの方法も記載される。
記載される全ての実施形態において、変異は、１つもしくは複数の挿入、欠失、置換、または前述の２つもしくは３つの任意の組合せ（例えば、挿入および欠失；挿入および置換；欠失および置換；置換および挿入；挿入、欠失、および置換）などの任意の所望のタイプのものであり得る。挿入、欠失、および置換は、任意の数のヌクレオチドのものであり得る。それらは、コドン（コード領域）および／または非コード領域にあり得る。
図１Ａおよび１Ｂは、ＣＲＩＳＰＲに支援される合理的なタンパク質エンジニアリング（ＣＡＲＰＥ）の概略を提示する。図１Ａは、ドナーライブラリー構築の概要を示す。合成ｄｓＤＮＡ編集カセットは、目的の遺伝子の上流のゲノム配列を標的にするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現するベクターと共形質転換された。共形質転換は、編集オリゴヌクレオチドの多重リコンビニアリングを介して、ドナーライブラリーを作製し、それは、ｇＲＮＡにより選択的に濃縮される。次に、ドナーライブラリーは、遺伝子の３’末端に隣接するＰＡＭ（最終ＰＡＭ）に変異導入される（欠失する）オリゴヌクレオチドを使用して、増幅された。図１Ｂは、最終タンパク質ライブラリー作製の概略を示す。ドナーライブラリーは、ＢｓａＩで処理されて、Ｐ１部位が取り除かれ、３’ＰＡＭ欠失および合理的なコドン変異を有するｄｓＤＮＡカセットのライブラリーは、最終ｇＲＮＡと共形質転換されて、最終タンパク質ライブラリーが作製された。 図２は、高い効率での編集オリゴヌクレオチドのＰ１特性の取り込み、ならびに標的化コドン位置（下線）における変異を確かにする、ｇａｌＫドナーライブラリー構築物からのクローン由来のＤＮＡ配列を提示する。Ｐ１の配列は、配列番号１により提供される。 図３Ａは、プライマー設計を示す。図３Ｂは、プライマーの数に対する予測される密度を示す。 図４Ａは、リンカーおよび構築物結果を提示する。図４Ｂは、エマルジョンＰＣＲベースの追跡に関連する１０個の編集を示す。 図４Ａは、リンカーおよび構築物結果を提示する。図４Ｂは、エマルジョンＰＣＲベースの追跡に関連する１０個の編集を示す。 図５は、代謝エンジニアリングのための合理的なタンパク質編集の概要である。 図６は、ＣＲＩＳＰＲにより濃縮された合理的なタンパク質ライブラリーの作製の概要である。 図７は、ＣＡＲＰＥの設定および実証の概要である。 図８は、反復性ＣＲＩＳＰＲ同時選択のためのストラテジーを示す。 図９は、ＣＡＲＰＥを使用した多重タンパク質エンジニアリングのためのストラテジーを提示する。 図１０は、ＣＡＲＰＥを使用したｇａｌＫドナーライブラリーの構築を示す。 図１１Ａは、ＣＡＲＰＥを使用した多重ＣＲＩＳＰＲベースの編集の概要を示す。図１１Ｂは、追跡可能なＣＲＩＳＰＲ濃縮リコンビニアリング（ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ）によるゲノムエンジニアリングを使用した、多重ＣＲＩＳＰＲベースの編集の概要を示す。 図１１Ａは、ＣＡＲＰＥを使用した多重ＣＲＩＳＰＲベースの編集の概要を示す。図１１Ｂは、追跡可能なＣＲＩＳＰＲ濃縮リコンビニアリング（ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ）によるゲノムエンジニアリングを使用した、多重ＣＲＩＳＰＲベースの編集の概要を示す。 図１２は、ｇａｌＫの編集コドン２４のための編集カセット、プロモーター、およびスペーサーを含む、代表的なＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲベクター（構築物）を示す。 図１３は、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲを使用した、ｇａｌＫ編集の結果を示す。上部のパネルは、ｇａｌＫコドン２４編集ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲベクターで形質転換された細胞由来の染色体およびベクター（プラスミド）のＤＮＡ配列決定結果を示し、これは、ベクター上の編集カセット（オリゴヌクレオチド）が、所望のゲノム編集（変異）の高い効率での追跡を可能にする「トランス−バーコード」として配列決定され得ることを示している。下部のパネルは、編集されていない野生型表現型（赤色）を示す、細胞のＤＮＡ配列決定クロマトグラフを示す。方法は、野生型、編集されていない対立遺伝子および編集／変異導入された対立遺伝子の両方を有する、複数の染色体を有する細胞の同定を可能にする。 図１４Ａ〜１４Ｃは、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲの概要を示す。図１４Ａは、設計構成要素の概略を示す。ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットは、細胞ゲノムにおける特定の部位を標的にし、ｄｓＤＮＡ切断を生じさせるためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を含有する。標的領域に相補的な相同性の領域は、ＰＡＭおよび他の近くの所望の部位に変異導入される。組換えを起こす細胞は、高い存在量に選択的に濃縮される。ベクターにおけるＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ編集カセットの配列決定は、ゲノム編集／変異の追跡を可能にする。図１４Ｂは、コドン１４５におけるＥ．ｃｏｌｉ ｇａｌＫ遺伝子のための編集カセット設計の例を示す。ＰＡＭは、最も近くの利用可能なＰＡＭ位置における同義の変化のため作られ得る、最も近くの利用可能なＰＡＭ変異で欠失される。これは、ＰＡＭ欠失部位における１〜２ヌクレオチドの「サイレント痕（ｓｉｌｅｎｔ ｓｃａｒ）」を有する変異誘発を可能にする。図１４Ｃは、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットが、アレイベースの合成方法を使用して合成され得ること、これにより、ゲノムワイドスケールの何千もの変異の系統的標的化、および適合の同時評価のため、少なくとも１０４〜１０６カセットの並行合成を可能にすることを示す。 図１４Ａ〜１４Ｃは、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲの概要を示す。図１４Ａは、設計構成要素の概略を示す。ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットは、細胞ゲノムにおける特定の部位を標的にし、ｄｓＤＮＡ切断を生じさせるためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を含有する。標的領域に相補的な相同性の領域は、ＰＡＭおよび他の近くの所望の部位に変異導入される。組換えを起こす細胞は、高い存在量に選択的に濃縮される。ベクターにおけるＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ編集カセットの配列決定は、ゲノム編集／変異の追跡を可能にする。図１４Ｂは、コドン１４５におけるＥ．ｃｏｌｉ ｇａｌＫ遺伝子のための編集カセット設計の例を示す。ＰＡＭは、最も近くの利用可能なＰＡＭ位置における同義の変化のため作られ得る、最も近くの利用可能なＰＡＭ変異で欠失される。これは、ＰＡＭ欠失部位における１〜２ヌクレオチドの「サイレント痕（ｓｉｌｅｎｔ ｓｃａｒ）」を有する変異誘発を可能にする。図１４Ｃは、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットが、アレイベースの合成方法を使用して合成され得ること、これにより、ゲノムワイドスケールの何千もの変異の系統的標的化、および適合の同時評価のため、少なくとも１０４〜１０６カセットの並行合成を可能にすることを示す。 図１５Ａは、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲベクターの概略を示す。図１５Ｂは、ＰＡＭ変異および変異導入されるコドンが１７ヌクレオチドだけ離れた、Ｅ．ｃｏｌｉ ｇａｌＫ遺伝子におけるＹ１４５＊変異の作製のための代表的なＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲの部分を示す。代表的なＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲの部分の核酸配列は、配列番号２８により提供され、リバース相補体は、配列番号３３により提供される。 図１６Ａ〜１６Ｃは、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ設計のための対照を提示する。図１６Ａは、方法の効率に対する編集カセットのサイズの効果を示す。図１６Ｂは、方法の効率に対するＰＡＭ変異／欠失と所望の変異の間の距離の効果を示す。図１６Ｃは、方法の効率に対するＭｕｔＳシステムの存在または不存在の効果を示す。
詳細な説明
細菌および古細菌ＣＲＩＳＰＲシステムは、正確なゲノム編集のための強力な新規ツールとして現れた。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで特に十分に特徴付けられ、単純な設計規則が、その２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）結合活性をリプログラミングするために確立された（Jinekら、Science（２０１２年）、３３７巻（６０９６号）：８１６〜８２１頁）。ＣＲＩＳＰＲにより媒介されるゲノム編集法の使用は、細菌（Congら、Science（２０１３年）、３３９巻（６１２１号）：８１９〜８２３頁）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（DiCarloら、Nucleic Acids Res.（２０１３年）４１巻：４３３６〜４３４３頁）、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ（Waaijersら、Genetics（２０１３年）、１９５巻：１１８７〜１１９１頁）、および種々の哺乳動物細胞株（Congら、Science（２０１３年）、３３９巻（６１２１号）：８１９〜８２３頁、Wangら、Cell（２０１３年）、１５３巻：９１０〜９１８頁）を含む、広範な生物における文献において急速に蓄積されている。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ホーミングヌクレアーゼ、およびＴＡＬＥＮＳのなどの、他のエンドヌクレアーゼベースのゲノム編集技術同様、ＣＲＩＳＰＲシステムの正確なゲノム編集を媒介する能力は、標的認識の高度に特異的な性質から生じる。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓシステム由来のＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と１４〜１５塩基対認識標的の間の完全な相補性を要求し、これは、ＣＲＩＳＰＲシステムの免疫機能が、自然に利用されることを示唆している（Jinekら、Science（２０１２年）、３３７巻（６０９６号）：８１６〜８２１頁、Brounsら、Science（２００８年）、３２１巻：９６０〜９６４頁、Semenovaら、ＰＮＡＳ（２０１１年）、１０８巻：１００９８〜１０１０３頁）。
ｃａｓ９遺伝子によりコードされるＣａｓ９ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼを利用して、定向ゲノム進化を行い／ゲノムＤＮＡなどのＤＮＡにおいて変化（欠失、置換、付加）を生成するゲノム編集の方法が、本明細書において記載される。ｃａｓ９遺伝子は、任意の供給源から、例えば細菌Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓなどの細菌から得られ得る。ｃａｓ９の核酸配列、および／またはＣａｓ９のアミノ酸配列は、天然に存在するｃａｓ９および／またはＣａｓ９の配列に対して、変異導入され得、変異は、例えば、１つもしくは複数の挿入、欠失、置換、または前述の２つもしくは３つの任意の組合せであり得る。かかる実施形態において、得られた変異導入Ｃａｓ９は、天然に存在するＣａｓ９と比較して、増強されたまたは低減したヌクレアーゼ活性を有し得る。
図１Ａ、１Ｂ、および１１Ａは、ＣＲＩＳＰＲに支援される合理的なタンパク質エンジニアリング（ＣＡＲＰＥ）と称される、ＣＲＩＳＰＲにより媒介されるゲノム編集法を提示する。ＣＡＲＰＥは、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）編集カセット由来の指向性変異を直接ゲノムに取り込む、「ドナー」ライブラリーおよび「最終」ライブラリーの作製に依存する２段階の構築プロセスである。ドナー構築の第１の段階（図１Ａ）において、合理的に設計された編集オリゴは、目的のオープンリーディングフレームの５’にある配列または他の配列などの、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする／標的にするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と共に細胞に共形質転換される。ＣＡＲＰＥの鍵となる技術革新は、隣接遺伝子における１つまたは複数の所望のコドンの変異を有する単一のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の欠失または変異を結合させ、これにより、１回の形質転換において完全なドナーライブラリーの作製を可能にする編集オリゴヌクレオチドの設計にある。次に、ドナーライブラリーは、編集オリゴヌクレオチド由来の合成特性を使用する、組換え染色体の増幅により（例えば、ＰＣＲ反応により）回収され、第２のＰＡＭ欠失または変異が、遺伝子の３’末端において同時に取り込まれる。従って、このアプローチは、コドン標的化変異を直接ＰＡＭ欠失に共有結合させる。ＣＡＲＰＥの第２の段階（図１Ｂ）において、最終ＰＡＭ欠失／変異、および標的化変異（１つまたは複数のコドンにおける１つまたは複数のヌクレオチドなどの、１つまたは複数のヌクレオチドの所望の変異）を有するＰＣＲにより増幅されたドナーライブラリーは、最終ｇＲＮＡベクターでナイーブ細胞に共形質転換されて、合理的に設計されたタンパク質ライブラリーを発現する細胞の集団が生み出される。
ＣＲＩＳＰＲシステムにおいて、ＣＲＩＳＰＲトランス活性化（ｔｒａｃｒＲＮＡ）およびスペーサーＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、標的領域の選択をガイドする。本明細書において使用される場合、標的領域は、少なくとも１つのコドン（１つまたは複数のコドン）における少なくとも１つのヌクレオチドの変異などの、少なくとも１つのヌクレオチドの変異が所望される、細胞または細胞の集団の核酸における任意の遺伝子座を指す。標的領域は、例えば、ゲノム遺伝子座（標的ゲノム配列）または染色体外遺伝子座であり得る。ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは、単一のガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、またはｇＲＮＡと称される、単一のキメラＲＮＡ分子として表され得る。ｇＲＮＡの核酸配列は、標的領域の領域に相補的である、第１の領域とも称される第１の核酸配列、およびステムループ構造を形成し、Ｃａｓ９を標的領域に動員するよう機能する、第２の領域とも称される第２の核酸配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡの第１の領域は、標的ゲノム配列の上流の領域に相補的である。一部の実施形態において、ｇＲＮＡの第１の領域は、標的領域の少なくとも一部に相補的である。ｇＲＮＡの第１の領域は、標的ゲノム配列に完全に相補的（１００％相補的）であり得るか、または１つもしくは複数のミスマッチを含み得、但し、それは、Ｃａｓ９に特異的にハイブリダイズ／ガイドし、動員するのに、標的ゲノム配列に十分に相補的である。一部の実施形態において、ｇＲＮＡの第１の領域は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または少なくとも３０ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ｇＲＮＡの第１の領域は、少なくとも２０ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、第２の核酸配列により形成されるステムループ構造は、少なくとも５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ステムループ構造は、８０〜９０または８２〜８５ヌクレオチド長であり、さらに特定の実施形態において、ステムループ構造を形成する、ｇＲＮＡの第２の領域は、８３ヌクレオチド長である。
一部の実施形態において、ＣＡＲＰＥ法を使用して、第１の細胞に導入される（ドナーライブラリーの）ｇＲＮＡの配列は、第２の細胞／ナイーブ細胞に導入される（最終ライブラリーの）ｇＲＮＡの配列と同一である。一部の実施形態において、１つより多くのｇＲＮＡは、第１の細胞の集団、および／または第２の細胞の集団に導入される。一部の実施形態において、１つより多くのｇＲＮＡ分子は、１つより多くの標的領域に相補的である、第１の核酸配列を含む。
ＣＡＲＰＥ法において、記載される方法において使用するための、編集オリゴヌクレオチドとも称される、２本鎖ＤＮＡカセットは、多くの供給源から得られるか、またはそれに由来し得る。例えば、一部の実施形態において、ｄｓＤＮＡカセットは、非相同なランダム組換え（ＮＲＲ）により多様化された核酸ライブラリーに由来し、かかるライブラリーは、ＮＲＲライブラリーと称される。一部の実施形態において、編集オリゴヌクレオチドは、例えば、アレイベースの合成により合成される。編集オリゴヌクレオチドの長さは、編集オリゴヌクレオチドを得る際に使用される方法に依存し得る。一部の実施形態において、編集オリゴヌクレオチドは、およそ５０〜２００ヌクレオチド、７５〜１５０ヌクレオチド、または８０〜１２０の間のヌクレオチド長である。
編集オリゴヌクレオチドは、（ａ）細胞の核酸の標的領域に相同であり、標的領域に対する少なくとも１つのコドンの変異（所望の変異と称される）を含む領域、および（ｂ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む。ＰＡＭ変異は、ＣＲＩＳＰＲシステムによりもはや認識されないように、ＰＡＭの配列を変異する、１つまたは複数のヌクレオチドの任意の挿入、欠失、または置換であり得る。かかるＰＡＭ変異を含む細胞は、ＣＲＩＳＰＲにより媒介される殺傷に対する「免疫」であると言われ得る。標的領域の配列に関連する所望の変異は、標的領域の少なくとも１つのコドンにおける１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、および／または置換であり得る。
ＣＡＲＰＥ法は、説明のみの目的のため、細菌の遺伝子に関連して以下で記載される。方法は、細菌および古細菌を含む任意の原核生物由来の遺伝子、または酵母および哺乳動物（ヒトを含む）を含む任意の真核生物由来の遺伝子を含む、目的の任意の遺伝子に適用され得る。ＣＡＲＰＥ法は、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムにおけるｇａｌＫ遺伝子において行われ、これは、部分的には、この遺伝子についての活性アッセイの利用可能性に起因している。方法を、ＢＷ２３１１５親株、およびリコンビニアリングを媒介するｐＳＩＭ５ベクター（Dattaら、Gene（２００８年）、３７９巻：１０９〜１１５頁）を使用して行った。ｃａｓ９遺伝子は、アラビノースの添加により切断活性の制御を可能にするｐＢＡＤプロモーターの制御下でｐＢＴＢＸ−２骨格にクローニングされた。合成ｄｓＤＮＡカセット（１２７ｂｐ）を選択的に取り込む能力の評価は、縮重プライマーから、および／またはマイクロアレイ技術を介して２７，０００個のメンバーライブラリーの一部として合成された合理的に設計されたオリゴヌクレオチド（オリゴ）から構築された、ＮＮＫライブラリー由来のｄｓＤＮＡカセットを使用して行われた。両方の場合において、オリゴヌクレオチドは、ｇａｌＫ遺伝子産物の活性部位残基に変異導入されるよう設計された。ドナー株ライブラリーの高度に効率的なリカバリーは、ｇａｌＫ遺伝子座において指向されたプライマーで得られる増幅産物サイズの変化に基づき検証された。ＮＲＲライブラリー由来のこれらのコロニーＰＣＲ産物の配列決定は、ｄｓＤＮＡカセット由来の合成プライミング部位（Ｐ１）が、効率約９０〜１００％で取り込まれたことを示した。これは、これらのライブラリーが、他のリコンビニアリングベースの編集アプローチにおいて典型的に使用されているエラープローンｍｕｔＳノックアウト株に依存することなく、高い効率で作製され得ることを示した（Costantinoら、ＰＮＡＳ（２００３年）、１００巻：１５７４８〜１５７５３頁、Wangら、Nature（２００９年）、４６０巻：８９４〜８９８頁）。コドン変異の効率の下降（約２０％）が存在し、それは、対立遺伝子置換中のｍｕｔＳ補正に起因し得る。最終ライブラリーにおけるクローンの予備的評価は、最終コドン編集効率が、構築の両方の相が、ｍｕｔＳ＋バックグラウンドにおいて行われるとき、約１０％であったことを示した。
同時選択可能な編集についての他の最近公開されたプロトコールとの比較は、ＰＡＭおよびコドン変異を共有結合させないが、代わりに複製中に互いに近接することによる、代替のプロトコールを使用して行われた（Wangら、Nat. Methods（２０１２年）、９巻：５９１〜５９３頁）。これらの非共有結合的実験において、上と同一の編集オリゴが使用され、同一のドナー／最終ＰＡＭ部位を標的にするｓｓＤＮＡオリゴを使用して、それらの挿入について同時選択するための努力がなされた。得られた変異体のコロニースクリーニングは、ＰＡＭ変異体のリカバリーにおける高い効率を明らかにする。しかしながら、これらは、ｄｓＤＮＡ編集カセットの挿入についての強力な同時選択でないように思われる。これは、ＰＡＭ欠失オリゴヌクレオチドの相対的リコンビニアリング効率の大きな差、およびかなり多い染色体欠失を生み出す編集カセットに起因し得る。
ＣＡＲＰＥ法の最終編集効率を改善する能力は、ドナー構築相中に変異の喪失を防ぐ努力において野生型ドナー株に導入される前に、例えば、ｍｕｔＳ欠損株においてドナー構築を行うことにより、評価され得る。加えて、ＣＡＲＰＥ法の一般性は、例えば、ｄｘｓ、ｍｅｔＡ、およびｆｏｌＡを含む、いくつかの必須遺伝子においてＣＡＲＰＥを利用することにより、評価され得る。必須遺伝子は、記載されるｇＲＮＡ設計ストラテジーを使用して、有効に標的化された。結果はまた、ドナーライブラリー作製中に生じる遺伝子破壊にも関わらず、ドナーライブラリーが有効に構築され、リコンビニアリングの１〜３時間後以内に回収され得ることを示す。
追跡可能なＣＲＩＳＰＲ濃縮リコンビニアリングによるゲノムエンジニアリング（ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ）と称されるＣＲＩＳＰＲにより媒介されるシステムを使用した、追跡可能な、正確なゲノム編集のための方法も、本明細書において提供される。ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ法は、編集カセットおよびｇＲＮＡ両方をコードする単一のベクターを使用して、高い効率の編集／変異導入を達成する。アレイベースのＤＮＡ合成などの、並行ＤＮＡ合成で使用されるとき、ＧＥＮ−ＴｒａＣＥＲは、何千もの正確な編集／変異の単一ステップの作製を提供し、細胞のゲノム（ゲノムＤＮＡ）の配列決定よりむしろ、ベクター上の編集カセットを配列決定することにより、変異をマッピングすることを可能にする。方法は、タンパク質およびゲノムエンジニアリング適用における、ならびに実験室の革新的実験において同定される変異などの、変異の再構築についての広範な有用性を有する。
ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ法およびベクターは、所望の変異およびＰＡＭ変異を含む編集カセットを、単一のベクター上のｇＲＮＡをコードする遺伝子と組み合わせ、それは、１回の反応において変異のライブラリーの作製を可能にする。図１１Ｂにおいて示される通り、方法は、所望の変異およびＰＡＭ変異を含む編集カセットを含むベクターを、細胞または細胞の集団に導入することを伴う。一部の実施形態において、ベクターが導入される細胞はまた、Ｃａｓ９もコードする。一部の実施形態において、Ｃａｓ９をコードする遺伝子は、細胞または細胞の集団にその後導入される。細胞または細胞集団において、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを含む、ＣＲＩＳＰＲシステムの発現が活性化され、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９を、ｄｓＤＮＡ切断が生じる標的領域に動員する。任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、標的領域に相補的な編集カセットの相同な領域は、ＰＡＭおよび標的領域の１つまたは複数のコドンに変異導入される。ＰＡＭ変異が組み込まれていない細胞の集団の細胞は、Ｃａｓ９により媒介されるｄｓＤＮＡ切断に起因する、編集されていない細胞の死を起こす。ＰＡＭ変異が組み込まれている細胞の集団の細胞は、細胞死を起こさず、それらは、生存可能なままであり、高い存在量に選択的に濃縮される。生細胞が得られ、標的変異のライブラリーを提供する。
ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲを使用した追跡可能なゲノム編集の方法は、（ａ）少なくとも１つの編集カセット、プロモーター、および少なくとも１つのｇＲＮＡをコードするベクターを、細胞または細胞の集団に導入し、これにより、ベクターを含む細胞または細胞の集団（細胞の第２の集団）を生成するステップ、（ｂ）Ｃａｓ９が発現される条件下で、細胞の第２の集団を維持するステップであって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、ベクター、第２のベクター、または細胞の第２の集団の細胞のゲノム上にコードされ、ＤＮＡ切断、およびＰＡＭ変異を含まない細胞の第２の集団の細胞の死をもたらし、一方、ＰＡＭ変異を含む細胞の第２の集団の細胞は、生存可能である、ステップ、（ｃ）生細胞を得るステップ、ならびに（ｄ）細胞の第２の集団の少なくとも１つの細胞におけるベクターの編集カセットを配列決定して、少なくとも１つのコドンの変異を同定するステップを含む。
一部の実施形態において、ｃａｓ９をコードする別々のベクターはまた、細胞または細胞の集団に導入される。ベクターを細胞または細胞の集団に導入することは、当該技術分野において公知の任意の方法または技術を使用して行われ得る。例えば、ベクターは、化学的形質転換およびエレクトロポレーションを含む形質転換、形質導入、ならびに微粒子銃などの、標準的プロトコールにより導入され得る。
編集カセットは、（ａ）細胞または細胞の集団における核酸の標的領域を認識し（それにハイブリダイズし）、細胞の核酸の標的領域に相同であり、標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、および（ｂ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む。ＰＡＭ変異は、変異導入されたＰＡＭ（ＰＡＭ変異）が、ＣＲＩＳＰＲシステムにより認識されないように、ＰＡＭの配列に変異導入する１つまたは複数のヌクレオチドの任意の挿入、欠失、または置換であり得る。例えば、ＰＡＭ変異を含む細胞は、ＣＲＩＳＰＲにより媒介される殺傷に対する「免疫」であると言われ得る。標的領域の配列に関連する所望の変異は、標的領域の少なくとも１つのコドンにおける１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、および／または置換であり得る。一部の実施形態において、ＰＡＭ変異と所望の変異の間の距離は、編集カセット上の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ＰＡＭ変異は、編集カセットの末端から少なくとも９ヌクレオチドに位置する。一部の実施形態において、所望の変異は、編集カセットの末端から少なくとも９ヌクレオチドに位置する。
一部の実施形態において、標的領域の配列に関連する所望の変異は、核酸配列の挿入である。標的領域に挿入された核酸配列は、任意の長さのものであり得る。一部の実施形態において、挿入された核酸配列は、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または少なくとも２０００ヌクレオチド長である。核酸配列が標的領域に挿入される実施形態において、編集カセットは、少なくとも３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または少なくとも６０ヌクレオチド長であり、標的領域に相同である、領域を含む。
用語「ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセット」は、編集カセット、プロモーター、スペーサー配列、およびｇＲＮＡをコードする遺伝子の少なくとも部分を指すために使用され得る。一部の実施形態において、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセット上のｇＲＮＡをコードする遺伝子の部分は、標的領域に相補的であるｇＲＮＡの部分をコードする。一部の実施形態において、標的領域に相補的であるｇＲＮＡの部分は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または少なくとも３０ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、標的領域に相補的であるｇＲＮＡの部分は、２４ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットは、少なくとも２つのプライミング部位をさらに含む。一部の実施形態において、プライミング部位を使用して、例えば、ＰＣＲにより、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットが増幅され得る。一部の実施形態において、標的領域に相補的であるｇＲＮＡの部分は、プライミング部位として使用される。
ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ法において、記載される方法における使用のための編集カセットおよびＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットは、多くの供給源から得られるか、またはこれに由来し得る。例えば、一部の実施形態において、編集カセットは、例えば、アレイベースの合成により合成される。一部の実施形態において、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットは、例えば、アレイベースの合成により合成される。編集カセットおよび／またはＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットの長さは、編集カセットおよび／またはＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットを得る際に使用される方法に依存し得る。一部の実施形態において、編集カセットは、およそ５０〜３００ヌクレオチド、７５〜２００ヌクレオチド、または８０〜１２０の間のヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットは、およそ５０〜３００ヌクレオチド、７５〜２００ヌクレオチド、または８０〜１２０の間のヌクレオチド長である。
一部の実施形態において、方法はまた、例えば、アレイベースの合成により、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットを得ること、およびベクターを構築することも伴う。ベクターを構築する方法は、当業者に公知であり、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットをベクターにライゲーションすることを伴い得る。一部の実施形態において、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットまたはＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットのサブセット（プール）は、ベクターの構築に先立ち、例えば、ＰＣＲにより増幅される。
ベクターを含み、Ｃａｓ９もコードする細胞または細胞の集団は、Ｃａｓ９が発現される条件下で維持されるか、または培養される。Ｃａｓ９発現は制御され得る。本明細書において記載される方法は、Ｃａｓ９発現が活性化され、Ｃａｓ９の生成をもたらす条件下で細胞を維持することを伴う。Ｃａｓ９が発現される具体的な条件は、Ｃａｓ９発現を調節するために使用されるプロモーターの性質などの、要因に依存するであろう。一部の実施形態において、Ｃａｓ９発現は、アラビノースなどの、インデューサー分子の存在下において誘導される。Ｃａｓ９をコードするＤＮＡを含む細胞または細胞の集団が、インデューサー分子の存在下にあるとき、Ｃａｓ９の発現が生じる。一部の実施形態において、Ｃａｓ９発現は、リプレッサー分子の存在下で抑制される。Ｃａｓ９をコードするＤＮＡを含む細胞または細胞の集団が、Ｃａｓ９の発現を抑制する分子の不存在下にあるとき、Ｃａｓ９の発現が生じる。
生存可能なままの細胞の集団の細胞は、Ｃａｓ９により媒介される殺傷の結果として編集されていない細胞の死を起こす細胞から得られるか、または分離され、これは、例えば、細胞の集団を培養物表面に広げて生細胞の成長を可能にすることにより行われ得、それは、次に、評価のため利用可能である。
ＰＡＭ変異に結合した所望の変異は、集団の生細胞（ＰＡＭ変異が組み込まれている細胞）中のベクター上の編集カセットを配列決定することにより、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ法を使用して追跡可能である。これは、細胞のゲノムを配列決定する必要なく、変異の容易な同定を可能にする。方法は、編集カセットを配列決定して、１つより多くのコドンの変異を同定することを伴う。ベクターの成分としての、またはベクターからの分離および任意選択で増幅の後、編集カセットの配列決定が行われ得る。配列決定は、Ｓａｎｇｅｒ配列決定などの、当該技術分野において公知の任意の配列決定法を使用して、行われ得る。
本明細書において記載される方法は、原核細胞および真核細胞を含む、ＣＲＩＳＰＲシステムが機能し得る（例えば、ＤＮＡを標的化し、切断する）任意のタイプの細胞において行われ得る。一部の実施形態において、細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）などの、細菌細胞である。他の実施形態において、細胞は、酵母細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの、真菌細胞である。他の実施形態において、細胞は、藻類細胞、植物細胞、昆虫細胞、またはヒト細胞を含む哺乳動物細胞である。
「ベクター」は、所望の配列、または細胞に送達されるべき、もしくは細胞において発現されるべき配列を含む様々な核酸のいずれかである。所望の配列は、例えば、制限およびライゲーションにより、または組換えにより、ベクターにおいて含まれ得る。ＲＮＡベクターも利用可能であるが、ベクターは、典型的にＤＮＡで構成される。ベクターは、プラスミド、フォスミド、ファージミド、ウイルスゲノム、および人工染色体を含むが、これらに限定されない。
ＧＥＮ−ＴｒａＣＥＲ法において有用なベクターは、本明細書において記載される少なくとも１つの編集カセット、プロモーター、およびｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む。一部の実施形態において、１つより多くの編集カセット（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ超の編集カセット）は、ベクター上に含まれる。一部の実施形態において、１つより多くの編集カセットは、異なる標的領域と相同である（例えば、異なる編集カセットが存在し、それぞれが、異なる標的領域と相同である）。あるいは、または加えて、ベクターは、１つより多くのｇＲＮＡ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ超のｇＲＮＡ）をコードする１つより多くの遺伝子を含んでもよい。一部の実施形態において、１つより多くのｇＲＮＡは、異なる標的領域の部分に相補的である領域を含有する（例えば、異なるｇＲＮＡが存在し、それぞれが、異なる標的領域の部分に相補的である）。
一部の実施形態において、少なくとも１つの編集カセット、プロモーター、およびｇＲＮＡの部分をコードする遺伝子を含む、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットは、ｇＲＮＡの別の部分をコードするベクターにライゲーションされる。ライゲーションの際、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセット由来のｇＲＮＡの部分およびｇＲＮＡの他の部分がライゲーションされて、機能性ｇＲＮＡが形成される。
プロモーターおよびｇＲＮＡをコードする遺伝子は、作動可能に連結される。一部の実施形態において、方法は、Ｃａｓ９をコードする第２のベクターの導入を含む。かかる実施形態において、ベクターは、Ｃａｓ９をコードする遺伝子に作動可能に連結した１つまたは複数のプロモーターをさらに含み得る。本明細書において使用される場合、「作動可能に」連結したは、プロモーターが、ｇＲＮＡをコードする遺伝子、またはＣａｓ９をコードする遺伝子などの、遺伝子をコードするＤＮＡの転写に影響するか、または調節することを意味する。プロモーターは、天然のプロモーター（ベクターが導入される細胞に存在するプロモーター）であり得る。一部の実施形態において、プロモーターは、分子（例えば、インデューサーまたはリプレッサー）の存在または不存在により調節されるプロモーターなどの、誘導可能または抑制可能なプロモーターである（プロモーターは調節されて、ｇＲＮＡをコードする遺伝子、またはＣａｓ９をコードする遺伝子などの、遺伝子の誘導可能または抑制可能な転写を可能にする）。ｇＲＮＡの発現に必要とされるプロモーターの性質は、種または細胞タイプに基づき変動し得、当業者に認識されるであろう。
一部の実施形態において、方法は、本明細書において記載される少なくとも１つの編集カセット、プロモーター、および少なくとも１つのｇＲＮＡを含むベクターの導入前またはそれと同時に、Ｃａｓ９をコードする別個のベクターを、細胞または細胞の集団に導入するステップを含む。一部の実施形態において、Ｃａｓ９をコードする遺伝子は、細胞または細胞の集団のゲノムに組み込まれる。Ｃａｓ９をコードするＤＮＡは、本明細書において記載される少なくとも１つの編集カセット、プロモーター、および少なくとも１つのｇＲＮＡを含むベクターの導入前、または本明細書において記載される少なくとも１つの編集カセット、プロモーター、および少なくとも１つのｇＲＮＡを含むベクターの導入後に、細胞のゲノムに組み込まれ得る。あるいは、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡなどの、核酸分子は、ゲノムに組み込まれたＤＮＡから発現され得る。一部の実施形態において、Ｃａｓ９をコードする遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれる。
本明細書において記載されるＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ法において有用なベクターは、スペーサー配列、２つもしくはそれ超のプライミング部位、またはスペーサー配列および２つもしくはそれ超のプライミング部位の両方をさらに含み得る。一部の実施形態において、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットに隣接するプライミング部位の存在は、編集カセット、プロモーター、およびｇＲＮＡ核酸配列の増幅を可能にする。
（実施例１）
ｇａｌＫを編集するためのＣＡＲＰＥ法の使用
ＣＡＲＰＥアプローチを、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムにおけるガラクトキナーゼ遺伝子ｇａｌＫ上で行った。遺伝子産物の活性を評価するために多くの利用可能なアッセイが存在する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＷ２３１１５親株、およびリコンビニアリングを媒介するｐＳＩＭ５ベクター（Dattaら、Gene（２００８年）、３７９巻：１０９〜１１５頁）を使用して、実験を行った。アラビノースの培養培地への添加による、Ｃａｓ９切断活性の制御を可能にするためのｐＢＡＤプロモーターの制御下で、ｐＢＴＢＸ−２骨格にＣａｓ９をコードする遺伝子をクローニングした。
第一に、合成ｄｓＤＮＡカセット（１２７ｂｐ）を選択的に取り込む能力を試験した。合成ｄｓＤＮＡカセットは、縮重プライマーから、またはマイクロアレイ技術を介して２７，０００個のメンバーのライブラリーの部分として合成した合理的に設計したオリゴから構築したＮＮＲライブラリーに由来した。両方の場合において、ｇａｌＫ遺伝子産物の活性部位残基に変異導入され、ならびに合成プライミング部位、Ｐ１（配列番号１）を含有するよう、オリゴヌクレオチドを設計した。ｇａｌＫ遺伝子座において指向させたプライマーを使用したコロニーＰＣＲにより得た増幅産物サイズの変化に基づき、ドナー株ライブラリーの高度に効率的なリカバリーを検証した。ＮＮＲライブラリー由来のコロニーＰＣＲ産物の配列決定は、ｄｓＤＮＡカセット由来の合成プライミング部位（Ｐ１）を効率約９０〜１００％で取り込むことを示した（図２）。この驚くべき、予測外の結果は、他のリコンビニアリングベースの編集アプローチ（Constantinoら、PNAS（２００３年）、１００巻：１５７４８〜１５７５３頁、Wangら、Nature（２００９年）、４６０巻：８９４〜８９８頁）において典型的に使用されているエラープローンｍｕｔＳ欠損株に依存することなく、高い効率でライブラリーが作製され得ることを示唆する。しかしながら、コドン変異の効率の下降（約２０％）が存在し、それは、対立遺伝子置換中のＭｕｔＳによる補正に起因し得る。この研究において、構築の両方の相を、ｍｕｔＳ＋バックグラウンドにおいて行うとき、最終コドン編集効率は約１０％であった。
ＣＡＲＰＥ法の最終編集効率および一般性を増強するために、ドナー構築相中の変異の喪失を防ぐ努力において、ｍｕｔＳ＋ドナー株に導入される前に、ｍｕｔＳ欠損株においてドナー構築を行うことができる。
（実施例２）
必須の遺伝子を標的にするためのＣＡＲＰＥ法の使用
ＣＡＲＰＥアプローチの一般性を試験するために、上で記載した通り、ｄｘｓ、ｍｅｔＡ、およびｆｏｌＡを含む、いくつかの必須遺伝子において、方法を使用した。ｇＲＮＡ設計ストラテジーを使用して、必須遺伝子を標的化することができる（図３）。
ｄｘｓ遺伝子を標的化するＣＡＲＰＥ実験由来のデータはまた、ドナーライブラリー作製中に生じる遺伝子破壊にも関わらず、リコンビニアリングの１〜３時間後以内にドナーライブラリーを有効に構築し、回収することが可能であることも示唆する。
（実施例３）
イソペンテノールの生成を調節するためのＣＡＲＰＥ法の使用
細菌生成を介した産業上の製造のための良好なバイオ燃料の捜索は、当該技術分野の水準のゲノム設計、エンジニアリング、および所望の生成物についてのスクリーニングを行う能力を要求する。これまでに、本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムにおける全ての遺伝子の発現レベルを個々に修飾する能力を示した（Warnerら、Nat. Biotechnol（２０１０年）、２８巻：８５６〜８６２頁）。追跡可能な多重リコンビニアリング（ＴＲＭＲ）と呼ばれるこの方法は、約８０００個のゲノム的に修飾した細胞（約４０００個の過剰発現した遺伝子、および約４０００個のノックダウンした遺伝子）のライブラリーを生成した。このライブラリーは、異なる条件下で後にスクリーニングされ、それは、遺伝子産物の活性のより深い理解を可能にし、これらの選択下で良好に遂行する株をもたらした。ＴＲＭＲは、２つのレベル（過剰発現およびノックダウン）のタンパク質発現の修飾を可能にするが、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の修飾を可能にしなかった。ここで、本発明者らは、バイオ燃料の最適な生成のための、ＯＲＦ修飾および全代謝経路をエンジニアリングする、巨大なライブラリーを生成することを目的とする。
（ランダム変異誘発と対照的に）合理的に設計されるかかるライブラリーを生成する際の主な困難は、所望の変異の標的細胞への挿入効率である。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるゲノム修飾の基準の方法であるリコンビニアリングは、外来ＤＮＡの宿主ゲノムへの挿入を促進するためにラムダファージ由来の組換え遺伝子を使用する。しかしながら、このプロセスは、低い効率に苦しみ、抗生物質耐性遺伝子の付加に続く選択（ＴＲＭＲにおいてなど）、または組換え事象の再帰的な誘導（すなわち、ＭＡＧＥによる（Wangら、Nature（２００８年）、４６０巻：８９４〜８９８頁）のいずれかにより、克服し得る。本明細書において記載されるＣＡＲＰＥ法は、集団由来の全ての非組換え細胞を取り除くためのＣＲＩＳＰＲシステムの使用に伴ってリコンビニアリング効率を増大する。ＣＲＩＳＰＲは、侵襲性ファージおよびプラスミドに対する、最近発見されたＲＮＡベースの細菌および古細菌の適応性防御機構である（Bhayaら、Ann. Rev. of Genetics（２０１１年）、４５巻：２７３〜２９７頁）。このシステムは、２つのプラスミド、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼＣａｓ９をコードする１つのプラスミド、およびＣａｓ９をその固有の位置にガイドする配列特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする第２のプラスミドを使用して、配列指向性２本鎖切断を可能にする、広範なエンジニアリングを起こした（Qiら、Cell（２０１３年）、４５巻：２７３〜２９７頁）。ＣＡＲＰＥ法は、配列に依存した態様でＤＮＡ切断およびその結果として細胞死を誘導するＣＲＩＳＰＲシステムの能力を利用する。本発明者らは、ＯＲＦ内の所望の変異に加えて、ＣＲＩＳＰＲ機構により標的にされる遺伝子のオープンリーディングフレームの外側の共通の位置の変異を含む、ＤＮＡリコンビニアリングカセットを生成した。ＰＡＭ変異／欠失に起因する、ＣＲＩＳＰＲにより媒介される死の回避を伴い、所望の変異を連結／結合するこのアプローチは、細胞の総集団内の操作された細胞の劇的な濃縮を可能にする。
方法を、ＤＸＳ経路を使用してさらに示す。ＤＳＸ経路は、テルペンおよびテルペノイドの生合成をもたらす、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）の生成をもたらす。興味深いことに、ＩＰＰはまた、リコペンまたはイソペンテノールの前駆体でもあり、必要な遺伝子の付加をもたらし得る。リコペンは、細菌のコロニーを赤色にし、故に、容易にスクリーニング可能である一方で、イソペンテノールは、エタノールより高いエネルギー密度および低い水混和性を有する「第２世代」バイオ燃料であると考えられる。３種のタンパク質をエンジニアリングのために選択した：１）経路の第１の酵素および律速酵素、ＤＳＸ、２）ＤＸＳ経路由来の代謝フラックスを転用する、ＩｓｐＢ、ならびに３）Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ両方においてＩＰＰをイソペンテノールに変換することが示された、ＮｕｄＦ（Withersら、App. Environ. Microbiol（２００７年）、７３巻：６２７７〜６２８３頁、Zhengら、Biotechnol. for biofuels（２０１３年）、６巻：５７頁）。ＤＸＳおよびＩｓｐＢをコードする遺伝子における変異を、コロニー色素定量のために開発された新規画像分析ツールで、リコペン生成の増大についてスクリーニングする。ＮｕｄＦ活性を、ＧＣ／ＭＳによりイソペンテノールレベルを測定することにより直接的に、およびバイオセンサーとして機能するイソペンテノール栄養要求性細胞により間接的にアッセイする。この方法は、高い正確さおよび効率でＥ．ｃｏｌｉゲノムへの巨大変異ライブラリーを合理的に操作する能力、および高収量のイソペンテノールを生成する株をもたらす。
（実施例４）
ｇａｌＫを編集するためのＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ法の使用
ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ法を使用して、ｇａｌＫ遺伝子を編集し、それは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるリコンビニアリングのためのモデルシステムとして働いた（Yuら、２０００年）。構築した第１のＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットを、ｇａｌＫ＿Ｑ２４と称される、ｇａｌＫのコドン２４におけるインフレームＰＡＭの位置に終結コドンを導入するよう設計した（図１２）。構築物およびベクターを、高処理で必要な変異を生成する、カスタムパイソンスクリプトを使用して、設計した。
対照カセットを、環状ポリメラーゼクローニング（ＣＰＥＣ）法を使用して、Qiら、Cell（２０１３年）により記載されるｇＲＮＡベクターにクローニングした。骨格を、次のプライマー、ＣＣＡＧＡＡＡＴＣＡＴＣＣＴＴＡＧＣＧＡＡＡＧＣＴＡＡＧＧＡＴ（配列番号２９）、およびＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴ（配列番号３０）で直線化した。
ＧｅｎＴＲＡＣＥＲカセットをｇｂｌｏｃｋｓとして注文し、次のプライマー
ＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＡＴＴＴＣＡＧＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＣＴＴＡＧＣＴＴＴＣＧＣＴＡＡＧＧＡＴＧＡＴＴＴＣＴＧＧ（配列番号３１）、
ＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ（配列番号３２）
を使用して増幅した。
成分を、ＣＰＥＣを使用して一緒にまとめ（ｓｔｉｔｃｈ）、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換して、ベクターを作製した。この手順は、１０４〜１０５ＣＦＵ／μｇのオーダーのクローニング効率で、プールしたオリゴヌクレオチドライブラリーを使用して、多重で行われるべきである。
ｐＳＩＭ５（ラムダＲＥＤプラスミド）およびＸ２−ｃａｓ９プラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５細胞を、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、および３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ中３０℃において、中央対数期（０．４〜０．７ＯＤ）まで成長させた。ｐＳＩＭ５ベクターのリコンビニアリング機能を、４２℃において１５分間誘導し、次に、氷上に１０分間置いた。次に、ペレット化して冷却Ｈ２Ｏ １０ｍＬで２回洗浄することにより、細胞をエレクトロコンピテントにした。細胞を、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲプラスミド（カルベニシリン耐性もコードする）１００ｎｇで形質転換し、３７℃にて３時間で回収した。細胞５０〜１００μＬを、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、および１００μｇ／ｍｌカルベニシリン（carbenecillin）を含有する適当な培地にプレーティングして、ＣＲＩＳＰＲにより編集された株について選択的に濃縮した。ｇａｌＫ遺伝子についての編集効率を、ガラクトースを添加したＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天上での赤色／白色スクリーニングを使用して、計算した。
ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天上でのスクリーニングに基づき、約１００％の編集効率が、ｇａｌＫ＿Ｑ２４＊設計で観察された。興味深いことに、高い効率を達成するためにミスマッチ修復ノックアウトを必要とする、オリゴにより媒介されるリコンビニアリング方法（Liら、２００３年、Sawitzkeら、２０１１年、Wangら、２０１１年）と異なり、インタクトなミスマッチ修復機構を有するか、または有しない株において、効果は存在しなかった。
次に、染色体およびベクター配列を、Ｓａｎｇｅｒ配列決定により検証した。
予測した通り、ベクターにおける設計した変異を、染色体上に写し（図１３）、これは、変異が両方の位置に存在したこと、およびプラスミドが、トランス作用性バーコード（トランス−バーコード）またはゲノム編集の記録として働くことを示している。
Ｃａｓ９により媒介される切断に対して細胞を「免疫する」が、撹乱されていない翻訳産物をそのままにする、同義のＰＡＭ変異（図１４Ｂ、ΔＰＡＭ）からなる「サイレント選択可能な痕（ｓｉｌｅｎｔ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｓｃａｒ）」を生み出すことにより、ゲノムスケールでのタンパク質コードフレームの合理的な変異誘発のため、設計を適合させた。本発明者らは、サイレント痕が、コドンにおける近くの編集についての同時選択、または目的の他の特性を高い効率で可能にし得ると判断した。相同性アームの長さの効果、およびｇａｌＫにおけるＰＡＭ変異／欠失と所望の変異の間の距離を評価し、効率を比較した（図１６Ｂ）。相同性アームの長さを、同一のＰＡＭ編集により、８０〜１００ヌクレオチド（それぞれ、約５％および４５％）まで伸長させたとき、ｇａｌＫ位置１４５における変異の効率の有意な増大が観察された。
（実施例５）
変異を再構築するためのＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ法の使用
簡単なユーザーインプット定義でゲノム周囲の部位の標的化を可能にする、カスタム自動設計ソフトウエアを使用して、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲアプローチをゲノムスケールまで拡大させた。Ｅ．ｃｏｌｉにおける温度適応の最近報告された研究（Tenaillonら、２０１２年）から、非同義の点変異の全てを再構築することにより、アプローチを試験した。この研究は、独立して増殖させた株由来の１１５種の単離物において生じた変異の完全なセットを特徴付けた。このデータセットは変異の多様な供給源をもたらし、その個々の適合効果がこの複雑な表現型の機構的支持をさらに明らかにする。コドン使用およびΔＰＡＭの２倍の多重度で、これらの変異のそれぞれを再構築し、可能であれば、下流の適合解析におけるＰＡＭおよび標的コドン変異の両方についての統計的補正を可能にした。
（実施例６）
遺伝子相互作用を調節するためのＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ法の使用
Ｅ．ｃｏｌｉゲノムにおけるそれぞれの遺伝子の上流の環境要因（酸素レベル、炭素供給源、ストレス）により著しく調節されるプロモーターを組み込むことにより、ライブラリーを作り直すプロモーターを作製する。ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ法を使用して、例えば、生成のため目的の化学物質に対する耐性について有益であり得る、作り直された遺伝子型を有する株を作製する。

Claims (53)

  1. （ａ）（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、前記標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む編集カセット、
    （ｉｉ）プロモーター、ならびに
    （ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および
    （ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）
    を含む、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
    をコードするベクターを細胞に導入して、これにより、ベクターを含む細胞を生成するステップ、
    （ｂ）Ｃａｓ９が発現される条件下で前記ベクターを含む細胞を維持するステップであって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、前記ベクター上にコードされるか、第２のベクター上にコードされるか、または前記細胞のゲノム上にコードされ、前記ベクターを含み前記ＰＡＭ変異を含まない細胞ならびに前記ベクターおよび前記ＰＡＭ変異を含む細胞の生成をもたらす、ステップ、
    （ｃ）（ｂ）の生成物を細胞生存に適した条件下で培養し、これにより、生細胞を生成するステップ、
    （ｄ）（ｃ）において生成された生細胞を得るステップ、ならびに
    （ｅ）（ｄ）において得られた少なくとも１つの生細胞の前記ベクターの編集オリゴヌクレオチドを配列決定し、少なくとも１つのコドンの前記変異を同定するステップ
    を含む、ゲノムエンジニアリングの方法。
  2. （ａ）（ｉ）（ａ）核酸の標的領域に相同であり、前記標的領域に対する変異を含む領域、および（ｂ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む少なくとも１つの編集カセット、
    （ｉｉ）少なくとも１つのプロモーター、ならびに
    （ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
    をコードするベクターを細胞の第１の集団に導入して、これにより、ベクターを含む細胞の第２の集団を生成するステップ、
    （ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼが発現される条件下で細胞の前記第２の集団を維持するステップであって、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、前記ベクター、第２のベクター、または細胞の前記第２の集団の細胞のゲノム上にコードされ、前記ＰＡＭ変異を含まない細胞におけるＤＮＡ切断およびかかる細胞の死をもたらす、ステップ、
    （ｃ）（ｂ）において生成された生細胞を得るステップ、ならびに
    （ｄ）細胞の前記第２の集団の少なくとも１つの細胞の前記ベクターの編集オリゴヌクレオチドを配列決定することにより、少なくとも１つのコドンの前記変異を同定するステップ
    を含む、追跡可能なＣＲＩＳＰＲ濃縮リコンビニアリングによるゲノムエンジニアリングの方法。
  3. 編集オリゴヌクレオチドの集団を合成するおよび／または得るステップをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 編集オリゴヌクレオチドの前記集団を増幅するステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ベクターが、スペーサーおよび／または少なくとも２つのプライミング部位をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記編集カセットが、前記ＰＡＭ変異の１００ヌクレオチド以内の少なくとも１つのコドンの変異を含む標的領域を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. （ａ）（ｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する遺伝子（隣接遺伝子）における少なくとも１つのコドンの変異を有する第１の単一のＰＡＭの欠失と結合する、合理的に設計されたオリゴヌクレオチドなどの、１つまたは複数の編集オリゴヌクレオチド、および（ｂ）染色体のオープンリーディングフレームの５’にあるヌクレオチド配列を標的にするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、第１の細胞の集団に導入すること（それらにより第１の細胞の集団を共形質転換すること）により、プラスミド中に組換え染色体または組換えＤＮＡなどの組換えＤＮＡを含む、ドナーライブラリーを構築し、これにより、標的化されたコドン変異を有する組換え染色体を含む第１の細胞の集団を含むドナーライブラリーを生成するステップ、
    （ｂ）前記編集オリゴ由来の合成特性を使用し、前記遺伝子の３’末端の第２のＰＡＭ欠失（最終ＰＡＭ欠失）を同時に取り込む組換えＤＮＡ（組換え染色体など）の増幅（ＰＣＲ増幅など）により、（ａ）において構築された前記ドナーライブラリーを回収し、これにより、標的化されたコドン変異を前記最終ＰＡＭ欠失に直接共有結合させ、前記最終ＰＡＭ欠失および標的化されたコドン変異を有する回収されたドナーライブラリーを生成するステップ、ならびに
    （ｃ）前記最終ＰＡＭ欠失および標的化されたコドン変異を有する前記回収されたドナーライブラリー、ならびに最終ｇＲＮＡプラスミドを、ナイーブ細胞の集団に共形質転換し、これにより、標的化されたコドン変異を含む最終ライブラリーを生成するステップ
    を含む、ＣＲＩＳＰＲに支援される合理的なタンパク質エンジニアリング（コンビナトリアルゲノムエンジニアリング）の方法。
  8. タンパク質が生成される条件下で前記最終ライブラリーを維持するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
  9. 細胞の前記第１の集団が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを発現する、請求項７または請求項８に記載の方法。
  10. Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、誘導可能なプロモーターの制御下で発現される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記編集オリゴヌクレオチドが、前記第１の細胞に存在する標的核酸に相補的である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記編集オリゴヌクレオチドが、前記第１の細胞における１つより多くの標的部位または遺伝子座を標的にする、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記編集オリゴヌクレオチドの核酸配列が、前記標的核酸に対する１つまたは複数の置換、欠失、挿入を含む、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記編集オリゴヌクレオチドが合理的に設計される、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記編集オリゴヌクレオチドが、縮重プライマーオリゴヌクレオチドを使用して生成される、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記編集オリゴヌクレオチドが、核酸の収集物（ライブラリー）に由来する、請求項７に記載の方法。
  17. 前記ｇＲＮＡがプラスミド上にコードされる、請求項７に記載の方法。
  18. 前記編集オリゴヌクレオチドおよび前記ｇＲＮＡが、形質転換により前記第１の細胞に導入される、請求項７に記載の方法。
  19. 前記編集オリゴヌクレオチドおよび前記ｇＲＮＡが、前記第１の細胞に順次導入される、請求項７に記載の方法。
  20. 前記編集オリゴヌクレオチドおよび前記ｇＲＮＡが、前記第１の細胞に同時に導入される、請求項７に記載の方法。
  21. 前記ドナーライブラリーを回収するステップが、（ａ）前記編集オリゴヌクレオチドの取り込みについて細胞をスクリーニングするステップ、および（ｂ）前記編集オリゴヌクレオチドを取り込んだことが確認された細胞を選択するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
  22. 前記ドナーライブラリーを回収するステップが、前記回収されたドナーライブラリーを処理するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
  23. 前記最終細胞／ナイーブ細胞が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを発現する、請求項７に記載の方法。
  24. Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、誘導可能なプロモーターの制御下で発現される、請求項２３に記載の方法。
  25. （ａ）（ｉ）編集オリゴヌクレオチドを含む合成ｄｓＤＮＡ編集カセット、および（ｉｉ）目的の遺伝子のすぐ上流のゲノム配列を標的にするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現するベクターを、第１の細胞の集団に、前記編集オリゴヌクレオチドのｇＲＮＡによる多重リコンビニアリングおよび選択的濃縮が生じる条件下で導入し（共形質転換し）、これにより、ドナーライブラリーを生成するステップ、
    （ｂ）目的の前記遺伝子の３’末端に隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（最終ＰＡＭ）を欠失する、オリゴヌクレオチドを有する前記ドナーライブラリーを増幅し、これにより、３’ＰＡＭ欠失を有するｄｓＤＮＡ編集カセット、合理的なコドン変異、およびＰ１部位を含む増幅されたドナーライブラリーを生成するステップ、
    （ｃ）前記増幅されたドナーライブラリーを、ＢｓａＩで処理して、前記Ｐ１部位を取り除くステップ、ならびに
    （ｄ）（ｃ）において生成された前記増幅されたドナーライブラリーおよび最終ｇＲＮＡで、ナイーブ細胞の集団を共形質転換し、これにより、３’ＰＡＭ欠失を有するｄｓＤＮＡ編集カセット、合理的なコドン変異、および最終ｇＲＮＡを含む、共形質転換された細胞の集団を生成するステップ
    を含む、ＣＲＩＳＰＲに支援される合理的なタンパク質エンジニアリングの方法。
  26. （ｄ）において生成された共形質転換された細胞の前記集団を、タンパク質発現が生じる条件下で維持するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記第１の細胞が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを発現する、請求項２５または２６に記載の方法。
  28. Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、誘導可能なプロモーターの制御下で発現される、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記編集オリゴヌクレオチドが、前記第１の細胞に存在する標的核酸に相補的である、請求項２５に記載の方法。
  30. 前記編集オリゴヌクレオチドが、前記第１の細胞における１つより多くの標的部位または遺伝子座を標的にする、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記編集オリゴヌクレオチドの核酸配列が、前記標的核酸に対する１つまたは複数の置換、欠失、挿入を含む、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記編集オリゴヌクレオチドが合理的に設計される、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記編集オリゴヌクレオチドが、縮重プライマーオリゴヌクレオチドを使用して生成される、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記編集オリゴヌクレオチドが、核酸の収集物（ライブラリー）に由来する、請求項２５に記載の方法。
  35. 前記ｇＲＮＡがプラスミド上にコードされる、請求項２５に記載の方法。
  36. 前記編集オリゴヌクレオチドおよび前記ｇＲＮＡが、形質転換により前記第１の細胞に導入される、請求項２５に記載の方法。
  37. 前記編集オリゴヌクレオチドおよび前記ｇＲＮＡが、第１の細胞の前記集団に順次導入される、請求項２５に記載の方法。
  38. 前記編集オリゴヌクレオチドおよび前記ｇＲＮＡが、前記第１の細胞に同時に導入される、請求項２５に記載の方法。
  39. 前記ドナーライブラリーを回収するステップが、（ａ）前記編集オリゴヌクレオチドの取り込みについて細胞をスクリーニングするステップ、および（ｂ）前記編集オリゴヌクレオチドを取り込んだことが確認された細胞を選択するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  40. 前記ドナーライブラリーを回収するステップが、前記回収されたドナーライブラリーを処理するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  41. 前記最終細胞／ナイーブ細胞が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを発現する、請求項２５に記載の方法。
  42. Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、誘導可能なプロモーターの制御下で発現される、請求項３８に記載の方法。
  43. （ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同である領域を含み、前記標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む編集カセット、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異、
    （ｉｉ）プロモーター、ならびに
    （ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および
    （ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）
    を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
    を含む、ベクター。
  44. （ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同である領域を含み、前記標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む編集カセット、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異、
    （ｉｉ）プロモーター、ならびに
    （ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および
    （ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）
    を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
    を含む、ベクター。
  45. （ｉ）（ａ）核酸の標的領域に相同であり、前記標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異を含む領域、および（ｂ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む少なくとも１つの編集カセット、
    （ｉｉ）少なくとも１つのプロモーター、ならびに
    （ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
    を含む、ベクター。
  46. （ｉ）（ａ）核酸の標的領域に相同であり、前記標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異を含む領域、および（ｂ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む少なくとも１つの編集カセット、
    （ｉｉ）少なくとも１つのプロモーター、ならびに
    （ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
    を含む、ベクター。
  47. スペーサー、少なくとも２つのプライミング部位、またはスペーサーおよび少なくとも２つのプライミング部位をさらに含む、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載のベクター。
  48. 前記編集カセットが、前記ＰＡＭ変異の１００ヌクレオチド以内に少なくとも１つのコドンの変異を含む標的領域を含む、請求項４４、４６、または４７のいずれか一項に記載のベクター。
  49. 請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法により生成される細胞の集団を含む、ライブラリー。
  50. 請求項４３〜４８のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞の集団を含む、ライブラリー。
  51. （ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、前記標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む編集カセット、
    （ｉｉ）プロモーター、ならびに
    （ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および
    （ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）
    を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
    を含むベクターを含む、細胞の集団。
  52. （ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、前記標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む編集カセット、
    （ｉｉ）プロモーター、ならびに
    （ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および
    （ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）
    を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
    を含むベクターを含む、細胞の集団。
  53. （ａ）（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、前記標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む編集カセット、
    （ｉｉ）プロモーター、ならびに
    （ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および
    （ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）
    を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
    をコードするベクターを細胞に導入して、これにより、前記ベクターを含む細胞を生成するステップ、
    （ｂ）Ｃａｓ９が発現される条件下で前記ベクターを含む細胞を維持するステップであって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、前記ベクター上にコードされるか、第２のベクター上にコードされるか、または前記細胞のゲノム上にコードされ、前記ベクターを含み前記ＰＡＭ変異を含まない細胞ならびに前記ベクターおよび前記ＰＡＭ変異を含む細胞の生成をもたらす、ステップ、
    （ｃ）（ｂ）の生成物を細胞生存に適した条件下で培養し、これにより、生細胞を生成するステップ、
    （ｄ）（ｃ）において生成された生細胞を得るステップ、ならびに
    （ｅ）（ｄ）において得られた少なくとも１つの生細胞の前記ベクターの編集オリゴヌクレオチドを配列決定し、少なくとも１つのコドンの前記変異を同定するステップ
    を含む、ゲノムエンジニアリングの方法。
JP2016568490A 2014-02-11 2015-02-11 Ｃｒｉｓｐｒにより可能にされる多重ゲノムエンジニアリング Withdrawn JP2017505145A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461938608P 2014-02-11 2014-02-11
US61/938,608 2014-02-11
PCT/US2015/015476 WO2015123339A1 (en) 2014-02-11 2015-02-11 Crispr enabled multiplexed genome engineering

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019167052A Division JP6863620B2 (ja) 2014-02-11 2019-09-13 Ｃｒｉｓｐｒにより可能にされる多重ゲノムエンジニアリング

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2017505145A true JP2017505145A (ja) 2017-02-16
JP2017505145A5 JP2017505145A5 (ja) 2018-07-19

Family

ID=53800598

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016568490A Withdrawn JP2017505145A (ja) 2014-02-11 2015-02-11 Ｃｒｉｓｐｒにより可能にされる多重ゲノムエンジニアリング
JP2019167052A Active JP6863620B2 (ja) 2014-02-11 2019-09-13 Ｃｒｉｓｐｒにより可能にされる多重ゲノムエンジニアリング
JP2021036322A Active JP7232540B2 (ja) 2014-02-11 2021-03-08 Ｃｒｉｓｐｒにより可能にされる多重ゲノムエンジニアリング

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019167052A Active JP6863620B2 (ja) 2014-02-11 2019-09-13 Ｃｒｉｓｐｒにより可能にされる多重ゲノムエンジニアリング
JP2021036322A Active JP7232540B2 (ja) 2014-02-11 2021-03-08 Ｃｒｉｓｐｒにより可能にされる多重ゲノムエンジニアリング

Country Status (22)

Country Link
US (16) US10266849B2 (ja)
EP (4) EP4063503A1 (ja)
JP (3) JP2017505145A (ja)
KR (3) KR20220142547A (ja)
CN (2) CN106164271B (ja)
AU (2) AU2015217208B2 (ja)
CA (3) CA3075047C (ja)
CY (1) CY1123115T1 (ja)
DE (1) DE212015000061U1 (ja)
DK (1) DK3105328T3 (ja)
ES (2) ES2802984T3 (ja)
GB (1) GB2544382B (ja)
HR (1) HRP20201040T1 (ja)
HU (2) HUE066611T2 (ja)
IL (2) IL246951B (ja)
LT (1) LT3105328T (ja)
MX (1) MX2016010285A (ja)
PL (1) PL3105328T3 (ja)
PT (1) PT3105328T (ja)
RS (1) RS60492B1 (ja)
SI (1) SI3105328T1 (ja)
WO (1) WO2015123339A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200024247A (ko) * 2017-06-30 2020-03-06 인스크립타 인코포레이티드 자동 세포 처리 방법, 모듈, 기기 및 시스템
JPWO2020250855A1 (ja) * 2019-06-11 2020-12-17
JP2021087454A (ja) * 2014-02-11 2021-06-10 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイトＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＯＬＯＲＡＤＯ，ａ ｂｏｄｙ ｃｏｒｐｏｒａｔｅ Ｃｒｉｓｐｒにより可能にされる多重ゲノムエンジニアリング

Families Citing this family (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2853829C (en) 2011-07-22 2023-09-26 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
RS62263B1 (sr) 2013-04-16 2021-09-30 Regeneron Pharma Ciljana modifikacija genoma pacova
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
CA2930015A1 (en) 2013-11-07 2015-05-14 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions with governing grnas
RU2725520C2 (ru) 2013-12-11 2020-07-02 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы и композиции для направленной модификации генома
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
GB201406968D0 (en) 2014-04-17 2014-06-04 Green Biologics Ltd Deletion mutants
GB201406970D0 (en) 2014-04-17 2014-06-04 Green Biologics Ltd Targeted mutations
CN111647627A (zh) 2014-04-28 2020-09-11 重组股份有限公司 多重基因编辑
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
CN108291218B (zh) * 2015-07-15 2022-08-19 新泽西鲁特格斯州立大学 核酸酶非依赖性靶向基因编辑平台及其用途
ES2840648T3 (es) * 2015-10-22 2021-07-07 Inst Nat Sante Rech Med Generación de código de barras de endonucleasa
IL294014B2 (en) 2015-10-23 2024-07-01 Harvard College Nucleobase editors and their uses
CA3007635A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Zymergen Inc. Promoters from corynebacterium glutamicum
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
WO2017106251A1 (en) * 2015-12-14 2017-06-22 President And Fellows Of Harvard College Cas discrimination using tuned guide rna
US11254928B2 (en) 2016-01-15 2022-02-22 Astrazeneca Ab Gene modification assays
EP3219799A1 (en) 2016-03-17 2017-09-20 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Conditional crispr sgrna expression
US11939571B2 (en) * 2016-06-10 2024-03-26 President And Fellows Of Harvard College Library-scale engineering of metabolic pathways
WO2017217768A1 (ko) * 2016-06-15 2017-12-21 주식회사 툴젠 온타겟 및 오프타겟의 다중 타겟 시스템을 이용하는, 표적 특이적 유전자 가위 스크리닝 방법 및 이의 용도
US11293021B1 (en) 2016-06-23 2022-04-05 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
JP2019518478A (ja) 2016-06-24 2019-07-04 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイトＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＯＬＯＲＡＤＯ，ａ ｂｏｄｙ ｃｏｒｐｏｒａｔｅ バーコードを付けたコンビナトリアルライブラリーを生成する方法
KR102345898B1 (ko) 2016-06-30 2022-01-03 지머젠 인코포레이티드 글루코오스 투과 효소 라이브러리를 생성하는 방법 및 이의 용도
WO2018005655A2 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Zymergen Inc. Methods for generating a bacterial hemoglobin library and uses thereof
IL308426A (en) 2016-08-03 2024-01-01 Harvard College Adenosine nuclear base editors and their uses
HRP20220406T1 (hr) 2016-08-08 2022-05-27 Aerase, Inc. Pripravci i metode za liječenje raka deplecijom arginina i imunoonkološkim sredstvima
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
SG11201903089RA (en) 2016-10-14 2019-05-30 Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US12065666B2 (en) 2017-01-05 2024-08-20 Rutgers, The State University Of New Jersey Targeted gene editing platform independent of DNA double strand break and uses thereof
ES2928176T3 (es) 2017-01-10 2022-11-16 Christiana Care Gene Editing Inst Llc Métodos para mutagénesis dirigida al sitio in vitro mediante el uso de tecnologías de edición de genes
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
EP3592777A1 (en) 2017-03-10 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Cytosine to guanine base editor
JP7191388B2 (ja) 2017-03-23 2022-12-19 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸によってプログラム可能なｄｎａ結合蛋白質を含む核酸塩基編集因子
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
US10738327B2 (en) 2017-08-28 2020-08-11 Inscripta, Inc. Electroporation cuvettes for automation
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
AU2018336128B2 (en) 2017-09-19 2023-01-05 Tropic Biosciences UK Limited Modifying the specificity of plant non-coding RNA molecules for silencing gene expression
US10435713B2 (en) 2017-09-30 2019-10-08 Inscripta, Inc. Flow through electroporation instrumentation
CN111757937A (zh) 2017-10-16 2020-10-09 布罗德研究所股份有限公司 腺苷碱基编辑器的用途
KR20200122298A (ko) 2017-12-05 2020-10-27 에어레이즈, 인크. 아르기나제 1 결핍을 치료하기 위한 방법 및 조성물
AU2019241967A1 (en) 2018-03-29 2020-11-19 Inscripta, Inc. Automated control of cell growth rates for induction and transformation
WO2019200004A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 Inscripta, Inc. Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
US10508273B2 (en) 2018-04-24 2019-12-17 Inscripta, Inc. Methods for identifying selective binding pairs
US10557216B2 (en) 2018-04-24 2020-02-11 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of T-cell receptor peptide libraries
SG11202010319RA (en) 2018-04-27 2020-11-27 Iovance Biotherapeutics Inc Closed process for expansion and gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
EP4252759A3 (en) 2018-05-11 2023-11-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center T cell receptors targeting pik3ca mutations and uses thereof
CA3108767A1 (en) 2018-06-30 2020-01-02 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US10752874B2 (en) 2018-08-14 2020-08-25 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US10532324B1 (en) 2018-08-14 2020-01-14 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US11142740B2 (en) 2018-08-14 2021-10-12 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
WO2020081149A2 (en) 2018-08-30 2020-04-23 Inscripta, Inc. Improved detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
US11214781B2 (en) 2018-10-22 2022-01-04 Inscripta, Inc. Engineered enzyme
EP3870697A4 (en) 2018-10-22 2022-11-09 Inscripta, Inc. MODIFIED ENZYMES
EP3874051A1 (en) * 2018-10-31 2021-09-08 Novozymes A/S Genome editing by guided endonuclease and single-stranded oligonucleotide
WO2020191243A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
US11001831B2 (en) 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
AU2020247900A1 (en) 2019-03-25 2021-11-04 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
AU2020288623A1 (en) 2019-06-06 2022-01-06 Inscripta, Inc. Curing for recursive nucleic acid-guided cell editing
US10907125B2 (en) 2019-06-20 2021-02-02 Inscripta, Inc. Flow through electroporation modules and instrumentation
EP3986909A4 (en) 2019-06-21 2023-08-02 Inscripta, Inc. GENOME-WIDE RATIONAL DESIGNED MUTATIONS LEADING TO INCREASED LYSINE PRODUCTION IN E. COLI
US10927385B2 (en) 2019-06-25 2021-02-23 Inscripta, Inc. Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
EP3997221A4 (en) * 2019-07-08 2023-07-05 Inscripta, Inc. INCREASED NUCLEIC ACID-DRIVEN CELL EDIT VIA A LEXA-RAD51 FUSION PROTEIN
EP4038190A1 (en) 2019-10-03 2022-08-10 Artisan Development Labs, Inc. Crispr systems with engineered dual guide nucleic acids
CA3155727A1 (en) 2019-10-25 2021-04-29 Cecile Chartier-Courtaud Gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
WO2021102059A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
EP4069837A4 (en) * 2019-12-10 2024-03-13 Inscripta, Inc. NEW MAD NUCLEASES
US10704033B1 (en) 2019-12-13 2020-07-07 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US11008557B1 (en) 2019-12-18 2021-05-18 Inscripta, Inc. Cascade/dCas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells
US10689669B1 (en) 2020-01-11 2020-06-23 Inscripta, Inc. Automated multi-module cell processing methods, instruments, and systems
CA3157061A1 (en) 2020-01-27 2021-08-05 Christian SILTANEN Electroporation modules and instrumentation
US20210283565A1 (en) 2020-03-10 2021-09-16 Cellares Corporation Systems and methods for cell processing
KR20210123237A (ko) 2020-04-02 2021-10-13 중앙대학교 산학협력단 CRISPR/Cas9 시스템을 기반으로 한 유전체 편집 방법 및 이의 용도
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
US20240216823A1 (en) 2020-04-28 2024-07-04 Diamant Toys Ltd Gaming kits and methods of playing with housings reconfigurable by retrievable unlocking elements
DE112021002672T5 (de) 2020-05-08 2023-04-13 President And Fellows Of Harvard College Vefahren und zusammensetzungen zum gleichzeitigen editieren beider stränge einer doppelsträngigen nukleotid-zielsequenz
US11787841B2 (en) 2020-05-19 2023-10-17 Inscripta, Inc. Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli
KR102687692B1 (ko) * 2020-07-08 2024-07-24 경상국립대학교산학협력단 미세상동성 기반 말단 결합을 통한 유전자 교정에 이용되는 공여자 핵산 및 이의 용도
EP4214314A4 (en) 2020-09-15 2024-10-16 Inscripta Inc CRISPR EDITING TO EMBED NUCLEIC ACID LANDING PADS INTO LIVING CELL GENOMES
US11566241B2 (en) * 2020-10-02 2023-01-31 Inscripta, Inc. Methods and systems for modeling of design representation in a library of editing cassettes
US11512297B2 (en) 2020-11-09 2022-11-29 Inscripta, Inc. Affinity tag for recombination protein recruitment
WO2022103699A1 (en) * 2020-11-10 2022-05-19 Inscripta, Inc. Transcriptional roadblocks for gene editing and methods of using the same
EP4271802A1 (en) 2021-01-04 2023-11-08 Inscripta, Inc. Mad nucleases
US11332742B1 (en) 2021-01-07 2022-05-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
TW202241508A (zh) 2021-01-29 2022-11-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 細胞介素相關之腫瘤浸潤性淋巴球組合物及方法
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
WO2022198141A1 (en) 2021-03-19 2022-09-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd69 selection and gene knockout in tils
JP2024519029A (ja) 2021-05-17 2024-05-08 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｐｄ－１遺伝子編集された腫瘍浸潤リンパ球及び免疫療法におけるその使用
WO2022256448A2 (en) 2021-06-01 2022-12-08 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes
EP4370676A2 (en) 2021-06-18 2024-05-22 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing or modifying human genes
US20240287506A1 (en) * 2021-06-21 2024-08-29 Westlake University Library construction method based on long overhang sequence ligation
WO2023004074A2 (en) 2021-07-22 2023-01-26 Iovance Biotherapeutics, Inc. Method for cryopreservation of solid tumor fragments
WO2023028521A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Inscripta, Inc. Genome-wide rationally-designed mutations leading to enhanced cellobiohydrolase i production in s. cerevisiae
WO2023147488A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
WO2023167882A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Artisan Development Labs, Inc. Composition and methods for transgene insertion
WO2023196877A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2023200770A1 (en) 2022-04-12 2023-10-19 Inscripta, Inc. Curing for iterative nucleic acid-guided nuclease editing
WO2023201369A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment
WO2023220608A1 (en) 2022-05-10 2023-11-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with an il-15r agonist
WO2023225410A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Artisan Development Labs, Inc. Systems and methods for assessing risk of genome editing events
US20240052370A1 (en) 2022-07-27 2024-02-15 Inscripta, Inc. Modulating cellular repair mechanisms for genomic editing
WO2024062138A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Mnemo Therapeutics Immune cells comprising a modified suv39h1 gene
WO2024098027A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd103 selection
WO2024112571A2 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Iovance Biotherapeutics, Inc. Two-dimensional processes for the expansion of tumor infiltrating lymphocytes and therapies therefrom
WO2024118836A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes with shortened rep step

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013176772A1 (en) * 2012-05-25 2013-11-28 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription
WO2014093622A2 (en) * 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1028757A (en) 1910-07-28 1912-06-04 Charles Margerison Combined curtain-pole and shade-support.
US1024016A (en) 1910-10-29 1912-04-23 Emma R Bowne Gas-burner.
US1001776A (en) 1911-01-12 1911-08-29 Augustin Scohy Railroad switch and frog.
US1001184A (en) 1911-04-20 1911-08-22 Charles M Coover Non-slipping device.
US1026684A (en) 1911-09-16 1912-05-21 Emil A Lauer Lamp.
US6562594B1 (en) 1999-09-29 2003-05-13 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US20010049104A1 (en) * 2000-03-24 2001-12-06 Stemmer Willem P.C. Methods for modulating cellular and organismal phenotypes
US20030044866A1 (en) 2001-08-15 2003-03-06 Charles Boone Yeast arrays, methods of making such arrays, and methods of analyzing such arrays
ES2975413T3 (es) 2001-12-17 2024-07-05 Univ Pennsylvania Secuencias de serotipo 8 de virus adenoasociado (AAV), vectores que las contienen y usos de las mismas
NZ537597A (en) 2002-06-14 2008-07-31 Diversa Corp Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
JP4447977B2 (ja) 2004-06-30 2010-04-07 富士通マイクロエレクトロニクス株式会社 セキュアプロセッサ、およびセキュアプロセッサ用プログラム。
US10066233B2 (en) 2005-08-26 2018-09-04 Dupont Nutrition Biosciences Aps Method of modulating cell resistance
CN101583370A (zh) * 2005-09-27 2009-11-18 阿穆尼克斯公司 蛋白质药物及其用途
CN101395282A (zh) * 2006-01-03 2009-03-25 麻省理工学院 启动子改造与遗传控制
AU2007258872A1 (en) 2006-06-16 2007-12-21 Danisco A/S Bacterium
WO2008052101A2 (en) 2006-10-25 2008-05-02 President And Fellows Of Harvard College Multiplex automated genome engineering
WO2009032185A2 (en) 2007-08-28 2009-03-12 The Johns Hopkins University Functional assay for indentification of loss-of-function mutations in genes
US20140121118A1 (en) 2010-11-23 2014-05-01 Opx Biotechnologies, Inc. Methods, systems and compositions regarding multiplex construction protein amino-acid substitutions and identification of sequence-activity relationships, to provide gene replacement such as with tagged mutant genes, such as via efficient homologous recombination
WO2012142591A2 (en) 2011-04-14 2012-10-18 The Regents Of The University Of Colorado Compositions, methods and uses for multiplex protein sequence activity relationship mapping
WO2012149470A1 (en) * 2011-04-27 2012-11-01 Amyris, Inc. Methods for genomic modification
US11458157B2 (en) 2011-12-16 2022-10-04 Targetgene Biotechnologies Ltd. Compositions and methods for modifying a predetermined target nucleic acid sequence
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
EP2855666B1 (en) 2012-05-25 2019-12-04 Cellectis Use of pre t alpha or functional variant thereof for expanding tcr alpha deficient t cells
BR112014031891A2 (pt) * 2012-06-19 2017-08-01 Univ Minnesota direcionamento genético nas plantas utilizando vírus de dna
WO2014022702A2 (en) 2012-08-03 2014-02-06 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing
SG11201503059XA (en) 2012-10-23 2015-06-29 Toolgen Inc Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof
KR102243092B1 (ko) 2012-12-06 2021-04-22 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절
EP3031921A1 (en) 2012-12-12 2016-06-15 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
DK3064585T3 (da) 2012-12-12 2020-04-27 Broad Inst Inc Konstruering og optimering af forbedrede systemer, fremgangsmåder og enzymsammensætninger til sekvensmanipulation
EP4286402A3 (en) * 2012-12-12 2024-02-14 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
KR20150105633A (ko) 2012-12-12 2015-09-17 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작을 위한 시스템, 방법 및 최적화된 가이드 조성물의 조작
CN105121641A (zh) 2012-12-17 2015-12-02 哈佛大学校长及研究员协会 Rna-引导的人类基因组工程化
WO2014110006A1 (en) 2013-01-10 2014-07-17 Ge Healthcare Dharmacon, Inc. Templates, libraries, kits and methods for generating molecules
CA2898184A1 (en) 2013-01-16 2014-07-24 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
US10612043B2 (en) 2013-03-09 2020-04-07 Agilent Technologies, Inc. Methods of in vivo engineering of large sequences using multiple CRISPR/cas selections of recombineering events
EP2971167B1 (en) 2013-03-14 2019-07-31 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
IL289396B2 (en) 2013-03-15 2023-12-01 The General Hospital Coporation Using tru-grnas to increase the specificity of RNA-guided genome editing
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
WO2014165825A2 (en) 2013-04-04 2014-10-09 President And Fellows Of Harvard College Therapeutic uses of genome editing with crispr/cas systems
EP3004337B1 (en) 2013-05-29 2017-08-02 Cellectis Methods for engineering t cells for immunotherapy by using rna-guided cas nuclease system
CN116042726A (zh) 2013-07-09 2023-05-02 哈佛大学校长及研究员协会 多重rna向导的基因组工程
EP3019619B1 (en) 2013-07-11 2021-08-25 ModernaTX, Inc. Compositions comprising synthetic polynucleotides encoding crispr related proteins and synthetic sgrnas and methods of use
US10563225B2 (en) 2013-07-26 2020-02-18 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
ES2915377T3 (es) 2013-08-02 2022-06-22 Enevolv Inc Procedimientos y células huésped para ingeniería genómica, de vías y biomolécular
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
EP4074330A1 (en) 2013-09-05 2022-10-19 Massachusetts Institute of Technology Tuning microbial populations with programmable nucleases
DE202014010413U1 (de) 2013-09-18 2015-12-08 Kymab Limited Zellen und Organismen
WO2015048577A2 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions
WO2015048690A1 (en) 2013-09-27 2015-04-02 The Regents Of The University Of California Optimized small guide rnas and methods of use
US20150098954A1 (en) 2013-10-08 2015-04-09 Elwha Llc Compositions and Methods Related to CRISPR Targeting
US10752906B2 (en) 2013-11-05 2020-08-25 President And Fellows Of Harvard College Precise microbiota engineering at the cellular level
WO2015068785A1 (ja) 2013-11-06 2015-05-14 国立大学法人広島大学 核酸挿入用ベクター
US11326209B2 (en) 2013-11-07 2022-05-10 Massachusetts Institute Of Technology Cell-based genomic recorded accumulative memory
EP3375877A1 (en) 2013-11-18 2018-09-19 Crispr Therapeutics AG Crispr-cas system materials and methods
US9074199B1 (en) 2013-11-19 2015-07-07 President And Fellows Of Harvard College Mutant Cas9 proteins
RU2725520C2 (ru) 2013-12-11 2020-07-02 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы и композиции для направленной модификации генома
CA2932472A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods of use of crispr-cas systems in nucleotide repeat disorders
US10787654B2 (en) 2014-01-24 2020-09-29 North Carolina State University Methods and compositions for sequence guiding Cas9 targeting
EP4063503A1 (en) 2014-02-11 2022-09-28 The Regents of the University of Colorado, a body corporate Crispr enabled multiplexed genome engineering
CN113265394B (zh) 2014-02-13 2024-08-06 宝生物工程（美国)有限公司 从核酸的初始集合中耗尽靶分子的方法、以及用于实践其的组合物和试剂盒
WO2015153889A2 (en) 2014-04-02 2015-10-08 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Materials and methods for the treatment of latent viral infection
GB201406970D0 (en) 2014-04-17 2014-06-04 Green Biologics Ltd Targeted mutations
GB201406968D0 (en) 2014-04-17 2014-06-04 Green Biologics Ltd Deletion mutants
US20170051311A1 (en) 2014-05-02 2017-02-23 Tufts University Methods and apparatus for transformation of naturally competent cells
WO2015179540A1 (en) 2014-05-20 2015-11-26 Regents Of The University Of Minnesota Method for editing a genetic sequence
US20170191123A1 (en) 2014-05-28 2017-07-06 Toolgen Incorporated Method for Sensitive Detection of Target DNA Using Target-Specific Nuclease
WO2015188065A1 (en) 2014-06-05 2015-12-10 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease design
CA2951707A1 (en) 2014-06-10 2015-12-17 Massachusetts Institute Of Technology Method for gene editing
US20170107541A1 (en) 2014-06-17 2017-04-20 Poseida Therapeutics, Inc. A method for directing proteins to specific loci in the genome and uses thereof
US20150376586A1 (en) 2014-06-25 2015-12-31 Caribou Biosciences, Inc. RNA Modification to Engineer Cas9 Activity
GB201411344D0 (en) 2014-06-26 2014-08-13 Univ Leicester Cloning
EP3169776A4 (en) 2014-07-14 2018-07-04 The Regents of The University of California Crispr/cas transcriptional modulation
US20160053304A1 (en) 2014-07-18 2016-02-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods Of Depleting Target Sequences Using CRISPR
US20160053272A1 (en) 2014-07-18 2016-02-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods Of Modifying A Sequence Using CRISPR
US20160076093A1 (en) 2014-08-04 2016-03-17 University Of Washington Multiplex homology-directed repair
CN113789317B (zh) 2014-08-06 2024-02-23 基因工具股份有限公司 使用空肠弯曲杆菌crispr/cas系统衍生的rna引导的工程化核酸酶的基因编辑
US10513711B2 (en) 2014-08-13 2019-12-24 Dupont Us Holding, Llc Genetic targeting in non-conventional yeast using an RNA-guided endonuclease
WO2016040594A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 The Regents Of The University Of California Reconstruction of ancestral cells by enzymatic recording
CN113930455A (zh) 2014-10-09 2022-01-14 生命技术公司 Crispr寡核苷酸和基因剪辑
EP3708155A1 (en) 2014-10-31 2020-09-16 Massachusetts Institute Of Technology Massively parallel combinatorial genetics for crispr
AU2015355546B2 (en) 2014-12-03 2021-10-14 Agilent Technologies, Inc. Guide RNA with chemical modifications
MX2017007907A (es) 2014-12-17 2017-09-18 Du Pont Composiciones y métodos para la edición genética eficaz en e. coli usando sistemas de ácido desoxirribonucleico (arn) guía/endonucleasa de sistema asociado a repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente espaciadas (cas) en combinación con moldes de modificación de polinucleótido circular.
JP6947638B2 (ja) 2014-12-20 2021-10-13 アーク バイオ， エルエルシー Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ系タンパク質を使用する核酸の標的化枯渇、富化および分割のための組成物および方法
GB201506509D0 (en) 2015-04-16 2015-06-03 Univ Wageningen Nuclease-mediated genome editing
MX2017014561A (es) 2015-05-15 2018-03-02 Pioneer Hi Bred Int Nuevos sistemas de arn guia/endonucleasa cas.
CN109536474A (zh) 2015-06-18 2019-03-29 布罗德研究所有限公司 降低脱靶效应的crispr酶突变
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
CA2990699A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof
WO2017015015A1 (en) 2015-07-17 2017-01-26 Emory University Crispr-associated protein from francisella and uses related thereto
JP6937740B2 (ja) 2015-07-28 2021-09-22 ダニスコ・ユーエス・インク ゲノム編集システムおよび使用方法
US11339408B2 (en) 2015-08-20 2022-05-24 Applied Stemcell, Inc. Nuclease with enhanced efficiency of genome editing
JP6799058B2 (ja) 2015-09-21 2020-12-09 アークトゥラス・セラピューティクス・インコーポレイテッドＡｒｃｔｕｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． アレル選択的な遺伝子編集およびその使用
WO2017053713A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 Tarveda Therapeutics, Inc. Compositions and methods for genome editing
ES2840648T3 (es) 2015-10-22 2021-07-07 Inst Nat Sante Rech Med Generación de código de barras de endonucleasa
EP3350327B1 (en) 2015-10-23 2018-09-26 Caribou Biosciences, Inc. Engineered crispr class 2 cross-type nucleic-acid targeting nucleic acids
CN106893739A (zh) 2015-11-17 2017-06-27 香港中文大学 用于靶向基因操作的新方法和系统
EP3380634A1 (en) 2015-11-26 2018-10-03 Dnae Group Holdings Limited Single molecule controls
WO2017100343A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Arc Bio, Llc Methods and compositions for the making and using of guide nucleic acids
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
KR20190090081A (ko) 2015-12-07 2019-07-31 지머젠 인코포레이티드 Htp 게놈 공학 플랫폼에 의한 미생물 균주 개량
US20210207134A1 (en) 2015-12-24 2021-07-08 B.R.A I.N. Ag Reconstitution of dna-end repair pathway in prokaryotes
JP2019518478A (ja) 2016-06-24 2019-07-04 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイトＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＯＬＯＲＡＤＯ，ａ ｂｏｄｙ ｃｏｒｐｏｒａｔｅ バーコードを付けたコンビナトリアルライブラリーを生成する方法
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013176772A1 (en) * 2012-05-25 2013-11-28 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription
WO2014093622A2 (en) * 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NATURE BIOTECHNOLOGY, 2013, VOL.31, NO.3, PP.233-239 AND SUPPLEMENTARY MATERIALS, JPN6018050423, ISSN: 0004032427 *
NATURE BIOTECHNOLOGY, 2013, VOL.31, NO.9, PP.827-832, JPN6018050408, ISSN: 0004032428 *
NUCLEIC ACID RES., 2011, VOL.39, NO.21, PP.9275-9282, JPN6018050413, ISSN: 0004032429 *
NUCLEIC ACID RES., 2014.12(ONLINE), VOL.43, NO.1, PP.530-543, JPN6018050418, ISSN: 0004032430 *
PNAS, 2014, VOL.111, NO.16, E1629-E1638 AND SUPPORTING INFORMATION, JPN6018029282, ISSN: 0004032426 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021087454A (ja) * 2014-02-11 2021-06-10 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイトＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＯＬＯＲＡＤＯ，ａ ｂｏｄｙ ｃｏｒｐｏｒａｔｅ Ｃｒｉｓｐｒにより可能にされる多重ゲノムエンジニアリング
JP7232540B2 (ja) 2014-02-11 2023-03-03 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイト Ｃｒｉｓｐｒにより可能にされる多重ゲノムエンジニアリング
KR20200024247A (ko) * 2017-06-30 2020-03-06 인스크립타 인코포레이티드 자동 세포 처리 방법, 모듈, 기기 및 시스템
KR102424850B1 (ko) * 2017-06-30 2022-07-22 인스크립타 인코포레이티드 자동 세포 처리 방법, 모듈, 기기 및 시스템
JPWO2020250855A1 (ja) * 2019-06-11 2020-12-17

Also Published As

Publication number Publication date
EP3105328A1 (en) 2016-12-21
KR102496984B1 (ko) 2023-02-06
SI3105328T1 (sl) 2020-09-30
JP2019205478A (ja) 2019-12-05
US11078498B2 (en) 2021-08-03
KR20220142547A (ko) 2022-10-21
US20180230493A1 (en) 2018-08-16
EP3985114A1 (en) 2022-04-20
US11702677B2 (en) 2023-07-18
EP3690044B1 (en) 2024-01-10
EP4063503A1 (en) 2022-09-28
ES2802984T3 (es) 2021-01-22
US20200157575A1 (en) 2020-05-21
IL261664B (en) 2020-11-30
NZ723531A (en) 2022-03-25
US20220364121A1 (en) 2022-11-17
ES2974229T3 (es) 2024-06-26
US20190194693A1 (en) 2019-06-27
JP6863620B2 (ja) 2021-04-21
DE212015000061U1 (de) 2017-09-03
AU2018271257A1 (en) 2018-12-13
WO2015123339A1 (en) 2015-08-20
GB2544382B (en) 2018-05-30
IL261664A (en) 2018-10-31
KR20210002759A (ko) 2021-01-08
US10364442B2 (en) 2019-07-30
RS60492B1 (sr) 2020-08-31
CN106164271B (zh) 2020-06-02
CA2938456C (en) 2022-06-21
US10465207B2 (en) 2019-11-05
EP3690044A1 (en) 2020-08-05
HUE066611T2 (hu) 2024-08-28
PT3105328T (pt) 2020-07-06
CA3075047C (en) 2022-02-01
US10351877B2 (en) 2019-07-16
US11795479B2 (en) 2023-10-24
CY1123115T1 (el) 2021-10-29
US20190376087A1 (en) 2019-12-12
US20190390227A1 (en) 2019-12-26
US20200157574A1 (en) 2020-05-21
US20180371499A1 (en) 2018-12-27
US20170240922A1 (en) 2017-08-24
AU2015217208A1 (en) 2016-09-08
US10435715B2 (en) 2019-10-08
US20200392539A1 (en) 2020-12-17
GB2544382A (en) 2017-05-17
US11345933B2 (en) 2022-05-31
CA3161903A1 (en) 2015-08-20
DK3105328T3 (da) 2020-07-13
US20190264231A1 (en) 2019-08-29
CA3075047A1 (en) 2015-08-20
US10240167B2 (en) 2019-03-26
GB201615434D0 (en) 2016-10-26
US20170321226A1 (en) 2017-11-09
AU2018271257B2 (en) 2020-08-13
US10731180B2 (en) 2020-08-04
US10711284B2 (en) 2020-07-14
IL246951B (en) 2019-03-31
US20220119844A1 (en) 2022-04-21
HRP20201040T1 (hr) 2021-01-08
US10266849B2 (en) 2019-04-23
US20210254104A1 (en) 2021-08-19
US20180230492A1 (en) 2018-08-16
HUE049634T2 (hu) 2020-09-28
KR102209636B1 (ko) 2021-01-29
US11639511B2 (en) 2023-05-02
CN106164271A (zh) 2016-11-23
KR20160122197A (ko) 2016-10-21
EP3105328B1 (en) 2020-04-08
JP7232540B2 (ja) 2023-03-03
PL3105328T3 (pl) 2020-10-19
EP3105328A4 (en) 2017-07-26
AU2015217208B2 (en) 2018-08-30
CA2938456A1 (en) 2015-08-20
JP2021087454A (ja) 2021-06-10
MX2016010285A (es) 2017-01-11
US10669559B2 (en) 2020-06-02
US20240093241A1 (en) 2024-03-21
LT3105328T (lt) 2020-07-10
US9982278B2 (en) 2018-05-29
CN111705365A (zh) 2020-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7232540B2 (ja) Ｃｒｉｓｐｒにより可能にされる多重ゲノムエンジニアリング

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180213

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20180213

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180604

A871 Explanation of circumstances concerning accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871

Effective date: 20180604

A975 Report on accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005

Effective date: 20180613

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20180731

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20181031

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20181219

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190319

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20190513

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190913

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20190924

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20190927