KR20210123237A - CRISPR/Cas9 시스템을 기반으로 한 유전체 편집 방법 및 이의 용도 - Google Patents

CRISPR/Cas9 시스템을 기반으로 한 유전체 편집 방법 및 이의 용도 Download PDF

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KR20210123237A
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이상준
이호중
김현주
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중앙대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 CRISPR/Cas9 시스템을 기반으로 한 유전체 편집 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 및 불일치 가이드 RNA (sgRNA)를 이용한 CRISPR 시스템은 표적 DNA에 유의적인 유전체 편집 효과를 달성하는 바, 본 발명의 CRISPR 시스템은 유전자 가위를 이용한 유전자 교정용 조성물, 유전체 수준의 스크리닝, 암을 비롯한 다양한 질병의 치료제, 질병 진단 또는 이미징용 조성물 개발, 형질전환동식물 개발 등의 폭넓은 분야에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

CRISPR/Cas9 시스템을 기반으로 한 유전체 편집 방법 및 이의 용도{Method for Genome Editing Based on CRISPR/Cas9 System and Uses Thereof}
본 발명은 CRISPR/Cas9 시스템을 기반으로 한 유전체 편집 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
1970년대 유전체 편집 기술의 탄생 이후 다양한 유전자 편집 도구들이 개발되어 왔다. 현재 유전체 편집 도구로 활발히 연구되고 있는 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템은 박테리오파지 등에 감염된 후 생존한 미생물이 감염된 DNA 서열의 일부 (20개 염기 내외)를 Spacer 형태로 저장해두었다 재감염 되었을 때 그를 인식하고 침입한 DNA에 이중가닥 절단을 유발하는 일종의 적응 면역 체계이다. 그 중에서도 CRISPR/Cas9 (CRISPR-associated 9) 시스템은 표적 염기 부위에 이중 가닥 절단을 일으키기 위해 단일 폴리펩티드만이 필요하고, 표적 염기 부위로의 가이드 역할을 하는 가이드 RNA(guide RNA)와 표적 부위에 이중가닥 절단을 유발하는 Cas9 핵산 분해 효소(Cas9 nuclease)로 각각 기능이 나누어져 있기 때문에 이전 세대의 유전체 편집 도구인 ZFN, TALEN 등에 비해 간단한 원리와 설계비용이 저렴한 장점을 가지고 있어 가장 널리 사용되고 있다.
CRISPR 시스템이 표적 부위에 이중 가닥 절단을 유발하기 위해서는 가이드 RNA와 표적 염기의 상보적 일치 외에 Cas9 핵산 분해 효소와 표적 부위 옆에 존재하는 Protospacer adjacent motif (PAM) 간의 상호작용을 필요로 한다. PAM은 표적 부위의 바로 옆에 존재하는 짧은 서열로, CRISPR 시스템에서 외래 DNA와 자기 DNA를 구분 짓는 중요한 척도가 된다. CRISPR/Cas9 시스템은 5'-NGG의 PAM 서열을 가지는데, 이로 인해 유전체에서 표적으로 선정이 가능한 부위의 범위를 제한하는 장애물로도 작용하고 있다. 따라서 표적으로 선정 가능한 범위를 넓히기 위해 다른 서열의 PAM을 가지는 CRISPR/Cas 시스템들도 연구되어 왔다.
CRISPR/Cas9 시스템은 미생물에서 유래하였기 때문에 표적 부위와 가이드 RNA의 서열이 전부 일치하지 않더라도 이중 가닥 절단을 유발하는 활성을 가진다. CRISPR/Cas9 시스템은 미생물뿐 아니라 진핵생물의 유전체 편집에도 널리 이용되고 있기 때문에 표적 부위에만 이중 가닥 절단을 유발하는 정확성이 중요하므로 불일치 허용을 줄이기 위해 가이드 RNA의 길이를 짧게 하거나, Cas9 핵산 분해 효소를 구조를 변화시키는 등의 연구가 진행되어 왔다.
세포 내에 DNA를 삽입하여 돌연변이를 도입하는 단일가닥 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 도입은 간단한 원리를 가지고 있으나, 낮은 수율로 인해 원하는 변이체를 얻기 어려웠고, 이를 해결하기 위해 CRISPR/Cas9 시스템과 연계되어 미생물의 유전체를 편집하는데 이용되어 왔다. 표적 부위에 돌연변이가 일어나지 않은 세포는 CRISPR/Cas9에 의해 타겟으로 인식되어 세포 유전체에 이중가닥 절단이 일어나 사멸하고, 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 도입에 의해 표적 DNA 서열에 변이가 일어난 세포는 타겟으로 인식되지 않아 살아남게 되어 변이된 균주를 얻는 것이 가능한데, 이를 음성 선택 (negative selection) 이라 하고, 음성 선택을 통하여 유전체가 편집된 미생물 변이체를 얻는 것이 가능하였다.
미국의 위스콘신 대학교-매디슨 연구진은 젖산균 (Lactobacillus leuteri)에서 CRISPR/Cas9 시스템과 PAM 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 유전체가 편집된 변이 균주를 제작하였다. 중국의 톈진 대학교 연구진은 CRISPR/Cas9 시스템과 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 대장균 (Escherichia coli)의 유전체에서 유전자 결실, 점 돌연변이, 코돈의 변이 등을 유도하였다. 중국의 톈진 산업생명공학연구소 연구진은 CRISPR/Cas9 시스템과 PAM 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 산업균주로 널리 이용되고 있는 코리네박테리움 (Corynebacterium glutamicum)의 유전체를 편집하는데 성공하였다.
상기와 같이 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 미생물의 유전체를 편집하는 연구에 관심이 집중되고 있으나, 1~2개 염기의 점 돌연변이가 일어난 타겟도 돌연변이가 일어나지 않은 타겟과 동일하게 인식하여 사멸시키는 CRISPR/Cas9 시스템의 불일치 허용으로 인해 원하는 부위에 점 돌연변이를 유발해 낸 선행 연구들은 찾아보기 힘든 실정이다.
따라서, 이러한 장애물을 극복하고, 미생물을 포함한 목적 대상의 유전체를 자유자재로 용이하고 효율적으로 편집할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요하다.
US 20170226522 A1 한국공개특허 제10-2016-0122197호 (2016.10.21 공개)
Li, Y., Lin, Z., Huang, C., Zhang,Y., Wang, Z., Tang, Y. J., Chen, T., Zhao, X., 2015. Metabolic engineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9meditated genome editing. Metab Eng. 31,13-21. Pyne, M. E., Moo-Young, M., Chung, D. A.,Chou, C. P., 2015. Coupling the CRISPR/Cas9 System with Lambda RedRecombineering Enables Simplified Chromosomal Gene Replacement in Escherichia coli. Appl EnvironMicrobiol. 81, 5103-14.
상술한 상황 하에서, 본 발명자들은 CRISPR/Cas9 시스템을 기반으로 하여 목적 대상의 유전체를 단일 염기 수준으로 정교하게 편집할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 이에, 본 발명자들은, 표적 DNA와 상보적이지 않은 염기 서열을 도입한 염기 불일치 가이드 RNA(target-mismatched sgRNA)를 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템에, 표적 DNA와 상보적이지 않은 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 이용한 위치 유도 돌연변이를 도입하였고, 그 결과, 상기 표적 DNA와 상기 가이드 RNA 서열 간에 2 개 이상의 불일치(mismatch)가 부여(발생)되어 CRISPR/Cas9 시스템의 불일치 허용을 극복하고, 대장균의 유전체를 단일 염기 수준까지 정확하게 편집(교정)할 수 있을 뿐만 아니라, 점 돌연변이 도입 효율을 향상시켰음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 CRISPR/Cas9 시스템 기반 유전체 편집 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 CRISPR/Cas9 시스템 기반 유전체 편집용 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 CRISPR/Cas9 시스템 기반의 유전체 편집 효율 증가 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 CRISPR/Cas9 시스템 기반의 표적 DNA가 편집된 대상체의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 CRISPR/Cas9 시스템 기반의 표적 DNA가 편집된 대상체의 제조 방법에 의해 제조된, 표적 DNA가 편집된 대상체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산 서열", "뉴클레오타이드 서열" 및 "폴리뉴클레오타이드 서열"은, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드, 및 이의 단편 또는 일부, 및 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 의미하고, 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 CRISPR/Cas9 시스템 기반 유전체 편집 방법을 제공하며, 상기 방법은 표적 DNA에 상보적으로 결합하는, 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA에 의해, 상기 표적 DNA와 상기 가이드 RNA 서열 간에 1 개 이상의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드가 부여되는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "유전체 교정(genome editing)"은, 특별한 언급이 없는 한, 표적 DNA의 표적 부위에서의 Cas9 절단에 의한 핵산 분자의 결실, 삽입, 치환 등에 의하여 유전자 기능을 편집, 회복, 수정, 상실 및/또는 변경시키는 것을 의미한다.
바람직하게는, 본 발명에서 가이드 RNA와 표적 DNA 간의 1 개 이상의 불일치 뉴클레오타이드가 오히려 CRISPR 시스템의 편집 효과를 향상시키는 것을 특징으로 한다.
상기 가이드 RNA와 표적 DNA 간의 1 개 이상의 미스매치는 공여 핵산 분자의 도입 및 인위적인 가이드 RNA 상의 불일치 도입에 의해 달성된다.
본 발명에서 CRISPR/Cas9 시스템 기반 유전체 편집을 언급하면서 사용되는 용어 "공여 핵산 분자" 또는 “공여체 핵산 서열"은 표적 DNA에 삽입하고자 하는 목적의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 천연의 또는 변형된 폴리뉴클레오티드, RNA-DNA 키메라, 또는 DNA 단편, 또는 PCR 증폭된 ssDNA 또는 dsDNA 단편 또는 이의 유사체를 지칭한다.
이러한 공여 핵산 분자는 표적 DNA 상에 변형을 유발하여 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 임의의 형태, 예컨대, 단일-가닥 및 2중-가닥 형태를 포함할 수 있다.
상기 표적 DNA 상의 변형은 임의의 목적 위치에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 녹아웃(knockout), 녹인(knockin), 내인성 핵산 서열의 상동, 이종상동성(endogenous) 또는 이종 핵산 서열로의 치환, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 바람직하게는, 상기 표적 DNA 상의 변형은 야생형 DNA 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환에 의해 점 돌연변이가 도입(유도)된 것이고, 이러한 점 돌연변이의 도입은 예컨대, 올리고뉴클레오타이드에 의한 것이다.
상술한 점 돌연변이의 도입은 표적 DNA와의 미스매치를 유발한다.
본 명세서에서 돌연변이 유도(유발)를 언급하면서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오타이드"의 길이는, 10개의 내지 90개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 15개 내지 85개의 뉴클레오타이드(mer), 더욱 바람직하게는 20개 내지 50개의 뉴클레오타이드(프로브 또는 암플리머(amplimer)로서 사용될 수 있음)의 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 일시예에서, 상기 돌연변이 유발을 위한 올리고뉴클레오타이드(mutagenic oligonucleotide)는 41 mer의 길이로 사용하였으나, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용하는 용어 "불일치" 또는 "미스매치(mismatch)"는 DNA간 또는 DNA와 RNA 염기 간에 상보적인 결합에서 비상보적인 서열이 존재하는, 부적정 염기쌍이 발생한 상태를 의미한다. 본 발명자는 올리고뉴클레오타이드 및 CRISPR/Cas에 이용되는 가이드 RNA를 이용하여, 야생형 DNA 서열에서 1 개 이상의 뉴클레오타이드가 점 돌연변이됨으로써 존재하는 미스매치와, 표적 DNA에 상보적인 가이드 RNA 간에 의도적인 불일치 염기를 부여하여 발생한 미스매치로 인해 CRISPR가 표적 DNA를 인식하지 못함을 확인하였다.
따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "불일치 뉴클레오타이드", "불일치 염기"또는 "미스매치 뉴클레오타이드"는 비-상보적인 뉴클레오타이드를 의미하며 혼용된다.
또한, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 불일치 뉴클레오타이드는 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 가이드 RNA 상의 다양한 위치(site)에 위치시킬 수 있다.
즉, 상기 가이드 RNA 상의 불일치 뉴클레오타이드의 위치는, 표적 DNA와 이에 상보적인 가이드 RNA 간에 인위적 불일치 염기를 부여함으로써, CRISPR가 표적 DNA를 인식하지 못하도록 하는 한, 임의의 위치에 존재할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 공여 DNA 상의 점 돌연변이가 존재하는 위치에 상응하는, 가이드 RNA 상의 위치로부터 1 개의 뉴클레오타이드가 이격된 바로 근접한 부위에 위치하거나, 또는 10 개 이상 원격된 부위에 위치할 수 있다.
본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 불일치 뉴클레오타이드의 수는 제한되지 않으나, 바람직하게는, 불일치 뉴클레오타이드의 수는 1 내지 10개, 보다 바람직하게는 1 내지 5개, 보다 더욱 바람직하게는 1 내지 3개, 보다 더욱 더 바람직하게는 1 내지 2개, 가장 바람직하게는 1개(단일 불일치 뉴클레오타이드)일 수 있다.
또한, 가이드 RNA에 최소 2 개의 불일치 뉴클레오타이드가 있는 경우, 불일치 뉴클레오타이드는 연속적 또는 불연속적으로 위치할 수 있다.
본 명세서에서 불일치 뉴클레오타이드 위치를 언급하면서 사용되는 용어"바로 근접한(immediately adjacent)"은, 표적 DNA 상에 변형을 유발하는 공여 핵산 분자(예컨대, 올리고뉴클레오타이드) 상에, 점 돌연변이가 존재하는 위치에 상응하는 위치로부터 5'- 또는 3'-말단 방향으로 인접(juxtaposition)한, 즉, 1 개 뉴클레오타이드만큼 이격된 부위에 위치하는 것을 의미한다.
용어 "가이드 RNA"는 표적 DNA에 특이적인 RNA로, Cas 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cas 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA를 말한다.
상기 가이드 RNA는 표적 DNA와 혼성화하는 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA (transactivating crRNA)를 포함하는 이중 RNA (dualRNA), 또는 상기 crRNA 및 tracrRNA의 부분을 포함하고 표적 DNA와 혼성화하는 단일-사슬 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서 상기 가이드 RNA는 sgRNA이다.
상기 가이드 RNA가 crRNA 및 tracrRNA의 필수적인 부분 및 표적과 상보적인 부분을 포함한다면, 어떠한 가이드 RNA라도 본 발명에 사용될 수 있다.
상기 crRNA는 표적 DNA와 혼성화될 수 있다.
가이드 RNA는 RNA의 형태 또는 가이드 RNA를 암호화하는 DNA의 형태로 세포 또는 유기체에 전달될 수 있다. 또한, 가이드 RNA는 분리된 RNA의 형태, 바이러스 벡터에 포함되어 있는 RNA, 또는 벡터에 암호화되어있는 형태일 수도 있다. 바람직하게, 상기 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 또는 아그로박테리움 (agrobacterium) 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 CRISPR/Cas9 시스템 기반 유전체 편집을 언급하면서 사용되는 용어 "불일치 가이드 RNA"는 표적 DNA와 가이드 RNA 서열 간에 불일치 뉴클레오타이드가 1 개 이상 존재하는 crRNA를 포함하는 sgRNA로서, 본 명세서에서 target-mismatched sgRNA와 혼용하여 사용된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "혼성화(hybridization)"는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2 개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "Cas 단백질"은 CRISPR/Cas 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA (trans-activating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제 (nickase)를 형성한다.
Cas 유전자 및 단백질의 정보는 국립생명공학정보센터 (national center for biotechnology information, NCBI)의 GenBank에서 구할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas 단백질을 암호화하는 CRISPR-연관 (CRISPR-associated, cas) 유전자는 종종 CRISPR-반복 스페이서 배열(CRISPR repeat-spacer array)과 관련된다. CRISPR-Cas 시스템은 두 개의 class와 여섯 개의 type이 존재하며, 이들 중에서, Cas9 단백질 및 crRNA 및 tracrRNA를 수반하는 type ±ISPR/Cas 시스템이 대표적으로 잘 알려져 있다.
상기 표적 DNA는 상기 crRNA 또는 sgRNA와 상보적인 서열의 뉴클레오타이드 및 프로토스페이서-인접 모티프(protospacer-adjacent motif, PAM)를 포함한다.
상기 올리고뉴클레오타이드는 표적 DNA의 프로토스페이서-인접 모티프(protospacer-adjacent motif, PAM)를 포함한다.
상기 PAM은 5'-NGG-3' 트리뉴클레오타이드 (trinucledotide)이다.
종래 기술인 돌연변이 유발 올리고뉴클레오타이드를 세포에 삽입하면, DNA를 복제하는 과정에서 낮은 수율로 돌연변이가 도입될 뿐이었다. 종래 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하는 경우에도 CRISPR/Cas9의 불일치 허용으로 인해 단일 염기 점 돌연변이를 도입하는데 어려움이 있었다.
이에, 상술한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 CRISPR/Cas9의 불일치 허용을 극복하면서 표적 유전자의 목표 염기에 점 돌연변이를 도입시켜 효과적으로 편집 효과를 달성하는 데 영향을 미치는, 불일치 가이드 RNA를 설계하고 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이와 함께 CRISPR/Cas9 시스템에 적용하였다.
그 결과, 점 돌연변이에 의한 불일치 염기 수 및 상기 불일치 가이드 RNA (target-mismatched sgRNA)에 의해 증가한 불일치 염기 수로 인해 유전자 가위가 표적으로 인식하지 않아 표적 DNA가 절단되지 않고 살아남음으로써, 효과적인 유전체 편집 효과를 달성함을 규명하였다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 방법은 미스매치가 없는 종래 가이드 RNA에 비하여 유전체 편집 효과가 증가하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 갈락토오스당 수송계 유전자인 galK 유전자 부위의 1 내지 4개 염기 (504번 내지 507번)에 점 돌연변이를 일으키는 올리고뉴클레오타이드를 세포에 삽입하여 위치 유도 돌연변이 도입 후 CRISPR/Cas9으로 음성 선택하여 맥콘키 선택배지에 도말하였을 때, 2개 염기에 돌연변이가 도입된 경우 89%, 3개 염기에 돌연변이가 도입된 경우 94%, 4개 염기에 돌연변이가 도입된 경우 92%의 편집 효율을 얻었으나, 단일 염기에 점 돌연변이가 도입된 균주는 얻을 수 없었다.
올리고뉴클레오타이드에 의해 돌연변이가 도입되는 염기의 위치에 상응하는 가이드 RNA 상의 위치에 바로 근접하게 불일치 서열을 위치시키면 돌연변이가 도입되지 않은 세포들은 죽어버리고, 돌연변이가 도입된 세포들은 증가한 불일치 염기 수로 인해 살아남게 된다.
즉, 돌연변이가 도입되지 않은 세포들은 표적 유전자에 이중 가닥 절단이 일어나 죽게 되고, 돌연변이가 도입된 세포들은 표적으로 인식되지 않아 살아남게 되며, 이를 음성 선택이라고 한다.
또한, 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이로 galK 유전자의 504번 염기에 돌연변이를 유발 후 단일 염기 불일치 가이드 RNA를 이용한 CRISPR/Cas9 시스템으로 음성 선택하여 최소 36%에서 최대 95%의 편집 효율로 단일 염기에 돌연변이가 일어난 균주를 얻어낼 수 있었다.
또한, 이중 염기 불일치 가이드 RNA를 이용한 CRISPR/Cas9 시스템으로 음성 선택한 경우에는 한 가지 경우를 제외하고 모두 음성 선택이 불가능하였다.
상술한 방식으로 돌연변이 도입 후 선별된 변이 자손균주 유전체의 일부를 염기서열 분석 후 모균주의 유전체 서열과 비교분석한 결과, 목표 염기에 단일 염기 점 돌연변이가 도입된 것을 확인하였다.
결론적으로 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 도입과 불일치 가이드 RNA를 이용한 CRISPR/Cas9 음성 선택으로 대장균의 유전체에서 목표 염기에만 정확하게 돌연변이를 도입할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 방법은 단일 염기 점 돌연변이를 도입하여 목적 대상체의 유전체를 효과적으로 단일 염기 단위로 정교하게 편집할 수 있음을 입증한다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템 기반 유전체 편집용 조성물을 제공하며, 상기 표적 DNA와 상기 가이드 RNA 서열 간에 1 개 이상의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드가 부여된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 CRISPR-Cas9 시스템에서 표적 유전자를 인식하나 표적 DNA와 1개 이상의 불일치 서열이 존재하는 가이드 RNA를 발현할 수 있는 구조물을 포함하며, 가이드 RNA 및 공여 DNA(예컨대, 올리고뉴클레오타이드)가 동시에 세포 내로 전달되고, Cas9 단백질에 의한 표적 DNA의 절단 시 공여 DNA를 통해 표적 DNA 대신 점 돌연변이 서열을 포함하는 공여 DNA가 유전체 내에 포함되어 표적 DNA의 치환 돌연변이 효율을 높일 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 방법을 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 CRISPR/Cas9 시스템 기반의 유전체 편집 효율 증가 방법을 제공하며, 표적 DNA에 상보적으로 결합하는, 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA에 의해 상기 표적 DNA와 상기 가이드 RNA 서열 간에 1 개 이상의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드가 부여되는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 CRISPR/Cas9 시스템 기반의 유전체 편집 효율 증가 방법은, 단일 점 돌연변이가 특정 조합의 표적:가이드 RNA 간의 염기쌍 배치, 즉, 피리미딘 (Py:Py) 염기쌍 또는 퓨린 (Pu:Pu) 염기쌍 배치 하에서 도입됨에 따라, 보다 편집 효율이 배가되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 방법은 상술한 방법을 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, CRISPR/Cas9 시스템 기반의 표적 DNA가 편집된 대상체의 제조 방법을 제공한다:
(a) 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 표적 DNA 상에 변형을 유발하는 공여 핵산 분자를 제작하는 단계;
(b) 표적 DNA에 대해 상보적으로 결합하고, 상기 표적 DNA에 대해 1 개 이상의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드가 부여된 가이드 RNA를 제작하는 단계; 및
(c) 상기 (a) 단계의 공여 핵산 분자 및 상기 (b) 단계의 가이드 RNA를, 편집시키고자 하는 대상체에 주입시켜 상기 표적 DNA와 상기 가이드 RNA 서열 간에 2 개 이상의 불일치(mismatch)가 발생함으로써 대상체의 표적 DNA가 편집되는 단계.
또한, 본 발명의 상기 CRISPR/Cas9 시스템은 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 당업계에 공지된 임의의 선별마커를 이용할 수 있다.
본 발명의 대상체는, 본 발명의 방법을 적용할 수 있는 한, 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라스미드, 바이러스, 원핵 세포, 분리된 진핵 세포 또는 인간을 제외한 진핵 유기체일 수 있다.
상기 진핵 세포는 효모, 곰팡이, 식물, 곤충, 양서류, 포유동물 등의 세포일 수 있고, 예를 들어, 당업계에서 일반적으로 사용되는 인 비트로에서 배양된 세포, 이식된 세포, 일차 세포 배양, 인 비보 세포, 인간을 포함하는 포유 동물의 세포일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, cas9 유전자가 유전체에 통합된 균주를 사용하기 때문에 cas9 플라스미드를 삽입하는 과정이 불필요하고, Cas9 단백질의 안정적인 과발현을 유도할 수 있다. dsDNA를 사용하여 증폭, 정제 과정을 추가로 필요로 하지 않고, 단일 점 돌연변이를 포함하는 올리고뉴클레오타이드(mutagenic oligonucleotide)와 가이드 RNA 플라스미드의 삽입 과정만이 필요하므로, 유전체의 교정까지 전체적인 시간을 단축시켰다.
본 발명의 일 실시예에 사용된 가이드 RNA 플라스미드의 경우 42℃에서 배양함에 따라 소실되기 때문에 연속적인 유전체의 편집이 가능하고, 유전체에 통합된 cas9 유전자의 경우 P1 transduction 및 L-arabinose가 포함된 최소배지에서의 배양으로 손쉽게 제거되기 때문에 아무런 흔적 없이 유전체를 편집하는 것이 가능하므로 유전자 변형 생물체와 관련된 문제로부터 큰 영향을 받지 않을 수 있다.
상기 Cas9 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas9 단백질은 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 임의의 것도 이용할 수 있으나, 바람직하게는 스트렙토코커스 속 (genus Streptococcus)으로부터 유래한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 표적 DNA가 편집된 대상체의 제조 방법에 의해 제조된, 표적 DNA가 편집된 대상체를 제공한다.
예를 들어, 표적 DNA가 편집된 대상체는 본 발명의 방법에 따라 제조된, yaaA 유전자, ybdG 유전자, ydcO 유전자, ydiU 유전자, preT 유전자, ypdA 유전자, fau 유전자, yhbU 유전자, mnmE 유전자, thiH 유전자, proX 유전자, galK 유전자, moeA 유전자, yjhF 유전자의 특정 염기에 단일 염기 점 돌연변이가 일어나 유전자의 기능이 결실 또는 변이된 대장균 MG1655 변이 균주이다.
본 발명은 목적 대상의 유전체를 단일 염기 단위로 편집, 수선하는 방법에 관한 것으로서, 목표 유전자에 변이가 일어난 목적 대상, 예컨대, 미생물 균주들의 유전체를 올바르게 수선하거나, 코돈의 변화 등을 유발함으로써 유용 물질 등의 생산능을 최적화시킨 균주를 제작하는 방법을 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 및 불일치 가이드 RNA (sgRNA)를 이용한 CRISPR 시스템은 표적 DNA에 유의적인 유전체 편집 효과를 달성할 뿐만 아니라, off-targeting 효과가 매우 적으므로, 본 발명의 CRISPR 시스템은 유전자 가위를 이용한 유전자 교정용 조성물, 유전체 수준의 스크리닝, 암을 비롯한 다양한 질병의 치료제, 질병 진단 또는 이미징용 조성물 개발, 형질전환동식물 개발 등의 폭넓은 분야에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 발명의 내용과 기본 원리에 대한 개념도를 나타낸 것이다.
도 2는 다양한 길이의 점 돌연변이를 유발하는 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 후 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 음성 선택을 통해 CRISPR/Cas9 시스템의 도입 돌연변이의 길이 별 편집 효율 (Editing efficiency) 및 콜로니 생성 단위 (Colony Forming Unit)를 그래프로 나타낸 것이며, 점 돌연변이가 일어난 타겟도 돌연변이가 일어나지 않은 타겟과 동일하게 인식하는 불일치 허용 (mismatch tolerance)에 대한 개념도를 나타낸 것이다.
도 3은 CRISPR/Cas9의 불일치 가이드 RNA를 이용하여 불일치 허용 특성을 극복한 단일 염기 편집에 관한 개념도를 나타낸 것이며, 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 후 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 음성 선택 시에 PAM 서열로부터 먼 염기 불일치 가이드 RNA를 이용하여 단일 염기 점 돌연변이가 도입된 경우, 가이드 RNA의 불일치 서열 위치에 따른 편집 효율 및 작동 여부를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 후 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 음성 선택 시에 PAM 서열에 가까운 불일치 가이드 RNA를 이용하여 단일 염기 점 돌연변이가 도입된 경우, 가이드 RNA의 불일치 서열 위치에 따른 편집 효율 및 작동 여부를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 유전체 편집이 완료된 균주로부터 람다-레드 베타 발현 플라스미드 및 가이드 RNA 플라스미드와 cas9 유전자를 제거하는 내용에 대한 개념도를 나타낸 것이다.
도 6은 대장균 MG1655 유전체 내의 서로 다른 16개 표적에서 단일 염기 불일치 가이드 RNA를 이용한 점 돌연변이 도입에 대한 개념도와 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 불일치 가이드 RNA/Cas9을 이용한 xylR single point mutation의 도입을 보여준다.
도 8은 본 발명의 불일치 가이드 RNA/Cas9을 이용하여 xylR single point mutation을 도입한 대장균주의 xylose 당의 소비 속도 수준을 확인한 결과이다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. Cas9 유전자가 유전체에 삽입된 균주의 제작
본 발명자들은 cas9 유전자가 유전체에 삽입되어 있는 돌연변이 대장균 균주(E. coli MG1655 araBAD::PBAD-cas9-KmR)는 람다-레드 재조합 (lambda-red recombineering)을 통해 제작하였다. 대장균 MG1655 균주를 LB 고체배지에 도말 후 자라난 단일 콜로니를 LB 액체배지 200 ㎖에 접종하여 37℃에서 OD600nm가 0.4가 될 때까지 배양하고, 3500 rpm에서 20분 동안 원심분리 후 40 ㎖의 10% glycerol로 세척하는 과정을 두 번 거쳐 electrocompetent cell로 제조하였다.
삽입할 cas9 유전자는 pCas (Addgene plasmid #62225) 로부터 PCR로 증폭되고, 카나마이신 유전자와 함께 재조합을 위한 상동 서열을 갖도록 cas9-KmR 카세트로 PCR로 증폭되었다. 증폭된 PCR 산물은 정제된 후 L-arabinose에 의해 pKD46 플라스미드의 람다-레드 재조합 효소가 과발현된 대장균 MG1655에 삽입되어 L-arabinose에 유전자의 발현이 유도되는 프로모터의 뒷부분에 위치됨으로써 HK1059 균주로 제작되었다.
올리고뉴클레오타이드에 의한 재조합을 돕기 위한 람다-레드 베타 발현 플라스미드 pHK463은 pKD46 backbone과 bet 유전자 부분을 각각 PCR로 증폭하여, isothermal assembly를 통하여 제작하였으며, L-arabinose 유도 시에만 베타 단백질을 발현하도록 만들어졌다.
실시예 2. CRISPR-Cas9 음성 선택 및 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이를 이용한 유전체 편집
상기 실시예 1의 HK1059 균주를 LB 고체배지에 도말 후 자라난 단일 콜로니를 LB 액체배지 200 ㎖에 접종하여 37℃에서 OD600nm가 0.4가 될 때까지 배양하고, 3500 rpm에서 20분 동안 원심분리 후 40 ㎖의 10% glycerol로 세척하는 과정을 두 번 거쳐 electrocompetent cell로 제조하였다.
올리고뉴클레오타이드에 의한 재조합을 돕기 위한 람다-레드 베타 발현 플라스미드 pHK463을 HK1059 균주에 삽입하여 도말 후 형성된 단일 콜로니를 LB 액체배지 200 ㎖에 접종하여 30℃에서 OD600nm가 0.4가 될 때까지 배양하고, L-arabinose를 1 mM 농도로 첨가해 3시간 추가로 배양하여 람다-레드 베타 단백질과 Cas9 단백질을 과발현시켰다. 이후 3500 rpm에서 20분 동안 원심분리 후 40 ㎖의 10% glycerol로 세척하는 과정을 두 번 거쳐 electrocompetent cell로 제조하였다.
돌연변이 유발 올리고뉴클레오타이드들은 galK 유전자(NCBI accession no. 945358)의 503번 염기부터 507번 염기까지 각각 1개에서 4개의 염기가 치환되도록 제작되었다. 가이드 RNA를 발현하는 플라스미드와 올리고뉴클레오타이드를 HK1059에 전기 천공으로 삽입한 후 갈락토오스를 5 g/L로 첨가한 맥콘키(MacConkey plate) 선택 배지에 도말한 후 30℃에서 배양하였다.
올리고뉴클레오타이드에 의해 galK 유전자에 돌연변이가 도입된 경우 galK 유전자가 정상적으로 발현되지 않아 갈락토오스 대사가 불가능하고, 갈락토오스 대사를 하지 못하는 결과로 맥콘키 선택배지에서 흰색 콜로니를 형성한다. 돌연변이가 일어나지 않아 갈락토오스의 대사가 이루어지고, 대사산물에 의해 맥콘키 배지의 pH가 6.8 이하로 낮아지면 적색 콜로니를 형성한다. 고체배지에서 형성된 콜로니의 색도 별 비율 [흰색 콜로니/(흰색 콜로니 + 적색 콜로니)]로 CRISPR/Cas9 시스템의 편집 효율을 계산하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 2개 염기의 점 돌연변이는 86%, 3개 염기의 점 돌연변이는 81%, 4개 염기의 점 돌연변이는 86%의 편집 효율로 도입되었다. 그러나, 단일 점 돌연변이의 도입의 편집 효율은 CRISPR/Cas9 시스템의 불일치 허용으로 인해 2%인 것으로 나타났다.
이에, 본 발명자들은 이러한 CRISPR/Cas9의 불일치 허용을 극복하고 유전체를 단일 염기 수준으로 정교하게 편집하기 위해, 유전체에 목적 단일 점 돌연변이가 도입되도록 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이(oligonucleotide-directed mutagenesis); 및 특정 위치에 불일치(미스매치) 서열이 존재하도록 설계한 불일치 가이드 RNA를 이용하는 CRISPR/Cas9 시스템을 확립하였다.
보다 구체적으로, 본 발명자들은 가이드 RNA에 미리 가이드 RNA가 상보적으로 결합하는 타겟 유전자 서열과 상보적이지 않은 염기 서열, 즉, 불일치(미스매치) 서열이 존재하도록 불일치 가이드 RNA를 설계하였다.
따라서, 이에 의해, 점 돌연변이 도입에 의한 표적 DNA와의 불일치 염기 1 개 및 가이드 RNA 상 부여한 불일치 염기 1 개의 총 2 개의 불일치가 생성된다(도 3a, 도 3b 및 도 4a).
이후, 유전자 가위의 타겟 DNA 서열에 올리고뉴클레오타이드에 의해 돌연변이가 도입된 경우, 돌연변이가 도입된 서열은 유전자 가위가 타겟 서열로 인식하지 못해 세포는 생존할 수 있는 반면, 돌연변이가 유발되지 않은 타겟은 유전자 가위의 불일치 허용에 의해 이중가닥의 DNA가 절단되어 세포는 생존하지 못하게 되므로(음성선택, Negative selection), 목적 유전체를 단일 염기 수준으로 효과적으로 편집할 수 있을 뿐만 아니라, 선별할 수 있다.
실시예 3. 불일치 가이드 RNA(target-mismatched sgRNA) 내 염기 불일치의 위치 및 개수에 따른 단일 점 돌연변이의 도입 효율 확인
3-1. PAM 서열로부터 이격된 위치에 존재하는 목적 점 돌연변이에 대한 가이드 RNA 상의 미스매치 서열 위치 및 개수
본 발명자들은, 불일치 가이드 RNA 상에 존재하는 미스매치 서열 위치 및 개수가 편집 효율에 영향을 미치는 지 확인하기 위해, PAM 서열로부터 이격된(먼) 위치에 목적의 점 돌연변이를 위치시킨 올리고뉴클레오타이드; 및 상기 점 돌연변이 위치를 기준으로 5' 및 3' 양쪽에 각각 단일, 이중 미스매치(불일치) 서열을 갖는 가이드 RNA를 이용하여 단일 점 돌연변이를 도입하였다.
간략하게는 다음과 같다.
PAM 서열로부터 5'-방향으로 이격된 위치인 galK 유전자의 504번 염기에 점 돌연변이(T→A)를 유발하는 올리고뉴클레오타이드와 점 돌연변이 위치를 기준으로 5' 및 3' 양쪽에 각각 단일, 이중 불일치 서열을 갖는 가이드 RNA를, 상기 실시예 2의 람다-레드 베타 단백질과 Cas9 단백질이 과발현된 균주에 삽입하여 실시예 2에 기재된 방법과 동일하게 편집 효율과 콜로니 형성 단위를 계산하였다.
그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, galK 유전자의 505번 염기에 단일 불일치 서열을 갖는 가이드 RNA 플라스미드를 사용한 경우, 약 95%의 편집 효율을 보였다. 반면, 503번에 단일 불일치 서열이 존재하는 경우, 36%로 편집 효율이 감소하였다.
또한, galK 유전자의 505번 및 506번 염기에 이중 불일치 서열을 갖는 가이드 RNA 플라스미드를 사용한 경우, 약 86%의 편집 효율을 보였다. 반면, 502 및 503번 염기에 이중 불일치 서열이 존재하는 경우, 흰색 콜로니가 형성되지 않아 편집 효율을 계산할 수 없었으며, 콜로니 형성 단위 값이 이전보다 큰 폭으로 증가했는데, 이는 502 및 503번 염기에 이중 불일치 서열이 존재하는 경우 점 돌연변이 도입 여부에 관계없이 가이드 RNA가 상보적으로 결합하는 galK 타겟 유전자 서열을 인식하지 못해 유전자 가위가 작동하지 않아 세포가 음성 선택되지 않고 살아남은 것이다.
3-2. PAM 서열로부터 근접한 위치에 존재하는 목적 점 돌연변이에 대한 가이드 RNA 상의 미스매치 서열 위치 및 개수
본 발명자들은, 불일치 가이드 RNA(target-mismatched sgRNA) 상에 존재하는 미스매치 서열 위치 및 개수가 편집 효율에 영향을 미치는 지 확인하기 위해, PAM 서열로부터 근접한(가까운) 위치에 목적의 점 돌연변이를 위치시킨 올리고뉴클레오타이드; 및 상기 점 돌연변이 위치를 기준으로 5' 및 3' 양쪽에 각각 단일, 이중 미스매치(불일치) 서열을 갖는 가이드 RNA를 이용하여 단일 점 돌연변이를 도입하였다.
간략하게는 다음과 같다.
상기 실시예 3과 동일한 방법으로, PAM 서열에 근접한 위치인 galK 유전자의 578번 염기에 단일 점 돌연변이(C→A)를 유발하는 올리고뉴클레오타이드와 점 돌연변이 위치를 기준으로 5' 및 3' 양쪽에 각각 단일, 이중 불일치 서열을 갖는 가이드 RNA를, 상기 실시예 2의 람다-레드 베타 단백질과 Cas9 단백질이 과발현된 균주에 삽입하여 편집 효율과 콜로니 형성 단위를 계산하였다.
그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, galK 유전자의 579번 염기에 단일 불일치 서열이 존재하는 경우 84%, 577번 염기에 불일치 서열이 존재하는 경우 82%의 편집효율을 보였다.
반면, 576, 577번 염기 및 579, 580번 염기에 이중 불일치 서열이 존재하는 경우, 상기 실시예 3에서의 경우와 마찬가지로 흰색 콜로니가 형성되지 않아 편집 효율을 계산할 수 없었고, 콜로니 형성 단위 값이 이전보다 큰 폭으로 증가했는데, 576, 577번 염기 및 579, 580번 염기에 이중 불일치 서열이 존재하는 경우, 또한 점 돌연변이 도입 여부에 관계없이 가이드 RNA가 상보적으로 결합하는 galK 타겟 유전자 서열을 인식하지 못해 유전자 가위가 작동하지 않아 세포가 음성 선택되지 않고 살아남은 것이다.
즉, 이중 불일치 sgRNA의 경우 흰색 콜로니가 관찰되지 않았고 생존율이 현저하게 높았으며 이는 Cas9/이중 염기 불일치 sgRNA 복합체가 편집되지 않은 표적을 인식할 수 없음을 나타낸다.
상기 실시예 3-1 및 3-2의 결과들은, 본 발명의 위치 유도 돌연변이(oligonucleotide-directed mutagenesis) 및 염기 불일치 가이드 RNA(target-mismatched sgRNA)를 이용하는 CRISPR/Cas9 시스템에서, 가이드 RNA 상 미스매치 서열의 위치는, 점 돌연변이가 PAM 서열로부터 이격되어 있는지, 근접해 있는 지와 같은 PAM 서열 위치와는 상관없이, 목적하는 점 돌연변이가 도입된 위치를 기준으로, 이에 상응하는 가이드 RNA 상의 위치에서 1 개 뉴클레오타이드만큼 이격된 위치에 1 개 이상의 미스매치 서열이 존재할 때 효과적임을 보여준다.
실시예 4. 유전체 편집이 끝난 균주로부터 cas9 유전자 가이드 RNA 플라스미드의 제거
본 발명자들은, 서로 다른 위치의 연속된 유전체 편집이 가능하도록 유전체 편집이 모두 끝난 균주를 42℃에서 배양하여 가이드 RNA 플라스미드를 제거하였다. cas9 유전자는 P1 박테리오파지 형질도입을 통해 araBAD 유전자와 치환하여 본래의 균주와 비교했을 때 galK 유전자에서 단일 염기 점 돌연변이만이 일어난 균주를 확보하였다(도 5).
실시예 5. 단일 불일치 가이드 RNA를 이용하여 서로 다른 16개 표적의 단일 염기 편집
본 발명자들은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이; 및 특정 위치에 미스매치가 존재하도록 설계한 불일치 가이드 RNA를 이용하는 CRISPR/Cas9 시스템이 다른 표적 부위에도 작동하는지 추가적으로 검증하였다.
이에, 대장균 MG1655 균주의 유전체에서 16개의 서로 다른 CRISPR/Cas9 표적 부위를 선정하였고, 표적 염기 서열 중 11번째 뉴클레오타이드에 기존의 것과 다른 점 돌연변이를 각각 유발하는 세 개의 올리고뉴클레오타이드를 제작하였으며, 가이드 RNA의 12번째 뉴클레오타이드에 서로 다른 세 개의 불일치 서열을 포함하게 하여 표적 한 부위 당 네 개의 가이드 RNA를 제작하였다(도 6a).
돌연변이 유발 올리고뉴클레오타이드들은 yaaA 유전자의 740번 염기, ybdG 유전자의 685번 염기, ydcO 유전자의 755번 염기, ydiU 유전자의 285번 염기, preT 유전자의 1125번 염기, ypdA 유전자의 749번 염기, fau 유전자의 371번 염기, yhbU 유전자의 239번 염기, mnmE 유전자의 39번 염기, thiH 유전자의 305번 염기, proX 유전자의 741번 염기, galK 유전자의 504번, 578번, 935번 염기, moeA 유전자의 350번 염기, yjhF 유전자의 492번 염기를 각각 다른 세 개의 염기로 치환하도록 제작되었다 (A→G/T/C, T→G/A/C, G→A/T/C, 또는 C→G/A/T).
표적 한 부위 당 표적 서열과 일치하는 가이드 RNA 및 점 돌연변이 위치를 기준으로 오른쪽에 불일치 서열을 갖는 각각 다른 세 개의 가이드 RNA를 발현하는 플라스미드와 점 돌연변이 유발 올리고뉴클레오타이드를 HK1059에 전기 천공으로 삽입한 후 (표적 16개 Х 점 돌연변이 유발 올리고뉴클레오타이드 3개 Х 가이드 RNA 4개 = 192 전기 천공) LB배지에 도말한 후 37℃에서 배양하였으며, 형성된 콜로니 중 무작위로 세 개를 선정하여 생어 염기 서열 분석을 통해 돌연변이의 도입 여부를 확인하였다.
그 결과, 48 가지의 가능한 점 돌연변이 경우 중 (표적 16개 Х 점 돌연변이 유발 올리고뉴클레오타이드 3개) 54% (26/48)의 점 돌연변이가 13개의 표적에서 성공적으로 유도되었으며, 192개 전기 천공 중 42개의 전기 천공에서 돌연변이 도입에 성공하였다.
한편, 점 돌연변이는 염기쌍 하나의 변이가 생겨서 서열이 바뀌는 현상을 말하는 데 Transition 및 Transversion이 있다. Transition은 Py 염기는 Py 염기로, Pu 염기는 Pu 염기로 바뀌는 현상이며, Transversion은 Py 염기가 Pu 염기로, 또는 Pu 염기가 Py 염기로 바뀌는 현상이다(Py = pyrimidine = C 또는 T, Pu = purine = G 또는 A)
돌연변이 도입에 성공한 42개 전기천공 (/192개 전기 천공) 결과를 이러한 돌연변이 유형 (64 Transition + 128 Transversion)에 따라 결과를 나누었을 때, Transition이 9% (6/64), Transversion이 28% (36/128)로 더 우세하게 나타났으며, 표적 일치 가이드 RNA를 이용하여서는 42개 전기천공 중 한 가지 경우만이 성공했는데, Transition의 경우 N'11 : N'11 이 Py:Pu 또는 Pu:Py의 조합으로 대응되는 반면, Transversion의 경우 N'11 : N'11 이 Py:Py 또는 Pu:Pu의 염기쌍 배치를 갖게 되기 때문인 것으로 보여진다(도 6b).
염기쌍 배치가 가이드 RNA와 가이드 RNA가 상보적으로 결합하는 타겟 유전자 서열 간의 불일치에 영향을 미치는 것으로 판단하여 42개의 전기 천공 결과를 표적과 가이드 RNA 간의 염기쌍 배치에 따라 나누었을 때(도 6b), Transversion의 경우 43.7%의 점 돌연변이가 Py:Py 또는 Pu:Pu 의 염기쌍 배치 하에서 도입된 반면, 표적 일치 가이드 RNA를 포함한 Py:Pu (15.6%) 또는 Pu:Py (9.3%)의 염기쌍 배치에서는 감소한 성공률을 보였다.
또한, Transition의 경우 Py:Pu 또는 Pu:Py의 염기쌍 배치일 때 점 돌연변이가 도입되지 않았으며, Py:Py일 때 12.5%, Pu:Pu 25%의 성공률을 보였다.
즉, 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기쌍 부분이다. 퓨린 또는 피리미딘 염기쌍 부분은 전형적으로 아데닐, 시토신, 구아닌, 우라실 또는 티민이다.
이는, 본 발명의 불일치 가이드 RNA(sgRNA)가 CRISPR/Cas9의 불일치 허용을 극복하고 작동하여 점 돌연변이 유발 효율을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 불일치 가이드 RNA와 가이드 RNA가 상보적으로 결합하는 타겟 유전자 서열 간의 특정 염기쌍 배치 조건, 즉, 점 돌연변이가 Py:Py 또는 Pu:Pu의 염기쌍 배치 하에서 도입될 때, 보다 효과적으로 점 돌연변이를 유발시킬 수 있는 최적의 조건임을 입증한다.
프라이머 이름 프라이머 염기서열 (5'→3') 서열번호
Cas-AraC-F1 GCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATACCCGTTTTTTTGGATGGAGTGAAACGATGGATAAGAAATACTCAATAGGCT 1
KmR-AraD-R4 GTGGTGCCGGTTGCTGGAATCGACTGACCCGCCTGCGCCCAGATGGTGGCGTGGCGCGAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTT 2
Cas-KmR-OR2 GACGGATCCCCGGAATTCAGTCACCTCCTAGCTGACTCAAA 3
Cas-KmR-OF3 GCTAGGAGGTGACTGAATTCCGGGGATCCGTCGACCTGCAG 4
Ara-F1 AGCAGCTCCGAATAGCGCCCTTCCCCTTGC 5
AraD_500dn CCAGCCAGAAGGAGACTTCTGTCCCTTG 6
bet_for AGGAGGTTATAAAAAATGAGTACTGCACTCGCAACGCTGGC 7
bet_rev TTATCGTGAGGATGCGTCATGCTGCCACCTTCTGCTCTGCGG 8
rep101_for AAGGTGGCAGCATGACGCATCCTCACGATAATATCCGGGTAG 9
ara_promoter_rev GAGTGCAGTACTCATTTTTTATAACCTCCTTAGAGCTCGAATTC 10
galK504A GAAAACCAGTTTGTAGGCTGAAACTGCGGGATCATGGATCA 11
galK504AT GAAAACCAGTTTGTAGGCTGATACTGCGGGATCATGGATCA 12
galK503AGC GAAAACCAGTTTGTAGGCTAGCACTGCGGGATCATGGATCA 13
galK504ATCA AAAACCAGTTTGTAGGCTGATCATGCGGGATCATGGATCAG 14
galK578A CTTGCTGATCGATTGCCGCTAACTGGGGACCAAAGCAGTTT 15
Sm_ATG_Out GATACTGGGCCGGCAGGCGCTCCATTGCCC 16
Sm_TAA_Out GCAATGGAGCGCCTGCCGGCCCAGTATCAG 17
ClaI-gRNA-F ATCGATAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAG 18
NcoI-gRNA-R CCATGGGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTC 19
Cas-galK-WF AGGCTGTAACTGCGGGATCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 20
Cas-galK-WR TGATCCCGCAGTTACAGCCTACTAGTATTATACCTAGGACTG 21
galK505C_F AGGCTGTCACTGCGGGATCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 22
galK505C_R TGATCCCGCAGTGACAGCCTACTAGTATTATACCTAGGACTG 23
galK505CC_F AGGCTGTCCCTGCGGGATCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 24
galK505CC_R TGATCCCGCAGGGACAGCCTACTAGTATTATACCTAGGACTG 25
galK502GC_F AGGCGCTAACTGCGGGATCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 26
galK502GC_R TGATCCCGCAGTTAGCGCCTACTAGTATTATACCTAGGACTG 27
galK503C_F AGGCTCTAACTGCGGGATCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 28
galK503C_R TGATCCCGCAGTTAGAGCCTACTAGTATTATACCTAGGACTG 29
galK563_F TGATCGATTGCCGCTCACTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 30
galK563_R CAGTGAGCGGCAATCGATCAACTAGTATTATACCTAGGACTG 31
galK579C_F TGATCGATTGCCGCTCCCTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 32
galK579C_R CAGGGAGCGGCAATCGATCAACTAGTATTATACCTAGGACTG 33
galK579CA_F TGATCGATTGCCGCTCCATGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 34
galK579CA_R CATGGAGCGGCAATCGATCAACTAGTATTATACCTAGGACTG 35
galK577G_F TGATCGATTGCCGCGCACTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 36
galK577G_R CAGTGCGCGGCAATCGATCAACTAGTATTATACCTAGGACTG 37
galK576AG_F TGATCGATTGCCGAGCACTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 38
galK576AG_R CAGTGCTCGGCAATCGATCAACTAGTATTATACCTAGGACTG 39
표적 유전자
(표적 염기 서열)		 프라이머 염기서열 (5'→3') 서열번호
yaaA
(TTCCTCCAGCA*ATGGCGAAC)		 TTGATGAAGATTCCTCCAGCG*ATGGCGAACTGGTGTTTAAA 40
TTGATGAAGATTCCTCCAGCT*ATGGCGAACTGGTGTTTAAA 41
TTGATGAAGATTCCTCCAGCC*ATGGCGAACTGGTGTTTAAA 42
galK
(CGTGCCGCAAA*TTGACACTC)		 TCGAAATCACCGTGCCGCAAG*TTGACACTCTGGTAGAAATC 43
TCGAAATCACCGTGCCGCAAT*TTGACACTCTGGTAGAAATC 44
TCGAAATCACCGTGCCGCAAC*TTGACACTCTGGTAGAAATC 45
ybdG
(CCACCGTCAAA*GTGCGTAAC)		 ATTGGGTTAACCACCGTCAAG*GTGCGTAACTGGGACAATAC 46
ATTGGGTTAACCACCGTCAAT*GTGCGTAACTGGGACAATAC 47
ATTGGGTTAACCACCGTCAAC*GTGCGTAACTGGGACAATAC 48
moeA
(GCAGGAGCAGA*CTGAACAAA)		 CGGTGGTGATGCAGGAGCAGG*CTGAACAAATGGACAATGGC 49
CGGTGGTGATGCAGGAGCAGT*CTGAACAAATGGACAATGGC 50
CGGTGGTGATGCAGGAGCAGC*CTGAACAAATGGACAATGGC 51
galK
(AGGCTGT*AACTGCGGGATCA)		 GAAAACCAGTTTGTAGGCTGG*AACTGCGGGATCATGGATCA 52
GAAAACCAGTTTGTAGGCTGA*AACTGCGGGATCATGGATCA 53
GAAAACCAGTTTGTAGGCTGC*AACTGCGGGATCATGGATCA 54
ydcO
(ATTTACTGGAT*TGCTGGCAC)		 CATTAATTGTATTTACTGGAG*TGCTGGCACTGGTTTTTTCC 55
CATTAATTGTATTTACTGGAA*TGCTGGCACTGGTTTTTTCC 56
CATTAATTGTATTTACTGGAC*TGCTGGCACTGGTTTTTTCC 57
ydiU
(GGCGAACAACT*GCTTGCTGA)		 TTGTAGTGCCATCAGCAAGCG*GTTGTTCGCCGAGTAAAATG 58
TTGTAGTGCCATCAGCAAGCT*GTTGTTCGCCGAGTAAAATG 59
TTGTAGTGCCATCAGCAAGCC*GTTGTTCGCCGAGTAAAATG 60
preT
(GACCCGCAAGT*CTTTGCTGC)		 CCAGACCCGCGACCCGCAAGG*CTTTGCTGCTGGCGATATTG 61
CCAGACCCGCGACCCGCAAGA*CTTTGCTGCTGGCGATATTG 62
CCAGACCCGCGACCCGCAAGC*CTTTGCTGCTGGCGATATTG 63
ypdA
(TACTAATACCG*ATCATGTGC)		 CGGTGGCGATTACTAATACCA*ATCATGTGCTGGCCTATGTT 64
CGGTGGCGATTACTAATACCT*ATCATGTGCTGGCCTATGTT 65
CGGTGGCGATTACTAATACCC*ATCATGTGCTGGCCTATGTT 66
proX
(CTGCCGAATGG*TGCGAATTA)		 CGATACCAAACTGCCGAATGA*TGCGAATTATGGCTTCCCGG 67
CGATACCAAACTGCCGAATGT*TGCGAATTATGGCTTCCCGG 68
CGATACCAAACTGCCGAATGC*TGCGAATTATGGCTTCCCGG 69
fau
(TGATGAGTACG*GTCAGCGCC)		 TGGTCGCCTTTGATGAGTACA*GTCAGCGCCTGGGAATGGGC 70
TGGTCGCCTTTGATGAGTACT*GTCAGCGCCTGGGAATGGGC 71
TGGTCGCCTTTGATGAGTACC*GTCAGCGCCTGGGAATGGGC 72
yhbU
(TTGGCAGCGCG*CCGTGGATA)		 GTTACGCCCGTTGGCAGCGCA*CCGTGGATATGGCGGCGCAG 73
GTTACGCCCGTTGGCAGCGCT*CCGTGGATATGGCGGCGCAG 74
GTTACGCCCGTTGGCAGCGCC*CCGTGGATATGGCGGCGCAG 75
galK
(TGATCGATTGCCGCTC*ACTG)		 CTTGCTGATCGATTGCCGCTG*ACTGGGGACCAAAGCAGTTT 76
CTTGCTGATCGATTGCCGCTA*ACTGGGGACCAAAGCAGTTT 77
CTTGCTGATCGATTGCCGCTT*ACTGGGGACCAAAGCAGTTT 78
mnmE
(CAGGCCACGCC*TCCGGGACG)		 TATCGTAGCCCAGGCCACGCG*TCCGGGACGTGGCGGCGTTG 79
TATCGTAGCCCAGGCCACGCA*TCCGGGACGTGGCGGCGTTG 80
TATCGTAGCCCAGGCCACGCT*TCCGGGACGTGGCGGCGTTG 81
thiH
(TCGCATCAAGC*GCAAAACGC)		 CCATGAGTAATCGCATCAAGG*GCAAAACGCTGGATGAAGCG 82
CCATGAGTAATCGCATCAAGA*GCAAAACGCTGGATGAAGCG 83
CCATGAGTAATCGCATCAAGT*GCAAAACGCTGGATGAAGCG 84
yjhF
(ACTGTTATCGC*CAGGGAATA)		 CCCCGGCCCGACTGTTATCGG*CAGGGAATATGGCGCTGATG 85
CCCCGGCCCGACTGTTATCGA*CAGGGAATATGGCGCTGATG 86
CCCCGGCCCGACTGTTATCGT*CAGGGAATATGGCGCTGATG 87
PAM 서열은 밑줄친 부위로 나타냈다.
단일 염기 돌연변이는 굵은 글씨체*로 나타냈다.
실시예 6. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 및 불일치 가이드 RNA를 이용하는 CRISPR/Cas9 시스템의 검증
본 발명자들은 본 발명의 목적 단일 점 돌연변이가 도입되도록 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이; 및 특정 위치에 미스매치가 존재하도록 설계한 불일치 가이드 RNA를 이용하는 CRISPR/Cas9 시스템이 실제 작동하여 CRISPR/Cas9의 불일치 허용을 극복하고 유전체를 단일 염기 수준으로 정교하게 편집할 수 있는 지 검증하였다.
이에, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 및 불일치 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR/Cas9 (도 7)를 이용하여 xylR(transcription activator) 단일 점 돌연변이가 도입된 Nissle 1917 균주의 xylose 소비 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 8a 내지 8d에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 불일치 가이드 RNA/Cas9 이용하여 xylR single point mutation을 도입한 대장균주의 xylose 당의 소비 속도는 유의하게 증가하였다.
즉, 혐기조건에서 본 발명에 따라 유전체 편집된 미생물인 대장균주는 xylose 당을 (B)보다 (D)의 소비 속도가 증가하였고, 혐기조건에서 glucose와 xylose 당이 동시에 존재할 때 (A)보다 (C)의 xylose 당의 소비속도가 현저하게 증가한 것을 확인하였다.
이는, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 및 불일치 가이드 RNA를 이용하는 CRISPR/Cas9 시스템이 실제 작동한다는 것을 입증한다.
따라서, 본 발명은 종래 CRISPR/Cas9 시스템에 비해 점 돌연변이 도입 효율이 향상될 뿐만 아니라, 실제 단일 염기 단위의 정교한 유전자 편집 효과를 달성한바, 목표 유전자에 변이(예컨대, 점 돌연변이)가 일어난 미생물 균주들의 유전체를 올바르게 수선하거나, 또는 코돈의 변화 등을 유발함으로써 물질 생산에 최적화된 코돈과 대사경로를 가지게 하여, 유용 물질의 생산능을 최적화시킨 균주의 제작 등에 다양하게 활용될 수 있어, 유용 산물 생산과 관련된 산업적 활용에 매우 유용하다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Method for Genome Editing Based on CRISPR/Cas9 System and Uses Thereof <130> CAU1-4PCT <150> KR 1020200040352 <151> 2020-04-02 <160> 87 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas-AraC-F1 <400> 1 gctttttatc gcaactctct actgtttctc catacccgtt tttttggatg gagtgaaacg 60 atggataaga aatactcaat aggct 85 <210> 2 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KmR-AraD-R4 <400> 2 gtggtgccgg ttgctggaat cgactgaccc gcctgcgccc agatggtggc gtggcgcgag 60 tgtaggctgg agctgcttcg aagtt 85 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas-KmR-OR2 <400> 3 gacggatccc cggaattcag tcacctccta gctgactcaa a 41 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas-KmR-OF3 <400> 4 gctaggaggt gactgaattc cggggatccg tcgacctgca g 41 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ara-F1 <400> 5 agcagctccg aatagcgccc ttccccttgc 30 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AraD_500dn <400> 6 ccagccagaa ggagacttct gtcccttg 28 <210> 7 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bet_for <400> 7 aggaggttat aaaaaatgag tactgcactc gcaacgctgg c 41 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bet_rev <400> 8 ttatcgtgag gatgcgtcat gctgccacct tctgctctgc gg 42 <210> 9 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rep101_for <400> 9 aaggtggcag catgacgcat cctcacgata atatccgggt ag 42 <210> 10 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ara_promoter_rev <400> 10 gagtgcagta ctcatttttt ataacctcct tagagctcga attc 44 <210> 11 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK504A <400> 11 gaaaaccagt ttgtaggctg aaactgcggg atcatggatc a 41 <210> 12 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK504AT <400> 12 gaaaaccagt ttgtaggctg atactgcggg atcatggatc a 41 <210> 13 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK503AGC <400> 13 gaaaaccagt ttgtaggcta gcactgcggg atcatggatc a 41 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK504ATCA <400> 14 aaaaccagtt tgtaggctga tcatgcggga tcatggatca g 41 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK578A <400> 15 cttgctgatc gattgccgct aactggggac caaagcagtt t 41 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sm_ATG_Out <400> 16 gatactgggc cggcaggcgc tccattgccc 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sm_TAA_Out <400> 17 gcaatggagc gcctgccggc ccagtatcag 30 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ClaI-gRNA-F <400> 18 atcgatagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaag 34 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NcoI-gRNA-R <400> 19 ccatgggaag atcctttgat cttttctacg gggtc 35 <210> 20 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas-galK-WF <400> 20 aggctgtaac tgcgggatca gttttagagc tagaaatagc aag 43 <210> 21 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas-galK-WR <400> 21 tgatcccgca gttacagcct actagtatta tacctaggac tg 42 <210> 22 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK505C_F <400> 22 aggctgtcac tgcgggatca gttttagagc tagaaatagc aag 43 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK505C_R <400> 23 tgatcccgca gtgacagcct actagtatta tacctaggac tg 42 <210> 24 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK505CC_F <400> 24 aggctgtccc tgcgggatca gttttagagc tagaaatagc aag 43 <210> 25 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK505CC_R <400> 25 tgatcccgca gggacagcct actagtatta tacctaggac tg 42 <210> 26 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK502GC_F <400> 26 aggcgctaac tgcgggatca gttttagagc tagaaatagc aag 43 <210> 27 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK502GC_R <400> 27 tgatcccgca gttagcgcct actagtatta tacctaggac tg 42 <210> 28 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK503C_F <400> 28 aggctctaac tgcgggatca gttttagagc tagaaatagc aag 43 <210> 29 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK503C_R <400> 29 tgatcccgca gttagagcct actagtatta tacctaggac tg 42 <210> 30 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK563_F <400> 30 tgatcgattg ccgctcactg gttttagagc tagaaatagc aag 43 <210> 31 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK563_R <400> 31 cagtgagcgg caatcgatca actagtatta tacctaggac tg 42 <210> 32 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK579C_F <400> 32 tgatcgattg ccgctccctg gttttagagc tagaaatagc aag 43 <210> 33 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK579C_R <400> 33 cagggagcgg caatcgatca actagtatta tacctaggac tg 42 <210> 34 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK579CA_F <400> 34 tgatcgattg ccgctccatg gttttagagc tagaaatagc aag 43 <210> 35 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK579CA_R <400> 35 catggagcgg caatcgatca actagtatta tacctaggac tg 42 <210> 36 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK577G_F <400> 36 tgatcgattg ccgcgcactg gttttagagc tagaaatagc aag 43 <210> 37 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK577G_R <400> 37 cagtgcgcgg caatcgatca actagtatta tacctaggac tg 42 <210> 38 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK576AG_F <400> 38 tgatcgattg ccgagcactg gttttagagc tagaaatagc aag 43 <210> 39 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK576AG_R <400> 39 cagtgctcgg caatcgatca actagtatta tacctaggac tg 42 <210> 40 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yaaA <400> 40 ttgatgaaga ttcctccagc gatggcgaac tggtgtttaa a 41 <210> 41 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yaaA <400> 41 ttgatgaaga ttcctccagc tatggcgaac tggtgtttaa a 41 <210> 42 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yaaA <400> 42 ttgatgaaga ttcctccagc catggcgaac tggtgtttaa a 41 <210> 43 <211> 41 <212> DNA <213> 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Claims (11)

  1. 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9) 시스템 기반 유전체 편집 방법으로서,
    상기 표적 DNA와 상기 가이드 RNA 서열 간에 1 개 이상의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드가 부여되는 단계를 포함하는, CRISPR/Cas9 시스템 기반 유전체 편집 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 가이드 RNA는 표적 DNA와 혼성화하는 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA (transactivating crRNA)를 포함하는 이중 RNA (dualRNA), 또는 상기 crRNA 및 tracrRNA의 부분을 포함하고 표적 DNA와 혼성화하는 단일-사슬 가이드 RNA (sgRNA)인 것을 특징으로 하는,
    CRISPR/Cas9 시스템 기반 유전체 편집 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 표적 DNA는 상기 crRNA 또는 sgRNA와 상보적인 서열의 뉴클레오타이드 및 프로토스페이서-인접 모티프(protospacer-adjacent motif, PAM)를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    CRISPR/Cas9 시스템 기반 유전체 편집 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 공여 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태인 것을 특징으로 하는,
    CRISPR/Cas9 시스템 기반 유전체 편집 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 공여 핵산 분자는 표적 DNA 상에 변형을 유발하는 것을 특징으로 하는,
    CRISPR/Cas9 시스템 기반 유전체 편집 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 녹아웃(knockout), 녹인(knockin), 내인성 핵산 서열의 상동, 이종상동성(endogenous) 또는 이종 핵산 서열로의 치환, 또는 이의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    CRISPR/Cas9 시스템 기반 유전체 편집 방법.
  7. 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템 기반 유전체 편집용 조성물로서,
    상기 표적 DNA와 상기 가이드 RNA 서열 간에 1 개 이상의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드가 포함되는 것을 특징으로 하는,
    CRISPR/Cas9 시스템 기반 유전체 편집용 조성물.
  8. 표적 DNA에 상보적으로 결합하는, 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템 기반의 유전체 편집 효율 증가 방법으로서,
    상기 표적 DNA와 상기 가이드 RNA 서열 간에 1 개 이상의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드가 부여되는 단계를 포함하는, CRISPR/Cas9 시스템 기반의 유전체 편집 효율 증가 방법.
  9. 다음 단계를 포함하는, CRISPR/Cas9 시스템 기반의 표적 DNA가 편집된 대상체의 제조 방법:
    (a) 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 표적 DNA 상에 변형을 유발하는 공여 핵산 분자를 제작하는 단계;
    (b) 표적 DNA에 대해 상보적으로 결합하고, 상기 표적 DNA에 대해 1 개 이상의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드가 부여된 가이드 RNA를 제작하는 단계; 및
    (c) 상기 (a) 단계의 공여 핵산 분자 및 상기 (b) 단계의 가이드 RNA를, 편집시키고자 하는 대상체에 주입시켜 상기 표적 DNA와 상기 가이드 RNA 서열 간에 2 개 이상의 불일치(mismatch)가 발생함으로써 대상체의 표적 DNA가 편집되는 단계.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 CRISPR/Cas9 시스템은 항생제 저항성 선별마커를 이용하는 것을 특징으로 하는, 표적 DNA가 편집된 대상체의 제조 방법.
  11. 제9항의 표적 DNA가 편집된 대상체의 제조 방법에 의해 제조된, 표적 DNA가 편집된 대상체.
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