JP2024504355A - 標的ｄｎａ配列及びクローニングベクターを作製するための方法 - Google Patents

標的ｄｎａ配列及びクローニングベクターを作製するための方法 Download PDF

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Abstract

本願は、標的ＤＮＡ配列及びクローニングベクターを作製するための方法に関する。該方法は、宿主細胞内のＤＮＡ構築物を増幅及び抽出するステップ、並びにプロテロメラーゼ－ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼ－ＤＮＡエキソヌクレアーゼ触媒作用の３ステップ恒温酵素反応ステップを含み、ここで構築物は、自律的に複製され、（ａ）１つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼ認識配列；（ｂ）標的ＤＮＡ配列；並びに（ｃ）標的ＤＮＡ配列の２つの末端の側翼でのプロテロメラーゼ認識配列を含む。

Description

本願は、生物工学の分野、特に、標的ＤＮＡ配列及びクローニングベクターを作製するための方法に関する。
遺伝子編集に基づく遺伝子療法及び細胞療法は、３０年を超える開発を経て、十分に開発された。特に、ヌクレアーゼ（亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬヌクレアーゼ及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ）に基づく正確な遺伝子編集及びウイルスに依存しない送達モードのおかげで、ウイルスに依存しない、より安全でより効率的な遺伝子療法が可能になっている。初期段階では、遺伝子欠損型の遺伝性疾患の補償を実施するような治療における標的タンパク質遺伝子の送達及び発現のため、プラスミドが使用される。また、大きい断片の遺伝子が相同組換えに基づいてノックインされるとき、プラスミド又は線状化プラスミド断片は、編集鋳型として使用される。診療では、遺伝子編集におけるプラスミドの適用は、多くの欠点及び潜在的リスクを有することが判明している：１）非標的断片の冗長なベクター骨格配列を含むことに起因した、インビボ又は免疫細胞送達中の二本鎖ＤＮＡに基づく細胞傷害性の増加；２）プラスミド上の冗長な骨格配列は、主に複製起点部位及び抗生物質耐性遺伝子であり、これらの遺伝子は、遺伝子療法に使用されるとき、ヒトの正常な微生物叢によって汚染される可能性があるだけでなく、細菌源を有する配列は、一般にＣｐＧアイランドを含み、プラスミド複製プロセスにおいてメチル化される傾向があり、適用中に強力な免疫原性をもたらす；並びに３）相同組換え修復の間、ＰＣＲ増幅法に基づいて調製された平滑末端二本鎖ＤＮＡが、非相同組換え修復末端結合をもたらす可能性がある修復鋳型として採用されることで、相同性アームの反復領域を含む編集配列をもたらし、元の設計を損なう。
上記問題を解決することを目標に、二重酵素消化モードで標的断片をプラスミドから分離することを試みる研究が行われている。しかし、該方法は、大規模断片分離及び精製に対して実現困難であり、アガロースゲル電気泳動を通じて小規模精製を実施可能であるに過ぎない。さらに、該方法では、ＤＮＡ断片に対してＤＮＡ色素に応じて発色を呈し、埋め込まれたＤＮＡ色素が完全に除去され得るか又は否かについても、検証するのが困難な課題である。２０１６年、Ｓｌａｖｃｅｖらが標的断片の二本鎖ＤＮＡの発酵技術により、細菌に基づいてインビボ組換えが実現されることを報告したが、その結果は、不完全な組換え効率に起因し、葉状体の溶解後に精製された産物が、細菌ゲノム及び元のプラスミドなどのＤＮＡ不純物の汚染を有することになり、高純度の最終産物もアガロースゲル電気泳動に応じて分離されることを示している。即ち、該方法は、スケールアップが困難であることや、工業生産における有毒なＤＮＡ色素といった上記の問題をやはり有する。
標的断片を直接的に入手するという別の試みは、大量の二本鎖ＤＮＡを、ＰＣＲ増幅を通じて調製することである。しかし、ＰＣＲによって使用されるＤＮＡポリメラーゼは、細菌体におけるＤＮＡ複製系の場合よりも配列忠実度で劣る。大規模調製の間、大量の高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを購入するための費用は非常に高い。大きい断片が増幅されるとき、ＰＣＲの収量はやや減少し、非全長断片の汚染が生じる可能性がある。決定的問題は、ミリグラムレベルの二本鎖ＤＮＡ純粋産物が求められるとき、大量のＰＣＲを実施し、数百又はさらに数千のＰＣＲ反応産物をまとめて収集する必要があり、ＧＭＰ標準に合致することが困難であることである。その問題を解決するため、英国のＴｏｕｃｈｌｉｇｈｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）に基づく、二本鎖ＤＮＡのインビトロ温度制御インデックス増幅法（ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔｉｃ ｉｎｄｅｘ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を開発した。しかし、標的産物が遺伝子ノックインのための鋳型として使用されるとき、インビトロ複製の方法は、細菌体におけるＤＮＡ複製の誤り訂正機構の欠損に起因し、ＤＮＡ配列の突然変異を増加させるリスクを有することになる。特に、標的配列が極めて高い割合のＧＣ配列、ヘアピン構造及び反復配列を含むとき、一般に高難易度（ｈｉｇｈ－ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙ）配列領域内で欠損が生じることがない、ＤＮＡポリメラーゼに基づくインビトロ複製によって保証することは困難である。さらに、全体的なインビトロ複製プロセスは、インデックス複製であり、且つランダムであり、反応が完了した後、標的配列単量体が化合物から切断及び放出されるとき、産物は、不完全断片産物と混合され、除去することが困難な不純物を有することになる。
標的ＤＮＡ配列を調製するための単純な効率的方法がいまだ求められる。
本願は、標的ＤＮＡ配列及びクローニングベクターを作製するための方法を提供する。該方法及びクローニングベクターは、作製予定の標的ＤＮＡ配列に対する特別な制限を有せず、それ故、様々なＤＮＡ配列に適した一般的な方法及びクローニングベクターが存在する。さらに、該方法及びクローニングベクターは、高純度の標的ＤＮＡ配列を大規模に効率的に作製するように構成され得る。該方法では、プロテロメラーゼ認識配列並びにＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼ認識配列を含むＤＮＡ構築物が使用され、ＤＮＡ構築体は、細胞内ベクター増幅プロセスを通じて（例えば、プラスミド形質転換及び抽出方法を通じて）大規模に作製され、次に高純度の標的ＤＮＡ断片は、プロテロメラーゼ－ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼ－ＤＮＡエキソヌクレアーゼの恒温酵素反応の３つのステップを通じて得ることができる。最終産物は、アルコール（例えば、エタノール）沈殿濃縮を施すことができ、大規模に調製することが容易である。全体的な調製及び精製プロセスは、ＤＮＡ色素を含まない。最終産物は、宿主細胞によるインビボ複製に由来し、配列は、正確さが高く、配列のエラー、欠失又は突然変異は、標的配列内に高難易度（ｈｉｇｈ－ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙ）配列を含むことに起因し、回避される。
クローニングベクター
本願は、標的ＤＮＡ配列を作製する、又は下記のＤＮＡ構築物を構築するように構成された一般的なクローニングベクターを提供する。一般的なクローニングベクターは、自律的複製ベクターであり、（ａ）１つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼ認識配列、並びに（ｂ）複数のクローニング部位を含む。
いくつかの実装形態では、クローニングベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ又はウイルス（例えば、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）及びアデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ））から選択される。クローニングベクターは、複製起点を含んでもよい。クローニングベクターは、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位又は外来ＤＮＡ配列（例えば、プロテロメラーゼ認識配列と連結された側翼（ｌａｔｅｒａｌ ｗｉｎｇ）を有する標的ＤＮＡ配列）、及び／若しくはクローニングベクターによって形質転換された細胞を認識し、選択するように構成された選択マーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子及びｃｃｄＢ遺伝子）を挿入するように構成された複数のクローニング部位を含んでもよい。
いくつかの実装形態では、クローニングベクターは、２つ以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼ認識配列を含む。いくつかの実施形態では、クローニングベクターは、３つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又は２つ以上のメガヌクレアーゼ認識配列を含む。１つの具体的な実施形態では、クローニングベクターは、５つのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又は２つのメガヌクレアーゼ認識配列を含む。
本明細書で用いられるＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼは、限定はされないが、ＡｌｗＩ、ＢｃｃＩ、ＢｓｍＡｌ、ＥａｒＩ、ＭｌｙＩ、ＰｌｅＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢｌ、ＦａｕＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｎｌＩ、ＳａｐＩ、ＢｂｓＩ、ＢｃｉＶＩ、ＨｐｈＩ、ＭｂｏＩＩ、ＢｆｕａＩ、ＢｓｐＭＩ、ＳｆａＮＩ、ＨｇａＩ、ＢｂｖＩ、ＥｃｉＩ、ＦｏｋＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｇＩ、ＡｃｌＷＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、Ｂｓｔ６Ｉ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｔＭＡＩ、Ｅａｍｌ１０４１、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＰｐｓＩ、ＳｃｈＩ、ＢｆｉＩ、Ｂｓｏ３１Ｉ、ＢｓｐＴＮＩ、ＢｓｐＱＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＳｍｕＩ、ＢｆｕＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｕＡＩ、ＢｓｔＶ２Ｉ、ＡｓｕＨＰＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＬｗｅＩ、ＡａｒＩ、ＢｓｅＭＩＩ、ＴｓｐＤＴＩ、ＴｓｐＧＷＩ、ＢｓｅＸＩ、ＢｓｔＶｌＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、ＧｓｕＩ、ＰｓｒＩ又はＭｍｅＩを含む。いくつかの実装形態では、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼは、以下：ＢｂｓＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＥａｒＩ、ＨｇａＩ及びＳｆａＮＩの１つ又はいずれかの組み合わせから選択される。ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼを調製し、使用するための方法は、従来法であり、多数のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、商業的に入手可能である。「ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列」は、対応するＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼによって認識され、切断され得る配列であり、特異的な使用されるＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼに応じて決定され、当該技術分野で公知である。一実施形態では、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼは、ＧＣＴＣＴＴＣの認識配列を有するＢｓｐＱＩを含む。
本明細書で用いられる「メガヌクレアーゼ」という用語は、二本鎖ＤＮＡ標的配列の１２ｂｐより大きい希少なニックを有するエンドヌクレアーゼサブタイプである。メガヌクレアーゼは、一般に二量体酵素であり、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）とも呼ばれ、配列及び構造モチーフに応じて、５つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ－ＹＩＧ、ＨＮＨ、Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックス及びＴＯ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫに分割可能である。構造データは、各ファミリーの少なくとも１つのメンバーとして利用可能である。いくつかの実装形態では、メガヌクレアーゼは、以下：Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ及びＩ－ＳｍａＭＩのいずれか１つ又はいずれかの組み合わせから選択される。メガヌクレアーゼを調製し、使用するための方法は、従来法であり、多数のメガヌクレアーゼが、商業的に入手可能である。「メガヌクレアーゼ認識配列」は、対応するメガヌクレアーゼによって認識され、切断され得る配列であり、特異的な使用されるメガヌクレアーゼに応じて決定され、当該技術分野で公知である。一実施形態では、メガヌクレアーゼは、ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴの認識配列を有するＩ－ＳｃｅＩを含む。
いくつかの実装形態では、クローニングベクター内のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列は、以下：ＢｂｓＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＥａｒＩ、ＨｇａＩ及びＳｆａＮＩの認識配列のいずれか１つ又はいずれかの組み合わせから選択される。
いくつかの実装形態では、クローニングベクター内のメガヌクレアーゼ認識配列は、以下：Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ及びＩ－ＳｍａＭＩの認識配列のいずれか１つ又はいずれかの組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態では、クローニングベクターは、複製起点及び選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子又はｃｃｄＢ遺伝子から選択されてもよい。いくつかの実装形態では、クローニングベクターは、ラクトースオペロン配列、複数のクローニング部位を含むβガラクトシダーゼをコードする遺伝子、及び３つ以上のＢｓｐＱＩ認識配列及び／又は２つ以上のＩ－ｓｃｅＩ認識配列を含む。いくつかの実施形態では、ラクトースオペロン配列は、ｌａｃプロモーター及びｌａｃ作動遺伝子を含む。
クローニングベクターは、中／高コピークローニングベクターであってもよい。いくつかの実装形態では、本願のＤＮＡ構築物を構築するように構成されたクローニングベクターは、ｐＢＲ３２２ベクター、ｐＵＣベクター、又はｐＥＴベクターに由来する。いくつかの好ましい実施形態では、本願のＤＮＡ構築物を構築するように構成されたクローニングベクターは、ｐＵＣ５７ベクターなどのｐＵＣベクターに由来する。いくつかの実装形態では、ｐＵＣベクターは、配列番号１２で示されるような配列を含み、又は配列番号１２で示されるような配列である。
本明細書で用いられる「～に由来する」という用語は、～から再構築される、即ち、クローニングベクターが、クローニングベクターの由来元である初期ベクター（ｐＢＲ３２２ベクター、ｐＵＣベクター、又はｐＥＴベクターなど）を再構築することによって得られることを指す。一方で、再構築は、（ｉ）１つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／若しくはメガヌクレアーゼ認識配列が、ｐＢＲ３２２ベクター、ｐＵＣベクター、若しくはｐＥＴベクターなどの初期ベクター上に挿入されること；（ｉｉ）ｐＢＲ３２２ベクター、ｐＵＣベクター、若しくはｐＥＴベクターなどの初期ベクター上で突然変異が実施されることで、１つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／若しくはメガヌクレアーゼ認識配列が作製されること、又は（ｉ）及び（ｉｉ）の組み合わせを含んでもよい。いくつかの実装形態では、ＤＮＡ構築物又はクローニングベクター上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識部位をより多くし、酵素消化を受ける骨格断片をより小さくするため、さらなるＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列が、コドンの同義突然変異を通じて、複製起点部位及び抗生物質耐性遺伝子配列に付加され得る。
いくつかの実装形態では、クローニングベクターは、以下：（ｉ）ＢｓｐＱＩ認識配列がｐＵＣ５７ベクターの１５５４位塩基及び２５３９位塩基の後に付加され、且つＩ－ｓｃｅＩ認識配列が１５０１位塩基及び２４７９位塩基の後に付加される；並びに（ｉｉ）ｐＵＣ５７ベクターの１３９７位塩基のＧがＣに突然変異され、且つ２１３６位塩基及び２１３７位塩基のＡＴがＧＣに突然変異される、といったｐＵＣ５７ベクター上での再構築を実施することによって構築される。いくつかの実装形態では、ｐＵＣベクターは、配列番号１２で示されるような配列を含む、又は配列番号１２で示されるような配列である。
いくつかの実装形態では、クローニングベクターのヌクレオチド配列は、配列番号１で示されるような配列を含む、又は配列番号１で示されるような配列である。
ＤＮＡ構築物
本願は、下記の標的ＤＮＡ配列を作製するための方法において使用されるＤＮＡ構築物をさらに提供する。ＤＮＡ構築物は、自律的に複製され、（ａ）１つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼ認識配列；（ｂ）標的ＤＮＡ配列；並びに（ｃ）標的ＤＮＡ配列の２つの末端の側翼でのプロテロメラーゼ認識配列を含む。ＤＮＡ構築物は、（ｉ）１つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼ認識配列を含むクローニングベクターを提供する；並びに（ｉｉ）プロテロメラーゼ認識配列と連結された２つの末端での側翼を有する標的ＤＮＡ配列をクローニングベクターに挿入することを含む方法を通じて構築されてもよい。いくつかの実装形態では、ＤＮＡ構築物は、上記の通り、プロテロメラーゼ認識配列と連結された２つの末端での側翼を有する標的ＤＮＡ配列をクローニングベクターの複数のクローニング部位に挿入することによって調製される。
本明細書中の「ＤＮＡ構築物」は、宿主細胞又はバイオソームに導入されるべきＤＮＡ断片の手作業で構築された産物を指す。本明細書中のＤＮＡ構築物は、自律的に複製される、即ち、それは、複製起点（ｏｒｉ）などの、原核生物又は真核生物宿主細胞内のＤＮＡ構築物の自律的複製を支持する配列を含んでもよい。
いくつかの実装形態では、ＤＮＡ構築物は、２つ以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のエンドヌクレアーゼ認識配列を含む。
いくつかの実装形態では、ＤＮＡ構築物は、複製起点部位及び選択マーカー遺伝子をさらに含む。
いくつかの実装形態では、標的ＤＮＡ配列は、２つの末端でプロテロメラーゼ認識配列に直接的に隣接する、即ち、２つの末端での標的ＤＮＡ配列とプロテロメラーゼ認識配列との間に他の配列が存在しない。
いくつかの実装形態では、２つの末端での標的ＤＮＡ配列とプロテロメラーゼ認識配列との間に、エンドヌクレアーゼ認識部位及びニッキング酵素認識部位などの他の配列がさらに存在する。
標的ＤＮＡ配列の２つの末端での２つのプロテロメラーゼ認識配列は、直接的重複又は逆位重複を受けてもよい。
本明細書で用いられる「プロテロメラーゼ」という用語は、プロテロメラーゼ認識配列を認識及び切断し、プロテロメラーゼ認識配列を含むＤＮＡと再連結されることで、閉鎖二本鎖ＤＮＡを作製することができる酵素を指す。プロテロメラーゼは、一般にファージ中に見出され、例えば、限定はされないが、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ファージＮ１５（即ち、プロテロメラーゼＴｅｌＮ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）ファージｐｈｉ Ｋ０２、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）ファージＰｙ５４、ハロモナス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）ファージｐｈｉ ＨＡＰ、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）ファージＶＰ８８２、及びボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）プラスミドｌｐＢ３１．１６に由来するプロテロメラーゼである。いくつかの実装形態では、プロテロメラーゼは、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ファージＮ１５、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）ファージｐｈｉ Ｋ０２、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）ファージＰｙ５４、ハロモナス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）ファージｐｈｉ ＨＡＰ、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）ファージＶＰ８８２、及びボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）プラスミドｌｐＢ３１．１６、又はそれらの相同体若しくは変異体に由来するプロテロメラーゼから選択される。いくつかの実装形態では、プロテロメラーゼは、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ファージＮ１５、又はその相同体若しくは変異体に由来するプロテロメラーゼ（ＴｅｌＮ）である。相同体は、一般に、プロテロメラーゼの機能的相同体であり、そのアミノ酸配列は、プロテロメラーゼの天然アミノ酸配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性を有してもよい。変異体は、プロテロメラーゼの天然アミノ酸配列に対する切断、挿入、置換及び／又は欠失、例えば、１つ以上のアミノ酸の切断、挿入、置換及び／又は欠失を含んでもよい。プロテロメラーゼを調製し、使用するための方法は、従来法であり、多数のプロテロメラーゼが、商業的に入手可能である。
本明細書で用いられる「プロテロメラーゼ認識配列」という用語は、プロテロメラーゼによって認識され得るＤＮＡ配列であり、特異的な使用されるプロテロメラーゼに応じて決定され、当該技術分野で公知である。いくつかの実装形態では、プロテロメラーゼ認識配列は、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ファージＮ１５、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）ファージｐｈｉ Ｋ０２、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）ファージＰｙ５４、ハロモナス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）ファージｐｈｉ ＨＡＰ、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）ファージＶＰ８８２、及びボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｌｐＢ３１．１６に由来するプロテロメラーゼ認識配列から選択される。いくつかの実装形態では、プロテロメラーゼ認識配列は、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ファージＮ１５に由来する。いくつかの実装形態では、プロテロメラーゼ認識配列は、配列番号２を含む、又はそれから構成される。
標的ＤＮＡ配列を作製するための方法
本願は、標的ＤＮＡ配列を作製するための方法を提供する。「作製する」という用語は、増幅、クローニング及び複製などの用語と互換可能に用いることができる。該方法は、本願のＤＮＡ構築物を宿主細胞内で増幅及び抽出するステップ、プロテロメラーゼ－ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼ－ＤＮＡエキソヌクレアーゼ触媒作用の３ステップ恒温酵素反応ステップ（即ち、第１の切断反応－第２の切断反応－消化反応）、並びに任意選択的な回収ステップを含む。
いくつかの実装形態では、標的ＤＮＡ配列を作製するための方法は、
導入されたＤＮＡ構築物であって、自律的に複製され、（ａ）１つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼ認識配列；（ｂ）標的ＤＮＡ配列；並びに（ｃ）標的ＤＮＡ配列の２つの末端の側翼でのプロテロメラーゼ認識配列を含むＤＮＡ構築物とともに宿主細胞を培養することによってＤＮＡ構築物を増幅し、増幅されたＤＮＡ構築物を宿主細胞から抽出することと；
プロテロメラーゼを増幅及び抽出されたＤＮＡ構築物と接触させることを可能にし、ここで、プロテロメラーゼがＤＮＡ構築物上のプロテロメラーゼ認識配列を認識及び切断することにより、第１の切断反応混合物を得ることと；
第１の切断反応混合物を１つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼと接触させることを可能にし、ここで、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼが、構築物上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼ認識配列を認識及び切断することで、第２の切断反応混合物を得ることと；
第２の切断反応混合物を１つ以上のエキソヌクレアーゼと接触させることを可能にすることで、標的ＤＮＡ配列以外の他の配列を消化することと、
を含む。
１．ＤＮＡ構築物を増幅及び抽出するステップ
本願に従う標的ＤＮＡ配列を作製するための方法は、本願のＤＮＡ構築物を増幅及び抽出するステップを含み、ここでＤＮＡ構築物の増幅は、宿主細胞内で実施される。
いくつかの実装形態では、ＤＮＡ構築物を増幅及び抽出するステップは、導入されたＤＮＡ構築物とともに宿主細胞を培養することによってＤＮＡ構築物を増幅し、増幅されたＤＮＡ構築物を宿主細胞から抽出することを含む。いくつかの実装形態では、ＤＮＡ構築物を増幅及び抽出するステップは、当該技術分野で公知である宿主細胞のプラスミドを利用することによって増幅及び抽出することである。
本明細書で用いられる「宿主細胞」という用語は、ベクター又は構築物に導入されるように変換され、内在するベクター又は構築物の複製を支持する能力がある任意の細胞を包含する。宿主細胞は、原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞などの細菌細胞）又は真核細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞又は哺乳動物細胞）であってもよい。
ＤＮＡ構築物は、当該技術分野で公知の任意の方法によって宿主細胞に導入され得る。該方法は、限定はされないが、ＤＮＡ構築物が、化学的形質転換又はエレクトロポレーション形質転換を通じて、限定はされないが、Ｔｏｐ１０化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、製品カタログ番号：Ｃ４０４０１０）、ＤＨ５α化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、製品カタログ番号：１８２６５０１７）、及びＤＨ１０Ｂ化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、製品カタログ番号：１２３３１０１３）を含む、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）コンピテント細胞などの適切なコンピテント細胞に侵入することを可能にすることを含む。
宿主細胞内でのＤＮＡ構築物の増幅は、宿主細胞をＤＮＡ構築物の増幅に適した条件下で培養することによって実施される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ構築物は、クローニングベクターが大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされた後、好適な液体培地（例えば、耐性遺伝子を含有するＬＢ培地）中で発酵され、培養される。また、ＤＮＡベクターは、発酵され、蓄積された宿主細胞内で増幅される。
増幅されたＤＮＡ構築物の抽出は、限定はされないが、アルカリ溶解法の使用、又は市販のプラスミド抽出キット（例えば、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット、Ｑｉａｇｅｎ）の使用を含む、当該技術分野で公知の抽出方法を通じて実施することができる。
２．第１の切断反応
本願に従う標的ＤＮＡ配列を作製するための方法は、ＤＮＡ構築物を増幅及び抽出する上記ステップ後の、第１の切断反応のステップをさらに含む。第１の切断反応のステップは、プロテロメラーゼを増幅及び抽出されたＤＮＡ構築物と接触させることを可能にすることを含んでもよく、ここでプロテロメラーゼは、ＤＮＡ構築物上のプロテロメラーゼ認識配列を認識及び切断することで、第１の切断反応混合物が得られる。
第１の切断反応は、プロテロメラーゼ活性にとって適切な温度下での恒温反応であってもよい。適切な温度は、当該技術分野で公知であり、例えば、２０～４０℃、例えば、２５～３５℃、及び例えば、３０℃であってもよい。第１の切断反応のための時間は、１０分～２４時間、例えば、３０分～１２時間、例えば、４０分、５０分、１時間、２時間、又は４時間であってもよい。
いくつかの実装形態では、標的ＤＮＡ配列を作製するための方法は、第１の切断反応後にプロテロメラーゼを不活性化するステップを含む。不活性化するステップは、プロテロメラーゼがその不活性化温度より高い（例えば、６０℃より高い、７０℃より高い、及び例えば、７５℃）ように加熱し、その温度を好適な時間（例えば、２分～１時間、例えば、５分、１０分、又は２０分）維持することを含んでもよい。
３．第２の切断反応
本願に従う標的ＤＮＡ配列を作製するための方法は、第１の切断反応の上記ステップ後に第２の切断反応のステップをさらに含む。第２の切断反応は、第１の切断反応混合物を１つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼと接触させることを可能にすることを含んでもよく、ここでＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼは、構築物上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼ認識配列を認識及び切断することで、第２の切断反応混合物が得られる。
第２の切断反応は、使用されるＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼにとって適切な温度下での恒温反応であってもよい。適切な温度は、当該技術分野で公知であり、例えば、２０～５５℃、例えば、３０～５０℃、及び例えば、３７℃であってもよい。第２の切断反応のための時間は、１０分～２４時間、例えば、３０分～１２時間、例えば、４０分、５０分、１時間、２時間、又は４時間であってもよい。
いくつかの実装形態では、標的ＤＮＡ配列を作製するための方法は、第２の切断反応後にＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼを不活性化するステップを含む。不活性化するステップは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼがその不活性化温度より高い（例えば、６０℃より高い、６５℃より高い、及び例えば、６５℃又は７０℃）ように加熱し、その温度を特定の時間（例えば、２分～１時間、例えば、１０分、２０分、又は２５分）維持することを含んでもよい。
４．消化反応
本願に従う標的ＤＮＡ配列を作製するための方法は、第２の切断反応の上記ステップ後の消化反応のステップをさらに含む。消化反応のステップは、第２の切断反応混合物を１つ以上のエキソヌクレアーゼと接触させることを可能にすることで、標的ＤＮＡ配列以外の他の配列を消化する、及び好ましくは、標的ＤＮＡ配列以外の全ての他のヌクレオチド配列を消化することを含む。
エキソヌクレアーゼは、限定はされないが、ファージＴ５エキソヌクレアーゼ（ファージＴ５遺伝子Ｄ１５産物）、ファージλエキソヌクレアーゼ、ＲａｃプロファージのＲｅｃＥ、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）に由来するエキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、及びファージＴ７エキソヌクレアーゼ（ファージＴ７遺伝子６産物）を含む、当該技術分野で公知の任意のエキソヌクレアーゼであってもよい。本開示のいくつかの実装形態では、エキソヌクレアーゼは、Ｔ５エキソヌクレアーゼ又はλエキソヌクレアーゼである。エキソヌクレアーゼを調製し、使用するための方法は、従来法であり、多数のエキソヌクレアーゼが、商業的に入手可能である。
消化反応は、使用されるエキソヌクレアーゼにとって適切な温度下での恒温反応であってもよい。適切な温度は、当該技術分野で公知であり、例えば、２０～５５℃、例えば、３０～５０℃、及び例えば、３７℃であってもよい。消化反応のための時間は、１０分～２４時間、例えば、３０分～１２時間、例えば、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間又は６時間であってもよい。
いくつかの実装形態では、標的ＤＮＡ配列を作製するための方法は、消化反応の後にエキソヌクレアーゼを不活性化するステップを含む。不活性化するステップは、エキソヌクレアーゼをその不活性化温度より高い（例えば、６０℃より高い、６５℃より高い、及び例えば、７０℃、７５℃又は８０℃）ように加熱し、その温度を特定の時間（例えば、２分～１時間、例えば、５分、１０分、又は２０分）維持することを含んでもよい。
さらなる精製ステップは、第１の切断反応が完了し且つ第２の切断反応が完了した後には含まれない。本願に従う全ての酵素消化反応が、プロテロメラーゼを利用する第１の切断反応、並びにＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼを利用する第２の切断反応を、標的ＤＮＡ配列を切断することを伴わない条件で含むことは、当業者によって理解され得る。
いくつかの実装形態では、標的ＤＮＡ配列を作製するための方法は、消化反応の上記ステップに後に、任意選択的な標的ＤＮＡ配列回収ステップをさらに含んでもよい。回収ステップは、以下：消化ステップにおける産物を、フェノール・クロロホルム抽出及びＤＮＡ吸着遠心カラム（ＤＮＡ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｃｏｌｕｍｎ）、イソプロパノール／エタノール沈殿によって回収する、又は反応系におけるプロテアーゼ及び塩を、高性能液体クロマトグラフィーによって支持される分子ふるいクロマトグラフィーによって除去する、といったいずれか１つ又はいずれかの組み合わせを通じて実施されてもよい。得られた標的ＤＮＡ配列が哺乳動物細胞又は動物実験に使用されるとき、内毒素除去及び／又は無菌濾過処理がさらに実施されてもよい。
消化反応の産物は、閉鎖線形二本鎖ＤＮＡである。いくつかの実装形態では、本願に従う標的ＤＮＡ配列を作製するための方法によって作製される標的ＤＮＡ配列は、閉鎖線形二本鎖ＤＮＡである。
本願に従う標的ＤＮＡ配列を作製するための方法は、精製ステップを全く伴わない場合に、標的ＤＮＡ配列の高純度（例えば、産物純度が１００％である）作製を実現し得る。いくつかの実装形態では、標的ＤＮＡ配列を作製するための方法は、標的ＤＮＡ配列を精製するステップを全く含まない、例えば、消化反応後に標的ＤＮＡ配列を精製するステップを含まない、第２の切断反応後に産物のＤＮＡ配列を精製するステップを含まない、及び／又は第１の切断反応後に産物のＤＮＡ配列を精製するステップを含まない。いくつかの実装形態では、本願に従う標的ＤＮＡ配列を作製するための方法によって作製される標的ＤＮＡ配列の純度は、９５％超、９８％超、９９％超である、又は１００％である。
本願に従う標的ＤＮＡ配列を作製するための方法により、標的ＤＮＡ配列を大規模に作製することができる。いくつかの実装形態では、導入されたＤＮＡ構築物を有する宿主細胞の発酵培養系は、最大で１Ｌ又はそれ以上、例えば、５Ｌ若しくは１０Ｌ又はそれ以上であってもよい。いくつかの実装形態では、増幅されたＤＮＡ構築物の抽出については、増幅されたＤＮＡ構築物を、１Ｌ若しくはそれ以上、５Ｌ若しくはそれ以上又は１０Ｌ若しくはそれ以上である発酵培養系から抽出することであってもよい。いくつかの実装形態では、作製された標的ＤＮＡ配列は、最大で１ｍｇ若しくはそれ以上、５ｍｇ若しくはそれ以上、又は１０ｍｇ若しくはそれ以上である。
５．いくつかの他の実装形態
いくつかの実装形態では、本願のＤＮＡ構築物は、標的ＤＮＡ配列とプロテロメラーゼ認識配列との間にさらなる制限エンドヌクレアーゼ認識配列をさらに含み、本願に従う標的ＤＮＡ配列を作製するための方法は、消化反応のステップ（即ち、「第２の切断反応混合物を１つ以上のエキソヌクレアーゼと接触させることを可能にすることで、標的ＤＮＡ配列以外の他の配列を消化する」ステップ）後、制限エンドヌクレアーゼを消化反応産物（即ち、閉鎖線形二本鎖ＤＮＡ）と接触させることを可能にすることで、さらなる制限エンドヌクレアーゼ認識配列を認識及び切断し、それにより、閉鎖線形二本鎖ＤＮＡの２つの末端を除去することで、２つの閉鎖していない末端を有する（平滑末端又は付着末端を有する）二本鎖標的ＤＮＡ断片を調製するステップをさらに含む。
いくつかの実装形態では、本願のＤＮＡ構築物は、標的ＤＮＡ配列とプロテロメラーゼ認識配列との間にさらなるニッキング酵素認識配列をさらに含有し、本願に従う標的ＤＮＡ配列を作製するための方法は、消化反応のステップ（即ち、「第２の切断反応混合物を１つ以上のエキソヌクレアーゼと接触させることを可能にすることで、標的ＤＮＡ配列以外の他の配列を消化する」ステップ）後、ニッキング酵素を消化反応産物（即ち、閉鎖線形二本鎖ＤＮＡ）と接触させることを可能にすることで、さらなるニッキング酵素認識配列を認識及び切断し、それにより、二本鎖ＤＮＡの陽性センス鎖及びアンチセンス鎖内の１本の鎖を除去することで、２つの末端が共有結合閉鎖構造であり、局所が二本鎖ＤＮＡであり、且つ中間の標的断片領域が一本鎖ＤＮＡである、ＤＮＡ配列を形成するステップをさらに含む。
本明細書で用いられる「ニッキング酵素」という用語は、限定はされないが、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｓｓＳＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ及びＮｔ．ＣｖｉＰＩを含む。ニッキング酵素を調製し、使用するための方法は、従来法であり、多数のニッキング酵素が商業的に入手される（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）。「ニッキング酵素認識配列」は、対応するニッキング酵素によって認識され、切断され得る配列であり、特異的な使用されるニッキング酵素に応じて決定され、当該技術分野で公知である。
本願に従う標的ＤＮＡ配列を作製するための方法によって作製される標的ＤＮＡ配列は、化学的又は物理的送達法を通じて細胞又は動物身体に移入され、外因性遺伝子の一過性発現を実施する、又は外因性ＤＮＡ配列をゲノムに組み込むことができる。
いくつかの実装形態では、本願に従う標的ＤＮＡ配列を作製するための方法によって作製される標的ＤＮＡ配列は、タンパク質の発現に使用されるようにタンパク質コード配列を含んでもよい。例えば、標的ＤＮＡ配列は、プロモーター、標的遺伝子及びポリ（Ａ）テールを含む。
したがって、本願は、標的タンパク質を発現するための方法をさらに提供する。該方法は、
本願に従う標的ＤＮＡ配列を作製するための方法であって、標的ＤＮＡ配列が標的タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む、方法を実行することと；
得られた標的ＤＮＡ配列を原核細胞又は真核細胞に導入することと；
原核細胞又は真核細胞をタンパク質発現に適した条件下でインキュベートすることと、
を含む。
いくつかの実装形態では、本願に従う標的ＤＮＡ配列を作製するための方法によって作製される標的ＤＮＡ配列は、標的ゲノムの遺伝子再構築、例えば、ＣＲＩＳＰＲに基づく遺伝子再構築のために使用することができる。
したがって、本願は、標的ＤＮＡ配列を標的ゲノムの標的組み込み部位に組み込むための方法をさらに提供する。該方法は、
本願に従う標的ＤＮＡ配列を作製するための方法であって、標的ＤＮＡ配列が標的組み込み部位の２つの末端での相同性アーム配列及び中間の標的ノックイン断片を含む、方法を実行することと；
得られた標的ＤＮＡ配列、Ｃａｓ９タンパク質及び標的ＤＮＡ配列に基づいて設計されたｓｇＲＮＡを一緒に原核細胞又は真核細胞に導入することと；
原核細胞又は真核細胞をインキュベートすることで、標的ＤＮＡ配列を標的ゲノムに組み込むことと、
を含む。
最適なｓｇＲＮＡ配列は、既存のｓｇＲＮＡ設計ウェブサイト、例えば：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｇＲＮＡ－ｄｅｓｉｇｎ－ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌを通じて、標的ＤＮＡ配列に基づいて設計される。
標的組み込み部位の２つの末端での相同性アーム配列は、標的組み込み遺伝子部位の２つの末端での、約３００ｂｐ、約３１０ｂｐ、約３２０ｂｐ、約３３０ｂｐ及び約３５０ｂｐの配列であってもよい。例えば、標的組み込み遺伝子は、ＴＲＡＣ遺伝子又はＲＡＢ１１ａ遺伝子であり、標的組み込み部位の２つの末端での相同性アーム配列は、ＴＲＡＣ遺伝子又はＲＡＢ１１ａ遺伝子の左末端及び右末端での約３００ｂｐの配列である。
標的ＤＮＡ配列を本願に従う標的ゲノムの標的組み込み部位に組み込むための方法により、標的ゲノム内の組み込まれた標的ＤＮＡ配列の、例えば、７日又はそれ以上にわたって安定に発現される、安定な連続的発現を実現することができる。
キット
本願は、標的ＤＮＡ配列を作製するためのキットであって、本願に従う標的ＤＮＡ配列を作製するための方法を実行するように構成される、キットをさらに提供する。キットは、クローニングベクター、プロテロメラーゼ、１つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼ、並びに１つ以上のエキソヌクレアーゼを含む。キットは、本願に従う方法を記録している操作説明書をさらに含んでもよい。
本願によって提供される標的ＤＮＡ配列を作製するための方法は、標的ＤＮＡ配列を産業的に大規模生産することに適する。いくつかの実装形態では、標的ＤＮＡ配列を作製するための方法は、１Ｌ若しくはそれ以上、５Ｌ若しくはそれ以上、１０Ｌ若しくはそれ以上又は２０Ｌ若しくはそれ以上の発酵タンク内で実施される。
本願に従う方法は、以下の有益な効果：
Ｉ．本願に従う方法は、任意の配列について単純で一般的であり、各配列に特化して設計する必要がなく、全ての配列のいずれであっても異なる調製技術を用いる必要がない
ＩＩ．本願に従う方法の決定的な原料が大規模に抽出されたプラスミドであり、各ステップにおける酵素消化反応がサーモスタット的に実施されることから、規模拡大が容易である
ＩＩＩ．本願に従う方法のために選択される酵素は、反応条件についての非常に高い互換性を有し、次のステップにおける酵素消化反応系が、酵素消化反応の各ステップ後の酵素消化産物を精製することなく調製される一方で、酵素消化系は、酵素消化の第１ステップにおいて確立され得る。後の酵素消化反応の各ステップに関して、以前のステップにおいて反応した酵素のみが不活性化される必要があり、次に新たな酵素が反応のための反応系に添加される
ＩＶ．本願に従う方法は、電気泳動又は高性能液体クロマトグラフィーに基づくＤＮＡ断片分離に応じてストライプ状のＤＮＡ選別を全く行うことなく、大量の高純度標的ＤＮＡ配列を調製することが可能であり、また、遺伝子編集の鋳型を経済的且つ効率的に調製し、大規模にコンプライアンスモードで正確な編集を行うのに非常に適する
Ｖ．本願に従う方法は、特に、標的ＤＮＡ配列を産業的に大規模生産するように構成されるとき、品質管理を実現するのが容易であり、ＧＭＰ生産に適する
を実現する。
本発明は、以下の図面を参照して、より詳細に説明される。
本願の一実施形態における、一般的な構築物の機能エレメント及び制限エンドヌクレアーゼの酵素消化部位レイアウトを示す。 本願の１つの実装形態の標的ＤＮＡ配列の作製フローを示す。 本願の一実施形態における、アガロースゲル電気泳動を通じて二本鎖ＤＮＡの中間産物及び最終産物を検出した結果を示す。レーンＭは、３０００ｂｐの二本鎖ＤＮＡマーカーであり、レーン１は、ＴｅｌＮ酵素消化を受けた精製された調製ベクターの産物であり、レーン２は、Ｉ－ｓｃｅＩ酵素消化を受けたレーン１産物の産物であり、そしてレーン３は、λエキソヌクレアーゼによって消化されたレーン２産物の産物である。 本願の一実施形態における、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００を通じての最終産物の標的配列１の純度検証を示す。 本願の一実施形態における、アガロースゲル電気泳動を通じて二本鎖ＤＮＡの中間産物及び最終産物を検出した結果を示す。レーンＭは、３０００ｂｐの二本鎖ＤＮＡマーカーであり、レーン１は、ＴｅｌＮ酵素消化を受けた精製された調製ベクターの産物であり、レーン２は、ＢｓｐＱＩ酵素消化を受けたレーン１産物の産物であり、そしてレーン３は、λエキソヌクレアーゼによって消化されたレーン２産物の産物である。 本願の一実施形態における、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００を通じての最終産物の標的配列２の純度検証を示す。 本願の一実施形態における、本願の方法に従って調製された標的配列２のエレクトロポレーション後の細胞生存率の検出を示す。 本願の一実施形態における、本願の方法に従って調製された標的配列２のエレクトロポレーション後４８時間の細胞の緑色蛍光タンパク質発現の検出を示す。 本願の一実施形態における、本願の方法に従って調製された標的配列２のエレクトロポレーション後の細胞生存率の検出を示す。 本願の一実施形態における、本願の方法に従って調製された標的配列２のエレクトロポレーション後７日の細胞の緑色蛍光タンパク質発現の検出を示す。
特に指定されない限り、本発明で使用される科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されている意味を有する。
本開示における技術的解決は、添付の図面及び実施形態を参照して、さらに詳述される。特に指定されない限り、下記の実施例における方法及び材料は、市販されている従来製品である。本開示が属する当業者は、下記の方法及び材料があくまで例示的であり、本開示の範囲を限定するものとみなされるべきでないことを理解するであろう。
実施例１：一般的な構築物の設計及び構築
ｐＵＣ５７カナマイシン耐性ベクターを、再構築ベクターとして選択する。図１に示す通り、ＢｓｐＱＩ酵素消化認識部位が最初に７１４位塩基に限って存在することに基づき、２つのＢｓｐＱＩ酵素消化認識部位（配列：ＧＣＴＣＴＴＣ）を、機能エレメント間の１５５４位塩基及び２５３９位塩基の後にそれぞれ付加する。最初に存在しない２つのメガヌクレアーゼＩ－ｓｃｅＩ酵素消化認識配列（配列：ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ）を１５０１位Ａ塩基及び２４７９位Ａ塩基の後にノックインする。さらに、１３９７位塩基で、点突然変異を通じてＧをＣに改変することで、コドンの同義突然変異を実現し、このようにして、１つのＢｓｐＱＩ酵素消化認識部位を、ｏｒｉの機能における変化が生じないことを確認する状況下で、そのコード遺伝子上に付加する。同様に、同義突然変異（ＡＴからＧＣ）を通じて、２１３６位及び２１３７位で塩基ＡＴがＧＣに突然変異され、１つのＢｓｐＱＩ酵素消化認識部位を、カナマイシン耐性遺伝子のコード遺伝子に付加する。上記の配列挿入及び点突然変異はいずれも、Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．を通じた、ｐＵＣ５７－ＫａｎＲプラスミドベクター（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．、配列情報は：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｖｅｃｔｏｒ－ｄａｔａｂａｓｅ／６２５８／、配列番号１２を参照されたい）に基づく部位特異的突然変異サービスに従い、図１に示すような一般的な調製構築物が得られる。一般的な構築物の機能エレメントは、左から右へ、ｌａｃプロモーター、ｌａｃ作動遺伝子、及び複数のクローニング部位（ＭＳＣ）を含むβガラクトシダーゼをコードする遺伝子ｌａｃＺα；プラスミド複製起点部位配列ｏｒｉ、カナマイシン耐性遺伝子ＫａｎＲ、並びに付加されたＢｓｐＱＩ認識配列ＧＣＴＣＴＴＣ及びＩ－ｓｃｅＩ酵素消化認識配列ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴを含む、ｐＵＣ５７－ＫａｎＲベクターのブルーホワイトスポットスクリーニングのための既存のラクトースオペロン配列を含む。一般的な構築物の設計された配列は、配列番号１に示す通りである。
実施例２：ＧＦＰ遺伝子をＲＡＢ１１ａ遺伝子にノックインするように構成された標的配列１
２．１ 標的配列１の設計
ＧＦＰ配列部位の２つの末端でのノックイン配列は、ヒトゲノムＲＡＢ１１ａ（Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－１１Ａ）遺伝子ノックイン部位の左側及び右側それぞれの、配列番号４及び配列番号５でそれぞれ示される、３００ｂｐの（ＲＡＢ１１ａ相同性アーム配列としての）配列から選択する。設計された標的配列１の元の配列（１３５６ｂｐの安定な二本鎖ＤＮＡ）は、配列番号３に示す通りであり、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ファージＮ１５に由来するプロテロメラーゼＴｅｌＮ認識配列ＴＡＴＣＡＧＣＡＣＡＣＡＡＴＴＧＣＣＣＡＴＴＡＴＡＣＧＣＧＣＧＴＡＴＡＡＴＧＧＡＣＴＡＴＴＧＴＧＴＧＣＴＧＡＴＡ（配列番号２）を、標的ＤＮＡ配列１の２つの末端に付加する。２つの末端にプロテロメラーゼＴｅｌＮ酵素認識配列を付加した後の標的配列１の配列は、配列番号６に示す通りである。設計された末端配列は、Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ．ｃｎ／ｇｅｎｅ＿ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ｈｔｍｌ）によって完全配列の遺伝子合成を施す。
２．２ ＤＮＡ構築物の調製及び大規模プラスミドの調製
ステップ２．１で合成された、２つの末端にＴｅｌＮ酵素認識配列を付加した標的配列１（配列番号６）を、Ｔ４リガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、製品カタログ番号：ＥＬ００１１）による、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｒ３１９５Ｌ）を通じての単一の酵素消化の線状化を受けた一般的なベクターｐＵＣ５７－Ｋａｎ－Ｖ６（実施形態１で調製した一般的なベクター）の酵素消化部位にフラットに結合する。結合産物を、エレクトロポレーション法を通じて大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）コンピテント細胞に変換し、形質転換された大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）を、カナマイシンを有するＬＢプレート培地上にコーティングし、３７℃の温度に置き、一晩培養する。翌日、１０の単一コロニーを採取し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する３ｍＬのＬＢ液体培地上で液体培養を行い、プラスミド抽出を行う。各プラスミドを、サンガー配列決定手段を通じて同定し、配列が全体的に正確であるプラスミドを決定する。プラスミド抽出及び配列決定は、Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ．ｃｎ／ｃｕｓｔｏｍ－ｐｌａｓｍｉｄ－ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）によって完了する。正確な配列を有するプラスミドを含有する採取した大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）株を画線し、保存する。保存した大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）株を接種してシード溶液を調製し（ＯＤ値が約０．８）、次にシード溶液を１Ｌの大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）培養系に１％接種することで、１０Ｌの大規模プラスミド抽出を実施する。
２．３ 標的配列１を含む安定な二本鎖ＤＮＡの調製
大規模抽出を受けた調製プラスミドベクターに、３ステップ恒温酵素消化反応を施すことで、標的配列１を含む線状閉鎖二本鎖ＤＮＡを得る。ステップＩ、０．８ｍｇの調製した環状ベクターを、２つの末端が閉鎖されていて、それぞれが標的配列１及びベクター骨格を含む２つの二本鎖ＤＮＡ線状断片に、ＴｅｌＮ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０６５１Ｓ、５Ｕ／μＬの酵素１μＬを３００ｆｍｏｌずつのＴｅｌＮ認識部位に添加する）によって切断し、３０℃で１時間にわたってインキュベーションを実施し、次に７５℃で１０分間にわたって加熱を施すことで、ＴｅｌＮ酵素を不活性化する。反応が完了した後、反応が完全に実施されているか又は否か、即ち、調製ベクターが超らせん状環状プラスミドから２つの線状化二本鎖ＤＮＡに完全に改変されているかを、アガロース電気泳動法によって検出するが、ストライプ位置は、それぞれ標的断片及び調製ベクターの骨格サイズ（約２．６ｋｂ）である必要がある。ステップＩＩ、標的配列１は、ＢｓｐＱＩ認識配列ＧＣＴＣＴＴＣを含み、Ｉ－ｓｃｅＩ酵素認識配列を含まない標的配列１を有するＩ－ｓｃｅＩ酵素を採用し、標的配列１を、変化しない状態で作製する一方、ベクターの骨格配列を、Ｉ－ｓｃｅＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｒ０６９４Ｌ）によって、二本鎖を含む複数の壊れたＤＮＡ断片に切断することになる。反応条件は、反応が３７℃で１時間実施され、次に不活性化が実施される場合である。反応が完了した後、反応が完全に実施されているか又は否かを、アガロース電気泳動法によって検出する。ステップＩＩＩ、断片化されたベクターの骨格ＤＮＡ断片を、ＤＮＡエキソヌクレアーゼによって完全に消化する。ステップＩＩにおける反応後、エキソヌクレアーゼ、即ち、λエキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２６２Ｌ）又はＴ５エキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０６６３Ｌ）を、反応系に添加し、３７℃で２時間反応させ、次に熱失活を施す。具体的な反応条件については、以下の表１～表３を参照されたい。反応後、標的産物の純度を、アガロースゲル電気泳動によって検出するが、産物は、ストライプ状の標的のみを有する単一産物である（図３を参照）。最終産物、即ち、安定な二本鎖標的配列１に対し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００を通じて純度検証を行う。１００％の純度を有し、標的断片のみを含むＤＮＡ純粋産物（図４を参照）は、さらなるＤＮＡ分子断片の選別又は精製ステップを全く行わない条件で、得ることができる。
図３に示す通り、レーンＭは、３０００ｂｐの二本鎖ＤＮＡマーカーである。レーン１は、ＴｅｌＮ酵素消化を受けた精製された調製ベクターの産物であり、ここで産物は、１ｋｂのストライプ状の標的二本鎖ＤＮＡ及び２ｋｂのベクター骨格二本鎖ＤＮＡを含む。レーン２は、レーン１産物がＩ－ｓｃｅＩ酵素消化を受けた後の産物であり、ここで産物は、２つの断片に切断された１ｋｂのストライプ状の標的二本鎖ＤＮＡ及びベクター骨格二本鎖ＤＮＡを含む。レーン３は、レーン２産物がラムダＥｘｏエキソヌクレアーゼによって消化された後の産物であり、最終産物は、１ｋｂのストライプ状の標的二本鎖ＤＮＡのみを有する。
図４に示す通り、最終産物は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒキャピラリー電気泳動及びＤＮＡ１２０００検出チップを通じて純度検出を受ける。５０ｂｐのピーク及び１７，０００ｂｐのピークは、チップ検出の内部参照ピークであり、標的配列の材料ピークは、全検出範囲内に限って存在し、純度は１００％である。
２．４ 標的配列１を含む安定な二本鎖ＤＮＡの最終精製
上記の反応産物は、フェノール・クロロホルム抽出（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、製品カタログ番号：１５５９３０３１）、及び特殊な材料で作られたＤＮＡ吸着遠心カラム（ＱＩＡＧＥＮ－ｔｉｐ １００、Ｑｉａｇｅｎ、製品カタログ番号：１００４３）によって回収してもよく、次に標的配列のみを含むＤＮＡ分子を、イソプロパノール（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、シリアル番号８０１０９２１８）／エタノール（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、シリアル番号１０００９２５７）沈殿によって回収する。実施形態で採用されたイソプロパノール／エタノール沈殿方法は、次の具体的ステップを含む：１）０．７倍体積の正常温度のイソプロパノールを加え（例えば、０．７ｍｌのイソプロパノールを１ｍｌの濃縮予定の安定な二本鎖ＤＮＡに加え）、均一に混合し、次に遠心分離を、１２，０００～１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間実施し、上清を慎重に吸収することで、沈殿物の接触を回避する；２）１ｍｌの正常な温度の７０％エタノール溶液を添加し、プラスミド沈殿物を緩やかに懸濁して十分な洗浄を行い、遠心分離を、１２，０００～１４，０００ｒｐｍ、４℃で５～１０分間実施し、上清を慎重に吸収することで、沈殿物の接触を回避する；３）遠心分離を、５，０００～１０，０００ｒｐｍ、４℃で５～１０秒間実施し、残留液体を、２０μＬ又は２００μＬのピペッターによって完全且つ慎重に吸収することで、沈殿物の接触を回避する；及び４）透明な液体（乾燥は、一般に液体が完全に吸収された後の１分以内に終了し得る）が裸眼で認められなかった後、適切な体積を有する溶液（例えば、溶液Ｖ、１０ｍＭのトリス－Ｃｌ ｐＨ８．５又はミリＱレベルの純水）を添加し、ＤＮＡを溶解させる。
標的配列を含む０．８ｍｇの精製された調製ベクターを実施形態で採用し、ここで標的配列の長さは、調製ベクター全体の３５％を占める、即ち、理論上の安定な二本鎖ＤＮＡ産物は、０．２８ｍｇである必要がある。イソプロパノール沈殿及び精製後、得られた純粋産物の標的配列のみを含む安定な二本鎖ＤＮＡは、Ｏ．Ｄ．２６０紫外線吸収測定（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｏｎｅ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によると０．１８ｍｇであり、生産性は、６４．７３％である。反応系を増幅することにより、標的配列を含む４．５ｍｇの精製された調製ベクターが同時に得られることで、１ｍｇの最終産物が同時に得られることを保証する。１ｍｇ以上のプラスミドを、高性能液体クロマトグラフィー（ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００，Ｃｙｔｉｖａ）によって支持された分子ふるいクロマトグラフィー（クロマトグラフィーカラム充填剤：セファロース６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，Ｃｙｔｉｖａ）を通じて精製することで、反応系におけるプロテアーゼ及び塩を除去する。
実施例３：ＣＭＶプロモーターを有するＧＦＰの遺伝子編集鋳型をＴＲＡＣ遺伝子にノックインするように構成された標的配列２
３．１ 標的配列２の設計
ＣＭＶプロモーターを有する、ＧＦＰ配列部位の２つの末端でのノックイン配列は、ヒトゲノムＴＲＡＣ（Ｔ細胞受容体α鎖コード遺伝子）遺伝子ノックイン部位の左側及び右側それぞれの、配列番号７及び配列番号８でそれぞれ示される、３００ｂｐの（ＴＲＡＣの左及び右の相同性アーム配列としての）配列から選択する。標的配列２の元の配列（１８８５ｂｐの安定な二本鎖ＤＮＡ）は、配列番号９に示す通りであり、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ファージＮ１５由来のプロテロメラーゼＴｅｌＮ認識配列ＴＡＴＣＡＧＣＡＣＡＣＡＡＴＴＧＣＣＣＡＴＴＡＴＡＣＧＣＧＣＧＴＡＴＡＡＴＧＧＡＣＴＡＴＴＧＴＧＴＧＣＴＧＡＴＡ（配列番号２）を、標的ＤＮＡ配列２の２つの末端に付加する。２つの末端の後の標的配列２の配列に、配列番号１０で示すようなプロテロメラーゼＴｅｌＮ酵素認識配列を付加する。設計された末端配列は、Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ．ｃｎ／ｇｅｎｅ＿ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ｈｔｍｌ）によって完全配列の遺伝子合成を受ける。
３．２ ＤＮＡ構築物の調製及び大規模プラスミドの調製
実施形態２と同様、ＴｅｌＮ酵素認識配列を付加した２つの末端を有する、３．１において合成された標的配列２を、Ｔ４リガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、製品カタログ番号：ＥＬ００１１）による制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｒ３１９５Ｌ）を通じた単一の酵素消化・線状化を受けた、ｐＵＣ５７－Ｋａｎ－Ｖ６（実施形態１で調製された一般的なベクター）にフラットに結合する。結合産物を、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）コンピテント細胞に変換し、形質転換された大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）を、ＬＢプレート培地上でカナマイシンでコーティングし、３７℃の温度下に置いて、一晩培養する。翌日、１０の単一コロニーを採取し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ液体培地３ｍＬ上で液体培養を行い、プラスミド抽出を行う。プラスミド抽出は、Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ．ｃｎ／ｃｕｓｔｏｍ－ｐｌａｓｍｉｄ－ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）によって完了する。各プラスミドを、配列決定手段を通じて同定し、配列が全体的に正確であるプラスミドを決定する。正確な配列を有するプラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）株を画線し、保存する。シード溶液を調製し、シード溶液を１Ｌの大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）培養系に接種することによって、１０Ｌの大規模プラスミド抽出を実施する。
３．３ 標的配列２を含む安定な二本鎖ＤＮＡの調製
実施形態２．３における操作ステップと同様、大規模抽出を受けた調製プラスミドベクターに３ステップ恒温酵素消化反応を施すことで、標的配列を含む閉鎖二本鎖ＤＮＡを得る。ステップＩ、実施形態３．２で得られた環状の調製ベクターを、２つの末端が閉鎖されていて、それぞれが標的配列２及びベクター骨格を含む２つの二本鎖ＤＮＡ線状断片に、ＴｅｌＮ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０６５１Ｓ、５Ｕ／μＬの酵素１μＬを３００ｆｍｏｌずつのＴｅｌＮ認識部位に添加する）によって切断するが、具体的な反応条件については、表４を参照されたい。反応が完了した後、反応が完全に実施されているか又は否かを、アガロース電気泳動法によって検出する。ステップＩＩ、標的配列２は、実施形態Ｉで使用したＩ－ｓｃｅＩによる酵素消化を施してもよい。しかし、標的配列は、ＢｓｐＱＩ認識配列を含まず、酵素消化のため、一般的なベクター上により多くの酵素消化部位を有するＢｓｐＱＩを採用してもよく、標的断片は、変化しない状態で作製する一方で、ベクター骨格配列を、二本鎖を含む複数の壊れたＤＮＡ断片に切断することになるが、具体的な反応条件については、表５を参照されたい。反応が完了した後、反応が完全に実施されているか又は否かを、アガロース電気泳動法によって検出する。ステップＩＩＩ、断片化されたベクター骨格ＤＮＡ断片を、ＤＮＡエキソヌクレアーゼによって完全に消化する。ステップＩＩにおける反応後、λエキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２６２Ｌ）又はＴ５エキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０６６３Ｌ）を、反応系に添加し、３７℃で２時間反応させ、次に熱失活を施す。具体的な反応条件については、表６を参照されたい。標的産物の純度を、アガロースゲル電気泳動によって検出するが、産物は、ストライプ状の標的のみを有する単一産物である（図５を参照）。最終産物、即ち、安定な二本鎖標的配列２に対し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００を通じて純度検証を行う。図６に示す通り、５０ｂｐのピーク及び１７，０００ｂｐのピークは、チップ検出の内部参照ピークであり、標的配列の材料ピークは、全検出範囲内に限って存在し、純度は１００％である。１００％の純度を有し、標的断片のみを含むＤＮＡ純粋産物は、さらなるＤＮＡ分子断片の選別又は精製ステップを全く行わない条件で、得ることができる。
図５に示す通り、レーンＭは、３０００ｂｐの二本鎖ＤＮＡマーカーである。レーン１は、ＴｅｌＮ酵素消化を受けた精製された調製ベクターの産物であり、ここで産物は、１．８ｋｂのストライプ状の標的二本鎖ＤＮＡ及び２ｋｂのベクター骨格二本鎖ＤＮＡを含む。レーン２は、レーン１産物がＢｓｐＱＩ酵素消化を受けた後の産物であり、ここで産物は、５つの断片に切断された１．８ｋｂのストライプ状の標的二本鎖ＤＮＡ及びベクター骨格二本鎖ＤＮＡを含む。レーン３は、レーン２産物がλエキソヌクレアーゼによって消化された後の産物であり、最終産物は、１．８ｋｂのストライプ状の標的二本鎖ＤＮＡのみを有する。
図６に示す通り、最終産物は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒキャピラリー電気泳動及びＤＮＡ１２０００検出チップを通じて純度検出を受ける。５０ｂｐのピーク及び１７，０００ｂｐのピークは、チップ検出の内部参照ピークであり、標的配列の材料ピークは、全検出範囲内に限って存在し、純度は１００％である。
３．４ 標的配列２を含む安定な二本鎖ＤＮＡの最終精製
上記の反応産物は、フェノール・クロロホルム抽出（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、製品カタログ番号：１５５９３０３１）、及び特殊な材料で作られたＤＮＡ吸着遠心カラム（ＱＩＡＧＥＮ－ｔｉｐ １００，Ｑｉａｇｅｎ、製品カタログ番号：１００４３）によって回収してもよく、次にイソプロパノール（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、シリアル番号８０１０９２１８）／エタノール（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、シリアル番号１０００９２５７）沈殿を実施する。実施形態で採用されたイソプロパノール／エタノール沈殿方法は、次の具体的ステップを含む：１）０．７倍体積の正常温度のイソプロパノールを加え（例えば、０．７ｍｌのイソプロパノールを１ｍｌの濃縮予定の安定な二本鎖ＤＮＡに加え）、均一に混合し、次に遠心分離を、１２，０００～１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間実施し、上清を慎重に吸収することで、沈殿物の接触を回避する；２）１ｍｌの正常な温度の７０％エタノール溶液を添加し、プラスミド沈殿物を緩やかに懸濁して十分な洗浄を行い、遠心分離を、１２，０００～１４，０００ｒｐｍ、４℃で５～１０分間実施し、上清を慎重に吸収することで、沈殿物の接触を回避する；３）遠心分離を、５，０００～１０，０００ｒｐｍ、４℃で５～１０秒間実施し、残留液体を、２０μＬ又は２００μＬのピペッターによって完全且つ慎重に吸収することで、沈殿物の接触を回避する；及び４）透明な液体（乾燥は、一般に液体が完全に吸収された後の１分以内に終了し得る）が裸眼で認められなかった後、適切な体積を有する溶液（例えば、溶液Ｖ、１０ｍＭのトリス－Ｃｌ ｐＨ８．５又はミリＱレベルの純水）を添加し、ＤＮＡを溶解させる。
標的配列を含む１．２ｍｇの精製された調製ベクターを実施形態で採用し、ここで標的配列の長さは、調製ベクター全体の４２．５％を占める、即ち、理論上の安定な二本鎖ＤＮＡ産物は、０．５１ｍｇである必要がある。イソプロパノール調製及び精製後、得られた純粋産物の標的配列のみを含む安定な二本鎖ＤＮＡは、Ｏ．Ｄ．２６０紫外線吸収測定（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｏｎｅ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によると０．２６ｍｇであり、生産性は、５０．９８％である。反応系を増幅することにより、標的配列を含む４．６２ｍｇの精製された調製ベクターが同時に得られることで、１ｍｇの最終産物が同時に得られることを保証する。１ｍｇ以上のプラスミドを、高性能液体クロマトグラフィー（ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００，Ｃｙｔｉｖａ）によって支持された分子ふるいクロマトグラフィー（クロマトグラフィーカラム充填剤：セファロース６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，Ｃｙｔｉｖａ）を通じて精製することで、反応系におけるプロテアーゼ及び塩を除去する。
実施例４：緑色蛍光タンパク質の発現のための実施例３で調製された標的配列２のＨＥＫ２９３Ｔ細胞株へのエレクトロポレーション
４．１ ＨＥＫ２９３Ｔ哺乳動物細胞株の培養及び調製：培地（ＤＭＥＭ低グルコース、Ｇｉｂｃｏ（商標）、カタログ番号：１１８８５０８４）を、４℃の冷蔵庫から取り出し、室温の超クリーンベンチに配置する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－３２１６（商標））凍結チューブを、手で保持し、３７℃で振盪させ、解凍する。１ｍＬの細胞凍結培地を５ｍＬの培地に添加し、ＤＭＳＯを除去し、遠心分離を実施し、次に上清を廃棄する。５ｍＬの新しい培地を添加し、培養を６ｃｍのプレート内で実施し、１×１０＾６細胞／ボトルを１０ｃｍの培養皿に添加し、４８時間培養する。
４．２ ＤＮＡのＨＥＫ２９３Ｔ細胞株へのエレクトロポレーション
１．細胞計数が１．９６×１０＾６／ｍＬであり、全体が５ｍＬである。
２．１０μＬのエレクトロポレーション液体＋緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする１μｇ／μＬの標的配列２又は実施形態３．２で抽出された２μＬのプラスミドサンプル
３．ステップ１で得られた１ｍＬの細胞を取得し、低速で遠心分離し、上清を廃棄し、次に１０μＬのエレクトロポレーション液体を添加し、再懸濁する。
４．ステップ２における標的配列２又はプラスミドサンプル及びステップ３における細胞を、室温で１０分間インキュベートする。
５．ステップ４においてインキュベートしたサンプル及び細胞を均一に混合し、次に室温で１０分間インキュベートする。
６．Ｃｅｌｅｔｒｉｘ ＣＴＸ－１５００ ＬＥエレクトロポレーターを、４２０Ｖの電位でのエレクトロポレーションに採用し、３つの群の各サンプルについて試験する。
７．細胞を培養皿で培養する。
８．細胞を４８時間培養した後、生細胞の割合及び緑色蛍光タンパク質の発現を伴う細胞集団の割合を観察するため、フローサイトメーター（ＣｙｔｏＦＬＥＸ，ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）を使用する。
４．３ 試験結果
図７に示す通り、生存率検出について、正常形態を有する細胞集団を、フローサイトメーターを通じて選択することによって計数及び決定し、２μｇの安定な二本鎖ＤＮＡ標的配列２のエレクトロポレーションによる細胞サンプルにおける生存率は、２μｇのプラスミドのエレクトロポレーションの場合及びＤＮＡのエレクトロポレーションを全く伴わないブランク対照群の場合に近い。
図８に示す通り、緑色蛍光タンパク質の発現レベル検出では、フローサイトメーターを通じて同定された生細胞集団内での緑色蛍光タンパク質陽性で発現された細胞を選択し、百分率を計数する。２μｇの安定な二本鎖ＤＮＡのエレクトロポレーションによる細胞サンプルにおけるＧＦＰ発現率平均値は１８．２１％であり、２μｇのプラスミドのエレクトロポレーションにおけるＧＦＰ発現率平均値は３５．７０％である一方で、ＤＮＡのエレクトロポレーションを全く伴わないブランク対照群におけるＧＦＰ発現率平均値は０．３６％である。それは、導入された安定な二本鎖ＤＮＡが細胞内で発現され得ることを示す。２μｇのプラスミドのエレクトロポレーションによるＨＥＫ２９３細胞のＧＦＰ発現率は、２μｇの安定な二本鎖ＤＮＡのエレクトロポレーションによる同細胞の場合の２倍であるが、プラスミドが細胞質に侵入し、一過性トランスフェクション発現を受けることがその超らせん構造故により容易であることから、これはあり得る。
実施例５：ＧＦＰ発現遺伝子のゲノム固定点ノックインのための実施例３で調製された標的配列２及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＲＮＰ化合物の双方のＨＥＫ２９３Ｔ細胞株へのエレクトロポレーション
５．１ ＨＥＫ２９３Ｔ哺乳動物細胞株の培養及び調製：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、実施形態４．１の場合と同じ方法を通じて再生する。
５．２ ＤＮＡのＨＥＫ２９３Ｔ細胞株へのエレクトロポレーション
１．細胞計数が１．９６×１０＾６／ｍＬであり、全体が５ｍＬである。
２．１０μＬのエレクトロポレーション液体＋緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする１μｇ／μＬの安定な二本鎖ＤＮＡ標的配列２又は実施形態３．２で抽出された２μＬのプラスミドサンプル；及び０．５μＬの５０ピコモルのＣａｓ９タンパク質（ＧｅｎＣｒｉｓｐｒ Ｃａｓ９－Ｎ－ＮＬＳヌクレアーゼ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｚ０３３８８）＋１μＬの２００ピコモルのｓｇＲＮＡ（標的ＤＮＡ配列に基づいて設計ウェブサイトｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｇＲＮＡ－ｄｅｓｉｇｎ－ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌにおいて設計された後の配列：ＡＧＡＧＵＣＵＣＵＣＡＧＣＵＧＧＵＡＣＡｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａＧＡＡＡｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｕｕｕの配列番号１１であって、Ｎａｎｊｉｎｇ Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成される）（遺伝子ノックイン実験群）を加え、室温で１０分間インキュベートするが、Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡを添加しない場合をブランク対照群とする。
３．ステップ１で得られた１ｍＬの細胞を取得し、低速で遠心分離し、上清を廃棄し、次に１０μＬのエレクトロポレーション液体を添加して再懸濁し、次にインキュベーションを室温で１０分間実施する。
４．２及び３を均一に混合し、次にインキュベーションを室温で１０分間実施し、次に混合物をエレクトロポレーションカップに移す。
５．Ｃｅｌｅｔｒｉｘ ＣＴＸ－１５００ ＬＥエレクトロポレーターを、４２０Ｖの電位でのエレクトロポレーションに採用し、３つの群の各サンプルについて試験する。
６．細胞を培養皿で培養する。
７．細胞を７日間培養した後、生細胞の割合及び緑色蛍光タンパク質の発現を伴う細胞集団の割合を観察するため、フローサイトメーターを使用する。
５．３ 試験結果
図９に示す通り、生存率検出について、正常形態を有する細胞集団を、フローサイトメーターを通じて選択することによって計数及び決定し、Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡ化合物（ＲＮＰ、リボ核タンパク質）を添加するか又は否かにかかわらず、２μｇの安定な二本鎖ＤＮＡのエレクトロポレーションによる細胞サンプルにおける生存率は、２μｇのプラスミドのエレクトロポレーションの場合及びＤＮＡのエレクトロポレーションを全く伴わないブランク対照群の場合に近い。
緑色蛍光タンパク質の発現レベル検出では、フローサイトメーターを通じて同定された生細胞集団内での緑色蛍光タンパク質陽性で発現された細胞を選択し、百分率を計数する。図１０に示す通り、Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡ化合物（ＲＮＰ）を添加するか否かにかかわらず、ＤＮＡのエレクトロポレーションを全く伴わないブランク対照群におけるＧＦＰ発現率平均値は、０にほぼ等しい。２μｇのプラスミドのエレクトロポレーションにおけるＧＦＰ発現率平均値は、非常に近く、それぞれ５．５１％及び５．９１％であり、それは、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ ＲＮＰ化合物が添加された実験群が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ゲノム上でＧＦＰ遺伝子断片のノックインを大規模には受けず、且つプラスミド鋳型の残留に起因するＧＦＰのバックグラウンド発現を受けることを示す。２μｇの安定な二本鎖ＤＮＡのエレクトロポレーションによる細胞サンプルにおけるＧＦＰ発現率平均値は、それぞれ１３．３５％及び４．９２％である。安定な二本鎖ＤＮＡのＧＦＰ発現は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株へのエレクトロポレーションを受けてから７日後、ＲＮＰを伴わない対照群と比較して、やはり１３．３５％である。それは、遺伝子編集に基づくＧＦＰコード遺伝子のノックインが生じ、且つ安定な二本鎖ＤＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ媒介に基づく固定点ノックインにとってより有利であり、プラスミドの場合より低い鋳型の残留を有することを示す。（緑色蛍光タンパク質の発現バックグラウンドは、プラスミドの場合よりやや低いが、ＣＲＩＳＰＲ媒介に基づく固定点ノックインは、有意に改善され得る。）
本発明の実装形態は、上記実施形態に記載の場合に限定されない。本発明の精神及び範囲から逸脱しない限り、当業者は、本発明に対し、形態及び詳細において様々な修飾及び改善を行うことができ、これらは本発明の保護範囲内に入るとみなされる。

Claims (30)

  1. 標的ＤＮＡ配列を作製するための方法であって、
    ＤＮＡ構築物を増幅及び抽出するステップであって、導入されたＤＮＡ構築物であって、自律的に複製され、（ａ）１つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼ認識配列；（ｂ）前記標的ＤＮＡ配列；並びに（ｃ）前記標的ＤＮＡ配列の２つの末端の側翼でのプロテロメラーゼ認識配列を含むＤＮＡ構築物とともに宿主細胞を培養することによって前記ＤＮＡ構築物を増幅し、前記増幅されたＤＮＡ構築物を前記宿主細胞から抽出することを含むステップと；
    第１の切断反応のステップであって、プロテロメラーゼを前記増幅及び抽出されたＤＮＡ構築物と接触させることを可能にし、ここで、前記プロテロメラーゼが前記ＤＮＡ構築物上の前記プロテロメラーゼ認識配列を認識及び切断することにより、第１の切断反応混合物を得ることを含むステップと；
    第２の切断反応のステップであって、前記第１の切断反応混合物を１つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼと接触させることを可能にし、ここで、前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼが、前記構築物上の前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼ認識配列を認識及び切断することで、第２の切断反応混合物を得ることを含むステップと；
    消化反応のステップであって、前記第２の切断反応混合物を１つ以上のエキソヌクレアーゼと接触させることを可能にすることで、前記標的ＤＮＡ配列以外の他の配列を消化することを含むステップと、
    を含む、方法。
  2. 前記プロテロメラーゼが、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ファージＮ１５、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）ファージｐｈｉ Ｋ０２、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）ファージＰｙ５４、ハロモナス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）ファージｐｈｉ ＨＡＰ、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）ファージＶＰ８８２、及びボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）プラスミドｌｐＢ３１．１６、又はそれらの相同体若しくは変異体に由来するプロテロメラーゼから選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＤＮＡ構築物が、２つ以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼ認識配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、以下：ＢｂｓＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＥａｒＩ、ＨｇａＩ及びＳｆａＮＩの１つ又はいずれかの組み合わせから選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記メガヌクレアーゼが、以下：Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ及びＩ－ＳｍａＭＩのいずれか１つ又はいずれかの組み合わせから選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記エキソヌクレアーゼが、Ｔ５エキソヌクレアーゼ又はλエキソヌクレアーゼである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記ＤＮＡ構築物が、複製起点及び選択マーカー遺伝子を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記第１の切断反応が完了し、且つ前記第２の切断反応が完了した後、さらなる精製ステップが含まれない、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記第１の切断反応のステップが、プロテロメラーゼ活性に適した温度下でサーモスタット的に実施され、前記第２の切断反応のステップが、前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／若しくはメガヌクレアーゼに適した温度下でサーモスタット制御され、並びに／又は前記消化反応のステップが、前記エキソヌクレアーゼに適した温度下でサーモスタット的に実施される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記第１の切断反応後に前記プロテロメラーゼを不活性化し、前記第２の切断反応後に前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／若しくはメガヌクレアーゼを不活性化し、並びに／又は前記消化反応後に前記エキソヌクレアーゼを不活性化するステップをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ＤＮＡ構築物が、以下：（ｉ）前記１つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼ認識配列を含むクローニングベクターを提供する；並びに（ｉｉ）前記プロテロメラーゼ認識配列と連結された前記２つの末端での前記側翼を有する前記標的ＤＮＡ配列を前記クローニングベクターに挿入することを含む方法を通じて構築される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記クローニングベクターが、プラスミドである、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記クローニングベクターが、ｐＢＲ３２２ベクター、ｐＵＣベクター、又はｐＥＴベクターに由来する、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記宿主細胞が、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記ＤＮＡ構築物が、前記標的ＤＮＡ配列と前記プロテロメラーゼ認識配列との間にさらなる制限エンドヌクレアーゼ認識配列をさらに含み、前記制限エンドヌクレアーゼを消化反応産物と接触させることを可能にすることで、前記さらなる制限エンドヌクレアーゼ認識配列を認識及び切断し、それにより、前記消化反応のステップ後、平滑末端又は付着末端を有する二本鎖標的ＤＮＡ断片を調製するステップをさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記ＤＮＡ構築物が、前記標的ＤＮＡ配列と前記プロテロメラーゼ認識配列との間にさらなるニッキング酵素認識配列をさらに含み、ニッキング酵素を消化反応産物と接触させることを可能にすることで、前記さらなるニッキング酵素認識配列を認識及び切断し、それにより、前記消化反応のステップ後、２つの末端が末端閉鎖二本鎖ＤＮＡであり、中間体が一本鎖ＤＮＡであるＤＮＡ配列を調製するステップをさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  17. 標的タンパク質を発現させるための方法であって、
    請求項１～１６のいずれか一項に記載の標的ＤＮＡ配列であって、前記標的タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ配列を作製するための方法を実行することと；
    前記得られた標的ＤＮＡ配列を原核細胞又は真核細胞に導入することと；
    前記原核細胞又は前記真核細胞をタンパク質発現に適した条件下でインキュベートすることと、
    を含む、方法。
  18. 標的ＤＮＡ配列を標的ゲノムの標的組み込み部位に組み込むための方法であって、
    請求項１～１６のいずれか一項に記載の標的ＤＮＡ配列であって、前記標的組み込み部位の２つの末端での相同性アーム配列及び中間の標的ノックイン断片を含む標的ＤＮＡ配列を作製するための方法を実行することと；
    前記得られた標的ＤＮＡ配列、Ｃａｓ９タンパク質及び前記標的ＤＮＡ配列に基づいて設計されたｓｇＲＮＡを一緒に原核細胞又は真核細胞に導入することと；
    前記原核細胞又は前記真核細胞をインキュベートすることにより、前記標的ＤＮＡ配列を前記標的ゲノムに組み込むことと、
    を含む、方法。
  19. 自律的複製ベクターであり、且つ（ａ）１つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼ認識配列、並びに（ｂ）複数のクローニング部位を含む、クローニングベクター。
  20. ｐＢＲ３２２ベクター、ｐＵＣベクター、又はｐＥＴベクターに由来する、請求項１９に記載のクローニングベクター。
  21. ２つ以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼ認識配列を含む、請求項１９又は２０に記載のクローニングベクター。
  22. 前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列が、以下：ＢｂｓＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＥａｒＩ、ＨｇａＩ及びＳｆａＮＩの認識配列のいずれか１つ又はいずれかの組み合わせから選択される、請求項１９～２１のいずれか一項に記載のクローニングベクター。
  23. 前記メガヌクレアーゼ認識配列が、以下：Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ及びＩ－ＳｍａＭＩの認識配列のいずれか１つ又はいずれかの組み合わせから選択される、請求項１９～２２のいずれか一項に記載のクローニングベクター。
  24. 複製起点及び前記選択マーカー遺伝子を含む、請求項１９～２３のいずれか一項に記載のクローニングベクター。
  25. ラクトースオペロン配列、前記複数のクローニング部位を含むβガラクトシダーゼをコードする遺伝子配列、及び３つ以上のＢｓｐＱＩ認識配列及び／又は２つ以上のＩ－ｓｃｅＩ認識配列を含む、請求項１９～２４のいずれか一項に記載のクローニングベクター。
  26. 前記ｐＵＣベクターに由来する、請求項２５に記載のクローニングベクター。
  27. ｐＵＣ５７ベクターに由来する、請求項２６に記載のクローニングベクター。
  28. 以下：（ｉ）前記ＢｓｐＱＩ認識配列が前記ｐＵＣ５７ベクターの１５５４位塩基及び２５３９位塩基の後に付加され、前記Ｉ－ｓｃｅＩ認識配列が１５０１位塩基及び２４７９位塩基の後に付加される；並びに（ｉｉ）前記ｐＵＣ５７ベクターの１３９７位塩基のＧがＣに突然変異され、２１３６位塩基及び２１３７位塩基のＡＴがＧＣに突然変異される、前記ｐＵＣ５７ベクター上での再構築を実施することによって構築される、請求項２６又は２７に記載のクローニングベクター。
  29. 自身のヌクレオチド配列が、配列番号１で示されるような配列を含む、請求項１９～２７のいずれか一項に記載のクローニングベクター。
  30. 標的ＤＮＡ配列を作製するためのキットであって、請求項１９～２９のいずれか一項に記載のクローニングベクター、プロテロメラーゼ、１つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼ、並びに１つ以上のエキソヌクレアーゼを含む、キット。
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