KR20220061891A - 비천연 아미노산이 위치-특이적으로 도입된 유전자 편집 단백질 및 이를 이용한 유전자 편집 방법 - Google Patents
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Abstract
일 양상은 비천연 아미노산이 위치-특이적으로 도입된 유전자 편집 단백질 및 이를 이용한 유전자 편집 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 일 양상에 따르면 유전자 편집 단백질의 세포 내 전달 및 활성을 크게 향상시킬 수 있는 아미노산 서열상의 위치를 기능화함으로써 표적 세포 유전자 교정 효과를 극대화할 수 있으므로 in vivo 및 ex vivo에서 외부 자극이나 장비 없이 세포교정을 통한 치료제로서 유용하게 활용될 수 있다.
Description
비천연 아미노산이 위치-특이적으로 도입된 유전자 편집 단백질 및 이를 이용한 유전자 편집 방법에 관한 것이다.
유전자치료제 시장은 2016년 5.84억달러(약 6,584억원)에서 연평균('17-'23) 33.3%로 성장해 2023년 44.02억달러(약 5조원) 규모를 보일 전망이다. 암 질환과 희귀질환에 대한 유전자치료제가 전체시장의 60% 이상을 차지하며, 뒤이어 신경질환, 심혈관 질환, 전염병 순으로 시장을 형성하고 있다.
최근에는 CRISPR 기반 유전자편집 도구를 활용한 유전자 치료제 연구가 활발해지고 있다. CRISPR 시스템의 경우 플라스미드, 리보핵산단백질, messenger RNA 등에 기반한 방법으로 전달이 가능하며, 이 중 리보핵산단백질의 경우 Cas9 단백질과 single guide RNA (sgRNA)로 구성된다. 글로벌 유전자편집 시장은 2018년 36억2000만 달러(약 4조860억 원)에서 연평균 14.5%씩 성장, 오는 2023년에는 71억2000만 달러(약 8조370억 원) 규모에 달할 것으로 전망되고 있다. 또한 CRISPR/Cas9 기술은 2018년 19억5000만 달러로 53.8%를 점유해 가장 큰 규모를 형성하고 있고, 2023년까지 14.7%씩 성장해 38억7000만 달러 규모를 형성해 유전자편집 시장 54.2%를 차지할 것으로 기대되고 있다.
CRISPR 치료제 개발의 예로서, 대표적인 회사인 미국 Editas사는 in vivo 유전자 치료 기술로 안과질환을 타겟으로 Allergan Pharmaceuticals사와 파트너십을 맺고 치료제를 개발 중이다. 특히 10형 레버 선천성 흑암시(LCA: Leber congenital amaurosis type 10)라는 희귀 선천성 망막질환의 치료를 위해 바이러스 기반 in vivo 유전체 교정 기술로 아데노부속바이러스(AAV)를 적용하고 있다.
미국 Intellia사는 지질나노입자(LNP: lipid nanoparticle)를 이용하여 Cas9과 가이드 RNA의 리보핵산단백질 전달에 기반한 치료 기술을 중점적으로 연구하고 있다. 특히 트랜스티레틴 유전분증(transthyretin amyloidosis)이라는 희귀 간질환을 대상으로 Regeneron사와 치료제를 공동개발 중이며, 영장류에서 전임상 결과를 발표하였다.
또한, 미국 CRISPR Therapeutics는 지중해성 빈혈 치료제로 ex vivo에서 조혈모세포를 추출하여 유전자교정 후 환자에게 다시 주입하는 자가세포치료제를 Vertex Pharmaceuticals와 파트너십을 맺고 개발 중이다.
국내에서는 툴젠 사가 AAV에 의한 in vivo 전달로 혈우병, 샤르코마리투스(Charcot-Marie-Tooth)라는 말초신경질환, 10형 레버 선천성 흑암시 질환을 대상으로 한 치료제 개발에 투자가 많이 이루어지고 있다. 최근 툴젠 사는 서울대학교와 협력으로 CRISPR 발현 AAV 전달로 레버 선천성 흑암시 질환의 마우스 모델에서 HDR에 의한 편집 효과도 나타난 것으로 보고되었다. 또한 삼성서울병원과 툴젠의 협력으로 샤르코마리투스 치료를 위해 CRISPR RNP를 투여하여 마우스 모델에서 indel에 의한 편집 및 치료 효능을 보인 결과를 2019년 발표하였다.
CRISPR 시스템의 기술적, 산업적 응용에 있어서 리보핵산단백질의 경우 가장 직접적인 전달 방법으로 transient한 유전자 조절 효과로 플라스미드 또는 바이러스 기반 전달 방법의 경우 발생할 수 있는 비특이적 표적 효과의 위험성이 가장 적다. 하지만 Cas9 단백질의 분자량이 크고 구조가 불안정하여 세포내 전달을 촉진하는 기술이 요구되며, 산업용, 의료용 목적을 위해서는 Cas9 시스템의 엔지니어링을 통해 부가적인 생리활성 기능을 부여해야 하는 한계점이 존재한다.
이러한 측면에서, CRISPR 시스템의 구성요소인 Cas9 단백질을 화학적으로 개질할 경우 캐리어 또는 생리활성물질을 다양하게 컨쥬게이션하여 Cas9 단백질의 다기능화가 가능하다. Cas9의 화학적 개질 방법의 경우 생산 과정에 있어 재조합 단백질 제작에 비해 과정이 매우 용이하고 단백질의 구조적인 안정성을 높게 유지할 수 있어 플랫폼 기술로써 큰 장점을 지닌다.
예컨대, 비천연 아미노산을 단백질에 도입하는 기술을 이용하면 대상 단백질에 선택화학반응이 가능하여, 전달용 캐리어, 병용 투여용 약물, 리간드 등 다양한 생리활성물질을 자유자재로 접합할 수 있다. 선택화학반응을 이용하면 원래 단백질의 lysine, cysteine의 기능기를 이용하는 방법과 비교하여 다양한 생리활성물질을 간단한 과정에 의해 접합하거나, 다종의 물질을 동시에 기능화할 수 있다.
이에, 본 발명은 CRISPR 유전자교정 시스템의Cas9 단백질에 비천연 아미노산을 위치특이적으로 도입함으로써, 선택화학반응기를 부여하여 다종의 생리활성물질로 Cas9을 기능화할 수 있는 기술을 개발하였다. 본 기술을 전달촉진 물질, 병용투여를 위한 치료용 약물, 표적용 리간드 등으로 기능화한 Cas9을 제작할 수 있는 범용 기술로써 유전자교정 치료제 개발, 농산물 품종 개량, 미생물공학 등 다양한 분야에 응용 가치가 높을 것이다.
일 양상은 비천연 아미노산이 위치-특이적으로 도입된 유전자 편집 단백질을 제공한다.
다른 양상은 상기 유전자 편집 단백질 및 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염을 포함하는 유전자 편집용 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 유전자 편집 단백질에 비천연 아미노산을 위치-특이적으로 도입하는 단계;
상기 유전자 편집 단백질 및 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염을 개체로부터 분리된 세포에 처리하거나 개체에 투여하는 단계를 포함하는 유전자 편집 방법을 제공한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
일 양상은 비천연 아미노산이 위치-특이적으로 도입된 유전자 편집 단백질에 관한 것이다.
일 양상에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 azide기를 가진 아미노산일 수 있고, 구체적으로, AzF(p-azido-L-phenylalanine) 또는 이의 염일 수 있다. 상기 AzF(p-azido-L-phenylalanine) 또는 이의 염은 천연으로부터 유래될 수도 있고, 공지의 유기 합성 방법을 이용하여 합성될 수도 있다.
또한, 상기 AzF(p-azido-L-phenylalanine) 또는 이의 염은 비단백질 화합물, 펩티드, 식물 유래 조직이나 세포의 추출물, 미생물(예를 들어 세균류 또는 진균류, 그리고 특히 효모)의 배양으로 얻어진 생산물일 수 있다.
상기 용어 "염"은 일 양상에 따른 특정 화합물과 비교적 무독성인 산 또는 염기를 이용해서 조제되는 염을 의미한다.
또한, 본 명세서에서 상기 "염"은 "약학적으로 허용 가능한 염"일 수 있다.
용어 "약학적으로 허용 가능한"이란 상기 화합물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
용어 "약학적으로 허용 가능한 염"이란, 일 양상에 따른 특정 화합물과 비교적 무독성인 산 또는 염기를 이용해서 조제되는 염을 의미한다. 상기 화합물이 상대적으로 산성 관능기를 포함할 때, 순수 용액 또는 적합한 불활성 용매 중에서 충분한 양의 염기를 이러한 화합물의 중성 형태와 접촉시킴으로써 염기 부가염을 얻을 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염기 부가염은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아민, 혹은 마그네슘의 염 또는 유사한 염이 포함된다. 상기 화합물이 상대적으로 염기성 관능기를 포함할 때, 순수 용액 또는 적합한 불활성 용매 중에서 충분한 양의 산을 이러한 화합물의 중성 형태와 접촉시킴으로써 산 부가염을 얻을 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 산 부가염은 염산, 브롬화 수소산, 질산, 탄산, 탄산 수소 이온, 인산, 인산 1수소 이온, 인산 2수소 이온, 황산, 황산 수소 이온, 요오드화 수소산 또는 아인산 등의 무기산의 염, 그리고 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 안식향산, 숙신산, 수베르산, 푸마르산, 락트산, 만델산, 프탈산, 벤젠술폰산, p-톨릴술폰산, 구연산, 주석산, 메탄술폰산 등의 유기산의 염을 들 수 있고, 나아가 아미노산(예를 들면 아르기닌 등)의 염 및 글루쿠론산 등의 유기산의 염도 포함된다.
상기 약학적으로 허용 가능한 염은 산성 또는 염기성 부분을 포함하는 모체 화합물로부터 통상적인 화학적 방법으로 합성할 수 있다. 일반적으로 이러한 염은 수중 또는 유기 용매 중 또는 이 2종의 혼합물 중에서, 이들 화합물의 유리산 또는 염기의 형태를 화학량론적으로 적량인 염기 또는 산과 반응시켜서 조제된다. 일반적으로 에테르, 아세트산에틸, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴 등의 비수성 매질이 바람직하다.
상기 "위치-선택적(site-specific)으로 도입"은 대상 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 특정 잔기가 선택적으로 변형되는 것을 의미할 수 있다. 상기 변형은 예를 들어, 치환, 결실, 삽입으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
용어 "단백질(Protein)"는 아마이드 결합 (또는 펩티드 결합)으로 연결된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다.
일 양상에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질은 야생형 단백질의 아미노산 서열 중 Tyr(tyrosine) 또는 Phe(phenylalanine)이 변형된 것일 수 있고, 구체적으로, 야생형 단백질의 아미노산 서열 중 Tyr(tyrosine) 또는 Phe(phenylalanine)이 AzF(p-azido-L-phenylalanine)로 치환된 것일 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질은 CRISPR/Cas9 시스템에 이용되는 것일 수 있고, 구체적으로, Cas 단백질일 수 있고, 보다 구체적으로는 Cas9 단백질일 수 있다. 상기 유전자 편집 단백질은 상기 유전자 편집 단백질의 아미노산 서열과 각각 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질을 포함할 수 있다.
용어 "상동성(Homology)"은 야생형 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 이러한 상동성의 비교는 당업계에서 널리 알려진 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있으며, 2개 이상의 서열간 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다.
또한, 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 상기 유전자 편집 단백질의 N- 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 상기 보호기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 상기 유전자 편집 단백질의 개질, 특히 유전자 편집 단백질의 안정성을 증진시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함될 수 있다.
상기 용어 "안정성"은 생체 내 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 폴리펩티드를 보호하는 인 비보(in vivo) 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미하는 것일 수 있다.
아울러, 상기 유전자 편집 단백질은 표적화 서열, 태그 (tag), 표지된 잔기를 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있다.
일반적으로, 널리 알려진 유전자 편집 수단인 "CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템"은 집합적으로 Cas 유전자를 코딩하는 서열, tracr(트랜스-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "직접 반복부" 및 tracrRNA-가공 부분 직접 반복부 포함), 가이드 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로도 지칭), 가이드 RNA 또는 CRISPR 유전자좌로부터의 기타 서열 및 전사물을 포함하는 CRISPR-관련(CRISPR-associated; 이하 Cas) 유전자의 발현에 수반되거나, 그의 활성을 유도하는 전사물 및 다른 요소를 지칭한다. 일부 구현 예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 I형, II형 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유래된다. 일부 구현 예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체, 예를 들어, 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes)로부터 유래된다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 증진시키는 요소(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 프로토스페이서로도 지칭)를 특징으로 한다. CRISPR 복합체의 형성의 맥락에서, "표적 서열" 또는 "표적 유전자"는 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 여기서, 표적 서열과 가이드 서열 간의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 증진시킨다. 본질적으로 완전한 상보성이 필요하지 않지만, 혼성화를 야기하고, CRISPR 복합체의 형성을 증진시키는 충분한 상보성이 존재한다. 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현 예에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질 내에 위치한다. 일부 구현 예에서, 표적 서열은 진핵 세포의 세포기관, 예를 들어, 미토콘드리아 또는 엽록체 내에 존재할 수 있다.
상기 Cas 단백질은 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(trans-activating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제(nickase)를 형성한다. 상기 Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csn1 및 Csx12로도 알려짐), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 그의 상동체 또는 그의 변형된 버전을 포함한다. 이들 효소가 알려져 있으며; 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 단백질의 아미노산 서열은 수탁 번호 Q99ZW2 하에 스위스프로트(SwissProt) 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 일부 구현 예에서, 비변형 CRISPR 효소, 예를 들어, Cas9는 DNA 절단 활성을 갖는다.
일부 구현 예에서, CRISPR 효소 또는 유전자 편집 단백질은 Cas9 단백질이며, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophiles) 유래 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 아우레우스(Streptocuccus aureus) 유래 Cas9 단백질 및 네이세리아 메닝기디티스(Neisseria meningitidis) 유래 Cas9 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 Cas9 단백질일 수 있고, 구체적으로 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질일 수 있다. 일부 구현 예에서, Cas9 단백질은 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다.
일부 구현 예에서, Cas9 단백질은 진핵 세포 내의 핵 내에 위치하기 위하여 Cas9 단백질의 5'- 또는 3'-, 또는 양 말단 부분에 NLS(nuclear localization sequence or signal)를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 NLS는 하나 또는 그 이상일 수 있다.
본 명세서에서 용어 “핵 위치화 서열 또는 신호(Nuclear localization sequence or signal, NLS)"는 특정물질(예컨대, 단백질)을 세포 핵 내로 운반하는 역할을 하는 아미노산 서열을 의미하며, 대체적으로 핵공(Nuclear Pore)을 통하여 세포 핵 내로 운반하는 작용을 한다. 상기 핵 위치화 서열은 진핵생물에서 CRISPR 복합체 활성에 필요하지 않지만, 이러한 서열을 포함하여, 시스템의 활성을 증진시켜, 특히 핵 내의 핵산 분자를 표적화하는 것으로 여겨진다.
또한 RNA 유전자 가위(RNA-guided CRISPR)(clustered regularly interspaced short palindrome repeats)-연관된 뉴클레아제 Cas9는 표적 유전자의 넉아웃, 전사 활성화 및 single guide RNA(sgRNA)(즉, crRNA-tracrRNA 융합 전사체)를 이용한 억제에 대한 획기적인 기술을 제공하며, 이 기술은 수많은 유전자 위치를 타겟팅하는 것으로 알려져 있다.
Cas9 (또는 Cpf1) 단백질은 CRISPR/Cas9 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, 상기 Cas9 (또는 Cpf1) 유전자 및 단백질의 정보는 국립생명공학정보센터(national center for biotechnology information, NCBI)의 GenBank에서 구할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas (또는 Cpf1)단백질을 암호화하는 CRISPR-연관 유전자는 약 40 개 이상의 서로 다른 Cas (또는 Cpf1) 단백질 패밀리가 존재하는 것으로 알려져 있으며, cas 유전자 및 반복 구조(repeat structure)의 특정 조합에 따라 8개의 CRISPR 하위 유형 (Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern, 및 Mtube)을 정의할 수 있다. 따라서 상기 각 CRISPR 하위 유형이 반복단위를 이루어 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체를 형성할 수 있다.
상기 Cas9가 DNA로 암호화되어 개체 또는 세포로 전달되는 경우, 상기 DNA는 일반적으로 (그러나 필수적이지는 않음) 타겟 세포에서 작동 가능한 조절 요소 (예컨대, 프로모터)를 포함할 수 있다. 상기 Cas9 발현을 위한 프로모터는, 예컨대, CMV, EF-l a, EFS, MSCV, PGK, 또는 CAG 프로모터일 수 있다. gRNA 발현을 위한 프로모터는, 예컨대, HI, EF-la, tRNA 또는 U6 프로모터일 수 있다. Cas9를 코딩하는 유전자의 서열은 nuclear localization signal(NLS) (e.g., SV40 NLS)를 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 프로모터는 조직 특이성 또는 세포 특이성을 갖는 것일 수 있다.
용어 "키메라 RNA", "키메라 가이드 RNA", "가이드 RNA", "단일의 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA)" 및 "합성 가이드 RNA"는 상호교환가능하게 사용되며, 가이드 서열, tracr 서열 및/또는 tracr 메이트 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 용어 "가이드 서열"은 표적 부위를 지정하는 가이드 RNA 내의 약 20bp 서열을 지칭하며, 용어 "가이드" 또는 "스페이서"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 또한, 용어 "tracr 메이트 서열"은 용어 "직접 반복부(들)"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스 활성화 crRNA (transactivating crRNA, tracrRNA)로 이루어져 있는 것일 수 있으며, 또는 crRNA 및 tracrRNA의 부분을 포함하고 상기 표적 DNA와 혼성화하는 단일 사슬 RNA (single-chain RNA, sgRNA)일 수 있다.
일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고, 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하기에 충분한, 표적 폴리뉴클레오티드 서열과의 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
또한 상기 가이드 RNA의 기능을 변형/증진시키기 위하여 가이드 RNA 염기 서열의 일부분을 변형할 수 있다. 또한 일부 구현 예에서, 가이드 서열과 그의 상응하는 표적 서열 간의 상보성의 정도는 적절한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬되는 경우, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 최적의 정렬은 서열을 정렬하기에 적절한 임의의 알고리즘의 사용으로 결정될 수 있으며, 그의 비제한적인 예는 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우즈-휠러 트랜스폼(Burrows-Wheeler Transform)에 기초한 알고리즘(예를 들어, 버로우즈 휠러 얼라이너(Burrows Wheeler Aligner)), ClustalW, Clustal X, BLAT, 노보얼라인(Novoalign)(노보크라프트 테크놀로지즈(Novocraft Technologies), ELAND(일루미나(Illumina), 미국 캘리포니아주 샌디에고), SOAP(soap.genomics.org.cn에서 이용가능) 및 Maq(maq.sourceforge.net에서 이용가능)를 포함한다. 일부 구현 예에서, 가이드 서열은 예컨대 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현 예에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적절한 검정에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험되는 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체를 형성하기에 충분한 CRISPR 시스템의 성분은 예를 들어, CRISPR 서열의 성분을 인코딩하는 벡터로의 트랜스펙션 후에, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 서베이어 검정에 의한 표적 서열 내의 우선적인 절단의 평가에 의해서와 같이, 상응하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포로 제공될 수 있다. 유사하게, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 절단은 표적 서열, 시험되는 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체의 성분을 제공하고, 표적 서열에서 시험 및 대조군 가이드 서열 반응 간의 결합 또는 절단 비율을 비교함으로써 시험관에서 평가될 수 있다. 다른 검정이 가능하며, 당업자에게 용이하게 사용될 수 있을 것이다.
가이드 서열은 임의의 표적 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다. 일부 구현 예에서, 표적 서열은 세포의 게놈 내의 서열이다. 예시적인 표적 서열은 표적 게놈에서 독특한 것들을 포함한다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 유래 Cas9에 대하여, 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNNXGG (N은 A, G, T 또는 C이며; X는 임의의 것일 수 있음)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG의 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNXGG (N은 A, G, T 또는 C 이며; X는 임의의 것일 수 있음)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 스트렙토코커스 써모필러스 CRISPR1 Cas9에 대하여, 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNNXXAGAAW (N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있으며; W는 A 또는 T임)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW의 스트렙토코커스 써모필러스 CRISPR1 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNXXAGAAW(N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있으며; W는 A 또는 T임)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9에 대하여, 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNNXGGXG (N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있음)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG의 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNXGGXG (N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있음)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 이들 서열 각각에서, "M"은 A, G, T 또는 C일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질은 천연으로부터 유래될 수도 있고, 당해 분야에서 널리 공지된 다양한 단백질 합성 방법으로 획득할 수 있다. 일례로서, 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 단백질 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있다. 또한, 일례로서, 상기 유전자 편집 단백질은 펩티드, 식물 유래 조직이나 세포의 추출물, 미생물(예를 들어 세균류 또는 진균류, 그리고 특히 효모)의 배양으로 얻어진 생산물일 수 있다.
용어 "발현(expression)"은 폴리펩티드(polypeptide)가 구조 유전자로부터 생산되는 과정을 지칭한다. 상기 과정은 유전자(폴리뉴클레오티드)의 mRNA로의 전사, 및 이러한 mRNA의 폴리펩티드(단백질)(들)로의 해독을 포함한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
일 양상에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질은 유전자 재조합으로 제조된 것일 수 있고, 구체적으로, 상기 유전자 편집 단백질은 야생형의 유전자 편집 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 중 Tyr(tyrosine) 및 Phe(phenylalanine)을 코딩하는 뉴클레오티드의 서열 코돈을 amber stop codon (TAG)으로 변이시킨 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 미생물에 형질전환시킨 후, 발현시킴으로써 제조될 수 있다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, V1k_GE, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 벡터에서 상기 유전자 편집 단백질을 코딩하는 유전자는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
상기 형질전환에 있어서, 당업계에 주지된 형질전환 방법으로서 벼의 유전자의 형질전환이 가능한 방법이라면 특별히 제한되지는 아니하나, 구체적인 예를 들자면, 아그로박테리움-매개 형질전환법, 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol; PEG)-매개 프로토플라스트 형질전환법, 유전자총법, 전극(electrode) 형질전환법, 진공 침윤(Vacuum infiltration) 형질전환법 및 탄화규소 섬유-매개 형질전환법으로 이루어진 군에서 선택된 하나에 의해 수행되는 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물은 DBCO(Dibenzylcyclooctyne)기 또는 말레이미드(Maleimide)기를 갖는 화합물일 수 있다. 상기 유전자 편집 단백질은 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물과 클리화학반응을 통해 개질될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염은 하나 이상의 PEG(Polyethylene glycol)이 결합되어 있고, 상기 하나 이상의 PEG는 리간드 또는 표적화제와 결합된 것일 수 있다.
또한, 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염은 표적화제와 결합된 것일 수 있다.
상기 리간드는 Folate(Fol) 또는 세포투과성 펩티드일 수 있고, 상기 표적화제는 압타머, 항체 또는 이들의 단편 또는 항암제일 수 있으며, 상기 항암제는 올라파립(Olaparib)일 수 있고, 구체적으로 상기 세포투과성 펩티드는 TAT 펩티드일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 세포투과성 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있다.
예를 들어, 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물은 DBCO-올라파립, DBCO-PEG, DBCO-(PEG)n-Folate, Maleimide-올라파립일 수 있다(상기 n은 1 내지 10일 수 있다).
또한, 상기 용어 "염"은 "약학적으로 허용 가능한 염"일 수 있으며, 구체적으로는 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 압타머, 항체 또는 이들의 단편 또는 항암제은 특정 표적(항원을 포함)을 위하여 결합된 것으로서, 이를 통해 상기 유전자 편집 단백질은 특정 세포 내 특정 유전자에 대한 정교한 편집을 하는 데 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염은 특정 세포를 표적화하는 압타머, 항체 또는 이들의 단편 또는 항암제와 결합되어 있을 수 있고, 상기 압타머, 항체 또는 이들의 단편 또는 항암제가 표적화하는 특정 세포에서 내포 작용(endocytosis)를 통해 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염에 접합된 유전자 편집 단백질이 세포 내로 함입되어, 특정 유전자를 편집할 수 있다.
예를 들어, 상기 항암제가 올라파립인 경우, 난소암, 유방암 및 전립선암을 포함하는 유전성 BRCA1(breast cancer type 1 susceptibility protein) 또는 BRCA2(breast cancer type 2 susceptibility protein) 돌연변이를 포함하는 암 세포가 표적화될 수 있고, 상기 유전자 편집 단백질은 상기 암 세포 내에 함입되어, 특정 유전자를 편집할 수 있다.
다른 양상은 상기 유전자 편집 단백질 및 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염을 포함하는 유전자 편집용 조성물에 관한 것이다.
상기 "유전자 편집 단백질", "유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물", "염", "유전자 편집" 등은 전술한 범위 내일 수 있고, 예를 들어, 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물은 DBCO(Dibenzylcyclooctyne)기 또는 말레이미드(Maleimide)기를 갖는 화합물일 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염은 하나 이상의 PEG(Polyethylene glycol)이 결합되어 있고, 상기 하나 이상의 PEG는 리간드 또는 표적화제와 결합된 것일 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염은 표적화제와 결합된 것일 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 리간드는 Folate(Fol) 또는 세포투과성 펩티드일 수 있고, 상기 표적화제는 압타머, 항체 또는 이들의 단편 또는 항암제일 수 있으며, 상기 항암제는 올라파립(Olaparib)일 수 있고, 구체적으로 상기 세포투과성 펩티드는 TAT 펩티드일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 세포투과성 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있다.
상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염은 특정 세포를 표적화하는 압타머, 항체 또는 이들의 단편 또는 항암제와 결합되어 있을 수 있고, 상기 압타머, 항체 또는 이들의 단편 또는 항암제가 표적화하는 특정 세포에서 내포 작용(endocytosis)를 통해 상상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염에 접합된 유전자 편집 단백질이 세포 내로 함입되어, 특정 유전자를 편집할 수 있다.
예를 들어, 상기 항암제가 올라파립인 경우, 난소암, 유방암 및 전립선암을 포함하는 유전성 BRCA1(breast cancer type 1 susceptibility protein) 또는 BRCA2(breast cancer type 2 susceptibility protein) 돌연변이를 포함하는 암 세포가 표적화될 수 있고, 상기 유전자 편집 단백질은 상기 암 세포 내에 함입되어, 특정 유전자를 편집할 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 유전자 편집용 조성물은 세포투과성 펩티드, 핵 국소화 신호(nuclear localization signal: NLS) 펩티드 및/또는 엔도소몰라이틱(endosomolytic) 펩티드를 더 포함할 수 있다. 상기 세포투과성 펩티드는 예를 들어, TAT 펩티드, PTD4 펩티드, 트랜스포탄(Transportan) 펩티드일 수 있고, 상기 NLS 펩티드는 예를 들어, SV40 펩티드일 수 있고, 상기 엔도소몰라이틱(endosomolytic) 펩티드는 CM18 펩티드일 수 있다.
상기 TAT 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있고, 상기 PTD4 펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있고, 상기 트랜스포탄(Transportan) 펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있고, 상기 SV40 펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있고, 상기 CM18 펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있다.
상기 유전자 편집용 조성물이 세포투과성 펩티드, 핵 국소화 신호(nuclear localization signal: NLS) 펩티드 및/또는 엔도소몰라이틱(endosomolytic) 펩티드를 더 포함할 경우, 상기 유전자 편집 단백질 및 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염을 세포 내 효과적으로 유입 및 핵에 전달하여, 유전자 편집 효율을 증진시킬 수 있다.
또 다른 양상은 유전자 편집 단백질에 비천연 아미노산을 위치-특이적으로 도입하는 단계;
상기 유전자 편집 단백질 및 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염을 개체로부터 분리된 세포에 처리하거나 개체에 투여하는 단계를 포함하는 유전자 편집 방법에 관한 것이다.
상기 "유전자 편집 단백질", "유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물", "염", "유전자 편집" 등은 전술한 범위 내일 수 있고, 예를 들어, 상기 비천연 아미노산은 AzF(p-azido-L-phenylalanine)일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 비천연 아미노산을 위치-선택적으로 도입하는 단계는 야생형 단백질의 아미노산 서열 중 Tyr(tyrosine) 또는 Phe(phenylalanine)을 AzF(p-azido-L-phenylalanine)로 치환하는 단계인 것일 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질은 Cas9 단백질일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물은 DBCO(Dibenzylcyclooctyne)기 또는 말레이미드(Maleimide)기를 갖는 화합물일 수 있다.
또한, 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염은 하나 이상의 PEG(Polyethylene glycol)이 결합되어 있고, 상기 하나 이상의 PEG는 리간드 또는 표적화제와 결합된 것일 수 있다.
또한, 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염은 표적화제와 결합된 것일 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 리간드는 Folate(Fol) 또는 세포투과성 펩티드일 수 있고, 상기 표적화제는 압타머, 항체 또는 이들의 단편 또는 항암제일 수 있으며, 상기 항암제는 올라파립(Olaparib)일 수 있고, 구체적으로 상기 세포투과성 펩티드는 TAT 펩티드일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 세포투과성 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있다.
상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염은 특정 세포를 표적화하는 압타머, 항체 또는 이들의 단편 또는 항암제와 결합되어 있을 수 있고, 상기 압타머, 항체 또는 이들의 단편 또는 항암제가 표적화하는 특정 세포에서 내포 작용(endocytosis)를 통해 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염에 접합된 유전자 편집 단백질이 세포 내로 함입되어, 특정 유전자를 편집할 수 있다.
예를 들어, 상기 항암제가 올라파립인 경우, 난소암, 유방암 및 전립선암을 포함하는 유전성 BRCA1(breast cancer type 1 susceptibility protein) 또는 BRCA2(breast cancer type 2 susceptibility protein) 돌연변이를 포함하는 암 세포가 표적화될 수 있고, 상기 유전자 편집 단백질은 상기 암 세포 내에 함입되어, 특정 유전자를 편집할 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 개체로부터 분리된 세포에 처리하거나 개체에 투여하는 단계에서, 세포투과성 펩티드, 핵 국소화 신호(nuclear localization signal: NLS) 펩티드 및/또는 엔도소몰라이틱(endosomolytic) 펩티드를 개체로부터 분리된 세포에 더 처리하거나 개체에 더 투여할 수 있다. 상기 세포투과성 펩티드는 예를 들어, TAT 펩티드, PTD4 펩티드, 트랜스포탄(Transportan) 펩티드일 수 있고, 상기 NLS 펩티드는 예를 들어, SV40 펩티드일 수 있고, 상기 엔도소몰라이틱(endosomolytic) 펩티드는 CM18 펩티드일 수 있다.
상기 TAT 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있고, 상기 PTD4 펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있고, 상기 트랜스포탄(Transportan) 펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있고, 상기 SV40 펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있고, 상기 CM18 펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있다.
상기 세포투과성 펩티드, 핵 국소화 신호(nuclear localization signal: NLS) 펩티드 및/또는 엔도소몰라이틱(endosomolytic) 펩티드를 개체로부터 분리된 세포에 더 처리하거나 개체에 더 투여하는 경우, 상기 유전자 편집 단백질 및 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염을 세포 내 효과적으로 유입 및 핵에 전달하여, 유전자 편집 효율을 증진시킬 수 있다.
용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, "개체"란 편집하고자 하는 유전자를 보유하는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 생물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
또한, 상기 "개체로부터 분리된 세포"는 개체로부터 분리된 세포 뿐만 아니라, 개체로부터 분리된 세포를 공지의 배양 방법 등으로 계대배양한 세포일 수 있고, 개체로부터 분리된 세포로부터 유전적, 화학적 또는 물리적으로 조작 또는 변형된 세포일 수 있고, 새로이 인공적으로 합성 또는 제작된 세포일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다.
상기 유전자 편집 단백질 및 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 구체적으로, 상기 유전자 편집 단백질 및 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염은 0.001 내지 1000 mg/kg/day로, 보다 구체적으로 0.1 내지 100 ㎎/kg/day로 투여될 수 있다. 상기 투여는 하루에 한 번 투여되는 것일 수도 있고, 수 회 나누어 투여되는 것일 수도 있으나, 구체적으로, 상기 유전자 편집 단백질 및 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있다.
상기 유전자 편집 단백질 및 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 제공될 수 있다.
구체적으로, 상기 담체는 예를 들어, 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres) 또는 나노 구형 입자일 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반될 수 있다.
상기 상기 유전자 편집 단백질 및 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염이 제제화될 경우에는 통상적으로 사용하는 윤활제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있고, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있고, 점안제 형태로 제조 시 공지의 희석제 또는 부형제 등이 사용될 수 있다.
일 양상은 유전자 편집 단백질의 특정위치에 선택화학적 기능기 도입하여 선택적인 클릭 화학 반응을 통해 생리활성물질로 유전자 편집 단백질을 다기능화하였으며, 이를 통해 유전자 편집 단백질 및 접합 물질의 세포 내 전달 및 활성을 극대화시킬 수 있음을 확인하였다. 일 양상에 따르면, CRISPR 단백질의 세포 내 전달 및 활성을 크게 향상시킬 수 있는 아미노산 서열상의 위치를 기능화함으로써 표적세포 유전자교정 효과를 극대화할 수 있으므로 in vivo 및 ex vivo에서 외부 자극이나 장비 없이 세포교정을 통한 치료제로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 위치특이적 변이에 의해 비천연 아미노산을 Cas9에 도입 및 다기능화하는 기술의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 Cas9 단백질에 위치특이적 변이를 유도하기 위해 각 domain에서 다양한 위치 선정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 3은 위치특이적으로 비천연 아미노산이 도입된 Cas9-AzF의 정제 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Cas9-AzF의 뉴클레아제 효소 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Cas9-AzF에 DBCO-BDP-FL 반응에 의한 선택화학반응성을 확인한 결과이다.
도 6은 시험관 내 DNA 절단 분석에 의해 조사된 Cas9-AzF(Y373) 및 다른 컨쥬게이트 (Cas9-AzF-DBCO-PEG 및 Cas9-AzF-DBCO-PEG-Folate)에 대한 DNA-절단 활성의 예시를 나타낸 도이다.
도 7은 시험관 내 DNA 절단 분석에 의해 조사된 Cas9-AzF(Y373) 및 다른 컨쥬게이트 (Cas9-AzF-DBCO-Olaparib 및 Cas9-AzF-DBCO-Olaparib&Mal-Olaparib)에 대한 DNA-절단 활성의 예시를 나타낸 도이다.
도 8은 DBCO- 및 말레이미드-기능화된 올리파립의 제조를 나타낸 도이다.
도 9는 다양한 Cas9-AzF(Y373) 제형의 접합(conjugation) 반응을 나타낸 도이다.
도 10은 다양한 Cas9-AzF(Y373) 제형의 세포 흡수를 나타낸 도이다.
도 11 내지 13은 다양한 Cas9-Olaparib 컨쥬게이트들의 항-증식능을 나타낸 도이다.
도 14는 다양한 Cas9-AzF 제형의 유전자 편집 효율(T7E1)을 나타낸 도이다.
도 2는 Cas9 단백질에 위치특이적 변이를 유도하기 위해 각 domain에서 다양한 위치 선정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 3은 위치특이적으로 비천연 아미노산이 도입된 Cas9-AzF의 정제 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Cas9-AzF의 뉴클레아제 효소 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Cas9-AzF에 DBCO-BDP-FL 반응에 의한 선택화학반응성을 확인한 결과이다.
도 6은 시험관 내 DNA 절단 분석에 의해 조사된 Cas9-AzF(Y373) 및 다른 컨쥬게이트 (Cas9-AzF-DBCO-PEG 및 Cas9-AzF-DBCO-PEG-Folate)에 대한 DNA-절단 활성의 예시를 나타낸 도이다.
도 7은 시험관 내 DNA 절단 분석에 의해 조사된 Cas9-AzF(Y373) 및 다른 컨쥬게이트 (Cas9-AzF-DBCO-Olaparib 및 Cas9-AzF-DBCO-Olaparib&Mal-Olaparib)에 대한 DNA-절단 활성의 예시를 나타낸 도이다.
도 8은 DBCO- 및 말레이미드-기능화된 올리파립의 제조를 나타낸 도이다.
도 9는 다양한 Cas9-AzF(Y373) 제형의 접합(conjugation) 반응을 나타낸 도이다.
도 10은 다양한 Cas9-AzF(Y373) 제형의 세포 흡수를 나타낸 도이다.
도 11 내지 13은 다양한 Cas9-Olaparib 컨쥬게이트들의 항-증식능을 나타낸 도이다.
도 14는 다양한 Cas9-AzF 제형의 유전자 편집 효율(T7E1)을 나타낸 도이다.
본 발명은 CRISPR 유전자교정 시스템의Cas9 단백질에 비천연 아미노산을 위치특이적으로 도입함으로써, 선택화학반응기를 부여하여 다종의 생리활성물질로 Cas9을 기능화할 수 있는 기술에 관한 것이다.
이에, 본 발명은 본 발명은 위치특이적으로 비천연 아미노산이 도입되어 생리활성물질이 접합된 다기능화된 CRISPR 유전자편집 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 다기능화된 CRISPR 단백질의 제조용 조성물 및이를 이용한 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 위치특이적 다기능화가 가능한 Cas9 단백질 개발
본 발명에서는 Cas9 단백질에 위치특이적으로 비천연 아미노산인 p-azido-L-phenylalanine (AzF)을 도입하였다. AzF는 azide (N3) 기능기를 포함하여 선택화학적 클릭 반응에 의해 다양한 생리활성 물질로 개질이 가능하게 한다. 이에, Genetic code expansion 방법에 있어 amber codon suppression 을 유도하기 위해, 우선 Cas9 단백질 표면에 노출된 아미노산 중 tyrosine (Tyr) 및 phenylalanine (Phe)을 다양한 위치를 선정하여 tyrosine codon (TAC) 및 phenylalanine (TTC)를 amber stop codon (TAG)으로 변이를 일으킴으로써 Mj AzF-RS/mutRNACUA 에 의해 AzF가 도입될 수 있도록 하였다(도 1).
실시예 2. 비천연 아미노산 AzF 도입을 위한 벡터 제작
벡터 제작을 위해 pETDuet SpCas9 wt His6 플라스미드를 이용하였는데, 여기에는 wild type Streptococcus pyogenes Cas9, N-terminal에 SV40 nuclear localization sequence/signal (NLS) 및 C-terminal에 His6-tag을 포함하고 있다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 Cas9을 구성하는 각 domain의 다양한 아미노산 위치에 amber stop codon을 도입하기 위해 프라이머를 설계하였다: Y5 (RuvC), Y81 (Bridge Helix), Y192 (RecII), Y373 (RecI), F375 (RecI), Y430 (RecI), Y568 (RecI), Y594 (RecI), Y639 (RecI), Y836 (HNH), Y943 (RuvC), F1235 (PAM interacting), Y1326 (PAM interacting) 및 Y1356 (PAM interacting). 우선, PCR에 의해 insertion된 부위를 증폭하고, overlap extension PCR에 의해 두 부위의 DNA를 접합시켰다. 그 후 제한 효소 처리 및 T4 DNA ligase을 이용하여 재조합 플라스미드를 제작하였다.
실시예 3. 비천연 아미노산이 도입된 변이된 Cas9 단백질 생산
AzF가 도입된 변이된 Cas9 단백질(Cas9-AzF)은 competent cell인 E. coli BL21 (DE3)에서 발현시킨 후, His-tag을 이용한 affinity chromatography에 의해 정제하였다. 우선, 제작한 재조합 플라스미드는 E. coli DH5α에 transformation 후 ampicillin 첨가에 의해 selection하고 서열분석을 통해 변이됨을 확인하였다. AzF가 도입된 Cas9 단백질을 생산하기 위해서는 pETDuet SpCas9 wt His6 플라스미드와 함께 Mj AzF-RS/mutRNACUA을 포함하는 pRSFDuet M.j AzFRS TyrT 플라스미드를 E. coli BL21 (DE3)에 transformation하고, 배양 후 회수하였다. 다음으로 IPTG를 처리하고 AzF를 첨가하여 배양한 후 His-tag을 이용하여 Cas9을 정제하였다. SDS-PAGE 분석 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 Cas9-AzF에 해당하는 162.2 kDa 위치에서 단백질을 확인하였으며, 획득 수율은 native Cas9에 비해 ~50% 정도로 나타났다.
실시예 4. 비천연 아미노산이 도입된 Cas9의 물성 및 기능 분석
AzF가 도입된 경우 Cas9의 제한효소 활성을 분석하기 위해 PCR로 합성된 DNA template에 Cas9-AzF와 single guide RNA (sgRNA)를 처리한 후 전기영동으로 확인하였다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 native Cas9에 비하여 73-86%로 활성이 유지되는 것을 확인하였다.
또한, Cas9에 도입된 AzF의 반응성을 확인하기 위해 azide 기능기와 선택화학반응을 하는 dibenzylcyclooctyne으로 개질된 형광물질 BODIPY (BODIPY FL-PEG4-DBCO)와 반응을 유도하여 형광을 측정하였다. 그 결과, 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이 Cas9-AzF에 DBCO-BDP-FL 반응에 의한 클릭반응이 일어난 것을 확인하였다.
또한, Cas9-AzF의 엔도뉴클라아제(Endonuclease)의 활성을 in vitro에서 확인하였다. 구체적으로, Cas9-AzF의 유전자 편집 기능을 in vitro에서 DNA 절단 분석으로 조사하였다. Cas9-AzF의 제한 효소 활성을 분석하기 위해, 암-관련 EGFR, RAD52 Exon 4 및 POLQ Exon 16 A 유전자들을 표적화하는 sgRNA를 설계하고 준비하였다. T7 프로모터 영역, CrRNA에 대한 주형 영역 및 TracrRNA에 대한 주형 영역으로 구성된 각 sgRNA에 대한 DNA 주형을 합성하였고, PCR로 증폭하였다. 그 후, 각 sgRNA를 생성하기 위해, 상기 합성된 DNA 주형 및 T7 중합효소를 이용하여 in vitro 전사를 수행하였다. 3개의 sgRNA 모두 ~125개의 뉴클레오타이드 크기를 갖는 것으로 나타났다. PCR로 증폭된 표적 DNA는 EGFR에 대해 819 bp, RAD52 Exon 4에 대해 843 bp, POLQ Exon 16 A에 대해 896 bp, PLK1에 대해 890 bp, RAD52 target DNA 1에 대해 817 bp 및 POLQ Exon 3에 대해 820 bp의 크기를 갖는 것으로 나타났다.
Cas9-AzF 단백질 및 다른 컨쥬게이트들(Cas9-AzF-DBCO-PEG, Cas9-AzF-DBCO-PEG-Folate, Cas9-AzF-DBCO-Olaparib) 및 2중 가닥 절단을 유도하는 sgRNA의 기능은 Cas9-AzF 단백질 또는 엔도뉴클레아제(endonuclease) 절단을 유도하기 위한 sgRNA 및 PCR로 증폭된 표적 DNA를 혼합함으로써 조사하였다. Cas9-AzF는 대조군(native Cas9) 대비 EGFR에 대해 ~80-87%, RAD52 Exon 4에 대해 ~76-97% 및 POLQ Exon 16 A 표적 유전자 및 표적 위치인 Y5 (RuvC), Y81 (Bridge Helix), Y192 (RecII), Y373 (RecI), Y836 (HNH) 및 Y943 (RuvC)에 대해 ~88-95%의 DNA 절단 활성을 나타냈고, 이는 Cas9에 AzF의 함입은 주요한 단백질 기능 손실을 나타내지 않는다는 것을 입증하였다(표 1, 도 6 및 7). 다른 모든 Cas9-AzF 컨쥬게이트에 대해서도 유사한 절단 활성이 발견되었다. 하지만, 표적 위치 Y1326 및 Y1356 (PAM interacting)의 경우, Cas9-AzF의 주요 기능 손실은 EGFR에 대해 ~14-26%, RAD52 Exon 4에 대해 ~0-4% 및 POLQ Exon 16 A 표적 유전자에 대해 ~16-23%로 감소하였고, 다른 모든 Cas9-AzF 컨쥬게이트에 대해 유사한 절단 활성이 인식될 수 있었고, 이는 Cas9의 PAM 상호작용 도메인 내 AzF의 도입이 Cas9 단백질의 표적 DNA 서열에 대한 결합을 실패로 유도한다는 것을 시사한다. 일반적으로, Cas9-sgRNA 복합체는 비표적 가닥 상의 절단 부위로부터 3-4개 뉴클레오티드 하류에서 발견되며, 절단을 위하여 표적화된 DNA 영역을 절단하기 위해 Cas 뉴클레아제에 필수적인 PAM(protospacer adjacent motif) DNA 서열(NGG)에 결합한다.
| Target gene | Position | SpCas9 domain | nCas9 | Cas9-AzF | Cas9-AzF-DBCO-PEG(2k) | Cas9-AzF-DBCO-PEG(5k) | Cas9-AzF-DBCO-PEG(1k)-FA | Cas9-AzF-DBCO-Olaparib |
| EGFR | Y5 | RuvC | 96.8 | 82.3 | 81.1 | 77.0 | - | - |
| Y81 | Bridge Helix | 94.8 | 83.2 | 80.7 | 81.4 | - | - | |
| Y192 | RecII | 98.6 | 82.4 | 82.7 | 82.5 | - | - | |
| Y373 | RecI | 98.4 | 83.5 | 79.8 | 79.9 | 72.3 | 88.8 | |
| Y836 | HNH | 100.0 | 86.8 | 79.7 | 77.6 | - | - | |
| Y943 | RuvC | 98.0 | 80.3 | 76.4 | 75.0 | - | - | |
| Y1326 | PAM interacting | 90.8 | 25.6 | 19.0 | 12.1 | - | - | |
| Y1356 | PAM interacting | 94.1 | 13.7 | 20.0 | 10.0 | - | - | |
| RAD52 Exon 4 | Y5 | RuvC | 91.2 | 76.2 | 71.7 | 69.4 | - | - |
| Y81 | Bridge Helix | 97.5 | 88.6 | 81.6 | 75.5 | - | - | |
| Y192 | RecII | 94.2 | 88.1 | 81.8 | 87.2 | - | - | |
| Y373 | RecI | 97.6 | 96.6 | 96.2 | 96.6 | 77.2 | 89.3 | |
| Y836 | HNH | 100.0 | 97.1 | 96.3 | 95.8 | - | - | |
| Y943 | RuvC | 98.1 | 94.4 | 96.9 | 95.5 | - | - | |
| Y1326 | PAM interacting | 95.2 | 4.2 | 8.8 | 4.9 | - | - | |
| Y1356 | PAM interacting | 94.9 | 00.0 | 00.0 | 00.0 | - | - | |
| POLQ Exon 16 A | Y5 | RuvC | 95.1 | 88.1 | 90.6 | 85.3 | - | - |
| Y81 | Bridge Helix | 97.5 | 88.0 | 84.1 | 82.9 | - | - | |
| Y192 | RecII | 93.0 | 92.3 | 93.6 | 92.3 | - | - | |
| Y373 | RecI | 98.3 | 94.5 | 94.2 | 95.4 | 92.6 | 90.3 | |
| Y836 | HNH | 100.0 | 95.4 | 93.5 | 95.2 | - | - | |
| Y943 | RuvC | 98.0 | 92.6 | 93.7 | 93.0 | - | - | |
| Y1326 | PAM interacting | 92.8 | 16.4 | 13.8 | 17.4 | - | - | |
| Y1356 | PAM interacting | 96.0 | 23.4 | 00.0 | 11.3 | - | - |
상기 표 1은 in vitro DNA 절단 분석에 의해 평가된 Cas9-AzF 엔도뉴클레아제 활성의 개요를 나타낸 것이다. 구체적으로, EGFR, RAD52 Exon 4 및 POLQ Exon 16 A 표적 유전자에 대한 다른 표적 위치 (Y5 (RuvC), Y81 (Bridge Helix), Y192 (RecII), Y373 (RecI), Y836 (HNH), Y943 (RuvC), Y1326 (PAM interacting), Y1356 (PAM interacting)) 및 다른 컨쥬게이트(Cas9-AzF-DBCO-PEG, Cas9-AzF-DBCO-PEG-Folate, Cas9-AzF-DBCO-Olaparib)로 Cas9-AzF에 대해 조사한 결과이다.
실시예 5. 위치특이적 Cas9 다기능화 및 세포 내 전달
먼저, DBCO- 및 말레이미드-기능화 컨쥬게이트의 제조 및 Cas9-AzF의 위치-특이적 다기능화를 확인하고자 하였다. 본 연구를 통해 항암제(Olaparib), 생체안정성 고분자(polyethylene glycol, PEG) 및 리간드(folate, FA)를 Cas9-AzF에 컨쥬게이션하여, 그의 세포 내 전달 및 유전자 편집 효과 및 그의 치료제로서의 효능을 검증하였다. PARPi(nuclear poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor)인 FDA 승인된 소분자 억제제(SMI: small molecule inhibitor) 올라파립(Olaparib)은 DNA 복구에 관여하는 효소인 PARP에 선택적으로 결합하고 억제하여, 단일 가닥 DNA 파손(SSB: single strand DNA breaks)의 PARP-매개 복구를 억제한다. 올라파립은 난소암, 유방암 및 전립선암을 포함하는 유전성 BRCA1(breast cancer type 1 susceptibility protein) 또는 BRCA2(breast cancer type 2 susceptibility protein) 돌연변이를 지닌 사람들의 암에 작용한다. PARP를 표적화하는 약물은 BRCA1- 및 BRCA2-결핍 세포와 같은 HR(homologous recombination)이 있는 종양 세포에서 SL(synthetic lethality)을 유발한다. SL은 두 개 이상의 유전자들이 동시에 불활성화가 세포 사멸을 유발할 때 발생되는 반면, 이러한 유전자들 중 오직 하나의 불활성화는 생존력에 영향을 미치지 않는다. 올라파립의 약물 효과 및 이러한 다기능적 CRISPR-Cas9 시스템의 유전자 편집 효과의 결합은 DNA 이중 나선 손상(DSBs)의 복구를 매개하고, 상동 재조합에 중요한 DNA-결합 단백질인 DNA 어닐링 인자 방사선 민감성 52(RAD52) 또는 미세상동성-매개, error-prone, DSB 복구 경로 쎄타 매개 말단 연결(TMEJ)을 매개하는 널리 보존된 DNA 중합효소인 DNA 중합효소 θ(POLQ)을 파괴하기 위해 Cas9을 이용함으로써 BRCA1- 및 BRCA2-결핍 세포에서 SL을 유발할 수 있다. 종양-특이적 사멸을 위해 SL을 이용하여 암을 표적화하는 조합 요법은 암-특이적 표적화 요법에 새로운 접근 방식을 나타낸다.
올라파립(4-(4-Fluoro-3-(piperazine-1-carbonyl)benzyl)phthalazin-1(2H)-one)은 말레이미드(Mal) 또는 DBCO로 성공적으로 기능화되어, Cas9-AzF와 추가로 반응하였다(도 8). Mal-PEG4-Olaparib의 경우, Mal-PEG4-NHS 에스테르를 올라파립과 반응시켰고(몰 과량비 1:10), DBCO-Olaparib의 경우, DBCO-Sulfo-NHS 에스테르를 올라파립과 반응시켰고(몰 과량비 1:10), 2개 모두 RT에서 2시간 동안 반응 후, HPLC(UFLC-SHIMADZU LC-2020 liquid chromatography)로 정제하였다.
다음으로, Cas9-AzF(Y373)는 DBCO-PEG(2k/5k), DBCO-PEG(1k)-Folate, Mal-PEG4-Olaparib 및 DBCO-Olaparib으로 기능화되었고, 이의 세포 내 전달 및 유전자 편집 효과 및 그의 치료제로서의 효능을 검증하였다(도 9). Cas9-AzF(Y373)-DBCO-PEG(2k/5k)의 경우, Cas9-AzF(Y373)를 DBCO-PEG(2k/5k)와 반응시켰고(몰 과량비 1:100), Cas9-AzF(Y373)-DBCO-PEG(1k)-Folate의 경우, Cas9-AzF(Y373)를 DBCO-PEG(1k)-Folate와 반응시켰으며(몰 과량비 1:60), Cas9-AzF(Y373)-Mal-Olaparib의 경우, Cas9-AzF(Y373)를 Mal-PEG4-Olaparib와 반응시켰고(몰 과량비 1:100), Cas9-AzF(Y373)-DBCO-Olaparib의 경우, Cas9-AzF(Y373)를 DBCO-Olaparib와 반응시켰으며(몰 과량비 1:100), 4가지 모두 Tris-Cl (50 mM), KCl (200 mM) 및 EDTA (0.1 mM) 용액에서 4℃의 온도로, 24시간 동안 반응시켰다. 이후 30 kDa amicon filter로 정제하였고(14,000 g, 5x, 5 분), SDS-PAGE로 확인하였다.
또한, BRCA1-돌연변이 HCC1937 인간 유방암 세포DPTJ Cas9-AzF 제제의 세포 흡수를 확인하고자 하였다. 세포 내 전달은 Cas9-AzF(Y373)를 sgRNA 및 TAT 펩티드(서열번호 1: GRKKRRQRRRPQ)와 복합체화하여 달성하였고, 이는 세포막을 투과하기 위한 세포-침투성 펩티드 및 핵으로의 전위를 위한 핵 국소화 서열로 구성되었다. 이 때, 상기 TAT 펩티드는 염기성 아미노산을 다수 포함하여 Cas9 또는 Cas9-AzF와 결합한 sgRNA와 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성하여, 세포 내에 효과적으로 유입 및 핵에 전달되어 유전자편집 효율을 유도, 향상시키는 바, 함께 이용하였다. Cas9-AzF(Y373), Cas9-AzF(Y373)-DBCO-PEG(2k/5k), Cas9-AzF(Y373)-DBCO-PEG(1k)-FA, Cas9-AzF(Y373)-Mal-Olaparib 및 Cas9-AzF(Y373)-DBCO-Olaparib의 세포 흡수를 조사하기 위해, 서로 다른 Cas9-AzF(Y373) 제형의 세포 내 전달을 공초점 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다. 전달 특성화를 위해, 다른 제형들을 Alexa Fluor™ 647 형광단 (AF647)으로 표지하였다. 이러한 접합 반응을 위해, Alexa Fluor™ 647 NHS 에스테르(Succinimidyl Ester, Thermo Fisher Scientific, USA)를 Cas9-AzF(Y373)와 4℃에서 2시간동안 반응시켰고(몰 비 1:1), MWCO 투석막 (20k, buffer change 5x)을 이용하여 정제하였으며, SDS-PAGE로 확인하였다. BRCA1 5382C 돌연변이를 갖는 HCC1937 인간 유방암 세포(5382 뉴클레오티드에서 C를 삽입)를 8-웰 세포 배양 슬라이드(SPL Life Sciences Co., Ltd., South Korea)에 웰 당 5.0 x 104 세포로 시딩하였고, 웰 당 200 μl의 총 부피가 되도록 시딩하였다. 상기 웰에는 AF647이 표지된 Cas9-AzF(Y373), Cas9-AzF(Y373)-DBCO-PEG(2k/5k), Cas9-AzF-Mal-Olaparib, Cas9-AzF(Y373)-DBCO-Olaparib과 함께 샘플을 대해 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI-1640 배지 (Gibco®, + 25 mM HEPES, + L-Glutamine, Thermo Fisher Scientific, USA) 또는 Cas9-AzF(Y373)-DBCO-PEG(1k)-FA와 함께 샘플에 대해 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI-1640 배지 Gibco® (+ L-Glutamine, + Phenol Red, - Folic Acid) (Thermo Fisher Scientific, USA)가 포함되어 있었다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 24시간동안 배양하였다. 5% CO2 및 습한 대기 하 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 세포들을 200 μl의 HEPES (10 - 20 mM)가 첨가된 Opti-MEM 배지 (Opti-MEM®, Gibco® (+ L-Glutamine, + HEPES, - Phenol Red), Thermo Fisher Scientific, USA)로 1회 세척하였고, 그 후, Opti-MEM (+ 10-20 mM HEPES) (control) 또는 500 Nm(200 μl Opti-MEM (+ 10-20 mM HEPES) 배지 내 최종 농도)의 Cas9-AzF(Y373), Cas9-AzF(Y373)-DBCO-PEG(2k/5k), Cas9-AzF(Y373)-DBCO-PEG(1k)-FA, Cas9-AzF(Y373)-Mal-Olaparib 및 Cas9-AzF(Y373)-DBCO-Olaparib(sgRNA가 있거나 없는 모든 샘플들(Cas9:sgRNA(POLQ) 1:1 몰 비, 500 nM), + 10 μg TAT 펩티드)를 37℃ 및 5% CO2에서 4시간 동안 처리하였다. 4시간 동안 배양 후, 각 웰을 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (DPBS, Gibco®, without: Calcium Chloride, Magnesium Chloride, Thermo Fisher Scientific, USA)로 3회 세척하였다. 그 후 세포들을 DPBS (RT에서 10-20분 배양) 내 4% 파라포름알데히드(PFA solution, Methanol-free, Thermo Fisher Scientific, USA)으로 고정하였다. 고정 후, 각 웰들을 200 μL DPBS로 2회 세척하고, 200 μl DPBS 내에서 10분 간 0.1% Triton-X 100(Sigma-Aldrich, USA)와 함게 배양함으로써 세포 투과를 수행하였다. 배양 후, 각 웰을 DPBS로 1-2회 세척하고, F-actin을 2 droplets/ml rhodamine-phalloidin (ActinRedTM 555 ReadyProbesTM reagent, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, USA)로 표지하였다. 30분 배양(RT에서 빛 보호) 후, 염색 혼합물을 흡인하고, 웰 당 200 μl DPBS로 교체하였다. 200 μl DPBS에서 1-2회 워싱 단계 후, 배지를 흡인하고, 세포 핵을 5 μl/well 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Vectashield Mounting Medium, Vector Laboratories, Inc., USA)로 염색하였다. 슬라이드를 커버 글라스로 덮고, 샘플을 공초점 현미경(LSM 880 or LSM 780, Carl Zeiss AG, Germany) 하에서 관찰될 때까지 4℃에서 보관하였다. 이미지는 40배 확대를 이용하여 LSM 880 또는 LSM 780 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM, Carl Zeiss AG, Germany)으로 기록하였다. Rhodamine-phalloidin 방출은 565 nm에서 기록하였고, AF647는 672 nm, DAPI는 460 nm에서 기록하였다. 모든 이미지는 ZEN Black and Blue Edition (Carl Zeiss AG, Germany)을 이용하여 가공되었다.
도 10에서 나타난 바와 같이, 4시간 동안 처리 후, TAT 펩티드와 혼합 후 Cas9-AzF(Y373), Cas9-AzF-Mal-Olaparib 및 Cas9-AzF(Y373)-DBCO-Olaparib 제형에 대한 증가된 형광 강도가 관찰되었고, 이미지 분석에 의한 상대적인 형광 강도/세포의 정량화에 의해 표적 세포 내 성공적인 내재화를 확인할 수 있었다(nCas9에 비해 P < 0.01). 하지만, as9-AzF(Y373)-DBCO-PEG(2k/5k) 및 Cas9-AzF(Y373)-DBCO-PEG(1k)-FA의 경우, 형광 신호가 거의 감지되지 않았고, PEGylation이 표적 세포로의 흡수 및 전달을 감소시킨다고 가정하였다. PEGylation은 이식된 PEG 사슬 및 세포막 간의 입체적 상호작용으로 인해 세포 흡수 및 세포 내 trafficking에 유의하게 영향을 미친다는 것으로 널리 알려져 있다.
실시예 6. 위치특이적 Cas9-Olaparib 접합체의 약물반응성 검증
BRCA1-돌연변이 HCC1937 인간 유방암 세포에 접합하는 Cas9-Olaparib의 항증식능을 조사하였다. 세포 증식은 제조사의 지시에 따라 cell counting Kit-8 (CCK8, Dojindo Molecular Technologies, Inc.)를 이용한 세포 증식 및 세포 독성 분석을 수행하여 결정하였다. 간단히 말해, HCC1937 세포는 트립신화되고, 계수되고, 초기 밀도 1.0x104 cells/well (in 100 μl 세포 현탁액 내)로 96-웰 세포 배양 플레이트에 시딩되었다. 37℃에서 가습 CO2 배양기에서 24시간 배양 후, 세포들을 세포 배양 액으로 세척하였고, 96-웰 미세역가 플레이트에서 0 h, 48 h 및 72 h 동안(37℃, 5% CO2) 배양 배지 내 희석된 저농도(100 nM, 200 nM, 500 nM)의 Cas9-AzF(Y373), Cas9-AzF(Y373)-Mal-Olaparib, Cas9-AzF(Y373)-DBCO-Olaparib 및 Cas9-AzF(Y373)-DBCO-Olaparib&Mal-Olaparib 또는 대조군 제형(모든 샘플은 sgRNA (Cas9:sgRNA(POLQ) 1:1 몰 비)가 있거나 없음, + 10 μg TAT 펩티드)을 처리하였다. 그 후, WST 시약(CCK-8 용액 (10 μl))을 첨가하여 비색 반응을 시작하였고, 세포들을 microplate reader (Infinite® 200 PRO, Tecan Austria GmbH)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하기 전에 37℃ 및 5% CO2에서 1시간 동안 배양하였다. 세포 생존율은 0 h 처리에 대한 값으로 정규화에 기반하여 결정하였다.
저농도(100 nM, 200 nM, 500 nM)의 Cas9-AzF-Mal-Olaparib 또는 대조군 제형의 처리 후 세포 생존율은 72시간 후에 Cas9-AzF/sgRNA + Olaparib 혼합물(500 nM)의 경우 63-64% 감소, Cas9-AzF-Mal-Olap/sgRNA (500 nM)의 경우 47% 감소, Cas9-AzF-DBCO-Olap/sgRNA (500 nM)의 경우 53% 감소, Cas9-AzF-DBCO-Olap/Mal-Olap/sgRNA (500 nM)의 경우 43% 감소하였다(도 11 내지 13).
실시예 7. 위치특이적 Cas9-Olaparib 접합체의 유전자 교정 기능 검증
본 실시예에서는 Cas9-AzF 제형의 유전자 편집 효능을 확인하고자 하였다. 원하는 표적 부위(RAD52 Exon 4, POLQ Exon 16 A)의 돌연변이 효율을 분석하기 위해, 서로 다른 Cas9-AzF 제형들의 유전자 편집 효율을 T7E1(T7 Endonuclease I) 분석 및 NGS(next-generation sequencing)로 분석하였다. T7E1 또는 NGS 샘플들은 하기에 따라 제조하였다: 먼저, HCC1937 인간 유방암 세포 또는 H1975 비소세포 인간 폐암 세포를 24-웰 세포 배양 슬라이드(SPL Life Sciences Co., Ltd., South Korea)에 웰 당 5.0 x 104 cells로 10% FBS를 포함하는 RPMI-1640 배지(Gibco®, + 25 mM HEPES, + L-Glutamine, Thermo Fisher Scientific, USA) 내 웰당 0.5 ml의 총 부피로 시딩하였다. 세포들을 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다. 5% CO2의 습윤한 대기 하 37℃에서 24시간 동안 배양 후, 세포들은 10% FBS를 포함하는 2 ml RPMI-1640 배지로 세척하였고, 그 후 500 nM(10% FBS를 포함하는 500 μl RPMI-1640 배지 내 최종 농도)의 nCas9, nCas9-Mal-Olaparib, Cas9-AzF(Y373), Cas9-AzF(Y373)-Mal-Olaparib, Cas9-AzF(Y373)-DBCO-Olaparib 및 Cas9-AzF(Y373)-DBCO-Olaparib&Mal-Olaparib 또는 대조군 제형(모든 샘플들은 sgRNA(Cas9:sgRNA 1:1 몰 비, 500 nM)가 있거나 없음, + 10 μg TAT 펩티드)을 37℃ 및 5% CO2에서 48시간 동안 처리하였다. 48시간 배양 후, 유전체 DNA 분리를 수행하였다. T7E1 분석을 위해, 유전체 DNA (50 ng)를 각 표적의 T7E1 프라이머와 함께 PhusionTM high-fidelity DNA 중합효소 (Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 증폭하였다. PCR 조각은 GeneAll® ExpinTM PCR SV kit (GeneAll Biotechnology, South Korea)을 이용하여 정제하였다. T7E1 분해를 위한 PCR heteroduplexes 및 T7E1 분해를 Alt-RTM 유전자 편집 검출 키트 (Integrated DNA Technologies, IDT, USA)를 이용하여 T7 endonuclease 1 (1 U/μl)와 함께 수행하였고, 그 후, 겔 전기영동으로 확인하고, 겔 문서화 시스템 (ChemiDoc XRS+ Imager, Biorad, USA)를 이용해 분석하였다. 인델 효율(%)은 하기 수학식 1로 계산하였다:
[수학식 1]
100 Х (1-(1-(a+b)/(a+b+c))^(1/2))
상기 "a" 및 "b"는 절단된 조각의 영역을 나타내고, "c"는 절단되지 않은 조각의 영역을 나타낸다. NGS의 경우, DNA 시퀀싱 라이브러리는 PCR에 의해 생성되었고, MiniSeqTM 시스템 (Illumina, USA)으로 분석하였다.
HEK293T 세포 및 HCC1937 세포 내 Cas9 표적 부위 (POLQ Exon 16 A)에서의 인델 효율의 분석은 리포펙타민 (CMAX=CRISPRMAX) 제형은 Cas9-AzF/sgRNA + CMAX (HEK293T 세포)에 대해 42.2%의 인델 효율 및 Cas9-AzF/sgRNA + CMAX (HCC1937 세포)에 대해 8.8%를 나타냈고, Cas9-AzF(Y373)-DBCO-Olaparib&Mal-Olaparib/sgRNA + CMAX에 대해서는 더 낮은 퍼센트를 나타냈다(HEK293T 세포에 대해 8.4%, HCC1937 세포에 대해 2.7%)(도 14).
하기 표 2는 다양한 Cas9-AzF 제형의 유전자 편집 효율(NGS: Gene editing efficiency)을 나타낸다. NGS 샘플은 HCC1937 세포, H1975 세포 및 HEK293T 세포(1.0x104 cells/well)에 500 nM의 nCas9, Cas9-AzF(Y373), Cas9-AzF(Y373)-Mal-PEG4-Olaparib, Cas9-AzF(Y373)-DBCO-Olaparib 및 Cas9-AzF(Y373)-DBCO-Olaparib&Mal-PEG4-Olaparib 또는 대조군 제형을 처리하여 제조되었다(모든 샘플들은 sgRNA (Cas9:sgRNA(POLQ/RAD52) 1:1 몰 비)가 있거나 없음, 10 μg TAT 펩티드). 다양한 인간 세포주(HCC1937 인간 유방암 세포 또는 H1975 비소세포 인간 폐암 세포) 내 Cas9 표적 부위(RAD52 Exon 4, POLQ Exon 16 A)에서 단일 뉴클레오티드 삽입/결실(인델: InDels)의 분석은 돌연변이는 도입되지 않았거나(0%), 심지어 양성 대조군인 CMAX도 매우 낮은 퍼센트로 도입되었다(0.1-0.2%)(도 14). 대조적으로, HEK293T 세포에 대한 돌연변이는 Cas9-AzF/sgRNA(POLQ) + CMAX에 대해 도입되었지만(7.6%), Cas9-AzF(Y373)-DBCO-Olaparib&Mal-Olaparib/sgRNA(POLQ) + CMAX에 대해서는 낮은 퍼센트로 도입되었고(1.5%), RAD52 유전자에 대해선 도입되지 않았다(0.5-0.6%)(표 2).
| Treatment/cell line | Indel frequency (%) | |||||
| POLQ Exon 16 A | RAD52 Exon 4 | |||||
| HCC1937 | H1975 | HEK293T | HCC1937 | H1975 | HEK293T | |
| nCas9 + CMAX | 0.2 | 0.3 | 0.1 | 0.0 | 0.1 | 0.6 |
| Cas9-AzF + CMAX | - | 0.1 | 7.6 | - | 0.0 | 0.6 |
| Cas9-AzF-DBCO-Olaparib + CMAX | 0.2 | - | 1.5 | 0.1 | - | 0.5 |
POLQ 및 RAD52 유전자를 표적할 때, HCC1937 및 H1975 세포 내 Cas9-AzF 컨쥬게이트에 대한 낮은 유전자 편집 퍼센트의 NGS 결과에 대한 가능한 이유는 세포주, 유전자 선택 및 sgRNA 설계일 수 있다. 일반적으로, CRISPR 표적화 및 유전자 편집 효율은 CRISPR 시스템, 세포주, 유전자 및 가이드 RNA에 의해 크게 다를 수 있다. 이 다기능 CRISP-Cas9 유전자 편집 시스템의 기능을 추가로 확인하기 위해, 다양한 세포주가 사용될 수 있고, POLQ 및 RAD52 유전자 내 다양한 sgRNA 표적화 영역이 설계될 수 있고, 세포 성장을 억제하고, 세포 성장 정지를 유도하고, 종양 세포 내 세포사멸을 일으키는 다양한 암-관련 유전자(e.g. PLK1, BRCA1/2)가 표적 유전자로서 선택될 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology
<120> A GENE EDITING PROTEIN SITE-SPECIFICALLY INCORPORATED WITH
UNNATURAL AMINO ACID AND A METHOD FOR EDITING OF GENE USING THE
SAME
<130> P-19559
<150> KR 10-2020-0147709
<151> 2020-11-06
<160> 5
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TAT peptide
<400> 1
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PTD4 peptide
<400> 2
Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala
1 5 10
<210> 3
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Transportan peptide
<400> 3
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu
1 5 10 15
Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
20 25
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SV40 peptide
<400> 4
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CM18 peptide
<400> 5
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr
1 5 10 15
Thr Gly
Claims (22)
- 비천연 아미노산이 위치-특이적으로 도입된 유전자 편집 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 AzF(p-azido-L-phenylalanine)인, 유전자 편집 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질은 야생형 단백질의 아미노산 서열 중 Tyr(tyrosine) 또는 Phe(phenylalanine)이 AzF(p-azido-L-phenylalanine)로 치환된 것인, 유전자 편집 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질은 CRISPR/Cas9 시스템에 이용되는 것인, 유전자 편집 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질은 Cas9 단백질인, 유전자 편집 단백질.
- 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 유전자 편집 단백질 및 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염을 포함하는 유전자 편집용 조성물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물은 DBCO(Dibenzylcyclooctyne)기 또는 말레이미드(Maleimide)기를 갖는 화합물인, 유전자 편집용 조성물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염은 하나 이상의 PEG(Polyethylene glycol)이 결합되어 있고,
상기 하나 이상의 PEG는 리간드 또는 표적화제와 결합된 것인, 유전자 편집용 조성물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염은 표적화제와 결합된 것인, 유전자 편집용 조성물.
- 청구항 8에 있어서, 상기 리간드는 Folate(Fol) 또는 세포투과성 펩티드인, 유전자 편집용 조성물.
- 청구항 8 또는 9에 있어서, 상기 표적화제는 압타머, 항체 또는 이들의 단편 또는 항암제인, 유전자 편집용 조성물.
- 청구항 11에 있어서, 상기 항암제는 올라파립(Olaparib)인, 유전자 편집용 조성물.
- 유전자 편집 단백질에 비천연 아미노산을 위치-특이적으로 도입하는 단계;
상기 유전자 편집 단백질 및 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염을 개체로부터 분리된 세포에 처리하거나 개체에 투여하는 단계를 포함하는 유전자 편집 방법.
- 청구항 13에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 AzF(p-azido-L-phenylalanine)인, 유전자 편집 방법.
- 청구항 13에 있어서, 상기 비천연 아미노산을 위치-선택적으로 도입하는 단계는 야생형 단백질의 아미노산 서열 중 Tyr(tyrosine) 또는 Phe(phenylalanine)을 AzF(p-azido-L-phenylalanine)로 치환하는 단계인 것인, 유전자 편집 방법.
- 청구항 13에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질은 Cas9 단백질인, 유전자 편집 방법.
- 청구항 13에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물은 DBCO(Dibenzylcyclooctyne)기 또는 말레이미드(Maleimide)기를 갖는 화합물인, 유전자 편집 방법.
- 청구항 13에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염은 하나 이상의 PEG(Polyethylene glycol)이 결합되어 있고,
상기 하나 이상의 PEG는 리간드 또는 표적화제와 결합된 것인, 유전자 편집 방법.
- 청구항 13에 있어서, 상기 유전자 편집 단백질 내 azide기와 클릭화학반응이 가능한 화합물 또는 이의 염은 표적화제와 결합된 것인, 유전자 편집 방법.
- 청구항 18에 있어서, 상기 리간드는 Folate(Fol) 또는 세포투과성 펩티드인, 유전자 편집 방법.
- 청구항 18 또는 19에 있어서, 상기 표적화제는 압타머, 항체 또는 이들의 단편 또는 항암제인, 유전자 편집 방법.
- 청구항 21에 있어서, 상기 항암제는 올라파립(Olaparib)인, 유전자 편집 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2021/016050 WO2022098160A1 (ko) | 2020-11-06 | 2021-11-05 | 비천연 아미노산이 위치-특이적으로 도입된 유전자 편집 단백질 및 이를 이용한 유전자 편집 방법 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| KR1020200147709 | 2020-11-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220061891A true KR20220061891A (ko) | 2022-05-13 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR20210123237A (ko) | 2020-04-02 | 2021-10-13 | 중앙대학교 산학협력단 | CRISPR/Cas9 시스템을 기반으로 한 유전체 편집 방법 및 이의 용도 |
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Patent Citations (1)
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